PÉCSI TUDOMÁNYEGYETEM Kémia Doktori Iskola
Anyagátadás a nagyhatékonyságú folyadékkromatográfiában PhD értekezés Bacskay Ivett Orsolya
Témavezető: Dr. Felinger Attila egyetemi tanár
PÉCS, 2012
„A gyermek élete roppant gazdag, az egész világ benne rejlik, ám a külvilág számára mindez nem látható.” Müller Péter
2
Tartalomjegyzék 1.
Rövidítések jegyzéke............................................................................... 5
2.
Bevezetés................................................................................................ 8
3.
Célkitűzések .......................................................................................... 10
4.
HPLC állófázisok fejlődése – irodalmi áttekintés ................................... 12
5.
Kromatográfiás modellek....................................................................... 21
5.1. Általános sebességi modell ................................................................... 25 5.1.1. Axiális diszperzió............................................................................ 28 5.1.2. Külső anyagátadás a szemcse felszínén ....................................... 34 5.1.3. Pórusbeli diffúzió ............................................................................ 35 5.2. A van Deemter-egyenletből származtatott tányérmagasság-egyenlet .. 36 5.3. Momentumanalízis ................................................................................ 38 5.4. Sztochasztikus modell ........................................................................... 40 6.
Inverz méretkizárásos kromatográfia..................................................... 42
7.
Kísérleti körülmények ............................................................................ 45
7.1. HPLC oszlopok térkitöltési tényezőinek meghatározása ....................... 47 7.2. Molekuláris diffúzió vizsgálata megállított áramlásos (’peak parking’) módszerrel............................................................................................. 47 7.3. Semleges, kismolekulatömegű komponensek anyagátadási együtthatóinak meghatározása ....................................................................... 48 7.4. Különböző geometriájú állófázisokon kialakuló anyagátadási gátlás összehasonlítása................................................................................... 48 7.5. Alkilbenzolok anyagátadási együtthatóinak meghatározása sztochasztikus modell szerint ................................................................................ 49 8.
Momentumok meghatározása ............................................................... 50
9.
Eredmények és megvitatásuk ............................................................... 54
9.1. HPLC oszlopok térkitöltési tényezőinek meghatározása ....................... 55 9.2. A molekuláris diffúzió vizsgálata............................................................ 59 9.3. Anyagátadás méretkizárásos kromatográfiában ................................... 61 9.4. Anyagátadás fordított fázisú kromatográfiában ..................................... 65 9.4.1. Makroszkopikus modellek .............................................................. 70 9.4.1.1.
Axiális diszperziós együttható.............................................. 76
9.4.1.2.
Külső anyagátadási állandó................................................. 81 3
9.4.1.3.
Pórusbeli diffúziós együttható.............................................. 83
9.4.2. A sztochasztikus modell ................................................................. 89 9.5. A makroszkopikus és a mikroszkopikus modellek összehasonlítása .... 95 10.
Összefoglalás........................................................................................ 99
11.
Tézispontok ......................................................................................... 103
Megjelent közlemények.................................................................................. 105 Köszönetnyilvánítás ....................................................................................... 110 Irodalomjegyzék ............................................................................................. 111 Függelék ........................................................................................................ 116
4
1. Rövidítések jegyzéke
A
kromatográfiás csúcs alatti terület
C(t)
a kromatográfiás sáv koncentráció-profilja
CF
karakterisztikus függvény
DL
axiális diszperziós együttható
Dm
a mintamolekula molekuláris diffúziós együtthatója homogén folyadékfázisban
dp
átlagos szemcseátmérő
Dp
pórusbeli effektív diffúziós együttható
Dp,m
a pórust kitöltő mozgófázisban zajló diffúzió együtthatója
Ds
felületi diffúziós együttható
E
a rendszer belsőenergiaváltozása
G
a rendszer Gibbs-féle szabadentalpia-változása
H
a rendszer entalpiaváltozása
S
a rendszer entrópiaváltozása
Vm
az álló- és mozgófázisbeli parciális moláris térfogatok különbsége
EMG
exponenciálisan módosított Gauss-függvény
F
fázisarány
GC
Gázkromatográfia, Gas Chromatography
GR
általános sebességi modell, General rate model
h
redukált tányérmagasság
HETP, H
elméleti tányérmagasság, Height Equivalent to a Theoretical Plate
Hext
a külső anyagátadási gátlás hozzájárulása az elméleti tányérmagassághoz
HL
az axiális diszperzió hozzájárulása az elméleti tányérmagassághoz
HMA és H0 Suzuki által bevezetett H/2uh mennyiségek Hp
a pórusbeli diffúzió hozzájárulása az elméleti tányérmagassághoz
HPLC
Nagyhatékonyságú
folyadékkromatográfia,
High
Performance
Liquid
Chromatography ISEC
Inverz méretkizárásos kromatográfia, Inverse Size-exclusion Chromatography
K
adszorpciós egyensúlyi állandó
k’
retenciós tényező
ka
adszorpciós sebességi állandó
kB
Boltzmann-állandó
kd
deszorpciós sebességi állandó
kext
a szemcsék felszínén kialakuló anyagátadási gátlás sebességi állandója
KHDC
a hidrodinamikai hatás retencióhoz történő hozzájárulását leíró egyensúlyi állandó
KSEC
a méretkizáródás retencióhoz történő hozzájárulását leíró egyensúlyi állandó
5
L
oszlophossz
MB
az oldószer molekuláris tömege
MW
molekuláris tömeg
n
az adszorpciós lépések várható értéke
N
elméleti tányérszám
NMR
Mágneses magrezonancia spektroszkópia, Nuclear Magnetic Resonance
p
nyomás
R
egyetemes gázállandó
r0
az állófázis szemcséi között kialakult csatorna sugara
Re
Reynolds-szám
reff
a makromolekula effektív sugara
rG
a makromolekula forgási sugara
ri és rp
porózus héj belső és külső sugara a pellikuláris szemcsékben
rp
átlagos szemcsesugár
Sc
Schmidt-szám
SEC
Méretkizárásos kromatográfia, Size-Exclusion Chromatography
Sh
Sherwood-szám
T
abszolút hőmérséklet
t0
holtidő
tp
parkolási idő
tR
retenciós idő
tR’
korrigált retenciós idő
u0
a mozgófázis szabad keresztmetszeti felületre vonatkoztatott lineáris sebessége
uh
a mozgófázis intersticiális, azaz a szemcsék közötti sebessége
UHPLC
Ultra
hatékony
folyadékkromatográfia,
Ultra
Chromatography VA
a minta moláris térfogata a normál forráspontján
Vcol
a kromatográfiás oszlop geometriai térfogata
Vexcl
szemcsék közötti térfogat
VM
holttérfogat
Vp
pórustérfogat
6
High
Performance
Liquid
1
a nulladrendű Bessel-függvény első gyöke
d
az axiális diszperzió hozzájárulása a második centrális momentumhoz
f
a külső anyagátadási gátlás hozzájárulása a második centrális momentumhoz
L
a második centrális momentum szemcsén belüli diffúzió együtthatója
e
külső térkitöltési tényező
p
belső térkitöltési tényező
t
teljes térkitöltési tényező
m
azoldószer asszociációs faktora
obstrukciós faktor
a mozgófázis dinamikus viszkozitása
B
az oldószer dinamikus viszkozitása
az oszloptöltetet jellemző geometriai állandó
1
akromatográfiás csúcs első abszolút momentuma
2’
a kromatográfiás csúcs második centrális momentuma
('2)m
a mozgófázis hozzájárulása a második centrális momentumhoz
('2)sys
a készülék oszlopon kívüli holttérfogatának hozzájárulása a második centrális momentumhoz
m
a mozgófázis hatása a csúcsszélesedésre
s
az állófázis hatása a csúcsszélesedésre
sys
a rendszer oszlopon kívüli térfogatának hatása a csúcsszélesedésre
redukált mozgófázis sebesség
tortuozitási faktor
relatív molekulaméret
p
szemcsesűrűség
s
mozgófázis sűrűsége
a kromatográfiás csúcs varianciája
az exponenciálisan módosított Gauss függvény exponenciális időállandója
m
a részecske várható tartózkodási ideje a mozgófázisban két megkötődés között
s
a részecske várható tartózkodási ideje az állófázison egy megkötődés alkalmával
7
2. Bevezetés
Kromatográfiás folyamatokat a legtöbb esetben egyensúlyi, vagy kinetikai modellekkel írják le. Az elválasztás során fellépő fizikai-kémiai folyamatok általában differenciális tömegmérleg-egyenletekkel írhatók le [1, 2]. Az egyensúlyi modellek a mozgó- és az állófázis között pillanatnyi egyensúlyokat tételeznek fel, a kinetikai modellek sebességi állandókat alkalmaznak az anyagátadási gátlás jellemzésére. Giddings és Eyring mikroszkopikus nézőpontú sztochasztikus modellje [3], amely a molekulák véletlen bolyongása alapján írja le a csúcsok kialakulását, közvetlen betekintést nyújt a kromatográfiás folyamatokba. Az álló- és mozgófázis között kialakuló anyagátadási folyamatok központi szerepet játszanak a folyadékkromatográfiában. A modern HPLC állófázisokon az anyagátadás kis molekulák esetén igen gyors, amely összetett minták
hatékony
anyagátadás
elválasztását
kinetikájának
teszi
lehetővé.
meghatározása
A
töltetekben
szükséges
a
kialakuló
kromatográfiás
folyamatok részletes megismeréséhez, mivel a kinetika jelentősen befolyásolja a csúcsok alakját, szélességét, aszimmetriáját. Anyagátadásnak tekintjük a kromatográfiában a molekulák mozgását a mozgó- és az állófázison keresztül. A diffúzió viszonylag kis sebességű anyagátadás, ezért a molekulák áthaladása mindkét fázison jelentős tényezője a sávszélesedésnek. A folyamat a következő hatások együttes eredménye: axiális diszperzió, szemcsék felszínén kialakuló anyagátadási gátlás és pórusbeli diffúzió. Ezek a jelenségek részben a mintamolekulák molekuláris diffúziójától, részben az adszorpció-deszorpció sebességétől függnek. A fordított fázisú folyadékkromatográfiában fellépő fizikai adszorpció gyors kinetikájú [4], ezért az adszorpció-deszorpció hatását a sávszélesedésre figyelmen kívül hagyhatjuk [5]. A csúcsszélesedés mértékét az elméleti tányérmagassággal, azaz a csúcs oszlophossz alapján számolt varianciájának és az oszlop hosszának hányadosával adjuk meg. Számos tányérmagasság-egyenletet fogalmaztak meg – a van Deemter-egyenlet, Huber-egyenlet, Giddings-egyenlet, Horváth8
egyenlet, Knox-egyenlet [6-10] –, amelyekben közös, hogy a kromatográfiás csúcsok szélesedését az axiális diszperzióval és a mozgó-, illetve az állófázisban kialakuló anyagátadási gátlással írják le. A makroszkopikus nézőpontú modellek a kromatográfiás folyamatokat anyagátadási jelenségek összegeként írják le (pl. általános sebességi modell). Azok a modellek, melyek molekuláris szinten vizsgálják az elválasztást, mikroszkopikus nézőpontúak (pl. sztochasztikus modell).
9
3. Célkitűzések
Számos módszer létezik fordított fázisú folyadékkromatográfiában kialakuló anyagátadási gátlás együtthatóinak meghatározására. Munkánk célja, hogy makroszkopikus és mikroszkopikus megközelítésű modellek alapján meghatározott együtthatókat összevessük. A kromatográfiás elemzéseinkhez két vegyülettípust választottunk: semleges,
kismolekulatömegű
komponenseket
(alkilbenzolokat),
valamint
makromolekulákat (monodiszperz polisztirol-standardokat és humán inzulint). Kutatási céljaink a következő módon foglalhatók össze:
Mivel az anyagátadási gátlás több összetevője függ az oszlopok geometriájától, szükséges a munkánk során alkalmazott HPLC-oszlopok térkitöltési tényezőinek meghatározása.
A méretkizáródás retencióhoz történő hozzájárulását leíró egyensúlyi állandó, a KSEC fontos nagymolekulák anyagátadásának vizsgálatakor. Az egyensúlyi állandót a méretkizárásos kromatográfia sztochasztikus modellje alapján kívántuk meghatározni.
A molekuláris diffúzió fontos tényezője az anyagátadási folyamatoknak, ezért
szükséges
megállapítása.
a
mintakomponensek
Feladatunk
volt
diffúziós
együtthatójának
polisztirol-standardok
molekuláris
diffúziójának meghatározása ’peak parking’, vagyis megállított áramlásos módszerrel.
Célunk volt polisztirolok anyagátadási együtthatóinak meghatározása és összehasonlítása teljesen porózus és porózus kéreggel bevont tömörmagvú szemcséjű állófázisban.
10
Semleges,
kismolekulatömegű
komponensek
és
makromolekula
anyagátadási együtthatóinak meghatározását terveztük fordított fázisú folyadékkromatográfiában: 1) az általános sebességi modell alapján; 2) az
általánosan
használt
van
Deemter-egyenletből
eredő
tányérmagasság-egyenlet alapján; 3) momentumanalízissel; 4) és a kromatográfia sztochasztikus modellje alapján.
Célunk a teljesen porózus szemcséjű és porózus kéreggel bevont tömörmagvú szemcséjű oszloptölteteken kialakuló anyagátadási gátlás összehasonlítása.
Végezetül összehasonlítottuk a fent felsorolt makroszkopikus modelleket a sztochasztikus modellel.
11
4. HPLC állófázisok fejlődése – irodalmi áttekintés
A kromatográfia több mint fél évszázados múltra tekinthetett vissza [11], amikor
1964-65-ben
Horváth
Csaba
megépítette
az
első
olyan
folyadékkromatográfiás készüléket, amely összetett minták elválasztását hatékonyan és gyorsan oldotta meg, valamint az elemzés eredménye mennyiségi
kiértékelésre
is
alkalmas
volt.
1966-67-ben
megjelent
publikációiban a módszert nagyhatékonyságú folyadékkromatográfiának (High Performance Liquid Chromatography, HPLC) nevezte el [12, 13]. Néhány éven belül már a kereskedelmi forgalomban is megjelentek a HPLC-készülékek, amely tény a módszer robbanásszerű fejlődéséhez vezetett. Az 1970-es évek közepétől a HPLC-állófázisok is jelentős fejlődésen mentek keresztül. Napjainkra a nagyhatékonyságú folyadékkromatográfia az egyik legjelentősebb műszeres analitikai módszerré vált. A HPLC népszerűsége a bőséges állófázis-kínálatnak köszönhető, mivel könnyen kivitelezhető és széleskörűen alkalmazható vizsgálati módszer kis molekulák és szerves polimerek elválasztására. A kromatográfia alapvető feltétele a mozgófázis áramlása az állófázison keresztül. A minta átjutásának a mozgófázisból az állófázisba és vissza, azaz az anyagátadásnak, gyorsnak és gyakorinak kell lennie az oszlop hatékonysága érdekében. Az ideális töltetnek több egymásnak ellentmondó tulajdonsággal kellene rendelkeznie, ezért kompromisszumra
kell
törekedni
az
állófázis
tervezésénél.
A
gyors
anyagátadást rövid diffúziós utak kialakításával lehet elérni, valamint a mozgóés állófázisnak nagy felületen kell érintkeznie [8], miközben a töltetben kialakuló nyomásesés sem lehet túl nagy. Az igények közötti egyensúly megteremtése foglalkoztatja a kromatográfusokat az elmúlt 50 évben. A korai HPLC-elemzések folyadék-folyadék megoszláson [14], vagy adszorpción alapultak [15], amelyekhez szabálytalan alakú, 100–300 µm szemcseméretű ipari szorbenseket (szilikagél, aluminium-oxid, aktív szén) alkalmaztak. Ilyenfajta állófázisokon apoláris molekulák választhatók el nemvizes mozgófázis használatával, a gradiens elúció megvalósítása igen bonyolult és nehezen ismételhető. 12
Az 1970-es években megoldották a kis szemcseméretű (10–15 µm) adszorbens töltetek előállítását és hatékony oszlopok töltését. A folyadékfolyadék megoszlásos kromatográfia sok problémáját oldotta meg a kémiailag kötött állófázisok kifejlesztése, melyek közül a hidrofób csoportokkal borított, úgynevezett fordított fázisú töltetek kerültek széleskörű felhasználásra [16, 17]. Szilikagél és szilikagél alapú adszorbensek Jelenleg
a
legnépszerűbb
hordozók,
mivel
merevségük,
nyomásállóságuk alkalmassá teszik őket a HPLC mérések során kialakuló nagy nyomásesés (50–100 MPa) elviselésére. Számos egyéb előnyös tulajdonsággal rendelkeznek, összetett porózus szerkezetüknek köszönhető nagy fajlagos felületük (10–500 m2/g) teret ad az adszorpciós kölcsönhatásoknak. A szilikagél felszíne sokféleképpen módosítható (kémiailag kötött állófázisok), kompatibilis vízzel és bármely szerves oldószerrel. Az eluensek összetételének változtatása nem okoz duzzadást, vagy más deformációt, ezért alkalmas gradiens elúciós elemzésekhez. A szilikagél pH 2–8 tartományban stabil, lúgos pH-n feloldódik, illetve a felszínéhez kötött fázis hidrolizál. Másik hátrányos tulajdonsága a felszín savassága, amely bázikus komponensek elválasztásánál okoz problémát (elhúzódó aszimmetrikus csúcsok, ’tailing’). Porózus, gömbszimmetrikus szilikagél többféle módon állítható elő, így változatos kémiai tulajdonságú, tisztaságú, pórusméret-eloszlású hordozóhoz juthatunk [18]. Az előállítás módja jelentősen befolyásolja a szilikagél felületét, amely meghatározza kromatográfiás viselkedését. Kromatográfiás célokra a teljesen hidratált felszínű szilikagél a legalkalmasabb. Az elválasztás során a retenciós mechanizmust a módosítatlan szilikagél esetén a felületen található szilanolcsoportok, valamint a fémionszennyezés, a kémiailag módosított szilikagél (fordított fázisú töltet) esetén pedig a borítottság, a fajlagos felület és a porozitás befolyásolja nagymértékben [19, 20]. A hidratált szilikagél felületén különböző típusú szilanolcsoportok (-SiOH) találhatók, mellettük kis mennyiségben sziloxáncsoportok (-Si-O-Si-) is előfordulnak. Szabad, geminális és vicinális helyzetű szilanolcsoportokat különböztethetünk meg:
13
Szabad szilanol: a szilanolcsoportok között nincs hidrogénkötés, általában egy sziloxáncsoport helyezkedik el kettő, szomszédos szilanolcsoport között.
Geminális szilanol: egy szilíciumatomon két hidroxilcsoport található.
Vicinális szilanol: kettő, szomszédos szilanol csoport között hidrogénkötés alakul ki. A szilanolcsoportok reakcióképességét tekintve nincs konszenzus a
szakirodalomban. Egyes kutatócsoportok a szabad szilanolcsoportokat tekintik a legreakcióképesebbnek, míg a geminális és vicinális csoportoknak az adszorpcióban tulajdonítanak szerepet [21]. Más szerzők véleménye szerint a vicinális szilanol reaktívabb, mint a szabad [22]. Néhány közlemény arról számol be, hogy a geminális helyzetű szilanolcsoportok a legreaktívabbak [23, 24]. A kémiailag kötött állófázisok előállításakor a szilikagél, mint hordozó és a szilanizálószer között kovalens kötéseket alakítanak ki. Az 1960-as években először gázkromatográfiában alkalmaztak adszorbensként olyan állófázist, amely szilikagélhez kovalensen kötött szénhidrogénláncokat tartalmazott. Stewdard és Perry javaslatára [25] alkalmazták a hidrofób oktadecil-klórszilán borítású szilikagélt kromatográfiás állófázisként. Ez újabb távlatokat nyitott meg a HPLC elválasztásokban. Horváth [26, 27], Halász [16, 28] és Kirkland [17, 29] munkásságának köszönhető, hogy a hidrofóbbá tett szilikagél, azaz az állófázis, napjainkra a folyadékkromatográfiában az egyik leggyakrabban használt elválasztó töltetté vált. A fordított fázisú folyadékkromatográfiás elválasztásoknál a mozgófázis polárisabb az állófázisnál. Változatos lánchosszúságú alkilcsoportokkal (C1-C30) borított szilikagélek érhetők el kereskedelmi forgalomban, de a C18 (oktadecil)-, vagy C6 (3,3-dimetil-butil)-láncokkal borított tölteteket alkalmazzák legszélesebb körben. Az általánosan elterjedt fordított fázisú állófázisok szilanolcsoportok és szerves szilíciumvegyületek reakciójából kialakuló sziloxánok (≡Si-O-SiR3). A szerves szilíciumvegyületek többféle funkciós csoportot is tartalmazhatnak, mint pl. kloro-, alkoxi-, alkil-amino-csoportokat. Tanulmányok bizonyítják, hogy a 14
szilikagél annál stabilabb, minél nagyobb a borítottsága [30]: a szilikagél stabilitását növelik a hosszabb alkilláncot tartalmazó ligandumok, valamint a fordított fázisú töltet tömörsége. A hagyományos szilikagél-alapú fordított fázisokban (pl. C18, C8, C4…) monomer
organoszilánt
alkalmaznak,
amelyben
a
szilíciumatomhoz
a
ligandumon kívül két további metilcsoport kapcsolódik. A rövid láncú lidandumok (pl. C1, C4 és CN), valamint a fenilcsoportokkal borított fordított fázis különösen érzékeny a hidrolízisre, főként savas közegben. Stabil fordított fázis érhető el utánszilanizálással (’endcapping’), amely során metil-szilil helyett izopropil-, izobutli-szilil csoportokkal borítják a hordozót [31-33]. Ezek az elágazó csoportok sztérikusan akadályozzák meg a Si-O-Si kötések hidrolízisét. Szerves polimer adszorbensek A kereskedelmi forgalomban elérhető szerves polimer adszorbenseket két csoportba sorolhatjuk, hidrofilek vagy hidrofóbok. Hidrofil hordozók például a poli(metakrilát), poli(vinilalkohol); hidrofób állófázisok polisztirol-divinil-benzol, divinil-benzol. Hidrofil felületű polimer állófázisok széles körben alkalmazhatók bioanalitikai
méretkizárásos
elemzésekhez,
affinitáskromatográfiában
és
ioncserélő kromatográfiában is. A polimer fázisok legnagyobb előnye a szilikagéllel szemben, a nagy pHstabilitásuk (0 ≤ pH ≤ 14). Hátrányuk, hogy kevésbé nyomásállóak [34], valamint duzzadnak és zsugorodnak a mozgófázis összetételétől függően [35]. Szervetlen hordozók A szilikagél alapú töltetek hátrányait kiküszöbölendő kutatásokat folytattak új adszorbensekkel. Olyan hordozókat kerestek, melyek mechanikai szilárdsága és hatékonysága összemérhető a szilikagéllel, de tágabb pHtartományban stabilak és nincsenek kedvezőtlen retenciós tulajdonságaik. Az alumínium-oxid alapú töltetek alkalmazásáról az 1980-as években jelentek meg közlemények [36]. A kereskedelmi forgalomban kapható töltetek pH 2–13 tartományban stabilak, magas hőmérsékleten használhatók, általában normálfázisúak, de lehetnek polimerrel borítottak is. Jelenleg az alumínium-oxid alapú tölteteket HPLC elválasztásokhoz nem, de mintaelőkészítéshez gyakran alkalmazzák. 15
A cirkónium-oxid alapú töltetek alacsony és magas pH-jú (1 ≤ pH ≤ 14) mozgófázissal és igen magas hőmérsékleten (≤ 150°C) is használhatók [37]. A magas pH-jú eluensek alkalmazása lehetővé teszi az alkalikus komponensek nem ionos formában történő elemzését. Jó alternatívája a szilikagélnek alacsony pH-jú eluensek alkalmazásakor vagy ionpárkromatográfiás analízis során. Kereskedelmi forgalomban csak polimerrel borított (1-butadién vagy polisztirol) porózus töltet kapható. Titán-oxid alapú állófázisokat normálfázisú elválasztásoknál alkalmaznak [38]. A szén, mint kiváló adszorbens régóta ismert, ám mechanikai tulajdonságai nem tették lehetővé HPLC-adszorbensként történő alkalmazását. Knox és Gilbert módszerével [39] porózus szén állítható elő, ez a porózus grafitizált szén (PGC). A delokalizált elektronok hatása és a hidrofób tulajdonsága miatt egyedülállóan szelektív. Alkalmas geometriai izomerek elválasztására [40, 41]. A PGC erősebben hidrofób, mint a hagyományos fordított fázisú szilikagél, ezért magasabb szerves oldószer arányt (90–100%) követel meg az eluensben. A grafitizált szén állófázis speciális előnye, hogy bármely pH-n és hőmérsékleten végezhető vele elemzés, kitűnő a nyomásállósága. Hátránya, hogy kevésbé hatékony, mint a szilikagél alapú állófázis, mechanikailag sérülékeny,
különösen
tiszta
eluensek
szükségesek
hozzá
a
jó
megkötőképessége miatt.
A HPLC oszlopok általában kisméretű szemcsékkel vannak megtöltve, melyek
többnyire
gömbszimmetrikusak.
Az
1990-es
években
újfajta
oszloptöltetek jelentek meg [42], az egy tömbből álló monolitok. Mindkét típusú állófázis esetében a kromatográfiás kölcsönhatások az adszorbens felületén zajlanak. Az elválasztás hatékonyságának kedvez az állófázisok nagy fajlagos felülete, melyet porózus, illetve hálós szerkezetük biztosít.
16
Porózus szemcsék A porózus szemcsék [18] a legelterjedtebben alkalmazott szilikagél-alapú töltetek. Nagy fajlagos felületű (kb.10–500 m2/g) és pórustérfogatú anyagok. A szilikagél előállítási módjától függ, hogy szabálytalan vagy gömb alakú szemcsék keletkeznek. A szabálytalan szemcsék méreteloszlása szélesebb tartományba esik, amely nyomásemelkedést okozhat, és kevésbé hatékony töltet, mint a szabályos gömb. Szabálytalan szemcséjű oszlopokat leginkább preparatív célokra használnak. Az analitikai kromatográfiás célra használt gömb alakú szilikagélszemcsék átmérője általában 3–5 μm tartományban van, de alkalmaznak kis szemcseméretű (1,5–2 μm), különösen szűk szemcseméret-eloszlású tölteteket is. Félpreparatív, illetve preparatív kromatográfiás elválasztásokhoz a 10 μm feletti átlagos szemcseméretű töltetek a megfelelőek. A szemcsék egyik legfontosabb paramétere a pórusátmérő és annak eloszlása. Az átlagos pórusátmérőnek legalább tízszer nagyobbnak kell lennie, mint a mintamolekula átmérőjének, hogy a minta a szemcsepórusokban szabadon mozogjon, ne gátolja a pórus a minta diffúzióját [43]. A pórustérfogat és a fajlagos felület aránya információt ad a pórusok alakjáról, melyek a következők lehetnek:
henger-alakú pórusok, kör-keresztmetszettel;
szűk bevezető nyílású, de beljebb kiöblösödő pórusok;
hasítékok.
A pórusok átmérőjük szerint is osztályozhatók, a 2 nm alattiak a mikropórusok, az 50 nm alattiak a mezopórusok, az ennél nagyobbak a makropórusok. A pórusok méreteloszlása is igen fontos jellemzője az adszorbensnek. A mikropórusok nem vesznek részt folyadékkromatográfiás folyamatokban, mivel olyan szűkek, hogy a mintamolekulák nem férnek el bennük.
A
mezopórusokban
általában
gátolt
a
diffúzió,
anyagátadást eredményez és csökkenti az oszlop hatékonyságát.
17
amely
lassú
Tömörmagvú szemcsék Horváth
Csaba
és
munkatársai
[13,
44,
45]
valamint
Huber
kutatócsoportja [46] az 1960-as évek végén készített és alkalmazott pellikuláris töltetet (50 μm szemcseátmérőjű sztirol-divinil-benzol kopolimerrel fedett üveggyöngy) ioncserélő állófázisként. A porózus réteg vastagsága általában a gyöngy átmérőjének 1/30-ad része volt. Két előnyt vártak az állófázistól: nagy terhelhetőséget a nagy kapacitású ioncserélő gyanta miatt és gyors anyagátadást a szilárd- és a folyadékfázis között a vékony állófázisnak köszönhetően. A Kirkland által előállított [47] 40 μm szemcseátmérőjű részecskék tömör szilika-maggal rendelkeztek, melyet meghatározott vastagságú és átlagos pórusátmérőjű porózus réteg fedett. 2000-ben 5 μm szemcseátmérőjű, 0,25 μm kéregvastagságú, 300 Å pórusátmérőjű töltet előállítását publikálták [48], mely fehérjék, polipeptidek gyors elválasztását tette lehetővé [49].
4.1 ábra Halo típusú szemcse pásztázó elektronmikroszkópos felvétele (2,7 μm átlagos szemcseátmérő, 1,7 µm átmérőjű tömör mag, 0,5 µm porózus kéreg) [50]
A 2006-ban megjelent 1,7 μm átmérőjű tömör magból és 0,5 μm vastagságú porózus kéregből álló 2,7 μm átmérőjű szemcse hozta meg az
18
áttörést (4.1 ábra) [51-53]. A 0,5 μm vastag porózus kéreg kiküszöböli az első tömörmagvú töltetek hátrányát, a kicsi adszorpciós kapacitást, mivel a porózus kéreg térfogata a szemcse térfogatának 75%-a. Napjainkban különböző átmérőjű és kéregvastagságú, tömörmagvú szemcséket alkalmazhatunk [54, 55]. Egyre szélesebb körben alkalmaznak ilyen tölteteket, mivel gyors és hatékony elválasztást eredményeznek [55-61], köszönhetően a rövidebb szemcsén belüli diffúziós úthossznak [62].
Nemporózus szemcsék Az
1980-as
években
jelentek
meg
[63-65]
3
μm-nél
kisebb
szemcseátmérőjű monodiszperz rendszerek, melyek nemporózus szilikagél szemcséket tartalmaztak. Leggyakrabban az 1,5 μm szemcseátmérőjű tölteteket alkalmazzák az analitikai kromatográfiás elválasztásokhoz. A töltet fajlagos felülete, tekintve, hogy nem tartalmaz pórusokat, megegyezik a geometriai felülettel (~2 m2/g). A nemporózus adszorbensekkel töltött oszlopok terhelhetősége általában alacsony, az oszlopok nyomásesése magas. Ezeken az oszlopokon végezhető gyors elválasztások [31, 66, 67], és a kitűnő visszanyerés olyan új feladatok megoldására teszik alkalmassá a tölteteket, melyek porózus szemcséken hosszabb idő alatt és kisebb érzékenységgel végezhetők el. Bár az említett tölteteket biopolimerek gyors elválasztására tervezték [63-65, 68, 69], a kis molekulatömegű szerves vegyületek analízisében is elterjedt a nemporózus töltetek alkalmazása [70-72].
Monolit állófázis A monolit oszloptöltetként történő alkalmazását rövid időn belül több kutatócsoport is publikálta. Stellan Hjertén [42] hidrofil, Svec és Frechet [73] hidrofób polimer-alapú monolit fejlesztését írta le. Nakanishi [74] és Tanaka [75, 76] szilikagél-alapú monolitot dolgozott ki. A szilikagél-alapú monolitok szerkezetét a mikrométeres vastagságú összefüggő szilícium-dioxid váz és a makropórusok jellemzik (4.2 ábra). A porozitást főként a makropórusok határozzák meg, a külső térkitöltési tényező 19
ebben az állófázisban 0,60 felett alakul [77], a mezopórusok főként a fajlagos felülethez
járulnak
hozzá
(250–300
m2/g).
A
makropórusok
kevésbé
tekervényesek, mint a hagyományos töltetekben a szemcsék közötti járatok és kevesebb bennük a szűkület.
4.2 ábra Pásztázó elektronmikoroszkópos fevétel (A) szilikagél-alapú monolit HPLC állófázisról; (B) mezopórus; (C) makropórus [78]
A monolit állófázison alacsony nyomáson is gyors anyagátadás alakul ki, amely gyors, nagyhatékonyságú elemzéseket tesz lehetővé [75, 76]. A pórusok szerkezete lehetővé teszi fehérjék, oligonukleotidok és nanorészecskék (DNS, RNS), valamint élő organizmusok (vírusok, baktériumok) elemzését [78].
20
5. Kromatográfiás modellek
A modell a világ leírásának, megértésének az eszköze, a világra vonatkozó ismereteinknek kifejezője; a valóságos rendszer egyszerűsített, annak vizsgálatunk szempontjából lényegi tulajdonságait kiemelő mása. A kromatogramok bonyolult és igen komplex fizikai-kémiai folyamatok eredményeként jönnek létre, ezért egységes, az elválasztó oszlopot elhagyó minta koncentráció-profilját pontosan leíró matematikai függvény felállítása nem lehetséges. A lineáris kromatográfia a kromatográfia egy különleges esete, mely során a termodinamika határozza meg a csúcsok helyét és a kinetika a csúcsok alakját. Lineáris kromatográfiában egyensúlyban az állófázishoz adszorbeált minta koncentrációja arányos a mozgófázisbelivel. Az adszorpciós izoterma lineáris szakaszán az alacsony minta koncentráció miatt a jel intenzitása arányos a minta koncentrációjával. Ez a lineáris viselkedés lehetővé tesz egy igen fontos egyszerűsítést, nevezetesen, mivel nincs versengés a különböző minta-összetevők között, a többkomponensű elválasztás úgy tekinthető, mint a különböző egyedi komponensek elúciójának algebrai összege. Ezért elegendő egyetlen összetevőnek az oszlopban történő mozgását figyelni függetlenül attól, hogy a mintában hány komponens van jelen. A legegyszerűbb lineáris modellek az úgynevezett „tányérmodellek”, melyek úgy tekintik a kromatográfiás oszlopot, mint véges hosszúságú elméleti tányérok sorozatát. Egy elméleti tányér magassága (HETP, H) az oszlop hosszának, L, és az elméleti tányérok számának, N, hányadosaként adható meg. Mindegyik tányér egy-egy cellaként értelmezhető, melyekben az egyes fázisok között pillanatnyi egyensúlyok alakulnak ki. A Marint-Synge-féle tányérmodell [79] elhanyagolja a minta diffúzióját a tányérok között. A Craig-féle tányérmodell [80] szerint a mozgófázis és a minta egyik cellából a másikba való átmenetekor újabb egyensúlyok állnak be. A tömegmérleg-modellek a tányérmodellekkel ellentétben folytonosan kezelik a minta eloszlását az állófázis és mozgófázis között. A mintazóna mozgását az oszlopban differenciálegyenletekkel írják le. A kezdeti és a 21
peremfeltételek figyelembe vételével a csúcsok alakja a differenciális tömegmérleg-egyenlet integrálásával számolható. Számos kinetikai modellt alkottak a kutatók, melyek különböző részletességgel írják le a kromatográfiás elválasztásokat. Az általános sebességi modell (general rate model, GR) a legösszetettebb kinetikai modell, mellyel meghatározhatók az anyagátadási együtthatók [81], e modellt számos kromatográfus tanulmányozta [82, 83]. Figyelembe veszi az axiális diszperziót és az anyagátadási gátlás mind a négy lehetséges forrását. Mivel a kromatográfia általános sebességi modellje túl komplex, ezért lehetetlen a parciális differenciálegyenleteket időtartományban megoldani. Mindazonáltal a Laplace-tartományban a megoldás levezethető, amelyből kifejezhetők a statisztikai momentumok [84]. Az oszlop hatékonysága a mintamolekulák retenciós idejének eloszlása alapján, vagy a csúcsok momentumainak felhasználásával is megadható. H
2 L
L
' 2 12
5.1.1
ahol 2 a csúcsszélességet jellemző, hossz alapján számolt variancia és L az oszlop hossza, illetve µ1a csúcs első abszolút momentuma és µ2’ a második centrális momentuma. A momentumok a csúcs integrálásából számolhatók. Az általános sebességi modell alapján meghatározott momentumok lehetővé teszik a részletes tányérmagasság-egyenlet egyszerűsítését a hagyományos szemcséjű töltetű és a monolit oszlopok esetén is [85]. Lapidus és Amudson [86] vezette be a nemegyensúlyi, kinetikai modellt, melyet változatos formákban alkalmaznak. A reakció-diszperziós modell a nemegyensúlyi állapotot a lassú adszorpciónak és deszorpciónak tulajdonítja, míg a transzport-diszperziós modell gyors adszorpció-deszorpciót feltételez, miközben az anyagátadás lassú kinetikájú. Az egyesített pórusmodell [87] az általános sebesség modellnek egy másik egyszerűsített alakja. Bonyolultabbnak tűnhet, mint az összevont kinetikus modell, mert az általános sebességi modellhez hasonlóan a figyelembe veszi a szemcsék közötti térben (monolit oszlop esetén a járatokban) áramló mozgófázis és az állófázis pórusaiban stagnáló oldószer
22
közötti különbséget, viszont eltekint az állófázis felületén kialakuló radiális koncentráció gradienstől. A klasszikus van Deemter-egyenlet általánosan használt összefüggés, annak ellenére, hogy mérési adatokból származtatják. Az axiális diszperziót, valamint a mozgó- és az állófázisban fellépő anyagátadási gátlást veszi figyelembe a csúcsok szélesedésének leírásánál [6]. A kromatográfiás csúcsalakok vizsgálatára elterjedten alkalmazzák a momentumanalízist [1, 4, 88, 89], amely linearizált tányérmagasság-egyenletet alkalmaz az anyagátadási együtthatók meghatározására. A mikroszkopikus vagy sztochasztikus modell molekuláris szinten írja le a kromatográfiás folyamatokat a molekulák véletlen bolyongásán keresztül. A kromatográfia sztochasztikus modelljét Giddings és Eyring 1955-ben vezette be [3], mely szerint feltételezik, hogy a molekulák az oszlopban történő vándorlásuk során véletlen számú adszorpciós-deszorpciós lépést (n) tesznek meg, amely Poisson-eloszlást követ (5.1.2 egyenlet). Továbbá, amikor a molekula adszorbeálódik az állófázison, időt tölt el ott a deszorpcióig – ez az állófázison töltött idő is véletlen változó, amely exponenciális eloszlású. f( x)
e x x!
5.1.2
ahol az adszorpciós lépések számát jelenti, azaz n .
5.1 ábra
Poisson-eloszlás
23
Az 1960-as években történtek próbálkozások a modell heterogén felszínre történő kiterjesztésére, de az időtartomány-beli kezelése meglehetősen bonyolult kifejezést eredményezett, mely nem alkalmas gyakorlati számításokhoz [8, 90]. A karakterisztikus függvény (CF) rendkívüli módon megkönnyíti a sztochasztikus modell alkalmazását a kromatográfiában [91, 92], lehetővé teszi a modell kiterjesztését heterogén felszínekre [93, 94], amelyek más módon nehezen kezelhetők [3, 95, 96]. A szorpciós energiák bármely egymodelles és többmodelles eloszlása miatt a kromatográfiás sáv profilja is leírható CF-fel. A sztochasztikus modellt kiterjesztették még a mozgófázis diszperziójának és a méretkizárás jelenség leírására is [97-99]. A CF segítségével zárt alakú kifejezést kapunk a sáv profiljára Fourier-tartományban, így a statisztikai momentumok közvetlenül számolhatók, akkor is, ha az időtartományba történő transzformáció csak numerikusan lehetséges [100, 101]. A sztochasztikus modellek nagyon gyakran figyelmen kívül hagyják a mozgófázis diszperzióját, viszont néhány tanulmányban Gauss-eloszlással [91, 97, 102], vagy diffúziós egyenletekből számolt első áthaladási idővel írják le [95, 103]. A
mikroszkopikus
és
makroszkopikus
modellek
összevetése
leggyakrabban az első és a második momentumok összehasonlítására szorítkozik. Cavazzini és csoportja kimutatta, ha a mozgófázis diszperzióját figyelmen kívül hagyják, akkor a mikroszkopikus és makroszkopikus modellek alapján számolt elméleti tányérszámok megegyeznek [94]. Felinger és munkatársai
a
mozgófázis
Gauss-eloszlású
diszperziójának
figyelembevételével bizonyították, hogy a sztochasztikus-diszperziós és az egyesített kinetikai modell első és második momentumai megegyeznek [97]. Később bemutatták, hogy nemcsak a momeumok, hanem a csúcsalakok is megegyeznek [103].
Munkánk során az általános sebességi modell, a van Deemteregyenletből származtatott tányérmagasság-egyenlet alapján, momentumanalízissel, valamint sztochasztikus modell segítségével határoztuk meg a kromatográfiás anyagátadási együtthatókat.
24
5.1. Általános sebességi modell
A kromatográfiás csúcsok szélesedése a lineáris kromatográfiában a következő jelenségek együttes következménye [1, 8] (5.2 ábra): (1) a kromatográfiás
töltet
szemcséi
között
illetve
pórusain
keresztüláramló
mozgófázis axiális keveredése (axiális és örvénydiffúzió); (2) anyagátadás a mozgófázis
és
mintamolekulák
az
állófázis-szemcsék
diffúziós
vándorlása
külső
az
felszíne
között;
állófázis-szemcsék
(3)
a
pórusaiban
(állófázison belüli diffúzió); (4) adszorpció/deszorpció az állófázis adszorpciós helyein (az adszorpció/deszorpció kinetikája). A
negyedik
tényező
hatása
a
sávszélesedésre
fordított
fázisú
rendszerekben elhanyagolhatóan kicsi a másik háromhoz képest, mivel a fizikai adszorpció során az adszorpció/deszorpció nagyon gyors [4]. A többi jelenség közel
azonos
mértékben
befolyásolja
a
csúcsok
szélesedését
HPLC
rendszerekben [5, 104].
5.2 ábra A mozgófázis diffúziója porózus állófázisban [105] ka, kd az adszorpció és a deszorpció sebességi állandója, kext a szemcsék felszínén kialakuló külső anyagátadási gátlás sebességi állandója, tortuozitási faktor, p belső térkitöltési tényező
25
Az általános sebességi modell feltételezi, hogy a mozgófázis áthalad az állófázis szemcséi között lévő téren, miközben a mintamolekulák a mozgófázis áramából diffúzióval jutnak el a szemcsék felszínére, illetve azok pórusaiba, ahol mozdulatlan a mozgófázis. Külön taglalja, hogy mi történik az állófázis szemcséinek felszínén, illetve pórusaiban, ezért két anyagmérleg egyenlet szükséges a mintamolekulák mozgásának leírásához. A kromatográfiás csúcs első momentuma (µ1) L 1 Fa L 1 k1 uh uh
1
5.1.1
a p K 1 p
5.1.2
k1 Fa
5.1.3
F
1 e
5.1.4
e
ahol L az oszlop hossza, uh a mozgófázis lineáris sebessége a szemcsék között, e külső térkitöltési tényező, p belső térkitöltési tényező, K az adszorpciós egyensúlyi állandó. Egy retenció nélküli, nem adszorbeálódó komponens csúcsának első momentuma egyenlő az oszlop holtidejével:
t0
L uh
1 e 1 e p
5.1.5
A második centrális momentum a következő módon adható meg:
'2
rp2 2L DL Fa2 rp 2 1 k 1 uh uh2 uh 3kext 15Dp
26
5.1.6
ahol DL az axiális diszperziós együttható, kext a külső (szemcsefelületi) sebességi állandó, Dp a pórusbeli diffúziós együttható és rp az átlagos szemcsesugár. Az általános sebességi modellből meghatározott momentumok lehetővé teszik, hogy igen részletes tányérmagasság-egyenletet írjunk fel:
2DL 2uh k1 ' H L 22 uh F k1 1 1
2
rp rp2 3k 15 D ext p
5.1.7
H értéke a következő összetevőkből adódik össze H H L H ext H p
5.1.8
ahol HL az axiális diszperziós tag
HL
2DL uh
5.1.9
amíg Hext és Hp a szemcse felszínén és a pórusaiban kialakuló anyagátadási gátlás hozzájárulása a tányérmagassághoz, úgy, mint
H ext
2u h F
2u Hp h F
2
k1 r p 1 k1 3k ext
5.1.10
2
2 k1 r p 1 k1 15Dp
5.1.11
27
5.1.1. Axiális diszperzió
A szemcsék közötti járatok átlagos mérete nagyságrendileg megegyezik a szemcsék átmérőjével. Mivel a szemcsék általában gömbszimmetrikusak és a töltet rendezetlen, a szemcsék közötti tér szerkezete viszonylag egyszerű [8].
5.3 ábra Áramlás a HPLC oszlopban
A diffúziós együttható ebben a közegben gyakorlatilag megegyezik a homogén folyadékfázisbelivel, mivel sem a töltet szerkezetének, sem az áramlási csatornák kanyarulatosságának és szűkületeinek nincs szignifikáns hatása az axiális diszperzióra. A töltetben az oldószer vagy mintamolekulák csak rövid szakaszokat tudnak egyenes vonalban mozogva megtenni, anélkül, hogy szemcsének ütköznének, ezért az áramlási csatornák a töltetszemcsék körül kanyarognak (5.3 ábra). A töltet tortuozitása, azaz tekervényessége a csatornák átlagos hossza és az oszlophossz közötti arány. A kromatográfia modellezése során minden jelenséget, amely részt vesz az axiális keveredésben, egyetlen axiális diszperziós együtthatóban vonnak
28
össze. Van Deemter az axiális diszperziót a szemcsék közötti térben zajló molekuláris diffúzió és az örvénydiffúzió összegeként értelmezi [6]: D L D m d p u h
5.1.12
ahol Dm a minta molekuláris diffúziós együtthatója a homogén folyadékfázisban, dp a szemcseátmérő, uh a mozgófázis lineáris sebessége a szemcsék közötti térben, obstrukciós faktor, geometriai állandó, melyek értéke általában 0,7 és 0,5 körül van. Az axiális diszperziót különböző tapasztalati vagy féltapasztalati egyenletek alapján becsülhetjük meg. A Gunn-korreláció az egyik lehetőség az axiális diszperzió meghatározására, mely a következő [106]:
e DL d pu h A B Re Sc
5.1.13
ahol dp a szemcseátmérő, az oszloptöltet tortuozitási faktora (1,4); Re a Reynolds-szám és Sc a Schmidt-szám, melyek a következő tapasztalati összefüggésekkel írhatók le [107]:
Re
Sc
suhd p
5.1.14
5.1.15
s Dm
ahol s a mozgófázis sűrűsége és a dinamikus viszkozitása; Dm a minta molekuláris diffúziós együtthatója a homogén folyadékfázisban.
örvénydiffúzió: A jelenség elnevezése megtévesztő, mert a lassú diffúzió miatt nem alakulnak ki örvények. Miközben a mozgófázis átáramlik a töltött oszlopon, a mintamolekulák véletlenszerűen választanak utat az állófázis járataiban. Ez sávszélesedéshez vezet, mert a járatok hossza különbözik.
29
Az A és a B tényező a következő módon adható meg:
A
Re Sc 1 p 2 2 4 1 1 e
5.1.16
2 4 12 1 e Re Sc 3 1 B p1 p exp 2 1 Re p p Sc 14 14 1 e
ahol
1
a
nulladrendű
Bessel-függvény
első
5.1.17
gyöke
(2,405)
és
p 0,17 0,33 exp(24 / Re) . A folyadék lineáris sebessége és az oszlop
keresztmetszetén áthaladó folyadék átlagsebessége közötti arány eloszlásának varianciáját nullának tekintjük. A Gunn-egyenlet egyszerűbb formában is felírható könnyen használható kromatográfiás együtthatókkal, mely alak a Giddings-egyenlet mozgófázis tagjára emlékeztet [101]: 2DL 2 2 / F uhd p 2 / F
5.1.18
uhd p
5.1.19
Dm
ahol = 0,714, = 2,586, = 0,0712, a redukált szemcseközti sebesség, és F a fázisarány (ld. 5.1.4 egyenlet) [108]. A , és paraméterek értéke a redukált szemcseközti sebesség széles tartományában 5.1.13 egyenletet a Gunn-egyenlethez illesztve adható meg [101].
30
Molekuláris diffúzió Az
anyagátadási
együtthatók
mennyiségi
meghatározása
során
szükséges a mintamolekula molekuláris diffúziójának (Dm) pontos ismerete, hiszen
fontos
tényezője
a
kromatográfiás
folyamatok
során
fellépő
anyagátadásnak. Számos technika létezik a molekuláris diffúzió meghatározására. Stokes 1950-ban publikálta diafragmás módszerét [109]. Emellett többféle optikai módszer is létezik: fényszórás mérés [110]), spektroszkópiai módszer (NMR, [111]), valamint jelentős szerepet tölt be a Taylor-módszer [112]. A
felsorolt
módszerek
alkalmasak
a
Dm
kívánt
pontosságú
meghatározására, ellenben drágák és komoly műszerezettséget igényelnek, ezért többnyire becsléssel állapítják meg a mértékét. Az irodalomban számos összefüggés
található
a
Dm
meghatározására
[107].
Kétkomponensű
folyadékelegyekben, számos tapasztalati összefüggést írtak le, melyeket Li és Carr foglalt össze [112, 113]. A Wilke-Chang-egyenlet [114] az egyik leggyakrabban alkalmazott összefüggés a Dm folyadék fázisban történő meghatározására. 7,4 10 8 m MB T Dm BVA0,6 1/ 2
5.1.20
ahol MB az oldószer moláris tömege, m az oldószer asszociációs faktora, T az oszlop abszolút hőmérséklete, B a dinamikus viszkozitása (cP), VA a minta moláris térfogata a normál forráspontján (cm3/mol). A
Scheibel-egyenlet
[115]
egy
módosított
Wilke-Chang-egyenlet,
általában kis molekulák molekuláris diffúziójának meghatározására használják: 2/3 8.2 10 8 T 3VB 1 Dm BVA1/ 3 VA
5.1.21
ahol T az oszlop abszolút hőmérséklete, VA a minta moláris térfogata normál forráspontján (cm3/mol) [116], VB az oldószer moláris térfogata és B a dinamikus viszkozitása (cP). 31
Gritti a következő módon adta meg [117] polisztirolok molekuláris diffúzióját tetrahidrofuránban: Dm 3,45 10 4 MW 0,564
5.1.22
ahol MW a moláris tömeg. Fehérjék
molekuláris
diffúziójának
meghatározására
Young
és
munkatársai dolgoztak ki összefüggést [118]:
Dm 8,31 10 8
T MW 1 / 3
5.1.23
ahol Dm mértékegysége cm2/s, a dinamikus viszkozitásé, , cP, MW, molekuláris tömegé gramm, és T az abszolút hőmérsékleté K. A
molekuláris
diffúzió
nagyon
érzékeny
tulajdonsága
a
mintamolekuláknak, erősen függ számos kísérleti paramétertől (úgymint a minta tulajdonságaitól, koncentrációjától, az oldószer összetételétől, a hőmérséklettől és a nyomástól). Igen kedvező lenne kromatográfiás állófázison fellépő anyagátadás vizsgálata esetén, ha a Dm pontosan meghatározható lenne egy HPLC-rendszerben. Miyabe
és
munkatársai
az
úgynevezett
’peak
parking’,
azaz
csúcsparkoltatáson alapuló módszert javasolják erre a célra [119, 120]. Knox és McLaren 1964-ben vezette be a módszert, melyet megállított áramlásos technikának is neveznek [10], nitrogéngázban megmérték az etilén molekuláris diffúzióját, és számos GC-töltet obstrukciós (gátlási) faktorát. Ezek után kezdték alkalmazni LC-rendszerek kinetikai tulajdonságainak meghatározására is [117, 119, 121, 122] A „csúcsparkoltatásos” módszer lényege, hogy a mozgófázist addig áramoltatjuk, míg a mintazóna el nem éri megközelítőleg a kromatográfiás oszlop közepét, majd az áramlást megállítjuk, és hagyjuk a mintát áramlásmentes közegben diffundálni egy adott ideig, majd újraindítjuk a mozgófázis áramlását.
32
A
parkolási
idő
alatt
bekövetkező
sávszélesedést
a
variancia
növekedése mutatja, melyért az axiális diszperzió a felelős:
d 2 2DLdt p
5.1.24
ahol DL a minta axiális diszperziója a mozgófázisban, ami egyenlő Dm-mel, amennyiben a kísérletet csőben végezzük. Ha az áramlási csatornák összetettek, kanyarulatosak, kiöblösödőek a töltetben, az hatással van a Dm-re is. Ebben az esetben DL az obstrukciós faktoron () keresztül arányos a Dm-mel [8]:
d 2 2Dmdt p
5.1.25
33
5.1.2. Külső anyagátadás a szemcse felszínén
Elfogadott mérési módszer nem létezik a külső anyagátadási gátlás mérésére, ez a jelenség modellek alapján írható le. A filmelmélet az egyik legegyszerűbb elmélet, ami fázisok közötti anyagátadást ír le. Feltételezi, hogy minden felületet, így az oszlop szemcséit is, stacioner filmréteg borít. Ezen a folyadékrétegen keresztül az anyagátadás csak molekuláris diffúzióval valósul meg. A réteg egyik oldala ki van téve a mozgófázis áramlásának és teljesen megközelíthető. A másik oldala a szemcsét borítja és csak a pórusnyílásoknál közelíthető meg (5.2 ábra). Ez a mozdulatlan folyadékréteg szinte mindig hipotetikus, mivel szilárd felületen is mozog a folyadék. A réteg vastagságát, ennél fogva az anyagátadási állandót is, a hidrodinamikai tulajdonságok és az áramlási sebesség határozza meg. Az irodalomban számos tapasztalati összefüggés található a külső anyagátadási együttható leírására [123]. A Wilson-Geankoplis tapasztalati egyenlettel [124] a többi anyagátadási együtthatótól függetlenül határozható meg a külső anyagátadási együttható. A 0,0015 Re 55 Reynolds-számú rendszerekre
Sh
1,09 1/ 3 1/ 3 Sc Re e
5.1.26
A Wilson-Geankoplis-egyenletben szereplő Sherwood-szám (Sh) a külső anyagátadási együttható függvénye:
Sh
k ext d p
5.1.27
Dm
A kext a következőképpen fejezhető ki:
k ext
1,09 1/ 3 Dm uh d e p
2/3
5.1.28
34
5.1.3. Pórusbeli diffúzió
A mozgófázis a szemcsék pórusaiban nem áramlik, hanem stagnál, a mintamolekulák diffúzióval haladnak. Útjuk a következő lépesekkel írható le: 1) bejutnak a szemcsébe; 2) diffúzióval haladnak a szemcsén keresztül; 3) adszorbeálódnak; 4) deszorbeálódnak; 5) diffúzióval elhagyják a szemcsét. Általában az anyagátadás sebességét a pórusbeli transzport sebessége szabályozza a szorpció kinetikája helyett. A pórusbeli diffúzió néhány egymás mellett lezajló jelenség által valósul meg, melyek sebessége számos körülménytől függ (pórusméret, tortuozitás, a szűkületek mérete, a pórushálózat összetettsége, a minta-koncentrációja…). Lényegében négy fő jelenség alakítja a pórusbeli diffúziót: a molekuláris diffúzió, a Knudsen-diffúzió, a Poiseuille-áramlás és a felületi diffúzió. A tényleges pórusbeli diffúzió kísérletes meghatározásakor a felsorolt jelenségek összességét mérjük [1]. A fordított fázisú HPLC-ben a felületi diffúzió hozzájárulása a pórusbeli diffúzióhoz jelentős. A felületi diffúzió a pórusok felszínére adszorbeálódott folyadékrétegben
játszódik
le.
A
mintamolekulák
mozgékonysága
az
adszorbeált fázisban kisebb, mint a szabad folyadékban. A diffúziós határréteg nagyobb mintakoncentrációja miatt jelentős felületi diffúzió alakulhat ki. Amikor a pórusbeli és a felületi diffúzió párhuzamosan megy végbe, akkor a teljes pórusbeli diffúziót Suzuki [4] szerint a D p D p,m KD s
5.1.29
egyenlettel fejezhetjük ki, ahol Dp a pórusbeli effektív diffúziós együttható, Dp,m a pórusokban található oldatban, távol a pórus felszínén adszorbeálódott folyadékréteg elektromos terétől zajló diffúzió együtthatója, Ds a felületi diffúziós együttható, ρ a szemcse sűrűsége, és K az adszorpciós egyensúlyi állandó.
35
5.2. A
van
Deemter-egyenletből
származtatott
tányérmagasság-
egyenlet
A kromatográfia hagyományos modelljeiben azt feltételezik, hogy a sávszélesedésért felelős jelenségek három tag összegekét adhatók meg. Van Deemter és munkatársai szerint négy sávszélesedési tényező okozza a kromatográfiás csúcsok kiszélesedését: 1) az örvénydiffúzió; 2) a hosszanti (axiális) diszperzió; 3) az anyagátadási gátlás a mozgófázisban; 4) és az állófázisban [6]. A van Deemter-egyenlet általánosan használt empirikus összefüggés a HETP leírására,
H A B / u Cu
5.2.1
Az A tag az örvénydiffúziós jelenséget írja le a mozgófázis átlagos sebességének széles tartományában. A B/u tag a szemcsék közötti axiális diszperziót írja le, a Cu tag a külső anyagátadási gátlást, a szemcsék pórusaiban zajló diffúziót és az állófázis felszínén zajló adszorpciót-deszorpciót fogalja magába.
B 2DL
2 k C 1 F k1 1
5.2.2
2
rp rp2 3k 15 D ext p
5.2.3
36
Amennyiben
összehasonlítjuk
az
általános
sebességi
modell
tányérmagasság-egyenletét (5.1.7 egyenlet) a van Deemter-egyenlettel, látható, hogy nem tartalmaz A tagot. Az általános sebességi modell által leírt fizikaikémiai hatások a van Deemter-egyenlet B/u és Cu tagjainak felelnek meg. A kromatográfiás folyamatokban szereplő fizikai-kémiai jelenségekről a B/u és a Cu tag szolgáltat információt. Amennyiben a van Deemter-egyenlet alapján kívánjuk meghatározni az anyagátadási együtthatókat, az A tag elhanyagolható, és az 5.2.1 egyenlet a következő formában írható fel:
H B / u Cu
5.2.4
Ha figyelembe vesszük, hogy az axiális diszperzió felírható a molekuláris diffúzió és az örvénydiffúzió összegeként (5.1.12 egyenlet) [6], felfedezhető a van Deemter egyenlet és az 5.2.4 egyenlet közötti összefüggés.
37
5.3. Momentumanalízis
Az első momentum egyenesen arányos az adszorpciós egyensúlyi állandóval, a második centrális momentumból kiszámolható a szemcsék pórusaiban történő diffúzió fordított fázisú kromatográfia esetén. Az első momentum (µ1) és a második centrális momentum (µ’2) a következőképpen adható meg [4]:
1
L 0 u0
5.3.1
'2
2L ( L f d ) ( '2 )m ( '2 )sys u0
5.3.2
L
e DL 02
5.3.3
u02
0 e (1 e )( p p KCE )
5.3.4
f (1 e )(r p / 3k ext )( p p K CE )2
5.3.5
d (1 e )(r p2 / 15Dp )( p p K CE )2
5.3.6
ahol (µ'2)m és (µ'2)sys kifejezi a mozgófázis és a készülék oszlopon kívüli holttérfogatának hozzájárulását a második centrális momentumhoz. L, f és d axiális diszperziók, a folyadék-szemcse anyagátadási gátlás és a szemcsén belüli diffúzió hozzájárulása a második centrális momentumhoz, p a szemcse sűrűsége, KCE vegyészmérnöki egyensúlyi állandó. A Suzuki modell szerint felírt momentumok (5.3.1 és 5.3.2 egyenlet, eltekintve a mozgófázis és az oszlopon kívüli holttérfogat második centrális momentumhoz történő hozzájárulásától) és az általános sebességi modellben felírt 1 és 2’ (5.1.1 és 5.1.11 egyenlet) egyenértékű, amennyiben: 38
K CE 1 t K p (1 e )
5.3.7
Mivel a kromatográfiában az egyensúlyi állandó meghatározásakor a minta koncentrációját mind a folyadék-, mind a szilárd fázisban a mintatömeg egységnyi térfogatra vonatkoztatásával adjuk meg (pl. g/cm3), így K dimenzió nélküli szám. A vegyészmérnökök a folyadékfázis mintakoncetrációját az előbb említett módon adják meg, viszont a szilárd fázis koncentrációját az adszorbeált anyagnak a tömegkoncentrációjával számolják, ezért KCE mértékegysége például cm3/g. Az 5.2.4 tányérmagasság-egyenlet linearizálásával HMA és H0 került bevezetésre könnyebb kezelhetőség miatt:
H MA
H0
D '2 L 2L H 0 2 1 2u 0 u 0
5.3.8
f d 02
5.3.9
Ezek a paraméterek nem az általánosan használt HETP-értékek, hanem HETP/2u0, ezért idő mértékegységük van. Az 5.3.8 egyenlet alapján kijelenthetők, hogy a HMA az axiális diszperzió miatt függ a mozgófázis sebességétől,
valamint
HMA-t
1/u02
függvényében
ábrázolva
lineáris
összefüggést kapunk. Az axiális diszperziós együttható (DL) az egyenes meredeksége és H0 a tengelymetszet.
39
5.4. Sztochasztikus modell
A kromatográfia sztochasztikus modellje [3] azt a valószínűséget írja le, hogy egy molekula az oszlopon belül t időben z helyen található. Feltételezi, hogy ka anyagátadási együttható sebességi állandó, mely kifejezi azt a valószínűséget, hogy a mintamolekula átjut a mozgófázisból az állófázisba. A kd sebességi állandó egy másik anyagátadási együtthatót ír le, azt, amikor a mintamolekula visszajut az állófázisból a mozgófázisba. A ka állandó kifejezi, hogy a mintamolekula pillanatszerűen jut át az állófázisba. A kd sebességi állandó elsőrendű folyamattal írja le a mozgófázisba történő visszajutást.
5.4 ábra
Molekulák véletlen vándorlása kromatográfiás oszlopban [125]
Amikor a molekula abszorbeálódik, helye nem változik az oszlopban, miközben az idő telik, amit s*-sel jelölünk. Amikor deszorbeálódik, előre halad a mozgófázissal a következő adszorpcióig, ezt az időt m*-mel jelöljük. Mivel ezek a tartózkodási idők véletlen változók, minden molekula egyéni útvonalon halad és különböző idő múlva éri el az oszlop végét. Két molekula, mely egyszerre kezdte meg vándorlását az oszlopban, adott időben különböző helyeken tartózkodik. A kromatográfiás csúcsok a molekulák egyéni retenciós idejének valószínűség sűrűség függvényei (5.4 ábra).
40
Az az átlagos időm, amelyet a molekula a mozgófázisban tölt az állófázisból történő kilépés és visszatérés között, és s az az átlagos idő, amelyet egy adszorpciós lépés alkalmával az állófázison tölt. Ezek az időállandók közvetlenül viszonyulnak a fentiekben bevezetett adszorpciós állandóhoz – vagyis a mozgófázisból az állófázisba történő transzporthoz – és a deszorpcióhoz – azaz az állófázis elhagyásához:
m 1/ k a
5.4.1
s 1/ k d
5.4.2
Egy retenció nélküli molekula t0 idő után távozik az oszlopról, vándorlása során csak a mozgófázisban tartózkodik. Minden retencióval rendelkező molekula retenciós ideje (tR) a t0 — mivel ugyanannyi időt tölt a mozgófázisban, mint a retenció nélküli molekula —, és a korrigált retenciós idő (tR’) – tulajdonképpen az állófázison töltött idő – összege. Így a holtidő és a korrigált retenciós idő kifejezhető az átlagos mozgó- és állófázison eltöltött tartózkodási idővel, valamint az anyagátadási lépések átlagos számával (n): t0 mn
5.4.3
t R ' s n
5.4.4
Továbbá a kromatográfiás csúcsok varianciája is megadható az állófázisban lejátszódó folyamatok függvényeként: 5.4.5
2 2n s
41
6. Inverz méretkizárásos kromatográfia
A fentiekben leírtak alapján nyilvánvaló, hogy az anyagátadás pontos meghatározásakor ismernünk kell a kromatográfiás oszlop és töltet geometriai paramétereit. Az irodalomban többféle módszert is leírtak az állófázisok térkitöltési tényezőinek meghatározására. Polimerek elválasztásakor igen gyakran alkalmaznak méretkizárásos kromatográfiát (size-exclusion chromatography, SEC), mely mérési módszer alapján a mozgófázisban feloldott minta komponensei méretük szerint válnak el; egy jól ismert szerkezetű kromatográfiás állófázis segítségével határozzuk meg a polimer keverékek méreteloszlását. A nagy molekulák nem férnek be a kis átmérőjű pórusokba, ezért gyorsabban eluálódnak, mint azok a kisebb méretű molekulák, melyek bejutnak az állófázis pórusaiba. A méretkizárásos kromatográfia az egyik leggyakrabban alkalmazott módszer polimer vegyületek méreteloszlásának meghatározására. Az elúció során kialakuló sávszélesedés okait már nagyon korán elkezdték tanulmányozni [126].Halász és munkatársai dolgozták ki az inverz méretkizárásos kromatográfiát (ISEC) [127], melyet azóta folyamatosan bővítettek, finomítottak [128]. A méretkizárásos kromatográfia fordított, inverz módját az állófázisok térkitöltési
paramétereinek
meghatározására
alkalmazzák
[127].
Kitűnő
alternatívája a higanyos porozimetriának [128] – mivel kevesebb kísérleti körülményt kell biztosítani, pl. kontaktszög, felszíni tenzió – és a nitrogénadszorpciós méréseknek [129] – mivel a mérések során nem változik meg az állófázisok felszíne és a pórustérfogat. Jól definiált méreteloszlású standard polimerek injektálása esetén a molekulatömeg
függvényében
változó
aszimmetriájú
csúcsokat
kapunk,
amelyeket az állófázisból történő kizáródás eredményez. A módszer az állófázisok széles palettáján alkalmazható: szilícium-dioxidon [128], kémiailag módosított felszínű szilikagélen [130, 131], aluminium-oxidon [132], szintetikus polimer adszorbenseken [133], valamint monolit-tölteten is [134]. Ismert, hogy a fordított fázisú kromatográfiában négy független anyagátadási jelenség okozza a kromatográfiás csúcsok szélesedését. A 42
méretkizárásos kromatográfiában a mintamolekulák nem adszorbeálódnak az állófázishoz, a sávszélesedést az axiális diszperzió, a külső anyagátadási gátlás és a szemcsén belüli diffúzió okozza. A méretkizárásos kromatográfia sztochasztikus modellje a szemcsék között áramló mozgófázis és a szemcsék pórusaiban stagnáló mozgófázis közötti véletlenszerű kicserélődésen alapul [98]. A mintakomponensek retencióját a méretkizárás és a hidrodinamikai hatás együttesen befolyásolja. A kizáródó komponensek retencióját egyedül a hidrodinamikai hatás alakítja. VR V0 K HDC Vp K SEC
5.4.1
ahol KHDC a retencióhoz hozzájáruló hidrodinamikai hatás, a KSEC a méretkizáródás hozzájárulását leíró egyensúlyi állandó.
K HDC
V0 1 2 C2
5.4.2
reff r0
5.4.3
ahol C = 2.698, reff a makromolekula effektív sugara és r0 az állófázis-szemcsék között kialakult csatorna sugara.
reff
2
5.4.4
rG
ahol rG a polimer forgási sugara, amely a következő módon számolható: k BTMW B rG 4K
5.4.5
43
ahol kB a Boltzmann-állandó, T az abszolút hőmérséklet (K), a hordozó viszkozitása, K = 3·10-8 m2/s és B = 0,549 [98]. r0 és e megadható az állófázis szemcseátmérője, dp szerinti:
e 3 1 e
5.4.6
Vexcl 4 Vexcl Vcol d p2L
5.4.7
dp
r0
e
ahol Vexcl a szemcsék közötti térfogat és Vcol a kromatográfiás oszlop geometriai térfogata. K SEC (1 ) m
0 1 esetén
rG rp
5.4.8
5.4.9
ahol a relatív makromolekula-méret, rG a makromolekula forgási sugara, rp az állófázis-szemcse sugara. Az m a teljes méretkitevő, melynek értéke utal a pórusok alakjára, 1 esetén hasított, 2-nél hosszú hengeres, illetve 3-nál gömbvagy kúpalakú pórust feltételez [98, 135].
44
7. Kísérleti körülmények
A HPLC méréseket egy Agilent 1100 folyadékkromatográfon végeztük. A készülék
egy
kettős
szivattyúból,
automata
mintaadagolóból,
oszlop-
termosztátból, diódasoros UV-detektorból épül fel. Munkánk során a következő fordított fázisú oszlopokon végeztünk kísérleteket: a.
teljesen porózus Waters Symmetry C18 (150 mm × 4,6 mm, átlagos szemcseméret 5 µm, pórusátmérő 100 Å)
b.
teljesen porózus Waters Symmetry C18 (75 mm × 4,6 mm, átlagos szemcseméret 3,5 µm, pórusátmérő 100 Å)
c.
teljesen porózus Waters SunFire C18 (100 mm × 3,0 mm, átlagos szemcseméret 3,5 μm, pórusátmérő 94 Å)
d.
porózus kéreggel bevont tömörmagvú Halo C18 (100 mm × 4,6 mm, átlagos szemcseméret 2,7 µm, 1,7 µm átmérőjű tömör mag, 0,5 µm porózus kéreg, pórusátmérő 90 Å)
45
Felhasznált vegyszerek: a.
A HPLC oszlopok térkitöltési tényezőinek meghatározásához felhasznált vegyszerek:
Eluens: tetrahidrofurán (THF) Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). Minta: a különböző molekulatömegű polisztirol-standardokat (MW 580, 1480, 3070, 3950, 5120, 6930, 10100, 31420, 70950, 170800, 578500, 1233000, 3250000) Varian (Varian, Inc. USA) gyártotta. b.
Molekuláris diffúzió vizsgálata során felhasznált vegyszerek:
Eluens: tetrahidrofurán (THF) Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). Minta: a különböző molekulatömegű polisztirol-standardokat (MW, 10100, 31420, 70950) Varian (Varian, Inc. USA) gyártotta. c.
Semleges,
kis-molekulatömegű
komponensek
anyagátadási
együtthatóinak meghatározása során felhasznált vegyszerek: Eluens: metanol (CH3OH) és ioncserélt víz Scharlau Lab. Chemicals (Barcelona, Spanyolország). Minta: tiokarbamid, toluol, etilbenzol, n-propilbenzol, n-butilbenzol SigmaAldrich (St. Louis, MO, USA) és n-pentilbenzol Fluka (St. Louis, MO, USA). d. Különböző
geometriájú
állófázisokon
kialakuló
anyagátadási
gátlás
összehasonlítása során felhasznált vegyszerek: Eluens: trifluor-ecetsav (TFA) Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA), acetonitril (CH3CN), ioncserélt víz Scharlau Lab. Chemicals (Barcelona, Spanyolország). Minta: humán inzulin (MW=5,5 kDa) Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA).
46
7.1. HPLC oszlopok térkitöltési tényezőinek meghatározása
A
térkitöltési
tényezők
meghatározására
inverz
méretkizárásos
kromatográfia (ISEC) módszerét alkalmaztuk. Eluensként a porózus oszlopok esetén 1 cm3/perc, a tömörmagvú oszlop esetén 0,5 cm3/perc áramlási sebességű tetrahidrofuránt alkalmaztunk. Mintaként 1µl 0,5 mg/cm3 koncentrációjú, különböző molekulatömegű standard polisztirol-oldatokat injektáltunk (MW 580, 1480, 3070, 3950, 5120, 6930, 10100, 31420, 70950, 170800, 578500, 1233000, 3250000). A méréseket 20 °C-on végeztük és 254 nm-en detektáltunk. A méréseket oszlopok nélkül, nulla térfogatú szűkítő alkalmazásával is elvégeztük.
7.2. Molekuláris
diffúzió
vizsgálata
megállított
áramlásos
(’peak
parking’) módszerrel
A méréseket a b. és a d. jelű oszlopokon végeztük el. Mintaként 1-1 µl 0,5 mg/cm3 koncentrációjú standard polisztirol oldatot injektáltunk (MW 10100, 31420, 70950). Az eluens, 100% tetrahidofurán, áramlási sebessége 1 cm3/perc volt, melyet a minták várható retenciós idejük felénél 30, 60, 120, 180, 240, 480 percre megállítottuk, majd a parkolási idő leteltével újraindítottuk. A méréseket 20 °C-on végeztük el, és 254 nm-en detektáltunk.
47
7.3. Semleges,
kismolekulatömegű
komponensek
anyagátadási
együtthatóinak meghatározása
Az a. jelű oszlopon hajtottuk végre standard alkilbenzol-keverék elválasztását. Különböző áramlási sebességen végeztünk méréseket 0,1–2,5 cm3/perc tartományban, 20, 30 és 40 °C-on. Az eluens minden esetben 80% metanolt és 20% ioncserélt vizet tartalmazott. A standard keverék 0,4 µl/cm3 toluolt, etilbenzolt, n-propilbenzolt, nbutilbenzolt és n-pentilbenzolt és 0,8 µg/cm3 tiokarbamidot tartalmazott, amelyből 20 µl-t injektáltunk mérésenként. A komponensek detektálása 254 nm-es hullámhosszon történt. Az oszlop holttérfogatának meghatározása a tiokarbamid-csúcsok retenciós
adatai
alapján
történt,
mivel
a
tiokarbamid
megkötődése
elhanyagolható a C18-as állófázison. 1 µl 1,6 µg/cm3-es tiokarbamid-oldatot injektáltunk, a mérés a fentiekben leírt módon zajlott. A rendszer oszlopon kívüli térfogatát 0,4 µl/cm3 toluol-oldat injektálásával határoztuk meg, úgy, hogy a kromatográfiás oszlop helyett egy nulla térfogatú szűkítőt kötöttünk a rendszerbe.
7.4. Különböző geometriájú állófázisokon kialakuló anyagátadási gátlás összehasonlítása A méréseket a c. és d. jelű oszlopokon 20°C-on, 0,02–1,4 cm3/perc áramlási sebesség tartományban végeztük. Az eluens minden esetben 21% acetonitrilt és 79% ioncserélt vizet tartalmazott, 0,1% trifluor-ecetsavval. Mérésenként 1 µl inzulin-oldatot injektáltunk, melyet 205 nm-en detektáltunk. Az oszlopok holttérfogatát 1 µl 1,6 µg/cm3-es tiokarbamid-oldat injektálásával határoztunk meg a fent leírt mérési körülmények között. A
48
rendszer oszlopon kívüli térfogatát inzulin-oldat injektálásával határoztuk meg, úgy, hogy a kromatográfiás oszlop helyett egy nulla térfogatú szűkítőt kötöttünk a rendszerbe.
7.5. Alkilbenzolok
anyagátadási
együtthatóinak
meghatározása
sztochasztikus modell szerint Az a. jelű oszlopon végeztük el egy standard alkilbenzol-keverék elválasztását. A méréseket 0,25, 0,50, 1,00 és 1,50 cm3/perces áramlási sebességen hajtottuk végre, 10, 20, 30 és 40 °C-on. Az eluens minden esetben 80% metanolt és 20% ioncserélt vizet tartalmazott. A kísérletek további körülményei megegyeznek a 7.3. pontban leírtakkal.
49
8. Momentumok meghatározása
Az általános anyagátadási állandók meghatározásakor először a kromatográfiás csúcsok momentumait kell megállapítani. A nulladik momentum, azaz a csúcs alatti terület és az első momentum, vagyis a jel várható értéke a következő módon számolható:
0 f (t )dt
7.5.1
1
tf (t )dt
7.5.2
f (t )dt
A második centrális momentum, azaz a jel varianciája:
2
'
(t 1 )2 f (t )dt
7.5.3
f (t )dt
Gyakran nehéz megfelelő pontossággal meghatározni a statisztikai momentumokat. A magasabb rendű momentumok pontosságát erősen befolyásolja az alapvonal emelkedése és zaja. A legbiztosabb módszer az, ha csúcsalak-modellt illesztünk a kísérletben felvett csúcs pontjaira, majd a legjobb illeszkedés paramétereiből kiszámoljuk a momentumokat [1]. A kromatográfiában az exponenciálisan módosított Gauss-görbe (EMG) az egyik leggyakrabban alkalmazott aszimmetrikus függvény csúcsalakok leírására. Annak ellenére, hogy az EMG-csúcsalak paramétereinek nincs fizikai jelentése, a csúcs momentumai meghatározhatók a függvény megfelelő pontosságú illesztése után.
50
Munkánk során a következő EMG-függvényt illesztettük a kromatográfiás csúcsokhoz:
f (t )
2 t t R A t tR erfc exp 2 2 2 2 2
7.5.4
ahol A a csúcs alatti terület, tR a retenciós idő, a szórás, az EMG-függvény exponenciális időállandója. Ezen a ponton ki kell hangsúlyozni, hogy az EMG-modell tisztán tapasztalati,
nem
alkalmas
kinetikai
vagy
anyagátadási
együtthatók
meghatározására. A kromatográfusok mégis gyakran alkalmazzák ezt a csúcsalak-modellt, mivel számos kísérleti csúcsot képes leírni. Mindazonáltal a
paraméternek nincs semmilyen kapcsolata az anyagátadással vagy az adszorpció-deszorpció kinetikájával. Az EMG-modell első és második centrális momentuma:
1 t R
7.5.5
és
2 ' 2 2
7.5.6
Mindkét momentum additív tagokból áll. Az álló- és mozgófázis hatását (s, illetve m), valamint az oszlopon kívüli hatásokat (sys) egyenként kell meghatározni. Ismernünk kell hatásukat a kromatográfiás csúcs helyzetére és szélességére,
ha
a
csúcs
alakja
alapján
fizikai-kémiai
paramétereket
szándékozunk megadni.
s m sys
7.5.7
A hozzájárulások mértékét tiokarbamid (oszloppal, m), illetve toluol vagy inzulin (oszlop nélkül, sys) injektálással mértük ki.
51
Számos oka van annak, hogy a HPLC-ben aszimmetrikus csúcsokat figyelhetünk meg. Például a valóban lassú anyagátadás és szorpciós kinetika. Habár csak extrém lassú kinetika esetén figyelhetünk meg aszimmetrikus csúcsokat. A fordított fázisú kromatográfiában a kinetika elég gyors és az anyagátadási lépések száma elég nagy ahhoz, hogy az elválasztások során szimmetrikus csúcsokat kapjunk. Ha kísérleti úton felvett kromatográfiás csúcsok momentumait kívánjuk meghatározni, mindig számolnunk kell hibalehetőségekkel. Főleg magasabb rendű momentumok pontos meghatározása bonyolult. A pontosság növelésére csúcsalak-függvényeket illesztenek a kísérletileg felvett pontokra és a legjobban illeszkedő függvény alapján határozzák meg a csúcs momentumait.
8.1 ábra Kromatográfiás csúcs statisztikai momentumai az idő függvényében A pontok numerikus integrálással nyert adatok, a görbe az EMG-függvény [7.5.4 egyenlet] illesztése
A kísérletben és az elméletben meghatározott nulladik, első és második centrális momentum időtengely menti profiljának összehasonlítása látható a 8.1 ábrán. Az elméleti eloszlást az EMG-függvény illesztésével határoztuk meg, ahol R2 = 0,9999, és az illesztés standard hibája 0,0056.
52
A
nulladik
és
az
első
momentum
esetében
kitűnő
egyezést
tapasztaltunk. A második centrális momentum esetében a kísérleti eredmény különbözik az elméletitől, ennek megfelelően kísérleti adatok alapján a második centrális momentum pontos megadása bizonytalan.
Munkánk során PeakFit v4.12 programmal végzett illesztés alapján határoztuk meg a csúcsok első és második centrális momentumait. A program a legkisebb négyzetek módszere szerint illeszti az EMG-függvényt.
53
9. Eredmények és megvitatásuk
Az elválasztástechnikában elszánt verseny folyik gyors elválasztások kifejlesztéséért, miközben a fejlesztők szem előtt tarják a nagy hatékonyság megtartását. A HPLC-ben két lehetőség van e célok elérésére: új állófázisokat kell kifejleszteni, vagy a készülékek oszlopon kívüli térfogatát kell minimalizálni. Még nincs egy évtizede, hogy 2004-ben megjelentek a piacon az úgynevezett UHPLC (Ultra High Performance Liquid Chromatography) készülékek, melyekkel extrém magas nyomáson (1000 bar) 2 µm alatti szemcseátmérőjű állófázisokon végezhetők elválasztások. Ezen körülmények között az analízisidő 1–2 percre csökken, miközben az elválasztás felbontása és a hatékonysága nem romlik [136]. Az állófázisok széles választéka érhető el kereskedelmi forgalomban, ám a fejlesztésük a mai napig töretlen. A hagyományos porózus szilika-szemcsék a legelterjedtebben alkalmazott HPLC állófázisok [18], mivel ezeknek a fajlagos felülete elég nagy ahhoz, hogy hatékony elválasztásokat végezhessünk rajtuk. Gyorsabb anyagátadást a diffúziós utak rövidítésével lehet elérni, erre megoldás a szemcseátmérő csökkentése és szemcsén belüli pórusok térfogatának csökkentése, megszüntetése. A reneszánszukat élő tömörmagvú, 3 µm alatti szemcseátmérőjű töltetek (4.1 ábra) mindkét lehetőséget kihasználva gyors és hatékony elválasztást biztosítanak, miközben a bennük kialakuló nyomásesés sem extrém nagy.
Munkánk során hagyományos HPLC-készüléken végzett mérésekkel hasonlítottuk össze számos szempontból a klasszikus teljesen porózus gömbszimmetrikus szemcséjű és porózus kéreggel bevont tömörmagvú gömbszimmetrikus szemcséjű (a továbbiakban röviden tömörmagvú), C18-as borítású állófázison kialakuló anyagátadást.
54
9.1. HPLC oszlopok térkitöltési tényezőinek meghatározása
A Kísérleti körülmények című fejezetben felsorolt négy oszlopon végeztük HPLC méréseinket a fejezet 7.1. pontjában leírtak szerint. Méretkizárásos kromatográfiában a retenció a mintakomponensek relatív méretétől, (5.4.9 egyenlet), függ. A 9.1 ábrán (és az I. függelékben) monodiszperz polisztirol-standardok egymásra vetített kromatogramja látható, melyeket teljesen porózus és tömörmagvú állófázisokon fejlesztettünk ki. Megfigyelhető
a
csúcsok
szimmetriájának
változása
a
molekulaméret
függvényében. A pórusokba bejutó polimerek csúcsai (kék) szélesebbek, míg a kizáródó polimerek csúcsai (piros) keskenyebbek.
9.1 ábra Monodiszperz polisztirol-standardok (MW 580 – 325000 mérettartomány) egymásra vetített méretkizárásos kromatogramja 20°C-on 100 % tetrahidrofurán eluens esetén
55
9.2 ábra Standard polisztirolok retenciós térfogata a standardok molekulatömege köbgyökének függvényében zöld: a pórusokból teljesen kizáródó polimerek retenciós térfogat értékeire illesztett egyenes, y tengelymetszete VM; világoskék: a pórusokba bejutó polimerek retenciós térfogat értékeire illesztett egyenes, y tengelymetszete Vexcl.
A 9.2 ábrán (és a II. függelékben) a polisztirolok retenciós térfogatát molekulatömegük köbgyökének függvényében ábrázoltuk. A pórusokba bejutó és a kizáródó polimerek retenciós térfogat értékeire külön-külön egyenest illesztettünk. Az egyenesek metszéspontjából meghatározható a pórusba bejutó polimerek maximális mérete. A kizáródó polimerek retenciós térfogat értékeire illesztett egyenes y tengelymetszete megadja az oszlop szemcsék közötti térfogatát, Vexcl-t (9.2 ábra). Az oszlopok közötti különbség az eltérő szemcseméretre vezethető vissza. Az 9.1 táblázatban soroltuk fel az oszlopok térkitöltési tényezőit. A teljes térkitöltési tényező
t
VM Vcol
9.1.1
56
ahol VM az oszlop teljes vagy geometriai térfogatának (Vcol) azon része, melyet a mozgófázis tölt ki, vagyis az oszlop holttérfogata. A külső térkitöltési tényező a szemcsék közötti térfogat és az oszlop térfogatának hányadosa:
e
Vexcl Vcol
9.1.2
A szemcséken belüli, belső térkitöltési tényezőt (p) az előzőek ismeretében a következő módon határoztuk meg:
p
t e 1 e
9.1.3
A szelektivitás méretkizárásos kromatográfiában a mintamolekulák effektív sugara és az állófázis-szemcsék között kialakult csatornák egymáshoz való arányától függ (5.4.9 egyenlet). A KSEC álladó K SEC (VR Vexcl ) / Vp
9.1.4
összefüggés alapján számolható, ahol Vp a pórustérfogat, mely Vp VM Vexcl
9.1.5
A 9.3 ábrán a KSEC látható a függvényében ábrázolva, a szimbólumok számolt értékek, melyekre az 5.4.8 egyenletet illesztettük. Megfigyelhető, hogy a KSEC-re, a méretkizáródás hozzájárulását leíró egyensúlyi állandókra illesztett görbe a kisebb szemcseméretű (2,7 ill. 3,5 µm) oszlopok esetében közel azonos, a legnagyobb szemcséjű állófázis (5 µm) KSEC egyensúlyi állandóira illesztett görbe jelentősen eltér a többitől. A méretkizáródást leíró egyensúlyi állandóra nincs hatással a szemcsék pórusátmérője, illetve a szemcse felépítése, azaz hogy teljesen porózus-e, vagy tömörmagvú.
57
Az m kitevő (5.4.8 egyenlet) információt ad a pórusok alakjáról (9.1 táblázat). Mivel m értéke ~2 vagy ~3, a vizsgált oszlopok pórusai, hosszúak és hengeresek, illetve kónikusak.
9.3 ábra Méretkizáródás retencióhoz történő hozzájárulását leíró egyensúlyi állandó (KSEC)a standard polisztirolok relatív méretének függvényében
9.1 táblázat A HPLC állófázisok szemcsék közötti térfogatának, Vexcl, holttérfogatának, VM, és térkitöltési tényezőinek összehasonlítása 3
3
Vexcl (cm )
VM (cm )
t
e
p
m
porózus, 5 µm, 100 Å
0,912
1,477
0,601
0,394
0,342
3,02
porózus, 3,5 µm, 100 Å
0,458l
0,763
0,596
0,414
0,311
2,18
porózus, 3,5 µm, 94 Å
0,256
0,459
0,634
0,362
0,426
1,99
tömörmagvú, 2,7 µm, 90 Å
0,708
0,846
0,535
0,444
0,164
2,26
58
9.2. A molekuláris diffúzió vizsgálata
Az anyagátadási együtthatók meghatározása előtt célszerű a molekuláris diffúzió pontos meghatározása, mivel az axiális diszperzió, a külső anyagátadás és a pórusbeli diffúzió is függ a Dm-től. A megállított áramlásos módszer megfelelő eljárás lehet a molekuláris diffúziós együttható megállapítására kromatográfiás körülmények között. A mérésekhez méretkizárásos körülményeket választottunk, mivel ilyen beállításoknál nincs kémiai kölcsönhatás a minta és az állófázis között; a sávszélesedést nem befolyásolja a minta adszorpciója. A Kísérleti körülmények című fejezet 7.2. pontban leírtak alapján végeztük el kísérleteket az a. teljesen porózus Waters Symmetry C18 (150 mm × 4,6 mm, átlagos szemcseméret 5 µm, pórusátmérő 100 Å) és a d. porózus kéreggel bevont tömörmagvú Halo C18 (100 mm × 4,6 mm, átlagos szemcseméret 2,7 µm, 1,7 µm átmérőjű tömör mag, 0,5 µm porózus kéreg, pórusátmérő 90 Å) oszlopon.
9.4 ábra Polisztirol-standardok 2 értéke a parkolási idő függvényében porózus és tömörmagvú állófázison A szimbólumok mért értékek, amelyekre lineáris regresszióval illesztettünk egyeneseket.
59
Mintaként olyan méretű polisztirolokat választottunk, mely még beférnek az állófázisok pórusaiba (MW=101000), illetve kizáródnak onnan (MW=31420 és 70950). Injektálás után, mikor a mintadugó elérte az oszlop hosszának felét, adott ideig leállítottuk a mozgófázis áramoltatását, majd a parkolási idő letelte után újraindítottuk. A polisztirol-csúcsok növekvő varianciája (2) látható a 9.4 ábrán a parkolási idő függvényében (∆t), a mért pontokra lineáris regresszióval illesztettük egyenest (R2 = 0,8773—0,9853), melynek meredeksége az 5.1.25 egyenlet alapján a Dm. A mért pontok szórására a polisztirolok és a pórusátmérők méreteloszlása ad magyarázatot. A számolás során az obstrukciós faktort (értékét, mindkét állófázis esetén 0,7-nek tekintettük [119, 120].
9.2 táblázat Polisztirolok molekuláris diffúziós együtthatói, Dm (cm2/s), teljesen porózus és tömörmagvú szemcséjű állófázison
Polisztirol MW = 10100 porózus 2
Dm (cm /s)
szemcse
(5.1.25 egyenlet)
tömörmagvú szemcse
2
Dm (cm /s) [98] 2
Dm (cm /s) [117]
MW = 31420
MW = 70950
6,044·10
-7
5,023·10
-7
4,429·10
-7
1,146·10
-6
7,698·10
-7
5,939·10
-7
-6
1,900·10 * -6
1,903·10 **
-6
1,019·10 *
-6
1,003·10 **
-7
6,516·10 *
-7
6,337·10 **
*30 °C-on meghatározva ** 21 °C-on meghatározva
Várakozásainknak megfelelően a molekuláris diffúziós együttható értéke a polisztirolok molekulatömegének függvényében csökken (9.2 táblázat). Megfigyelhető továbbá, hogy a tömörmagvú és a teljesen porózus szemcséken a Dm értéke azonos nagyságrendű és jó egyezést mutat az irodalomban található empirikus összefüggések [98, 117] alapján meghatározott diffúziós együtthatókkal.
60
9.3. Anyagátadás méretkizárásos kromatográfiában
A Kísérleti körülmények című fejezet 7.2. pontban leírtak alapján, de a mozgófázis folyamatos áramoltatásával végeztünk kísérleteket. A polisztirolstandardok anyagátadási együtthatóit az általános sebességi modell alapján határoztuk meg. A számításokhoz az előző fejezetben az 5.1.25 egyenlet alapján meghatározott molekuláris diffúziós együtthatókat vettük figyelembe.
9.5 ábra Monodiszperz polisztirol-standardok (MW 10100 - kék, MW 31420 – piros) egymásra vetített méretkizárásos kromatogramja 20°C-on 100% tetrahidrofurán eluens esetén teljesen porózus (vonal) és tömörmagvú szemcséjű (pontozott vonal) állófázison
A pórusokból kizáródó polisztirolok csúcsszélesedése hasonló a teljesen porózus és a tömörmagvú szemcséjű állófázison (2MW31420-porózus
2MW31420-tömörmagvú
sz.
sz.
= 0,74 s2,
= 0,55 s2; 9.5 ábra), míg a pórusokba bejutó, a teljes
diffúziós utat bejáró minták esetén jelentős különbség tapasztalható (2MW10100porózus sz.
= 3,45 s2, 2MW10100-tömörmagvú sz. = 0,99 s2; 9.5 ábra). A pórusokba bejutó
polisztirolok redukált tányérmagassága ( h H / d p ) is (9.6 ábra, pontozott
61
vonallal összekötött szimbólumok) 4-6-szor nagyobb a teljesen porózus, mint a tömörmagvú állófázison. Kaczmarski és Guiochon pellikuláris oszlopokra is kiterjesztette a többnyire teljesen porózus állófázisokra alkalmazott általános sebességi modellt, mely szerint a tányérmagasság-egyenlet a következő formában írható fel [137]:
2DL 2u h k 1 ' H L 22 uh F k 1 1 1
2
rp r p2 R 3k ext 15D p
9.3.1
ahol R a következőt jelenti:
R
r p4 2r p3 r i 3r p2 r i 2 r p r i 3 5r i 4
r
2 p
r p ri ri 2
2
9.3.2
ahol ri és rp a porózus héj belső és külső sugara a pellikuláris szemcsékben. A munkánk során használt tömörmagvú szemcsékre R= 0,588 teljesen porózus szemcsék esetében R = 1. A általános sebességi modellt alkalmazva az axiális diszperzió a Gunnösszefüggés (5.1.13 egyenlet, [106]) alapján számolható. A DL mértéke függ az oszloptöltet szemcseméretétől, tortuozitásától, a mintamolekulák molekuláris diffúziójától és számos kísérleti körülménytől, melyeket a Reynolds-szám és a Schmidt-szám összegez. Ezért a Re-számot (5.1.14 egyenlet) és a Sc-számot (5.1.15 egyenlet) minden komponensre, minden kromatográfiás körülményre kiszámoltuk. A külső anyagátadási állandó meghatározására általánosan alkalmazott összefüggés a Wilson-Geankoplis-korreláció [124], mellyel a Sherwood-szám arányos. Az összefüggésből levezetett 5.1.28 egyenlettel határoztuk meg a három polisztirol minta kext értékeit a vizsgált állófázisokban. A pórusbeli diffúziós együttható a 9.3.1 tányérmagasság-egyenletből kifejezve számolható. Az eredményeket a 9.3 táblázat tartalmazza.
62
9.3 táblázat Polisztirolok-standardok anyagátadási együtthatói teljesen porózus és tömörmagvú szemcséjű állófázisban (axiális diszperziós együttható, DL; külső anyagátadási együttható, kext; pórusbeli diffúziós együttható, Dp) porózus szemcse MW = 10100 2
MW = 31420
MW = 70950
kext (cm/s)
1,988·10
-2
ø
ø
3,109·10
-2
ø
ø
1,487·10
-8
ø
ø
3,398·10
-9
ø
ø
2
1,763·10
2,378·10
-5
MW = 70950
-4
Dp (cm /s)
-5
MW = 31420
2,169·10
2,370·10
-4
MW = 10100
DL (cm /s)
2,293·10
-4
tömörmagvú szemcse
2,853·10
-5
Az axiális diszperziós állandó a molekulatömeg, illetve a molekuláris diffúziós együttható növekedésével együtt nő. A különbség abból ered, hogy az axiális diszperzió hozzájárulása a redukált tányérmagassághoz a pórusba bejutó
polimerek
esetén
elenyésző,
míg
a
kizáródó
polisztirolok
sávszélesedését jelentős mértékben az axiális diszperzió alakítja ki (9.6 ábra).
9.6 ábra Polisztirol-standardok redukált tányérmagassága a redukált sebesség függvényében A kék és a zöld görbe az axiális diszperzió hozzájárulása a redukált tányérmagassághoz porózus és tömörmagvú szemcséjű állófázisban.
63
A teljesen porózus szemcsék között az axiális diszperzió nagyobb, mint a tömörmagvú szemcsék között. Ez a különbség abból ered, hogy a DL egyenesen arányos a mozgófázis sebességével (uh,
porózus szemcse
= 0,25 cm/s,
uh, tömörmagvú szemcse = 0,11 cm/s) és a szemcsemérettel. Külső anyagátadási gátlásról és pórusbeli diffúzióról csak a pórusokba bejutó 10100-as molekulatömegű polisztirol esetében beszélhetünk. A külső anyagátadási gátlás szempontjából nincs szignifikáns különbség az állófázisok között. Láthattuk (9.6 ábra), hogy a pórusba bejutó polisztirolok esetében az axiális diszperzió hozzájárulása a csúcsszélesedéshez minimális, a külső anyagátadási gátlás a két oszlopon hasonló. Várhatóan a pórusbeli diffúzió eltérése eredményezi azt, hogy a teljesen porózus szemcsét tartalmazó oszlopban nagyobb a sávszélesedés. A tömörmagvú szemcsékben negyede a pórusbeli effektív diffúzió a teljesen porózus szemcsékben kialakuló diffúzióhoz képest, mivel a mag lecsökkenti a szemcséken belüli diffúziós utakat.
64
9.4. Anyagátadás fordított fázisú kromatográfiában
Fordított
fázisú
méréseinkhez
töltés
nélküli
kismolekulákat,
alkilbenzolokat és az élettudományokban is jelentős szerephez jutó, töltéssel rendelkező biopolimert, az inzulint választottuk. A Kísérleti körülmények című fejezet 7.3. pontban leírtak alapján végeztük el az alkilbenzol-keverék elválasztását az a. teljesen porózus Waters Symmetry C18 (150 mm × 4,6 mm, átlagos szemcseméret 5 µm, pórusátmérő 100 Å) oszlopon, illetve 7.4. alfejezetben leírtak szerint inzulin-oldatot injektáltunk a c. teljesen porózus Waters SunFire C18 (100 mm × 3,0 mm, átlagos szemcseméret 3,5 μm, pórusátmérő 94 Å) és d. porózus kéreggel bevont tömörmagvú Halo C18 (100 mm × 4,6 mm, átlagos szemcseméret 2,7 µm, 1,7 µm átmérőjű tömör mag, 0,5 µm porózus kéreg, pórusátmérő 90 Å) oszlopokra.
9.7 ábra Alkilbenzol-keverék kromatogramja Oszlop: Waters Symmetry C18 (150x4,6 mm, átlagos szemcseméret 5 µm); Eluens: 80% metanol/20% víz; Áramlási sebesség: 1,00 cm3/perc; Hőmérséklet: 30 °C; Csúcsok: 1 = tiokarbamid, 2 = toluol, 3 = etilbenzol, 4 = n-propilbenzol, 5 = n-butilbenzol, 6 = n-pentilbenzol
65
Az
alkilbenzolok
ideális
komponensek
anyagátadási
együtthatók
meghatározásához: nem ionizálhatók, így nem lépnek kölcsönhatásba az állófázis szabad szilanolcsoportjaival, ezért szimmetrikus csúcsokat kapunk az elemzésekkor (9.7 ábra); valamint kis méretük miatt a teljes diffúziós tér bejárására alkalmasak. A 9.7 ábrán a detektorjelet az idő függvényében ábrázoltuk, a csúcsok szélességének növekedése látszólagos, mivel a nagyobb retenciójú npentilbenzol molekulái lassabban hagyják el az oszlopot, mint a kisebb retenciójú molekulák. Az adott mérési körülmények között a n-pentilbenzol elméleti tányérszáma N= 14745, az elméleti tányérmagassága H= 10,614 m; az n-etilbenzolé N = 13552 és H= 11,069 µm. A HL összefüggés alapján hosszmértékegységben a csúcsok szélessége ~0,13 cm. Tehát a csúcsok tényleges szélesedés között nincs különbség.
9.8 ábra Human inzulin kromatogramok tömörmagvú állófázison Oszlop: Halo C18 Eluens: 21% acetonitril/79% víz 0,1% trifluor-ecetsavval; Áramlási sebesség: 1,3 illetve 0,1 cm3/perc; Hőmérséklet: 20 °C; Minta 1 µl inzulin-oldat; Detektálás: 205 nm
A 9.8 ábrán tömörmagvú tölteten a humán inzulin injektálása során kapott
kromatogramok
láthatók,
a
detektorjelet
66
a
retenciós
térfogat
függvényében ábrázoltuk. A mozgófázis áramlási sebessége 0,1 cm3/perc, illetve 1,3 cm3/perc volt. Az áramlási sebesség növelésével a csúcsszélesedés szignifikáns, a retenciós tényező nő az áramlási sebesség, ill. a nyomás függvényében (9.9 és 9.10 ábra).
9.9 ábra A humán inzulin retenciós tényezőjének változása a mozgófázis sebességének függvényében
Kis molekulák esetében a korrigált retenciós térfogat és a holttérfogat aránya,
vagyis
a
retenciós
tényező
állandó,
mert
az
áramlási
sebességnek/nyomásnak, nincs hatása a kis molekulák retenciójára. Fehérjék és
más
nagy
molekulák
esetében
viszont
megfigyelték,
hogy
a
nyomás/áramlási sebesség erősen befolyásolja a retenciót [67, 138-142]. A retenciós térfogatbeli különbséget az emelkedő áramlási sebesség mellett (9.9 ábra) a fokozódó nyomásváltozás okozza (9.10).
67
9.10 ábra
A humán inzulin retenciós tényezőjének változása az átlagnyomás függvényében
Esetünkben a tömörmagvú állófázison 0,02 cm3/perc áramlási sebesség mellett az inzulin retenciós tényezője k’ = 4,85, a magasabb, 1,3 cm3/perc áramlási sebesség mellett pedig k’ = 10,31 (9.9 ábra) [143]. Eredményeink az irodalomban leírtakkal jó egyezést mutatnak [67, 139]. A 9.10 ábrán is jól látható; az inzulin retenciós tényezője mindkét oszlop esetében az oszlopon uralkodó átlagnyomással együtt növekszik. A retenciós paraméterek és a termodinamikai mennyiségek közötti összefüggés a következőképpen írható le:
G RT ln K RT ln Fk ' H TS E pV TS
9.4.1
ahol G, H, E és S a rendszer szabadentalpia-, entalpia-, belsőenergia- és entrópiaváltozása; R az egyetemes gázállandó, T abszolút hőmérséklet, K adszorpciós egyensúlyi állandó, F fázisarány, k’ retenciós tényező, p a nyomás, és Vm az álló- és mozgófázisbeli parciális moláris térfogatok különbsége.
68
A 9.4.1 egyenletből
ln k '
E RT
p
Vm RT
S R
ln F
9.4.2
lnk’ nyomás szerinti első deriváltja állandó hőmérsékleten, ha az álló- és a mozgófázisbeli térfogatváltozás − a nyomásváltozástól függetlenül − állandó marad: ln k ' Vm p R
9.4.3
Magas nyomáson az inzulin és az állófázis közötti kölcsönhatások sokkal változatosabbak, mint alacsony nyomáson. Továbbá a kölcsönhatások energiája csökken, ha az oszlopon kialakuló átlagnyomás nő. A nyomás hatására
bekövetkező
változás
az
inzulin
és
az
állófázis
közötti
kölcsönhatásban a fehérje konformációváltozásának köszönhető [144]. A fehérjemolekulák adszorpció során bekövetkező konformációváltozás (-hélix → -lemez) közben polipeptid-láncokat tartalmazó fibrillumokká alakulnak át [145], amely eredményeként a molekula hidrofób magja a felszínre kerül [146, 147]. Mivel az inzulin parciális moláris térfogata kisebb az állófázison adszorbeálódva, mint a mozgófázisban oldva, az inzulin retenciós paraméterei függenek az áramlási sebességtől. Ezért jelentősebb az inzulin adszorpciója magasabb nyomáson, mint alacsonyabb nyomáson.
69
9.4.1. Makroszkopikus modellek
Az általános sebességi modell alkalmazása esetén a kromatográfiás csúcsok
momentumait
a
mozgófázis
és
az
oszlopon
kívüli
térfogat
hozzájárulásával, µm-mel és µsys-szel korrigáltuk, majd az 5.1.1 egyenlet alapján meghatároztuk a kromatográfiás csúcsok tányérmagasságát. Mivel a modell igen
részletes,
az
anyagátadási
együtthatók
egymástól
függetlenül
megadhatók. A van Deemter-egyenlet alapvetően tapasztalati összefüggés. A B és C együtthatók értékeit egy méréssorozat HETP-értékből állapítottuk meg, ezért fizikai mennyiségi jelentésük van, így alkalmasak anyagátadási együtthatók meghatározására. Ha ezen összefüggés alapján szándékozzuk megadni az anyagátadási együtthatókat, akkor a tányérmagasság kiszámolásához a komponensek csúcsainak momentumait csak a rendszer oszlopon kívüli térfogatával (µsys) kell korrigálni. A tányérmagasságot szintén az 5.1.1 egyenlet alapján számoltuk ki.
9.11 ábra Az n-pentilbenzollal, 30 °C-on kimért tányérmagasság (H, m) a mozgófázis sebességének függvényében (uh, cm/s) A szimbólumok kísérleti eredményekből számolt pontok, a vonalak a pontokra illesztett 5.2.4 egyenlet.
70
A 9.11 ábrán a 20 °C-on elvégzett méréssorozatból a n-pentilbenzolcsúcs adataiból kiszámolt H (5.1.1 egyenlet) értékek láthatók, a mozgófázis felületi sebességének függvényében. Mivel az általános sebesség modell tányérmagasság-egyenlete nem tartalmazza az A együtthatót, az anyagátadási együtthatók meghatározásához a kromatográfiás folyamatokban szereplő fizikai-kémiai jelenségekről a B/uh és a Cuh tagból nyerhető információ, ezért a pontokra az 5.2.4 tányérmagasság-egyenletet illesztettük. Ezt az ábrázolást mindhárom hőmérsékleten elvégzett méréssorozattal, az alkilbenzol-keverék összes komponensére elkészítettük (III. függelék). A 9.12 ábrán az inzulin tányérmagassága látható a mozgófázis sebességének
függvényében
porózus
és
tömörmagvú
állófázison.
A
tányérmagasság kiszámítását és a görbeillesztését a fentiekben ismertetett módon
végeztük.
függvényében
A
tányérmagasság
pontosabb
ábrázolása
összehasonlítást
tesz
a
lineáris lehetővé,
sebesség mint
a
tányérmagasság-egyenlet hagyományos ábrázolása, mivel kiküszöböli az állófázisok eltérő térkitöltéséből adódó különbségeket [1]. Alacsony áramlási sebességen a mért pontok szórása az illesztett görbétől egyrészt mérési hibából adódik, másrészt az illesztett tányérmagasság-egyenlet (5.2.4 egyenlet) nem
veszi
figyelembe
az
örvénydiffúzió
hozzájárulását
szélesedéséhez. Tapasztalatunk egybeesik irodalmi adatokkal [58].
71
a
csúcsok
9.12 ábra A humán inzulin tányérmagassága a mozgófázis sebességének függvényében 1. A szimbólumok kísérleti eredményekből számolt pontok, a vonalak a pontokra illesztett 5.2.4 tányérmagasság egyenlet.
9.13 ábra
A humán inzulin tányérmagassága a mozgófázis sebességének függvényében 2. [143]
72
A 9.3.1 egyenletet alkalmazva és figyelembe véve, hogy az axiális diszperziót a molekuláris diffúzió és az örvénydiffúzió együttesen határozza meg (5.1.12 egyenlet), és az áramlási sebesség, illetve a nyomás erősen befolyásolja a retenciót (9.9 és 9.10 ábra) a 9.13 ábra pontosabb illesztést mutat. Várhatóan a tömörmagvú állófázis esetében a tányérmagasság-értékek alacsonyabbak. Az 5.2.4 tányérmagasság-egyenlet illesztése során kapott B és C együtthatókat a 9.4 táblázatban soroltuk fel, melyek jó egyezést mutatnak a tömörmagvú állófázis esetében nyert irodalmi adatokkal [58]. Gritti [56] és Fekete [55, 148] nagyobb C együtthatót ír le különböző típusú tömörmagvú állófázisok esetén, mint teljesen porózuson, mivel a szemcsék durva felszínét vastag stagnáló folyadékréteg borítja, amely lassítja a szemcsékben az anyagátadást. Méréseink szerint azonban nem különbözik jelentősen a két állófázison a C együttható értéke.
9.4 táblázat Az inzulin-csúcsok B és C együtthatói az 5.2.4 tányérmagasság-egyenletből különböző állófázisokon B (cm2/s)
C (s)
porózus szemcse
5,93·10-6
3,11·10-3
tömörmagvú szemcse
1,01·10-6
3,16·10-3
Az 5.2.3 egyenlet szerint a C együttható függ - a
k1 tényezőn keresztül - a k1 1
retenciótól. Az inzulin retenciós tényezője mérési körülményeink között a tömörmagvú állófázison közel kétszer akkora, mint a teljesen porózus állófázison (9.10 ábra), ezért nem értünk el nagyobb C együtthatót, vagyis kisebb a tányérmagasságot a tömörmagvú állófázison, mint a teljesen porózuson.
73
A momentumanalízis elvégzéséhez is széles mozgófázis áramlási sebesség tartományban van szükség kísérleti eredményekre. A módszer alkalmazásakor
a
hagyományos
HETP
érték
helyett
a
H MA H / 2u h összefüggést használtuk, ahol H-t szintén az 5.1.1 egyenlettel számoltuk ki.
9.14 ábra Momentumanalízis 1. A 30 °C-on végzett méréssorozat n-pentilbenzol-csúcsok adataiból meghatározott HMA (s) 1/ u h2 függvényében
A 9.14 ábra a n-pentilbenzol-csúcsok paramétereiből meghatározott HMAértékeit mutatja az 1/ u h2 függvényében 30°C-on, a 9.15 ábrán az inzulincsúcsok HMA-értékeinek hasonló bemutatása látható. Az 5.3.8 egyenlet alapján a pontokra illesztett egyenes meredeksége DL, az axiális diszperzió (9.5 és 9.6 táblázat), H0 a metszéspontja. Ezt az ábrázolást is elkészítettük a standard keverék
összes
komponensére
mindhárom
méréssorozat alapján (V. függelék).
74
hőmérsékleten
elvégzett
Jól látható, hogy magas áramlási sebességen (kicsi 1/ u h2 értékeknél) a pontok szórása jelentős, mivel a kísérleti hibák az egyenes illesztését a linearizált
adatokhoz
eltérő
módon
befolyásolják.
Ezért
a
módszerrel
megállapított anyagátadási együtthatók pontossága bizonytalan és várhatóan eltér a tányérmagasság-egyenlettel maghatározott értékektől.
9.15 ábra Momentumanalízis 2. Inzulin-csúcsokból meghatározott HMA-értékek az 1/uh2 függvényében
Mivel momentumanalízis tányérmagasság-egyenlete (5.3.8 egyenlet) az 5.2.4 egyenlet módosított van Deemter-egyenlet linearizált alakja, mely nem veszi figyelembe a molekulák retenciójának változását, ezért nem alkalmas a modell az inzulin anyagátadási együtthatóinak meghatározására.
75
9.4.1.1.
Axiális diszperziós együttható
A 9.5 táblázat foglalja össze az alkilbenzolok és a tiokarbamid axiális diszperziójának értékeit (DL, cm2/s), három különböző hőmérsékleten, a fentiekben leírt modellek alapján meghatározva. Az általános sebességi modell esetében az empirikus Gunnösszefüggés (5.1.13 egyenlet) [106] alapján határozható meg az axiális diszperziós együttható, mely számos kísérleti körülményt vesz figyelembe. Az 5.1.19 egyenlet a Gunn-összefüggés egyszerűsített formája, mely általánosan használt kromatográfiás paramétereket és a molekuláris diffúziós együtthatót tartalmazza. Az alkilbenzolok molekuláris diffúzióját a Scheibel-egyenlettel (5.1.21 egyenlet), az inzulinét a Young-összefüggés (5.1.23 egyenlet) alapján határoztuk meg. A van Deemter-egyenletben a B/u tag szolgáltat információt az axiális diszperzióról. A B együttható arányos a DL-lel, amelyet az 5.2.2 egyenlet alapján számoltuk ki. Az alkilbenzolok B együtthatói a IV. függelékben találhatók. Momentumanalízist
alkalmazva,
ha
H MA ( ' 2 L ) /(212uh ) -t
1/ u h2
függvényében ábrázoljuk, lineáris összefüggést kapunk (9.14 ábra). Az egyenes meredeksége az axiális diszperziónak felel meg (5.3.8 egyenlet). Mivel a Gunn-egyenlet tapasztalati összefüggés, minden kísérleti körülményre megadható az axiális diszperziós együttható (9.16 és 9.17 ábra). Az alkilbenzolok és a tiokarbamid axiális diszperziója 0,1–2,5 cm3/perc áramlási sebességű tartományban 10-6–10-4 cm2/s tartományba esik (9.5 táblázat). Az inzulin 0,02–1,3 cm3/perc áramlási sebesség tartományban a porózus szemcsék között 1,00·10-6–4,95·10-4 cm2/s, a tömörmagvú szemcsék között 9,51·10-7–7,91·10-5 cm2/s (9.6 táblázat). A van Deemter-egyenletből származtatott 5.2.4 tányérmagasságegyenlet illesztéséhez és a momentumanalízishez adott mozgófázis áramlási sebesség tartomány szükséges. Ezen modellek alapján egy általános értéket kapunk, mely a mérési tartományban az n-pentilbenzolnál 10-5 cm2/s nagyságrendű, beleesik a Gunn szerinti meghatározás intervallumába.
76
Az n-pentilbenzol axiális diszperziója (DL, cm2/s) a mozgófázis sebességének(uh, cm/s) függvényében 30°C-on Gunn-egyenlettel (GE), az 5.2.4 tányérmagasság-egyenlettel (PH) és momentumanalízissel (MA) számolva
9.16 ábra
9.17 ábra A humán inzulin axiális diszperziós együtthatója a mozgófázis sebességének függvényében Gunn-egyenlettel meghatározva
77
A momentumanalízisben is a mozgófázis áramlási sebességétől függetlenül az axiális diszperziós együtthatóra egyetlen értéket kaptunk (4.1 ábra).
Az
alkalmazott
ábrázolás
(HMA
tányérmagasság-egyenlet
linearizált
formája,
az
1/ uh2 függvényében) ezért
az
5.3.8
egy
egyenlet
illeszkedése a mérési pontokra nagy uh értéknél nem tökéletes (9.14 ábra). Ebből
adódik
az
eltérés
a
tányérmagasság-egyenlet
alapján
és
a
momentumanalízissel meghatározott DL értékek között. Az n-pentilbenzol axiális diszperziós együtthatója 10-6 cm2/s nagyságrendű.
78
9.5 táblázat Az alkilbenzolok és a tiokarbamid axiális diszperziós együtthatója (DL, cm2/s) a Gunn-egyenlet, az 5.2.4 tányérmagasság-egyenlet és a momentumanalízis módszerével meghatározva 20°C DL
DL
DL
DL
DL
DL
DL
(tányérmagasság-
(MA,
(Gunn-egyenlet,
(tányérmagasság-
(MA,
(Gunn-egyenlet,
2
2
2
2
2
cm /s) -7
1,36·10 –3,41·10 2,90·10 –3,39·10 2,91·10 –3,50·10 6,40·10 –3,57·10 3,02·10 –3,55·10 2,77·10 –3,28·10 4
cm /s)
cm /s)
egyenlet, cm /s)
2
cm /s)
4,45·10
-5
4,58·10
-5
2,98·10 –3,63·10
-6
-4
3,67·10
-5
3,52·10
-5
3,19·10 –3,52·10
3,58·10
-5
3,55·10
-5
3,03·10 –3,63·10
2,94·10
-5
2,81·10
-5
3,10·10 –3,59·10
2,59·10
-5
2,41·10
-5
6,64·10 –3,38·10
2,52·10
-5
2,34·10
-5
3,36·10 –3,38·10
8,77·10
-6
7,18·10
-5
3,47·10 –2,96·10
-6
-4
3,98·10
-5
3,84·10
-5
-6
-4
3,35·10
-5
3,19·10
-5
3,28·10 –3,46·10
-6
-4
3,78·10
-5
3,54·10
-5
-6
-4
3,13·10
-5
2,97·10
-5
3,41·10 –3,34·10
-6
-4
3,51·10
-5
3,38·10
-5
-6
-4
2,90·10
-5
2,73·10
-5
6,37·10 –3,20·10
-6
-4
3,24·10
-5
3,09·10
-5
-6
-4
2,87·10
-5
2,71·10
-5
3,82·10 –3,01·10
-6
-4
3,20·10
-5
3,04·10
-5
-6
-4
8,90·10
-5
8,07·10
-5
4,31·10 –2,51·10
-6
-4
1,12·10
-5
1,06·10
-5
-
4 -6
tiokarbamid
egyenlet, cm /s)
(MA,
-
4 -6
toluol
cm /s)
2
-
4 -6
etilbenzol
cm /s)
DL
-
4 -6
n-propilbenzol
egyenlet, cm /s)
2
DL (tányérmagasság-
-
4 -6
n-butilbenzol
40°C
(Gunn-egyenlet, 2
n-pentilbenzol
30°C
-
Megfigyelhető, hogy az alkilbenzolok esetében a momentumanalízissel meghatározott DL kisebb, mint a tányérmagasság egyenlet alapján számított érték. Míg az inzulin esetében az ellenkezőjét tapasztaljuk. Eredményeink alapján az axiális diszperzió az alkilbenzolok esetében retenció
függvényében
nő,
de
egyértelmű
hőmérsékleti
függés
nem
tapasztalható. A teljesen porózus és a tömörmagvú szemcsék között kialakuló axiális diszperzió szignifikánsan nem különbözik, mivel a DL nem függ a szemcsék belső szerkezetétől. A minimális különbség a porózus szemcséjű állófázis javára a nagyobb szemcseméretből adódhat. Az elméleti tányérmagasság egyenlet és a momentumanalízis jó egyezést
mutat
a
tapasztalati
Gunn-összefüggéssel,
mivel
mindhárom
módszerrel hasonló nagyságrendű axiális diszperzió számolható.
9.6 táblázat A humán inzulin axiális diszperziós együtthatói (DL, cm2/s) teljesen porózus és tömörmagvú állófázison a Gunn-egyenlet, alapján meghatározva 2
DL (cm /s)
porózus szemcse
Gunn-egyenlet
1,00·10 –4,95·10
-6
-4
tömörmagvú szemcse
-7
9,51·10 –7,91·10
-5
9.4.1.2.
Külső anyagátadási állandó
A külső anyagátadási állandó meghatározására általánosan alkalmazott összefüggés a Wilson-Geankoplis-korreláció, 5.1.26 egyenlet [124]. Az alkilbenzolok és az inzulin külső anyagátadási állandóját mindkét állófázison a 9.3. alfejezetben ismertetett módon számoltuk ki.
9.18 ábra Az n-pentilbenzol külső anyagátadási állandója a mozgófázis sebességének függvényében
Az eredmények az alkilbenzoloknál 10-2–10-1 cm/s tartományba estek. Az inzulin esetében kext értéke a teljesen porózus szemcséken 1,1·10-2–6,8·10-2 cm/s, a tömörmagvú szemcséken 1,1·10-2–4,6·10-2 cm/s. Eredményeink megfelelnek az irodalomban talált nagyságrendnek [89]. Megfigyelhető, hogy az értékek, a vártnak megfelelően, erősen függenek a mozgófázis sebességétől és a hőmérséklettől (9.18 ábra). Nagy áramlási sebességnél csökken a szemcséket borító folyadékfilm vastagsága, amely a kext-et növeli.
81
A teljesen porózus és a tömörmagvú állófázison kialakuló külső anyagátadás sebességi állandóinak értéke nagyon hasonló: 0,004—0,300 cm/s áramlási sebesség tartományban 0,011—0,048 cm/s. Mivel sem az axiális diszperzió és sem a külső anyagátadási gátlás tekintetében nem jelentős az eltérés a teljesen porózus és a tömörmagvú szemcsék között, de a csúcsok szélesedése mégis jelentősen különbözik a két oszlopon, várhatóan a pórusbeli diffúzió értékében tapasztalhatunk majd eltérést.
82
9.4.1.3.
Pórusbeli diffúziós együttható
Az állófázis pórusaiban a mozgófázis nem áramlik, a mintamolekulák különböző irányú diffúzióval – a pórusrendszeren áthaladó és az állófázis irányába mutató diffúzió –, jutnak keresztül az állófázis kanyarulatos pórusrendszerén. Ezen diffúziók értékei összegződnek a pórusbeli diffúziós együtthatóban. A 9.7 táblázat tartalmazza az alkilbenzolok és a tiokarbamid pórusbeli diffúziós együtthatóját (Dp, cm2/s) három különböző hőmérsékleten, a 9.8 táblázat az inzulinét a kétfajta oszlopban, melyeket a fent említett módszerekkel határoztuk meg. Az általános sebességi modell szerint a pórusbeli diffúzió is a sávszélesedés egyik tényezője (5.1.7, illetve 9.3.1 egyenlet). A DL és a kext ismeretében megadható a tányérmagassághoz való hozzájárulásuk (5.1.9 és 5.1.10 egyenletek). Ezek után a 5.1.8 egyenletből kiszámoltuk a pórusbeli diffúzió
hozzájárulását
a
tányérmagassághoz
és
a 5.1.11
egyenlettel
meghatároztuk az állandó értékét minden kísérleti körülményre (9.19 ábra és 9.20 ábra). A van Deemter-egyenletből származtatott tányérmagasság-egyenletben a C tag együtt írja le a külső anyagátadási gátlást és a pórusbeli diffúziót. Az együttható értékei a IV. függelékben találhatók. A Dp értékeit az 5.2.3 egyenlettel számoltuk ki minden mérési körülményre. A 9.14 ábra az alkilbenzolok momentumanalízise alapján készült, H MA ( ' 2 L ) /(212uh ) értékét ábrázoltuk 1/ u h2 függvényében 0,5–2,5 cm3/perc áramlási sebesség tartományban. Az összefüggés lineáris, az 5.3.8 egyenlet alapján H0 az egyenesek metszéspontja. 0 és f értékét az 5.3.4 és 5.3.5 egyenletek alapján adtuk meg. A 5.3.9 egyenletet átrendezve (9.4.4)
d H0 02 f alakra kiszámoltuk d értékét, majd az 5.3.6 egyenletet
Dp
rp2 15 d
1 e p pK 2
(9.4.5)
83
formára hozva megkaptunk a pórusbeli diffúzió értékét (9.7 táblázat). A pórusbeli diffúzió az általános sebességi modell alapján számolva minden kromatográfiás körülményre kiszámolható. A van Deemter-egyenletből származtatott 5.2.4 tányérmagasság-egyenlet szerinti számítások során, valamint momentumanalízissel úgy adható meg minden mérési körülményre Dp érték, ha az egész mérési tartományra vonatkozó axiális diszperziós együtthatót használjuk fel a számításokhoz. A pórusbeli diffúziós együttható az általános sebességi modell alapján az alkilbenzoloknál 10-7–10-5 cm2/s tartományba esik, a tányérmagasság-egyenlet és a momentumanalízis alapján egy nagyságrendre szűkül az intervallum, 10-6 cm2/s.
9.19 ábra Az n-pentilbenzol pórusbeli diffúziója (Dp, cm2/s) a mozgófázis sebességének (uh, cm/s) függvényében 30°C-on Az általános sebesség modell alapján (GR), az 5.2.4 tányérmagasság-egyenlet (PH-egyenlet) szerint és momentumanalízissel (MA) számolva
84
A
tiokarbamid
esetében
kisebb
értékeket
kaptunk,
10-8–10-6
cm2/s
nagyságrendben, mint az alkilbenzoloknál, ez azzal magyarázható, hogy ennek a vegyületnek nincs retenciója a fordított fázisú állófázison. Általános elképzelés, hogy az oszloptöltetben a szemcsék zárt egységet alkotnak, melyek pórusaiban elvileg nem áramlik a mozgófázis, ezért azt várjuk, hogy a Dp független a mozgófázis áramlási sebességétől. Az 5.2.4 tányérmagasság-egyenlet alapján és a momentumanalízissel meghatározott Dp értékek változása az áramlási sebesség függvényében nem jelentős. Momentum-analízis során linearizált tányérmagasság-egyenletet illesztünk a mérési pontokra, ezért várható, hogy hasonló Dp értékeket kapjunk, mint az 5.2.4 tányérmagasság egyenlet illesztése alapján számoltak. A két modell eredményei azonban eltérnek egymástól, amely a momentumanalízis 5.3.8 egyenletének
rossz
illeszkedéséből
adódik
(9.14
ábra),
az
egyenes
modell
alapján
metszéspontjához közel eső adatoknak nagy a szórása. Megfigyelhető
hogy
az
általános
sebességi
meghatározott diffúziós együttható a mozgófázis áramlási sebességének függvényében nő (9.19 ábra). Ennek tekintetében elképzelhető, hogy a fordított fázisú töltet szemcséiben a pórusok felszínéhez nagyon közel kialakul egy lassú mozgófázis-áramlás, ami áramlási sebességtől függő effektív diffúziót eredményez.
85
9.7 táblázat Az alkilbenzolok és a tiokarbamid pórusbeli diffúziós együtthatói (Dp, cm2/s) három különböző hőmérsékleten az általános sebességi (GR) modell, az 5.2.4 tányérmagasság-egyenlet és a momentumanalízis (MA) alapján meghatározva 20°C
30°C
Dp
Dp
Dp
Dp
Dp
Dp
Dp
Dp
Dp
(GR modell,
(tányérmagasság-
(MA,
(GR modell,
(tányérmagasság-
(MA,
(GR modell,
(tányérmagasság-
(MA,
2
egyenlet, cm /s)
2
cm /s)
2
egyenlet, cm /s)
2
cm /s)
2
egyenlet, cm /s)
cm /s)
2
cm /s)
-7
n-pentilbenzol
1,37·10 – 2,74·10
-5
-6
-6
2,01·10 –4,65·10
-6
1,68·10 – 2,58·10
-5
1,98·10 – 2,02·10
-5
-6
4,31·10 – 1,72·10
-5
1,83·10 – 1,35·10
-6
-6
2,83·10 – 1,41·10
-6
1,26·10 – 1,87·10
-6
-6
-6
1,27·10 –1,62·10
-6
1,05·10 – 1,27·10
-6
-7
-6
1,12·10 –1,51·10
-6
9,18·10 – 1,17·10
-8
tiokarbamid
-6
-6
-6
1,46·10 –2,35·10
-7
toluol
1,72·10 – 3,20·10
-7
etilbenzol
-6
-6
-6
1,74·10 –3,28·10
-7
n-propilbenzol
2,54·10 – 8,98·10
-7
n-butilbenzoll
40°C
-6
-7
-7
2,38·10 –2,61·10
-7
1,80·10 – 1,93·10
-7
2
cm /s)
-7
1,84·10 – 7,41·10
-5
-6
1,93·10 –3,60·10
-6
4,08·10
-5
2,62·10 3,70·10
-5
-6
3,97·10
-6
1,38·10
1,47·10
-6
-6
-6
1,35·10 –1,68·10
-6
1,10·10 – 1,32·10
-6
-7
-6
1,20·10 –1,57·10
-6
9,84·10 – 1,23·10
-7
2,73·10 –
1,26·10 – 1,75·10
-7
-5
-6
-6
-6
1,52·10 –2,30·10
-6
1,58·10 –
1,43·10 – 2,15·10
-7– -5
-6
-6
-6
1,74·10 –2,92·10
-7
1,87·10 –
-6–
2,55·10
-7
1,91·10 –
1,58·10
-6
-7
-7
2,70·10 –2,94·10
-7
2,27·10 – 2,44·10
-7
2
2
cm /s)
-7
1,63·10 – 2,43·10
-5
-6
-6
1,63·10 –2,49·10
-6
1,98·10
-7
1,64·10 – 2,11·10
-5
1,65·10
-5
-6
1,30·10
-5
9,91·10
-6
-6
1,38·10
-6
1,18·10 – 1,54·10
-6
-6
-6
1,22·10 –1,46·10
-6
1,02·10 – 1,19·10
-6
-7
-6
1,09·10 –1,37·10
-6
9,08·10 – 1,09·10
-7
2,28·10 –
-6
-6
-6
1,35·10 –1,85·10
-7
1,36·10 –
1,29·10 – 1,76·10
-7
3,10·10 –
-6
-6
-6
1,51·10 –2,19·10
-7
1,58·10 –
1,39·10 –
-6
-7
-7
2,78·10 –2,99·10
-7
2,40·10 – 2,56·10
-7
Az inzulin pórusbeli diffúziós együtthatóinak általános sebességi modell alapján meghatározott numerikus értékei a 9.8 táblázatban láthatók. A diffúziós együttható a mozgófázis áramlási sebességének függvényében nő (9.20 ábra). Az a tény, hogy áramlási sebességtől függő pórusbeli diffúziós együtthatókat találtunk – a számításokban az áramlási sebességtől függő axiális diszperziót használtunk – azzal a függ össze, hogy a retenciós tényező arányos az áramlási sebességgel. A retenciós faktor növekedésével a pórusfelszíni diffúzió válik meghatározóvá, amely nagyobb pórusbeli diffúziót eredményez. Ez az eredményünk jó egyezést mutat az irodalomban találtakkal [149, 150]. 9.8 táblázat A humán inzulin pórusbeli diffúziós együtthatói (Dp, cm2/s) porózus és tömörmagvú állófázison az általános sebességi (GR) modell alapján meghatározva 2
Dp (cm /s)
porózus szemcse
GR modell
1,61·10 –2,42·10
-9
-8
tömörmagvú szemcse
-10
7,41·10 –1,00·10
-8
9.20 ábra A humán inzulin pórusbeli diffúziós együtthatói a mozgófázis sebességének függvényében az általános sebesség modell szerint
A pórusbeli diffúziós együtthatók azonos nagyságrendűek a tömörmagvú és a teljesen porózus állófázisra, ez összhangban áll azzal, hogy a két állófázis pórusátmérője közel azonos (90 Å). A tömörmagvú szemcsék esetében a szemcsék térfogatának egynegyede nem porózus, ezért az oszlop belső térkitöltési tényezője lényegesen kisebb (p = 0,1638), mint a porózus szemcsésé. Emiatt tapasztalhatunk a tömörmagvú szemcséjű állófázis esetében valamivel kisebb pórusbeli diffúziót.
88
9.4.2. A sztochasztikus modell
Amikor
a
sztochasztikus
modellt
fordított fázisú
kromatográfiára
alkalmazzuk, az időállandók az anyagátadási folyamatokat jellemzik, nem az adszorpciót. Porózus állófázis esetén a s átlagos tartózkodási időnek is megváltozik a jelentéstartalma, magába foglalja a külső anyagátadási gátlást, a pórusbeli diffúziót és az adszorpció-deszorpció kinetikáját. A sztochasztikus modell nagyon egyszerű módot nyújt az elválasztás részleteinek
kiértékeléséhez,
illetve
az
anyagátadás
kinetikájának
vizsgálatához. Az anyagátadási együtthatók meghatározásához csak a kromatográfiás csúcs első és második momentumát kell ismernünk. A számítások első lépése a mozgófázis diszperziójának és az oszlopon kívüli szélesedés csúcsokra történő hatásának meghatározása egy retenció nélküli komponens csúcsainak momentumaival. Az alkilbenzolok momentumait
m-mel, azaz az azonos körülmények között felvett tiokarbamid-csúcs momentumaival korrigáltam. Egy retenció nélküli komponens csúcsalakja és momentumai magukban hordozzák az oszlopon kívüli szélesedést és a mozgófázis hatását, azaz felhasználhatók korrekcióra és az állófázis hatásának meghatározására:
µ1=µ1µ10 és µ’2=µ’2µ’20, ahol µ10 és µ’20 a tiokarbamid első momentuma illetve második centrális momentuma. Kétféle forrásból származó adatkészletet alkalmaztunk az anyagátadási együtthatók meghatározására, kétféle módon határoztuk meg a csúcsok momentumait: (i) exportáltuk a Chemstation program által kiszámolt adatokat, illetve (ii) exponenciálisan módosított Gauss-függvényt illesztettünk a csúcsokra (7.5.4 egyenlet). A Chemstation program a csúcs momentumait numerikus integrálással határozza meg, amelyhez az 7.5.2 és az 7.5.3 egyenlet diszkrét formáját alkalmazza. A 9.9 és a 9.10 táblázat egy példán keresztül mutatja be az n a s és m értékének kiszámítását. Az anyagátadási lépések átlagos száma (n) a tiokarbamid-csúcs
momentumaival
korrigált
első
és
második
centrális
momentumokból az 5.4.4 és az 5.4.5 egyenletekkel a következő módon számolható:
89
21 2t ' R n 2 ' 2 s 2
2
9.4.6
A s és a m is hasonlóan egyszerű módon számolható:
s
m
1 t ' R n n
10 n
9.4.7
t0 n
9.4.8
A Chemstation program numerikus integrálása és az EMG-modell illesztése némileg eltérő momentumokat eredményezett ugyanazon csúcsokra, ezért például a momentumok meghatározásától függően az etilbenzol anyagátadási lépéseinek átlagos száma n = 16610 és n = 15363; az npentilbenzolé n = 27465 és n = 20663. Az eltérések oka a második centrális momentum meghatározásának bizonytalansága (8.1 ábra) [151]. 9.9 táblázat Sztochasztikus modell alapján számolt n, s és m értékek; a 10 °C-on és 0,25 cm3/perc áramlási sebességgel kifejlesztett kromatogram csúcsainak momentumait Chemstation szoftverrel határoztuk meg. tiokarbamid
toluol
etilbenzol
n-propilbenzol
n-butilbenzol
n-pentilbenzol
1 (s)
362,22
1004,64
1291,26
1823,22
2653,62
4014,66
2 (s)
19,71
77,45
123,63
244,85
519,39
991,14
1 (s)
642,42
929,04
1461,00
2291,40
3652,44
'2 (s)
57,75
103,93
225,14
499,69
971,43
n
14293
16610
18962
21015
27465
s (ms)
44,9
55,9
77,1
109,0
133,0
m (ms)
25,3
21,8
19,1
17,2
13,2
90
9.10 táblázat Sztochasztikus modell alapján számolt n, s és m értékek; a 10 °C-on és 0,25 cm3/perc áramlási sebességgel kifejlesztett kromatogram csúcsainak momentumait EMGfüggvény illesztésével határoztuk meg. tiokarbamid
toluol
etilbenzol
n-propilbenzol
n-butilbenzol
n-pentilbenzol
1 (s)
362,33
1005,35
1291,42
1823,23
2653,26
4011,18
2 (s)
22,39
96,07
134,76
267,98
569,32
1311,05
1 (s)
643,02
929,09
1460,90
2290,93
3648,85
'2 (s)
73,68
112,37
245,59
546,93
1288,66
n
11224
15363
17380
19192
20663
s (ms)
57,3
60,5
84,1
119,4
176,6
m (ms)
32,3
23,6
20,8
18,9
17,5
A 9.4.7 és a 9.4.8 egyenlettel kiszámolhatjuk egy anyagátadási lépés álló-, illetve mozgófázishoz kötődő tartózkodási idejét (s és m). Az alkilbenzolok állófázishoz kötődő tartózkodási idője s = 57–177 ms, illetve a mozgófázishoz tartozó tartózkodási idő m = 17–33 ms az adott hőmérsékleten és áramlási sebességen (9.21 ábra). Az állófázishoz kötődő tartózkodási idő nő a retenció erősségének függvényében; egy deszorpciós lépés után a mozgófázisban eltöltött idő a molekula soron következő adszorpciójáig csökken. A 9.21 ábráról leolvasható, hogy a s csökken a hőmérséklet emelésével. Megfigyelhető továbbá, hogy mindkét időállandó csökken az áramlási sebesség növelésével. A tartózkodási idők változása a hőmérséklet és az áramlási sebesség függvényében is sokkal kifejezettebb az erősebb retenciójú komponensek (npentil-, n-butilbenzol) esetében. A toluol időállandóinak meghatározása bizonytalan, mivel retenciója kicsi, és ezért a csúcsának kiszélesedésében a mozgófázis diszperziójának nagyobb szerepe van, mint az állófázisnak.
91
9.21 ábra A folyadékkromatográfia sztochasztikus modellje alapján számolt anyagátadási időállandók különböző áramlási sebességen a hőmérséklet függvényében
A vártnak megfelelően a mozgófázisban eltöltött tartózkodási idő független
a
mintamolekulától.
Adott
kísérleti
körülmények
között
a
mintamolekulák mozgófázishoz kötődő tartózkodási ideje azonos, valamint kismértékben
függ
a
hőmérséklettől.
Másfelől
az
állófázishoz
kötődő
tartózkodási idő erősen függ a hőmérséklettől és a mintamolekula retenciójától. Magasabb hőmérsékleten kisebb a retenció mivel s csökken. A 9.11 táblázat az 1,00 cm3/perces áramlási sebességű méréssorozatból meghatározott s, m és n értékeket tartalmazza. Az eredmények jó egyezést mutatnak az irodalomban található adatokkal [125]. Az átlagos adszorpciós lépések
száma
(n)
nő
a
retenció
függvényében,
a
kromatográfiás
kölcsönhatások erőssége, a mozgófázis áramlási sebessége és a hőmérséklet miatt. Az átlagos adszorpciós idő (s) a retenció növekedésével együtt nő.
9.11 táblázat A sztochasztikus modell alapján számolt s, m és n értékek az 1,00 cm3/perces áramlási sebességen végzett kísérletsorozatból 20°C
s (s)
n
30°C
m (s)
s (s)
n
40°C
m (s)
n
s (s)
m (s)
n-pentilbenzol 22829
3,77·10
-2
3,95·10
-3
22943
3,14·10
-2
3,90·10
-3
20331
2,95·10
-2
4,33·10
-3
n-butilbenzol
21635
2,56·10
-2
4,17·10
-3
21180
2,25·10
-2
4,22·10
-3
18769
2,16·10
-2
4,69·10
-3
n-propilbenzol 18530
1,92·10
-2
4,87·10
-3
18527
1,69·10
-2
4,83·10
-3
16613
1,64·10
-2
5,30·10
-3
etilbenzol
15938
1,44·10
-2
5,66·10
-3
16125
1,29·10
-2
5,55·10
-3
14605
1,26·10
-2
6,03·10
-3
toluol
13628
1,17·10
-2
6,62·10
-3
13854
1,06·10
-2
6,45·10
-3
12544
1,06·10
-2
7,02·10
-3
Az inzulin n, s és m értékeit porózus és tömörmagvú állófázison a 9.12 táblázatban
foglaltuk
össze.
Az
inzulinmolekulák
adszorpciós
ideje
a
tömörmagvú állófázison valamennyivel magasabb, mint a teljesen porózus állófázison. Az alacsony áramlási sebességeknél a számításokat néhány áramlási sebességfüggő szisztematikus hiba zavarja. Magasabb áramlási sebességen az inzulin átlagos adszorpciós ideje a tömörmagvú állófázison ~150 ms, a teljesen porózus állófázison kevesebb, ~100 ms.
9.12 táblázat Az inzulin n, s (ms), m (ms) értékei porózus és tömör magú állófázison, a sztochasztikus modell alapján számolva Áramlási
porózus szemcse
sebesség
tömörmagvú szemcse
n
s (ms)
m (ms)
n
s (ms)
m (ms)
0,02
12760
219,74
207,07
12083
1059,95
218,67
0,04
10694
179,32
65,22
12504
494,31
104,68
0,06
8286
138,73
55,84
11021
367,90
78,92
0,08
7010
120,20
49,53
9923
307,22
65,60
9143
271,33
56,79
6912
183,28
37,59
3
(cm /perc)
0,10
6053
110,45
45,78
0,20
3662
95,40
37,97
0,30
2752
88,29
34,05
6096
148,20
28,65
0,40
2275
86,24
31,26
4869
154,30
26,96
0,50
2227
76,15
25,44
4309
148,51
24,45
0,60
1726
88,17
27,22
4118
137,22
21,30
0,70
1423
98,74
28,44
3676
140,32
20,49
0,80
1404
95,05
25,35
3634
132,27
18,16
0,90
1243
103,03
25,49
3189
142,95
18,30
1,00
1168
104,99
24,53
2830
156,26
18,61
1,10
1218
98,02
21,48
2730
156,63
17,56
1,20
1093
108,23
22,01
2759
153,31
16,06
1,30
1103
105,31
20,19
2528
165,62
16,06
1,40
1025
112,99
20,13
Az inzulin retenciós tényezője kétszer magasabb, a tömörmagvú állófázison, mint a teljesen porózuson. Az állófázisban a tartózkodási idő egyenesen arányos a retenciós tényezővel, k' s / m . Ha a mozgófázis összetételét úgy változtatnánk, hogy a retenciós tényező megegyezzen a két oszlopon, a porózus héjú töltetben az átlagos tartózkodási idő a teljesen porózus fázisban eltöltött idő 3/4-része lenne [143].
94
9.5. A makroszkopikus és a mikroszkopikus modellek összehasonlítása
A különböző modellek alapján meghatározott anyagátadási együtthatók összehasonlíthatók. A szemcse felszínén kialakuló, külső anyagátadási együttható és a pórusbeli diffúziós együttható a mintamolekula útját írják le a mozgófázisból az állófázis felszínére. Ezek az anyagátadási gátlások összeadódva, együtt felelősek az állófázis okozta sávszélesedésért az általános sebességi modell, a van Deemter-egyenlet és a momentumanalízis szerint. A sztochasztikus modellben s fejezi ki az állófázis hatását a sávszélesedésre. A mikroszkopikus modell, az egyesített kinetikai modellhez hasonlóan, figyelmen kívül hagyja a szemcsén belüli pórusokat, melyekben a mozgófázis nem áramlik. Így p = 0 és a külső térkitöltési tényező azonos a teljes térkitöltési tényezővel, t-vel. Ennek megfelelve a 5.1.2 egyenlet a K alakra hozható, és a retenciós faktor k' aF formában írható fel, ahol F a fázisarány [84]. A makroszkopikus modellek és a mikroszkopikus modell együtthatói közötti viszony a következő módon írható le:
s
r r2 r2 k ' rp p a p p 3k F 3kext 15Dp ext 15Dp
9.5.1[152]
Az eredményeket a 9.22 és 9.23 ábra és a 9.13 táblázat tartalmazza. Az összehasonlított modellek mindegyikénél csökken a s az áramlási sebesség emelésével. A tányérmagasság-egyenlet szerint és a momentumanalízissel kapott időállandók közel azonosak. Ezek az eredmények kisebbek, mint a sztochasztikus modellel megállapított s, de nagyobbak, mint az általános sebesség modell szerinti értékek [108]. Ez a különbség visszavezethető a külső anyagátadási
gátlás
meghatározására
alkalmazott
Wilson-Geankoplis-
összefüggésre, illetve a modellekben alkalmazott egyszerűsítésekre.
95
9.22 Az n-pentilbenzol állófázishoz kötött anyagátadási időállandója 30°C-on (Az általános sebességi modell (GR), az 5.2.4 tányérmagasság-egyenlet alapján (PH), momentumanalízissel (MA) és a folyadékkromatográfia sztochasztikus modellje (SA) alapján meghatározva)
9.23 ábra A humán inzulin állófázishoz kötött anyagátadási időállandója teljesen porózus és tömörmagvú állófázison végzett mérések alapján (Az általános sebességi modell (GR) és a folyadékkromatográfia sztochasztikus modellje (SA) alapján meghatározva)
96
Megfigyelhető továbbá, hogy az általános sebességi modell és a sztochasztikus modell alapján megadott s hasonlóan változik a mozgófázis áramlási sebességének függvényében (9.22 és 9.23 ábra), mivel a sebességi modell szerint minden mérési pontra megadható a külső anyagátadási gátlás és a pórusbeli diffúzió mértéke. A tányérmagasság-egyenlet alapján és a mometumanalízissel meghatározott pórusbeli diffúziós együttható nem függ az áramlási sebességtől, ezért az ezekkel az anyagátadási együtthatókkal meghatározott s sem függ az áramlási sebességtől.
97
9.13 táblázat A makroszkopikus és a mikroszkopikus modellek alapján meghatározott állófázishoz kötött anyagátadási időállandók összehasonlítása 20°C
s
s
30°C
s
s
s
s
(tányér(GR, s)
magasság-
-3
3,98·10 – 6,35·10
-1
-3
n-butilbenzol
2,48·10 – 8,69·10
-2
-3
n-propilbenzol
1,63·10 – 4,79·10
-2
-3
etilbenzol
1,06·10 – 1,49·10
-2
-4
toluol
7,62·10 – 2,29·10
-2
-2
1,37·10 – 1,39·10
-2
-3
9,70·10 – 9,80·10
-3
-3
7,14·10 – 7,22·10
-3
-3
5,13·10 – 5,20·10
-3
-3
3,94·10 – 4,00·10
-3
s
s
s
s
(tányér(MA, s)
(SA, s)
(GR, s)
egyenlet, s) n-pentilbenzol
40°C
magasság-
(MA, s)
(SA, s)
(GR, s)
egyenlet, s) -2
1,15·10 – 1,16·10
-2
-3
9,81·10 – 9,91·10
-3
-3
8,07·10 – 8,16·10
-3
-3
6,07·10 – 6,16·10
-3
-3
4,69·10 – 4,77·10
-3
-2
2,32·10 – 1,10
-3
2,65·10 – 1,04·10
-2
1,64·10 – 6,17·10
-1
-2
1,23·10 – 3,64·10
-1
-3
9,73·10 – 2,46·10
-1
-3
7,34·10 – 2,04·10
-1
-1
-3
1,75·10 – 6,61·10
-2
-3
1,20·10 – 4,44·10
-2
-4
8,51·10 – 1,53·10
-2
-4
6,28·10 – 2,42·10
-2
-2
1,15·10 – 1,16·10
-2
-3
8,15·10 – 8,22·10
-3
-3
5,95·10 – 6,02·10
-3
-3
4,34·10 – 4,39·10
-3
-3
3,36·10 – 3,41·10
-3
s
s
(MA, s)
(SA, s)
(tányérmagasságegyenlet, s) -2
1,35·10 – 1,36·10
-2
-3
9,60·10 – 9,68·10
-3
-3
7,01·10 – 7,08·10
-3
-3
5,18·10 – 5,24·10
-3
-3
4,01·10 – 4,07·10
-3
-2
1,88·10 – 7,49·10
-1
-2
1,37·10 – 5,00·10
-1
-2
1,04·10 – 3,57·10
-1
-3
7,90·10 – 2,63·10
-1
-3
6,45·10 – 2,26·10
-1
-3
2,28·10 – 9,91·10
-2
-3
1,56·10 – 6,57·10
-2
-3
1,10·10 – 2,62·10
-2
-4
7,93·10 – 6,18·10
-2
-4
6,26·10 – 2,55·10
-2
-2
1,09·10 – 1,11·10
-2
-3
7,83·10 – 7,94·10
-3
-3
5,74·10 – 5,84·10
-3
-3
4,21·10 – 4,30·10
-3
-3
3,29·10 – 3,36·10
-3
-2
1,26·10 – 1,27·10
-2
-3
8,99·10 – 9,11·10
-3
-3
6,51·10 – 6,62·10
-3
-3
4,94·10 – 5,04·10
-3
-3
3,90·10 – 4,00·10
-3
-2
1,73·10 – 7,42·10
-1
-2
1,27·10 – 5,15·10
-1
-3
9,75·10 – 3,85·10
-1
-3
7,54·10 – 2,87·10
-1
-3
6,20·10 – 2,48·10
-1
10. Összefoglalás
Munkánk során teljesen porózus és porózus kéreggel bevont tömörmagvú
C18-as
borítású
fordított
fázisú
kromatográfiás
töltetek
összehasonlításával foglalkoztuk. Meghatároztuk kis- és nagymolekulatömegű modellvegyületek
anyagátadási
együtthatóit
és
összevetetettük
az
anyagátadási gátlást a különböző típusú tölteteken.
Első lépésként inverz méretkizárásos kromatográfiával meghatároztuk a munkánk során vizsgált oszlopok térkitöltési tényezőit, mivel az oszloptöltetek geometriája szerepet játszik az kromatográfiás elemzések során fellépő anyagátadási gátlásban.
A molekuláris diffúzió pontos megadása szintén kulcsfontosságú az anyagátadás vizsgálatakor, hiszen a mintamolekuláknak ez a tulajdonsága határozza meg a molekulák haladását a szemcseék pórusaiban, illetve az axiális diszperzió és a külső anyagátadási gátlás is függ tőle. HPLCrendszerben megállított áramlásos mérésekkel határoztuk meg monodiszperz polisztirol-standardok molekuláris diffúzióját. Eredményeink jól illeszkednek az irodalomban található empirikus összefüggések alapján számolható értékekhez.
Meghatároztuk monodiszperz polisztirol-standardok axiális diszperzióját (DL), a külső anyagátadási együtthatóját (kext), valamint a pórusbeli diffúziós együtthatójának (Dp) értékét a kromatográfia általános sebességi modellje szerint. A pórusokból kizáródó polimerek csúcsainak szélesedésében az axiális diszperzió játszik döntő szerepet mind a teljesen porózus, mind a tömörmagvú töltetekben. A pórusokba bejutó polisztirolok redukált tányérmagassága a porózus töltetben 4-6-szor nagyobb, mint a tömörmagvú állófázisban. A pórusokba bejutó minták esetén az axiális diszperzió hozzájárulása a
csúcsszélesedéshez elenyésző, és a külső anyagátadási gátlásban nincs jelentős különbség az állófázisok között, ezért levonható az a következtetés, hogy pórusbeli diffúziónak jelentős a szerepe a csúcsszélesedésben.
Elvégeztük
alkilbenzol-standardok
anyagátadási
együtthatóinak
meghatározását teljesen porózus állófázison fordított fázisú kromatográfiában. Számításainkhoz makroszkopikus és mikroszkopikus modelleket alkalmaztunk. Az általános sebességi modell alapján minden mérési körülményre kiszámoltuk az axiális diszperziós együtthatót. Tányérmagasság-egyenlet illesztésekor vagy a momentumanalízis során egy DL érték határozható meg az alkalmazott áramlási sebesség tartományban. Az axiális diszperzió az örvénydiffúzió miatt erősen függ a mozgófázis áramlási sebességétől. A 15 cmes oszlopokon általánosan alkalmazott 0,5–1,0 cm3/perces áramlási sebesség tartományban kis különbséget tapasztaltunk különböző modellek között. A pórusbeli diffúziónak függetlenül a mozgófázis áramlási sebességétől konstans értéket kellene kapnunk. Az eredményeink ezt nem minden esetben támasztották alá. Az ellentmondás egyrészt az általános sebességi modell hibájából eredhet: (1) nem bizonyított, hogy a Wilson-Geankoplis-egyenlet pontosan írja-e le a külső anyagátadási gátlást, (2) a modell elhanyagolja az örvénydiffúzió hatását a sávszélesedésre. Másrészt megfontolandó, hogy a szemcsék belseje mégsem annyira határolódik el a „külvilágtól”, mint ahogy eddig gondoltuk, és a pórusok felszínén kialakul egy lassú áramlás, amely áramlási sebességfüggő pórusbeli diffúziót eredményez. Mindezek ellenére kis különbségeket tapasztaltam a különböző modellek alapján meghatározott pórusbeli diffúziós együtthatók értékei között. A kromatográfia sztochasztikus modellje érdekes betekintést ad a kromatográfiás folyamatokba. Az állófázishoz kapcsolódó tartózkodási idő és az anyagátadási lépések számának meghatározása az elválasztás molekuláris szintű vizsgálatát eredményezi. Méréseink
során
az
alkilbenzolok
várható
tartózkodási
ideje
a
mozgófázisban két megkötődés között, m = 10–180 ms-nak adódott, a várható tartózkodási idejük az állófázison egy megkötődés alkalmával s = 5–20 ms-nak a mintától, a hőmérséklettől és a mozgófázis áramlási sebességétől függően. 100
Az anyagátadási lépesek száma n = 15000-25000, azaz ennyiszer kötődik meg a mintamolekula az állófázison és tér vissza a mozgófázisba az oszlopban történő vándorlása során. A fenti modellek a minta molekulák az állófázishoz kötődés időállandóján keresztül hasonlíthatók össze. A s = 12–25 ms-nak adódik a makroszkopikus modellek szerint, amely átfedésben van a sztochasztikus modell alapján számolt s értékekkel. Eredményeink szerint a kromatográfia molekuláris szintű modellje jó alternatívája az alkalmazott makroszkopikus modelleknek.
Meghatároztuk a humán inzulin anyagátadási együtthatóit teljesen porózus és porózus kéreggel bevont tömörmagvú szemcséjű állófázison. Számításainkhoz szintén makroszkopikus és mikroszkopikus modelleket alkalmaztunk. Méréseink
során
megállapítottunk,
hogy
az
inzulin
és
más
makromolekulák esetében is az áramlási sebesség, illetve a nyomásváltozás erősen befolyásolja a retenciót. Az általános sebességi modellt alkalmazva meghatároztunk az axiális diszperziót, a külső anyagátadási együtthatót, valamint a pórusbeli diffúziós együttható értékét mind a teljesen porózus, mind a tömörmagvú állófázison. Tányérmagasság-egyenlet
illesztésével
és
momentumanalízissel
meghatározott anyagátadási együtthatók numerikus értékei bizonytalanok, mivel a mozgófázis áramlási sebessége erősen befolyásolja a retenciós tényezőt. Mérési körülményeink között az áramlási sebesség függvényében változik a mintakomponens retenciós tényezője, amely a szemcse pórusaiban zajló felületi diffúzió és egyben az effektív diffúzió növekedését jelenti. Ezt figyelembe véve elfogadható, hogy az általános sebességi modell alapján áramlási sebességtől függő pórusbeli diffúziós értékeket kaptunk. Megállapítottuk, hogy a magas áramlási sebességek esetében az inzulinmolekulák
átlagos
adszorpciós
ideje,
melyet
a
kromatográfia
sztochasztikus modellje alapján számítottunk ki, a teljesen porózus állófázison (~100 ms) kisebb, mint a tömörmagvú állófázison (~150 ms). Az inzulin retenciós tényezője feleakkora, a teljesen porózus állófázison, mint a 101
tömörmagvún. Az állófázisban a tartózkodási idő egyenesen arányos a retenciós tényezővel, k' s / m . Ha a retenciós tényezők megegyeznének a két oszlopon, a tömörmagvú töltetben az átlagos tartózkodási idő a teljesen porózus fázisban eltöltött idő 75%-a körül lenne várható, mivel a tömör mag a szemcse térfogatának 1/4-része.
102
11.
Tézispontok
1) Meghatároztam méretkizárásos kromatográfiás rendszerben polisztirolok anyagátadási együtthatóit teljesen porózus és tömörmagvú szemcséjű állófázisokban: a) Kimutattam, hogy az axiális diszperzió ~80%-kal járul hozzá az állófázis szemcséiből kizáródó mintamolekulák sávszélesedéséhez mindkét típusú
állófázison,
míg
a
pórusokba
bejutó
polimerek
tányérmagasságához a pórusbeli diffúzió járul hozzá ~80%-kal. b) Megállapítottam, hogy az állófázis pórusaiba bejutó polisztirolok esetében tömörmagvú állófázison elért redukált tányérmagasság 4-6szor kisebb, mint teljesen porózus állófázison, mivel a tömörmag lerövidíti a szemcsékben a diffúziós utakat. 2) Különböző oszlopokon meghatároztam az általános sebességi modell szerint,
tányérmagasság-egyenlet
illesztésével
valamint
momentumanalízissel alkilbenzolok és az inzulin anyagátadási együtthatóit: a) Mivel a mozgófázis áramlási sebessége erősen befolyásolja a fehérjék retencióját, az utóbbi két modell szerint meghatározott anyagátadási együtthatók numerikus értékei bizonytalanok. b) Alkilbenzolok esetében az általánosan alkalmazott 0,5 – 1,0 cm3/perces áramlási sebesség tartományban kis különbséget tapasztaltam a különböző modellek alapján meghatározott az axiális diszperziós együttható értékében. c) Eredményeim alapján feltételezhető, hogy a szemcse pórusok felszínén a mozgófázis nagyon lassan áramlik, mivel az általános sebességi modell alapján áramlási sebességfüggő pórusbeli effektív diffúziót tapasztaltunk az alkilbenzolok esetében.
103
d) Inzulin esetében kimutattam, hogy az áramlási sebesség függvényében növekvő retenció sebességfüggő pórusfelületi diffúziót, illetve pórusbeli diffúziót eredményez. 3) A kromatrogáfia sztochasztikus modelljét alkalmazva meghatároztam különböző állófázisokon alkilbenzolok és az inzulin várható tartózkodási idejét a mozgófázisban két megkötődés között illetve a várható időt, amit a molekulák egy megkötődés alkalmával az állófázison töltenek. a) Az alkilbenzolok állófázison eltöltött átlagos várható tartózkodási ideje
s = 5-20 ms-nak adódott, az anyagátadási lépések száma n = 15000-25000. b) Az inzulin várható tartózkodási ideje az állófázison egy megkötődés alkalmával teljesen porózus állófázison 100 ms körüli, tömörmagvú állófázison 150 ms körüli érték. A különbség a két érték között arra utal, hogy kísérleti elrendezésünkben a tömörmagvú állófázison az inzulin retenciós tényezője kétszer akkora, mint a teljesen porózus állófázison. 4) Bemutattam, hogy a kromatográfia sztochasztikus modellje megfelelő kiváltója lehet anyagátadási vizsgálatok során az általános sebességi modellnek, mivel a makroszkopikus modellek alapján meghatározott anyagátadási együtthatókból számított s értékek (12–25 ms) átfednek a sztochasztikus modell alapján számolt s értékekkel (5–20 ms).
104
Megjelent közlemények A PhD értekezés alapjául szolgáló publikációk 1.
Ivett Bacskay, Attila Felinger
Macroscopic
and microscopic
analysis of
mass
transfer in
reversed
phase
liquid
chromatography JOURNAL OF CHROMATOGRAPHY A 1216: (8)1253-1262 (2009) IF: 4.101 2.
Ivett Bacskay, Attila Felinger
Rapid estimation of overall mass-transfer coefficients in liquid chromatography. ANALYTICAL METHODS 2: (12)1989-1993 (2010) IF: 1.036 3.
Ibolya Kiss, Ivett Bacskay, Ferenc Kilár, Attila Felinger
Comparison of the mass transfer in totally porous and superficially porous stationary phases in liquid chromatography ANALYTICAL AND BIOANALYTICAL CHEMISTRY 397: (3)1307-1314 (2010) IF: 3.841
A PhD értekezés témájában készült nemreferált konferencia absztraktok 1.
I. Bacskay, A. Felinger
Mass transfer kinetics from macroscopic and microscopic approaches in reversed phase liquid chromatography. International CEEPUS II Summer School, Torun-Gdansk-Bialystok, Poland. September 7-13, 2006, p. 212 2.
Bacskay I., Felinger A.
Az anyagátadás kinetikája a fordított fázisú folyadékkromatográfiában makroszkopikus és mikroszkopikus megközelítésben. XII. Nemzetközi Vegyészkonferencia. Csíkszereda, Románia. 2006. október 3-8. 11. o. 3.
I. Bacskay, A. Felinger
Determination of mass transfer coefficients in reversed phase liquid chromatography. International CEEPUS II Summer School, Pécs, Hungary. June 10-15, 2007, p 10
105
4.
A. Feinger, I. Bacskay
Molecular dynamic analysis of the retention mechanism in reversed phase liquid chromatography. 31thInternational Symposium on high Performance Liquid Phase Separations and Related Techniques. Genth, Belgium. June, 17-21, 2007 5.
I. Bacskay, A. Felinger
Determination of Mass Transfer Coefficients with Macroscopic and Microscopic Approaches in Reversed Phase Liquid Chromatography. 7th Balaton Symposium on High-Performance Separation Methods. Siófok, Hungary. September 5-7, 2007, P-5 6.
A. Felinger, I. Bacskay
Molecular Dynamic Analysis of Mass Transfer in Chromatography. 7th Balaton Symposium on High-Performance Separation Methods. Siófok, Hungary. September 5-7, 2007, L-27 7.
I. Kiss, I. Bacskay and A. Felinger
Comparison of the Mass Transfer Kinetics in Totally Porous, Superficially Porous and Nonporous Reversed Phase in Liquid Chromatography. 9th Symposium on Instrumental Analysis. Pécs, Hungay. June 29- July 2 2008, P-31 8.
I. Bacskay, I. Kiss and A. Felinger
Macroscopic and Microscopic Analysis of Mass Transfer Kinetics in Totally Porous and Superficially Porous Reversed Phase in Liquid Chromatography. 14thSymposium on Separation Science; New Achievements in Chromatography, Primosten, Croatia, 30 September – 3 October 2008, P-77 9.
Bacskay I., Felinger A.
Porózus és héj szerkezetű kromatográfiás állófázisokon kialakuló anyagátadási kinetika összehasonlítása nagy molekulatömegű komponensek esetében Elválasztástudomyányi vádorgyűlés, Sárvár, 2008 november 5-7, P-1 10.
Kiss I., Bacskay I., Felinger A.
Az anyagátadási együtthatók vizsgálata különböző geometriájú állófázisok esetében Elválasztástudomyányi vádorgyűlés, Sárvár, 2008 november 5-7, P-24 11.
I. Kiss, I Bacskay, F. Kilár, A. Felinger
The Examination of the Mass Transfer Coefficients on Different Geometry Stationary Phases in Reversed Phase Liquid Chromatography.
106
8th Balaton Symposium on High-Performance Separation Methods. 15th International Symposium on Separation Science, September 2-4, 2009, Siófok, Hungary. P10 12.
I. Kiss, I. Bacskay, F. Kilár, A. Felinger
Mass Transfer on Superficially Porous and Totally Porous Reversed Phases in HPLC. CECE 2009. 6th International Interdisciplinary Meeting on Bioanalysis, November 5 -8 , 2009, Pécs, Hungary. P20
A PhD értekezés témáján kívül készült tudományos közlemények 1.
Ivett Bacskay, Anikó Takatsy, Ákos Végvári, Anders Elfwing, András Ballagi Pordany,
Ferenc Kilár F, Stellan Hjerten Universal Method For Synthesis of Artificial Gel Antibodies by The Imprinting Approach Combined With a Unique Electrophoresis Technique For Detection of Minute Structural Differences of Proteins, Viruses, And Cells (bacteria): III. Gel Antibodies Against Cells (bacteria) ELECTROFORESIS 27: (23) 4682-4687 (2006) IF: 4.101 2.
Ivett Bacskay, Robert Gora, Zoltán Szabó Z, Ibolya Kiss, Václav Kasicka, Gabrial
Peltre, FerencKilar Seasonal Variations of Polycyclic Aromatic Hydrocarbons in Air Particulate Extracts CHROMATOGRAPHIA 68: S113-S117 (2008) IF: 1.312 3.
Borbála Boros, Ágnes Farkas, Silvia Jakabova, Ivett Bacskay, Ferenc Kilar, Attila
Felinger LC-MS Quantitative Determination of Atropine and Scopolamine in the Floral Nectar of Datura Species CHROMATOGRAPHIA 71: S43-S49 (2010) IF: 1.075
A PhD értekezés témáján kívül készült nem referált konferencia absztraktok 1.
I. Bacskay, V. Kasicka, F. Kilár
Determination of polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs) from dust collected in car-tunnels. 6th Symposium on Instrumental Analysis. Graz, Austria. June 24-27, 2001, P-28
107
2.
S. Hjertén, Á. Végvári, I. Bacskay, A. Takátsy, F.Kilár, O. Kornysova, A. Maruska, J.
Sedzik. Methological Advances in Microelectrophoresis, including Studies of the „Artificial Antibodies” against a given Protein, Virus or. Bacterium. APCE2002. The Fourth Asia-Pacific International Symposium on Microscale Separations and Analysis. Shanghai, China. October 11-14, 2002 3.
S. Hjertén, Á. Végvári, A. Takátsy, I. Bacskay, F. Kilár, J. Sedzik, H. Cheng, L. Haag
Proteomics, „Viromics”, and „Bacteromics” as Studied by Artificial Antibodies, using HPCE and Optical Techniques to Analyze their Selectivity. HPCE 200316th International Symposium on Microscale Separations and Analysis. Manchester Grand Hyatt, San Diego, CA. January 17-22, 2003 4.
I. Bacskay, A. Takátsy, F. Kilár, J. Sedzik, A. Kilár, S. Hjertén
„Synthetic antibodies” and their Application to Analysis and Purification of Macromolecules and Particles. "100 Years of Chromatography" 3rd Int. Symposium on Separations in BioSciences SBS 2003. Moscow, Russia.13-18, May, 2003 5.
I. Bacskay, A. Takátsy, A. Elfwing, A. Ballagi, F. Kilár, S. Hjertén
Polyacrylamide Gels as “Artificial Antibodies” against Proteins and Bacteria. 5th Balaton Symposium on High-Performance Separation Methods. Siófok, Hungary. September 3-5, 2003, P-04 6.
A. Takátsy, I. Bacskay, F. Kilár, S. Hjertén
“Artificial antibodies” recognizing proteins and viruses analyzed by capillary electrophoresis. 5th Balaton Symposium on High-Performance Separation Methods. Siófok, Hungary. September 3-5, 2003, P-203
7.
F. Kilár, I. Bacskay, A. Takátsy, A. Ballagi, S. Hjertén
Separation of Bacteria, Viruses and Macromolecules with “Artificial Antibodies”. 5th Balaton Symposium on High-Performance Separation Methods. Siófok, Hungary. September 3-5, 2003, L-33
8.
S. Hjertén, N. Ghasemzadeh, M. Hjertén, Á. Végvári, I. Bacskay, A. Kilár, M. Rezeli, A.
Takátsy, F. Kilár, A. Ballagi, A. Elfwing, H. Cheng, J. Sedzik, T. Aastrop, H. Anderson Universal method for synthesis of highly selective artificial gel antibodies against proteins,
108
viruses and cells; some techniques to study the selectivity and applications FEBS J 272: 399 (2005) 9.
I. Bacskay, S. Hjertén, F.Kilár
Polyacrylamide Gels as “Artificial Antibodies” against Proteins and Bacteria. Test for Selectivity based on Electroosmosis 6th International Symposium and Course. Teaching and Learning “Analytical and Bioanalytical Monitoring Methods”. Prague, Czech Republic, May 29 – June 4, 2005, p. 72 10.
I. Bacskay, I. Kiss, R. Góra, Z. Szabó, F. Kilár
Determination of polynuclear Aromatic hydrocarbons from Air Contamination by HPLC. 6th Balaton Symposium on High-Performance Separation Methods. Siófok, Hungary. September 7-9, 2005, P-71 11.
I. Bacskay, I. Kiss, R. Góra, Z. Szabó, F. Kilár
Monitoring of Polynuclear Aromatic Hydrocarbons from air. 8th Symposium on Instrumental Analysis. Graz, Austria. September 25-28, 2005, p. 46 12.
Bacskay I., Kiss I., Góra R., Szabó Z., Kilár F.
Szálló porhoz kötött policiklikus szénhidrogének meghatározása, a PAH profil változása. II. Kárpát-medencei Környezettudományi Konferencia. Pécs, Magyarország. 2006. június 1-2. 13.o. 13.
M. Rezeli, A. Takátsy, I. Bacsaky, N. Ghasemzadeh, Á. Végvári, J. Sedzik, A. Ballagi, F.
Kilár, S. Hjertén Artificial antibodies selective gels for macromolecules and bioparticles. ITP 2006, 15th International Symposium on Capillary Electroseparation Techniques. Paris, France. August 28-30, 2006, p. 56
109
Köszönetnyilvánítás
Köszönöm családomnak a támogatást, melyet munkám és tanulmányaim során nyújtottak,
férjemnek
és
fiamnak
a
rengeteg
türelmet,
amivel
távolmaradásaimat viselték. Köszönetemet szeretném kifejezni témavezetőmnek Dr. Felinger Attila egyetemi tanárnak, aki tudományos pályafutásomat figyelemmel kísérte, munkámat szakmai tapasztalataival, tanácsaival mindvégig segítette. Köszönetet mondok Dr. Kilár Ferenc egyetemi tanárnak, tanszékvezetőnek, hogy az általa vezetett tanszéken dolgozhattam, és aki biztosította a kutatómunkámhoz szükséges feltételeket. Köszönöm Dr. Kiss Ibolyának, hogy szakmai és baráti tanácsaival mindig átsegített a felmerülő nehézségeken. Köszönöm
a
segítséget,
a
sok-sok
bátorítást
és
türelmet
mindazon
munkatársaknak, akik doktori munkám során segítségemre voltak szakmailag és emberileg egyaránt.
110
Irodalomjegyzék [1]
Guiochon G, Felinger A, Shirazi DG, Katti AM (2006) Fundamentals of Preparative and Nonlinear Chromatography. Academic Press, Amsterdam
[2]
Guiochon G, Lin B (2003) Modeling for Preparative Chromatography. Elsevier, Amsterdam
[3]
Giddings JC, Eyring HJ (1955) Physical Chemistry 59:416-421
[4]
Suzuki M (1990) Adsorption Engineering. Elsevier, Amsterdam
[5]
Miyabe K, Guiochon G (2000) Advances in Chromatography 40:1-113
[6]
Van Deemter JJ, Zuiderweg, F.J. Klinkerberg, A. (1956) Chemical Engineering Science 5:271-289
[7]
Huber JFK (1973) Berichte der Bunsen-Gesellschaft für Physikalische Chemie 77:159-
[8]
Giddings JC (1965) Dynamics of Chromatography. Marcel Dekker, New York
[9]
Horváth Css, Lin HJ (1976) Journal of Chromatography 126:401-420
[10]
Knox JH (1977) Jouornal of Chromatographic. Science 15:352-364
[11]
Tsvet MS (1906) Berichte der Deutsche Botanische Gesellschaft 24:384-393
[12]
Horváth Cs, Lipsky SR (1966) Nature 211:748-
[13]
Horváth Cs, Preiss BA, Lipsky SR (1967) Analytical Chemistry 39:1422–1428
[14]
Huber JFK (1969) Journal of Chromatography Scienses. 7:855-
[15]
Snyder JR (1969) Journal of Chromatography Scienses. 7:595-
[16]
Halász I, Sebestian J (1969) In: Angew. Chem. Int., pp. 453-
[17]
Kirkland JJ, DeStefano JJ (1970) Journal of Chromatography Scienses. 8:309-
[18]
Unger K (1979) Porous Silica. Elsevier, Amsterdam, New York
[19]
Sander LC, Wise SA (1984) Analytical Chemistry 56:504-510
[20]
Nawrocki J (1991) Chromatographia 31:177-192
[21]
Boudreau SP, Cooper WT (1989) Analytical Chemistry 61:41-47
[22]
Snyder L, JW W (1966) Journal of Physical Chemistry 70:3941
[23]
Sindorf DW, Maciel GE (1983) Journal of the American Chemical Society 105:14871493
[24]
Pfleiderer B, Bayer E (1989) Journal of Chromatography 468:67-71
[25]
Steward HNM, Perry SG (1968) Journal of Chromatography 37:97-98
[26]
Horváth Cs, Melander W, Molnar I (1976) Journal of Chromatography 125:129-156
[27]
Molnar I, Horváth Cs (1977) Journal of Chromatography 142:623-640
[28]
Halasz I, Endele R, Asshauer J (1975) Journal of Chromatography 112:37-60
[29]
Kirkland JJ (1971) Journal of Chromatography Science 9
[30]
Sagliano N, Floyd TR, Hartwick RA, Dibussolo JM, Miller NT (1988) Journal of Chromatography 443:155-172
[31]
Ohmacht R (1983) Magyar Kémiai Folyoirat 89:229-232
[32]
Kirkland JJ, Glajch JL, Farlee RD (1989) Analytical Chemistry 61:2-11
111
[33]
Glajch JL, Kirkland JJ (1990) Lc Gc-Magazine of Separation Sciensesence 8:180-&
[34]
Lloyd LL (1991) Journal of Chromatography 544:201-217
[35]
Yasukawa K, Tamura Y, Uchida T, Yanagihara Y, Noguchi K (1987) Journal of Chromatography 410:129-136
[36]
Bienvogelsang U, Deege A, Figge H, Kohler J, Schomburg G (1984) Chromatographia 19:170-179
[37]
Li JW, Hu Y, Carr PW (1997) Analytical Chemistry 69:3884-3888
[38]
Kurganov A, Trudinger U, Isaeva T, Unger K (1996) Chromatographia 42:217-222
[39]
Gilbert MT, Knox JH, Kaur B (1982) Chromatographia 16:138-148
[40]
Bell C, Tsai EW, Ip DP, Mathre DJ (1994) Journal of Chromatography A 675:248-252
[41]
Petro M, Belliardo F, Novak I, Berek D (1998) Journal of Chromatography B 718:187192
[42]
Hjerten S, Liao JL, Zhang R (1989) Journal of Chromatography 473:273-275
[43]
Unger KK, Lork KD, H.-J. W (1991) HPLC of Proteins, Peptides and Polynucleotides. VHC, New York
[44]
Horváth Cs, Lipsky SR (1969) Analytical Chemistry 41:1227-1234
[45]
Horváth Cs, Lipsky SR (1969) Journal of Chromatography Scienses. 7:109
[46]
Huber JFK, Hulsman JARJ (1967) Analytica Chimica Acta 38:9
[47]
Kirkland JJ (1969) Analytical Chemistry 41:218-220
[48]
Kirkland JJ, Truszkowski FA, Dilks CH, Engel GS (2000) Journal of Chromatography A 890:3-13
[49]
Kirkland JJ (2000) Journal of Chromatographic Science 38:535-544
[50]
Guiochon G, Gritti F (2011) Journal of Chromatography A 1218:1915-1938
[51]
Kirkland JJ, Langlois TJ, DeStefano JJ (2007) American Laboratory 39:18-+
[52]
DeStefano JJ, Langlois TJ, Kirkland JJ (2008) Journal of Chromatographic Science 46:254-260
[53]
Gritti F, Cavazzini A, Marchetti N, Guiochon G (2007) Journal of Chromatography A 1157:289-303
[54]
Horvath K, Gritti F, Fairchild JN, Guiochon G (2010) Journal of Chromatography A 1217:6373-6381
[55]
Fekete S, Ganzler K, Fekete J (2011) Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis 54:482-490
[56]
Gritti F, Guiochon G (2007) Journal of Chromatography A 1166:30-46
[57]
Fekete S, Fekete J, Ganzler K (2009) Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis 49:64-71
[58]
Cavazzini A, Gritti F, Kaczmarski K, Marchetti N, Guiochon G (2007) Analytical Chemistry 79:5972-5979
[59]
Fekete S, Fekete J (2011) Talanta 84:416-423
[60]
Fekete S, Ganzler K, Fekete J (2010) Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis 52:672-679
112
[61]
Fekete S, Ganzler K, Fekete J (2010) Journal of Chromatography A 1217:6258-6266
[62]
Felinger A (2011) Journal of Chromatography A 1218:1939-1941
[63]
Unger KK, Jilge G, Janzen R, Giesche H, Kinkel JN (1986) Chromatographia 22:379380
[64]
Unger KK, Jilge G, Kinkel JN, Hearn MTW (1986) Journal of Chromatography 359:6172
[65]
Kalghatgi K, Horváth Cs (1988) Journal of Chromatography 443:343-354
[66]
Ohmacht R, Boros B (2000) Chromatographia 51:S205-S210
[67]
Felinger A, Boros B, Ohmacht R (2002) Chromatographia 56:61-64
[68]
Jilge G, Unger KK, Esser U, Schafer HJ, Rathgeber G, Muller W (1989) Journal of Chromatography 476:37-48
[69]
Ohmacht R, Kiss I (1996) Chromatographia 42:595-598
[70]
Ohmacht R, Boros B, Kiss I, Jelinek L (1999) Chromatographia 50:75-81
[71]
Boros B, Kovacs K, Ohmacht R (2000) Chromatographia 51:S202-S204
[72]
Krenn L, Boros B, Ohmacht R, Jelinek L (2000) Chromatographia 51:S175-S178
[73]
Svec F, Frechet JMJ (1992) Analytical Chemistry 64:820-822
[74]
Nakanishi K, Soga N (1991) Journal of the American Ceramic Society 74:2518-2530
[75]
Ishizuka N, Kobayashi H, Minakuchi H, Nakanishi K, Hirao K, Hosoya K, Ikegami T, Tanaka N (2002) Journal of Chromatography A 960:85-96
[76]
Tanaka N, Kobayashi H, Ishizuka N, Minakuchi H, Nakanishi K, Hosoya K, Ikegami T (2002) Journal of Chromatography A 965:35-49
[77]
Cabrera K (2004) Journal of Separation Scienseence 27:843-852
[78]
Miyabe K, Kobayashi H, Tokuda D, Tanaka N (2006) Journal of Separation Science 29:2452-2462
[79]
Martin AJP, Synge RLM (1941) Biochemical Journal 35:1359-
[80]
Craig LC (1944) Journal of Biological Chemistry 155:519-
[81]
Kučera E (1965) Journal of Chromatography 19:237-248
[82]
M S, Smith JM (1975) Advances in Chromatography 13:213–263
[83]
Lenhoff AM (1987) Journal of Chromatography 387:285–299
[84]
Felinger A, Guiochon G (2004) Chromatographia 60:S175-S180
[85]
Miyabe K, Guiochon G (2002) Journal of Physical Chemistry B 106:8898-8909
[86]
Lapidus L, Amundson NR (1952) Journal of Physical Chemistry 56:984-988
[87]
Morbidelli M, Servida A, Storti G, Carra S (1982) Industrial & Engineering Chemistry Fundamentals 21:123-131
[88]
Miyabe K, Guiochon G (1999) Analytical Chemistry 71:889-896
[89]
Hong L, Felinger A, Kaczmarski K, Guiochon G (2004) Chemical Engineering Science 59:3399-3412
[90]
Giddings JC (1963) Analytical Chemistry 35:1999-2002
[91]
McQuarrie DA (1962) Journal of Chemical Physics 38:437-445
[92]
Dondi F, Remelli M (1986) Journal of Physical Chemistry 90:1885-1891
113
[93]
Cavazzini A, Remelli M, Dondi F (1997) Journal of Microcolumn Separations 9:295-302
[94]
Cavazzini A, Remelli M, Dondi F, Felinger A (1999) Analytical Chemistry 71:3453-3462
[95]
Weiss GH (1970) Separation Science 5:51-62
[96]
Weiss GH (1982-83) Separ. Sciense. Technol. 17:1609-1622
[97]
Felinger A, Cavazzini A, Remelli M, Dondi F (1999) Analytical Chemistry 71:4472-4479
[98]
Pasti L, Dondi F, van Hulst M, Schoenmakers PJ, Martin M, Felinger A (2003) Chromatographia 57:S171-S186
[99]
Dondi F, Cavazzini A, Remelli M, Felinger A, Martin M (2002) Journal of Chromatography A 943:185-207
[100]
Felinger A (1998) Data Analysis and Signal Processing in Chromatography. Elsevier, Amsterdam
[101]
Felinger A (2008) Journal of Chromatography A 1184:20-41
[102]
Beynon JH, Clough S, Crooks DA, Lester (1958) Transaction of the Faraday Society 54:705-714
[103]
Felinger A, Cavazzini A, Dondi F (2004) Journal of Chromatography A 1043:149-157
[104]
Miyabe K, Cavazzini A, Gritti F, Kele M, Guiochon G (2003) Analytical Chemistry 75:6975-6986
[105]
Horváth Css, Lin HJ (1978) Journal of Chromatography 149:43-70
[106]
Gunn DJ (1987) Chemical Engineering Science 42:363-373
[107]
Reid RC, Prausnitz JM, Sherwood TK (1996) The properties of Gases and Liquids. McGraw-Hill, New York
[108]
Bacskay I, Felinger A (2009) Journal of Chromatography A 1216:1253-1262
[109]
Stokes RH (1950) Journal of American Chemical Society:763-767
[110]
Krahn W, Schweiger G, Lucas K (1983) Journal of Physical Chemistry 87:4515-4519
[111]
Stejskal EO, Tanner JE (1965) Journal of Chemical Physics 42:288–292
[112]
Li JW, Carr PW (1997) Analytical Chemistry 69:2530-2536
[113]
Li JW, Carr PW (1997) Analytical Chemistry 69:2550-2553
[114]
Wilke CR, Chang P (1955) AIChE Journal 1:264
[115]
Scheibel EG (1954) Indrustrial and Engineering Chemistry 46:2007-2008
[116]
Schotte W (1992) Chemical Engineering Journal and the Biochemical Engineering Journal 48:167-172
[117]
Gritti F, Guiochon G (2007) Analytical Chemistry 79:3188-3198
[118]
Young ME, Carroad PA, Bell RL (1980) Biotechnology and Bioengineering 22:947-955
[119]
Miyabe K, Ando N, Guiochon G (2009) Journal of Chromatography A 1216:4377-4382
[120]
Miyabe K, Nagai J, Guiochon G (2010) Chemical Engineering Science 65:3859-3864
[121]
Miyabe K, Matsumoto Y, Guiochon G (2007) Analytical Chemistry 79:1970-1982
[122]
Miyabe K, Matsumoto Y, Ando N (2009) Analytical Sciences 25:211-218
[123]
Miyabe K, Ando M, Ando N, Guiochon G (2008) Journal of Chromatography A 1210:6067
114
[124]
Wilson EJ, Geankoplis CJ (1966) Indrustrial and Engineering Chemistry Fundamentals 5:9-14
[125]
Felinger A (2004) Lc Gc North America 22:642-+
[126]
Halasz I, Vogtel P, Groh R (1978) Zeitschrift Fur Physikalische Chemie-Frankfurt 112:235-249
[127]
Knox JH, Ritchie HJ (1987) Journal of Chromatography 387:65-84
[128]
Jerabek K, Revillon A, Puccilli E (1993) Chromatographia 36:259-262
[129]
Mazsaroff I, Regnier FE (1988) Journal of Chromatography 442:15-28
[130]
Werner W, Halasz I (1980) Journal of Chromatographic Science 18:277-283
[131]
Vilenchik LZ, Asrar J, Ayotte RC, Ternorutsky L, Hardiman CJ (1993) Journal of Chromatography 648:9-17
[132]
DePhillips P, Lenhoff AM (2000) Journal of Chromatography A 883:39-54
[133]
Guan H, Guiochon G (1996) Journal of Chromatography A 731:27-40
[134]
Halász I, Groh R (1981) Analytical Chemistry 53:1325-1335
[135]
Giddings J, Kucera E, Russel C, Myers M (1968) Journal of Physical Chemistry 72:43997-44408
[136]
Swartz ME (2005) Journal of Liquid Chromatography & Related Technologies 28:12531263
[137]
Kaczmarski K, Guiochon G (2007) Analytical Chemistry 79:4648-4656
[138]
Felinger A, Boros B, Ohmacht R (2002) Chromatographia 56:61-64
[139]
Ohmacht R, Boros B (2000) Chromatographia 51:S:205-210
[140]
Liu XD, Szabelski P, Kacmarski K, Zhou DM, Guiochon G (2003) Journal of Chromatography A 988:205-218
[141]
Liu XD, Zhou DM, Szabelski P, Guiochon G (2003) Analytical Chemistry 75:3999-4009
[142]
Fallas MM, Neue UD, Hadley MR, McCalley DV (2008) Journal of Chromatography A 1209:195-205
[143]
Kiss I, Bacskay I, Kilar F, Felinger A (2010) Analytical and Bioanalytical Chemistry 397:1307-1314
[144]
Szabelski P, Liu XD, Guiochon G (2003) Journal of Chromatography A 1015:43-52
[145]
Mager PP, Penke B, Walter R, Harkany T, Hartig W (2002) Current Medicinal Chemistry 9:1763-1780
[146]
Qian MG, Lubman DM (1995) Analytical Chemistry 67:2870-2877
[147]
Stromqvist M, Lindgren K, Hansson L, Juneblad K (1995) Journal of Chromatography A 718:53-58
[148]
Fekete S, Fekete J, Ganzler K (2009) Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis 50:703-709
[149]
Gritti F, Guiochon G (2006) Chemical Engineering Science 61:7636-7650
[150]
Gritti F, Guiochon G (2006) Journal of Chromatography A 1128:45-60
[151]
Bacskay I, Felinger A (2010) Analytical Methods 2:1989-1993
[152]
Felinger A (2006) Journal of Chromatography A 1126:120-128
115
Függelék
I.
Monodiszperz polisztirol-standardok (MW 580 – 325000 mérettartomány) egymásra vetített méretkizárásos kromatogramja 20°C-on 100% tetrahidrofuránnal kifejlesztve
116
II.
Polisztirol-standardok retenciós térfogata a standardok molekulatömegének köbgyökének függvényében. zöld: a pórusokból teljesen kizáródó polimerek pontjaira illesztett egyenes, y tengelymetszete VM; világos kék: a pórusokba bejutó polimerek pontjaira illesztett egyenes, y tengelymetszete Vexcl
117
III.
Alkilbenzolokkal kimért tányérmagasság (H, cm) a mozgófázis sebességének függvényében (uh, cm/s)
118
IV.
Az 5.2.4 tányérmagasság-egyenlet B és C együtthatói különböző hőmérsékleteken 20°C 2
B (cm /s)
30°C 2
C (s)
B (cm /s)
40°C 2
C (s)
B (cm /s)
C (s)
n-pentilbenzol
8,90·10
-5
2,56·10
-3
7,35·10
-5
2,49·10
-3
7,95·10
-5
2,72·10
-3
n-butilbenzol
7,16·10
-5
2,66·10
-3
6,69·10
-5
2,51·10
-3
7,56·10
-5
2,68·10
-3
n-propilbenzol
5,87·10
-5
2,79·10
-3
6,27·10
-5
2,55·10
-3
7,02·10
-5
2,67·10
-3
etilbenzol
5,18·10
-5
2,76·10
-3
5,80·10
-5
2,49·10
-3
6,49·10
-5
2,58·10
-3
toluol
5,04·10
-5
2,71·10
-3
5,75·10
-5
2,43·10
-3
6,40·10
-5
2,49·10
-3
tiokarbamid
1,75·10
-5
2,88·10
-3
1,78·10
-5
2,51·10
-3
2,24·10
-5
2,34·10
-3
119
V.
Momentumanalízis
120
