PÉCSI TUDOMÁNYEGYETEM
Biológiai Doktori Iskola
Az Eisenia fetida coelomasejtjei: struktúra, funkció, eredet PhD értekezés
Somogyi Ildikó
Témavezetők: Dr. (habil) Pollák Edit egyetemi docens Dr. (habil) Molnár László egyetemi docens
.................................
.................................
Témavezetők aláírás
.................................... Iskolavezető aláírása
Pécs, 2012
Tartalomjegyzék 1. Rövidítések jegyzéke ........................................................................................................................... 4 2. Bevezetés ............................................................................................................................................. 6 2.1. Az oligochaeta gyűrűsférgek coelomasejtjei ................................................................................ 7 2.1.1. Morfológiai jellegzetességek ................................................................................................. 8 2.1.2. A coelomasejtek eredete ...................................................................................................... 18 2.1.3. A coelomasejtek funkciói .................................................................................................... 20 2.2. A gyűrűsférgek immunrendszere ............................................................................................... 21 2.3. Citotoxicitás ............................................................................................................................... 24 2.4. A gyűrűsférgek regenerációja..................................................................................................... 26 2.5. Neuroimmun kölcsönhatások ..................................................................................................... 27 3. Célkitűzések ...................................................................................................................................... 31 4. Anyagok és módszerek ...................................................................................................................... 33 4.1. A kísérleti állatok tartása ............................................................................................................ 33 4.2. A coelomasejtek izolálása .......................................................................................................... 33 4.3. Egér agy és hipofízis kiboncolása a Western blot analízis kontroll mintáihoz .......................... 33 4.4. Fénymikroszkópos hisztológiai és hisztokémiai vizsgálatok ..................................................... 34 4.4.1. May-Grünwald Giemsa (Pappenheim-féle panoptikus festés) ............................................ 34 4.4.2. Hematoxilin-eozin festés ..................................................................................................... 34 4.4.3. Perjódsav-Schiff-reakció ..................................................................................................... 34 4.4.4. Szudánfekete festés ............................................................................................................. 35 4.4.5. Akridinoranzs festés ............................................................................................................ 35 4.5. Funkcionális vizsgálatok ............................................................................................................ 36 4.5.1. A coelomasejtek szerepének vizsgálata a regeneráció folyamatában .................................. 36 4.5.2. Birka vörösvértestek fagocitózisának vizsgálata ................................................................. 39 4.5.3. Citotoxicitás vizsgálata........................................................................................................ 39 4.6. Ultrastruktúrális vizsgálatok....................................................................................................... 40 4.7. Dokumentáció, képfeldolgozás, számítógépes utómunkálatok .................................................. 41 5. Eredmények ....................................................................................................................................... 42 5.1. Intakt állatok coelomasejtjeinek morfológiai leírása .................................................................. 42 5.1.1. Az eleocyták fény- és elektronmikroszkópos jellemzése .................................................... 42 5.1.2. Az amoebocyták fény- és elektronmikroszkópos jellemzése .............................................. 46 5.1.3. A granulocyták fény- és elektronmikroszkópos jellemzése ................................................ 50 5.1.4. Bazofil citoplazmájú sejtek ................................................................................................. 53 5.1.5. Lebenyezett sejtmagvú coelomasejtek ................................................................................ 54
2
5.1.6. Korábbról nem ismert sejttípusok a coelomában ................................................................ 56 5.1.7. Az eleocyták és a chloragogén eredetű sejttöredékek kialakulása ...................................... 57 5.2. A coelomasejtek funkcionális vizsgálata.................................................................................... 59 5.2.1. A coelomasejtek szerepe a regeneráció folyamatában ........................................................ 59 5.2.2. A fagocitózis folyamatának vizsgálata ................................................................................ 71 5.2.3. Citotoxicitás jelensége coelomasejt-lizátummal kezelt sejtvonalon.................................... 73 6. Az eredmények megbeszélése ........................................................................................................... 77 6.1. Eleocyták .................................................................................................................................... 77 6.2. Amoebocyták ............................................................................................................................. 78 6.3. Granulocyták .............................................................................................................................. 80 6.4. Bazofil sejtek .............................................................................................................................. 83 6.5. Egyéb sejttípusok ....................................................................................................................... 83 6.6. Funkcionális kapcsolatok ........................................................................................................... 84 7. Összefoglalás ..................................................................................................................................... 88 8. Summary ........................................................................................................................................... 89 9. Köszönetnyilvánítás .......................................................................................................................... 90 10. Irodalomjegyzék .............................................................................................................................. 91 11. Publikációs jegyzék ....................................................................................................................... 101
3
1. Rövidítések jegyzéke AgNP – ezüst-nanopartikulum AO – akridinoranzs (Acridine Orange) cAMP – ciklikus adenozin-monofoszfát CCF – coeloma citolítikus faktor CCL – coelomasejt-lizátum DAB – 3,3’ diaminobenzidin DER – durva felszínű endoplazmatikus retikulum DMEM - Dulbecco’s Modified Eagle Medium EP - eiseniapore FM - fénymikroszkóp GA – glutár-aldehid HE – hematoxilin-eozin LBSS - Lumbricus Balanced Salt Solution LPS - lipopoliszacharid MGG – May-Grünwald-Giemsa NK – Natural Killer PACAP – hipofízis adenilát cikláz aktiváló peptid (pituitary adenylate cyclase-activating peptide) PAC1R – PACAP 1. típusú receptora PAS – Perjódsav - Schiff PB – foszfát puffer (phosphate buffer) PBS - phosphate-buffered saline solution 4
PFA - paraformaldehid PLC – foszfolipáz C RIA - radioimmunoassay RIPA – Radio Immuno Precipitation Assay SEM – scanning (pásztázó) elektronmikroszkóp SPI – szerin-proteáz inhibitor TBS – Tris-Buffered Saline TEM – transzmissziós elektronmikroszkóp TNF – tumor nekrózis faktor VIP - vasoactive intestinal peptide
5
2. Bevezetés A gerinctelen állatok testfelépítésének és életfolyamatainak megismerése részben a filogenezis folyamatának alaposabb megismerését biztosíthatja számunkra. Másrészt elősegítheti olyan biológiai jelenségek alapjainak a feltárását is, amelyek a különböző fejlettségi szintű állatcsoportokban általánosan előfordulnak. A bonyolultabb testfelépítésű szervezetekben, így a gerincesekben egyes jelenségek (pl. regeneráció, öröklődés, egyedfejlődési folyamatok, szöveti differenciálódás stb.) nehezebben, esetenként magasabb költségigényű kísérletek alkalmazásával tanulmányozhatók. Nem véletlen, hogy számos gerinctelen modellállatot használnak különböző alapkutatási projektekben, ezek közül terjedelmi okok miatt csak a legismertebbek megemlítése lehetséges. Több mint egy évszázada tanulmányozzák a csalánozók, a laposférgek regenerációjának folyamatát, és napjainkban több a regenerációban szerepet játszó gént és génterméket, szabályozó faktorokat azonosítottak ezekben a csoportokban, amelyekhez hasonló molekulák jelenlétét magasabb rendű szervezetekben, így gerincesekben is kimutatták. A kromoszómák és a gének öröklődésben játszott szerepét Morgan és munkatársai a már klasszikusnak tekinthető Drosophila melanogaster kísérletekkel mutatták ki. Szintén D. melanogaster-t használtak a röntgensugarak mutációt indukáló hatásának kimutatására. A megtermékenyítés, az embrionális fejlődés folyamatának fő lépéseit részben szintén gerinctelen modell-állatok (férgek, tengeri sünök) felhasználásával tisztázták. Az embrionális fejlődés alatti szövetdifferenciálódás folyamatát és az abban kulcsszerepet játszó programozott sejthalál (apoptózis) morfológiai jellegzetességeit, biokémiai folyamatait Sydney Brenner 1960-as években megkezdett kísérletei alapján a Caenorhabditis elegans (Nematoda) fajban írták le először. A kevéssertéjű gyűrűsférgek különböző fajait modell-állatként használják fémhalmozási és detoxikálási kísérletekben, ökotoxikológiai vizsgálatokban. Nehézfém-rezisztenciájuk fiziológiai háttere a fémionok inaktiválása és átmeneti tárolása, amelyben egyes coelomasejtek és a chloragocyták kiemelkedő szerepet játszanak. A gyűrűsférgekben jelenik meg először a törzsfejlődés során a veleszületett immunitás mellett a humorális immunválasz (Bilej és mtsai. 1995). Az antimikrobiális peptidek szintézise szintén a coelomasejtekben játszódik le. A csoport egyes fajai, így az Eisenia fetida is kiemelkedő regenerációs potenciállal jellemezhető, és ismert az is, hogy a regeneráció egyes lépései csak a coelomasejtek jelenlétében játszódnak le (Herlant-Meewis 1965). Az előzőek alapján 6
nyilvánvaló, hogy a coelomasejtek szerkezetének és funkciójának megismerése számos élettani folyamat lépéseinek feltárását segítheti elő.
2.1. Az oligochaeta gyűrűsférgek coelomasejtjei Az oligochaeta rend több tagjának is vizsgálták már a coelomasejtjeit, így ismert a Lumbricus terrestris (Stein és mtsai. 1977; Stein és Cooper 1978; Linthicum és mtsai. 1977), a Dendrobaena veneta (Adamowicz 2005) és az Allolobophora chlorotica (Kurek és mtsai. 2007) coelomasejtek tipizálása. Ezek a leírások nagyon különbözőek és nem teljesen egyértelműek. A különböző oligochaeta fajokban leírt coelomasejt-típusok összefoglalását az 1. táblázat tartalmazza. A kevéssertéjű gyűrűsférgek coelomaüregét coelomafolyadék tölti ki (1. ábra), amely az érfalakon át a vérből szűrődik ki. Ebben szabadon mozgó sejtek, az ún. coelomasejtek több típusa található (Jamieson 1981). A sejtek száma széles határok között változhat, extrém esetben teljesen kitölthetik a testüreget (1/b ábra). A coelomaüreg minden szelvénye egy dorsalis pórussal és egy páros metanephridiummal érintkezik a külvilággal, ezért az állat életmódjának köszönhetően a testüreg rendszeresen bakteriális és egyéb fertőzéseknek van kitéve. A coelomafolyadék a hidrosztatikai váz része, részt vesz a belső és a külső környezet kommunikációjában, fontos szerepet tölt be a homeosztázis fenntartásában, és mindemellett ez tartalmazza az immunkompetens coelomasejteket. A coelomafolyadék fontos szerepet játszik az ozmoregulációban, speciális ionösszetétele - mely nem azonos a vérplazma összetételével - már korábban ismertté vált (Fischer 1975). A coelomafolyadék ennek megfelelően részt vesz a belső szervek közti anyagcseréjében (Jamieson 1981), az átmeneti folyadéktárolásban és az immunfunkciókban (Cooper és mtsai. 2006; Engelmann és mtsai. 2004). A bélcsatorna, főként a középbél periintestinalis sinusaihoz kapcsolódó chloragogen szövet nagy, élénksárga színű sejtekből áll, a splanchopleurából származik. A typhlosolisba benyomuló részét centrális chloragogen szövetnek hívjuk. Elképzelhető, hogy a chloragogen sejtekben többek között antibakteriális anyagok termelése is folyik. A perifériális chloragogen szövet más gerinctelen fajok hepatopancreasával megegyező funkciót lát el, tápanyagraktározást (lipidek és glikogén), bomlástermékek tárolását, az ionforgalom szabályozását (Sima és mtsai. 1995). Ezen kívül hemoglobinszintézisre képes, ezért funkcionális szempontból a gerincesek vörösvértestjeihez vagy éppen a polychaeták erythrocytáihoz hasonlítható (Fischer és Horváth 1978). A chloragogen sejtekben a szervezet számára még hasznosítható, valamint detoxikált anyagok halmozódnak fel. Felhalmozott anyagaikat a 7
vérből veszik fel, és a coelomaüregbe adják le (Jamieson 1981). Ezen kívül a chloragogen szövet részt vesz a növekvő kokonok táplálásában (Liebmann 1942a), és a regenerációs folyamatokban is (Liebmann 1942a, b; Moment 1974). A chloragogen sejtek citoplazmáját 12 μm átmérőjű, kerek, sárgás pigmentet tartalmazó testek (chloragosomák) töltik ki. Mivel a sejtek időnként leválnak a bélfalról, vagy chloragosomákat adnak le a testüregbe (Fischer és Molnár 1992), egyes szerzők önálló coelomasejttípusként tárgyalják őket (Jamieson 1981).
1. ábra: Az Eisenia. fetida keresztmetszete hematoxilin-eozin kontrasztosítással. bw: bőrizomtömlő; dv: dorzális vérér; cc: testüreg; cns: központi idegrendszer; i: bélcsatorna ürege; ty: typhlosolis a centrális chloragogén szövettel; pc: perifériás chloragogen szövet.
2.1.1. Morfológiai jellegzetességek Cooper és Stein (1981) szerint a coelomasejtek morfológiájuk és eredetük szerint két sejtpopulációt alkotnak, ezek az amoebocyták (hyalin és granuláris) és az eleocyták. Az eleocyták - Cooper és Stein szerint ezek a sejtek azonosak a chloragogen sejtekkel – a chloragogen szövetből származnak, a bélcsatorna és a nagyobb erek külső felszínén helyezkednek el, endogén anyagok (glikogén, lipidek, pigmentek pl.: riboflavin) tárolására alkalmasak. A riboflavin-tartalom miatt egyes fajokban az eleocyta-típusú sejtek autofluoreszcenciát mutatnak (D. veneta, A. chlorotica, Dendrodrilus rubidus, E. fetida), ezzel ellentétben autofluoreszcencia nem jellemző a Lumbricus és Aporrectoda fajokban. Az egyes fajokban a coelomasejtek száma és az egyes sejttípusok aránya fajtól, évi ritmustól és környezeti hatásoktól is függ.
8
A. chlorotica
D. veneta
L. terrestris
Kurek és mtsai. 2007
Adamowitz 2005
Linthicum és mtsai. 1977
1. fő típus hyalin/agranuláris amoebocyta granulummentes citoplazma nagy pszeudopódiumok
amoebocyta fagoszómák, lizoszómák, mitokondriumok pszeudopódiumok
lymphocyta-szerű coelomasejt nagyméretű pszeudopódiumos bazofil coelomasejt lizoszómák fagocitózis invagináció a sejtmagon
2. fő típus granuláris amoebocyta denz granulumban gazdag citoplazma pszeudopódiumok
granulocyta ectoplazma organellummentes endoplazmában mitokondriumok, lizoszómák, szabad riboszómák, denz vakuólumok eleocyta endoplazma organellummentes ektoplazma: chloragosomák, mitokondriumok, egyéb denz granulumok
granulocyta-szerű coelomasejt acidofil granulocyta elektrondenz granulumok, vakuólumok változatos alakok pszeudopódium ritkán
3. fő típus eleocyta/chloragocyta chloragosomák glikogénszemcsék néhány pszeudopódium
eleocyta/chloragocyta számos pszeudopódium granulumok: lipid, protein, szénhidrát
Stein és Cooper 1978
neutrofil granulocyta
chloragocyta aggregálódnak ~ helyt ülő chloragocyta
maradványtesteket tartalmazó kisebb bazofil sejtek coelomasejtek átmeneti sejtek 1. táblázat: Az Oligochaeta gyűrűsférgek coelomasejtjei 9
Kurek és munkatársai (2007) az A. chlorotica fajban tanulmányozták a coelomasejtek morfológiáját (2. ábra). Három sejtpopulációt különböztettek meg fénymikroszkópos, pásztázó-,
és
transzmissziós-
elektronmikroszkópos
valamint
áramlási
citometriás
technikákkal. A hyalin (vagy más néven agranuláris) amoebocyták a coelomasejtek 30%-át képviselik, az élő sejtek áttetsző citoplazmájúak, nem fluoreszcensek, May-Grünwald-Giemsa festéssel sötét vagy világoskék agranuláris citoplazmával, ovális vagy bab alakú, sötétkék vagy ibolyaszínű sejtmaggal jellemezhetők. SEM képen a sejtmembrán kiterjedt pszeudopodiumokat képez, TEM preparátumokon pedig alacsony számban kisméretű granulumok láthatóak a citoplazmában. A granuláris amoebocyták a sejtek 8%-át teszik ki, citoplazmájuk áttetsző, hosszú vékony pszeudopodiumokkal rendelkeznek, nem mutatnak fluoreszcenciát, MGG festés során számos piros vagy sötétkék granulum látható a citoplazmában, a sejtmag ovális és sötétkékre festődik, a TEM preparátumokon nagy számban láthatunk elektrondenz granulumot a citoplazmában. A sejtek harmadik típusa az eleocyták vagy chloragocyták csoportja. Az élő sejtek nagy, sárgásbarna granulumokat tartalmaznak, amelyek autofluoreszcenciát mutatnak, MGG festéssel pedig alacsony mag/citoplazma arányt, nagy granulumokkal telített citoplazmát és kisméretű, kerek, sötétrózsaszínre festődő sejtmagot mutatnak. SEM vizsgálatokkal a sejtek felszínén rövid pszeudopodiumokat és labdaszerű
chloragoszómákat,
TEM
vizsgálatokkal
pedig
(chloragoszómák) és glikogén partikulumokat lehet kimutatni.
10
átlátszó
granulumokat
2. ábra: Az Allolobophora chlorotica coelomasejtjeinek fény- és elektronmikroszkópos fotói. hA: hyalin/agranuláris amoebocyta; gA: granuláris amoebocyta; E: eleocyta. Aránymérték: 5 µm. (Kurek és mtsai. 2007)
11
Adamowicz (2005) jellemezte a Dendrobaena veneta coelomasejtjeinek morfológiáját és ultrastruktúráját (3. ábra). Adamowicz szerint a sejtek eredete még nem világos, hiszen nehéz egyértelműen megállapítani, hogy bizonyos sejtek különböző fejlődési útvonalakat képviselnek vagy ugyanazon sejtvonal különböző fejlődési stádiumai. Ráadásul zavart keltett annak a nomenklatúrának a használata is, melyet Stein és munkatársai (1977) vezetett be a gerinces hematológia mintájára. Ezek után Adamowicz három sejttípust (eleocyta, amoebocyta, granulocyta), és azokon belül több alpopulációt nevezett meg, ahol az alpopulációk szerinte ugyanazon sejtvonal különböző állapotait jelentik. Az eleocyta sok különböző méretű ovális struktúrát tartalmaz a citoplazmájában, ezt a sejttípust a korábbi nevezéktanból chloragocytáknak nevezte el. A sejtek morula-szerű felszínnel rendelkeznek. A sejtek a szabad coelomasejtek 30%-át teszik ki, a mag/citoplazma arány alacsony, kisméretű kerek sejtmagjuk általában excentrikus elhelyezkedésű, kondenzált kromatint tartalmaz. A citoplazma homogén, organellummentes endoplazmára és heterogén ektoplazmára tagolódik. A sejtek nem képeznek pszeudopodiumokat, nagy tömegűek, kevésbé mobilisek és nehezen adherálódnak. A sejtek hasonlítanak a többi fajban leírt chloragocytákra, melyeket Stein és munkatársai (1977) I. típusú chloragocytának, Affar és munkatársai (1998) L. terrestris-ben és E. fetida-ban chloragocytának hívtak. A mikroszkópos vizsgálatok során a sejtek magját a chloragoszómák fedik el. A TEM vizsgálatok kimutatták, hogy a citoplazma elektrondenz organellumokat (granulumokat, mitokondriumokat) tartalmaz. Az amoebocyták általában aggregálódásra képesek. A sejtek 42%-át teszik ki. Ez a sejtcsoport a pszeudopodiumok és az ultrastruktúra alapján két altípusra osztható. Az I. típusú amoebocyta a II. típusú sejt fiatal alakja. A szerző erre a sejtek morfológiájából következtetett. A sejtek kisebbek, organellumokban szegényebbek, rövid lobopódiumokkal rendelkeznek. Sejtmagjuk nagy, ovális vagy konkáv, általában centrális helyzetű, kromatinja nem kondenzált. A citoplazma kevés, különböző denzitású lizoszómát, vakuólumot és vezikulát tartalmaz. A II. típusú amoebocyta szabálytalan alakú pszeudopodiumokat képez, amelyek a sejt egyik pólusára koncentrálódnak, nagy bab alakú magjában a kromatin nem kondenzált. A citoplazma általában a homogén ektoplazmára és a szemcsés endoplazmára oszlik. Az endoplazmában longitudinális mitokondriumok, szabad riboszómák, lizoszómák, és elektrondenz tartalmú fagoszómák találhatók. A sejtek fagocitotikus aktivitásra képesek, amelyre a pszeudopodiumok és a citoplazmában jelen lévő mikrofilamentumok is utalnak. A granulocyták számos karakterisztikus, elektrondenz, citoplazmatikus granulumot tartalmaznak, amelyeket a sejtek exocitózissal üríteni képesek. A coelomasejtek 28%-át teszik 12
ki, a sejtek magja kicsi, ovális, periférián helyezkedik el és alacsony denzitású kromatinnal rendelkezik. A citoplazma homogén, organellummentes ectoplasmára és organellumgazdag endoplasmára tagolódik, amelyben kevés ovális mitokondrium, lizoszómák, szabad riboszómák és különböző elektrondenzitású vakuólumok találhatók. A granulocyták nem hajlamosak aggregálódásra.
3. ábra: A Dendrobaena veneta coelomasejtjeinek transzmissziós elektronmikroszkópos fotói. (Adamowicz 2005) a: eleocyta; b: I. típusú amoebocyta; c: II. típusú amoebocyta; d: granulocyta. Jelmagyarázat: ch: chloragosoma; l: lizoszóma; v: vezikula; psp: pszeudopódium; enp: endoplasma; ecp: ectoplasma. Aránymérték: (a) 2 µm; (b-d) 1 µm.
13
Linthicum és munkatársai (1977) ultrastruktúrális vizsgálatokat végeztek L. terrestris coelomasejtjein, és négy sejttípust különböztettek meg (4. ábra). Ezek a lymphocyta-szerű, illetve a granulocyta-szerű coelomasejt, az eleocyta (Linthicum is a chloragogen sejttel azonosítja) és a maradványtesteket tartalmazó coelomasejt, ezeken a csoportokon belül pedig különböző fejlődési alakok figyelhetők meg. Linthicum a négy sejttípust a sejtek ultrastruktúrája alapján, az alsejttípusokat pedig fénymikroszkópos módszerekkel állapította meg. A lymphocyta-szerű coelomasejtek hasonlítanak az éretlen gerinces lymphocytákra, fénymikroszkópos vizsgálatokkal bazofil festődésűek. Két altípust különböztetett meg. Az I. altípus 4,5-7 μm átmérőjű, gömbölyű vagy ovális, sejtmagja 2,5-4 μm, centrális elhelyezkedésű, heterokromatinja főleg marginális. A magmembrán invaginációt mutat, a nucleolus feltűnő, kondenzált. A citoplazma kevés organellumot tartalmaz (kevés kisméretű mitokondrium, feltűnő Golgi apparátus, szabad riboszómák, rövid DER ciszternák), nagy vezikulumokat azonban nem találunk benne. A II.típusú sejtek nagyobbak (5-8,5 μm), sejtmagjuk szintén centrálisan található és morfológiailag hasonlít az előző sejttípus magjára. A citoplazma sok vakuólumot tartalmaz, amelyek valószínűleg másodlagos lizoszómák, bennük finoman granulált tartalom van vagy üresek. A mitokondriumok száma és a DER is hasonlít az I. típushoz. Ellentétben az I. sejttípussal, hosszú, keskeny pszeudopodiumokat képez, amelyből az következhet, hogy ezek a sejtek az érettebbek. A
második
nagy
sejtcsoport
a
granulocyta-szerű
coelomasejt,
amelynek
citoplazmájában elektrondenz granulumok találhatók. Ebben a csoportban is két altípust különböztettek meg, amelyek annyira különböznek egymástól, hogy valószínűleg nem ugyanannak a sejtvonalnak az alakjai. A I típusú sejtek nagyméretűek (9-15 μm), basofil festődésűek, sejtmagjuk nagy (6-7 μm), centrális helyzetű, benne kevés kondenzált kromatin található. Citoplazmájuk organellumgazdag endoplazmára és kevés organellumot tartalmazó ektoplazmára oszlik. Intracelluláris membránrendszere (DER, Golgi apparátus) kevés és fejletlen. Endoplazmában nagyszámú mikrofilamentum, kicsi (0,1-0,3 μm) sötét granulum és α és β glikogén-partikulum (amely aktív fagocitózis eredménye lehet) található. Az ektoplazma kevés granulumot és lekerekített, tompa végű pszeudopódiumot tartalmaz. A sejtek pszeudopódiumaik és mikrofilamentumaik miatt mobilisak. A II.típusú sejtek csillag alakúak, fénymikroszkópban basofilak, a sejttestjük 7-9 μm átmérőjű, a sejtmag excentrikus, invagináció gyakran látható a magmembránon, a mag perifériáján kondenzált kromatin található, látható a sejtmagvacska. A citoplazmában kevés DEG és Golgi apparátus és mérsékelt mennyiségű mitokondrium van, mikrofilamentumok nem látszanak. Kétféle 14
granulumot tartalmaz citoplazmájuk: (1) 0,1-0,3 μm átmérőjű kicsi, ovális granulumokat, amelyek hasonlítanak az előző típusú sejtek granulumaihoz, de jóval kevesebb van belőlük, és lizoszómára emlékeztet, valamint (2) nagyobb, 0,2-0,8 μm átmérőjű, kerek, világos, homogén tartalmú granulumokat, amelyek membránja nagyon szembetűnő, szekunder lizoszómára emlékeztet. A granulumok a citoplazmában mindenhol megtalálhatók, a pszeudopódiumok eredésénél pedig koncentráltabban vannak jelen. A citoplazma nem tagolódik ekto- és endoplazmára, perifériás részén glikogén szemcsék figyelhetők meg. A harmadik sejttípus az eleocyta, amelyet a szerző azonosnak vélt a chloragocytával. Ezek a legnagyobb coelomasejtek (18-25 μm), a chloragogen szövetből származnak, sok rövid pszeudopódiummal rendelkeznek. Sejtmagjuk heterokromatikus, a sejtmag/citoplazma arány 1:10, a citoplazmában DER és Golgi apparátus nincs vagy nagyon kevés, vezikulumok (glikogén) és granulumok nagy számban találhatók. A granulumok különböző méretűek és alakúak. A sejtek lipid, protein és szénhidrát tartalmú granulumaikat a coelomafolyadékba ürítik, amelyeket más coelomasejtek képesek fagocitózissal felvenni. Az eleocyták a granulocytákéhoz hasonló, kisméretű granulumokat nem tartalmaznak. A negyedik típusú sejt maradványtesteket tartalmaz a citoplazmájában. A denz testek tartalma ismeretlen. A sejtek méret 5-8 μm, gömbölyűek és fénymikroszkópban acidofil festődésűek. Éretlen és érett formák is fellelhetők. Az éretlen formák sok nagy, sötétszürke maradványtestet tartalmaznak, méretük változó, a citoplazmájuk finoman granulált, Golgi készülékük jól fejlett, DER ciszterna ritkán látható. A maradványtestek a Golgi komplex konvex felszíne mellett találhatók, és ha a citoplazma perifériájára kerülnek, nagyobbá és világosabbá válnak. Az érett alakokban a granulumok elektrondenzitása lecsökken, a granulumok a perifériás citoplazmarészekből kiürülnek, ezért ezekben a sejtalakokban sokkal kevesebb a granulum, üres vakuólumokat találunk bennük és a maradványtestek mindig a plazmamembránhoz közeli citoplazmarészekben vannak. Ezek a morfológiai jelek exocitózisra utalnak. A szerző az egyes sejttípusok alaki jellegzetességei alapján egy lehetséges fejlődési útvonalat feltételezett: eszerint az I. típusú lymphocyta-szerű coelomasejtek éretlen sejtalakok. Ezek a sejtek fokozatosan több lizoszómát halmoznak fel, amelyek denz granulumokként látszanak, illetve secunder fagoszómákat találhatunk bennük (világosabb granulumok), amelyek a fagocitózis eredményei. A sejtek pszeudopódiumokat növesztenek, és így már II. típusú lymphocyta-szerű coelomasejteknek tekinthetjük. Feltételezése szerint ezek a sejtek idegen anyagok hatására aktiválódnak, majd II típusú granulocyta-szerű
15
coelomasejtté alakulnak, amelyek sok granulummal, sok vakuolummal és bonyolult pszeudopodium-rendszerrel rendelkeznek.
4. ábra: A Lumbricus terrestris coelomasejtjeinek tipizálása Linthicum és munkatársai szerint (1977). a: I. típusú lymphocyta-szerű sejt; b: II. típusú lymphocyta-szerű sejt; c: I. típusú granulocyta-szerű sejt; d: II. típusú granulocyta-szerű sejt; e: eleocyta; f: maradványtesteket akkumuláló sejttípus. Jelmagyarázat: D: denz maradványtest; DG: denz granulum; EP: ectoplasma; EV: üres vezikula; G: Golgi apparátus; GG: glikogén; L: világos maradványtest; LG: közepesen denz granulum; M: mitochondrium; MF: mikrofilamentumok; MT: mikrotubulus;N: nucleus; NC: magmembrán invagináció; NO: nucleolus; PS: pszeudopódium; RER: durvafelszínű endoplazmatikus retikulum; V: vakuólum. 16
Stein és Cooper (1978) különböző citokémiai festések segítségével hét különböző sejtet különböztettek meg a földigiliszta (L. terrestris) coelomafolyadékában. Basofil sejteknek nevezték el a legnagyobb számban (63,5%) jelenlévő 5-30 μm átmérőjű, erősen basofil citoplazmájú sejteket, amelyeknek brómfenolkék festés során néha sötétkék 0,5 μm nagyságú granulumok találhatók a citoplazmájában. A kisebb sejtek gyér citoplazmával és a sejtmag körül keskeny szegéllyel rendelkeznek. A nagyobb sejtek citoplazmája gazdagabb, világosabb kékre festődik és átlátszó vakuólumokat találunk benne. A sejtek gyakran egymással összetapadnak és sejtaggregátumokat alkotnak, kisebb filopódiumokat vagy petaloid pszeudopódiumokat képeznek. A közepes és nagyobb méretű basofil sejtek felcsavarodott megnyúlást mutatnak. A sejtmagjuk kompakt, 4-8 μm átmérőjű, centrális vagy perifériás elhelyezkedésű, a kromatin kondenzált és sötétkékre festődik, a nucleolus nem látható ennél a festési eljárásnál. A sejtek 5-30 μm-esek, de a legtöbb 8-15 μm és ezek alkotják általában a sejtcsomókat is. Sok állatban találtak 100 μm átmérőjű sejteket is, de általában 30-60 μm-eseket, amelyek főleg a basofil sejtekre hasonlítanak, ezek közül a kisebbek (30-40 μm) nagy, átlátszó vakuólumokat tartalmaznak, amelyek vékony citoplazmahidakon keresztül anasztomizálnak. Ezeket a sejteket a szerzők nagy basofil sejteknek nevezték el. Acidofil sejtekként írták le azokat a sejteket, amelyek általában granuláltak, a sejtfelszínük hólyagos a granulumok miatt, amelyek PAS-reakció során rózsaszínűre illetve pirosra festődnek. Az egyik altípusban a granulumok nagy számban figyelhetők meg, 1-2 μm átmérőjűek, és kitöltik a sejteket. A sejtmag excentrikus elhelyezkedésű, 5-9 μm átmérőjű, lapos, sötétpirosra vagy ibolyára festődik, a nucleolus nem látható. A sejtek 10-30 μm átmérőjűek. A másik altípusba sorolt, 10-15 μm átmérőjű sejtekben a granulumok nagyobbak (2-4 μm), a sejtmag 6-8 μm átmérőjű, centrális vagy perifériás lokalizációjú, pirosas-ibolyásra festődik, benne a nucleolus nem látható. A granulocyta sejtcsoportba sorolt sejtekben a granulumok nagy változékonyságot mutatnak fejlődési tulajdonságukban és méretben is, ugyanis 0,5-2 μm átmérőjűek, brómfenol és Biebrich Scarlet basofil vagy acidofil festődést mutatnak, színük a specifikus kontrasztosítás után rózsaszín, lila és kék. A sejtfelszínen hólyagokat találunk. A sejtmag 6-8 μm, excentrikus, sötétlila, kondenzált kromatint tartalmaz. A neutrofil sejttípus 12-50 μm, a citoplazma gyengén kékre festődik, kicsi vagy közepes vakuólumokat tartalmaz, amelyekben baktériumot vagy chloragogént találhatunk. A citoplazma általában homogén, néha 1 μm világos granulumokat tartalmaz. A sejtmagja nagy
17
(8-10 μm), pirosra festődik, kevés heterokromatin látható benne. A sötétre festődő homogén kromatin között nem festődő területek találhatók. A nucleolus látható, kékre festődik. Az ötödik sejtcsoport a chloragogen sejt, amely elnevezés nagy, sok granulumot tartalmazó sejtet takar. A coelomasejtek közül a chloragogen sejt az egyetlen, amely nem aggregálódik. A szerzők két chloragogen-altípust különböztettek meg. Az egyik altípus 10-25 μm széles és 30-60 μm hosszú. A granulumok élénk kékre festődnek, kerek vagy ovális alakúak, 1-2 μm átmérőjűek és gyakran láthatók szabadon a coelomafolyadékban. A másik sejtaltípus gömbölyű, 12-20 μm átmérőjű, a granulumai szabálytalan alakúak, 0,5-2 μm átmérőjűek, sötétkék vagy ibolya festődésűek. Néha 4-6 sejt sejtcsomót alkot. A sejtmag perifériásan helyezkedik el. A chloragogen sejtek esetében a granulumok eltakarják a sejtmagot, ha a sejtmag azonban mégis látszik, akkor kicsi, rózsaszínre festődik és látható benne a nucleolus. A peritóneumról leszedve a hozzátapadt sejteket I. típusú chloragocytát mindig találtak, de II. típusút nem. Az utolsó sejttípus a sejtek 2 %-a, Stein átmeneti sejteknek nevezte el őket. Összetett kategóriának
tekinthető,
szinte
mindenféle
kombinációban
kétfajta
sejt
átmeneti
tulajdonságait mutatják. 2.1.2. A coelomasejtek eredete A gyűrűsférgek coelomasejtjeinek származása napjainkban még nem teljesen tisztázott. Négy teória (5. ábra) létezik a coelomasejtek eredetére vonatkozóan (Jamieson 1981): (i) Egyes szerzők szerint a sejtek coelomaüreg falát képező parietális lemezből vagy más néven somatopleurából származnak. A somatopleurából származó sejtek egy külön leukocyta-szerű sejtvonalat képeznek, melyre a granulált citoplazma jellemző. Egyes szerzők ezeket granulocytának hívják. A granuláris sejtek között pszeudopódiumokat képző illetve inkább transzport folyamatokat ellátó sejteket írtak le. (ii) Más szerzők szerint a splanchnopleura vagy viscerális lemez epitheliumának leváló sejtjeiből coelomasejtek differenciálódnak. A chloragogen sejtek szintén a viscerális epithelium származékai, emiatt többen a coelomasejteket leváló chloragogen sejteknek tartják. Ennek a sejtvonalnak a tagjaira fejlett Golgi apparátus, sok riboszóma jellemző. Ezen kívül megfigyelhetők olyan sejtalakok illetve sejttöredékek is a coelomafolyadékban, amelyek valószínűleg citoplazmalefűződéssel jöttek létre a chloragogen sejtekből, hasonlóan a gerinces vérlemezkék megakaryocytából történő leszakadásához. 18
(iii)A szelvények közötti dissepimentumok felületén szintén találunk peritoneális sejteket, amelyek a leváló coelomasejtek előalakjai lehetnek. (iv) A középbél területén lévő nagyobb erek külső felszínén szintén chloragogént találunk, de a chloragogen sejtek között elszórtan kisméretű világos citoplazmájú és nagy sejtmagvú hyaloblastokat is találunk, melyek hyalocyták, hyalin típusú coelomasejtek előalakjai lehetnek. Ezen sejtvonalra az agranuláris citoplazma, gyakori autofagoszóma és intenzív fagocitózis jellemző.
5. ábra: A coelomasejtek fejlődésének feltételezett útvonalai Valembois (1971) szerint. A-C: somatopleurából származó granuláris sejtfejlődési vonal; D-E: hyalin típusú sejtek fejlődési alakjai. Jelmagyarázat: av: autofág vakuólum; g: Golgi apparátus; ger: durvafelszínű endoplazmatikus retikulum; gl: glikogén; mf: microfibrillumok; ph: fagoszóma; r: szabad riboszómák; sg: specifikus granulumok;
19
2.1.3. A coelomasejtek funkciói (i) A giliszták coelomafolyadéka a hidrosztatikai váz része, részt vesz a belső és a külső környezet kommunikációjában, fontos szerepet tölt be a homeosztázis fenntartásában és mindemellett az immunkompetens coelomasejteket tartalmazza. Az amoebocyták képesek felismerni és eliminálni az idegen anyagokat (Jamieson 1981), fagocitózisra (Stein és mtsai. 1977; Cooper 1996, 2001; Kauschke és mtsai. 2001), enkapszulációra képesek (Valembois és mtsai. 1992; Cooper és mtsai. 2002), részt vesznek a véralvadásban, a gyulladásos folyamatokban, a graft rejekcióban, a granuloma formálásában (Field és mtsai. 2004) és a coelomafolyadék koagulációjában (Koenig és mtsai. 2003). Több szerző szerint (Stein és munkatársai 1977; Engelmann és mtsai. 2005) egyes coelomasejtek képesek fagocitózisra, kivételt képeznek ez alól a chloragogen sejtek. Az acidofil sejtek és a granulocyták kevésbé, a basofil és neutrofil coelomasejtek rendkívül intenzíven fagocitálnak. Az
immunválasz
kialakításában
betöltött
szerepükkel
részletesebben
később
foglalkozunk. (ii) Egyes gyűrűsféreg fajok nagymértékű regenerációra képesek, és ebben nagy jelentőséget tulajdonítanak a coelomasejteknek (Herlant-Meewis 1965; Liebmann 1942b). Az állat sérülésekor
vazokonstrikció,
coelomasejt-akkumuláció,
sebdugó-képzés
és
izomösszehúzódás megy rögtön végbe. A sebgyógyulás az amoebocyták migrációjával jár, ezek aggregálódnak és dugót képeznek, amely a további folyadékvesztést megakadályozza (Lemmi és Cooper 1981; Bilej és mtsai. 1995). Liebmann (1942b) szerint a chloragogen szövet sejtjei exkréciós és raktározó funkciót látnak el, továbbá egyes coelomasejtek (amoebocyták, eleocyták) a regenerációban is szerepet játszanak. Szerinte a chloragogén sejtek különböző anyagokat vesznek fel a vérből, azokat a chloragosomákban raktározzák, és ezután, ha szükséges, a coelomafolyadékba ürítik, amelyek tartalmát az amoebocyták veszik fel. Ezt később a metanephridiumba ürítik, és így eliminálják a szervezetből. Kutatásai azt igazolták, hogy a chloragoszómákban találhatók urátok, guanin, kitin, glikogén, fehérjék és zsírok, és a chloragogen sejtekben intenzív lipidtermelés folyik. A chloragogen szövetből felszabaduló szabadon úszó coelomasejteket eleocytáknak nevezte. Részletesen
vizsgálta
fénymikroszkóppal
a
giliszták
caudális
regenerációjának
folyamatát. A kutató kimutatásai szerint a sérülés után 3 órával megnő az eleocyták 20
száma a sebhez közeli szelvényekben. 9 órával a sérülés után a sejtekben egyesülnek a zsírcseppek és kilökődnek. Ezután a legtöbb sejt szétesik. Az eleocyták funkciója Liebmann szerint a nutritív anyagok kibocsátása, valamint az, hogy sérülés után az amoebocytákkal aggregálódva, megakadályozzák a coelomafolyadék-veszteséget és elzárják a sebet. A sérülés utáni heg felépítését is vizsgálta a coelomasejtek szempontjából. Egyrészt maga a forradás vagy heg amoebocytákból áll, amelyek citoplazmája sok zsírgranulumot tartalmaz. Ez alatt a zárt felső réteg alatt pedig eleocytákból álló lazább réteg alakul ki. A sérülést követő 4-5 nappal a craniálisabb szelvényekből is eleocyták migrálnak a vágás közelébe és ott feldúsulnak. Szerinte az eleocyták kisebb része epitheloid sejtekké transzformálódik, valamint zsírgranulumokat bocsájt ki, amelyek szükségesek a heg záródásához. Ezen kívül az eleocyták által szállított nutritív anyagok részt vesznek az új szövetek felépítésében is. (iii) A coelomasejtek fontos szerepet játszhatnak trofikus faktorok, hormonok, bioaktív anyagok szállításában is. Egyrészt a korábban említett regenerációs folyamatokban, ahol nutritív anyagokat a sérülés helyére szállítanak, illetve azokat kiürítve elősegítik a sebgyógyulás és a regeneráció folyamatát (Liebmann 1942b). Másrészt intakt állatok anyagcsere-folyamataiban is fontos szerepet játszhatnak, hiszen TSH és TSH-receptor immunreaktív sejteket találtak a coelomasejtek között (Wilhelm és mtsai. 2006). Eszerint a sejtek a termelődés helyéről hormonszerű anyagokat szállíthatnak a perifériás szövetekhez, ezzel elősegítve a homeosztázis szabályozását, a perifériás szövetek esetleges szekrécióját vagy éppen az emésztés folyamatát. Mindezen szállító és trofikus funkciót főként a granuláris típusú sejteknek tulajdonítják. (iv) Egyes szerzők (Liebmann 1942a; Jamieson 1981) feltételezése szerint az eleocyták fontos szerepet játszanak a gyűrűsférgek ivarsejtképzésében is, illetve az embrionális fejlődésben. Eszerint az eleocyták granulumaikkal tápanyagot (lipideket, fehérjéket, glikogént) biztosítanak a testüregben megtalálható ivarszerveknek, miközben azok a petesejtek és a hímivarsejtek termelését végzik. Ezen kívül a coelomasejtek, főként az eleocyták granulumaik tartalmát a coconfolyadékban is megtalálhatjuk, és mint nutritív anyagok, segítik az embriók fejlődését.
2.2. A gyűrűsférgek immunrendszere A kevéssertéjű gyűrűsférgek saját immunrendszere már nem csak celluláris, hanem elsőként a törzsfejlődés során humorális immunválaszra is képes (Bilej és mtsai. 2000). Az 21
oligochaeta gyűrűsférgek coelomaüregében található coelomafolyadék leukocyta-szerű sejteket tartalmaz. A sejtek morfológiai és funkcionális szempontból is analógiát mutatnak a gerincesek fehérvérsejtjeivel, és képesek in vivo illetve in vitro opszonizációra, fagocitózisra (Stein és mtsai. 1977), enkapszulációra (Valembois és mtsai. 1992), gyulladásos folyamatok megindítására, agglutinációra, allograft és xenograft elpusztítására és eliminálására (Hostetter és Cooper 1972). A celluláris immunválasz ebben a rendszertani csoportban is főként fagocitózisban és idegen sejtet felismerő folyamatokban nyilvánul meg (Stein és mtsai. 1977; Stein és Cooper 1981). A celluláris immunválasz során az idegen anyag illetve sejt (akár prokarióta, akár eukarióta) eliminálása három lépésben történik. Elsőként az effektor coelomasejtek a célsejtek membránjához tapadnak, ezután egy másik, általában kisebb méretű sejtekből álló sejtcsoport a célsejteket elpusztítja. Utolsó lépésként nagyméretű coelomasejtek az elpusztított idegen sejtek maradványait fagocitálják, illetve ún. brown body-k képzését kezdik meg, ezzel a coelomaüregből eliminálják az idegen sejteket (Valembois és mtsai. 1992; Cossarizza és mtsai. 1996). A giliszták coelomasejtjeinek fagocitotikus és citotoxikus képessége nem egyegy bizonyos sejtcsoportra jellemző. Egyes sejtek emlős sejtfelszíni markereket (pl. CD11a, CD45RA,
CD45RO,
β2-mikroglobulin)
felismerő
monoklonális
ellenanyagokkal
keresztreakciót mutatnak (Cooper és mtsai. 2006), de ezek egy része fagocitózisra is képes. Emiatt azt mondhatjuk, hogy a gyűrűsférgek coelomasejtjei, ellentétben a gerincesek fehérvérsejtjeivel, multifunkcionálisak, nem kizárólagosan egy immunválaszbeli lépés elvégzésére képes specifikus sejtek. A humorális immunválasz többek között lizozim (Lassalle és mtsai. 1988), agglutinin (Stein és Cooper 1988), fenoloxidázok/peroxidázok (Valembois és mtsai. 1991) szintézisével és szekréciójával zajlik (Jarosz és Glinski 1997; Cooper és mtsai. 1974). Ezeken kívül E. fetida-ban írták le elsőként a fetidin nevű lítikus faktort (Roch és mtsai. 1981; Milochau és mtsai. 1997). Néhány fontosabbnak tartott antimikrobiális faktor: fetidin, coeloma citolitikus faktor (CCF), eiseniapore, lysenin, Lumbricin, hemolysin, szerin proteáz inhibitor és ezek izoformái (2. táblázat). A Lumbricin I. kivételével ezek a molekulák nagyobb méretűek, mint a D. melanogaster-ben illetve rovarokban leírt antimikrobiális aktivitású molekulák (pl. drosomycin, metchnikowin, drosocin) (Hetru és mtsai. 2003). A citolítikus faktorok rövid összefoglaló jellemzését a 2. táblázat tartalmazza.
22
Molekula neve Fetidinek fetidin 1 (négy izoforma) fetidin 2 (monomorf)
Hatásmechanizmus, funkció sphingomyelinhez kötődnek,
Molekulasúly
40 kDa
hemolítikus, pórust képeznek a 45 kDa membránon, bakteriosztatikus,
Előfordulás, expresszió helye coelomafolyadék, chloragogen sejtek,
Referencia Valembois és mtsai. 1982, 1988;
Roch és pathogen mtsai. 1989 baktériumok beinjektálása után nő a mennyisége
részt vesznek az agglutinációban, a vérzéscsillapításban, az opszonizációban Coeloma citolitikus factor (CCF)
opszonizáció daganatos lízise
42 kDa sejtek
coelomafolyadék coelomasejtek
mintázat felismerő molekula Lysenin (három izoforma)
patkányban simaizom összehúzódást serkenti
41 kDa
coelomafolyadék coelomasejtek chloragogen sejtek
Bilej és mtsai. 1995; Beschin és mtsai. 1998
Sekizawa és mtsai. 1997; Yamaji és mtsai. 1998
sphingomyelinhez kötődik Eiseniapore (EP)
sphingomyelinhez kötődik pórust képez membránokon
Lumbricin I
antimikrobiális hatás
Hemolysinek hemolízis (H1, H2, H3) citotoxicitás Szerin serkentése proteáz inhibitor (SPI)
38 kDa
coelomafolyadék és/vagy coelomasejtek
Lange és mtsai. 1997
7,2 kDa
egész állatban
46, 43, 40 kDa
egész állatban
14 kDa
egész állatban
Cho és mtsai. 1998 Eue és mtsai. 1998 Roch és mtsai. 1998
a
2. táblázat: Antimikrobiális és citolítikus hatású proteinek listája és tulajdonságaik E. fetidaban
23
A gyűrűsférgek immunrendszeréről elmondható, hogy bonyolult celluláris és humorális folyamatok összetett rendszere, amelynek nagy része a coelomafolyadékban található faktorok és a coelomasejtek által termelt molekulák által szabályozott lépésekből áll, és a működése során fontos szerepet tölt be a coelomasejtek fagocitotikus és citotoxikus képessége. Az immunreakciók feltételezett kaszkád-szerű mechanizmusa külső behatásra (baktérium, gomba, daganatos sejtvonal) indul meg, amelynek pontos feltárása még nem történt meg. Az immunválasz kialakításában többek között részt vesznek olyan molekulák, mint a lizozim, a fetidinek, a szerin proteáz enzimek és azok gátló faktorai, a CCF, az EP, illetve a lysenin. A feltételezett reakciósorozatot a 6. ábra mutatja.
6. ábra: Az Eisenia fetida külső stimulus hatására bekövetkező immunfolyamatainak feltételezett kaszkád-szerű szabályozása (Beschin és mtsai. nyomán, 2002).
2.3. Citotoxicitás Bizonyos gerinctelenek képesek spontán elpusztítani különböző célsejteket anélkül, hogy olyan klón-specifikus immunsejtekkel rendelkeznének, mint a citotoxikus T lymphocyták (Tyson és Jenkin 1974; Decker és mtsai. 1981; Söderhäll és mtsai. 1985; Luquet és Leclerc 1983; Franceschi és mtsai. 1991; Suzuki és Cooper 1995a, b). Mindez arra utal, hogy NK-szerű aktivitással rendelkeznek. Több irodalmi adat utal arra, hogy a gyűrűsférgek 24
immunrendszere képes xeno- és allogén coelomasejt kultúrákat illetve emlős daganatos sejtvonalakat eliminálni. Cooper és munkatársai (1995) K562 (erythromyeloid human tumor) sejtvonalat alkalmaztak ennek vizsgálatára. Eredményeik azt mutatták, hogy a coelomasejtek és a tumor sejtvonal sejtjeinek 10 perces inkubációját követően a daganatos sejtek jelentős pusztulásnak indultak in vitro. A coelomasejtek közül a kisebb méretű elektrondenz populáció képes felismerni, megkötni és elpusztítani az idegen sejteket, hasonlóan a gerinces natural killer (NK) sejtekhez. A sejtek pszeudopódiumokat használnak és kapcsolatot alakítanak ki a target sejt membránjával. Ezután pedig a nagyobb méretű, kevésbé elektrondenz coelomasejtek végzik az elpusztított sejtmaradványok fagocitózisát. A gyűrűsférgek az NK sejtekre
jellemző
sejtfelszíni
molekulákkal
csak
részben
rendelkeznek,
hiszen
immunglobulinok, Fc receptorok hiányoznak, azonban Thy-1 (CD90) (Mansour és mtsai. 1985; Saad és Cooper 1990), β2 mikroglobulin (Shalev és mtsai. 1981; Roch és mtsai. 1983) illetve Lyt (Negm és mtsai. 1991, 1992) található a gerinctelenek immunsejtjeinek felszínén. Az említett sejtfelszíni molekulák képesek a nem saját struktúrák felismerésére, és aktiválni olyan sejtszintű folyamatokat, amelyek az idegen struktúrák, sejtek elpusztításához vezetnek. Ezen
folyamatok
alatt
a
perforin
és
egyéb
hemolitikus
pórusképző
molekulák
hatásmechanizmusait értjük. Engelmann és munkacsoportja (2004) szerint E. fetida coelomafolyadéka illetve a coelomasejtekből készült lizátum is képes elpusztítani daganatos (HeLa, HEp-2) és fibroblast (PA317) sejtvonalakat. Ebben a munkában arra alapoztak a szerzők, hogy a giliszta coelomafolyadéka számos antibakteriális anyagot, citotoxikus proteint és citokineket tartalmaz. Azt azonban, hogy ezek a hatóanyagok a coelomasejtek által termelt molekulák, még nem bizonyították korábbi munkák. Ebben a kísérletsorozatban az emlős daganatos sejtvonalakat sejtmentes coelomafolyadékkal, coelomasejtekkel, illetve coelomasejtekből készült homogenizátummal kezelték. Arra a következtetésre jutottak, hogy a citotoxicitásért felelős proteinek, amelyeket a coelomafolyadékból azonosítottak, nagy valószínűséggel a coelomasejtek termékei. Kobayashi és munkacsoportja (2001) a coelomasejtek citotoxikus hatását vizsgálta gerinces és gerinctelen célsejtekkel szemben. Azt tapasztalta, hogy a coelomafolyadék toxikus hatást fejtett ki gerinces sejteken, gerincteleneken azonban gyengébben vagy nem fejtett ki hatást. Arra a korábbi megállapításra alapozva, miszerint a (1) coelomafolyadékban található lysenin specifikusan sphingomyelinhez kötődve éri el membránkárosító hatását, (2) sphingomyelin pedig nincs vagy kevés található a gerincesek membránjában, a
25
coelomafolyadék citotoxikus hatásáért olyan molekula/molekulák felelősek, amelyek a sphingomyelint használják támadáspontként. Az elektromosan nem gerjeszthető sejtek működésében a citoplazmába való kálciumbeáramlás (Ca2+ influx) részt vesz olyan folyamatok szabályozásában, mint az exocitózis, enzim-kontroll, génexpresszió-szabályozás, sejtnövekedés, sejtproliferáció és az apoptózis. A Ca2+ influx folyamata során a plazmamembrán, a mitokondriumok, és - a legfontosabb,
intracelluláris
kálciumraktár
-
az
endoplazmatikus
retikulum
kálciumcsatornáinak megnyílásával következik be. A Ca2+ influx legfőbb útvonala ezekben a sejtekben az intracelluláris kálciumraktárak citoplazmába ürítése (Parekh 2003). A biomembránok elszórtan olyan elkülöníthető területekkel rendelkeznek, amelyek sphingolipidekben illetve koleszterinben gazdag szigetekként jelennek meg a membránban (lipid raftok). Ezeknek a membránszakaszoknak a tanulmányozása még nehézségekbe ütközik, ugyanis a megismeréshez szükséges technikai feltételek még csak részben adottak. Az már ismert azonban, hogy olyan molekulák, mint a kolera toxin vagy a gyűrűsférgekben azonosított
lysenin
olyan
specifikus
membránszakaszokat
ismernek
fel,
amelyek
sphingolipidben gazdagok. A lysenin sphingomyelinhez kötődése következtében lysenin molekulák oligomerizációja következik be, ami pedig a célsejt membránján pórusképződési folyamatot indít el. A sphingomyelin-megkötés indukálta Ca2+ influx jelet és ERK foszforilációt lyseninkezelt Jurkat T sejteken (leukémiás sejtvonal) tanulmányozták (Kiyokawa és mtsai. 2005).
2.4. A gyűrűsférgek regenerációja A giliszták életmódjából következik, hogy gyakran éri az állatokat sérülés, ennek következtében anterior vagy posterior szelvényeket veszítenek. Herlant-Meewis (1965) szerint a giliszták regenerációjának módja és sikeressége az amputáció anatómiai helyétől függ. A farki regeneráció során, amikor a szelvények eltávolítása a nyerget követő testrészekben történt, a műtétet követően sebgyógyulás és regenerációs blastema kialakulása következett be. Az újra képződő szelvények ebből a regenerációs blastemából képződnek. A regenerációs blastema eredete ma még nem teljesen ismert. Találhatók benne (i) myoblastok, amelyek a dedifferenciálódó bőrizomtömlő és bélcsatorna izomzatából származnak, (ii) bélcsatorna-hámsejtek és (iii) a coelomafolyadékban szabadon úszó mezodermális eredetű neoblastok és coelomasejtek, melyek a sérülés helyére vándorolnak (Jamieson 1981).
26
Több kutató felvetette, hogy a regeneráció során a sértett szövetek felszínén megtapadó coelomasejtek egyes típusai dedifferenciálódnak és más szöveti sejtekké (izom- és idegszövet) alakulnak át (Herlant-Meewis 1965; Jamieson 1981). Napjainkban általánosan elfogadott elmélet, hogy a giliszták mezodermális eredetű őssejtjei, az ún. neoblastok valamint a coelomasejtek a különböző sértett területekre vándorolnak. A neoblastok jellemzően kisméretű basofil sejtek, amelyeknek feltűnően nagy sejtmagját keskeny citoplazmaszegély veszi körül (Herlant-Meewis 1965, Jamieson 1981). A blastema kialakulásának sejtszintű háttere még nem teljesen ismert, de a hasdúclánc ganglionjának jelenléte mindenképp szükséges a szelvények regenerációjához. A hasdúclánc ganglionjának eltávolítása a sértett szelvényekből késlelteti az új farki szelvény kialakulását (Herlant-Meewis 1965). Ezen kívül a kutatók megállapították, hogy a gyűrűsférgek központi idegrendszere nemcsak mediálja a regenerációs folyamatokat, hanem maga is képes sérülést követő regenerációra (Herlant-Meewis 1965, Jamieson 1981).
2.5. Neuroimmun kölcsönhatások Egyre több kísérleti adat bizonyítja, hogy az ideg- és az immunrendszer különböző kémiai anyagok (citokinek, neuropeptidek) átadásával képes kommunikálni egymással. Ezen kívül számos ún. neurotranszmitter-szerű neuropeptid rendelkezik endogén hírvivő funkcióval az immunrendszerben, és részt vesz az immunválasz egyes komponenseinek a szabályozásában.
Minden
szervezet
rendelkezik
valamilyen
szintű
homeosztázis-
szabályozással, amely folyamatban bioaktív molekulák – többek között - antibakteriális peptidek vesznek részt. Az antibakteriális peptidek jelenléte a gerinctelen és a gerinces proenkefalin neuropeptid prekurzorokban (enkelytin, peptid B) azt a hipotézist támasztja alá, hogy néhány neuropeptid prekurzor részt vesz az immunválasz kialakulásában. Az ezekben a prekurzorokban megtalálható peptidek magas antibakteriális aktivitásukkal további opioid peptidekkel asszociálva immunkapcsolt kölcsönhatásokban vesznek részt (Salzet 2001). Napjainkban már sok neuropeptid ismert, amelyek fontos szerepet játszanak az egysejtű és
többsejtű
élőlények
életműködéseiben.
Egyes
neuropeptidek,
úgymint
az
oxitocin/vazopresszin, az angiotenzin aminosav-szekvenciája hasonló a gerincesekben és a gerinctelenekben, ami pedig arra enged következtetni, hogy ezen peptidek korai megjelenésűek, és konzervatívak az evolúció folyamatában. Ezek a peptidek már korábban megjelentek, mint az idegrendszer, ami azt sugallja, hogy az elsők között voltak az
27
intercelluláris kommunikációs folyamatokban. Ezek a peptidek kisszámú csoportot alkotnak, amelyeket ősi gének kódolnak (Salzet 2000). A neuropeptidek megtalálhatók a gyűrűsférgek központi idegrendszerében és az immunrendszerben is. Amióta ezeket a molekulákat megtalálták szabadon a vérben, hormonként is számon tartják őket (Lefebvre és Salzet 2003). A hormonális folyamatok enzimatikus szabályozása hasonló a gyűrűsférgekben és a gerincesekben. Ezen kívül az annelidákban szintetizálódó prekurzor génproduktumok aminosav-szekvenciája nagyban hasonlít az emlősökben termelődő, hasonló funkciót ellátó saját peptidek aminosavszekvenciájára. A gyűrűsférgekben, illetve a gerinctelenekben már specifikus neuropeptideket is azonosítottak. Salzet (2001) olyan peptidekkel foglalkozott gyűrűsférgekben, amelyek az opioid proopiomelanocortin prekurzorból származnak (opiátok, endocannabinoidok). Ezek a peptidek nagyon erős immunszuppresszor hatással bírnak és az endokrin- és immunrendszer közti kommunikáció modellmolekulái. Paraziták ezeket az immunszuppresszor molekulákat használják fel a gazdaszervezetben (Salzet 2000). A gyűrűsférgek központi idegrendszerében (agydúc, hasdúclánc) olyan neuroszekréciós sejteket
találunk,
amelyek
emlős-szerű
neuroendokrin
szignálmolekulákat
expresszálnak/raktároznak (3. táblázat). A sejtek neuroszekréciós tulajdonságaiknak köszönhetően főként a vérbe adják le szekrétumaikat. Ezek a neuropeptidek megtalálhatók az idegrendszeren kívül a gyűrűsférgek vérében, egyes célszövetekben és az immunsejtekben is. Szerepük a mai napig nem teljesen tisztázott. Főként regenerációs és szaporodási folyamatokban résztvevő hormonokat, faktorokat termelnek (Aros és Vígh 1959; Laverack 1964). Ezen kívül pedig azonosítottak egy specifikusan annelidákra jellemző negyedik peptidcsoport, a myotropikus peptideket (Oumi és mtsai. 1995). A táblázatban felsorolt peptidek emlősökben főként mint neurohormonok játszanak szerepet különböző folyamatok szabályozásában. Felvetődik a kérdés, hogy a gyűrűsférgek és a gerincesek neuroendokrin jelátviteli molekulái mennyire hasonlítanak. Körülbelül 30 neuropeptidet izoláltak már gyűrűsférgekből, amelyek nagy részét már korábban azonosították gerincesekben.
28
Neuropeptid
Referencia
Angiotenzin
Salzet és mtsai. 1992
Annelid gut tetradecapeptide
Oumi és mtsai. 1996
Annetocin (Oxitocin-szerű hormon)
Oumi és mtsai. 1996
Bombesin
Falugi és Davoli 1993
CAPA peptidek
Herbert és mtsai. 2009
Cholecystokinin
Reglődi és mtsai. 1999
Corticotropin-releasing factor
Lkhider és mtsai. 1987
FMRFamide
Falugi és Davoli 1993
Gastrin
Reglődi és mtsai. 1999
Opioidok
Renzelli-Chain és Kaloustian 1995
PACAP
Somogyvári-Vigh és mtsai. 2000
Pancreatic polypeptide
Sundler és mtsai. 1977
Proctolin
Lengvári és mtsai. 1994
Somatostatin
Falugi és Davoli 1993
Substance P
Falugi és Davoli 1993
Vasoactive intestinal peptide (VIP)
Sundler és mtsai. 1977
3. táblázat: Neuropeptidek a gyűrűsférgek 2006 idegrendszerében.
A fent említett neuropeptidek közül kiemelt fontosságú a PACAP (pituitary adenylate cyclase-activating peptide), amely az irodalmak szerint többek között neurotrofikus és neuroprotektív hatással is rendelkezik. A PACAP egy 38 aminosavból álló neuropeptid (PACAP38), amelyet eredetileg birka hipothalamusában írtak le. Serkenti a ciklikus AMP (cAMP) termelést a patkány adenohipofízisben, és ezáltal fokozza annak növekedési hormon, prolaktin, corticotropin és sárgatestserkentő hormon termelését fokozza (Miyata és mtsai. 1989). Később izoláltak egy 27 aminosavból álló peptidet is, melynek aminosavsorrendje megegyezett a PACAP38 N-terminális első 27 aminosav-szekvenciájával (Miyata és mtsai. 1989; Arimura és mtsai. 1991). A PACAP izoformák, amelyeknek közös receptoruk van a VIP-pel, két receptortípushoz kötődnek. Az I. típusú receptort (PAC1) először exokrin pancreas sejtjeiből izolálták (Buscali és mtsai. 1990). Molekulasúlya 55 és 65 kDa közötti a glikoziláltsági állapottól és az expresszálódó izoformáktól függően. Közel 500 aminosavból és 7 transzmembrán domén áll, a PACAP27 és 38 izoformák nagyobb affinitással kapcsolódnak ehhez a receptorhoz, mint a 29
VIP. Splice-variánsai közül már több ismert (pl.: S, Hip-Hop, Vs, TM4). A jelátviteli mechanizmusok közül jellemzően stimulálja az adenilát cikláz, a PLC útvonalat és mobilizálja a kálciumraktárakat (Vaudry és mtsai. 2000). Ezen kívül pedig számos eredmény számol be arról, hogy a PACAP-nak növekedési faktor-szerű hatása lehet az idegrendszer fejlődésében és a sérülést követő regenerációban (Vaudry és mtsai. 2000; Waschek 2002). Kimutatták, hogy a PACAP szabályozza az axonfejlődést (Guirland és mtsai. 2003), illetve elősegíti az axonális regenerációt a sérülések helyén (Kimura és mtsai. 2003). A PACAP hatása a gerincesek embrionális neurogenezisben (Sherwood és mtsai. 2007; Waschek 2002), illetve a perifériás idegrendszer regenerációjában már korábban ismertté vált (Meyer 2006). A neurotrofikus hatáson túl, exogén PACAP in vitro toxicitás és in vivo agyi pathológiás modellekben elért protektív hatását vizsgálták (Somogyvári-Vigh és Reglődi 2004). Más szerzők a PACAP protektív hatását vizsgálták apoptózist indukáló tényezőkkel szemben kisagyi szemcsesejtekben (Vaudry és mtsai. 2003), valamint kimutatták, hogy a PACAP csökkenti a károsodást és javítja a funkcionális eredményeket Parkinson-kóros modellekben (Reglődi és mtsai. 2004). Az idegrendszerben feltehetően léteznek olyan védelmi mechanizmusok, amelyek helyreállítják a kisebb sérüléseket és indukálják az idegi javító mechanizmusokat, és ebben a működésben valószínűleg fontos szerepet játszik a PACAP. Az E. fetida szervezetében már tanulmányozták ezeknek a molekuláknak az eloszlását, főként az idegrendszeri struktúrákban (Molnár és mtsai. 2006). A vizsgált peptideknek a gerinces állatcsoportokban számos funkciót tulajdonítanak, úgymint a vazoreguláció vagy a cirkadián ritmus szabályozása (Colwell és mtsai. 2004). Több kutatócsoport foglalkozik a PACAP szerepével a gerincesek immunfolyamataiban. Hízósejtekben a PACAP stimulálja a hisztamin és a szerotonin termelését, amely arra enged következtetni, hogy a molekula valószínűleg befolyásolja a gyulladásos folyamatok szabályozását (Mori és mtsai. 1994; Seebeck és mtsai. 1998). Makrofágokban a PACAP gátolja az IL-6, az IL-2 és a TNF-α, emellett pedig serkenti az IL-10 termelődését. Mindez arra a következtetésre ad lehetőséget, hogy a PACAP és agonistái gátolják a proinflammatórikus és serkentik az anti-inflammatórikus folyamatokat, vagyis lassítják a gyulladásos folyamatokat (Delgado és mtsai. 1998; Martinez és mtsai. 1998).
30
3. Célkitűzések Napjainkban a trágyagiliszta a toxikológiai, regenerációs, immunbiológiai
vizsgálatoknak
egyaránt
kedvelt
tesztállata.
neurobiológiai és
Ennek
oka,
hogy
laboratóriumban természetes életkörülményei könnyen biztosíthatóak és gyorsan szaporodik. A manapság alkalmazott mikrotechnikai és biokémiai módszerek ennél a fajnál viszonylag könnyen kivitelezhetőek. Ezen okok miatt választottuk modellállatként az E. fetida (Annelida, Oligochaeta) kifejlett egyedeit. Az oligochaeták immunkompetens sejtjei a másodlagos testüregben megtalálható coelomasejtek. Ezen sejtek pontosabb megismerése érdekében vizsgálatainkat három szempont szerint végeztük: 1. A coelomasejtek morfológiájának, citológiájának tanulmányozása,
az
egyes
sejttípusok elkülönítése, esetleges új sejtalakok leírása. A kevéssertéjű gyűrűsférgek más fajaiban (D. veneta; A. chlorotica; L. terrestris) már korábban történt ilyen jellegű vizsgálat. A tesztállatunk egyéb területeken való gyakori alkalmazása miatt fontosnak tartottuk a faj coelomasejtjeinek részletes tipizálását, hisztológiai, hisztokémiai és ultrastruktúrális leírását. 2. A coelomasejtek funkciójára vonatkozó egyre bővülő ismereteinket szerettük volna kiegészíteni a sejtek regenerációban és citotoxikus folyamatokban betöltött szerepével. a) A gyűrűsférgek nagyfokú regenerációs képessége ma is kedvelt kutatási célpont. Kísérleteink során egy korábban már gerincesekben bizonyítottan neuroprotektív hatással rendelkező anyag – a hipofízis adenilát cikláz aktiváló peptid (PACAP) - szerepét vizsgáltuk E. fetida caudális regenerációjában. Ezen belül vizsgálni kívántuk az egyes coelomasejtek PACAP és specifikus receptora- a PAC1 - expressziójának mintázatát, a PAC1-szerű peptid ultrastruktúrális megjelenését és molekuláris biológiai jellegzetességeit, valamint a PACAP-szerű peptidek koncentrációváltozását a coelomasejtekben a regeneráció során. b) A coelomasejtek immunreakciókban betöltött szerepének tisztázása érdekében vizsgálni kívántuk a sejtek fagocitotikus képességét, amelyet vizsgáltak már korábban más fajokban. Korábbi ismereteink szerint a coelomasejtekből készült homogenizátum citotoxikus hatást vált ki egyes sejtvonalakon, ezért
31
coelomasejtek homogenizátumával való inkubálás hatását vizsgáltuk daganatos sejtvonalon transzmissziós elektronmikroszkópos módszerrel és intracelluláris kálcium ion koncentráció-meghatározással. 3. A kevéssertéjűek coelomasejtjeinek származására vonatkozóan számos teóriát találunk a szakirodalomban. Ez alapján a sejtek származhatnak a somatopleurából, illetve a splanchnopleurális eredetű chloragogen szövetből. Ennek tisztázása érdekében ultrastruktúrális vizsgálatokat kívántunk végezni.
32
4. Anyagok és módszerek 4.1. A kísérleti állatok tartása Kísérleteink során ivarérett trágyagiliszta (Eisenia fetida, Oligochaeta, Annelida) egyedeket használtunk fel. Az állatokat a Pécsi Tudományegyetem Általános Állattani Tanszékén 1985-óta fenntartott tenyészetből vettük, standard laboratóriumi körülmények között tartottuk (hőmérséklet: 20 ± 1°C, napi 12 órás megvilágítás, folyamatos légcsere, a tenyésztalaj összetétele: 50% hansági tőzeg és 50% lótrágya, nedvességtartalma ~60%). A kísérletek megkezdése előtt 48 órával a kiválogatott állatokat csapvízzel nedvesített papírvattán tartottuk, amíg bélcsatornájukból a talajszemcsék kiürültek. A kísérletek előtt az állatokat csapvízzel alaposan megtisztítottuk.
4.2. A coelomasejtek izolálása A kísérleti állatokat 4ºC hőmérsékletű coelomasejt-izoláló puffert (71,2 mM NaCl; 5 mM EGTA; 50,4 mM guiacol–glycerol–éter; 5% (v/v) etil-alkohol; pH 7,3) tartalmazó főzőpohárba helyeztük. A kémiai hatásra kipréselt coelomasejteket tartalmazó szuszpenzióval különböző vizsgálatokat végeztünk.
4.3. Egér agy és hipofízis kiboncolása a Western blot analízis kontroll mintáihoz Az egereket (BALB/c) kloroformmal túlaltattuk, majd bonctálban rögzítettük hasi oldalukkal lefelé. A koponya bőrét és a koponyatető csontjait eltávolítottuk, a gerincvelőt elvágtuk a koponyaalap magasságában, majd kiemeltük az agyat és a hipofízist. Az izolált szerveket RIPA (Radio-immuno-precipitation assay buffer; összetétele: 50 mM Tris/HCl; 150 mM NaCl, 1 % (v/v) NP-40, 0.5 % (w/v) Na-deoxycholate, 5 mM EDTA, 0.1 % SDS, protease inhibitor cocktail, pH 8.0) pufferbe helyeztük, majd üvegből készült homogenizáló potterrel (Potter-Elvehjem PTFE, Sigma) homogenizáltuk. Minden szervből három mintát készítettünk. A mintákkal Western blot analízist végeztünk (ld. 4.5.1.).
33
4.4. Fénymikroszkópos hisztológiai és hisztokémiai vizsgálatok A fénymikroszkópos klasszikus hisztológiai és hisztokémiai vizsgálatokat intakt állatok coelomasejtjein végeztük. A kenetpreparátumokat tisztított és zselatinozott tárgylemezre készítettük. 4.4.1. May-Grünwald Giemsa (Pappenheim-féle panoptikus festés) A coelomasejtek általános karakterizálására konvencionális May-Grünwald Giemsa féle kontrasztosítást használtunk. A kenetpreparátumokra tömény, frissen szűrt May-Grünwald oldatot cseppentettünk, majd 2 perc után a festékkel megegyező mennyiségű desztillált vizet juttattunk a tárgylemezekre a festék leöntése nélkül. Ezután a higított festéket még 3 percig a preparátumon hagytuk, utána bő desztillált vízzel lemostuk. Ezután a Giemsa oldatot juttattunk a kenetekre (2 ml desztillált vízben 3 csepp tömény Giemsa oldat), amelyet 10 percig hagytunk a tárgylemezeken, majd alapos desztillált vizes mosás után felszálló alkoholsorban víztelenítettünk. Ezután xilolban derítettünk és DePeX-szel (Fluka) lefedtük a kontrasztosított preparátumokat. 4.4.2. Hematoxilin-eozin festés A coelomasejtek citoplazmájában található granulumok karakterizálására és sejtmagjuk jellemzésére első körben hematoxilin-eozin festést alkalmaztunk. A kenetpreparátumokat Carnoy-fixálóban (3 ml etil-alkohol, 0,5 ml jégecet, 1,5 ml kloroform) 10 percig rögzítettük. Mosás után hagyományos szukcedán alumínium-hematoxilin (Carazzi-féle) -eozin festéssel kontrasztosítottuk mintáinkat, majd felszálló alkoholsoros víztelenítés és xilolos derítés után DePeX-szel (Fluka) állandósítottuk. 4.4.3. Perjódsav-Schiff-reakció A vizsgálandó coelomasejtek citoplazmájának szénhidráttartalmát Perjódsav-Schiff reakció alkalmazásával vizsgáltuk. A kenetpreparátumokat Carnoy-fixálóban 10 percig rögzítettük. Mosás után 5 percig perjódsavval oxidáltuk a mintákat, majd alapos csapvizes és desztillált vizes mosás után 15 percig Schiff-reagenssel reagáltattuk. Ezután alapos kénessavas, majd csapvizes és végül desztillált vizes mosás után Carazzi-féle alumíniumhematoxilinnel magfestést hajtottunk végre. Végül felszálló alkoholsoros víztelenítést és xilolos derítést követően a preparátumokat DePeX-szel (Fluka) állandósítottuk.
34
4.4.4. Szudánfekete festés A citoplazma-granulumok lipidtartalmát Szudánfekete festéssel jellemeztük. A preparátumokat Baker-formalinnal (1 ml 40%-os formaldehid, 1 ml 10%-os kálcium-klorid, 8 ml desztillált víz) 10 percig rögzítettük. Alapos csapvizes és desztillált vizes mosás után 3 percig 70%-os etil-alkoholban áztattuk a keneteket, majd a festést 60 percig 37ºC-on Szudánfeketével végeztük, amelynek telített oldatát 70%-os etil-alkoholban elegyítettük. A differenciálást is 70%-os etil-alkoholban végeztük, majd alapos desztillált vizes mosás után neutrálvörössel magfestést végeztünk. A hidrofób lipidek eltávolítása után a kenetek nem mutattak Szudán pozitivitást. Ebből arra következtethetünk, hogy a Szudán festésünk sikeres és specifikus volt. Mosás után a preparátumokat glicerinnel fedtük le. 4.4.5. Akridinoranzs festés Az Akridinoranzs festést a granulumok savas ph-jának kimutatására használtuk. A keneteket 4%-os paraformaldehiddel 10 percig fixáltuk. Desztillált vizes mosások után 1 mg/ml koncentrációjú Akridinoranzs oldattal kontrasztosítottuk a mintákat. Az újabb desztillált vizes mosás után vizes fázisban fedőlemezzel lefedtük és azonnal fluoreszcens fénymikroszkóppal vizsgáltuk.
35
4.5. Funkcionális vizsgálatok 4.5.1. A coelomasejtek szerepének vizsgálata a regeneráció folyamatában
7. ábra: A regenerációs kísérletek metodikai összefoglalása. A 4 ºC-os szódavízben elbódított intakt ivarérett kísérleti állatokat a clitellum utáni 23. szelvénynél átvágtuk, majd az operált állatokat táptalajra helyeztük, és standard laboratóriumi körülmények között tartottuk. Az állatok egy részét a műtét után 3 órával, 1, 5 nappal, illetve 1 és 2 héttel használtuk fel szövettani és elektronmikroszkópos vizsgálatokhoz. Ezen kívül a műtött állatok egy részéből az előzőekben ismertetett módon coelomasejteket izoláltunk és a következőkben ismertetett vizsgálatokat végeztük el rajtuk (7. ábra). Regenerálódó testvég fénymikroszkópos vizsgálata A regenerálódó egyedek egy részének levágtuk a regenerálódott testvégét, azokat módosított Karnovsky-oldatban (2% paraformaldehid; 2,5% glutár-aldehid; 0,1 M foszfát puffer) fixáltuk 2 órán át 4ºC-on, majd foszfát pufferes mosást követően 1%-os OsO4-ban szintén 2 órán át 4ºC-on ozmifikáltuk. Felszálló alkoholsoros víztelenítés és propilén-oxidos derítés után epoxi-gyantába (Durcupan, Sigma) ágyaztuk a mintákat. A fénymikroszkópos vizsgálatra szánt blokkokból Reichert típusú ultramikrotommal 1 μm vastagságú félvékony 36
metszeteket készítettünk, és azokat zselatinos tárgylemezre vittük fel. A preparátumokat toluidinkék festéssel kontrasztosítottuk, majd DePeX-es (Fluka) fedéssel állandósítottuk. PACAP27 és PACAP 38 fénymikroszkópos immunhisztokémia A kiboncolt testrészeket frissen készített, jéghideg 4 %-os paraformaldehidben fixáltuk. Foszfát pufferben (PBS) való mosás után a mintákat 0,1%-os Triton X-100-tartalmú foszfát pufferben (PBS pH 7,4) szobahőmérsékleten permeabilizáltuk, az endogén peroxidázok gátlása érdekében metanol és H2O2 keverékében inkubáltuk, majd az aspecifikus jelölődés csökkentése érdekében 10%-os borjúszérumban tartottuk 30 percen át. Ezt követően a mintákat PACAP27 (88121-5) vagy PACAP38 (88111-3) antiszérumot tartalmazó oldatban inkubáltuk (PBS-ben oldva, 1:800) egy éjszakán át. Az inkubálás után a mintákat egy éjszakán át PBS-ben mostuk, majd kecske anti-nyúl biotinilált IgG (1:100, PBS-ben oldva) inkubáltuk 8 órán át. PBS-ben való 4 órás mosást követően a preparátumokat avidin-biotintormaperoxidáz enzim oldatban inkubáltuk egy éjszakán keresztül. Ezután 2 órás PBS-sel való mosást követően 0,1 M PB-ben feloldott 0,03%-os 3,3’-diaminobenzidin (DAB) és 0,01% hidrogén-peroxid (H2O2) keverékét használtuk a reakció vizualizálásához. Az antitest jelölést állandó sztereomikroszkópos kontroll mellett végeztük. A reakció leállításához a mintákat PBS-ben mostuk. Ezután a preparátumokat glicerinnel fedtük le, vizsgálatukat NIKON Opiphot-2 fénymikroszkóppal végeztük. Radioimmunoassay (RIA) Az izolált coelomasejtek tömegének lemérése után a sejteket jéghideg desztillált vízben homogenizáltuk. A homogenizátum centrifugálása után (12000 rpm, 4 ºC, 30 min) a felülúszót használtuk PACAP-szerű immunreaktivitás vizsgálatára. A vizsgálatot korábbi leírás alapján végeztük el (Jakab és mtsai. 2004). Röviden: A jód radioaktív izotópjával jelölt szarvasmarha PACAP27-et illetve 38-at reverz fázisú HPLC oszlopon tisztítottuk. Standard hígítási sorban szintetikus szarvasmarha PACAP27/38-at (Sigma) használtunk 0 és 1000 fmol/ml koncentráció-tartományban. A méréseket 0,05M-os foszfát pufferben (0,1M NaCl; 0,05% NaN3; 0,25% BSA; pH 4) készítettük elő. A polipropilén csőhöz, amely a foszfát puffert tartalmazta, 100 µl higított antitestet (1:100 000), 100 µl radioimmunoassay tracert (5000 cpm/cső) és 100-100 µl higított PACAP27-et illetve 38-at a hígítási sorból vagy a mintánkból. Az antitesthez kötött komplexet 4 ºC-on 48-72 órán keresztül inkubáltuk, majd 100 µl szeparáló oldat (10 aktív szén, 1 g dextrán, 0,2 g zsírmentes tejpor 100 ml desztillált vízben feloldva) hozzáadásával elválasztottuk a szabadon maradt antitestektől. A csöveket 37
centrifugáltuk (3000 rpm, 20 perc, 4ºC), dekantáltuk, majd a kapott precipitátum radioaktivitását
gamma-számlálóval
koncentrációját
kalibrációs
görbével
mértük.
Az
határoztuk
ismeretlen meg.
Az
minták
PACAP27/38
eredményeket
fmol/mg
PACAP27/38-szerű koncentrációban adtuk meg. A PACAP tartalmak közötti különbséget ANOVA tesztet követő Neuman-Keul`s posthoc analízissel vizsgáltuk. Western blot analízis Az intakt és regenerálódó állatokból izolált coelomasejtek egy részét, illetve az egérből származó kontroll mintákat fiziológiás oldatban (LBSS: 71,5 mM NaCl; 4,8 mM KCl; 4,2 mM NaHCO3; 1,1 mM MgSO4 × 7 H2O; 0,4 mM KH2PO4; 0,3 mM NaH2PO4; pH 7,3) centrifugáltuk (3400 rpm, 4°C, 4 perc), majd a felülúszót proteáz inhibitort (Protease Inhibitor Cocktail, Sigma) tartalmazó homogenizáló pufferbe (RIPA) helyeztük, és ismét centrifugáltuk (13000 rpm, 4ºC, 15 perc). A felülúszót 0,5 M Tris-HCl-t, glicerolt, SDS-t, brómfenol- kéket és β-merkaptoetanolt tartalmazó pufferben főztük. Lehűtés után a mintát SDS-poliakrilamidelektroforézis segítségével 200 volt feszültség alkalmazásával futtattuk, majd nitrocellulózra blottoltuk. Ezután a mintákat PAC1-receptor antitestet (Sigma) tartalmazó primer szérumban, majd
tormaperoxidázhoz
konjugált
szekunder
antitesttel
inkubáltuk.
Ezután
kemilumineszcenciás detektálást végeztünk. A kontrollként alkalmazott egér agyszövetből és hipofízisből származó minták előkészítését és vizsgálatát a coelomasejtekkel megegyező módon végeztük. Savanyú foszfatáz citokémia A savanyú foszfatáz (EC 3.1.3.2.) citokémiai lokalizációjához Ericsson és Trump (citálja Molnár és Gábriel 2001) módszerét alkalmaztuk. A regenerálódott testvégeket 6,25 %os pufferelt glutár-aldehidben hidegen fixáltuk, majd intenzív 7,5 %-os szacharózos pufferben (pH 6,0-6,2) való mosás után a mintákból kriosztát metszeteket készítettünk, amelyeket 30 percre frissen készített Gömöri-féle inkubáló médiumba (5,2 pH-jú 0,1 M-os acetátpufferben oldott Pb(NO3)2 és nátrium-β-glicerofoszfát keveréke) helyeztünk. Inkubálás után a mintákat 1 percig 0,1 M acetátpufferben és 30 percig 2 %-os ecetsavoldatban tartottuk. Ezután a mintákat víztelenítettük és epoxi gyantába (Durcupan, Sigma) ágyaztuk. A blokkokból Reichert típusú ultramikrotómmal ultravékony (60-70 nm) vastagságú metszeteket készítettünk, amelyeket Jeol 1200C típusú elektronmikroszkóppal vizsgáltunk.
38
Áramlási citometria A regenerálódó állatokból izolált coelomasejteket 10 % borjúszérumot tartalmazó RPMI 1640 (FCS, Sigma) mostuk, majd enyhe centrifugálás (500 rpm, 5 perc) után mintánként 106 db sejtet használtunk fel a további vizsgálatokhoz. A sejteket 4 % paraformaldehiddel (LBSSben oldva) rögzítettük 20 percig, majd először 0,1 % NaN3 tartalmú giliszta-ringerben, majd 0,1% szaponint és 0,1 % NaN3-tartalmazó giliszta-ringerrel mostuk. Savanyú foszfatáz immuncitokémiai reakció alkalmazása után (savanyú foszfatáz antitest-Sigma. 1:50, biotinnal jelölt anti-nyúl antitest 1:100, streptavidin-FITC 1:100) a sejteket szaponin tartalmú gilisztaringerrel, szaponint és NaN3-tartalmazó giliszta-ringerrel mostuk, végül 0,1 %-os paraformaldehiddel rögzítettük és Becton Dickinson FACS Calibur cytométerrel vizsgáltuk. Adatainkat FCS Express szoftverrel dolgoztuk fel. 4.5.2. Birka vörösvértestek fagocitózisának vizsgálata Formalinnal fixált birka vörösvértesteket alapos mosás után LBSS-ben diszpergáltuk, majd fecskendővel szódában bódított egyedek testüregébe juttattuk. A beavatkozást követően az állatokat nedves papírvattán tartottuk, majd 1, 3 és 5 nap után szövettani feldolgozást hajtottunk végre rajtuk. A beavatkozás helyétől caudális irányban lévő szelvényeket Carnoyfixálóban rögzítettük. A mintákat fixálás után felszálló alkoholsorban víztelenítettük, benzolban derítettük, majd paraffinba ágyaztuk. A mintákból készült félvékony metszeteket standard hematoxilin-eozin módszerrel kontrasztosítottuk, DePeX-szel (Fluka) állandósítottuk és fénymikroszkóppal vizsgáltuk. 4.5.3. Citotoxicitás vizsgálata Az Sp2 sejtvonalból (Sp2/0-Ag14; egérből származó myeloma sejtvonal) származó sejtekhez giliszta coelomasejtekből származó lizátumot adtunk a sejtlizátum citotoxikus hatásának vizsgálatára. Az izolált coelomasejtek szuszpenziójában sejtszámlálást végeztünk, amelynek eredménye: 107 sejt/ml. A sejteket centrifugáltuk (1000 rpm, 5 perc), majd LBSSben reszuszpendáltuk. Ezután a sejtszuszpenzión ultrahangos lizálást végeztünk, majd a lizátumot centrifugáltuk (13000 rpm, 4ºC, 15 perc), a felülúszót használtuk coelomasejtlizátumként (CCL). Kontrollként Jurkat sejtvonalból származó sejtekből készített lizátumot használtunk. Ennek előkészítése a coelomasejt-lizátum készítésével azonos módon történt.
39
Az Sp2 sejteket kigyűjtés után centrifugáltuk (1000 rpm, 5 perc), majd DMEM médiumban (Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM, Sigma) reszuszpendáltuk, és sejtszámlálást végeztünk, amelynek eredménye: 3,4×106 sejt/ml. A sejteket centrifugacsőben 30 percig szobahőmérsékleten állandó rázatás mellett feltöltöttük 1 % Fluo3 AM indikátorral (Boldizsar és mtsai. 2002; Minta és mtsai. 1989). Ezután a centrifugacsöveket feltöltöttük DMEM médiummal, és még további 30 percig inkubáltuk a sejteket. Az egy órás inkubálást követően a sejteket centrifugáltuk (1000 rpm, 5 perc) és reszuszpendáltuk friss DMEM médiumban, úgy, hogy a végkoncentráció 106/ml lett. Az Sp2 sejtszuszpenzióból 700 µl –es aliquotokat készítettünk, majd a sejteken a Ca2+szignál mérést Becton-Dickinson FACSCalibur áramlási citométeren végeztük. Az alap Ca2+ szint 50 másodperces detektálása után a mintákhoz 30 µl coelomasejt-lizátumot adtunk. A lizátumot 1:1, illetve 1:2 és 1:10 arányban LBSS-ben higított formában is alkalmaztuk, annak érdekében, hogy a lizátum esetleges dózisfüggő tulajdonságát is megvizsgáljuk. A Fluo-3 AM indikátor fluoreszcens szignálját az FL1 csatornában végeztük. Kontrollként a sejtekhez 30 µl LBSS-t illetve 30 µl Jurkat lizátumot adtunk.
4.6. Ultrastruktúrális vizsgálatok Az ultrastruktúrális vizsgálatok során négyféle kísérletsorozat készült: (i) Intakt állatok coelomasejtjeinek szuszpenzióját Eppendorf-csőben centrifugáltuk (3000 rpm, 5 perc), majd az centrifuga-cső aljára leülepedő aggregálódott coelomasejteket ezután már sejtrögként kezelve fixáltuk. A fixálószer összetétele: 1% OsO4 (125 µl 4%-os OsO4), 2,5% glutár-aldehid (50 µl 25% glutár-aldehid), 0,1 M kakodilát puffer (250 µl 0,2 M kakodilát puffer), desztillált víz (75 µl). (ii) PAC1-receptor immuncitokémiára szánt regenerálódott testvégeket módosított Karnovsky-oldatban fixáltuk. A fixálószer összetétele: 2% paraformaldehid; 2,5% glutár-aldehid; 0,1 M foszfát puffer; desztillált víz. (iii)A
coelomasejt-lizátum
citotoxikus
hatásának
vizsgálatához
700
µl
Sp2
sejtszuszpenziót 30 µl coelomasejt-lizátummal, illetve kontrollként ugyanennyi LBSS-sel és Jurkat sejtlizátummal 10 percig inkubáltuk. Ezután a mintákat Eppendorf-csőben centrifugáltuk (3000 rpm, 5 perc), majd az centrifuga-cső aljára leülepedő aggregálódott sejteket fixáltuk. A fixálószer összetétele: 4% paraformaldehid; 0,3% glutár-aldehid; 0,1 M foszfát puffer; desztillált víz. (iv) Az ezüst-nanopartikulum (AgNP) hatásának vizsgálatakor a coelomasejtek 24 órás nanopartikulum-kezelését követően a sejteket Eppendorf-csőben centrifugáltuk 40
(3000 rpm, 5 perc), majd az centrifuga-cső aljára leülepedő aggregálódott sejteket fixáltuk. A fixálószer összetétele: 4% paraformaldehid; 0,3% glutár-aldehid; 0,1 M foszfát puffer; desztillált víz. A fixálást követően az (i) kísérlet kivételével a mintákat 0,1 M PB-ben mostuk, majd 2 órán keresztül 1%-os OsO4-ban utófixáltuk. Az ozmifikálást követően mind a négy mintát felszálló alkoholsorral víztelenítettünk, propilén-oxiddal derítettük, majd epoxi-gyantába (Durcupan, Sigma) ágyaztuk. A blokkokból Reichert típusú ultramikrotommal ultravékony (60-70 nm) metszeteket készítettünk. A metszeteket nikkel-mikrostélyra vittük fel. A PAC1-receptor immuncitokémiára előkészített mintákat deozmifikálás után 5%-os normál kecske szérumban 30 percig előinkubáltuk (NaCl-ot tartalmazó TBS-ben) oldva, pH 7,6), majd a grideket szobahőmérsékleten egy éjszakára anti-PAC1 receptort (Sigma) tartalmazó szérumcseppre helyeztük. Több TBS-ben történt mosás után a grideket 18 nm-es aranyszemcsékhez kötött anti-nyúl IgG antiszérumot tartalmazó cseppekre helyeztük. A mintákat desztillált vízben mostuk. Az elektronmikroszkópos vizsgálatok előtt mind a négy minta gridjeit uranil-acetáttal és Reynolds-féle ólom-citráttal kontrasztosítottuk. A minták vizsgálatát Jeol 1200C típusú elektronmikroszkóppal végeztük.
4.7. Dokumentáció, képfeldolgozás, számítógépes utómunkálatok A totálpreparátumok, a félvékony sorozatmetszetek és a kenetek vizsgálatához NikonOtiphot-2 típusú fénymikroszkópot alkalmaztunk. Az elektronmikroszkópos vizsgálatainkat JEOL-1200 típusú transzmissziós elektronmikroszkóppal végeztük. A fotófilmre előhívott negatívokat és a western blot kísérleteink eredményét tartalmazó röntgenfilmeket professzionális lapolvasóval digitalizáltuk. A digitalizált képeken utólagos fényerő- és kontraszt-változtatásokat Adobe Photoshop CS3 programmal végeztünk. A diagramokat Microsoft Excel 2007 segítségével készítettük. A radioimmunoassay módszerrel kapott PACAP-tartalom különbségeket varianciaanalízist követő Neuman-Keul-féle post hoc analízissel becsültük meg.
41
5. Eredmények 5.1. Intakt állatok coelomasejtjeinek morfológiai leírása Az E. fetida coelomafolyadékában található sejtek vizsgálatakor a fő sejttípusok elkülönítéséhez a sejtek méretét, sejtmagjuk alakját, méretét és elhelyezkedését valamint a citoplazma granuláltságát vettük figyelembe. Három korábban más fajban leírt sejttípus azonosítása történt meg: (i) eleocyta; (ii) amoebocyta; (iii) granulocyta. Ezen kívül pedig elszórtan bazofil citoplazmájú sejteket találtunk, valamint olyan sejteket, amelyek sejtmagján erőteljes invagináció mutatkozik. A sejttípusok vizsgálatakor azt tapasztaltuk, hogy a három immunkompetens coelomasejttípus (i-iii) nem homogén sejtpopuláció. A sejtek kromatinja, magvacskája, granulumainak száma és elhelyezkedése, illetve a nyúlványok megléte, száma és kiterjedése is változatosságot mutat egy-egy populáció tagjai között. 5.1.1. Az eleocyták fény- és elektronmikroszkópos jellemzése A hematoxilin-eozin festés során a sejtek citoplazmája nem festődött. A sejtek lekerekítettek, átlagosan 25-30 µm átmérőjűek. Találtunk olyan lehetséges sejtalakokat is, amelyeknek nincs, vagy nem látszik a sejtmagjuk. Ezek valószínűleg sejttöredékek, amelyeket az ultravékony mintáinkon is megtaláltunk. Ha van sejtmag, akkor az a sejt közepén helyezkedik el. A citoplazmában lévő különböző méretű nem festődő képletek a citoplazma nagy részét elfedik, de még a sejtmag felületére is benyúlnak. A sejteknek nyúlványai nincsenek és nem aggregálódnak (8/a, b ábra). May-Grünwald Giemsa – féle kontrasztosítás során a korábban eleocytaként leírt sejttípuson belül 3 alpopuláció különböztethető meg. 1. Az első típus, amely a legtöbbször fordul elő kenetben, nagyméretű (20 – 35 µm). Sejtmagja általában középen helyezkedik el (4-5 µm), sötéten festődik, eukromatinizáció nem látható benne. A sejt felszíne a nagy granulumok miatt nem egyenletes, követi a granulumok alakját. A granulumok valószínűleg lipideket tartalmaznak. A granulumok mérete kb. 4-5 µm. A granulumok a citoplazmát teljesen kitöltik, más típusú granulum nem található benne. A sejtek gyakran csoportosan láthatók a kenetekben (8/c ábra). 2. A második eleocyta altípus sejtátmérője kisebb, 15-20 µm. A sejtmagjuk nagyobb (67 µm), általában excentrikus elhelyezkedésű. A citoplazmában található granulumok, amelyek nem festődnek, valószínűleg lipidet tartalmaznak. A granulumok mérete kisebb (1-2 µm),
42
mint az első altípusnál. Mivel a granulumok kisebbek, a citoplazma jobban festődik (8/d ábra). 3. A harmadik típusú eleocyta mérete 20-25 µm. A sejtmag kicsi és centrális helyzetű, erősen bazofil. Citoplazmája csak néhány óriás vakuólumot vagy lipid tatalmú granulumot tartalmaz. A citoplazma egyáltalán nem festődik, csak sejteni lehet a tartalmát. A sejtek gyakran megnyúltak, de nyúlványaik nincsenek (8/e ábra). PAS reakció során is a korábban tapasztalt 15-25 µm sejtméretet tapasztaltuk. Citoplazmájukban bazofil és PAS-pozitív granulumok sincsenek. A sejtek lekerekítettek, nyúlványaik nincsenek. Az eleocyták korábbi leírása alapján (lipidtartalmú kompartmentek a citoplazmában) Szudánfekete reakció során több, morfológia alapján elkülöníthető altípust találtunk, amelyek a következők: 1. A sejtek 25-30 µm átmérőjűek. A sejtmag általában a sejt közepén helyezkedik el, csak részben látszik a granulumok takarása miatt. 1-2 µm Szudánfekete-pozitív granulumok találhatók elszórtan a citoplazmában. A kisméretű Szudánfekete-pozitív granulumok mellett a sejtek nagyméretű, Szudánfeketével sem festődő vakuólumokat tartalmaznak (8/f ábra). 2. A sejtek 20 – 30 µm átmérőjűek. A sejtmag általában látható, a sejt közepén található. A sejtek nagy, hólyagszerű granulumokat tartalmaznak a citoplazmában, a granulumok perifériája Szudánfekete-pozitív, a többi része nem festődik, a vakuólumok mérete változó (28 µm) (8/g ábra). 3. A sejtek kisméretűek, kb. 15 µm átmérőjűek. A sejtmag a sejt közepén található, látszik a sejtmagvacska is. A citoplazmában található Szudánfekete-pozitív, jól elkülönülő granulumok hosszúkásak, hosszuk 4-5 µm, a sejt perifériáján találhatók (8/h ábra). 4. Maximum 15 µm átmérőjű sejtek, a sejtmag nagyméretű, 5-6 µm átmérőjű. Erősen Szudánfekete-pozitív 1-2 µm átmérőjű granulumok elszórtan találhatók a sejtben. A nagy, hólyagszerű képletek hiányoznak a sejtek citoplazmájából. A sejt felszíne nem egyenletes, de kisebb kiemelkedéseket látunk, mint a nagyméretű eleocytákon (8/i ábra). 5. A sejt kb. 15-20 µm átmérőjű, lekerekített. A sejt felszínén kiemelkedéseket nem találunk. A sejtmag kerek, kb. 5 µm átmérőjű. A sejtek citoplazmájának külső része (ektoplazma)
homogén,
enyhén
Szudánfekete-pozitív,
endoplazma
Szudán
negatív
egybefüggő, szinte egy darab nagy hólyag (8/j ábra). Egyes sejtek akridinoranzs-pozitívnak mutatkoztak. A sejtek 25 – 30 µm átmérőjűek, a sejtmagjuk a sejt perifériájára szorult. A lipid tartalmú vakuólumok mérete kb. 2-3 µm,
43
alakjuk változó. Azonban találtunk olyan sejteket is, amelyeknek lipidtartalmú granulumaik sokkal kisebbek (0,5-1 µm) és gömb alakúak (8/k ábra).
8. ábra: Az eleocyták fénymikroszkópos mintákban. (a; b) HE, a citoplazmában nem festődő granulumok nagy számban vannak jelen; (c) MGG 1. típus, a sejtek nagyméretűek, felszínük egyenetlen, sejtmagjuk kisméretű, nem festődő granulumaik nagy méretűek; (d) MGG 2. típus kisméretű, nem festődő granulumokkal; (e) MGG 3. típus rendkívül nagy méretű nem festődő granulumok a citoplazmában; (f-j) Szudánfekete festéssel kapott sejtaltípusok a lipid tartalmú granulumok mérete és eloszlása alapján. (f) 1. típus; (g) 2. típus; (h) 3. típus; (i) 4. típus; (j) 5. típus; (k) AO, a sejtek nagyméretű granulumai nem festődtek. Aránymérték 10 µm. A transzmissziós elektronmikroszkópos felvételeken (9. ábra) az eleocyták a legnagyobb méretű sejtek. Alakjuk szabálytalan, a sejtekben a sejtmag/citoplazma arány alacsony. A sejtmag általában a sejtek közepén helyezkedik el. A nucleus 1,5-2 µm átmérőjű, nagyjából gömb alakú. A sejtmag eukromatinizált. Némelyik metszetben még az erősen denz nucleolus is látható. A sejtmag felszínén behúzódás nem látható. A sejtek citoplazmája homogén, sejtalkotókban szegény endoplazmára és nagyméretű, jól elkülönülő, 0,5-1 µm átmérőjű, polimorf, membránnal határolt struktúrákkal teli ektoplazmára tagolható. Ezeknek a 44
struktúráknak a nagyobb része nem ozmiofil, de a granulumok között találunk erősen elektrondenz struktúrákat. A sejt pszeudopódiumokat nem képez, de sejtfelszíne nem egyenletes a nagy chloragosomákra emlékeztető struktúrák kiemelkedése miatt. A sejtek gyakran csoportokban helyezkednek el a coelomaüregben, néha sejtkapcsoló struktúrákra emlékeztető kapcsolatokkal összetapadnak.
9. ábra: Az eleocyták ultrastruktúrája. Jelmagyarázat: n: nucleus; dg: denz granulum; lg: nem ozmiofil (lipid) granulum, nyíl: sejtkapcsoló struktúrára emlékeztető kontakt. Aránymérték: 1 µm.
45
5.1.2. Az amoebocyták fény- és elektronmikroszkópos jellemzése Az amoebocyták 15-18 µm átmérőjűek. A sejtek felszíne nem egyenletes. Kisebbnagyobb pszeudopódiumok találhatók, illetve valószínűleg lezajlott fagocitózisok helyei láthatók a sejthártyán. A sejtek magja viszonylag nagyméretű (6-8 µm), kerek, a sejt közepén helyezkedik el. A sejtek általában magányosan helyezkednek el a keneten, nem aggregálódnak (10/a, b ábra). May-Grünwald Giemsa kontrasztosítás alkalmazásával több altípust találtunk az amoebocyta sejtalakok között. 1. A sejtek viszonylag nagyméretűek, átmérőjük kb. 20 µm. Sejtmagjuk kerek, kb. 7 µm átmérőjű, az eu- és heterokromatin jól elkülöníthető a MGG festéssel. Az erős eukromatinizáció arra utal, hogy a sejtek intenzív anyagcserét folytatnak. A citoplazma ezzel a festéssel enyhén rózsaszínűre festődik és apró granulumok láthatók benne. A sejtek nagyjából lekerekítettek, néha pszeudopódiumra emlékeztető nyúlványokat mutatnak (10/c, d ábra). 2. MGG festés során olyan sejteket is találtunk, amelyek 12-15 µm átmérőjűek. A citoplazmában kisebb-nagyobb vakuólumok (2-7 µm), a sejt szélén gyakran kitüremkedések (talán exocitózis helye vagy pszeudopódiumok). Néha előfordulnak kicsi, sötét granulumok (maximum 1-2 µm). Sejtmag kerek, excentrikus, mérete: 5-7 µm (10/e, f, g ábra). Perjódsav-Schiff reakció során korábbi leírások szerinti amoebocyta sejttípust nem találtunk.
46
10. ábra: Az amoebocyták fénymikroszkópos mintákban. A sejtek változatos alakúak, néha állábakkal rendelkeznek. Átmérőjük 15-20 µm. (a; b,) HE, a sejtek számos különböző méretű és hosszúságú állábbal rendelkeznek; (c; d,) MGG 1. típus, nagyméretű sejtek, citoplazmájukban enyhén rózsaszínűek, néhány pszeudopódiumot képeznek; (e; f, g) MGG 2. típus, kisebb méretű sejtek citoplazmájukban néhány erősen kékre festődő granulummal. Aránymérték 10 µm. Transzmissziós elektronmikroszkópia során is azt tapasztaltuk, hogy a sejtek szabálytalan alakúak. A sejtek között két fő típust találunk. Az egyik típusú amoebocyta kisebb pszeudopódiumokat, lobopódiumokat képez, amelyek rövidek, gumószerűek, tompák. A sejtek magja a sejt perifériájára szorul, erősen excentrikus helyzetű. A mag nagyméretű a többi sejttípushoz viszonyítva. A marginális kromatin gyakran erősen kondenzált, de az eukromatin mennyisége alacsony. A sejtmaghoz közel, nagyjából a sejt közepén sűrűn elhelyezkedő, nagyszámú, erősen elektrondenz struktúrát találunk, melyek diszkréten elkülönülnek egymástól, általában megnyúltak, ellipszis alakúak és kb. 50-100 nm átlagos átmérőjűek. A sejt perifériája felé haladva körben a citoplazmában nagyméretű (200-300 nm, vagy akár fél µm) szabálytalan alakú diszkrét membránnal határolt vakuólumok találhatók. A citoplazma sejthártyához közeli peremén gyakran találunk erősen elektrondenz struktúrákat, valószínűleg fagoszómákat, de a citoplazma ezen része általában viszonylag homogén, sejtalkotóban szegény (11/a, b, c ábra).
47
A másik típusú sejt hosszabb, keskenyebb, karcsúbb pszeudopódiumokat képez (11/d ábra). A sejtek alakja erősen szabálytalan, citoplazmájuk világos, kevésbé elektrondenz. A sejtek magja is szabálytalan alakú, és a heterokromatin mennyisége nagyobb, mint az első típusú sejt magjában. A hosszú pszeudopódiumok miatt az elektronmikroszkópos metszeteken nagyméretű üres vakuólomszerű struktúrák látszanak. Gyakran látunk endocitózisra utaló jeleket (11/f, h ábra). A sejtek pszeudopódiumaikkal gyakran képeznek szomszédos sejtekkel sejtkapcsolatokat (11/e, g ábra). A sejtek citoplazmája nagy számban tartalmaz különböző sejtalkotókat (vakuólumokat, granulumokat, mitokondriumokat). Az amoebocyták többféle megjelenési formája (morfológiája, nyúlványaik, citoplazmaszerkezetük) arra enged következtetni, hogy a fent leírt sejtalakok esetleg egy sejttípus több fejlődési alakját mutatják be.
48
11. ábra: Az amoebocyták ultrastruktúrája (a, b, c) 1. típus; (d-h) 2. Típus. Jelmagyarázat: n: nucleus; dg: denz granulum; ec: endocitózis; ecp: ectoplasma; enp: endoplasma; lp: lobopódium; v: vakuólum; nyíl: sejtkapcsolatok. Aránymérték: a-d, h: 1 µm; e, f, g: 200 nm. 49
5.1.3. A granulocyták fény- és elektronmikroszkópos jellemzése A sejtek hematoxilin-eozin festés során (12/c ábra) erősen bazofil granulumokat mutatnak citoplazmájukban. A granulumok az egész citoplazmát kitöltik, és szinte kiszorítják a sejtmagot a sejt perifériájára. A granulumok szabályos gömb alakúak és kisméretűek (0,5-1 μm). A sejtek alakja enyhén megnyúlt, hosszabbik átmérőjük kb. 25 μm, rövidebb átmérőjük pedig 20 μm. A sejtek felszíne egyenetlen a granulumok miatt. May-Grünwald Giemsa – féle kontrasztosítás után 12-15 μm átmérőjű sejteket figyeltünk meg. A citoplazma granulumokkal teli, a granulumok sötétpirosra festődnek. A sejtek alakja általában szabálytalan, néha pszeudopódiumokra emlékeztető nyúlványokat láthatunk. A sejtek nem aggregálódnak. A sejtek magja erősen bazofil, kerek 6-7 μm átmérőjű. A granulumok miatt a sejtmag általában a sejt szélére szorul, sőt a sejthártyát is kitolja és a sejt felszínén kitüremkedést okoz (12/a, b, ábra). PAS-reakció alkalmazása során a granulocyta sejttípust több alpopulációra tudtuk osztani, főként a granulumok száma, mérete, PAS-pozitivitása illetve elhelyezkedése alapján: 1. A sejtek mérete kb. 15 µm. Lekerekített sejtek, melyeknek nyúlványa nincs. A sejtmagjuk (5-6 µm), általában enyhén megnyúlt alakú, hematoxilinnel festve enyhén bazofil, a legtöbb sejtben a sejt perifériájára szorul, az eu- és heterokromatin viszonylag jól elkülöníthető. A citoplazmában kisszámú PAS-pozitív granulumot láthatunk (12/d ábra). 2. A sejtek nagyszámú PAS-pozitív granulumot tartalmaznak a citoplazmájukban. A sejtek magja szinte nem is látszik a granulumok miatt. A sejtek mérete kb. 12-14 µm, általában lekerekítettek. A sejtek felszíne a granulumok miatt egyenetlen. A granulumok nagyon kisméretűek, kb. 1 µm átmérőjűek és gömb alakúak (12/e ábra). 3. A sejtek mérete szinte teljesen egyforma, 10 µm átmérőjűek. A sejtek magja a sejt egyik oldalára szorul, kerek, kevésbé takarják el a granulumok, mint az előző sejttípusnál. A sejtmag néha erős eukromatinizációt mutat. A citoplazmában 8-10 db erősen PAS-pozitív granulum található, amelyek nagyobbak (2-3 µm), és gyakran nem is már a sejtben, hanem annak közvetlen szomszédságában találhatók, mintha a sejtek exocitózissal kiürítettek volna valamit. A sejtek nem aggregálódnak, általában egyesével találhatók a kenetekben (12/f ábra).
50
12. ábra: A granulocyták fénymikroszkópos mintákban. A sejtek változatos alakúak. Granulumaik gyakran rendkívül jól festődnek granulumok erős kiemelkedéseket okozhatnak a plazmamembránon, nem egyenletes. (a, b,) MGG; (c) HE; (d) PAS 1. típus; (e) PAS 2. Aránymérték 10 µm.
12-15 µm átmérőjűek, PAS-reakció során. A emiatt a sejtek felszíne típus; (f) PAS 3. típus.
Transzmissziós elektronmikroszkópos vizsgálataink során azt tapasztaltuk, hogy a granulocyták kissé megnyúlt, ellipszoid alakúak. A sejtmag a sejtek közepén helyezkedik el vagy esetleg kissé excentrikus, de semmiképp nem szorul teljesen a sejtek perifériájára (átmérője kb. 2-4 µm). A sejtmag általában lekerekedett, esetleg némileg megnyúlt, eukromatinizált. Nucleolus ritkán látható. A sejtmag felszínén befűződés nem tapasztalható. A sejtek morfológiájukat tekintve változatosságot mutatnak, ugyanis egyes sejtek citoplazmájának alapállománya nem túl denz, de benne nagy számban kisméretű denz granulumok találhatók. A granulumok általában 150-200 nm átmérőjűek. Vannak köztük nagyon erősen elektrondenz, gömb alakú granulumok, és kevésbé denz hosszúkás, esetleg pálcikaszerű képletek. A sejtek citoplazmája két könnyen elkülöníthető részből áll, ugyanis a citoplazma maghoz közelebbi része (endoplazma) polimorf granulumban és egyéb különböző elektrondenzitású sejtalkotókban (pl. ovális mitokondrium, lizoszóma, szabad riboszóma, polimorf vakuólum) gazdag, míg a citoplazma perifériás része (ektoplazma) viszonylag 51
homogén és granulummentes (13/a, b ábra). A sejt felszíne általában egyenletes, rajta néha kisebb kitüremkedések láthatók. Ezeknek a belsejében elektrondenz struktúrák láthatók (13/b ábra). Egyes sejtek citoplazmája viszont erősen elektrondenz, benne a granulumok nagyobbak (300-400 nm), erősebb denzitásúak. A granulumok a citoplazma egészében megtalálhatók. Ezeknek a sejteknek a sejthártyája sem egyenletes felületű, ugyanis gyakran észlelhető a granulumok exocitózisa (13/c, d ábra). A többféle altípus megjelenése azt sugallja, hogy ezeknek a sejteknek különböző állapota, esetleg fejlődési stádiuma lehet a coelomafolyadékban. A sejtekről általánosságban elmondható, hogy gyakran képeznek aggregátumokat, sejtkapcsolatokat más coelomasejttel.
13. ábra: A granulocyták ultrastruktúrális szerkezete. Jelmagyarázat: n: nucleus; enp: endoplazma; ecp: ectoplasma; dg: denz granulumok. Aránymérték: 1 µm.
52
5.1.4. Bazofil citoplazmájú sejtek A kenetek tanulmányozása során azt tapasztaltuk, hogy nem nagy számban, de rendszeresen megjelennek a coelomasejtek között olyan kisméretű sejtek, melyek citoplazmája bazofil festődést mutat (14. ábra). A sejtek további két csoportba sorolhatók citoplazmájuk struktúrája szerint. A sejtek egy része kicsi (6-7 µm), a sejtmag pedig maximum 5 µm átmérőjű. A sejtmag/citoplazma arány magas. A citoplazma gyakran csak egy keskeny szegélyként látható. A sejtmagokban gyakran eukromatin látható. A sejtek gyakran képeznek sejtkapcsolatokat a környező szöveti sejtekkel. Az érettebb alakok már nyúlványokat is képeznek. A keskeny plazmában basofil illetve eozinofil granulumok nem láthatók, a citoplazma Szudán negatív. A citoplazma PAS módszer alkalmazásával világos lilára festődik, és keskeny szegélyként jelenik meg a mag körül.
14. ábra: A kisméretű bazofil citoplazmájú sejtek fénymikroszkópos mintákban. A sejtek átmérője 6-7 µm, a sejtmagé 4-5 µm. A sejtek gömb alakúak, citoplazmájuk keskeny. (a, b) PAS; (c) MGG. Aránymérték: 10 µm. A bazofil citoplazmájú sejtek között viszont találunk nagyobb méretű sejteket (8-9 µm), melyek sejtmagja kissé ovális, és excentrikus elhelyezkedésű (15. ábra). A sejtek citoplazmája nem granulált, a plazmamembrán felszíne néha nem egyenletes.
15. ábra: A nagyobb méretű bazofil festődésű sejtek. A sejtek átmérője 8-9 µm. A sejtmag excentrikus, ovális alakú. A citoplazma nem granulált. (a) MGG; (b, c) PAS. Aránymérték: 10 µm. 53
5.1.5. Lebenyezett sejtmagvú coelomasejtek A sejtek mérete 8-15 µm, citoplazmájuk homogén, sejtmagjuk invaginációt tartalmaz. A sejtmag bab alakú, középen az invaginációval, mérete 5-8 µm. A sejtek lekerekítettek, kevés nyúlvány látható rajtuk. Citoplazmájuk nagyon gyengén festődik, PAS-pozitív és bazofil granulumokat nem tartalmaz. A sejtmag a sejt közepén vagy excentrikusan található (16. ábra). Az ultrastruktúrális felvételek alapján elmondható, hogy kétféle sejtalak rendelkezik befűződéses sejtmaggal. (i) Egy részük számos közepes hosszúságú lobopódiummal rendelkezik. A sejtek egy-egy nyúlványa néha rendkívül hosszú. A sejtek citoplazmájában néhány fagoszóma jellegű struktúrát találunk (17/a ábra). (ii) Ezen kívül olyan sejtek mutatnak még sejtmagjukon invaginációt, amelyek nem nyúlványosak, viszonylag sima felületű a plazmamembránjuk, néhány vakuólum és granulum található a citoplazmájukban. Legfeljebb egy-két rövidebb pszeudopódiummal rendelkeznek (17/b, c ábra). Ezek a megfigyelések egybeesnek a fénymikroszkópos felvételeken tapasztaltakkal.
16. ábra: A lebenyezett sejtmagvú sejttípus fénymikroszkópos mintákban. A nucleus rendszeresen behúzódással rendelkezik, és minden esetben excentrikus elhelyezkedésű. A citoplazma nem granulált. (a-d) MGG; (e-h) PAS. Aránymérték: 10 µm.
54
17. ábra: A lebenyezett sejtmagvú sejtek ultrastruktúrája. Aránymérték: 1 µm. Jelmagyarázat: csillag: magmembrán invaginációja; n: nucleus; lp: lobopódium; psp: pszeudopódium. 55
5.1.6. Korábbról nem ismert sejttípusok a coelomában A fénymikroszkópos minták tanulmányozása során olyan, eddig nem ismert sejtcsoport tagjait találtuk (18. ábra), amelyek enyhén megnyúltak (a hosszabbik átmérőjük kb.12 µm). A sejtek magja a sejt egyik végében található, sokszor kiemelkedést okozva a sejt felületén. A sejtmag enyhén bazofil és erős eukromatinizációt mutat, amely intenzív anyagcserére utal. A sejt citoplazmájában néhány (maximum 4-5) erősen PAS-pozitív granulumot találunk, amelyek mérete 2-3 µm. A sejtekben gyakran láthatunk nem festődő, fehér hólyagszerű képleteket, amelyek valószínűleg lipidet tartalmaznak. A sejteken néha nyúlványokat, pszeudopódium szerű képleteket láthatunk.
18. ábra: Az 1. új sejttípus PAS reakció után. A sejtek citoplazmájában nagyméretű, erősen PAS-pozitív granulumok találhatók, amelyek főként a sejtmag közelében helyezkednek el. Aránymérték: 10 µm. Egy másik eddig nem ismert csoportba tartozó sejtek (19. ábra) nagyméretűek (25-30 µm), szabálytalan alakúak. A sejtek citoplazmája erősen bazofil festődésű sejtalkotókkal, valószínűleg fagoszómákkal van tele. A fagoszómák általában 3-5 µm átmérőjűek. A sejtek alakja valószínűleg azért szabálytalan, mert intenzív membránfolyamatok, exo- illetve endocitózis folyik.
19. ábra: A 2. új sejttípus PAS reakcióval kontrasztosítva. A citoplazmában erősen bazofil fagoszómák találhatók. Aránymérték: 10 µm. 56
Ezen kívül pedig olyan sejteket találtunk, amelyeknek (20. ábra) több sejtmagjuk van, azaz multinukleáris sejtek. A sejtek különböző méretűek (10-20 µm), citoplazmájuk általában granulummentes. A sejtek lekerekítettek, nyúlványokat nem képeznek.
20. ábra: A 3. új sejttípus PAS reakcióval festett kenetben. Aránymérték: 10 µm. 5.1.7. Az eleocyták és a chloragogén eredetű sejttöredékek kialakulása Intakt egyedek coelomaüregének és chloragogen szövetének vizsgálata során azt tapasztaltuk, hogy a perifériás chloragogen szövet sejtjeinek egy részében sejtosztódás zajlik. Fénymikroszkópos metszetein tanulmányozása alapján elmondhatjuk, hogy az osztódás következtében létrejövő utódsejtek közül a bazálisabban kialakuló sejt a chloragogén szövetben marad, az apikális utódsejt pedig leválik a chloragogén szövetről és szabadon úszik a coelomafolyadékban (21. ábra).
21. ábra: Sejtosztódás a chloragogén szövetben. Jelmagyarázat: c: testüreg; ch: chloragogen szövet; k: periintestinális vérsinus; nyilak: osztódó chloragogén sejt. Aránymérték: 10 µm.
57
Ezen kívül a chloragogén szövet ultrastruktúrális vizsgálata során azt tapasztaltuk, hogy a sejtekben folyamatos membránátalakulás, membrán- és citoplazmalefűződés történik az emlős vérlemezkékhez illetve a megakaryocytákhoz hasonlóan. A chloragogen sejtek citoplazmájának apikális részében erősen elektrondenz és kevésbé elektrondenz granulumok halmozódnak fel. Ezután a plazmamembrán endomembránokkal olvad össze, majd az apikális rész lefűződik a coelomaüregbe, a bazális citoplazma-domén és a sejtmag pedig a szomszédos chloragogen sejtek szövedékében marad. Ez lehet annak a ténynek a magyarázata, miszerint a coelomafolyadékban állandóan jelen vannak sejttöredékekhez hasonló komponensek (22. ábra).
22. ábra: A chloragogen sejtek citoplazma-lefűződése. Jelmagyarázat: lm: hosszanti izomszövet; cm: körkörös izomszövet; nyíl: plazmamembrán lefűződése; kettősnyíl: fagoszóma; nyílhegy: intracelluláris membrán; kör: denz granulum; csillag: hemoglobintartalmú vakuólum. Aránymérték: 500 nm. 58
5.2. A coelomasejtek funkcionális vizsgálata 5.2.1. A coelomasejtek szerepe a regeneráció folyamatában A regenerációs blasztéma A caudális szelvények eltávolítása után gyors sebzáródás következik be, melynek során a bőrizomtömlő izomzatának kontrakciója és az epidermisz megvastagodása figyelhető meg. A sérülés helyén rövid időn belül nagy mennyiségű coelomasejt halmozódik fel. A bélcsatorna végét bezáró heg környékén laza szerkezetű, szabad szemmel is jól látható regenerációs blasztéma alakul ki a vágást követő napokban (23. ábra). A blasztéma morfológiailag sokféle sejtből áll, ezek között nagy számban találtunk coelomasejteket és neoblastokat. Nem csak a sérült szelvény környékén, hanem az utolsó 5 sértetlen szelvényben is a normálisnál nagyobb számban fordultak elő coelomasejtek. A testüregben főként eleocytákat és granulocytákat találtunk (24. ábra), míg a bélcsatorna és bőrizomtömlő sérült szövetei közé amoebocyták és granulocyták bevándorlását tapasztaltuk, valamint lebenyezett magvú,
nagy
kiterjedésű
lobopódium-rendszerrel
rendelkező
sejtek
is
gyakran
megfigyelhetők (25. ábra).
23. ábra: a: Az egy hetes regenerálódott testvég sztereomikroszkópos képe. b: A 2 hetes regenerálódott testvég fénymikroszkópos hosszmetszeti képe, toluidinkék festéssel. Aránymérték 100 µm. c: Friss seb körüli coelomasejt-invázió.
59
24. ábra: Coelomasejt-invázió a regenerálódó testvégben. d: dissepimentum; e: eleocyták; g: granulocyta; nyíl: lobopódiumos sejt. Méretarány: 10 µm
60
25. ábra: A lebenyezett magvú sejtek ultrastruktúrája a regenerációs blasztémában. Jelmagyarázat: n: nucleus; lp: lobopódium denz fagoszómákkal; csillag: sejtmaghártya invaginációja. Aránymérték: 1 µm.
61
A neoblastok elektronmikroszkópos felvételeken (26. ábra) lekerekített sejtek, melyeknek átmérője 7-8 µm. A sejtmag nagyméretű, kondenzált kromatinnal rendelkezik. A nucleolus gyakran erősen kirajzolódik (26/a, b, c ábra). A sejtek citoplazmája csak keskeny szegélyként jelenik meg a sejtmag körül, néhány kisebb denz granulumot tartalmaz. Jellegzetes tulajdonságuk, hogy a szomszédos sejtekkel sejtkapcsoló struktúrákat alakítanak ki (26/b ábra). Differenciáltabb formáik már nyúlványokkal is rendelkeznek (26/d ábra).
26. ábra: A neoblastok transzmissziós elektronmikroszkópos képei. Aránymérték a, c: 1 µm; b, d: 500 nm. Jelmagyarázat: nyíl: sejtkapcsolat; m: izomszövet; n: nucleus; nu: nucleolus.
62
PACAP-szerű peptidek és azok receptorának vizsgálata coelomasejtekben a caudális regeneráció során A regenerálódó testvégek totálpreparátumain, PACAP27 és PACAP38 immunjelölés során a regenerálódó szövetek környékén PACAP-pozitív coelomasejteket találtunk a coelomaüregben (27. ábra). Magányos coelomasejtek találhatók a somatopleurához és a vérerekhez tapadva. Jelölt sejtek legnagyobb számban a bőrizomtömlő belső oldalán valamint a sérült ganglion felszínén találhatók, mellettük ugyancsak PACAP-pozitív neoblasztok figyelhetők meg. A neoblasztok totipotens őssejtek a coelomafolyadékban. Morfológiájukat tekintve bazofil, kisméretű sejtek, melyek nagy sejtmag/citoplazma aránnyal rendelkeznek. Könnyen felismerhetőek és a coelomasejtektől elkülöníthetőek, hiszen sejtmagjuk nagyméretű, körülötte a citoplazma pedig csak keskeny szegélyként látható. A coelomasejtek közül morfológiai jellegzetességeik alapján egyes granulocyták és amoebocyták mutattak PACAP-pozitivitást a regenerációs blasztémában és környékén. Eleocyták nem mutattak PACAP-immunreaktivitást a preparátumainkban.
27. ábra: PACAP27 (a) és PACAP38 (b) -immunreaktivitást mutató coelomasejtek a regenerálódó testvégben. Nyilak: immunpozitív coelomasejtek, ch: serte; d: dissepimentum. Aránymérték: a: 50 µm; b: 20 µm.
63
Ultrastruktúrális vizsgálataink során a regenerációs végből készült preparátumokban PAC1-immunpozitivitást találtunk az amoebocyták (28/a ábra) és a granulocyták egy részén. Elvétve az eleocyták is mutattak jelölődést, de nem számottevő mértékben. A jelölt sejtek esetében az immunarany szemcsék főként a plazmamembránban voltak láthatók. Azonban a sejtek citoplazmájában, azon belül is intracelluláris membránokon is találtunk pozitív jelölődést. Immunpozitivitást tapasztaltunk az endoplazmatikus retikulum ciszternáin, illetve vakuólumok és granulumok membránjain. Ezen kívül a regenerálódó testvégben olyan PAC1immunpozitív
sejttípusokat
találunk,
melyek
hosszú
nyúlvánnyal/
nyúlványokkal
rendelkeznek. (28/b ábra) Találtunk továbbá olyan amoebocyta jellegű sejteket is, melyek szintén PAC1-immunpozitívak és sejtmagjukban nagyméretű invagináció figyelhető meg. Ezekből a sejtekből sokkal több figyelhető meg, mint az intakt állatokban. Valószínűsíthető, hogy ez a sejttípus aktiválódik a regenerációs folyamatok során.
64
28. ábra: a, b: PAC1 immunpozitivitást mutató coelomasejtek a regenerálódó testvégben. C: negatív kontroll. Jelmagyarázat: Nyilak: PAC1R-szerű fehérje. Aránymérték: a: 500 nm, b, c: 1 µm. 65
Radioimmunoassay kísérleteinkben vizsgáltuk az intakt és regenerálódó állatokból izolált coelomasejtek PACAP27-, és PACAP38-szerű peptidek koncentráció-változását (29. ábra). PACAP27 és PACAP38-szerű peptidek jelenléte kimutatható volt mind sértetlen mind regenerálódó állatokban. Az intakt állatok teljes testéből izolált coelomasejtekben a PACAP27-szerű peptid 6,03±1,09 fmol/mg, a PACAP38-szerű peptid pedig 69,19±19,11 fmol/mg koncentrációban volt jelen (29/a ábra). Ezzel szemben a sértést követő 3. órában vett mintákban a PACAP38-szerű peptid koncentrációja szignifikánsan lecsökkent, majd a regeneráció első és 5. napján már folyamatos, a kontroll állatokban mért értéket meghaladó koncentráció-emelkedést mutatott (29/a ábra). A fiziológiás PACAP38-szerű peptid koncentrációja a sértést követő 2. héten állt helyre. A PACAP27-szerű peptid koncentrációja már a sértést követő 3. órában szignifikánsan magasabbnak mutatkozott a kontroll állatokban mért értékekhez képest. A regeneráció első napjától koncentrációja kisebb ingadozásokat mutatott, de a teljes vizsgált időszakban magasabb volt, mint az intakt állatokban (29/a ábra).
29/a ábra: A PACAP-szerű peptidek (PACAP27 és 38) RIA módszerrel mért koncentrációja az intakt és a regenerálódó egyedek coelomasejtjeiben. Jelmagyarázat: Kék: PACAP27; Piros: PACAP38. : p<0,1 ; : p<0,05. RIA kísérleteink következő fázisában azt vizsgáltuk, hogy testrészenként hogyan oszlik meg a coelomasejtek PACAP27-, illetve a PACAP38-szerű peptid koncentrációja a regeneráció kezdeti szakaszában, amikor a teljes testből izolált coelomasejtek PACAP-szerű 66
peptidek mennyisége emelkedést mutatott. Ezért megvizsgáltuk a sértett állatok különböző részeiből izolált coelomasejtek PACAP27-, és PACAP38-szerű peptid koncentrációját a regeneráció első öt napján (29/b ábra). A PACAP38-szerű peptid koncentrációja folyamatos emelkedést mutatott a műtétet követő időszakban mind a sértés előtti utolsó 5 intakt szelvényből, mind az anterior testfélből izolált coelomasejtekben (29/b ábra). Az egyes testrészekből származó, különböző időszakokban vett izolátumok egymáshoz történő összehasonlításakor
nem
kaptunk
jelentős
eltérést
a
PACAP27-szerű
peptid
koncentrációjában. A sértés előtti utolsó 5 intakt szelvényből izolált coelomasejtek PACAP27-, és PACAP38-szerű peptid koncentrációja a teljes vizsgált időszakban szignifikánsan alacsonyabb volt, mint a test többi részéből izolált coelomasejtekben mért értékek, ami arra utal, hogy a PACAP-szerű peptidek a regeneráció kezdeti szakaszában egy karakterisztikus rostrocaudális gradiens mentén változnak.
29/b ábra: A PACAP-szerű peptidek (PACAP27 és 38) RIA módszerrel mért koncentrációja regenerálódó egyedek coelomasejtjeiben. Az utolsó 5 szelvényben és az állat többi intakt szelvényében mért peptidkoncentrációk összehasonlítása. Jelmagyarázat: Kék: PACAP27; Piros: PACAP38. (5): a regenerálódott szelvények és a vágás előtti öt intakt szelvény coelomasejtjei. (M): A rostrális intakt szelvények coelomasejtjei. : p<0,1 ; : p<0,05 ; : p<0,01. 67
Western blot analízisünk alátámasztja (30. ábra) ultrastruktúrális vizsgálatainkat, miszerint PAC1 receptor-szerű fehérje található a giliszta izolált coelomasejtjeiben. A PAC1 receptor-szerű fehérje molekulatömege - ellentétben az emlős mintákéval, ahol 80-90 kDa magasságában kaptunk jelet – 40 kDa körül mutatkozott a coelomasejtekből készült izolátumokban.
30. ábra: PAC1 receptor Western blot vizsgálata intakt (Ci) és regenerálódó (Cr) egyedek coelomasejtjein. Kontrollként használt minták: egéragy (Br) és egér hipofízis (Hy).
A coelomasejtek savanyú foszfatáz tartalmának vizsgálata a regeneráció során A szövetdegenerációban jelentős szerepet játszanak egyes coelomasejtek, amelyek tömegesen vándorolnak be a sértett szöveti struktúrákba. Vizsgálataink szerint a bőrizomtömlőben, bélcsatornában és a sértett ganglionban nagy számban fordulnak elő magas fagocitáló aktivitással jellemezhető amoebocyták (31, 32. ábra). Ultrastruktúrális vizsgálataink azt mutatják, hogy a nyúlványokkal rendelkező, amoeboid sejtek savanyú foszfatáz tartalmú lizoszómákkal rendelkeznek. A sejtek szabálytalan alakúak, sejtmagjuk általában a sejt egyik oldalára szorul a nagyszámú lizoszóma, vakuólum és granulum miatt. A sejtek citoplazmájában erősen savanyú foszfatázpozitív kompartmenteket, lizoszómákat találtunk, illetve kevésbé denz vakuólumok is található bennük. A sejtek nyúlványai hosszúak, amelyek a sérült szöveti felszíneket, kötőszöveti és izomsejteken végződnek. Morfológiájukat tekintve a sejtek az amoebocyta csoportba sorolhatók. Az izolált, savanyú foszfatáz immuncitokémiai reakcióval megfestett coelomasejteket fizikai paramétereik (méret és granularitás), valamint immunfluoreszcencia intenzitásuk 68
alapján vizsgáltuk áramlási citometriával. Négy sejtpopulációt azonosítottunk, amelyek mérete és granularitása karakterisztikus eltéréseket mutatott (31. ábra). Az R1 populációba az erősen granulált kisméretű coelomasejtek, az R2 populációba az amoebocyták tartoznak, az R3 populációban többféle sejt található, de többségük erősen autofluoreszcens granulumokat tartalmazó eleocyta. Az R4 populáció sejtjei nagyméretű, erősen granulált sejtek. A legerősebb festődést az amoebocyta sejtpopulációban, tehát a nagyobb méretű, kevésbé granulált csoportban találtunk.
31. ábra: A regenerálódó egyedek áramlási citometriával azonosított coelomasejt populációi.
69
32. ábra: Degenerálódó szövetek és a savanyú foszfatáz aktivitású amoebocyták elektronmikroszkópos szerkezete. Jelmagyarázat: m: izomszövet; AcP: savanyú foszfatáz tartalmú granulumok a sejt citoplazmájában; ex: savanyú foszfatáz tartalmú granulumok az extracelluláris térben. Aránymérték: 1 µm. 70
5.2.2. A fagocitózis folyamatának vizsgálata A fagocitózis jelenségének vizsgálatakor azt tapasztaltuk mind fény- mind pedig elektronmikroszkópos mintáinkban, hogy az amoebocyták végzik az idegen anyagok bekebelezését. Kísérleteink során azt tapasztaltuk, hogy az intakt állatok coelomasejtjei idegen kompartmenteknek a testüregbe való juttatásával indukálhatók, a sejtek egy csoportja fagocitózisra képes. Birka vörösvértestek fagocitózisa Intakt állatok coelomájába injektált vörösvértestek fagocitózisát főként amoeboid típusú sejtek végzik a testüregben. A metszeteken látható, hogy a testüreg falára tapadó nyúlványos sejtek, illetve a coelomában aggregálódott sejtek is fagocitálták a fixált vörösvértesteket. A vizsgálatokból az is megállapítható, hogy az eleocyták illetve granulocyta típusú sejtek nem fagocitálták az 5-6 µm átmérőjű jellegzetes alakú erősen eozinofil vörösvértesteket (33. ábra).
33. ábra: Birka vörösvértestek fagocitózisa egy nappal az injektálás után. ch: chloragogen; bw: bőrizomtömlő; e: eleocyta; nyíl: amoebocyták, melyek fagocitálták a vörösvértesteket. Aránymérték: 20 µm.
71
Ezüst nanopartikulumok fagocitózisa in vitro In vitro vizsgálatok során a coelomasejtek 24 órás inkubációs idő után azt mutatták, hogy képesek bekebelezni a 80-100 nm méretű AgNP-okat. A sejtek közül főként amoebocyta típusú sejtek citoplazmájában találtunk nanopartikulumokat. Egyértelmű jelet kaptunk az amoebocyták fagoszómáiban (34/b és c ábra), bizonyítva, hogy a sejtek képesek partikulumok bekebelezésére. Ezen kívül mikrofagocitózis jeleit is láttuk mintáinkban (34/a ábra).
34. ábra: Ezüst nanopartikulumok fagocitózisa amoebocytákban. Aránymérték: a, b: 200 nm; c: 500 nm.
72
5.2.3. Citotoxicitás jelensége coelomasejt-lizátummal kezelt sejtvonalon A myeloma sejtvonalból származó sejtekhez coelomasejt-lizátumot adva azt tapasztaltuk, hogy a sejtekben jelentősen megnőtt az intracelluláris Ca2+ koncentrációja (35. ábra). Áramlási citometriai vizsgálatok során azt tapasztaltuk, hogy a sejtekhez adott coelomasejt-lizátum szinte azonnal Ca2+-jelet váltott ki, a kontrollhoz (LBSS) viszonyítva sokszorosára nőtt a Fluo3AM által indikált intracelluláris Ca2+ ion koncentráció. Ezen kívül azt is láthattuk, hogy a sejtekhez adott coelomasejt-lizátum dózisfüggő Ca2+-jelet indukál, hiszen az 1:1 arányban, pufferben higított lizátum jóval gyorsabb hatást váltott ki, mint az 1:2, illetve 1:10 arányban higított lizátum. Ezt mutatják az áramlási citometria során kapott diagramok is.
35. ábra: Citotoxicitás-vizsgálat áramlási citometriával. CCL: Sp2 sejtek kezelése különböző higítású coelomasejt-lizátummal kezelve. Kontroll: Sp2 sejtek kezelése a lizátum pufferével (LBSS).
73
Ultrastruktúrális vizsgálataink során az intakt Sp2 sejtek kisméretűnek mutatkoztak (36. ábra). A sejtek lekerekedettek, általában nem aggregálódnak, átmérőjük 6-7 µm. A sejtek nagy számban, rövid nyúlványokat hordoznak, amelyek néha sejtkapcsoló szerkezetekre emlékeztető struktúrákkal a szomszédos sejtek nyúlványaival mutat kapcsolatot. A sejtek magja gyakran lebenyezett, sejtmagvacskájuk gyakran hálózatos szerkezetet mutat. Mitokondriumaik
normál
méretűek
és
struktúrájúak,
általában
lekerekítettek.
Az
endoplazmatikus retikulum átlagos mennyiségű a sejtekben, gyakran jól látható a sejtmag körül. A Jurkat-sejtvonalból származó lizátummal kezelt kontroll mintákban a sejteken nem tapasztaltunk változást. Ahogy az áramlási citometriás eredményeken, TEM vizsgálatokban sem látható jelentős változás a sejtek morfológiájában sem. Coelomasejt-lizátummal kezelt sejtek ultrastruktúrális vizsgálatai során azt tapasztaltuk (37. ábra), hogy a sejtek megnőnek, megduzzadnak, átmérőjük elérheti a 10 µm-t is. A sejtek apró nyúlványai eltűnnek, még inkább lekerekedett sejteket figyelhetünk meg, sejtkapcsolatok nem láthatók. A sejtek magja is megduzzad, lebenyezettsége eltűnik, kromatinizációja megváltozik,
a
heterokromatin
állomány
nagyobb
arányban
figyelhető
meg.
A
mitokondriumok átmérője is megnő, gyakran nagyobb világos tereket láthatunk bennük. Az endoplazmatikus retikulum is megduzzad. A plazmamembránon dezorganizáció jeleit nem tapasztaltuk. A sejtmag membránján azonban elvétve sérüléseket láthatunk. A sejtek citoplazmájáról általánosságban elmondható, hogy denzitása csökken.
74
36. ábra: Intakt Sp2 sejtek transzmissziós elektronmikroszkópos felvételei. Jelmagyarázat: n: nucleus; m: mitokondrium; er: endoplazmatikus retikulum; nyíl: rövid citoplazma-nyúlványok sejtkapcsolatokkal. Aránymérték: a, b: 1 µm; c: 200 nm. 75
37. ábra: Coelomasejt-lizátummal kezelt Sp2 sejtek transzmissziós elektronmikroszkópos felvételei. Jelmagyarázat: n: nucleus; m: mitokondrium; md: membrán-dezorganizáció. Aránymérték: a, b: 1 µm; c, d: 500 nm.
76
6. Az eredmények megbeszélése A trágyagiliszta (E. fetida) coelomasejtjeinek fény- és elektronmikroszkópos vizsgálata, valamint egyes hisztokémiai tulajdonságai alapján azokat öt csoportba soroltuk: eleocyták, amoebocyták, granulocyták, bazofil citoplazmájú sejtek valamint lebenyezett sejtmagvú coelomasejtek (38. ábra). Eredményeink részben megerősítik az oligochaeta gyűrűsférgek coelomasejtjeinek szerkezetéről eddig felhalmozott adatokat, részben pedig a coelomasejtek nevezéktanának és tipizálásának újragondolását, finomítását vetik fel.
6.1. Eleocyták A coelomasejtek legkönnyebben azonosítható típusát, az eleocytát több fajban leírták. Liebmann
(1942a)
ezt
a
sejtalakot
leváló
chloragogén
sejtnek
tekinti,
hiszen
fénymikroszkópos tulajdonságaik nagyban hasonlítanak. A sejtek mérete, fénymikroszkópban azonosított granulumai nagyban hasonlítanak. Azonban sem Liebmann, sem pedig más a témával foglalkozó kutatócsoport nem tapasztalt olyan sejtosztódást a chloragogén szövetben, illetve olyan citológiai átalakulást, amely arra utalna, hogy ezek a sejtek valóban chloragogén eredetűek. Az A. chlorotica fajban leírt (Kurek és mtsai. 2007) eleocytát a szerzők a chloragocytával azonos sejttípusnak tartották. A sejtek nagy, sárgásbarna granulumokat (chloragosoma) tartalmaznak, melyek nem elektrondenzek, ezen kívül a citoplazma még glikogént halmoz fel nagyobb mennyiségben. A sejtek felszíne egyenetlen a chloragosomák és néhány kisebb pszeudopódium miatt. D. veneta hasonló jellegű sejtjeit szintén chloragocytaként
azonosították
(Adamowitz
2005).
A
sejt
citoplazmájára
az
organellummentes endoplazmára és a chloragosomákban, mitokondriumokban, egyéb elektrondenz granulumokban gazdag ektoplazmára való tagolódás jellemző. A sejtek pszeudopódiumokat nem képeznek és nem adherálódnak. Linthicum és munkacsoportja (1977) L. terrestrisben is azonosnak vélte a chloragocyta és az eleocyta sejttípust. A chloragogén szövetből származtatták ezeket a szabadon úszó sejteket, amelyek nagyszámú pszeudopódiumot formálnak sejtfelszínükön, ellentétben a másik két faj eleocytáival. A sejtek citoplazmája rendkívül gazdag olyan granulumokban, amelyek főként lipid, protein és szénhidrát tartalmúak, és exocitózissal a környezetbe ürülhetnek. Ugyanebben a fajban Stein és Cooper (1978) eleocytákat nem is említ. A chloragocyták egyik típusát korai alaknak tekintik és a chloragogén szövetben helyt ülő sejtekkel azonosnak tartják. Granulumaikkal hasonló festődést mutató citoplazmarészeket a coelomafolyadékban is találtak. A fejlettebb
77
chloragocyta alak kisebb méretű, aggregálódik a coelomafolyadékban és granulumai is kisebbek. Eredményeink szerint az E. fetida eleocytái, amelyek méretük és jellegzetes sejtmagszerkezetük alapján jól azonosíthatók, különböző citoplazma-szerkezetűek lehetnek. Az
eleocytának
nevezett
sejtek között
találtunk olyan
sejtalakokat
szabadon a
coelomafolyadékban, amelyek erősen hasonlítanak a chloragogén sejtekre, denz granulumok tömegét tartalmazzák citoplazmájukban. Találtunk olyan típusú sejteket is, amelyek a denz granulumok között egyre több lipidtartalmú kompartmentet halmoznak fel. Azonosítottunk olyan sejttípusokat, amelyek már szinte csak lipideket tartalmaznak, főként a citoplazma perifériás részén. Ezeknek a sejteknek a sejtmag körüli citoplazmája homogén, granulummentes. Valamint olyan alakokat is találtunk, amelyekben az előbb említett lipidcseppek, vakuólumok lényegesen nagyobbak, és szinte az egész citoplazmát kitöltik. A denz granulumot tartalmazó forma valószínűsíthetően a chloragogen szövetből leváló alak, amely a coelomában degranulálódik és esetleg átalakulhat lipidet, majd később vakuólmokat tartalmazó eleocytává. Elsőként adtunk fénymikroszkópos és ultrastruktúrális bizonyítékot arra, hogy a chloragogén sejtekből alakulhatnak ki az eleocyták. A chloragocyták osztódása után a bazális helyzetű periintestinális kapillárisokhoz kapcsolódó sejt chloragocytaként funkcionál tovább, míg az apikális helyzetű utódsejt a lefűződés után a coelomaüregbe kerülve eleocytaként folytatja életét. A frissen lefűződő eleocyták chloragocytákra emlékeztető sajátosságokat mutatnak, amely tényre már több korábbi szerző is felhívta a figyelmet (Linthicum és mtsai. 1977; Stein és Cooper 1978). Transzmissziós elektronmikroszkópos vizsgálataink azonban arra is ráirányították a figyelmet, hogy a chloragocyták apikális része az intracelluláris membránok mentén a vérlemezkékhez hasonlóan sejttöredék formájában is leválhat. A chloragogén eredetű sejttöredékeket fagocitáló coelomasejtek kebelezik be, így anyagaik egy részét a szervezet számára újrahasznosítják. A chloragosomák lebontásával kalciumionok szabadulnak fel a coelomaüregben, amelyek befolyásolhatják a coelomasejtek működését és aktivitását (Opper és mtsai. 2010).
6.2. Amoebocyták A coelomasejtek második nagy csoportját szinte minden fajban lymphocyta-szerű, agranuláris amoebocytának tartják/tartották. Már fecskendőférgek testüregi sejtjei között is leírtak hasonló morfológiájú, endocitózisra képes sejteket korábban (Stang-Voss 1970). 78
Kurek és munkacsoportja (2007) A. chlorotica coelomafolyadékában olyan sejteket hív hyalin vagy
agranuláris
amoebocytának,
amelyek
sejtmagja
ovális,
citoplazmája
szinte
granulummentes, és kiterjedt pszeudopódiumokat képeznek. D. venetában (Adamowitz 2005) a hasonló morfológiájú sejtek állábakat képeznek. A fiatalabbnak tekintett alakok organellumban szegényebbek, kevesebb lizoszómát, vakuólumot tartalmaznak. A fejlettebb alakok
jóval
több
denz
granulumot,
fagoszómát
és
mitokondriumot
hordoznak
citoplazmájukban. L. terrestrisben a rokon sejteket lymphocyta-szerű sejteknek tartották (Linthicum és mtsai. 1977), amelyek szintén különböző fejlettségi állapotokat produkáltak a coelomafolyadékban. Fejlettségi szintjükre pszeudopódiumaik méretéből és kiterjedéséből következtettek. A sejtek egy részének a magján invagináció mutatkozott. Ultrastruktúrális vizsgálatok szerint ezeknek a sejteknek a fagocitotikus, illetve lizoszómális aktivitása rendkívül intenzív. Ezen kívül irodalmi adatok vannak arra vonatkozóan, hogy a polychaeta gyűrűsférgek egyes, hasonló morfológiájú coelomasejtjei ugyancsak patogén baktériumok fagocitózisát végzik (Fiztgerald és Ratcliffe 1982). E. fetida-ban az amoebocyta sejtalaknak szintén több formáját találtuk meg. A sejtek különbséget
mutatnak
pszeudopódiumaik
méretében
és
számában,
vakuólumaik
mennyiségében, illetve fagoszómáik méretében és állapotában. Funkcionális vizsgálataink során azt tapasztaltuk, hogy az amoebocyták rendkívül magas savanyú-foszfatáz aktivitást mutatnak az állatok sérülését követően. A magas savanyú foszfatáz aktivitás főként olyan sejtekre
jellemző,
amelyek
lizoszómális
rendszere
intenzív
lebontást,
fagocitált
kompartmentek inaktiválását végzi. A sérülés helyén nagy számban megjelenő savanyúfoszfatáz aktivitást mutató sejtek valószínűleg a lizoszómális enzimeik egy részét exocitózissal az extracelluláris térbe ürítik, és ezek az enzimek szerepet játszanak a szövetlebontási folyamatokban. A magas savanyú foszfatáz aktivitású amoebocyták a degenerálódó szövetelemek bekebelezését és annak lebontását biztosítják. Intakt állatok coelomasejtjeinek vizsgálata során azt tapasztaltuk, hogy a sejtek környezetébe kerülő idegen anyagok (birka vörösvértestek, ezüst nanopartikulumok) indukálják az amoebocyták fagocitotikus aktivitását. Fénymikroszkópos kísérleteink során azt láttuk, hogy az állatok coelomaüregébe juttatott fixált emlős vörösvértestek bekebelezését, eliminálását az amoebocyták már rövid idővel (1 nap) az injektálás után elkezdik. In vitro kísérleteink pedig azt sugallják, hogy az amoebocyták mikrofagocitózis folyamatára is képesek, ugyanis eredményeink azt mutatják, hogy a sejtek a 80-100 nm átmérőjű ezüst nanopartikulumok bekebelezését is megkezdik már 24 órán belül.
79
Immunhiszto- és immuncitokémiai vizsgálataink során azt tapasztaltuk, hogy a regenerációs blasztémában és környékén megnő a PACAP - és annak specifikus receptora, a PAC1-immunpozitivitást mutató amoebocyták száma. A PAC1 receptor-szerű fehérjét immunarany jelöléssel a plazmamembránban és az intracelluláris membránokon is kimutattuk. Több közlemény utal arra, hogy gerincesekben a PAC1 receptor a durva felszínű endoplazmatikus retikulumhoz kötött riboszómákon transzlálódik, majd ugyanitt a ciszternákban raktározódik, és vezikuláris transzporttal jut el a sejtmembrán bizonyos területeire (Muroi és mtsai. 1998). Emiatt írtak le gerinces mintákban (agy, hasnyálmirigy) intracelluláris PAC1-immunreaktív mintázatokat (Seki és mtsai. 1997). A coelomasejtek ultrastruktúrális vizsgálata során szintén hasonló eredményeket kaptunk, miszerint immunarany jelölést detektáltunk az ER membránjain, egyéb endomembránokon, vezikulák membránjain és a sejtmembránon. Immunjelölésünk során az intracelluláris immunaranyszemcsék valószínűsíthetően az inaktív, a plazmamembrán felé való transzportjának útvonalán lévő PAC1-szerű peptideket jelölték. A plazmamembránon kapott jel pedig már a kész, aktív forma jelenlétére utal. Western blot analízisünk során 40 kDa molekulasúlyú PAC1-R-szerű fehérjét mutattunk ki izolált coelomasejtekben. A PAC1R molakulatömege nagyfokú változatosságot mutat különböző fajokban. Ennek oka egyrészt a splice-variánsok megléte lehet (Vaudry és mtsai. 2000), másrészt az alkalmazott protokolltól függően Western blot analízis során különböző glikoziláltsági fokú fehérjék azonosítása lehetséges (Hashimoto és mtsai. 2000; Abu-Hamdan és mtsai. 2006).
6.3. Granulocyták A coelomasejtek harmadik nagy csoportja, a granulocyták, az előző két csoporthoz hasonlóan rendkívül nagyfokú heterogenitást mutat az egyes fajok coelomasejtjeinek jellemzése során. Már a kagylók haemolymphájában találkozhatunk különböző festődési tulajdonságú granulocytákkal (Cima és mtsai. 2000). A gyűrűsférgek közül pedig az A. chlorotica granulocytái kisméretű elektrondenz granulumokban gazdagok, és állábakat képeznek (Kurek és mtsai. 2007). Adamowitz szerint (2005) a granulocyták D. veneta-ban nem aggregálódnak, nem képeznek pszeudopódiumokat, szinte csak a citoplazma centrális része tartalmaz granulumokat, amelyek között mitokondriumok, lizoszómák, szabad riboszómák és különböző elektrondenzitású vakuólumok vannak. A L. terrestris granulocytaszerű coelomasejtjei (Linthicum és mtsai. 1977) rendkívül változatosak, a granulumok alakja, 80
elhelyezkedése, denzitása alapján, valamint a sejtek alakja, pszeudopódiumok megléte szerint több alakot is megkülönböztethetünk köztük. Stein és Cooper (1978) szintén ebben a fajban jellemezte a granulocytákat, amelyek a gerincesek granulocytáihoz hasonlóan többféle festődésűek lehetnek. Mintáinkban a granulocyták is különböző megjelenési formákat mutattak. A sejtek granulumai gyakran PAS-pozitívak, amely nagyobb szénhidráttartalom jelenlétére utalhat, illetve a lizoszómák enzimjeinek szénhidráttartalmát is mutathatja. Immunhisztokémiai vizsgálataink szerint a granulocyta sejtek PACAP-szerű peptidtartalma a regeneráció során megnő, hasonlóan az amoebocytákhoz. Radioimmunoassay analízisünk során azt az eredményt kaptuk, hogy a PACAP38 koncentrációja a sértést követő 3. órában már alacsonyabb volt, mint az intakt állatokban, ami arra enged következtetni, hogy a sejtek leadták PACAP38-tartalmukat, vagyis a PACAP38-nak közvetlen szerepe lehet a sérülésre adott válaszban. A PACAP27 és 38-szerű peptidek koncentrációja a vágást követő ötödik napra viszont emelkedést mutatott, amely azt sugallja, hogy ezeknek a peptideknek szerepe lehet a helyreállítási mechanizmusokban, esetlegesen apoptotikus folyamatok szabályozásában (Sherwood és mtsai 2000). Ezen kívül pedig a vizsgált peptidek koncentrációja rostrocaudális irányban változik. Eszerint a sérülést követő helyreállító folyamatok során a coelomasejtek, főként a granulocyták a sérült testvéghez szállítanak bizonyos bioaktív anyagokat, majd ott azt képesek leadni. Gerinctelenek közül főként a Drosophila melanogaster idegrendszerében találtak nagyobb PACAP koncentrációt, főként az idegrendszer ontogenezise során, ahol a peptid valószínűleg neurotranszmitterként funkcionál (Zhong 1995; Bhattacharya és mtsai. 2004). Ezen kívül immunhisztokémiai és immuncitokémiai módszerekkel kimutatták a gyűrűsférgek központi idegrendszerében, illetve a perifériális szövetekben (bőrizomtömlő, bélcsatorna) két változatát, a PACAP27-t és a PACAP38-t, valamint a PAC1 receptor jelenlétét (Molnár és mtsai. 2006, 2008; Reglődi és mtsai. 2000). A Lumbricus polyphemus agydúcában a PACAP 27 nagyobb koncentrációban van jelen, mint a 38 aminosavból álló forma (Somogyvári-Vigh és mtsai. 2000).A kevéssertéjű gilisztákban főként az idegrendszerben tanulmányozták a PACAP formák és a PAC1 eloszlását. Az idegrendszer sejtjei között számos neuroszekréciós sejtcsoport is PACAP-szerű peptidekre vonatkozóan immunpozitívnak bizonyult, tehát valószínűleg ezen sejtek PACAP-termelése okozza azt, hogy a vérben nagy koncentrációban van jelen mindkét PACAP-izoforma (Molnár és mtsai. 2011). Valószínűsíthető tehát, hogy a coelomasejtek a vérből veszik fel PACAP-szerű peptideket, majd azokat a sérülés helyére szállítják. 81
Gerincesek esetében a PACAP stimulálja hízósejtekben a hisztamin és a szerotonin termelését, amely arra enged következtetni, hogy a molekula valószínűleg befolyásolja a gyulladásos folyamatok szabályozását (Mori és mtsai. 1994, Seebeck és mtsai. 1998). Makrofágokban a PACAP gátolja az IL-6, az IL-2 és a TNF-α, emellett pedig serkenti az IL10 termelődését. Mindebből arra lehet következtetni, hogy a PACAP és agonistái gátolják a proinflammatórikus és serkentik az anti-inflammatórikus folyamatokat, vagyis lassítják a gyulladásos folyamatokat (Delgado és mtsai. 1998, Martinez és mtsai. 1998). Ezen kívül pedig számos eredmény számol be arról, hogy a PACAP-nak növekedési faktor-szerű hatása lehet az idegrendszer fejlődésében és a sérülést követő regenerációban (Vaudry és mtsai. 2000; Waschek 2002). Kimutatták, hogy a PACAP szabályozza az axonfejlődést (Guirland és mtsai. 2003), illetve elősegíti az axonális regenerációt a sérülések helyén (Kimura és mtsai. 2003). A PACAP hatása a gerincesek embrionális neurogenezisében (Sherwood és mtsai. 2007; Waschek 2002), illetve a perifériás idegrendszer regenerációjában már korábban ismertté vált (Meyer és mtsai. 2006). A neurotrofikus hatáson túl exogén PACAP in vitro toxicitás és in vivo agyi pathológiás modellekben elért protektív hatását vizsgálták (Somogyvári-Vigh és Reglődi 2004). Más szerzők a PACAP protektív hatását tanulmányozták apoptózist indukáló tényezőkkel szemben kisagyi szemcsesejtekben (Vaudry és mtsai. 2003), valamint kimutatták, hogy a PACAP csökkenti a károsodást és javítja a funkcionális eredményeket Parkinson-kóros modellekben (Reglődi és mtsai. 2004). Az idegrendszerben feltehetően léteznek olyan védelmi mechanizmusok, amelyek helyreállítják a kisebb sérüléseket és indukálják az idegi javító mechanizmusokat, és ebben a működésben valószínűleg fontos szerepet játszik a PACAP. Vizsgálataink alapján elmondhatjuk, hogy a coelomasejtek nem csak a PACAP-szerű peptidek jelenlétével jellemezhetők, hanem mindenképpen valamilyen PAC1-szerű receptor expressziójára is képesek. Ebből pedig azt a következtetést vonhatjuk le, hogy a sejtek aktivitása a receptoron keresztül módosítható PACAP-szerű peptiddel, vagy olyan peptiddel, amelyet ez a receptor képes specifikusan megkötni. Eredményeink alapján tehát elmondható, hogy (1) funkcionális kapcsolat lehet a PACAP peptidek és a gyűrűsférgek regenerációja között; (2) a coelomasejtek bizonyos populációi valószínűleg PACAP-ot szállítanak (és esetleg szintetizálnak) a regenerálódó testrészben; (3) a coelomasejtek egy csoportja, főként az amoebocyták valószínűleg mind PACAP, mind pedig PAC1 receptort expresszálnak, amely arra utalhat, hogy a PACAP a 82
regeneráció során autokrin és parakrin szabályozási folyamatokban is részt vehet a coelomasejtek esetében.
6.4. Bazofil sejtek A coelomasejtekből készült fénymikroszkópos kenetekben kis mennyiségben bazofil sejteket találtunk, amelyek méretük és struktúrájuk alapján két csoportba tartozhatnak. Az egyik csoportba olyan 8-10 µm átmérőjű sejteket sorolhatunk, melyek citoplazmája homogén bazofil festődést mutat, a citoplazma granulumokat nem tartalmaz. A sejtek magja nagyméretű (4-5 µm átmérőjű), lekerekített, gyakran a sejtek perifériájára szorul. A sejt nyúlványokat nem képez, általában csoportosan fordulnak elő a coelomában. Erről a sejttípusról korábban még senki nem számolt be és funkciójának megismeréséhez további vizsgálatok szükségesek. A bazofil kisméretű sejtek másik csoportjába a már korábban leírt neoblastok sorolhatók, amelyek kisebb átmérőjűek (6-7 µm). Sejtmagjuk a sejt méretéhez képest feltűnően nagy (4-5 µm) és általában a sejt közepén helyezkedik el. A sejtek citoplazmája nehezen vizsgálható, ugyanis az csak egy keskeny gyűrűként van jelen a sejtmag körül. A sejtek szintén lekerekítettek, jellemzően csoportokban jelennek meg a coelomaüregben. A regenerálódó testvég vizsgálata során elektronmikroszkópos képeken is azonosítani tudtuk ezt a sejttípust, amely jellemzően a regenerálódó állatban jellemzően nagyobb számban fordul elő.
A
sejtek
ultrastruktúrális
vizsgálat
során
megerősítették
fénymikroszkópos
eredményeinket, a sejtek magja nagyméretű, kromatinja erősen kondenzált, a nucleolus gyakran látható. Immuncitokémiai vizsgálataink során egyes neoblastok membránjain szintén találtunk PAC1-szerű immunarany jelölést, amely arra utalhat, hogy a PACAP esetlegesen a neoblastok letapadását, differenciálódását is befolyásolhatja. A neoblastok különböző fejlődési stádiumokat mutatnak, miszerint a legfejletlenebb kerek, nyúlványoktól mentes alakok és a különböző differenciáltságú sejtalakok is megtalálhatók a coelomaüregben, a regenerációs blasztémában és az újonnan differenciálódó szövetek felszínén. A sejtek gyakran képeznek jól látható sejtkapcsoló struktúrákat, amelyek szintén arra utalhatnak, hogy a differenciálódó szövetek részeként élik tovább életüket.
6.5. Egyéb sejttípusok Az intakt egyedek coelomasejtjei között találtunk lebenyezett magvú sejteket is, amelyeknek
száma
szintén
felszaporodott
83
a
regenerálódó
egyedekben.
A
sejtek
fénymikroszkópos azonosítása után elektronmikroszkópos vizsgálatok segítségével is azonosítani tudtuk ezt a sejttípust. Korábbi irodalmi adatok már léteztek erre a sejttípusra vonatkozóan (Linthicum és mtsai. 1977). Mivel ezeknek a sejtek a száma megnő a regenerálódó egyedekben, főként a sérült szövetek környezetében, arra lehet következtetni, hogy ezek a sejtek segítenek a sérülés helyreállításában. Általában ezek a sejtek nagyméretű nyúlványokkal rendelkeznek, és ezek a nyúlványok rendszerint nagyszámú denz fagoszómát tartalmaznak, emiatt talán a sérült szöveti törmelék eltakarításában, esetleg a sérülést követő mikroorganizmusok elleni védekezésben lehet szerepe. Ennek a sejtnek a részletes morfológiai leírásra, valamint a regenerációban betöltött szerepére korábbi adatok nem ismertek. Az általunk multinukleáris sejtnek vélt sejtalakok rendszeresen, de kis számban találhatók kenetekben. Stein és mtsai (1978) L. terrestris-ben fénymikroszkópos preparátumokon azonosítottak soksejtmagvú sejteket a testüregben. A sejteknek valószínűleg szerepe lehet a regenerációs folyamatokban, ugyanis vizsgálataink azt mutatják, hogy regenerált egyedekből készült mintákban gyakrabban vannak jelen ezek a sejtalakok. Fénymikroszkópos mintáinkban talált nagyméretű, PAS-pozitív granulumokkal rendelkező, valamint a fagoszómákkal teli citoplazmával jellemezhető sejttípusok korábbi leírásokban nem találhatók. A sejtek ultrastruktúrális és funkcionális jellemzéséhez további vizsgálatokra van szükség.
6.6. Funkcionális kapcsolatok Kísérleteink eredményeinek és a korábbi irodalmi adatoknak az összevetése után az a feltételezésünk, hogy az oligochaeta gyűrűsférgek coelomasejtjei inkább funkcionális szempontból különíthetőek el egymástól, és kevésbé a morfológia alapján. A vizsgált állatok életkörülményeinek, életfolyamatainak köszönhetően a környezettel közvetlen kapcsolatban álló coelomaüreg sejtjei folyamatos fejlődésben, átalakulásban lehetnek, ez lehet az oka annak, hogy minden egyes szerző más-más sejtalakokat tartott dominánsnak a vizsgált fajok coelomasejtjeinek esetében. A különböző fejlődésű sejtcsoportok tényleges kapcsolatainak bebizonyítására sejtfelszíni markerek vizsgálatát kívánjuk a jövőben elvégezni. Kevés és viszonylag korai irodalmi adat (Herlant-Meewis 1965) áll rendelkezésünkre arra vonatkozóan, hogy az immunkompetens coelomasejtek milyen szerepet játszanak a restitúciós folyamatokban. Ezek alapján a coelomasejtek közül az aggregálódott amoebocyták a sebzáródásban, az eleocyták pedig nutritív anyagoknak a sérülés helyére történő szállításában vesznek részt. Egyéb korábbi közlemények szerint (Liebmann 1942b) a 84
coelomasejtek
más
szerepet
is
betölthetnek
a
regenerálódó
testvég
szöveteinek
újraképzésében. Eszerint egyes coelomasejtek dedifferenciálódnak a sérülés hatására, majd a sérülés
helyén
megtapadva
különböző
szöveti
sejtekké
(izom
és
hámsejtekké)
differenciálódnak. Tapasztalataink szerint a regenerációs blasztéma nem csak amoebocytákat és eleocytákat tartalmaz, ahogy azt korábbi közlemények állítják (Liebmann 1942b, HerlantMeewis 1965), hanem nagy számban találunk a regenerálódó testvégben granulocytákat, amelyek szintén bioaktív anyagok szállításában vehetnek részt. Ezen kívül ellentétben azzal a korábbi feltételezéssel, miszerint a coelomasejtek transzformálódnak és különböző pótolandó szöveti sejtekké differenciálódnak (Herlant-Meewis 1965; Jamieson 1981), megállapíthatjuk, hogy valószínűleg a regenerációs blasztémában nagy számban előforduló totipotens neoblastok végzik a sérült szövetek pótlását, helyreállítását. Ultrastruktúrális vizsgálataink során azt tapasztaltuk, hogy bár az amoebocyták valóban nagy számban vannak jelen a regenerálódó testvégben, felszaporodnak a sérülés környezetében, és csupán a sérülés következtében felhalmozódó sejttörmelékek fagocitózisát, eltakarítását végzik. Azonban nem tapasztaltuk a sejtek differenciálódását. A fagocitáló amoebocytákról ultrastruktúrális vizsgálataink alapján elmondhatjuk, hogy nagyméretű sérült sejteket és kisebb méretű sejttörmelékeket is képesek bekebelezni. Ezzel biztosítják a neoblastok számára a megtapadási felszíneket, valamint a sérülés következtében beáramló mikróbák eliminálásával védelmi feladatot is elláthatnak. A coelomasejtek immunfolyamatokban betöltött szerepére vonatkozóan bizonyítékot szolgáltattunk egyrészt a fent említett fagocitotikus aktivitás megerősítésével, másrészt kísérleteink eredményei azt is alátámasztják, hogy a sejtek valószínűleg olyan citolítikus anyagokat termelnek, melyek az idegen sejtek elpusztításában fontos szerepet játszanak. A gyűrűsférgek immunrendszere nem csak celluláris, hanem humorális immunválasz kialakítására is képes (Bilej és mtsai. 2000), amelyet bizonyítanak azok a korábbi irodalmi adatok, miszerint a coelomafolyadékban különböző antimikrobiális, citolítikus hatású bioaktív anyagok azonosíthatóak (Lassalle és mtsai. 1988; Stein és Cooper 1988; Valembois és mtsai. 1991; Jarosz és Glinski 1997; Cooper és mtsai. 1974; Roch és mtsai. 1981; Milochau és mtsai. 1997). Ezeket valószínűleg a szabadon úszó coelomasejtek termelik. Kísérleteink során megerősítettük azt a korábbi felvetést, miszerint a coelomasejtek citoplazmájából olyan anyagok szabadulhatnak fel, amelyek idegen sejtek elpusztítására képesek, hiszen a sejtekből ultrahangos roncsolás segítségével nyert coelomasejt-lizátum dózistól függően Sp2 sejtek elpusztítására képes. A felszabaduló anyagok a célsejtekben intracelluláris kalciumion85
felhalmozódást okoznak, amely arra utalhat, hogy a sejtek plazma és intracelluláris endoplazmatikus
membránjai
károsodnak.
Ezt
alátámasztják
elektronmikroszkópos
megfigyeléseink, melyek szerint a sejtek mitokondriális membránjai is sérüléseket szenvednek. A mitokondriumok membránjának sérülése összefüggésben állhat a sejt kalciumanyagcseréjével (Bernardi és Rasola 2007). További Annexin- és Tunnel assay vizsgálataink azt sugállják, hogy valóban apoptotikus folyamatok zajlanak a lizátumkezelést követően, azonban
ennek
megerősítéséhez
még
további
vizsgálatok
szükségesek.
Azonban
ultrastruktúrális tapasztalataink azt a feltételezést megerősítik, miszerint a coelomasejtek által termelt faktorok apoptózis-szerű folyamatot indítanak el a célsejteken. Az apoptózis során a mitokondriumok
(mint
intracelluláris
kálciumraktárak)
károsodnak,
membránjaik
permeabililtása megváltozik, a raktározott kalcium pedig a sejt plazmájába ürül. A membránok integritásának felborulását, permeabilitásuk megváltozását okozhatták a membránokban található sphingomielinhez kötődő faktorok. A sphingomielin pedig a gerincesek mellett főként baktériumok és állati egysejtűek jellemző membrán-komponense (Yamayi és mtsai 1998), amely szintén bizonyíték lehet arra, hogy a coelomasejtek által termelt faktoroknak fontos szerepe lehet a vizsgált faj természetes környezetében előforduló mikróbákkal szembeni védekező mechanizmusokban. Korábbi irodalmi adatok alapján már ismert, hogy a coelomafolyadékban található molekulák közül több is sphingolipidekhez kötődve fejti ki citotoxikus, lítikus hatását (Valembois és mtsai. 1982; Lange és mtsai. 1997), ezeknek egy része olyan jelátviteli mechanizmusokat is indukál, melyben kálcium-ionok, mint másodlagos hírvivők is részt vesznek. Kobayashi és munkacsoportja (2001) már in vitro kísérletekben bizonyította, hogy a lysenin képes daganatos sejtvonalak lízisére. Ezek alapján elmondhatjuk, hogy a coelomasejtek lizátuma apoptózis-szerű folyamatot indít el emlős célsejtekben, és ebben nagy szerep lehet, a coelomasejtek által termelt citolítikus faktoroknak. A folyamat során az elpusztított sejtekben bizonyítottan membránkárosodás zajlik.
86
87
7. Összefoglalás Munkánk során a trágyagiliszta (E. fetida) coelomasejtjeinek tanulmányozásával foglalkoztunk mikroszkópos és molekuláris biológiai módszerekkel. Vizsgálataink során konvencionális fény- és elektronmikroszkópos technikákkal azonosítottuk az eleocyta, az amoebocyta és a granulocyta sejttípusokat. Ezen felül a csoportokban főként ultrastruktúra alapján altípusokat, lehetséges fejlődési stádiumokat írtunk le. Bizonyítékot szolgáltatunk arra vonatkozóan, hogy a coelomasejtek egy része a trofikus valamint raktározó funkciót ellátó, hemoglobintermelő chloragogén szövet sejtjeiből származhat. Elektronmikroszkópos felvételeinken azt tapasztaltuk, hogy a perifériás chloragogén szövet sejtjeiről a gerincesek vérlemezkéihez hasonlóan diszkrét citoplazma szegmensek fűződnek le, valamint a chloragogén sejtek osztódására is találtunk példát. A coelomasejtek funkciói közül részletesen jellemeztük a regenerációban betöltött szerepüket. Ultrastruktúrális vizsgálataink alapján elmondhatjuk, hogy az eleocyták és a granulocyták valószínűleg bioaktív anyagok szállítását végzik a regenerálódó testrészbe. Igazoltuk az amoebocyták fagocitotikus aktivitását és indukálható savanyú-foszfatáz termelését. Ez alapján elmondhatjuk, hogy az amoebocyták felismerik, fagocitálják és eliminálják a sérült szöveti törmeléket és a sejtmaradványokat. Fény- elektronmikroszkópos immunhiszto-
és
immuncitokémia,
radioimmunoassay
és
Western
blot
analízis
alkalmazásával kimutattuk, hogy a korábban már gerincesekben bizonyított neuroprotektív hatású peptid, a hipofízis adenilát cikláz aktiváló peptid PACAP–szerű peptid és annak specifikus (PAC1-szerű) receptora jelen van a regenerálódó testvég coelomasejtjeiben. Eredményeink azt mutatják, hogy a giliszta PACAP-szerű peptidjeinek koncentrációja megnő a regenerálódó egyedek coelomasejtjeiben, és eloszlásuk rostrocaudális irányban csökken. Ez arra utalhat, hogy a sejtek felveszik és a sebzés helyére szállítják a vizsgált peptideket. Regenerációs kísérleteink során azt tapasztaltuk, hogy korábbi adatokkal ellentétben nem a szabadon úszó coelomasejtek transzformációjával és differenciálódásával alakulnak ki a regenerált testrész szövetei, hanem a coelomaüregben sérülés hatására felszaporodó mezodermális eredetű totipotens őssejtek, a neoblastok alakítják ki azokat. Ezen kívül a sejtekből készült coelomasejt-lizátummal daganatos sejtvonal sejtjeit kezeltük. Áramlási citometriás és ultrastruktúrális vizsgálataink alapján megállapítottuk, hogy a coelomasejtek lizátuma citotoxikus hatással rendelkezik, mely bizonyíték lehet a humorális immunválasz kialakításában való aktív részvételre.
88
8. Summary The coelomocytes of the earthworm (E. fetida) were studied with microscopic and molecular biological methods. Similarly to the previous foundings three major types of coelomocytes, the eleocyte, the granulocyte and the amoebocyte were identified and characterized with conventional light- and electron microscopical techniques and histochemical methods. In addition, subtypes and possible developmental stages were described within these groups on the basis of their ultrastructure and cytochemical features. Our results show that both eleocytes and granulated cell debris originated from haemoglobin-producing chloragogen tissue possessing also trophic and storage functions. Based on electron microscopic results, we have to conclude that discrete cytoplasmic segments split from the peripheral chloragocytes like the platelets in the vertebrates from megakaryocytes, while eleocytes are apical daugther cells of dividing chloragocytes. The role of coelomocytes was described in the regeneration. We conclude by ultrastructural data that certain bioactive materials are transported to regenerating part of the body by eleocytes and granulocytes. The phagocytic activity and inducible production of acid phosphatase were confirmed in the amoebocytes. Based on the above mentioned amoebocytes recognize, phagocyte and eliminate the damaged cells and cell debris. It was showed with light-and electron-microscopic immunocytochemistry, radioimmunoassay and Western blot analysis that the neuroprotective PACAP-like peptides (which were previously demonstrated in vertebrates than pituitary adenylate cyclase activating peptide) and their specific PAC1-like receptor occurre in the coelomocytes isolated from the regenerating caudal segments. Our results show, that the concentration of PACAP-like peptides increased in the coelomocytes of the regenerating animals, and the amount of these compounds show a decreasing rostrocaudal gradient. It may indicate that coelomocytes uptake and transport these peptides to regenerating segments. Contrary to previous data we found that the renewing tissues of the regenerating body part do not originate from the free-floating coelomocytes or dedifferentiating tissues, but they are formed from the mesodermal totipotent stem cells, so called neoblasts, that migrate to the site of damage, attach to old tissues. Furthermore, cells of cancer cell lines were treated with lysate of coelomocytes. It can be established by our flow cytometric and ultrastructural studies, that the coelomocyte lysate has cytotoxic effect, which may be evidence of active involvement in humoral immune response.
89
9. Köszönetnyilvánítás Mindenekelőtt köszönetet szeretnék mondani témavezetőimnek dr. Pollák Editnek és dr. Molnár Lászlónak, hogy munkámat szakdolgozókén és PhD hallgatóként is segítették, támogatták, és nem csak szakmai, hanem baráti segítséget is nyújtottak abban, hogy pályafutásomnak ehhez a pontjához érkezzem. Köszönet illeti dr. Engelmann Pétert, aki a molekuláris biológiai módszerekben segített, és mint barát, egyengette munkámat phd-s éveim alatt. Külön köszönetet szeretnék mondani dr. Boros Ákosnak, aki seniorként nagyon sokban segített a laborban és azon kívül is. Ezen kívül köszönöm az Általános Állattani Tanszék dolgozóinak, Gunszt Dórának, Pozsgay Sándornénak és a tanszék szakdolgozóinak a sok segítséget. Valamint köszönöm páromnak, családomnak és barátaimnak, hogy munkámhoz a nyugodt hátteret biztosították, és támogattak abban, hogy ez a dolgozat elkészüljön.
90
10. Irodalomjegyzék Abu-Hamdan MD, Drescher MJ, Ramakrishnan NA, Khan KM, Toma VS, Hatfield JS, Drescher DG (2006) Pituitary adenylyl cyclase-activating polypeptide (PACAP) and its receptor (PAC1-R) in the cochlea: evidence for specific transcript expression of PAC1R splice variants in rat microdissected cochlear subfractions. Neuroscience 140(1):147161. Adamowicz A (2005) Morphology and ultrastructure of the earthworm Dendrobena veneta (Lumbricidae) coelomocytes. Tissue Cell 37(2):125-133. Affar EB, Dufour M, Poirier GG, Nadeau D (1998) Isolation, purification and partial characterization of chloragocytes from the earthworm species Lumbricus terrestris. Mol Cell Biochem 185(1-2):123-133. Arimura A, Somogyvári-Vigh A, Miyata A, Mizuno K, Coy DH, Kitada C (1991) Tissue distribution of PACAP as determined by RIA: highly abundant in the rat brain and testes. Endocrinology 129(5):2787-2789. Aros B, Vígh B (1959) Changes in the neurosecretion of the nervous system of earthworm under various external conditions. Acta Biol Hung 3. 47. Bernardi P, Rasola A (2007) Calcium and cell death: the mitochondrial connection. Subcell Biochem 45:481-506. Beschin A, Bilej M, Hanssens F, Raymakers J, Van Dyck E, Revets H, Brys L, Gomez J, De Baetselier P, Timmermans M (1998) Identification and cloning of a glucan- and lipopolysaccharide-binding protein from Eisenia foetida earthworm involved in the activation of prophenoloxidase cascade. J Biol Chem 273(38):24948-24954. Beschin A, Lucas R, De Baetselier P, Köhlerova P, Bilej M (2002) TNF analogue in earthworms and role of lectin-saccharide interactions in regulatory functions of primitive cytokines. In: Cooper EL, Beschin A, Bilej M (eds) A new model for analyzing antimicrobial peptides with biomedical applications. IOS Press NATO Science Series, pp. 149–163. Bhattacharya A, Lakhman SS, Singh S (2004) Modulation of L-type calcium channels in Drosophila via a pituitary adenylyl cyclase-activating polypeptide (PACAP)-mediated pathway. J Biol Chem 279(36):37291-37297.
91
Bilej M, Brys L, Beschin A, Lucas R, Vercauteren E, Hanušová R, De Baetselier P (1995) Identification of a cytolytic protein in the coelomic fluid of Eisenia fetida earthworms. Immunol Lett 45(1-2):123-128. Bilej M, De Baetselier P, Beschin A (2000) Antimicrobial defense of the earthworm. Folia Microbiol 45(4):283-300. Boldizsar F, Berki T, Miseta A, Nemeth P (2002) Effect of hyperglycemia on the basal cytosolic free calcium level, calcium signal and tyrosine-phosphorylation in human Tcells. Immunol Lett 82(1-2):159–164. Buscail L, Gourlet P, Cauvin A, De Neef P, Gossen D, Arimura A, Miyata A, Coy DH, Robberecht P, Christophe J (1990) Presence of highly selective receptors for PACAP (pituitary adenylate cyclase activating peptide) in membranes from the rat pancreatic acinar cell line AR 4-2J. FEBS Lett 262(1):77-81. Cho JH, Park CB, Yoon YG, Kim SC (1998) Lumbricin I, a novel proline-rich antimicrobial peptide
from
the
earthworm:
purification,
cDNA
cloning
and
molecular
characterization. Acta Biochim Biophys Sin 1408(1):67-76. Cima F, Matozzo V, Marin MG, Ballarin L (2000) Haemocytes of the clam Tapes philippinarum (Adams & Reeve, 1850): morphofunctional characterisation. Fish Shellfish Immunol 10(8):677-693. Colwell CS, Michel S, Itri J, Rodriguez W, Tam J, Lelièvre V, Hu Z, Waschek JA (2004) Selective deficits in the circadian light response in mice lacking PACAP. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol 287(5):1194-1201. Cooper EL, Lemmi CA, Moore TC (1974) Agglutinins and cellular immunity in earthworms. Ann New York Acad Sci 234(0):34-50. Cooper EL, Stein EA (1981) Oligochaetes. In: Ratcliffe NA, Rowley AF (eds) Invertebrate blood cells. Academic Press San Diego, pp. 75–140. Cooper EL, Cossarizza A, Suzuki MM, Salvioli S, Capri M, Quaglino D, Franceschi C (1995) Autogeneic but not allogeneic earthworm effector coelomocytes kill the mammalian tumor cell target K562. Cell Immunol 166(1):113-122. Cooper EL (1996) Earthworm immunity. In: Rincevich B, Müller WEG (eds) Invertebrate Immunology. Springer, Berlin, Heidelberg, pp. 10-45. Cooper EL (2001) Immune Response: Evolution. Ecyclopedia of Life Science. Cooper EL, Kauschke E, Cossarizza A (2002) Digging for innate immunity since Darwin and Metchnikoff. BioEssays 24(4):319-333.
92
Cooper EL, Kvell K, Engelmann P, Nemeth P (2006) Still waiting for the toll? Immunol Lett 104(1-2):18-28. Cossarizza A, Cooper EL, Suzuki MM, Salvioli S, Capri M, Gri G, Quaglino D, Franceschi C (1996) Earthworm leukocytes that are not phagocytic and cross-react with several human epitopes can kill human tumor cell lines. Exp Cell Res 224(1):174-182. Decker JM, Elmholt A, Muchmore AV (1981) Spontaneous cytotoxicity mediated by invertebrate mononuclear cells toward normal and malignant vertebrate targets: inhibition by defined mono- and disaccharides. Cell Immunol 59(1):161-170. Delgado M, Munoz-Elias EJ, Kan Y, Gozes I, Fridkin M, Brenneman DE, Gomariz RP, Ganea D (1998) Vasoactive intestinal peptide and pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide inhibit tumor necrosis factor alpha transcriptional activation by regulating nuclear factor-kB and cAMP response element-binding protein/c-Jun. J Biol Chem 273(47):31427-31436. Engelmann P, Molnár L, Pálinkás L, Cooper EL, Németh P (2004) Earthworm leukocyte populations specifically harbor lysosomal enzymes that may respond to bacterial challenge. Cell Tissue Res 316(3):391-401. Engelmann P, Pálinkás L, Cooper EL, Németh P (2005) Monoclonal antibodies identify four distinct annelid leukocyte markers. Dev Comp Immunol 29(7):599-614. Eue I, Kauschke E, Mohrig W, Cooper EL (1998) Isolation and characterization of earthworm hemolysins and agglutinins. Dev Comp Immunol. 22(1):13-25. Falugi C, Davoli C (1993) Localization of putative biochemical messengers during Eisenia foetida (Annelida, Oligochaeta) development. Tissue Cell 25(3):311-323. Field SG, Kurtz J, Cooper EL, Michiels NK (2004) Evaluation of an innate immune reaction to parasites in earthworms. J Invertebr Pathol 86(1-2):45-49. Fischer, E. (1975) Az Oligochaeták chloragosomáinak szerepe a homeostasisban. Biológia 23:185-196. Fischer E, Horváth I (1978) Evidence of the presence of extraperoxisomal catalase in chloragogen cells of the earthworm, Lumbricus terrestris L. Histochemistry 56(2):165171. Fischer E, Molnár L (1992) Environmental aspects of the chloragogenous tissue of earthworms. Soil Biol Biochem. 24(12):1723-1727. Fitzgerald SW, Ratcliffe NA (1982) Evidence for the presence of subpopulations of Arenicola marina coelomocytes identified by their selective response towards Gram+ve and Gram-ve bacteria. Dev Comp Immunol 6(1):23-34. 93
Franceschi C, Cossarizza A, Monti D, Ottaviani E (1991) Cytotoxicity and immunocyte markers in cells from the freshwater snail Planorbarius corneus (L.) (Gastropoda pulmonata): implications for the evolution of natural killer cells. Eur J Immunol 21(2):489-493. Guirland C, Buck KB, Gibney JA, DiCicco-Bloom E, Zheng JQ (2003) Direct cAMP signaling through G-protein-coupled receptors mediates growth cone attraction induced by pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide. J Neurosci 23(6):2274-2283. Hashimoto H, Shintani N, Nishino A, Okabe M, Ikawa M, Matsuyama S, Itoh K, Yamamoto K, Tomimoto S, Fujita T, Hagihara N, Mori W, Koyama Y, Matsuda T, Nagata S, Baba A (2000) Mice with markedly reduced PACAP (PAC1) receptor expression by targeted deletion of the signal peptide. J Neurochem 75(5):1810-1817. Herbert Z, Pollák E, Zougman A, Boros A, Kapan N, Molnár L (2009) Identification of novel neuropeptides in the ventral nerve cord ganglia and their targets in an annelid worm, Eisenia fetida. J Comp Neurol 514(5):415-432. Herlant-Meewis H (1965) Regeneration in Annelids. In: Abercrombie M, Brachet J (eds) Advances in morphogenesis. Vol. 4. Academic Press, New York, pp. 155-215. Hetru C, Troxler L, Hoffmann JA (2003) Drosophila melanogaster antimicrobial defense. J Infect Dis 187(2):327-334. Hostetter RK, Cooper EL (1972) Coelomocytes as effector cells in earthworm immunity. Immunol Comm 1(2):155-183. Jakab B, Reglodi D, Józsa R, Hollósy T, Tamás A, Lubics A, Lengvári I, Oroszi G, Szilvássy Z, Szolcsányi J, Németh J (2004) Distribution of PACAP-38 in the central nervous system of various species determined by a novel radioimmunoassay. J Biochem Biophys Meth 61(1-2):189-198. Jamieson BMG (1981) The ultrastructure of the oligochaeta. Academic Press, London. Jarosz J, Glinski Z (1997) Earthworm immun responses. Folia Biol 45(1-2):1-9. Kauschke E, Komiyama K, Moro I, Eue I, König S, Cooper EL (2001) Evidence for perforinlike activity assotiated with earthworm leukocytes. Zoology 104(1):13-24. Kimura H, Kawatani M, Ito E, Ishikawa K (2003) Effects of pituitary adenylate cyclaseactivating polypeptide on facial nerve recovery in the Guinea pig. Laryngoscope 113(6):1000-1006. Kiyokawa E, Baba T, Otsuka N, Makino A, Ohno S, Kobayashi T (2005) Spatial and functional heterogeneity of sphingolipid-rich membrane domains. J Biol Chem 280(25):24072-24084. 94
Kobayashi H, Ohtomi M, Sekizawa Y, Ohta N (2001) Toxicity of coelomic fluid of the earthworm Eisenia foetida to vertebrates but not invertebrates: probable role of sphingomyelin. Comp Biochem Physiol C Toxicol Pharmacol 128(3):401-411. Koenig S, Wagner F, Kauschke E, Peter-Katalinic J, Cooper EL, Eue I (2003) Mass spectrometric analyses of CL(39), CL(41) and H(1), H(2), H(3) confirm identity with fetidin and lysenin produced by earthworm leukocytes. Dev Comp Immunol 27(67):513-520. Kurek A, Homa J, Kauschke E, Plytycz B (2007) Characteristics of coelomocytes of the stubby earthworm, Allolobophora chlorotica (Sav.). Eur J Soil Biol 43(1):121-126. Lange S, Nüssler F, Kauschke E, Lutsch G, Cooper EL, Herrmann A (1997) Interaction of earthworm hemolysin with lipid membranes requires sphingolipids. J Biol Chem 272(33):20884-20892. Lassalle F, Lassegues M, Roch P (1988) Protein-analysis of earthworm celomic fluid IV. Evidence, activity induction and purification of eisenia-fetida-andrei lysozyme (Annelidae). Comp Biochem Physiol B Biochem Mol Biol 91(1):187-192. Laverack SM (1964) The Phisiology of the Earthworm. Oxford University Press London. Lefebvre C, Salzet M (2003) Annelid neuroimmune system. Curr Pharmaceut Des 9(2)149158. Lemmi CAE, Cooper EL (1981) Induction of coelomocyte proliferation by xenografts int he earthworm Lumbricus terresris. Dev Comp Immunol 5(1):73-80. Lengvári I, Csoknya M, Lubics A, Szelier M, Hámori J (1994) Proctolin immunoreactive elements in the nervous system of earthworm (Lumbricus terrestris). Acta Biol Hung 45(2-4):337-435. Liebmann E (1942a) The coelomocytes of Lumbricidae. J Morphol 11(2):221-249. Liebmann E (1942b) The role of the chloragogue in regeneration of Eisenia foetida. J Morphol 70:151-187. Linthicum DS, Stein EA, Marks DH, Cooper EL (1977) Electron-microscopic observations of normal coelomocytes from the earthworm, Lumbricus terrestris. Cell Tissue Res 185(3):315-330. Lkhider M, Marcel R, Tramu G (1987) Establishment of a map of neurons in the brain of Eisenia fetida (Annelida, Oligochaeta) containing substances immunologically specific to vertebrate peptides. Gen Comp Endocrinol 65(3):457-468. Luquet G, Leclerc M (1983) Spontaneous and induced cytotoxicity of axial organ cells from Asterias rubens (Asterid--echinoderm). Immunol Lett 6(6):339-342. 95
Mansour MH, DeLange R, Cooper EL (1985) Isolation, purification, and amino acid composition of the tunicate hemocyte Thy-1 homolog. J Biol Chem 260(5):2681-2686. Martinez C, Delgado M, Pozo D, Leceta J, Calvo JR, Ganea D, Gomariz RP (1998) VIP and PACAP enhance IL-6 release and mRNA levels in resting peritoneal macrophages: in vitro and in vivo studies.J Neuroimmunol 85(2):155-167. Meyer DK (2006) The effects of PACAP on neural cell proliferation. Regul Pept 137(1-2):5057. Milochau A, Lassegues M, Valembois P (1997) Purification, characterization and activities of two hemolytic and antibacterial proteins from coelomic fluid of the annelid Eisenia fetida andrei. Biochim Biophys Acta Protein Struct Mol Enzymol 1337(1):123-132. Minta A, Kao JP, Tsien RY (1989) Fluorescent indicators for cytosolic calcium based on rhodamine and fluorescein chromophores. J Biol Chem 264(14):8171–8178. Miyata A, Arimura A, Dahl RR, Minamino N, Uehara A, Jiang L, Culler MD, Coy DH (1989) Isolation of a novel 38 residue-hypothalamic polypeptide which stimulates adenylate cyclase in pituitary cells. Biochem Biophys Res Commun 164(1):567-574. Molnár L, Gábriel R (2001) Fény- és elektronmikroszkópos mikrotechnika. Dialóg Campus Kiadó, Budapest-Pécs. Molnar L, Pollak E, Boros A, Reglödi D, Tamás A, Lengvari I, Arimura A, Lubics A (2006) Comparative anatomy of PACAP-immunoreactive structures in the ventral nerve cord ganglia of lumbricid oligochaetes. Ann New York Acad Sci 1070:427-430. Molnár L, Pollák E, Boros A, Shioda S, Nakajo S, Tamás A, Lengvári I, Reglodi D, Lubics A (2008) PAC1 receptor localization in a model nervous system: light and electron microscopic immunocytochemistry on the earthworm ventral nerve cord ganglia. Regul Pept 145(1-3):96-104. Molnár L, Horváth B, Gunszt D, Somogyi I, Engelmann P, Steib A, Németh J, Lubics A, Reglődi D, Pollák E (2011) PACAP-like molecules in earthworms and their influence on the brain regeneration. Acta Physiol 202:81-81. Moment GB (1974) The possible roles of coelomic cells and their yellow pigment in annelid regeneration and aging. Growth 38(2):209-218. Mori T, Kawashima T, Beppu Y, Takagi K (1994) Histamine release induced by pituitary adenylate
cyclase
activating
polypeptide
Arzneimittelforschung 44(9):1044-1046.
96
from
rat
peritoneal
mast
cells.
Muroi M, Shioda S, Yada T, Zhou CJ, Nakai Y, Nakajo S, Arimura A (1998) Distribution and ultrastructural localization of PACAP receptors in the rat pancreatic islets. Ann New York Acad Sci 865:438-440. Negm HI, Mansour MH, Cooper EL (1991) Identification and structural characterization of Lyt-1 glycoproteins from tunicate hemocytes and mouse thymocytes. Comp Biochem Physiol B Biochem Mol Biol 99(4):741-749. Negm HI, Mansour MH, Cooper EL (1992) Identification and structural characterization of an LYT-2/3 homolog in tunicates. 101(1-2):55-67. Opper B, Németh P, Engelmann P (2010) Calcium is required for coelomocyte activation in earthworms. Mol Immunol 47(11-12):2047-2056. Oumi T, Ukena K, Matsushima O, Ikeda T, Fujita T, Minakata H, Nomoto K (1995) The GGNG peptides: novel myoactive peptides isolated from the gut and the whole body of the earthworms. Biochem Biophys Res Commun 216(3):1072-1078. Oumi T, Ukena K, Matsushima O, Ikeda T, Fujita T, Minakata H, Nomoto K (1996) Annetocin, an annelid oxytocin-related peptide, induces egg-laying behavior in the earthworm, Eisenia foetida. J Exp Zool 276(2):151-156. Parekh AB (2003) Store-operated Ca2+ entry: dynamic interplay between endoplasmic reticulum, mitochondria and plasma membrane. J Physiol 547(2):333-348. Reglödi D, Lubics A, Szelier M, Lengvári I (1999) Gastrin- and cholecystokinin-like immunoreactivities in the nervous system of the earthworm. Peptides 20(5):569-577. Reglödi D, Lengvari I, Szelier M, Vigh S, Arimura A (2000) Distribution of PACAP-like immunoreactivity in the nervous system of oligochaeta. Peptides 21(2):183-188. Reglodi D, Lubics A, Tamás A, Szalontay L, Lengvári I (2004) Pituitary adenylate cyclase activating polypeptide protects dopaminergic neurons and improves behavioral deficits in a rat model of Parkinson's disease. Behav Brain Res 151(1-2):303-312. Renzelli-Cain R, Kaloustian KV (1995) Evidence for the involvement of opioid peptides in phagocytosis, conformation, granulation and aggregation of immunocompetent Lumbricus terrestris amoebocytes. Comp Biochem Physiol C Pharmacol Toxicol Endocrinol 111(2):205-211. Roch P, Valembois P, Davant N, Lassegues M (1981) Protein-analysis of earthworm celomic fluid .2. isolation and biochemical-characterization of the Eisenia-fetida-andrei factor (EFAF). Comp Biochem Physiol B Biochem Mol Biol 69(4):829-836.
97
Roch P, Cooper EL, Eskinazi DP (1983) Serological evidences for a membrane structure related to human beta 2-microglobulin expressed by certain earthworm leukocytes. Eur J Immunol 13(12):1037-1042. Roch P, Canicatti C, Valembois P (1989) Interactions between earthworm hemolysins and sheep red blood-cell membranes. Biochim Biophys Acta 983(2):193-198. Roch P, Ville P, Cooper EL (1998) Characterization of a 14 kDa plant-related serine protease inhibitor and regulation of cytotoxic activity in earthworm coelomic fluid. Dev Comp Immunol 22(1):1-12. Saad AH; Cooper EL (1990) Evidence for a thy-1-like molecule expressed on earthworm leukocytes. Zool Sci 7(2):217-222. Salzet M, Verger-Bocquet M, Wattez C, Malecha J (1992) Evidence for angiotensin-like molecules in the central nervous system of the leech Theromyzon tessulatum (O.F.M.). A possible diuretic effect. Comp Biochem Physiol Physiol 101(1):83-90. Salzet, M (2000) Invertebrate molecular neuroimmune processes. Brain Res Rev 34(1-2):6979. Salzet M (2001) Neuroimmunology of opioids from invertebrates to human. Neuroendocrinol Lett 22(6):467-474. Seebeck J, Kruse ML, Schmidt-Choudhury A, Schmidt WE (1998) Pituitary adenylate cyclase activating polypeptide induces degranulation of rat peritoneal mast cells via highaffinity PACAP receptor-independent activation of G proteins. Ann N Y Acad Sci 865:141-146. Seki T, Shioda S, Ogino D, Nakai Y, Arimura A, Koide R (1997) Distribution and ultrastructural localization of a receptor for pituitary adenylate cyclase activating polypeptide and its mRNA in the rat retina. Neurosci Lett 238(3):127-130. Sekizawa Y; Kubo T; Kobayashi H; Nakajima T; Natori S (1997) Molecular cloning of cDNA for lysenin, a novel protein in the earthworm Eisenia foetida that causes contraction of rat vascular smooth muscle. Gene 191(1):97-102. Shalev A, Greenberg AH, Lögdberg L, Björck L (1981) Beta 2-Microglobulin-like molecules in low vertebrates and invertebrates. J Immunol 127(3):1186-1191. Sherwood NM, Krueckl SL, McRory JE (2000) The origin and function of the pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide (PACAP)/glucagon superfamily. Endocr Rev 21(6):619-670. Sherwood NM, Adams BA, Isaac ER, Wu S, Fradinger EA (2007) Knocked down and out: PACAP in development, reproduction and feeding. Peptides 28(9):1680-1687. 98
Sima P, Bilej M, Slipka J (1995) Perienteral chloragogen tissue and its role in defense in lumbricid worms. Adv Exp Med Biol 371:327-329. Somogyvári-Vigh A, Reglödi D, Li M, Lengvári I, Vigh S, Arimura A (2000) Tissue distribution of PACAP27 and -38 in oligochaeta: PACAP27 is the predominant form in the nervous system of Lumbricus polyphemus.Peptides 21(8):1185-1191. Somogyvári-Vigh A, Reglodi D (2004) Pituitary adenylate cyclase activating polypeptide: a potential neuroprotective peptide. Curr Pharm Des 10(23):2861-2889. Söderhäll K, Wingren A, Johansson MW, Bertheussen K (1985) The cytotoxic reaction of hemocytes from the freshwater crayfish, Astacus astacus. Cell Immunol 94(2):326-332. Stang-Voss C (1970) Studies on the ultrastructure of invertebrate hemocytes. II. On the hemocytes of Golfingia gouldi (Sipunculidae). Z Zellforsch Mikrosk Anat 106(2):200208. Stein EA, Avtalion RR, Cooper EL (1977) The coelomocytes of the earthworm Lumbricus terrestris: morphology and phagocytic properties. J Morphol 153(3):467-478. Stein EA, Cooper EL (1978) Cytochemical observations of coelomocytes from the earthworm, Lumbricus terrestris. Histochem J 10(6):657-678. Stein EA, Cooper EL (1981) The role of opsonins in phagocytosis by coelomocytes of the earthworm, Lumbricus terrestris. Dev Comp Immunol 5(3):415-425. Stein EA, Cooper EL (1988) In vitro agglutinin production by earthworm leukocytes. Dev Comp Immunol 12(3):531-547. Sundler F, Håkanson R, Alumets J, Walles B (1977) Neuronal localization of pancreatic polypeptide (PP) and vasoactive intestinal peptide (VIP) immunoreactivity in the earthworm (Lumbricus terrestris). Brain Res Bull 2(1):61-65. Suzuki MM, Cooper EL (1995a) Allogeneic killing by earthworm effector cells. Nat Immunol 14(1):11-19. Suzuki MM, Cooper EL (1995b) Killing of intrafamilial leukocytes by earthworm effector cells. Immunol Lett 44(1):45-49. Tyson CJ, Jenkin CR (1974) The cytoxic effect of haemocytes from the crayfish (Parachaeraps bicarinatus) on tumour cells of vetebrates. Aust J Exp Biol Med Sci 52(6):925-923. Valembois P (1971) Étude ultrastructurale des coelomocytes du lumbricien Eisenia fetida (Sav.). Bulletin de la Société Zoologique de France 96:59-72 Valembois P, Roch P, Lassegues M, Cassand P (1982) Antibacterial activity of the hemolytic system from the earthworm Eisenia fetida andrei. J Invertebr Pathol 40(1):21-27. 99
Valembois P, Roch P; Lassegues M (1988) Evidence of plasma clotting system in earthworms. J Invertebr Pathol 51(3):221-228. Valembois P, Seymour J, Roch P (1991) Evidence and cellular localization of an oxidative activity in the coelomic fluid of the earthworm Eisenia fetida andrei. J Invertebr Pathol 57(2)177–183. Valembois P, Lassegues M, Roch P (1992) Formation of brown bodies in the coelomic cavity of the earthworm Eisenia fetida andrei and attendant changes in shape and adhesive capacity of constitutive cells. Dev Comp Immunol 16(2-3):95-101. Vaudry D, Gonzalez BJ, Basille M, Yon L, Fournier A, Vaudry H (2000) Pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide and its receptors: from structure to functions. Pharmacol Rev 52(2):269-324. Vaudry D, Falluel-Morel A, Basille M, Pamantung TF, Fontaine M, Fournier A, Vaudry H, Gonzalez BJ (2003) Pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide prevents C2ceramide-induced apoptosis of cerebellar granule cells. J Neurosci Res 72(3):303-316. Waschek JA (2002) Multiple actions of pituitary adenylyl cyclase activating peptide in nervous system development and regeneration. Dev Neurosci 24(1):14-23. Wilhelm M, Koza A, Engelmann P, Németh P, Csoknya M (2006) Evidence for the presence of thyroid stimulating hormone, thyroglobulin and their receptors in Eisenia fetida: a multilevel hormonal interface between the nervous system and the peripheral tissues. Cell Tissue Res 324(3):535-546. Yamaji A, Sekizawa Y, Emoto K, Sakuraba H, Inoue K, Kobayashi H, Umeda M (1998) Lysenin, a novel sphingomyelin-specific binding protein. J Biol Chem 273(9):53005306. Zhong Y (1995) Mediation of PACAP-like neuropeptide transmission by coactivation of Ras/Raf and cAMP signal transduction pathways in Drosophila. Nature 375(6532):588592.
100
11. Publikációs jegyzék A disszertáció alapjául szolgáló tanulmányok: 1.
Somogyi I, Boros A, Engelmann P, Varhalmi E, Nemeth J, Lubics A, Tamas A, Kiss P, Reglodi D, Pollak E, Molnar L (2009) Pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide-like compounds could modulate the activity of coelomocytes in the earthworm. Ann New York Acad Sci 1163:521-523. IF: 2,303
2.
Varhalmi E, Somogyi I, Kiszler G, Nemeth J, Reglodi D, Lubics A, Kiss P, Tamas A, Pollak E, Molnar L (2008) Expression of PACAP- like compounds during the caudal regeneration of the earthworm Eisenia fetida. J Mol Neurosci 36(1-3):166– 174. IF: 2,061
3.
Hayashi Y, Engelmann P, Foldbjerg R,
, Somogyi I,
,
Autrup H, Sutherland DS, Scott-Fordsmand J, Heckmann LH (2012) Earthworms and humans in vitro: characterizing evolutionarily conserved stress and immune responses to silver nanoparticles. Environ Sci Technol 46(7):4166-4173. IF: 4,827* 4.
Molnar L, Engelmann P, Somogyi I, Mácsik LL, Pollak E (2012) Cold-stress induced formation of calcium and phosphorous rich chloragocyte granules (chloragosomes) in the earthworm Eisenia fetida. Comp Biochem Physiol Mol Integr Physiol doi: 10.1016/j.cbpa.2012.06.005. IF: 2,134* *: legutolsó 2010-es IF alapján
A disszertáció alapjául szolgáló konferencia absztraktok, poszterek és előadások: 1.
Engelmann P, Mácsik LL, Somogyi I, Opper B, Pollák E, Molnár L, Németh P (2011) Coelomasejt lizátum membránkárosító hatásának vizsgálata tumor sejtvonalakon. 41. Membrántranszport Konferencia, Sümeg. Poszter absztrakt.
2.
Mácsik LL, Somogyi I, Bovári J, Opper B, Pollák E, Molnár L, Németh P, Engelmann P (2010) Coelomasejt lizátum citotoxikus hatásainak vizsgálata HeLa, Jurkat és Sp2 sejtvonalakon. 40. Membrántranszport Konferencia, Sümeg. Poszter absztrakt.
101
3.
Mácsik LL, Somogyi I, Bovári J, Opper B, Pollák E, Molnár L, Németh P, Engelmann térképezése
P
(2010)
Coelomasejtek
tumrosejtvonalakon.
citotoxikus
Magyar
hatásmechanizmusának
Immunológiai
Társaság
39.
Kongresszusa, Szeged. Poszter absztrakt. 4.
Somogyi I (2009) A hipofízis adenilát cikláz aktiváló polipeptid (PACAP)-szerű vegyületek szerepe a giliszta coelomasejtek működésének modulálásában. Biológus Doktoranduszok Konferenciája, Pécs. Előadás.
5.
Somogyi I, Várhalmi E, Engelmann P, Opper B, Boros Á, Németh J, Lubics A, Reglődi D, Pollák E, Molnár L (2009) Pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide (pacap) modulates the activity of coelomocytes during the regeneration of the ventral nerve cord ganglia in the earthworms. 8th Göttingen Meeting of the German Neuroscience Society, Göttingen, Germany. Poszter absztrakt.
6.
Somogyi I, Engelmann P, Boros Á, Németh J, Lubics A, Reglődi D, Pollák, E, Molnár L (2008) PACAP-like compound modulate the activity of earthworm coelomocytes. 24th Conference of European Comparative Endocrinologist, Genova, Italy. Poszter absztrakt.
7.
Várhalmi E, Somogyi I, Kiszler G, Pollák E, Lammel K, Lubics A, Reglődi D, Németh J, Molnár L (2008) Possible role of PACAP in regeneration of the ventral nerve cord ganglia of the earthworm: a biochemical and immunohistochemical approach. International IBRO Workshop, Debrecen, Hungary. Poszter absztrakt.
8.
Várhalmi E, Somogyi I, Kiszler G, Pollák E, Lammel K, Lubics A, Reglődi D, Németh J, Molnár L (2008) Possible role of PACAP in regeneration of the ventral nerve cord ganglia of the earthworm: a biochemical and immunohistochemical approach. Ideggyógyászati szemle 61(S1):66-67.
9.
Somogyi I, Várhalmi E, Pollák E, Reglődi D, Németh J, Shioda S, Matsuda K, Lubics A, Molnár L (2007) PACAP and PAC1 receptor immunoreactivity in some coelomocytes of the regenerating Eisenia fetida. 8th International Symposium on VIP, PACAP and Related Peptides, Manchester, Vermont, USA. Poszter absztrakt.
102
10. Somogyi I, Várhalmi E, Pollák E, Reglődi D, Shioda S, Lubics A, Molnár L (2007) PACAP and PAC1 receptor immunoreactivity in some coelomocytes of the regenerating Eisenia fetida. J. Mol. Neurosci. 33(3):332-332. 11. Várhalmi E, Somogyi I, Kiszler G, Pollák E, Lubics A, Reglődi D, Németh J, Shioda S, Molnár L (2007) Does PACAP influence invertebrate nervous system regeneration? 8th International Symposium on VIP, PACAP and Related Peptides, Manchester, Vermont, USA. Poszter absztrakt. 12. Várhalmi E, Somogyi I, Kiszler G, Pollák E, Lubics A, Reglődi D, Shioda S, Molnár L (2007) Does PACAP influence invertebrate nervous system regeneration? J. Mol. Neurosci. 33(3):333-333. Egyéb publikációk: 1.
Boros A, Somogyi I, Engelmann P, Lubics A, Reglodi D, Pollak E, Molnar L (2010) Pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide type 1 (PAC1) receptor is expressed during embryonic development of the earthworm. Cell Tissue Res. 339(3):649-653. IF: 2,804
Egyéb konferencia absztraktok, poszterek és előadások: 1.
Boros Á, Gunszt D, Somogyi I, Pollák E, Molnár L (2011) Characterisation of CAPAergic neurons in the earthworm brain: from immunocytochemistry to gene identification. HSM Annual Meeting, Siófok. Társszerzős előadás.
2.
Molnár L, Horváth B, Gunszt D, Somogyi I, Engelmann P, Steib A, Németh J, Lubics A, Reglődi D, Pollák E (2011) PACAP-szerű molekulák gyűrűsférgekben és szerepük az agyregenerációban. A Magyar Farmakológiai Anatómus Mikrocirkulációs Élettani Társaságok Közös Tudományos Konferenciája, Pécs. Társszerzős előadás.
3.
Molnár L, Horváth B, Gunszt D, Somogyi I, Engelmann P, Steib A, Németh J, Lubics A, Reglődi D, Pollák E (2011) PACAP-like molecules in earthworms and their influence on the brain regeneration. Acta Physiol. 202:81-81.
4.
Gunszt D, Somogyi I, Joó T, Vecsei MJ, Debertin G, Pollák E, Molnár L (2010) A hasdúclánc normál és patológiás regenerációja Eisenia fetidában. Normal and 103
pathological regeneration of the ventral nerve cord ganglia in the earthworm Eisenia fetida. HSM Annual Meeting, Siófok. Társszerzős előadás. 5.
Molnár L, Horváth B, Mátyás M, Oravetz K, Gunszt D, Somogyi I, Boros Á, Pollák
E
(2010)
A
kiirtott
agy
regenerációja
kontroll
és
mérgezett
gyűrűsférgekben. Regeneration of the extirpated brain in control and toxicated earthworm. HSM Annual Meeting , Siófok. Társszerzős előadás. 6.
Lubics A, Horváth B, Somogyi I, Gunszt D, Boros A, Pollák E, Németh J, Reglődi D, Molnár L (2010) Brain extirpation stimulate PACAP expression in the central nervous system of the earthworm. 25th Conference of European Comparative Endocrinologists, Pécs, Hungary. Poszter absztrakt.
7.
Horváth B, Somogyi I, Gunszt D, Boros A, Pollák E, Németh J, Reglődi D, Lubics A, Molnár L (2009) Brain extirpation stimulatesPACAP expression in the central nervous system of the earthworm. 9th International Symposium on VIP, PACAP and Related Peptides, Kagoshima, Japan. Poszter absztrakt.
8.
Molnár L, Gunszt D, Boros Á, Pollák E, Somogyi I, Horváth B, Németh J, Reglődi D, Lubics A. (2009) The role of the circulatory system in the transportation of PACAP-like compounds in earthworms. 9th International Symposium on VIP, PACAP and Related Peptides, Kagoshima, Japan. Poszter absztrakt.
9.
Molnár L, Gunszt D, Boros Á, Pollák E, Somogyi I, Horváth B, Németh J, Reglődi D, Lubics A (2010) The role of the circulatory system in the transportation of PACAP-like compounds in earthworms. J. Mol. Neurosci. 42(3):308-309.
10. Boros Á, Engelmann P, Somogyi I, Lubics A, Reglődi D, Pollak E, Molnar L (2009): Pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide (PACAP) selective receptor (PAC1R) expression during the earthworm embryogenesis. 8th Göttingen Meeting of the German Neuroscience Society, Göttingen, Germany. Poszter absztrakt. 11. Lubics A, Boros Á, Engelmann P, Somogyi I, Herbert Zs, Reglődi D, Pollák E, Molnár L (2008) Pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide (PACAP) has an influence of the development and differentitation of embryonic tissue of the
104
earthworm
Eisenia
fetida.
24th
Conference
of
European
Comparative
Endocrinologist, Genova, Italy. Poszter absztrakt. 12. Boros Á, Pollák E, Reglődi D, Várhalmi E, Somogyi I, Kiszler G, Lubics A, Németh J, Molnár, L (2007) PACAP isoforms and Pac1 receptors are expressed in the regenerating ventral nerve cord ganglia of the earthworm Eisenia fetida. 11th Symposium on Invertebrate Neurobiology, Tihany, Hungary. Poszter absztrakt.
105
