OXIDATIVNÍ FOSFORYLACE
OBSAH • Mitochondrie
• Elektronový transport • Oxidativní fosforylace • Kontrolní systém oxidativního metabolismu.
Dýchací řetězec - oxidativní fosforylace • Oxidativní fosforylace je proces tvorby ATP při přenosu elektronů z NADH a FADH2 na kyslík přes řadu přenašečů elektronů.
• NADH a FADH2 jsou vytvořené při glykolýze, oxidaci mastných kyselin a cyklu trikarboxylových kyselin
• Oxidativní fosforylace je hlavním zdrojem energie aerobních organismů.
Oxidace a syntéza ATP jsou spojeny transmembránovým tokem protonů
Významné reakce katalyzované NAD(P)H dehydrogenasami
Mitochondrie • Mitochondrie jsou místem eukaryotního oxidačního metabolismu. Vnější membrána Vnitřní membrána Kristy Matrix
Mezimembránový prostor Drsné endoplazmatické retikulum
Mitochondrie obsahují: • pyruvátdehydrogenasu • enzymy citrátového cyklu • enzymy katabolismu mastných kyselin • enzymy spolu s proteiny elektronového transportního řetězce a oxidativní fosforylace.
Mitochondriální transportní systém • Vnější
mitochondriální membrána, stejně jako bakteriální, obsahuje poriny, proteiny, které dovolují volnou difúzi molekul do 10 kD.
• Vnitřní
membrána, která je hmotnostně složena ze 75 % z proteinů, volně propouští O2, CO2 a H2O. Jinak obsahuje řadu transportních proteinů, které kontrolují průchod metabolitů jako jsou ATP, ADP, pyruvát, Ca2+ a fosfát.
• Redukované
ekvivalenty (NADH) se transportují z cytosolu do mitochondrie, buď malát-aspartátovým člunkem nebo glycerol-3fosfátovým člunkem.
• NADH transportované glycerol-3-fosfátovým člunkem poskytuje po oxidaci jen 2 ATP.
Mitochondriální přenašeče
Malát – aspartátový člunek
• Malát – aspartátový člunek (srdce a játra). • Reversibilní – závisí na poměru NADH/NAD+ v cytoplasmě a matrix
Malát-aspartátový člunek
Glycerol-3-fosfátový člunek
• Glycerol-3-fosfátový člunek ve svalech(shuttle). • Redukce dihydroxyacetonfosfátu na glycerol-3-fosfát a poté mitochondriální glycerol-3-fosfátdehydrogenasa. • Tvoří se pouze 2 ATP !!!
Glycerol-3-fosfátový člunek
Translokátor ADP – ATP • Většina v mitochondrii vytvořeného ATP se využívá v cytoplasmě. • Vnitřní
mitochondriální membrána obsahuje ADP-ATP translokator transportující ATP do cytosolu a ADP z cytosolu do mitochondrie.
• Translokator
je dimer identických 30 kD podjednotek s jedním vazebným místem pro ADP i ATP, které vzájemně kompetují.
• Translokátor mění konformaci při vazbě buď ADP nebo ATP.
• Export
ATP (4 záporné náboje) proti importu ADP (3 záporné náboje) je elektrogenní antiport poháněný rozdílem membránového potenciálu.
Mechanismus mitochondriální ATP-ADPtranslokasy
• Mechanismus mitochondriální ATP-ADPtranslokasy (14 % proteinů mitochondriální membrány) ANTIPORTER. • ATP je transportován 30 x rychleji ven, než ADP dovnitř. Čtvrtina energie získaná ox. fosforylací jde na konto exportu ATP. • Inhibice – atraktylosid (rostlinný glykosid) a bongkreková kyselina (antibiotikum z plísně).
Konformační změny ADP-ATP translokátoru
Transport fosfátů • K syntéze ATP z ADP a Pi je nutné transportovat fosfát z cytosolu do mitochondrie.
• Fosfátový nosič – lze charakterizovat jako
elektrochemický Pi-H+ symport poháněný rozdílem (D pH) (transmembránový protonový gradient).
• Vytvořený transmembránový protonový gradient nevede pouze k syntéze ATP, ale také k transportu ADP a Pi.
Transport Ca2+ 1. Vstup do matrix je poháněn membránovým potenciálem (uvniř negativní) 2. Antiport s H+
• Mitochondrie – působí jako pufr pro cytosolový Ca2+
Elektronový transport / Termodynamika • Elektronové nosiče přenášející elektrony z NADH a FADH2 na kyslík jsou lokalizovány ve vnitřní mitochondriální membráně.
• Oxidace
NADH je silně exergonická. Měřítkem afinity substrátu k elektronům je standardní redukční potenciál (o´). Čím vyšší hodnota, tím větší afinita k elektronům.
Poloreakce oxidace NADH kyslíkem jsou: NAD+ + H+ + 2 e- NADH
o´= - 0, 315 V
½ O2 + 2 H+ + 2 e- H2O
o´= 0, 815 V
• NADH je donor elektronů, O2 akceptor. Celková reakce: ½ O2 + NADH + H+ H2O + NAD+ D o´= 0, 815 V – (-0, 315 V) = 1, 130 V !!!
Elektronový transport / Termodynamika • Redukční potenciál páru H+ : H2 je definován jako 0 voltů. • Např. NADH jako silné redukční činidlo předává elektrony a má tak negativní redukční potenciál.
• Silné oxidační činidlo jako je O2 přijímá elektrony a má tak pozitivní redukční potenciál.
• V biochemických textech je redukční potenciál uváděn při + -7
koncentraci H = 10 M (pH 7), zatímco v chemických 1 M (pH 0)
• Redukčnío´potenciál v biochemii je tak označen jako Eo´ (obdobně jako D G )
• Vztah mezi změnou standardní volné (Gibbsovy) energie a změnou redukčního potenciálu:
D Go´ = - nFDEo´ n = počet přenášených elektronů, F je Faradayův náboj (96, 48 kJ.mol-1.V-1) a DEo´ je ve voltech.
•
Elektronový transport / Termodynamika • Oxidace NADH poskytuje D Go´ = - 218 kJ.mol-1 volné energie. • K syntéze jednoho molu ATP z ADP a Pi je třeba 30, 5 kJ.mol-1. • Energetický
rozdíl D Go´ = - 218 kJ.mol-1 nelze přímo převést na
několik ATP.
• Ve vnitřní mitochondriální membráně je soustava tří proteinových komplexů přes které putují elektrony z NADH ke kyslíku.
• Celková volná energie je tak rozdělena na tři menší části z nichž každá se podílí na tvorbě ATP oxidativní fosforylací. Oxidace NADH poskytne přibližně 3 ATP.
• Termodynamická
efektivita za standardních biochemických podmínek je 42 %. (3 x 30,5 kJ.mol-1 x 100 / 218 kJ.mol-1).
Komplexy sekvence elektronového transportu
Komplexy sekvence elektronového transportu • Komplexy jsou řazeny podle vzrůstajícího redukčního potenciálu. • Komplex I: Katalyzuje oxidaci NADH koenzymem Q (CoQ). NADH + CoQ (oxidovaný) NAD+ + CoQ (redukovaný) Do´= 0, 360 V; D Go´ = - 69, 5 kJ.mol-1
• Komplex II: Katalyzuje oxidaci FADH2 koenzymem Q. FADH2 + CoQ (oxidovaný) FAD + CoQ (redukovaný) Do´= 0, 085 V; D Go´ = - 16, 4 kJ.mol-1 Redoxní reakce neposkytuje dostatečné množství energie pro tvorbu ATP. Funkcí je, pouze předávat elektrony z FADH2 do elektronového transportního řetězce.
Komplexy sekvence elektronového transportu • Komplex III: Katalyzuje oxidaci CoQ (red.) cytochromem c. CoQ (redukovaný) + 2 cytochrom c (oxidovaný)
• CoQ (oxidovaný) + 2 cytochrom c (redukovaný) Do´= 0, 190 V; D Go´ = - 36, 7 kJ.mol-1
• Komplex
IV: Katalyzuje oxidaci redukovaného cytochromu c kyslíkem – terminálním akceptorem elektronů. 2 cytochrom c (red.) + ½ O2 2 cytochrom c (oxid.) + H2O
D o´=0, 580 V; D Go´ = - 112 kJ.mol-1.
Komplexy sekvence elektronového transportu
Mitochondriální elektronový transport
Mitochondriální elektronový transport
Komplex I: NADH – koenzym Q oxidoreduktasa • Komplex I je největší protein v mitochondriální membráně – 43 podjednotek o celkové hmotnosti 900 kD.
• Komplex
I obsahuje jednu molekulu FMN a 6 až 7 komplexů (klastrů) železo-síra.
• Klastry
jsou prostetickými skupinami proteinů železo-síra nebo jinak nehemové proteiny.
• FMN
je pevně vázaný na proteiny; zatímco CoQ je, díky svému hydrofobnímu isoprenoidnímu řetězci, volně pohyblivý v lipidové dvojvrstvě membrány.
•U
savců obsahuje řetězec CoQ 10 C5 isoprenoidních jednotek (Q10).
• U některých organismů je řetězec CoQ kratší – 6 nebo 8 jednotek.
Struktura NADH-Q oxidoreduktasy (Komplex I)
Matrix
• Skládá se z části lokalizované v membráně a ramene v matrix. • NADH se oxiduje v rameni a elektrony jsou přeneseny do membrány, kde redukují CoQ.
Klastry železo-síra. Přechod elektronů mezi Fe2+ a Fe3+
Oxidační stavy FMN a koenzymu Q (CoQ) 2-
H2C
OPO 3
H3C
C
CH3
H3C
C
CH3
H3C
C
CH3
H H3C
N
H3C
O
CH2 N
O N
N H
H3CO
CH3 CH3
H
H3CO
CH2 O
O
Flavinmnonukleotid (FMN) (oxidovaná nebo chinonová forma)
N
H3C
N H
N N
H
O
H3CO
CH3
H
H3CO
R
Koenzym QH nebo ubisemichinon (radikálová nebo semichinonová forma) H
R
H
H3C
N
N
H3C
N H
H
OH
O
H
H
n
O
FAMNH (radikálová nebo semichinonová forma)
H
CH2
H
R
H3C
C
Koenzym Q (CoQ) nebo ubichinon (oxidovaná nebo chinonová forma)
H H
CH
Isoprenoidní jednotky
OH
N
O
H3CO
CH3
H
H3CO
R
O
FMNH2 (redukovaná nebo hydrochinonová forma)
OH
Koenzym QH2 nebo ubichinol
(redukovaná nebo hydrochinonová forma)
Reakce katalyzovaná NADH-Q oxidoreduktasy NADH + Q + 5 H+matrix → NAD+ + QH2 + 4 H+cytoplasma
• První krok: vazba NADH a přenos dvou elektronů na FMN (FMNH2).
• Druhý krok: elektrony jsou přeneseny na soustavu sloučenin železo – síra.
• Třetí krok: elektrony jsou přeneseny na vázaný CoQ. Tok dvou
elektronů z NADH na vázaný CoQ přes komplex I pumpuje čtyři elektrony z matrix. Redukce CoQ na CoQH2 vyžaduje další dva protony z matrix.
• Čtvrtý krok: pár elektronů z vázaného CoQH2 se přenáší na 4Fe – 4S a protony se uvolňují do cytoplasmy.
• Pátý krok: elektrony z 4Fe – 4S se přenáší na mobilní CoQ v
hydrofobní části membrány. To vede k odebrání dalších dvou protonů z matrix.
Přenos elektronů a translokace protonů v komplexu I.
• Tok
elektronů z NADH na CoQ probíhá stupňovitě mezi redox centry.
• NADH se účastní vždy jen dvouelektronové výměny. FMN a CoQ mohou přenášet jak dva, tak jeden elektron a proto tvoří elektronovou spojku mezi dvouelektronovým NADH a jednoelektronovými akceptory – cytochromy.
• Při
toku elektronů mezi redox centry komplexu I jsou transportovány čtyři protony z matrix do mezimembránového prostoru.
Spojení přenosu elektron – proton. Redukce chinonu (CoQ) na CoQH2 vede k odčerpání dvou protonů z matrix
Komplex II: sukcinát-koenzym Q oxidoreduktasa • Komplex
II obsahuje enzym citrátového cyklu sukcinátdehydrogenasu. Přenáší elektrony z FADH2 na CoQ.
–
• Komlex
II obsahuje sukcinátdehydrogenasu s kovalentně vázaným FAD, několik klastrů Fe-S a jeden cytochrom b560.
• Komplex I a II nejsou v sérii. • Komplex II přenáší elektrony ze sukcinátu na CoQ.
• CoQ je mobilní sběrač elektronů. • Cytochrom
b560 slouží pravděpodobně k odstraňování kyslíkatých radikálů vznikajících vedlejšími reakcemi.
Struktura sukcinát-koenzym Q oxidoreduktasy
Cytochromy-hemové transportní proteiny Během transportu elektronů alternují mezi Fe2+ a Fe3+. PROTEIN CH3 H2C HO
CH2
CH
CH
1
+
CH
CH2
S
CH
CH3
H3C
CH
Cys
CH3
S
N
4
N Fe
O
H
3
3
N
8
CH2
CH3
2
H3C
C
Cys
CH
CH2
H3C
CH N
+
2+
7
+
5
N CH3
H3C
N Fe
N
CH2
CH N
+
2+
N Fe
N
+
N
H3C
CH3
2+
N
+
H3C
CH3
6
CH2
CH2
CH2
CH2
CH2
CH2
CH2
CH2
CH2
CH2
CH2
CH2
-
COO
Hem a
COO
-
-
COO
COO
-
Hem b (Fe-protoporfyrin IX)
-
COO
COO
Hem c
-
CH3
Absorpční spektra hemových skupin redukovaných Fe2+ cytochromů Soretovy pásy
ABSORBANCE
Cytochrom a
439
Cytochrom b
429
532
563
Cytochrom c
415
521
550
Cytochrom c1
418
524
554
Cytochrom c
300
400
500 Vlnová délka (nm)
600
600
Komplex III: koenzym Q – cytochrom c oxidoreduktasa
• Komplex
III (také jako cytochrom bc1) transportuje elektrony z redukovaného CoQH2 na cytochrom c.
• Obsahuje: Dva cytochromy typu b, jeden c1 a jeden klastr [2Fe2S], znám také jako Rieskeho centrum.
• Transport elektronů a pumpování protonů probíhá
tzv. Q cyklem.
• CoQH2
podstupuje dva cykly reoxidace za tvorby stabilních meziproduktů – semichinonů CoQ.
• Existují
dvě nezávislá centra pro koenzym Q: Qo vážící CoQH2 (blíže vnější straně membrány – out) a Qi (blíže vnitřní straně membrány – inner) vážící semichinon CoQ..
Struktura koenzym Q – cytochrom c oxidoreduktasy
Q-cytochrom c oxidoreduktasa • Druhá protonová pumpa. • Funkcí komplexu III je katalyzovat přenos elektronů z QH2 na oxidovaný cytochrom c za současného pumpování protonů z matrix.
QH2 + 2 Cyt cox + 2 H+matrix → Q + 2 Cyt cred + 4 H+cytoplasma
Reakce Q cyklu První cyklus: CoQH2 + cytochrom c1 (Fe3+) CoQ. + cytochrom c1(Fe2+) + 2 H+ (mezimembránový prostor) Druhý cyklus - nejdříve další CoQH2 opakuje první cyklus. CoQH2 + CoQ. + cytochrom c1 (Fe3+) + 2 H+ (z matrix) CoQ + CoQH2 + cytochrom c1 (Fe2+) + 2 H+ (do mezimembrány) Z každých dvou CoQH2 vstupující do Q cyklu, je jeden regenerován.
Celková reakce: CoQH2 + 2 cytochrom c1(Fe3+) + 2H+ (z matrix) CoQ + 2 cytochrom c1 (Fe2+) + 4 H+ (do mezimembránového prostoru). Elektrony jsou následně přenášeny na cytochrom c, který je transportuje do komplexu IV.
Q cyklus – první část M E Z I M E M B R Á N O V Ý
Z KOMPLEXU I
QH2
2H+ FeS-protein P R O S T O R
QH2 Q e-
e-
bL
e-
bH
e-
c1
Q Q
o
PRVNÍ CYKLUS
e-
Q Q Q
i
M A T R I X
Q cyklus – druhá část M E Z I M E M B R Á N O V Ý
Z KOMPLEXU I
QH2
2H+ FeS-protein P R O S T O R
QH2 Q e-
e-
QH2
bL
e-
bH
e-
c1
e-
Q Q
o
DRUHÝ CYKLUS
Q Q
i
Q
M A + 2H T R I X
Q cyklus
Komplex IV: cytochrom c oxidasa • Katalyzuje
jednoelektronovou oxidaci čtyřech redukovaných cytochromů c a současnou čtyřelektronovou redukci jedné molekuly O2.
4 Cytochrom c (Fe2+) + 4 H+ + O2 4 cytochrom c (Fe3+) + 2 H2O
• Obsahuje
čtyři redoxní centra: cytochrom a, cytochrom a3, atom mědi značený jako CuB a dvojici atomů mědi označovaných jako CuA centrum.
• Redukce O2 cytochrom c oxidasou je postupný složitý proces.
Komplex IV: cytochrom c oxidasa • Cytochrom c oxidasa má dva kanály translokace protonů. • Čtyři tzv. chemické nebo skalární protony jsou odňaty z
matrix
během redukce kyslíku za tvorby dvou molekul vody.
• Proces
je spojen s translokací čtyř tzv. pumpovaných nebo vektorových protonů z matrix do mezimembránového prostoru.
• Při
reakci komplexu IV je celkově transportováno přes vnitřní mitochondriální membránu osm protonů.
8 H+(matrix) + O2 + 4 cytochrom c (Fe2+) 4 cytochrom c (Fe3+) + 2 H2O + 4 H+ (do mezimembránového prostoru)
Struktura cytochrom c oxidasy
Transport protonů z matrix cytochrom c oxidasou
Čtyři protony do cytoplasmy a čtyři na tvorbu vody
Reaktivní kyslíkaté radikály (ROS) • Čtyřelektronová redukce kyslíku cytochrom c oxidasou je rychlá a precizní.
• Přesto
vznikají kyslíkaté radikály, které reagují s různými buněčnými součástmi.
• Nejznámější je superoxidový radikál: O2 + e- O2- .
• Superoxidový radikál je prekurzorem silnějších oxidačních radikálů jako jsou protonovaný (hydroxoniový) O2- . HO2. a hydroxylový radikál . OH
Reaktivní kyslíkaté radikály (ROS) • Antioxidační mechanismus: superoxiddismutasa (SOD) přítomná téměř ve všech buňkách. Katalyzuje přechod O2- . na peroxid vodíku.
• Vytvořený
peroxid vodíku je degradován katalasou na vodu a
kyslík: 2 H2O2 2 H2O + O2 nebo glutathionperoxidasou: 2 GSH + H2O2 GSSG + 2 H2O
• Dalšími potenciálními antioxidanty jsou rostlinné sloučeniny jako askorbát (vitamin C) a -tokoferol (vitamin E). Pravděpodobně chrání rostliny před oxidačním stresem během fotosyntézy, kdy je H2O fotolýzou rozkládána na O2, protony a elektrony.
Redoxní systémy dýchacího řetězce
Komplex V: ATP synthasa Oxidativní fosforylace. Energetické spojení. Volná energie transportu protonů se uplatní při tvorbě ATP.
Komplex V: ATP synthasa
Chemiosmotická hypotéza oxidativní fosforylace
• Mitchell, P., Coupling of phosphorylation to electron and hydrogen transfer by a chemiosmotic type of mechanism. Nature 191, 144-148 (1961).
• Peter Mitchell (1920-1992), Nobelova cena za Fyziologii a medicínu 1978.
• Volná
energie elektronového transportu je realizována pumpováním H+ z mitochondriální matrix do mezimembránového prostoru za tvorby elektrochemického H+ gradientu přes membránu.
• Elektrochemický gradient je posléze uplatněn při syntéze ATP. Tato volná energie se nazývá protonmotivní síla.
Chemiosmotická hypotéza oxidativní fosforylace
• Naměřený
membránový potenciál přes membránu jaterní mitochondrie je 0, 168 V (v matrix negativní).
• Naměřené
pH v matrix je o 0,75 jednotky vyšší než v mezimembránovém prostoru.
• DG pro transport protonů z matrix je 21, 5 kJ.mol-1 – endergonní proces.
• Rušení gradientu, syntéza ATP, je proces exergonní!!
Procesy oxidace NADH a tvorby ATP
NADH + ½ O2 + H+
H2O + NAD+
D Go´ = - 220, 1 kJ/mol
ADP + Pi + H+
ATP + H2O
D Go´ = + 30, 5 kJ/mol
ATP synthasa – protony pumpující ATP synthasa, F1Fo-ATPasa • Multipodjednotkový transmembránový protein o celkové molekulové hmotnosti 450 kD.
• Složena ze dvou funkčních jednotek (komponent), Fo a F1. (Fo vyslovuj ef ó - o znamená na oligomycin citlivá komponenta). • protonvodivá (Fo) v membráně • katalytická (F1) v matrix
ATP synthasa – protony pumpující ATP synthasa, F1Fo-ATPasa
Oligomycin B
•Antibiotikum produkované streptomycety •Inhibuje ATP synthasu vazbou na Fo
•Brání transportu H+ kanálkem Fo
ATP synthasa – protony pumpující ATP synthasa, F1Fo-ATPasa.
• Fo je ve vodě nerozpustný transmembránový protein obsahující více jak osm různých typů podjednotek.
• F1
je vodě rozpustný periferní membránový protein složený z pěti typů podjednotek, které lze jednoduše oddělit od Fo působením močoviny.
• Rozpuštěná
F1 komponenta (oddělená od Fo) hydrolyzuje, ale nesyntetizuje ATP.
• F1 komponenta ATPsynthasy má podjednotkové složení 33e. Další
dva polipeptidy b2 a d tvoří stator, kterým jsou podjednotky a přichyceny k Fo
• Fo komponenta je složena z 12 peptidů c procházejících membránou a jedné podjednotky a.
Model F1Fo-ATPasy
Model F1Fo-ATPasy
Mechanismus syntézy ATP
• Rotace podjednotky o 120o proti směru hodinových ručiček mění strukturu tří podjednotek.
• Podjednotka s nově syntetizovaným ATP je ve formě T (tight) – nemůže uvolnit ATP.
• Pohybem podjednotky se převede na O formu, uvolní ATP a váže nové ADP a Pi
• Tok protonů přes ATPsynthasu vede k uvolnění pevně vázaného ATP
• Role protonového gradientu nespočívá v syntéze ATP, ale v jeho uvolnění ze synthasy !!! ATP se tvoří i bez protonmotivní síly, ale neuvolňuje se (hydrolyzuje)
Mechanismus rotace F1Fo-ATPasy • Protony z mezimembránového prostoru vstupují do podjednotky c, • reagují s podjednotkou a • vystupují ven až se c kruh otočí o jednu otočku, kdy se podjednotka c znovu setká s podjednotkou a.
Pohyb protonů přes membránu pohání rotaci c kruhu
Mechanismus vazebné změny – tvorba ATP z ADP a Pi
• F1
komponenta má tři reaktivní katalytické protomery ( jednotky), každý ve jiném konformačním stavu.
• L - váže substrát a produkt slabě (L = loosely) • T - váže pevně (T = tightly) • O - neváže vůbec, je otevřený (O = open) • Uvolněná energie translokací protonů se realizuje přechodem mezi těmito stavy.
• Fosfoanhydridová vazba ATP je syntetizována jen ve stavu T a ATP se uvolňuje ve stavu O.
• Tři stupně: • ADP a Pi se váží do stavu L. • Průchod protonů mění konformaci L na T. • ATP je syntetizované ve stavu T, druhé ATP se dostává pohybem rotoru do stavu O a oddisociuje.
Mechanismus vazebné změny tvorby ATP
1. Vazba ADP a Pi k L-místu 2. Energeticky závislá konformační změna přemění vazebná místa L na T, T na O a O na L 3. Syntéza ATP v místě T a uvolnění ATP z místa L
Poměr P/O • Poměr P/O reprezentuje relaci mezi množstvím syntetizovaného ATP (P) a množství redukovaného kyslíku (O).
• Tok dvou elektronů přes komplexy I, III a IV vede ke translokaci 10 protonů. Zpětný tok těchto protonů přes ATPasu poskytuje 3 ATP.
• Elektrony z FADH2, vynechávají komplex I, vedou ke translokaci 6 protonů, což poskytuje jen 2 ATP.
• U aktivně respirujících mitochondrií nebývá poměr P/O celé číslo. • Peter
Hikle prověřoval P/O poměry a prokázal, že aktuální hodnoty jsou blíže číslů 2,5 a 1,5.
Kontrolní mechanismy oxidativní fosforylace • Dospělý
člověk spotřebuje denně 6300-7500 kJ metabolické energie. To odpovídá volné energii hydrolýzy 200 molů ATP na ADP a Pi.
• Celkové množství v těle přítomného ATP je méně než 0,1 molu !!!
• ATP
musí být nutně recyklován a jeho produkce regulována, protože se neprodukuje nikdy více ATP než je potřeba.
• V lidském těle se denně vytvoří 65 kg ATP • Celkový obsah AMP + ADP + ATP je jen 3-4 g
• Každá molekula ADP se za den několikatisíckrát fosforyluje a pak defosforyluje
Regulace oxidativní fosforylace poměrem ATP/ADP – regulace akceptorem
• Oxidativní fosforylace (od NADH k cytochromu c) je v rovnováze:
½ NADH + cytochrom c (Fe3+) + ADP + Pi ½ NAD+ + cytochrom c (Fe2+) + ATP D G´ 0 Keq = ([NAD+] / [NADH])½.[c2+] / [c3+]. [ATP] /[ADP].[Pi]
•V
cytcytochrom c oxidasové reakci je konečný krok řetězce elektronů ireversibilní.
• Cytochromoxidasa je řízena dostupností substrátů [NADH] / [NAD+] a [ATP] / [ADP] .[Pi].
• Čím vyšší je poměr [NADH] / [NAD+]
a nižší [ATP] / [ADP] .[Pi], tím vyšší je koncentrace redukovaného cytochromu c [c2+] a vyšší cytochrom c oxidasová aktivita.
Regulace oxidativní fosforylace – glykolýza, citrátový cyklus
• Vliv poměru NADH/NAD+
• Inhibice fosfofruktokinasy citrátem
Regulace oxidativní fosforylace poměrem ATP/ADP – regulace akceptorem
Regulace oxidativní fosforylace poměrem ATP/ADP – regulace akceptorem
Respirační kontrola
• Elektrony jsou trasportovány na O2 tehdy, když je současně ADP fosforylováno na ATP. • Kontrola hladinou ADP.
Inhibitory blokující elektronový transportní řetězec -0.4 NAD+ (-0.315 V)
NADH
2 eKOMPLEX I D°´= 0.360 V (DG = -69.5 kJ.mol-1)
-0.2
0
(+0.031 V) Sukcinát
2 e-
Fumarát
D°´(V)
+0.2
FADH2
ADP + Pi
Rotenon, amytal
ATP
CoQ (+0.045 V)
KOMPLEX II
KOMPLEX III D°´= 0.190 V (DG = -36.7 kJ.mol-1)
ADP + Pi Antimycin A ATP
Cytochrom c (+0.235 V) +0.4
+0.6
KOMPLEX IV D°´= 0.580 V (DG = -112 kJ.mol-1)
ADP + Pi CNATP
2 e-
+0.8
2 H+ + 1/2 O2
H2O (+0.812 V)
Inhibitory blokující elektronový transportní řetězec
Inhibitory blokující elektronový transportní řetězec
• Rotenon – rostlinný toxin používaný indiány na Amazonce k lovu ryb, také insekticid)
• Amytal – barbiturát. • Antimycin – antibiotikum.
• Proč lze inhibici rotenonem zrušit přídavkem sukcinátu??
Inhibitory blokující elektronový transportní řetězec OCH3
CH3
H3CO H
O
H2C
O
H
O
O
Rotenon
O
CH2
N H
O NH
-
C
Kyanid
O
Amytal
O N
CH2 CH3
CH3
H
CH3
CH2
HN O
CH
O
CH3
H3C OH HN
CHO
Antimycin A
O
O
(CH 2)5
O H3C
CH3 CH2
CH3
Rozpojovače oxidativní fosforylace. Probíhá respirace – netvoří se ATP
Rozpojovače oxidativní fosforylace. Probíhá respirace – netvoří se ATP
MATRIX
CYTOSOL
+
Nízká [H+]
Vysoká [H ]
-
OH
O
NO2 +
H
OH NO2
+ NO2
NO2
2,4-Dinitrofenol (DNP)
-
O NO2
Difuze
NO2
+
NO2
2,4-Dinitrofenol (DNP)
NO2
+
H
Funkce odpojovacího proteinu UCP-1
Thermogenin UCP-1 protein) • hnědá adiposní tkáň bohatá na mitochondrie (zazimující živočichové, novorozenci, zvířata adaptovaná na zimu) • dimer (2x32 kDa) • u zvířat adaptovaných na chlad – 15 % proteinů mitochondriální membrány hnědé adiposní tkáně
Funkce odpojovacího proteinu UCP-1
Regulace na úrovni proteinkinasy závislé na AMP • Proteinkinasa závislá na AMP v játrech svalech a CNS • Při vysoké spotřebě ATP je ADP přeměňován adenylátkinasou na ATP a AMP • AMP aktivuje proteinkinasu závislou na AMP fosforylacíe řady enzymů - aktivace katabolických drah - inaktivace anabolických drah
2 adenylátkinasa 3 proteinkinasa závislá na AMP
Produkce ATP
