Optické mikroskopy. 1) Úvod + 2) použití

Optické mikroskopy Osnova : 1) Úvod 2) Použití 3) Historie 4) Princip zobrazení 5) Složení optického mikroskopu 6) Základní používané pojmy 7) Vady čoček + typy objektivů 8) Seznam firem na trhu 1) Úvod + 2) použití Z knížky Mikroskop - přístroj určený k pozorování drobných předmětů n. k rozlišení podrobností na pozorovaném předmětu Druhy mikroskopů podle způsobu zobrazení předmětu • elektronové (proud elektronů) • tunelovací (kontakt jednoatomového hrotu s atomy povrchu vzorku → rozdíl potenciálů → vznik proudu) • světelné (světelný paprsek) podle osvětlení objektu ….. v procházejícím světle ( světlo prochází pozorovaným objektem) ….. v dopadajícím světle ( světlo dopadá na povrch objektu) podle osvětlení okolí objektu ….. ve světlém poli (objekt má tmavý obrys a nalézá se ve světlém poli) ….. v temném poli (světlý objekt v temném poli, méně se používá) Adresa: [email protected] Mikroskopické metody Optická mikroskopie

Optická mikroskopie umožňuje pozorovat mikroskopické objekty a struktury do 1000násobného zvětšení bez speciálních úprav mikroskopu a při běžné přípravě vzorků broušením a leštěním nebo rozložených na skleněné podložce. Pozorování neleštěných povrchů v odraženém světle je u běžných mikroskopů možné jen u malých zvětšení pokud je nerovnost povrchu menší než hloubka ostrosti použitého objektivu. Pozorování neleštěných povrchů při větším zvětšení umožňuje konfokální mikroskop, dosahující zvýšenou hloubku ostrosti speciální konstrukcí optické soustavy nebo speciální software SIS Extended Focal Imaging, který dosahuje zaostření snímku objektu digitální rekonstrukcí série snímků pořízených při rozdílném zaostření. Optická mikroskopie umožňuje pozorovat vzorky v přirozeném stavu včetně vlhkosti a s malými úpravami též při nižších nebo vyšších teplotách.

1

Mikroskopická laboratoř FSv ČVUT je vybavena optickými mikroskopy ZEISS Neophot 21, Metaval, Amplival s mikrotvrdoměrem PAAR a videomikroskopem OLYMPUS OVM 1000NM, majícím objektivy se zvýšenou hloubkou ostrosti. Optická mikroskopie a obrazová analýza Systém obrazové analýzy byl v laboratoři uveden do provozu na počátku roku 1997. Skládá se ze tří částí: z optického mikroskopu, makro soustavy a PC s obrazovou analýzou. Optický mikroskop s mikrofotografickým zařízením umožňuje pozorování mikroskopických preparátů v procházejícím i v odraženém světle při zvětšení 1000x a při použití zoomu pak ještě větším. K dalšímu příslušenství patří vybavení pro epifluorescenci, dále pro temné pole, polarizované světlo a Nomarského DIC v odraženém i procházejícím světle. Makro soustava je tvořena repro stativem s osvětlovací soustavou. Na stativ je možno připevnit barevnou CCD video kameru s makro video zoom objektivy, které umožňují vytváření dokumentačních snímků nebo obrazů s různým zvětšením a nahrazují tak částečně stereomikroskop. Obrazy z mikroskopu nebo z makrooptiky snímané barevnou TV 3 CCD kamerou nebo černobílou CCD kamerou mohou být archivovány, softwarově upravovány, proměřovány a dále matematicky zpracovávány. Využití v celních laboratořích Optický mikroskop ve spojení s obrazovou analýzou je využíván např. v analýze papíru pro zjištění přítomnosti anorganického nátěru a stanovení vlákninového složení. U keramických dlaždic se posuzuje glazování. U dřevin se podle buněčné stavby rozlišují jejich druhy. Dále tato technika nachází uplatnění při rozlišování druhů vláken, škrobů, měří se tloušťka tenkých vrstev apod. Makro soustava se používá k dokumentaci vzorků, při posuzování heterogenních směsí, měření velikosti částic u sypkých materiálů, při rozlišení dřevovláknitých desek apod. Rozsah aplikací celého systému je velký a dále se rozšiřuje podle problémů, které vyvstávají u nově analyzovaných vzorků.

glazovaná dlaždice, polarizované odražené světlo, zvětšení 200x

příčný řez tropickou dřevinou Seraya, procházející světlo, zvětšení 200x

2

Z knížky

Na principu mikroskopu jsou založeny Stereomikroskopie (prostorové zobrazování objektu, přístroj - stereomikroskop) Mikrofotografie (znázornění objektu pomocí fotografie,přístroje - fotokamera, zaostřovací zařízení, expoziční automat…) Mikrokinematografie (filmování pohyblivých obrázků) Mikrofotometrie (měření světelných intenzit, fotometr spojený s mikroskopem, fotonásobič,…) Inverzní m. (pozorování objektů zespodu, přístroj – inverzní mikroskop, objektiv má pod stolkem, kondensor nad ním ) Mikromanipulace, mikrokultivace, m. za speciálních podmínek řada dalších……….. Adresa – mikroskopy.cz Optická mikroskopie je základem mikrostrukturální analýzy už přes 100 let. Tvar a technika mikroskopu se během posledních 40 let změnily jen málo, přičemž k největšímu pokroku došlo v oblasti vícenásobných optických vrstev (multilayer coating) sloužících k redukci nežádoucích odrazů světla na povrchu skel. Co se ale opravdu změnilo, je přístup k přípravě povrchu pro mikrostrukturální analýzu. Ta dnes dosahuje celistvosti vzorku a povrchové planarity na úrovni, která dříve byla nedosažitelná. Pokud se povrchová planarita mezi fázemi složky pohybuje v rozsahu jednoho mikrometru (1µm), je možné plně využít interferenčních technik. Další dimenzi získává analýza vzorku v případě průsvitných materiálů připravených celistvě a zkoumaných na tmavém poli. Při přípravě drolivých materiálů pomocí drcení, které zamezuje obrušování povrchu, je možné optickou aktivitu zesílit pomocí polarizačních technik. Při pozorování přesného obrazu uhlíkových vláken můžeme pomocí potlačení barev určit jejich směrovou orientaci. Lze doložit, jak použití nesprávné techniky může vést k chybné analýze, a také že pro získání komplexního pohledu je důležité použít kombinované optické techniky. Tato přednáška se proto zaměřuje na vizuální stránku, přičemž používá řadu mikrofotografií, které dokumentují autorovy rozsáhlé zkušenosti jak v přípravě povrchů, tak v používání technik optické mikroskopie. Adresa - httpstaffold.vscht.czktkwwwrootstaffkratkaBrno%202001.htm

Praktické využití mikroskopie v potravinářství J. Krátká, M. Maryška*, M. Voldřich, F. Kvasnička, R. Ševčík, P. Skálová, M. Dušek *

Ústav konzervace potravin a technologie masa Ústav skla a keramiky

Abstract:

3

Food processing is accompanied by various technological defects and faults, some of them are important for the quality of product or can influence its safety. The mentioned faults or technological defects can result from the technology or from external factors (work power, equipment, premises, hygiene, etc.). The faults and defect are prevented by the quality assurance systems, the food safety defect by HACCP. These systems need suitable monitoring , the optical macro and microscopy combined with computer image analysis could be a useful tool for this purpose (detection of clouds and sediments in drinks, identification of foreign bodies in food, etc.). Detection of authenticity of food products seems to be another perspective field of the use of the mentioned methods, especially evaluation of powdered products (spices, tea, coffee, addition of non permitted or undeclared additives into the powder products, etc.), detection of pulp particles in fruit juices, identification of botanical origin, etc. The presentation includes the examples of the use of these procedures for identification of clouds and sediments in spirits, detection of falsification of milled pepper, identification of foreign bodies in vine and others.

Mikroskopie jako taková, je rychlá a jednoduchá metoda, pro kterou zpravidla není třeba složitě připravovat vzorky. Zároveň umožňuje ve spojení s digitálním fotoaparátem či digitální kamerou pořízení a uchování velkého množství dat. Tak je možné vytvořit širokou databázi zjištěných závad potravinářských komodit, doplněnou o souhrnné informace použitých metod izolace vzorků a jejich přípravy. Takto vytvořenou základní databázi je možné průběžně doplňovat výsledky příslušné chemické analýzy upřesňující vlastní mikroskopické stanovení. Kompletní a průběžně aktualizovanou informační databázi lze použít jak k rychlému určení problému a rozhodnutí o dalším postupu při rozboru vzorku, tak i k vyhledávání zpětných informací o již provedených nálezech. Při využití moderní techniky je archivace získaných dat nenáročná, levná a téměř bez nároků na skladovací prostor a údržbu dat. V současnosti tak lze uchovávat na poměrně malém disku nejen textové a datové soubory v podobě snímků, ale i ve formátu celých video sekvencí. V naší práci bylo používáno světelného mikroskopu s možností polarizace světla, digitálního fotoaparátu, kamery a softwaru Lucia , umožňujícího zpracování digitálních snímků. Při detekci různých složek zkoumaných vzorků potravinářských výrobků je někdy nezbytné použít metody mikroskopie v polarizovaném světle. Z izotropních a anizotropních vlastností látek lze potom odhadnout jejich iontovou a molekulární strukturu. Mezi anizotropní látky řadíme takové, které propouštějí polarizované světlo do určité roviny rychleji než světlo kmitající kolmo na tuto rovinu. Tato vlastnost se projevuje např. u škrobu, buněčných stěn, fibril, jaderné membrány, krystaly atd. Jsou to látky s pravidelnou orientací základních stavebních složek. Hlavním předmětem této práce je za prvé detekce příčin zákalů ve výrobě různých typů alkoholických a nealkoholických nápojů, za druhé pak detekce falšování potravin přidáváním levnějších a lehce dostupných příměsí. Detekci příčin zákalů v tekutých výrobcích lze rozdělit na dva směry.

4

•

Makroskopické zkoumání výrobků zahrnuje především určení mikrobiologické příčiny zákalu. Přitom sledujeme změnu barvy výrobku, vývoj plynů, vznik přípachů a pachuti, změnu konzistence a všeobecně změnu senzorických vlastností daného výrobku; • Mikroskopické zkoumání navazuje na makroskopické a jeho cílem je dále prohloubit znalosti o původu zákalu. Sledujeme obsah nežádoucí mikrobiální kontaminace (obsah kvasinek, plísní a bakterií), popřípadě detekujeme obsah částic rostlinných pletiv, organických nebo anorganických přimísenin či sloučenin, vzniklých z přidaných činidel. V zásadě je možné rozdělit příčiny vzniku zákalů do několika skupin: 1. zákaly anorganického původu: 2. zákaly organického původu :

3. zákaly biologického původu:

Fe, Cu, Sn, Al, azbestová a celulózová vlákna vinný kámen, vápenaté soli kyseliny vinné, slizové a šťavelové, bílkoviny a jejich komplexy s polyfenoly a ionty kovů, třísloviny a jejich komplexy s pektiny, škrob kvasinky, plísně a bakterie

K potvrzení mikroskopického nálezu lze použít na příklad barevných reakcí zákalů s reagenčním činidlem. K dalším kvantitativním a kvalitativním stanovením lze pak využít některých instrumentálních metod. V našem případě bylo zpravidla používáno isotachoforetické stanovení kationtů. Druhým, neméně podstatným směrem našeho výzkumu, je využití mikroskopie k detekci falšování potravinářských výrobků. Zkoumaný vzorek lze opět prověřovat jak makroskopicky tak mikroskopicky. Lze tak ověřit botanické znaky specifické pro daný druh a prokázat identitu prověřovaného zboží. Zároveň lze mikroskopii použít pro sledování některých úseků technologických operací. Lze tak např. kontrolovat mletí kakaové hmoty či funkci emulgátorů a homogenizátorů. Mikroskopický rozbor vybraných komodit: 1. Med: Mikroskopickým zkoumáním jeho sedimentu lze určit podle druhu (velikosti, tvaru a specifických znaků) pylových zrn druh medu. Lze tedy bezpečně určit jeho botanický původ (akátový, lipový, luční, lesní). Zároveň lze, v návaznosti na předchozí stanovení, určit dobu květu a tak stanovit zda se jedná o med jarní, letní nebo podzimní. Stejně tak lze stanovit i geografický původ medu. Tento fakt je důležitý zejména při dokazování úmyslné deklarace medu jiného původu (např. pravého anglického medu s nálezem pylových zrn typické australské flóry). U zkaženého medu lze pak vždy detekovat zvýšený výskyt kvasinek, plísní nebo bakterií. 2. Výrobky z ovoce a zeleniny: Jedná se především o různé druhy marmelád a džemů. Jejich mikroskopickým rozborem a určením charakteristických biologických znaků jednotlivých druhů lze potvrdit nebo vyvrátit

5

pravost a množství deklarovaného ovocného základu. U sušených výrobků lze mikrobiologickou detekci využít k identifikaci povrchových roztočů a nedoporučit nebo vyloučit takový výrobek z distribuční sítě. 3. Koření: Při mikroskopickém rozboru koření lze zkoumat řadu parametrů typických pro daný botanický druh. Lze tak od sebe rozlišit kvalitní a nekvalitní zboží, co se týče kvality jednotlivých rostlinných druhů. Zároveň lze potvrdit či vyvrátit podezření z nastavení výrobku některou z dostupnějších a levnějších komodit ( nastavení pepře škrobem). Při rozboru koření se tak sledují především tvary a velikost buněk, trichomů, sekrečních kanálků, zásobních buněk a škrobových zrn. Dále se sleduje struktura povrchu listů a průduchů po obou jejich stranách, tvar a velikost pylových zrn, sklerenchymatických buněk. Mikroskopicky lze rovněž detekovat pro daný druh charakteristické sloučeniny (např. šťovan vápenatý ve vanilce, oxalát vápenatý v česneku). 4. Káva: Mikroskopickým rozborem kávy lze určit její pravost, tzn. botanický druh deklarovaného zboží. Dále lze ve výrobku detekovat možný obsah kávovinových náhražek, jako jsou fíky, čekanka, řepa, pampeliška, žito nebo ječmen.

5. Mlýnské výrobky: U mlýnských výrobků se mikroskopicky detekují především různé typy jednoduchých a složených škrobových zrn, aleuronových buněk a různě veliké úlomky oplodí a osemení. Lze tak u nich určit druh použitého základu a u směsí i přibližný poměr jednotlivých mouk. Cílem přednášky nebylo přinést vyčerpávající přehled možností, ale informovat o stavu projektu, na jehož řešení se v rámci postgraduálního studia podílím. Do budoucna předpokládám, že budeme rozvíjet především postupy identifikace technologických vad u potravin z ovoce, zeleniny, koření a dalších příbuzných produktů, rádi bychom pokračovali v přípravě databáze pro identifikaci fyzikálních nebezpečí ve vztahu k HACCP. Vzhledem k falšování potravin bude postup zřejmě doplňkem k analýzám autenticity prováděných na základě analýzy chemických markerů. 3) Historie Již od pradávna toužil člověk vidět věci menší než ty, které mohl vidět pouhým okem. Prvním krokem k tomu bylo zvládnutí techniky broušení čoček do brýlí italskými mnichy ve 14. století. Tato technika se rychle rozšířila po Evropě. Někteří optici začali upozorňovat, že pomocí dvou čoček lze vidět věci zvětšené.

6

Patrně jako prvý sestrojil použitelný mikroskop holandský brusič čoček a výrobce brýlí Zacharias Jansen někdy kolem roku 1590. Při jeho konstrukci použil jak konkávní (vyduté), tak konvexní (vypouklé) čočky. Italský astronom a matematik Galileo Galilei vylepšil Jansenův vynález a použil jej k vědeckým účelům, např. aby prozkoumal mravenčí oko. Ale teprve Anthony van Leeuwenhoek, holandský obchodník s látkami z Delftu, přispěl významnou měrou ke zdokonalení dosud primitivního přístroje Jeho koníčkem bylo foukání skla a jemná práce s kovem. Vymyslel, jak přesně vybrousit čočky a jak je sestavit a upevnit, aby vytvořily silný zvětšovací efekt. Díky svému mikroskopu mohl zkoumat strukturu vláken látek které prodával. Později začal také zkoumat listy, květiny a drobné organizmy, např. včely nebo vši. Studoval rovněž lidskou krev, kůži a vlasy. Jako první na světě viděl a popsal krevní buňky.

Van Leeuwenhoek (1632-1723) (převzato z http://neon.chemistry.ox.ac.uk/icl/heyes/structure_of_solids/Lecture1/leeuwenhoek.jpg) Van Leeuwenhoek sice dokázal nedocenitelný přínos mikroskopu v mnoha oblastech vědy, jeho přístroj však byl jednočočkový. Tím byly možnosti mikroskopu značně omezeny (přestože jeho čočky zvětšovaly až 270x). V roce 1665 vynalezl anglický fyzik a chemik Robert Hooke tzv. složený mikroskop s více čočkami. Zkoumal jím slabé plátky korku, který byl vyhledávaným materiálem loďařského průmyslu. přitom zjistil, že živé látky jsou tvořeny buňkami.

7

Van Leeuwenhoekeův mikroskop (převzato z http://www.ucmp.berkeley.edu/history/leeuwenhoek.html) V lékařském světě použil mikroskop např. Francouz Luis Pasteur při objevu kvasinek nebo Robert Koch při objevu bacilů tuberkulozy a cholery.

8

Němec Carl Zeiss vyrobil první mikroskop ("Stand 1") v r. 1857 (převzato z http://micro.magnet.fsu.edu/optics/timeline/people/zeiss.html)

V 19. století prožívá mikroskop dramatický vývoj. Přispěli k tomu především Carl Zeiss, který věnoval významné úsilí výrobě mikroskopů, Ernst Abbe, jehož jména je spojováno s teoretickou studií optických principů a Otto Schott, který vedl výzkum optického skla.

Zeissův mikroskop z roku 1934 (převzato z http://www.neurosurgery.org/cybermuseum/artgallery/collect/room1.html#zeiss)

9

Optický (paprskový) mikroskop dosáhl ve 30. letech své teoretické hranice. Ta je limitována 500násobným nebo 1000násobným (2000násobným) zvětšením a rozlišením 0,2 mikrometru. Vědci však chtěli vidět detaily buněk. To vyžadovalo zvětšení řádově 10 000násobné.

Ernst Ruska (převzato z http://neon.chemistry.ox.ac.uk/icl/heyes/structure_of_solids/Lecture1/ruska.jpg)

Bylo tedy nutno zkonstruovat mikroskop na jiném principu. Místo světelného paprsku se zde využívá elektronový paprsek (tok rychlých elektronů), místo skleněné čočky čočka magnetická. První mikroskop na tomto principu byl vyvinut v Německu v roce 1931 a zasloužili se o to především Max Knoll a Ernst Ruska. Byl to tzv. prozařovací elektronový mikroskop (TEM – Transmission Electron Microscope), kdy elektronové paprsky procházely zkoumaným předmětem (urychlovací napětí až 20 kV) a vytvořily stínový obraz (jako např. při promítání diapozitivu). Druhý typ elektronového mikroskopu, tzv. skenovací (SEM – Scanning Electron Microscope), se objevil v roce 1942, komerčně však byl požíván až kolem roku 1965, kdy se podařilo zvládnout skenování (postupné bombardování elektrony) vzorku (podobně jako např. při skenování fotografií). U tohoto typu mikroskopu je nutné urychlovací napětí pro elektrony 60 až 80 kV a jejich zvětšení je 30 000násobné a s kombinací s mikroskopem optickým až 100 000násobné.

10

Elektronový mikroskop z roku 1938 (převzato z http://helios.physics.utoronto.ca/%7Einteract/microsco/microscopy.htm)

Adresa – zeiss.cz Robert Koch, Nobelpreis für Medizin 1905. Koch gilt als Begründer der modernen Bakteriologie. Der Landarzt entdeckte in den 80er Jahren des vorigen Jahrhunderts die Tuberkelbazillen und Choleraerreger. "Verdanke ich doch einen großen Teil meiner Erfolge Ihren ausgezeichneten Mikroskopen", schrieb Koch an Zeiss; 1904 erhielt er das 10.000ste Objektiv homogener Immersion zum Geschenk.

11

Richard Zsigmondy, Nobelpreis für Chemie 1925. Der Göttinger Professor führte bahnbrechende Arbeiten auf dem Gebiet der Kolloidchemie aus. Er erfand 1903 das Ultramikroskop, 1918 den Membranfilter und 1922 den Ultrafeinfilter. Die Spaltultramikroskopie (nach Siedentopf/Zsigmondy) läßt winzig kleine Teilchen sichtbar werden, deren Linearausdehnung unter der Auflösungsgrenze liegt. Frits Zernike, Nobelpreis für Physik 1953. Der niederländische Physiker entdeckte 1930 beim Experimentieren mit Reflektionsgittern, daß er die Phasenlage der einzelnen Lichtstrahlen beobachten konnte, und wollte diese Erkenntnis auf das Mikroskop übertragen. Zusammen mit Zeiss entwickelte er das erste Phasenkontrastmikroskop, 1936 als Prototyp hergestellt. Es ermöglichte ein Studium lebender Zellen, ohne sie durch chemische Färbung zu schädigen

Manfred Eigen, Nobelpreis für Chemie 1967. Der Biophysiker und Gründer des Max-Planck-Instituts für Biophysikalische Chemie in Göttingen entwickelte ein Verfahren zum Einzelmolekül-Nachweis. Im Zusammenwirken mit seinem schwedischen Kollegen Rudolf Riegler sowie den Firmen EVOTEC und Carl Zeiss gelang 1995 die Herstellung des ersten kommerziell verfügbaren Fluoreszenz-Korrelations-Spektrometers ConfoCor. Erwin Neher, Nobelpreis für Medizin 1991. Zusammen mit Professor Sakmann entdeckte er am Max-Planck-Institut in Göttingen die grundlegenden Mechanismen der Kommunikation zwischen Zellen. Dabei wurden elektrophysiologische Untersuchungen an Ionenkanälen mit der Patch-Clamp Technik durchgeführt.

12

Bert Sakmann, Nobelpreis für Medizin 1991. Für die visuelle Kontrolle bei diesen versuchen benötigten die beiden Wissenschaftler Bilder mit ausgezeichnetem Kontrast und hoher optischer Auflösung. Es wurden speziell für diese Anwendungen konstruierte aufrechte Mikroskope eingesetzt - ausschließlich von Carl Zeiss. Die Grenzen brechen auf, die Grenzen verschwinden. Neue Dimensionen eröffnen sich, die noch vor Jahren als Science-fiction gegolten hätten. Und die technologischen Möglichkeiten ultramoderner Mikroskopie sind noch längst nicht ausgeschöpft. Telemikroskopie rund um den Erdball. Lichtschnelle digitale Kommunikation. Räumliche Bildserien, hochaufgelöst, kontrastreich, zeitecht...

Screening-Technologie von Carl Zeiss ausgezeichnet Jena, 06.12.2002. Für seine herausragenden Leistungen bei der Entwicklung eines Systems zur automatisierten Wirkstoffsuche in der Pharmaforschung hat Dr. Klaus Mlejnek, Leiter des Geschäftsbereiches Molekulare Medizin bei Carl Zeiss Jena, den 2002 SBS Accomplishment Award erhalten. Mit diesem Preis zeichnet die Gesellschaft für Biomolecular Screening (SBS) in jedem Jahr Mitglieder aus, die sich um die Förderung der Wirkstoffsuche verdient gemacht haben. Nach den Worten des Präsidenten der SBS, Dr. Thomas D.Y. Chung, wird die Beteiligung Dr. Mlejneks "an der Entwicklung des innovativen modularen Zeiss Systems zum Proben-Screening als ein bedeutender Beitrag auf dem Gebiet der Medikamentenentwicklung anerkannt". Das Screening großer pharmazeutischer Substanzbibliotheken hat zum Ziel, schnell geeignete Wirkstoffe für die Medikamentenentwicklung zu finden. Mit dem UHTS-System plate::explorer® von Carl Zeiss können mehrere 100.000 Proben am Tag auf ihre Eignung als potenzielle Wirkstoffe untersucht werden. Herzstück des Systems ist der plate::vision® Multimode Reader, der die vollautomatische Messung von Mikrotiterplatten mit höchster Datenqualität in extrem kurzer Zeit ermöglicht. Das System ist weltweit in der Pharmaindus-trie im Einsatz, so an allen Forschungsstandorten von F. Hoffmann-La Roche. Der mit 1000 US $ dotierte SBS Award wurde auf der 8. Jahrestagung der Gesellschaft für Biomolecular Screening in Den Haag, NL an Dr. Mlejnek übergeben. Die Gesellschaft ist 1994 als Forum des Wissens- und Informationsaustausches zwischen Spezialisten der Pharmaforschung und damit verbundener Disziplinen gegründet worden. Sie bietet ihren mehr als 2000 Mitgliedern verschiedene Publikationen, Veranstaltungen und Bildungsprogramme.

13

Z knížky Současnost Optický (paprskový) mikroskop dosáhl ve 30. letech své teoretické hranice. Ta je limitována 500násobným až 1000násobným zvětšením a rozlišením 0,2 mikrometru. Rozdělení Podle počtu okulárů: 1) Monokulární

2) Binokulární

3) Trinokulární

14

Podle výsledného obrazu: 1) Fluorescenční 2) Polarizační 3) Interferenční 4) Fázově kontrastní 5) + řada dalších (UV, Rtg, IČ) 4) Princip zobrazení Z knížky Pozorovaný předmět je postaven mezi jednoduchou a dvojitou ohniskovou vzdálenost objektivu tak, aby se zobrazil jako skutečný zvětšený a převrácený obraz – obr.1. Obraz předmětu vzniká v přiměřené vzdálenosti za dvojitou ohniskovou vzdáleností zvanou optický interval (délka optického tubusu). Je určena mechanickou délkou tubusu, která se měří od dosedací plochy objektivu k dosedací ploše okuláru. Není pro všechny objektivy stejná a obvykle se pohybuje okolo 170 mm. Tento obraz pak pozorujeme okulárem jako lupou a získáme neskutečný a zvětšený obraz – obr.2. Adresa – mikroskopy.cz Diagram optické dráhy Na následujícím obrázku je znázorněn diagram optické dráhy s mikrofotografickým zařízením.

2. Princip zvětšení Činnost mikroskopu je založena na vhodném uspořádání dvou systémů s konvexními čočkami. Při tomto uspořádání dochází ke zvětšení vzorku. V blízkosti vzorku je systém konvexních čoček Lo, který se nazývá objektiv. Tento objektiv vytváří skutečný obraz A' B' se zvětšením 1 až 100. V blízkosti oka je systém čoček Le, který se nazývá okulár, má zvětšení 20 až 50 a vytváří neskutečný obraz A"B". Obrazový prostor je ve vzdálenosti asi 250 mm od oka. Člověk tedy pozoruje zvětšení odpovídající obrazu A"B".

15

Pozorovaný předmět je postaven mezi jednoduchou a dvojitou ohniskovou vzdálenost objektivu tak, aby se zobrazil jako skutečný zvětšený a převrácený obraz – obr.1. Obraz předmětu vzniká v přiměřené vzdálenosti za dvojitou ohniskovou vzdáleností zvanou optický interval (délka optického tubusu). Je určena mechanickou délkou tubusu, která se měří od dosedací plochy objektivu k dosedací ploše okuláru. Není pro všechny objektivy stejná a obvykle se pohybuje okolo 170 mm. Tento obraz pak pozorujeme okulárem jako lupou a získáme neskutečný a zvětšený obraz – obr.2.

2. Aperturní clona kondenzoru Tato clona je připevněna k čočce kondenzoru a používá se k řízení rozlišení, kontrastu a hloubky ostrosti. Tyto parametry však nelze nastavit nezávisle. Rozlišení

Kontrast

Hloubka ostrosti

Jas

Aperturní clona kondenzoru zcela otevřená

Velké

Malý

Malá

Velký

Aperturní clona kondenzoru zcela zacloněná

Malé

Velký

Velká

Malý

Obecně lze říci, že optimální nastavení aperturní clony kondenzoru je 70-80% numerické

16

apertury objektivu. Pokud je tato clona zacloněná více než na 70%, pak dochází ke snížení jasu. Současně se však zvětšuje kontrast a hloubka ostrosti se zvětší dvakrát.

Adresa - httpwww.physics.muni.cz~kubenaoptika1sld001.htm httpwww.physics.muni.cz~kubenaModerni%20metody31_souboryframe.htm

a mnoho dalších.....

17

Z knížky Pro přesměrování světla do fotografického přístroje nebo televizní kamery jsou určeny trinokulární tubusy. Mikroskop však může mít pro fotografický přístroj nebo televizní kameru jeden i více samostatných výstupů. Jednoduché trinokuláry dělí světelné paprsky zrcadly, lepší jsou vybavené hranoly. 5) Složení optického mikroskopu + 6) Základní používané pojmy Adresa - httpwww.arid.cznikcovite.htm Víte všechno o světelných mikroskopech ? Rádi bychom Vám pomohli osvěžit a rozšířit si znalosti o mikroskopech. Nabízíme Vám krátký souhrn poznámek o světelných mikroskopech, používaných převážně v biologii a medicíně. Přivítáme Vaše připomínky a přání k textu, který Vám předkládáme.

Světelný mikroskop je optická soustava, určená k pozorování drobných - mikroskopických - objektů při velkém zvětšení až 1000x, případně 1500x. Hranice zvětšení ve světelném mikroskopu je dána vlnovými vlastnostmi světla. Obrazy z mikroskopu pozorujeme zrakem, takže o výsledné kvalitě obrazu rozhoduje nejen technická dokonalost mikroskopu, ale také psychofyziologická kondice uživatele.

Základní díly mikroskopu: Stativ Úplný mikroskop se skládá z mechanického tělesa, které tvoří stativ se stolkem, tubusem a osvětlovací soupravou s kondenzorem, a z optických dílů: okulárů a objektivů v otočném revolverovém nosiči. U běžných mikroskopů nejsou jednotlivé díly pevnou součástí stativu, lze je vyměňovat a sestavit tak mikroskop různým způsobem podle požadavků metody, kterou chceme použít. Mluvíme pak o “stavebnicových” mikroskopech. Jednotlivé díly mikroskopů se často nazývají "moduly". Zaostřování obrazu v mikroskopu se provádí změnou pozorovací vzdálenosti dvojitým souosým knoflíkem na obou stranách stativu mikroskopu. Vnější - větší - knoflík je pro hrubé nastavení, vnitřní menší - knoflík pro jemné zaostřování. Knoflík jemného posunu bývá opatřen stupnicí, nejmenší dílek odpovídá obvykle posunu o 1µm. Posun může být opatřen nastavitelnou zarážkou, vymezující pohyb ve směru zmenšování pozorovací vzdálenosti - to ulehčuje návrat do roviny ostrosti při výměně vzorků. Rovněž je obvyklé, že můžeme nastavit odpor proti pohybu při zaostřování (samostatným prstencem na společné ose se zaostřovacími knoflíky). Zaostřování se u vzpřímených mikroskopů děje svislým pohybem stolku, při zaostřování inverzních mikroskopů se může pohybovat revolverový nosič objektivů - stolek má pak pro uložení preparátu pevnou základní desku, která je součástí stativu a po ní se pohybuje vodič preparátu. Stolek mikroskopu slouží pro uložení pozorovaného vzorku do optické osy mikroskopu. Preparáty jsou nejčastěji na standardních podložních sklíčkách (76x26x1mm), bývají většinou zakryty krycím sklíčkem. U krycího sklíčka je nutno dbát na jeho kvalitu, má mít tloušťku přesně 0,17mm, být zcela čiré a planparalelní. Na tloušťku 0,17mm jsou vesměs korigovány objektivy, není-li tato hodnota dodržena, může to mít za následek zhoršení obrazu. Některé dražší objektivy jsou vybaveny korekcí na tloušťku krycího skla. To má význam hlavně u inverzních mikroskopů, kde preparát často pozorujeme přes Petriho misku nebo dno skleněné kultivační nádoby.

18

Dříve měly jednoduché mikroskopy stolky, opatřené dvěma svorkami, které přidržovaly podložní sklíčko s preparátem - vyhledávání se provádělo ručním posunováním sklíčka po stolku. Moderní mikroskopy mají vodič objektu (vodič preparátu), do kterého se upíná podložní sklíčko (nebo jiný nosič) s preparátem. Posun se provádí po ploše stolku ve dvou osách dvojitým souosým vrubovaným knoflíkem, umístěným většinou na pravé straně stolku tak, aby jej bylo možné pohodlně obsluhovat. Většinou je pohyb možné sledovat na stupnicích s milimetrovým dělením. To usnadňuje vyhledání místa na preparátu. Vodiče objektu mikroskopů NIKON Eclipse jsou upraveny k současnému uložení až dvou podložních sklíček. Povrch stolku je často vystaven působení různých chemikálií, bývá opatřen odolným nátěrem nebo volitelně keramickou vrstvou. Stolky inverzních mikroskopů jsou upraveny pro uložení velkých objektů - Petriho misek, Terasakiho komůrek nebo kultivačních lahví. Polarizační mikroskopy mají kruhové otočné stolky, opatřené stupnicí (360°). Tubus je základním dílem stativu a vsazuje se do něho nástavec pro okuláry, vesměs výměnný a upravený pro jeden nebo dva okuláry (monokulární nebo binokulární tubus), případně s dalším optickým výstupem (trinokulární tubus). Na opačném konci je k tubusu je připevněn otočný revolverový nosič objektivů, do kterého se závitem upevňují objektivy. Optická a mechanická délka tubusu patří k základním parametrům mikroskopu. Osvětlovací souprava se skládá ze síťového transformátoru na 220V/50Hz s regulací výstupního napětí (6 nebo 12 V=), kterým se napájí halogenová žárovka o výkonu 20 až 100W. Mikroskopy s vyšším výkonem žárovky mají samostatnou lampovou skříňku, nutnou pro lepší odvádění tepla, která se ke stativu připevňuje bajonetem. Velké mikroskopy mají v samostatné skříňce také napájecí transformátor. Regulace světelného výkonu žárovky se pak může provádět buď na tomto zdroji, nebo je přenesena do stativu (volitelné). Vzhledem k tomu, že se jen malá část výkonu žárovky promění ve světelné záření a zbytek (kolem 90%) v teplo, je nutné dbát na to, aby kolem lampové skříňky mohl volně proudit vzduch. Otočný revolverový nosič objektivů může pojmout pět až šest objektivů, které se do něj upevňují závitem. Revolverový nosič je připojen ke stativu buď trvale, nebo je výměnný. Výměnný revolver je výhodný při používání více druhů objektivů, pro metodu DIC je to podmínka (revolverový nosič pro tuto metodu musí být upraven pro zasunutí hranolů). Kondenzor. Abychom mohli osvětlení v mikroskopu účelně nastavit, je v dráze paprsků osvětlovací soustavy kondenzor, který je součástí osvětlovací soustavy mikroskopu. Rozlišovací schopnost objektivů mikroskopu může být dokonale využita jen tehdy, je-li osvětlení preparátu provedeno pomocí kondenzoru kuželem paprsků o určité nejmenší apertuře. Kondenzor je umístěn (u vzpřímených mikroskopů) pod stolkem, nesoucím preparát. Bývá většinou svisle posuvný v samostatném pomocném stolku, ze kterého jej lze snadno vyjmout. Důležité je, aby optická osa osvětlovací soustavy procházela středem kondenzoru. Toho dosáhneme přesným vystředěním jeho polohy pomocí středících šroubů. Kondenzor je opatřen irisovou clonou, ovládanou páčkou. V lepším případě se tato páčka pohybuje podél stupnice, udávající numerickou aperturu kondenzoru. Tuto hodnotu potřebujeme ke správnému nastavení. Numerická apertura kondenzoru má být vždy menší, než je apertura objektivu (přibližně 70%). Při nastavování osvětlení (včetně kondenzoru) postupujeme podle návodu, který navrhl Köhler (tzv. Köhlerovo nastavení - je popsáno dále). Základní typy kondenzorů jsou většinou podle svého konstruktéra jsou označeny jako Abbeho kondenzory, jsou vhodné pro objektivy se zvětšením od 4x až do 100x. Při použití objektivů s malým zvětšením mohou nastat potíže, protože se neosvětlí rovnoměrně celé zorné pole. Pro objektivy s malým zvětšením (2x až 0,5x) jsou k dispozici kondenzory s nízkou numerickou aperturou. Takové kondenzory se však nehodí pro objektivy s velkým zvětšením. Velmi kvalitní obraz při použití objektivů s olejovou imerzí zajišťují kondenzory pro olejovou imerzi - na ně se - podobně jako na preparát - nanese kapka imerzního oleje, takže paprsky procházejí po výstupu z kondenzoru homogenním prostředím se stejným indexem lomu. Zvláštní konstrukcí se vyznačují tzv. univerzální kondenzory. Mají vestavěný karusel, ovládaný zvenčí, do kterého jsou vloženy volitelné moduly: fázové prstence, prstenec pro tmavé pole, případně může být tento kondenzor vybaven moduly pro diferenciální interferenční nebo Hoffmanův kontrast. Vložené prstence jsou obvykle příslušné k objektivu. Pro fázový kontrast bývají označeny jako Ph1,

19

Ph-2 atd., tyto údaje jsou též na fázových objektivech. Podobné prstence se vkládají do kondenzoru při použití Hoffmanova kontrastu. Univerzální kondenzor může být upraven pro diferenciální interferenční kontrast podle Nomarského (DIC). Karusel kondenzoru pro DIC má jinou mechanickou konstrukci, která umožňuje vkládání hranolů. Pro pozorování v tmavém poli (v zástinu) musí být kondenzor rovněž vybaven doplňkem (clonou) pro tento způsob pozorování. Inverzní mikroskopy mají optickou soustavu "vzhůru nohama", tj. objektivy jsou pod preparátem a kondenzor s osvětlovací soupravou nad ním. Zde často záleží na tom, aby mezi výstupní čočkou kondenzoru a pozorovaným preparátem byl dostatečný prostor pro manipulaci (např. pro mikromanipulátory). Proto jsou kondenzory a podobně i objektivy u inverzních mikroskopů sestrojeny tak, aby jak pozorovací vzdálenost, tak i vzdálenost mezi preparátem a kondenzorem byly delší, než je běžné. Takové optické prvky bývají označeny LWD (long working distance = dlouhá pracovní vzdálenost), ELWD (extra long working distance), případně i SLWD (super long working distance = mimořádně dlouhá pracovní vzdálenost). Okuláry a tubusy Obraz v mikroskopu pozorujeme okulárem. Novější mikroskopy jsou vybaveny tubusem pro dva okuláry (binokulární tubus), takže obraz pozorujeme současně oběma očima. Obraz však u běžného mikroskopu není stereoskopický, protože se díváme přes jeden, oběma okulárům společný objektiv. Pro malá zvětšení jsou používány stereomikroskopy (preparační lupy), které pozorují obraz stereoskopicky současně dvěma samostatnými optickými systémy. Tubus se dvěma okuláry se nazývá binokulární tubus. Pro přesměrování světla do fotografického přístroje nebo televizní kamery jsou určeny tubusy s dalším výstupem, které se nazývají trinokulární tubusy. Mikroskop však může mít pro fotografický přístroj nebo televizní kameru jeden i více samostatných výstupů. Jednoduché trinokuláry dělí světelné paprsky zrcadly, lepší jsou vybavené hranoly. Poměr mezi množstvím světla, které je vedeno do okuláru a do třetího výstupu může být 100-0% a naopak nebo u lepších trinokulárů kromě toho ještě 80-20% i jiný. Okuláry jsou výměnné. Mohou být rozděleny podle optické konstrukce, podle zvětšení a podle velikosti pozorovaného obrazového pole (které je kruhové). Kritériem pro jakost okulárů je stupeň odstranění tzv. zbytkových vad: barevné vady, sklenutí a astigmatismu. Běžné okuláry mají zvětšení 10x, jsou však okuláry se zvětšením 5x, 12,5x , 15 x a jiné. Průměr zorného pole v okuláru se zmenšuje se stoupajícím zvětšením. Někdy se této veličině říká "číslo pole" - z anglického "field number" (zkratka "F.N."). Průměr zorného pole je závislý též na objektivu. Dobrý mikroskop má pro okuláry 10x průměr zorného pole kolem 20mm, velmi kvalitní mikroskopy mohou mít průměr zorného pole až 25mm. K zobrazení tak velkého zorného pole jsou nutné tzv. širokoúhlé okuláry (ozn. "UW"). Dobré okuláry mají možnost nastavit dioptrickou korekci pro uživatele, kteří nosí brýle. Zaostření obrazu pak závisí též na nastavení dioptrických korekcí v okulárech. Tato okolnost má vliv na správné zaostření mikrofotografického snímku, nemá-li mikrofotografický přístroj samostatný zaostřovací okulár. Měření pomocí mikroskopu Do okuláru se vkládá destička s pomocnou sítí (např. souřadnicové osy X a Y, čtvercová nebo kružnicová síť) nebo měřítko (obvykle 1 mm rozdělený na 100 dílků). Rovněž může být v okuláru fotografická "maska" - rámeček, vymezující obrazové pole snímku. Okulárový mikrometr je samostatná pomůcka, která se vkládá do tubusu místo okuláru a rovněž slouží k měření délek. Pokud nám pro srovnání velikostí stačí relativní hodnoty délek, nemusíme mikroskop kalibrovat. Pro stanovení absolutní velikosti měřených délek potřebujeme ještě objektivové měřítko, kterým pro danou soustavu objektiv - okulár vypočítáme kalibrační faktor. To je číslo, kterým musíme násobit počet dílků okulárového měřítka, abychom dostali měřenou úsečku v jednotkách délky (milimetry, mikrometry atd.).

20

Binokulární tubus má vždy možnost nastavit podle tvaru hlavy uživatele vzdálenost očních pupil. To je nezbytné, mají-li se obraz, pozorovaný každým okem zvlášť, spojit do jediného obrazu. Některým uživatelům to může činit zpočátku potíže. Do výstupu pro připojení fotografického přístroje se do trinokulárního tubusu vkládá projektiv, který má mít vlastnosti, zlepšující rovinatost a chromatickou korekci obrazu. Zvětšení v rovině fotografického snímku není shodné se zvětšením v okulárech, bývá větší. Tento rozdíl je u použití televizní kamery pro snímaní obrazu z mikroskopu ještě výraznější a je nutné s ním počítat. Hlavním důvodem pro tuto neshodu je u televizní kamery jednak to, že její čip je obdélníkový a jeho úhlopříčka je kratší, než průměr obrazového pole mikroskopu a pak také to, že se do adaptéru nevkládá projektiv, jako u fotografického nástavce. Vyrábějí se optické adaptéry, které tuto neshodu odstraňují, avšak nejsou levné.

Objektivy Jsou nejvýznamnější částí mikroskopu, která rozhoduje o jeho kvalitě, jsou objektivy. Jejich vlastnosti prošly dlouhým vývojem - od jednoduché čočky až k dnešním dokonalým objektivům. OPTICKÝ SYSTÉM Nikon CFI60 pro mikroskopy Nikon ECLIPSE Na základě dlouholetých zkušeností s objektivy CF provedl Nikon vývoj nových optických systémů, jehož výsledkem jsou objektivy Nikon CFI60 s vlastnostmi, předstihujícími podobné objektivy jiných značek. Tyto objektivy charakterizuje Nikon označením “redefinice nekonečna”. Na trh byly tyto objektivy zavedeny v r. 1997. Vývoj základních vlastností objektivů Nikon ukazuje tabulka: do r. 1976

1976 – 1996

od r. 1996

parfokální vzdálenost

33,6mm

45mm

60mm

objektivový závit (průměr)

20,3mm

20,3mm

25mm

optická délka tubusu

160mm

160mm

nekonečná

Objektivy Nikon CFI60 mají následující významné vlastnosti: • • • • • •

zdokonalenou kompenzaci zbytkové barevné vady a zdokonalenou rovinatost obrazu prodlouženou pracovní vzdálenost vyšší numerickou aperturu zvětšení 0,5x u objektivu Nikon CFI Macro Plan UW (pro ECLIPSE E800M a E1000M) vysokou propustnost pro uv-záření, významné při fluorescenčních metodách a při diferenciálním interferenčním kontrastu (metoda DIC) delší paralelní optická dráha paprsků při průchodu tubusem z objektivu do okuláru.

“Nekonečná” délka tubusu je mimo jiné výhodná pro vkládání modulů (fluorescence, mikrofotografie, diskusní zařízení, vložky pro zvýšení polohy okulárů atd.) do stativu mikroskopu mezi objektivy a okuláry. Při vkládání modulů není u této optiky nutné, aby měly další optiku (pomocné čočky). Objektivy Nikon CFI60 pro pozorování ve světlém poli jsou dodávány v následujících typech: typ

použitelnost pro

21

CFI Plan Apochromát CFI Plan Fluor CFI Plan Achromát CFI Achromát FF

UV-záření

fluorescenci

DIC

omezeně

ano

ano

ano

ano

ano

nedoporučené

ano

omezeně

omezeně

ano

nedoporučené

Objektivy Nikon CFI jsou vyráběny též pro fázový kontrast (CFI Achromát FF, CFI Plan Achromát, CFI Plan Fluor a CFI Plan Apochromát) a pro Hoffmanův kontrast (CFI HMC 10x, CFI HMC 20x F a CFI HMC LWD 40x C). Optika CFI je doplněna okuláry se zvětšením 10x - 12,5x a 15x se zorným polem až 25mm a projekčními okuláry PLI 2x – 2,5x – 4x a 5x. Vlastnosti objektivů udávají číselné hodnoty pro zvětšení, numerickou aperturu, parfokální vzdálenost, pozorovací (pracovní) vzdálenost a průměr vstupní / výstupní pupily. Rovněž stupeň odstranění zbytkových vad (aberace) je stejně jako u okulárů důležitým kritériem pro jejich jakost. Numerická apertura (zkratka n.a.) je součin indexu lomu prostředí mezi vstupní čočkou objektivu a preparátem (krycím sklem) a sinem poloviny otvorového úhlu objektivu. Je měřítkem pro dosažitelnou rozlišovací schopnost objektivu a tím též pro jeho zvětšení a pro světelný tok, který může objektiv zachytit. Numerická apertura je vyryta do objímky na každém objektivu dosahuje u objektivů se zvětšením 100x hodnot až 1,4. Parfokální vzdálenost je vzdálenost v milimetrech od závitu objektivu k povrchu preparátu, případně krycího skla. Má být pro všechny objektivy na jednom mikroskopu stejná, pak odpadá zaostřování při otáčení revolverovým nosičem. U nových objektivů NIKON CFI60 je tato hodnota 60mm. Pozorovací (pracovní) vzdálenost se měří od vstupní čočky objektivu k rovině preparátu (krycího skla), se stoupajícím zvětšením klesá až na zlomky milimetru. Některé objektivy mají pozorovací vzdálenost prodlouženou, označují se pak LWD nebo ELDW (jak jsme už zmínili u kondenzorů). Průměry pupil (vstupní / výstupní) určují numerickou aperturu a tím i jas obrazu. Jsou závislé na parfokální vzdálenosti Delší parfokální vzdálenost dovoluje vyšší numerickou aperturu. Názvy objektivů se u různých výrobců liší, přesto však mají hlavní skupiny podobné názvy, popisující jejich vlastnosti. Podle toho rozeznáváme: •

• • • •

achromáty - mají barevnou zbytkovou vadu odstraněnou jen pro dvě barvy, optimální barevná korekce je provedena pro žlutozelenou barvu, na kterou je oko nejcitlivější. Korekce pro modrou a červenou barvu nemusí být tak dokonalá. Achromáty jsou nejekonomičtější objektivy, mohou však být výhodné např. při fluorescenci, protože jsou složeny z méně čoček, takže pohlcují méně ultrafialového záření. Nové objektivy NIKON CFI Achromat FF jsou již dokonale korigovány na rovinatost obrazu (FF znamená "flat field" = rovinaté pole). plan-objektivy, např. planachromáty, mají dokonale odstraněnou vadu sklenutí, používají se hlavně pro mikrofotografické práce. Korekce barevné vady je stejná, jako u achromátů. apochromáty - mají již provedenou korekci barevné vady pro tři základní barvy spektra. Dosahují vyšší numerické aparatury a lepšího rozlišení pozorovaných detailů. planapochromáty spojují vlastnosti apochromátů s plan-objektivy. Patří k nejlepším a k nejdražším objektivům. fluoritové objektivy, - např. plan fluory (označení objektivů NIKON), využívají vynikajících optických vlastností fluoritového skla, které dobře propouští ultrafialové záření. Používají se

22

hlavně pro speciální účely, např. při fluorescenční mikroskopii. Fluoritové objektivy NIKON plan fluory spojují vlastnosti kvalitních planachromátů s vysokou propustností pro krátkovlnné záření a jsou vhodné nejen pro fluorescenci, ale též pro pozorování ve světlém poli. Objektivy NIKON CFI Plan Fluor DLL lze použít pro fázový kontrast, epifluorescenci, světlé pole i pro diferenciální interferenční kontrast. Barevné označení objektivů. Pro objektivy se vžilo označení barevnými proužky, aby se usnadnila rychlá orientace při otáčení revolverovým nosičem objektivů. Tak má např. NIKON následující označení: černá 1x hnědá 2x červená 4x žlutá 10x zelená 20x světle modrá 40x (světle modrá 50x) kobaltově modrá 60x bílá 100x Imerzní objektivy. Objektivy se dále mohou lišit tím, zda jsou “suché” nebo určené pro imerzi. U suchých objektivů je korekce provedena tak, že mezi objektivem a krycím sklem preparátu se předpokládá vrstva vzduchu. K imerzi se nejčastěji používá zvláštní imerzní olej, méně často voda. Imerzní olej má podobný index lomu jako sklo, takže vznikne opticky homogenní prostředí: krycí sklo › imerzní olej › objektiv, ve kterém objektiv zachytí maximum světla, které tvoří obraz v mikroskopu Tento olej má být dobré kvality, předepsaný index lomu má být 1,5130. Dříve často užívaný cedrový olej zanechává nepříjemné zbytky na objektivu. Olejová imerze se používá u objektivů s vyšším zvětšením, nejčastěji u zvětšení 100x. Podobný - i když slabší - účinek má vodní imerze. Index lomu vody je vyšší, než vzduchu, avšak nižší, než u imerzního oleje. Objektivy pro vodní imerzi mají význam hlavně tehdy, pozorujeme-li objekty, plovoucí ve vodě. Práce s vodní imerzí je méně náročná, objektivy není třeba pracně čistit od imerzního oleje. Objektivy pro práci bez krycího skla. Dále můžeme rozlišovat objektivy, vyžadující krycí sklo a objektivy pro práci bez krycího skla, označované NCG (no cover glass). Krycí sklo je součástí optické soustavy mikroskopu a musí mít tloušťku, na kterou jsou objektivy korigovány ( 0,17 mm). Rozdíly v tloušťce krycího skla mohou být příčinou pro snížení jakosti pozorovaného obrazu. Objektivy, korigované na práci bez krycího skla se používají hlavně v hematologii. Dokonalejší objektivy jsou vybaveny možností pro korekci na tloušťku krycího skla. Provádí se otočným prstencem na objektivu. Tato korekce má zvláštní význam u inverzních mikroskopů. Objektivy s irisovou clonou. Některé velmi kvalitní objektivy mohou být opatřeny irisovou clonou, která má podobnou funkci jako u fotografických objektivů. Vliv zaclonění objektivu mikroskopu na hloubku ostré kresby je však vzhledem k malým pozorovacím vzdálenostem velmi omezený, irisová clona se používá hlavně k omezení světelného toku objektivem. Optická délka tubusu. Objektivy jsou konstrukčně přizpůsobeny tzv. optické délce tubusu, která se může shodovat s jeho mechanickou délkou. Až donedávna byla optická (a současně i mechanická) délka tubusu u většiny mikroskopů 160mm. V posledních letech se vyrábějí mikroskopy s “nekonečnou” délkou tubusu, které mají četné výhody. Objektivy pro délku tubusu 160 mm nelze používat u mikroskopů s “nekonečnou” délkou tubusu a naopak. Mechanická délka tubusu u mikroskopů NIKON ECLIPSE je 200 mm, optická délka je "nekonečná". Délka tubusu v milimetrech bývá na objektivech vyznačena číslem (např. 160), případně symbolem pro nekonečno. NIKON například označuje tyto nové objektivy značkou CFI60.

23

Odpružené objektivy. Výstupní čočka objektivů s velkým zvětšením je při zaostření na preparát velmi blízko krycímu sklu a může dojít k mechanickému dotyku. Proto jsou objektivy s velkým zvětšením vybaveny pružným uložením vstupní čočky, která se při dotyku krycího skla částečně zasune do pouzdra, čímž je objektiv chráněn před poškozením. Takovým objektivům se říká “odpružené”. Objektivy pro speciální pracovní postupy. Jak jsme se již zmínili, některé metody vyžadují objektivy, upravené pro tyto metody. Sem patří fázový kontrast, Hoffmanův kontrast, případně Nomarského diferenciální interferenční kontrast (DIC). Objektivy pro DIC musí být doplněny hranoly v revolverovém nosiči objektivů a v kondenzoru. Dříve bylo pro metodu DIC nutné používat speciální objektivy, avšak NIKON CFI Plan Fluor DLL je univerzální objektiv, který lze použít k běžným postupům i pro tuto náročnou metodu. Metody různých fázových kontrastů nacházejí svoje uplatnění při pozorování objektů, které nelze barvit, jako např. při fertilizaci in vitro (metoda tzv. asistované reprodukce, umělé oplodňování). Pozorování v polarizovaném světle. Mikroskop může též sloužit pro pozorování v polarizovaném světle. Tato metoda – pokud se používá pro kvantitativní stanovení polarizačního úhlu – vyžaduje speciální okuláry a objektivy, které nemají vlastní polarizační účinky (bez vnitřního pnutí). Mikroskop musí být doplněn o polarizátor a analyzátor, může být vybaven kruhovým otočným stolkem se stupnicí. Kvalitativní polarizace v procházejícím světle se provádí s běžnými objektivy a s jednoduchou výbavou. K polarizačním mikroskopům se užívají kruhové stolky. Osvětlovací souprava mikroskopů střední a vyšší kvality je založena na principu Köhlerova osvětlení. Úplné Köhlerovo osvětlení se skládá ze zdroje světla, kolektorové čočky a irisové clony (je to dříve zmíněná polní clona). Pro naše účely stačí nastavit do optimální polohy clonu osvětlovacího systému, clonu kondenzoru (“aperturní” clona) a polohu kondenzoru. Jednoduché stativy mikroskopů mohou být vybaveny jen částečným Köhlerovým osvětlení, většinou nemají polní clonu a kolektorovou čočku. 1. Umístíme preparát a zaostříme s objektivem 1:20. 2. Uzavřeme clonu svítícího pole (polní clona). 3. Kondenzor zvyšujeme nebo snižujeme tak dlouho, až je obraz svítícího pole ostře ohraničený. To nastává většinou v případě, když je kondenzor značně vysoko. 4. Obraz svítícího pole posuneme (centrovacími šrouby kondenzoru) do středu zorného pole 5. Clonu svítícího pole (polní clonu) otevřeme tak, až se okraje jejího obrazu právě shodují s okrajem zorného pole. 6. Vyjmeme z tubusu okulár a pozorujeme clonu kondenzoru (aperturní clonu), kterou uzavřeme tak, aby zůstalo osvětleno ještě 2/3 průměru výstupní clony objektivu. Nemá-li mikroskop polní clonu, nastavujeme jen polohu kondenzoru a aperturní clonu. Kondenzor může být pevně uložen při výrobě, pak toto nastavení odpadá. Barevné a neutrální filtry. Součástí osvětlovací soustavy jsou filtry, které se vkládají do dráhy světla. Mohou se pokládat na výstupní čočku osvětlovací soustavy ve stativu mikroskopu, nasazovat na kondenzor nebo jsou uloženy ve stativu a vkládány pomocnými mechanizmy (páčkou apod.). Filtry můžeme rozdělit na pestré (barevné) a nepestré (neutrálně šedé). Barevné filtry mění chromatičnost pozorovaného obrazu. Běžný je modrý filtr, používaný při pozorování i při fotografické dokumentaci (označený běžně jako filtr pro "denní světlo") a zelený interferenční filtr (označovaný zkratkou "GIF"), velmi prospěšný při pozorování ve fázovém kontrastu. Nepestré - neutrálně šedé filtry slouží k zeslabení intenzity osvětlení (podobně jako "polní" clona), přitom se však nemění chromatičnost. NIKON označuje tyto filtry počátečními písmeny ND ("neutral density").

24

Kromě těchto filtrů se používají také filtry, absorbující tepelné záření. Pozorování v tmavém poli (v zástinu): Při pozorování v tmavém poli je z obrazu vyloučeno světlo, které by dopadalo přímo do objektivu. Prázdné zorné pole je při tomto postupu tmavé. Teprve to světlo, které se rozptýlí při dopadu na preparát, prochází částečně objektivem a vytváří obraz objektu, složený ze zářících bodů. Pro suché objektivy s numerickou aperturou do 0,65 není třeba zvláštních kondenzorů pro tmavé pole, stačí zastínit výstupní čočku kondenzoru clonou pro tmavé pole, která je ve volitelné výbavě mikroskopu. Protože se při tomto pozorování využívá jen zlomku světlené intenzity zdroje, má mít tento zdroj dostatečný výkon. Z hlediska světelné optiky je důležité, že při pozorování v tmavém poli září na tmavém podkladě ty části objektu, na kterých dochází ve vlastnostech světla k dostatečnému rozdílu při průchodu pozorovaným objektem, jako např. na hranách. Při tvorbě obrazu v tmavém poli nemají význam rozdíly v indexu lomu, které jsou podstatné při pozorování ve fázovém kontrastu. Pozorování ve fázovém kontrastu: Fyzikální principy fázového kontrastu nejsou snadno přístupné. Naopak praktické používání fázového kontrastu ve světlené mikroskopii nečiní většinou žádné potíže. Stručně můžeme říci, že po průchodu preparátem se světlo mění dvěma způsoby: změna amplitudy procházejícího světla nám zprostředkuje vnímání detailů kontrastů jak intenzity, tak i barev. Výsledný vjem je běžný kontrastní barevný obraz. Změna fáze světla, která nastává při průchodu objektem, není zrakem přímo viditelná. Nemá-li tedy objekt detaily, lišící se kontrastem, je pro lidský zrak průhledný, čirý. U řady biologických objektů tyto vlastnosti převažují a proto je zrakem obtížně identifikujeme. Mikroskop, vybavený pro pozorování ve fázovém kontrastu, nám umožňuje pozorovat i takové objekty, které způsobují jen fázový posun světla. Hlubší poznatky o tomto principu jsou součástí fyzikální optiky. Mikroskop pro pozorování ve fázovém kontrastu musí být pro tuto metodu vybaven. Potřebujeme objektivy pro fázový kontrast a kondenzor pro fázový kontrast. Oba tyto optické díly jsou opatřeny tak zvanými fázovými prstenci. U objektivů jsou jejich trvalou částí, u kondenzoru jsou používány podle potřeby. Objektivy pro fázový kontrast mají na jedné ze svých čoček nanesený neprůhledný "fázový" prstenec, na kterém nastává posun fáze světelné vlny. Objektivy pro fázový kontrast mohou sloužit též pro pozorování bez fázového kontrastu, avšak prstenec v objektivu způsobuje v tomto případě mírné snížení jakosti obrazu - udává se přibližně 10 %. U objektivu s malým zvětšením se toto zhoršení prakticky neprojevuje. Fázový kontrast je značně závislý na seřízení mikroskopu. K tomu se dodává účelná pomůcka, tzv. středící (centrovací) dalekohled. Ten se nasadí místo jednoho okuláru a pak pozorujeme polohu fázových prstenců, které můžeme vystředit pomocí nastavovacích prvků. Přesný postup je v návodu ke každému mikroskopu, nicméně vyžaduje trochu zkušeností. Je běžné používat pro světlé pole a fázový kontrast společné objektivy až do zvětšení 40x, pro vyšší zvětšení je téměř nutné používat pro každou metodu jednoúčelový objektiv. Kondenzor pro fázový kontrast bývá u jednoduchých mikroskopů vybaven tzv. šoupátkem, nesoucím 1 nebo 2 fázové prstence. Tyto fázové prstence jsou svým tvarem přizpůsobeny vždy objektivu s určitým zvětšením. Dokonalejší mikroskopy jsou vybaveny univerzálním otočným kondenzorem, vybaveným třemi fázovými prstenci, prstencem pro pozorování v tmavém poli a otvorem pro pozorování ve světlém poli. Volba se provádí otáčením karuselu, nesoucím jednotlivé prstence. Pozorování při fázovém kontrastu se podstatně zlepší, použijeme-li zelený interferenční filtr. Tento filtr propouští zelené světlo vlnové délky kolem 540nm, které zvyšuje vjem kontrastů. Oko je na tuto vlnovou délku světla maximálně citlivé. Fluorescenční mikroskopie Fluorescenční mikroskopie se dělí na dvě metody: pozorování v odraženém světle (epifluorescence) a pozorování v procházejícím světle (diafluorescence). Fluorescenční pozorování v procházejícím světle se v současné době téměř nepoužívá, pod pojmem fluorescence budeme rozumět výhradně pozorování odraženého fluorescenčního světla, tj. epifluorescenci. Podstatou fluorescence je buzení viditelného záření v objektech, které obsahují chemické sloučeniny (fluorochromy), schopné specificky měnit dopadající ultrafialové záření na “odražené” barevné viditelné záření. Některé biologické objekty již takové sloučeniny samy obsahují (např. chlorofyl), jiným

25

je musíme dodávat specifickým barvením. Takové preparáty jsou často zdrojem viditelného záření pouze dočasně. Pro fluorescenci potřebujeme samostatnou osvětlovací soustavu. Jednak musí světlo dopadat na objekt (podstata epifluorescence) a za druhé musí mít určitou vlnovou délku, často z oblasti ultrafialového záření. Výbava mikroskopu pro fluorescenci se skládá ze zdroje záření, nástavce pro osvětlení dopadajícím světlem, držáku s výměnnými fluorescenčními filtry a ochranného oranžového štítu. Zdrojem záření je téměř vždy vysokotlaká rtuťová výbojka, méně často halogenová žárovka. Výbojka je napájená ze sítě přes samostatný zdroj ze sítě 220V/50H, obecně zvaný “startér”. Je umístěna v lampové skříňce, která souvisí s nástavcem pro osvětlení dopadajícím světlem. Tyto díly je nutné stavebnicově vsadit do stativu mikroskopu, současně s držákem fluorescenčních filtrů. Výbojku v lampové skříňce je nutné vystředit a zaostřit tak, aby její světelný tok při dopadu na preparát byl maximální. To se provádí pomocí kolektorové čočky a středících šroubů na lampové skříňce při pozorování obrazu výboje ve středící pomůcce, která se upevní místo jednoho objektivu v revolverovém nosiči. Dokonalé vystředění výbojky je podmínkou pro dobrý výsledek a je nutné občas kontrolovat. Výbojka má životnost kolem 200 h, délka jejího života se měří hodinovým počitadlem na startéru. Život výbojky může být i delší, po překročení mezní doby nehrozí imploze, avšak uvnitř výbojky se usazuje kovový nálet, který snižuje její světelný výkon. Důležitou součástí fluorescenční výbavy jsou fluorescenční filtry. Fluorescenční filtr je obvykle vyroben jako “kostka”, která se skládá z excitačního filtru, závěrného filtru a dichroického zrcadla. Filtry se od sebe liší vlnovými délkami, které vymezují pásma propustnosti excitačního a závěrného filtru. Dichroické zrcadlo odráží přednostně krátkovlnné záření na preparát a propouští dlouhovlnné "fluorescenční" záření do okuláru. Pro praxi je důležité, že ke každému fluorescenčnímu barvivu je nutné přiřadit určitý fluorescenční filtr (mluvíme o jednom filtru, ačkoliv jde o soustavu dvou filtrů a zrcadla v kostce). Výrobci nabízejí množství různých filtrů, některé z nich jsou i vícepásmové. Metodiky práce předepisují určitá barviva a k ním specifické filtry, takže uživatel má ušetřenou namáhavou a finančně náročnou práci s jejich zkoušením. Běžné filtry jsou označeny písmenem, určujícím barevnou oblast světla (B = modrá, G = zelená), ve které pracují. Čísla v označení pak charakterizují pásma vlnových délek pro závěrný a excitační filtr, případně pro dichriocké zrcadlo. NIKON zveřejnil obsáhlou tabulku, ve které jsou k jednotlivým barvivům (fluorochrómům) uvedeny doporučené filtry, popsané kódovým označením výrobce (názvem) a vlnovými délkami budících a závěrných filtrů. Volba správného filtru je podstatnou podmínkou pro úspěšnou metodiku fluorescenční mikroskopie.

Dokumentace v mikroskopii Mikrofotografie Mikrofotografický způsob trvalého záznamu obrazu z mikroskopu je dnes již klasická metoda, používaná od doby, kdy fotografie dosáhla potřebné technické úrovně. Pro mikrofotografii jsou k dispozici zařízení různé dokonalosti (a pořizovací ceny). Mikrofotografická zařízení jsou vybavena různým stupněm automatizace. NIKON má automatizovaná mikrofotografická zařízení řady MICROFLEX. Při méně náročných postupech může být k fotografické dokumentaci použito těleso fotografického přístroje (bez objektivu), např. NIKON F-70 (F-90X, F-5) s příslušným nástavcem fotoadaptérem) a projektivem. Projektiv zastupuje při mikrofotografii okulár a má podobné vlastnosti. Žádoucí je, aby projektiv vyrovnával rovinu obrazu. Projektivy se vyrábějí s různým faktorem zvětšení - 1x až 5x. Je nutné si uvědomit, že zorné pole okuláru je kruhové, zatímco obrazové pole fotografického přístroje je obdélník. Při mikrofotografii nastává téměř vždy dodatečné zvětšení, protože úhlopříčka obrazového pole je kratší, než průměr zorného pole okuláru. Je-li toto zvětšení na závadu, lze je kompenzovat projektivy s proměnnou ohniskovou vzdáleností - jsou však nákladné. K badatelskými mikroskopům může být připojeno současně několik fotografických kamer popřípadě s

26

paralelním provozem televizní kamery. Pro mikrofotografii jsou vhodné objektivy typu planachromát (a lepší), osvětlení mikroskopu by mělo být provedeno halogenovou žárovkou s dostatečnou intenzitou světleného toku. Při barevné fotografii musíme brát ohled na teplotu chromatičnost světla (dříve nazývanou "barevná teplota") v osvětlovací soustavě mikroskopu. Používají se většinou barevné filmy pro "denní světlo", které předpokládají teplotu chromatičnosti světla kolem 5600 K. Není-li tato teplota dosažitelná přímo, používají se tzv. konverzní barevné filtry, známé z běžné fotografické praxe (např. modrý filtr pro "denní světlo"). Mikroskopy NIKON ECLIPSE jsou vybaveny v obvodu regulace osvětlení tlačítkem, které po stisknutí nastaví halogenovou žárovku na konstantní teplotu chromatičnosti.Tato možnost velmi usnadňuje reprodukovatelnost postupu při mikrofotografii. Mikrofotografie na klasickém filmovém nosiči je postupně nahrazována digitální mikrofotografií, při které se obraz ukládá jako datový soubor do paměti ROM. Nicméně však klasický film uloží větší objem paměti (uvádí se 8,5 MB na 1 políčko), než dosud uloží digitální fotografický záznam. Pozorování obrazů z mikroskopu na monitoru Je-li mikroskop vybaven trinokulárním tubusem nebo samostatným výstupem pro kameru, může být obraz snímán televizní kamerou a pozorován na monitoru. Pro dobrou kvalitu obrazu na monitoru musí mít kamera i monitor vysoké rozlišení (450 i více čar) a věrné barevné podání. Obrazy, získané tímto způsobem, lze vytisknout (videoprinterem nebo laserovou tiskárnou) nebo zpracovat v počítači pomocí tzv. obrazové analýzy. Jednoduchá cesta vede z kamery přes kompozitní nebo Y/C signál do monitoru a videoprinteru. Zde je využit analogový signál kamery. Dokonalejší cesta je podmíněna digitalizací obrazu. Signál z kamery se vede do počítače, který musí být vybaven obrazovou kartou. Počítač i monitor musí mít vlastnosti, které tento způsob zobrazovaní umožní. Velmi efektivní je obrazová databanka, do které se ukládají jednotlivé obrazy s komentářem a která velmi usnadňuje archivaci takto uložených obrazů. Televizní kamery, monitory a další prvky nejsou výrobky NIKON – dodávají se podle výběru uživatele, např. výrobky SONY.

Automatizace obsluhy mikroskopu Badatelské mikroskopy mohou být vybaveny různým stupněm automatizace obsluhy. Jednotlivé prvky mikroskopů mohou být ovládány servomotorky, jejich nastavení ovládá řídící jednotka, případně počítač (mikroskop je vybaven propojením, většinou RS 232). Data o nastavení těchto dílů se zobrazují na displeji, případně ukládají do paměti počítače. Byly vypracovány postupy, umožňující automatické zaostřování mikroskopu. Nákladnost takových automatizačních prvků však brání jejich rozšíření. Mikroskop s vysokým stupněm automatizace je NIKON ECLIPSE E1000. Řada obslužných prvků tohoto mikroskopu je ovládána motoricky, E1000 se nastavuje programovatelnou kartou, základní údaje se vkládají pomocí čárového kódu čtecí tužkou. Adresa - httpmicro.magnet.fsu.eduprimeranatomyanatomy.html

Introduction to Photomicrography The use of photography to capture images in a microscope dates back to the invention of the photographic process. Early photomicrographs were remarkable for their quality, but the techniques were laborious and burdened with long exposures and a difficult process for developing emulsion plates. The primary medium for photomicrography was film until the past decade when improvements in electronic camera and computer technology made digital imaging cheaper and easier to use than conventional photography. This section will address photomicrography both on film and with electronic analog and digital imaging systems.

27

The quality of a photomicrograph, either digital or recorded on film, is dependent upon the quality of the microscopy. Film is a stern judge of how good the microscopy has been prior to capturing the image. It is essential that the microscope be configured using Köhler illumination, and that the field and condenser diaphragms are adjusted correctly and the condenser height is optimized. When properly adjusted, the microscope will yield images that have even illumination over the entire field of view and display the best compromise of contrast and resolution. Almost all microscopists will, at some point, have the need or desire to record the images seen through the microscope. The main mechanism, for many years, of producing such photomicrographs was through the use of film, although in recent years most scientists have begun to capture images by means of electronic cameras. The main purpose of this tutorial is to enable the microscopist to record the observed images on film or digital media, and to do so with accuracy of image reproduction and with fidelity of color when color film is being used. The further aim is to empower the photomicrographer to secure excellent pictures without having to struggle through the already existing, far more complex reference literature. Use the links below to navigate to various topics in our discussions of photomicrography. Troubleshooting Problems in Photomicrography - Photography through the microscope is undergoing a transition from film to digital imaging. New digital technologies are producing higher resolution micrographs, but the quality still falls short of that obtainable with film. Microscope configuration errors represent the greatest obstacle to quality photomicrographs, followed by errors in filter selection, film choice, aberration, dirt and debris, and processing mistakes.

Adresa: http://www.biomed.cas.cz/d331/vade/mikroskopy.html 8. Mikroskopy 1. Optický mikroskop 2.Zobrazení buněk v kultuře mikroskopem invertovaným 3. Zobrazení buněk v tkáňových řezech mikroskopem přímým 4. Zeiss a Olympus 5. Zvětšení mikroskopu 6. Numerická aperura objektivu 7. Koehlerovo osvětlení 8. Fázový kontrast 9. Nomarského diferenciální interferenční kontrast (DIC) 10. Hoffmanův modulační kontrast (HMC) 11. Dodtův infračervený gradientový kontrast (Dodt gradient contrast (DGC) 2. Fluoresnční mikroskop 2. Epifluorescence 3. Monochromátor 4. Videomokroskopie 3. Konfokální mikroskop 4. Pojmy 1.

Optický mikroskop 2. Zobrazení buněk v kultuře mikroskopem invertovaným 3. Zobrazení buněk v tkáňových řezech mikroskopem přímým 4. Zeiss a Olympus 5. Zvětšení mikroskopu 6. Numerická apertura objetivu 7. Koehlerovo osvětlen 8. Fázový kontrast

28

2.

3. 4.

9. Nomarského diferenciální interferenční kontrast (DIC) 10. Hoffmanův modulační kontrast (HMC) 11. Dodtův infračervený gradientový kontrast (Dodt gradient contrast DGC). Fluorescenční mikroskop 2. Epifluorescence 3. Monochromátor 4. Videomokroskopie 5. Molecular probes Konfokální mikroskop Pojmy 1. Optický mikroskop

Obyčejný optický mikroskop se skládá z objektivu, který vytváří převrácený obraz objektu a okuláru, kterým tento obraz pozorujeme jako lupou. Součástí mikroskopu je i zdroj světla s kondenzorem, který zabezpečující optimální osvětlení objektu. Pro elektrofyziologické snímání z buněk v kultuře či tkáňových řezech se používají dva základní typy optických mikroskopů lišících se konstrukcí a způsobem uspořádání osvětlovací soustavy, t.j. mikroskop invertovaný a přímý. Kvalita zobrazení buněk závisí na třech hlavních faktorech: na dostatečném zvětšení obrazu, rozlišovací schopnost mikroskopu a na kontrastu obrazu. Rozlišovací schopnost mikroskopu závisí na numerické apertuře objektivu a kondenzoru a na kvalitě osvětlení preparátu t.j. na optimálním nastavení Koehlerova osvětlení. Buňky jsou objekty nezbarvené, které neabsorbují světlo. Kontrast při zobrazování buněk lze velmi efektivně zvýšit pomocí cytologických a histologických barviv, které se vyznačují vysokou specificitou vůči určitým buněčným strukturám, toto barvení se však zpravidla neslučuje s procesy probíhajícími v živých buňkách. Živé buňky však lze pozorovat pokud se od okolního prostředí liší alespoň indexem lomu, který spolu s jejich tloušťkou mění fázi procházejícího světelného vlnění. Kontrast buněk tak lze zvyšovat optickými metodami, které převádějí rozdíly v indexech lomu na jasový kontrast obrazu. Na tomto principu jsou založeny metody jako je např. fázový kontrast, Nomarského diferenciální interferenční kontrast a Hoffmanův modulační kontrast. Zvětšený obraz buněk detekujeme nejdříve okem, pak přes analogovou či digitální videokameru zobrazujeme na monitor či do počítače.

1.2.Zobrazení buněk v kultuře mikroskopem invertovaným Buňky v kultuře jsou objekty průhledné, které neabsorbují světlo, lze je pozorovat pomocí invertovaného mikroskopu v procházejícím světle. Buňky jsou osvětleny ze shora, světlo projde buňkami a stěnou misky do objektivu umístěném pod miskou. Výhodou je, že nad buňkami je dostatečně velký prostor pro umístění snímací elektrody i aplikačních trubiček.

1.3.Zobrazení buněk v tkáňových řezech mikroskopem přímým Tkáňové řezy jsou však objekty neprůhledné, buňky v povrchových vrstvách by nebyly v procházejícim světle vidět, lze je však pozorovat pomocí přímého (up-right) mikroskoipu v dopadajícím světle. Světlo přichází zhora, buňky jsou zobrazeny odraženým světlem a pozorovány přes imerzní objektiv ponořený do roztoku nad buňkami. Mezi buňkami a objektivem tedy není vzduch ale čirá kapalina, takže světlo prochází od buněk až k objektivu prostředím o téměř stejném indexu lomu, a nepůsobí zde odraz a lom na rozhraní mezi prostředími o různém indexu lomu. Tímto způsobem se zvýší numerická apertura objektivu mikroskopu, na které závisí rozlišovací schopnost mikroskopu. Nevýhodou však v tomto případě je velmi malý pracovní prostor mezi objektivem a buňkami (3mm při použití objektivu 40x). V důsledku toho se elektroda k buňce přikládá pod šikmým úhlem a pod objektivem je místo pouze pro jednu společnou aplikační trubičku.

29

1.4. Zeiss a Olympus Nejlepší pro elektrofyziologická a fluorescenční měření jsou mikroskopy firem Zeiss a Olympus (Olympus CZ): Axioskop 2 FS upright Microscope (Zeiss )

Olympus IX 70 - inverted Microscope (Olympus)

30

1.5. Zvětšení mikroskopu Zvětšení obrazu mikroskopem je dáno zvětšením okulárů a zvětšením objektivu. Okuláry mikroskopu během pokusu neobměňujeme, nejčastěji používáme okuláry zvětšující 20x 25x.. Pro zobrazení buněk a hrotu elektrody si však s jedním objektivem nevystačíme a musíme použít postupně aspoň dva objektivy. Pro první pohled na buněčný preparát a nastavení elektrod používáme objektiv s menším zvětšením, nejčastěji objektiv zvětšující 10x. Pak musíme nad vybraným místem nastavit objektivem o větším zvětšení, obyčejně používáme objektiv 40x nebo 60x, pod kterým již vidíme jednotlivé buňky a provádíme měření. Maximální užitečné zvětšení mikroskopu je však určeno i rozlišovací schopností objektivu. Za podmínek, kdy je minimální vzdálenost dvou rozlišitelných bodů srovnatelná s rozlišovací schopností lidského oka, obraz se nezlepší ani při použití silně zvětšujících okulárů, kdy dostaneme jen rozměrnější obraz bez nových detailů.

1.6.Numerická apertura objetivu Odhad minimální vzdáleností dvou rozlišitelných bodů (Ymin) je dán vztahem:: Ymin = konst.(λ/n.sinυ), kde λ je vlnová délka světla ve vákuu, n je index lomu prostředí před objektivem, a υ je polovina vrcholového úhlu kužele paprsků, které mohou vstoupit do objektivu. Veličina (n.sinυ) je tzv. numerická apertura objektivu, NA. U nejkvalitnějších imerzních objektivů bývá NA ~ 1.3 až 1.4. Pro nejkratší vlnové délky viditelného záření (λ≅ 400 nm) se pak rozlišovací schopnost těchto objektivů blíží hodnotě 0,17 µm.

31

1.7. Koehlerovo osvětlen Koehlerovo osvětlení nastavujeme pohybem kondenzoru nahoru a dolu, a pomocí clonek kondenzoru, kterými je přiváděno světlo z osvětlovacího zdroje. Jak nastavíme optimální osvětlení preparátu v přímém mikroskopu ? Ve snížené poloze kondenzoru naplno otevřeme otvor clonky kondenzoru a clonu vymezující vstup paprsků světla do objektivu. Pak zúžíme otvor clony vymezující vstup světelných paprsků a nastavíme pomocnými šrouby jeho střed doprostřed zorného pole. Zdviháme kondenzor a rozšiřujeme světelné pole, až jeho obraz plně a právě zaplní.zorné pole. Tím vymezíme vstup světla ze zdroje a zamezíme vstupu světla pocházejícího z okolí. Dále nastavíme clonku kondenzoru, která určuje numerickou aperturu osvětlovacího systému. Doporučuje se nastavit hodnotu NA kondenzoru na 70 - 80 % NA objektivu. Tímto nastavením omezíme rozptyl světla a dosáhneme lepšího rozlišení, kontrastu i hloubky ostrosti.

1.8. Fázový kontrast R. 1932 holandský fyzik Frederik Zernike uveřejnil princip fázového kontrastu v mikroskopu. Při fázovém kontrastu je do přední ohniskové roviny kondenzoru vložena kondenzorová maska (apertura ve tvaru úzkého mezikruží), která je kondenzorem a za ním následujícím objektivem zobrazena do zadní ohniskové roviny objektivu. Zde se nachází skleněná podložka s nanesenou fázovou maskou (tenká transparentní vrstva o vhodném indexu lomu) ve tvaru mezikruží, které se překrývá s obrazem kondenzorové apertury. Fázová maska mění fázi procházejícího záření o úhel α, případně může procházející záření také částečně absorbovat. Kontrast obrazu fázového objektu vůči pozadí roste s klesající propustností fázové masky. Fázová destička bývá zhotovena tak, že mění fázi buď o úhel π /2 nebo -π /2. Při fázovém kontrastu se intenzita světla v obrazu objektu mění lineárně se změnou fáze světla procházejícího objektem. S fázovou maskou měnící fázi o -π /2 se silnější části objektu jeví tmavší, tzv. pozitivní fázový kontrast. Při změně fáze o π /2 je tomu naopak, tzv. negativní fázový kontrast. Při fázovém kontrastu se často používá kvazimonochromatického osvětlení (žlutozelené světlo), při použití bílého světla bude obraz vzorku zbarvený, neboť úhel a o který fázová maska mění fázi procházejícího světla, závisí na vlnové délce. Nejmenší rozdíly v tloušťce různých buněčných struktur, které můžeme pomocí fázového kontrastu zaznamenat se tedy blíží k hodnotě 0.1 µm. Nevýhody: Při pozorování silně lomivých objektů (např kvasinek) vzniká tzv halo, což je jasně zářící rozhraní mezi objektem a okolním prostředím, v němž se ztrácejí skutečné hranice objektů. Druhým nedostatkem fázového kontrastu je to, že silně absorbující zbarvené objekty nemusí být ve fázovém kontrastu vůbec viditelné.

1.9. Nomarského diferenciální interferenční kontrast (DIC) Německá firma Carl Zeiss vyvinula r.1959 interferenční mikroskop, který umožnil vytváření a vyhodnocování optických interferencí ve zvětšeném biologickém preparátu. Umožnil tak zvláště povrchovou topologii preparátu. Od běžného mikroskopu se liší vloženým párem Wollastonových dvojlomných hranolů a párem zkřížených polarizátorů světla. Světlo vstupující do kondenzoru je nejprve lineárně polarizováno polarizátorem P1. Pak prochází prvním hranolovým děličem, přičemž směr jeho polarizace svírá s optickými osami hranolového děliče úhel 45°. Druhý hranol shodně orientovaný s hranolem prvním, se nachází těsně za zadní ohniskovou rovinou objektivu. Následuje polarizátor P2, který je kvůli lepšímu kontrastu zobrazení zkřížen s P1. V důsledku 32

rozdělení původně polarizovaného světla hranolem vzniknou dva identické obrazy předmětu, které jsou vůči sobě laterálně posunuty, vznikne zvětšený rozdvojený obraz. Wollastonovy hranoly pro DIC se vyznačují tím, že úhlový rozdíl vystupujících paprsků je velmi malý (asi 10-4 radiánu), laterální posun dvou obrazů je za těchto podmínek pod hranicí rozlišovací schopnosti mikroskopu. V předmětové rovině je ekvivalentem tohoto posunu vzdálenost odpovídající 0.1 mm. Analyzátor P2 orientovaný pod úhlem 45o vůči vzájemně kolmým polarizacím dvou laterálně posunutých obrazů, vytváří podmínky pro jejich interferenci. Prvním (objektivovým) hranolem způsobené fázové rozdíly však nejsou stejné pro světlo pocházející z různých míst plošného světelného zdroje. Úkolem druhého hranolu (kompenzačního) je proto učinit fázový rozdíl konstantní v celé ploše objektivového hranolu. Hodnotu konstantního fázového rozdílu lze plynule měnit laterálním posouváním obou Wollastonových hranolů vůči sobě, čímž se výrazně ovlivňuje vzhled obrazu. Platí, že pokud určitý gradient optické dráhy vede ke zvýšení jasu obrazu, pak opačný gradient se projeví snížením jasu. Zvětšený obraz vzorku se proto jeví jako šikmo osvětlený trojrozměrný objekt. Nevýhody: Je známo, že některé výrazně odlišné prostorové reliéfy objektů se mohou projevit prakticky shodnými reliéfy. U biologických preparátů se však optický reliéf zpravidla dostatečně shoduje s reálným prostorovým reliéfem. Pro DIC je typická velmi malá hloubka ostrosti (0.25 mm), což se přičítá efektu interference, pro níž se podmínky prudce mění při přeostření o zlomky vlnové délky. Výhody: Velkou předností DIC je, že obrazy zkoumaných objektů jsou bez rušivého halo, DIC umožňuje lepší kontrast zobrazení jemných fázových struktur objektu než fázový či Hoffmanův kontrast. Nomarskeho metodu lze také realizovat při horním osvětlení či při měření fluorescenčních. V kombinaci s infračerveným osvětlením ji lze použít pro vizualizaci těl i výběžků neuronů v živých mozkových řezech.

1.10. Hoffmanův modulační kontrast (HMC) Vznik tohoto modulační kontrastu se datuje do r. 1975. Jde v podstatě pouze o velmi dokonalou verzí šikmého osvětlení, které se používá ke zvýraznění kontrastu neabsorbujících předmětů. Vznik kontrastu při HMC je důsledek asymetrické filtrace Fourierova obrazu, což je typické pro všechny metody využívající mimoosové (anaxiální) osvětlení. Virtuálním zdrojem světla zajišťujícím šikmé osvětlení je obdélníková štěrbina nacházející se v přední ohniskové rovině kondenzoru. V místě jejího obrazu v zadní ohniskové rovině objektivu je umístěn modulátor. Modulátorem je maska, jejíž tvar se kryje s obrazem štěrbiny kondenzoru. Štěrbina modulárotu z jedné strany sousedí s absorbující plochou (nepropustná zona, zabírá méně než 10% apertury objektivu), z druhé strany je neabsorbující plocha (propustná zona).. Záření zdroje se po průchodu vzorkem s gradientem optické tloušťky odchýlí od původního směru šíření, jednotlivé příspěvky k odchýlenému záření vytvoří v zadní ohniskové rovině objektivu dílčí obrazy kondenzorové clony, které jsou však posunuty vůči štěrbině modulátoru. Je=li gradient kolmý na osu štěrbiny, posune se její tvar v závislosti na znaménku tohoto gradientu buď do nepropustné nebo do čiré zony modulátoru. Takové posunutí je provázeno ztemněním, při opačném gradientu zjasněním, příslušného místa v mikroskopickém obrazu. Výhody: Výsledný obraz budí dojem šikmo osvětleného reliéfu a je velmi podobný zobrazení pomocí Nomarského DIC, cena potřebných doplňkových komponent mikroskopu je však při HMC podstatně nižší než při DIC. Hlavní předností HMC oproti DIC, kromě ceny, je možnost pozorovat objekty i na dvojlomných podložkách (např. buněčné kultury v

33

plastikových miskách), které se pro DIC, kde je podstatná polarizace zobrazujícího světla, mohou stát zdrojem rušivých efektů. Nevýhody: Výrazně závisí na orientaci zobrazovaného objektu vůči štěrbině, neboť optické gradienty rovnoběžné se štěrbinou se v obrazu objektu neobjeví. Mezi biology je DIC zatím více oblíben než Hoffman, částečně proto, že je metodou s delší tradicí, zejména však kvůli tomu, že DIC často umožňuje lepší kontrast zobrazení jemných fázových struktur

1.11. Dodtův infračervený gradientový kontrast (Dodt gradient contrast DGC). Tento kontrast byl vyvinut teprve nedávno pro vizualizaci buněk ve tkáňových řezech v minulých deseti letech, jeho princip dosud nebyl zveřejněn.. Tubus je namontován mezi zdroj světla a mikroskop, kontrast je vhodný pro všechny typy objektivů, neinterferuje s fluorescenčním snímáním. 2. Fluorescenční mikroskop

V r. 1910 pozoroval Kohler při mikroskopování s ultrafialovým světlem fluorescenci mnoha preparátů. První fluorescenční mikroskop s UV excitací vznikl r.1913. Jako zdrojů světla se používá převážně vysokotlakých výbojek plněných rtutí nebo xenonem. Tyto výbojky vydávají velké množství energie svého záření v ultrafialové oblasti. Jejich světlo je poměrně stabilní, výbojky vydrží zářit asi 500 pracovních hodin. Zažehávají se však vysokonapěťovými pulsy, je proto potřeba zapínat je dříve než ostatní elektronické přístroje v aparatuře. Fluorescenční mikroskop je používán k vizualizaci označených buněk, buněčných struktur či molekul a k měření koncentrací iontů uvnitř buněk. Typicky se měří změny koncentrace vápníku v cytoplazmě, které jsou v klidovém stavu udržovány v rozmezí 50 až 200 nM a po stimulaci vstupu vápníku do buňky nebo po jeho uvolnění z intracelulárních zásob stoupají až destinásobně. Změny ve fluorescenčních vlastnostech sond po navázání iontu jsou registrovány a po porovnání s kalibrační křivkou přepočteny na komncentraci. pomocí mikrofluorescenčního měřícího systému MetaFluor od firmy Visitron. Fluorescenční mikroskopie používá většinou zesilovačů obrazu nebo chlazených CCD kamer (tzv. zesílená fluorescenční mikroskopie, IFM - Intenzified Fluorescence Microscopy).. Použití takových detektorů je nezbytné ve většině biologických vzorků, neboť intenzita jejich fluorescence nebývá postačující pro obyčejné videokamery. Musí se proto kombinovat s počítačovým zpracováním obrazu (videomikroskopie). Při IFM lze snižovat intenzitu buzení oproti intenzitě potřebné pro obyčejné vizuální pozorování, čímž lze úspěšně potlačit nežádoucí vybělování fluorescence.

2.1. Epifluorescence Epifluorescence spočívá ve vertikálním fluorescenčním osvětlení excitačním světlem o požadované vlnové délce. Objekt je pozorován přes objektiv, světlo dopadá zhora přes excitační filtr a dichronické zrcadlo, obraz předmětu je pozorován přes emisní filtr. Dichronické zrcadlo odráží excitační světlo o určité vlnové délce směrem do vzorku a propouští ostatní vlnové délky. Bariérový filtr umístěný mezi objektiv a okulár blokuje nechtěné vlnové délky, čímž poskytuje černé pozadí k fluorescenčnímu obrazu. Spektrální charakteristiky vlnové délky transmitance a reflektance dichronického zrcadla se kříží, takže je zapotřebí použít vhodnou kombinaci excitačních a barierových filtrů v kombinaci s dichronickým zrcadlem, aby bylo dosaženo dobrého kontrastního obrazu. K fluorescenčním

34

mikroskopům jsou proto dodávány různé optické kostky sestávající se ze 3 komponent: barierového a excitačního filtru a dichrnického zrcadla. Při excitaci barevného indikátoru ve vzorku při požadované vlnové délce je tak potřeba použít určitou optickou kostku. Pro přesnou práci se pro vyčlenění excitačního spektra používá monochromátoru. Epifluorescence může být používána v kombinaci s fázovým kontrastem i diferenciálním interferenčním kontrastem.

2.2. Monochromátor Monochromátor je přístroj, který kontroluje vlnovou délku světla analogovým napětím. Monochromatické světlo je přivedeno k mikroskopu speciálním epifluorescenčním kondenzorem. Monochromátor se skládá ze dvou částí, t.j. ze zdroje světla (rtuťová výbojka) a vlastního monochromatického zařízení. Světlo z lampy je sbíráno dvěma čočkami a torodiálním zrcadlem, poté je fokusováno na vstupní štěrbinu ve stěně oddělující zdroj světla od monochromatické zařízení. Tam je světlo odráženo parabolickým zrcadlem na mřížku fixovanou ke galvanometrickému snímacímu zařízení (scaneru). Mřížka generuje spektrum, které je fokusováno na optické vlákno (vodič světla). Otáčením scaneru se mění úhel mřížky a tím i vlnová délka monochromatického světla. Nastavení monochromátoru znamená zaostřit světlo na štěrbinu tak, aby bylo dosaženo maximálního průchodu světla co do intenzity.

2.3. Videomokroskopie Fluorescenční mikroskopie využívá videově umocněný kontrast, t.j. digitální zesílení relativně malých lokálních rozdílů v intenzitě světla, které při normálním způsobu zanikají v jasu pozadí. Zesílení spočívá v tom, že se napřed odečte pozadí zahrnující všechny nežádoucí odrazy a rozptyl světla v optické soustavě mikroskopu, tak neostré obrazy struktur nacházejících se mimo ohniskovou rovinu. Při fluorescenční mikroskopii lze tímto způsobem zesílit signál za podmínek, kdy není dost fotonů na to, aby vytvořily obraz bez šumu. Poměr signál/šum se tak zlepší integrací několika po sobě jdoucích obrazů..

2.4. Molecular probes Změny koncentrace iontů se stanovují pomocí fluorescenčních sond, které daný iont specificky váží a po vazbě mění své fluorescenční vlastnosti. Nejznámějším výrobcem těchto sond je firma Molecular probes 3.Konfokální mikroskop

První laserový konfokální rastrovací mikroskop byl vyroben r.1978. Pomocí konfokálního mikroskopu se lze zbavit neostrostí v důsledku překrývání se zaostřeného obrazu s rozmazanými obrazy struktur, které se nacházejí mimo zaostřenou rovinu, což je obzvlášť rušivý jev při fluorescenční mikroskopii. Při konfokální mikroskopii je pozorovaný objekt osvětlen bodovým zdrojem, nejčastěji k tomu slouží laserový paprsek fokusovaný na clonku, která je pak objektivem mikroskopu zobrazena na vzorek do bodu o průměru rovnajícím se minimální vzdáleností dvou rozlišitelných bodů. Stejný objektiv pak sbírá světlo vzorkem odražené a rozptýlené, případně fluorescenci. Při zpětném průchodu tohoto záření objektivem vznikne další obraz bodové clonky, který je pomocí děliče paprsků lokalizován před fotonásobič. V místě tohoto obrazu se nachází druhá konfokální bodová clonka, která blokuje detekci záření pocházejícího z míst vzorku mimo rovinu právě zaostřenou. Obraz celé této roviny získáme rastrováním bod po bodu. Existují tři různé způsoby rastrování, t.j. cestou rozmítání laserového paprsku nebo příčným posouváním vzorku před objektivem, případně posouváním objektivu před vzorkem. 35

Při rastrování je signál z fotonásobiče registrován počítačem spolu s informací o souřadnicích analyzovaných bodů. Celý soubor těchto dat je pak převeden na obraz pozorovaného vzorku. Tento obraz již díky prostorové filtraci záření dopadajícího na detektor neobsahuje neostré pozadí mimofokálních oblastí vzorky. Konfokální obrazy jsou proto vždy zaostřené a představují optické řezy vzorkem. S imerzním objektivem o numerické apertuře NA=1.3 a při použití modrozelené čáry argonového laseru (488nm) činí jejich tloušťka asi 0.4 µ m 4. Pojmy

Abbeho teorie mikroskopu. Ernas Abbe (1873) vysvětlil a experimentálně doložil fyzikální podstatu vzniku obrazu v optickém mikroskopu. Základní myšlenka jeho teorie spočívá v představěm že každý bod osvětleného objektu se stává zdrojem sekundárních sférických vln (Huygensův princip). Záření prošlé vorkem vstupuje v podobě sekundárních vln do objektivu a dostává se do zadní ohniskové roviny objektivu. Změny amplitudy a fáze světelných vln procházejících vzorkem Abbe popsal transmisní funkcí F (x,y), jejíž proměnné x a y značí souřadnice v předmětové rovině, která je kolmá na optickou osu mikroskopu. Zadní ohnisková rovina objektivu F = nejkritičtější místo mikroskopu, v této rovině se setkávají paprsky, které opouštějí předmětovou rovinu šíříce se stejným směrem a vstoupily do objektivu. Airyho kroužky Žádný objektiv nezobrazí bod opět jako bod , ale obrazem bodu jsou difrakční obrazce vznikající ohybem světla na výstupní pupile objektivu (Airyho kroužky). Při zobrazení dvou blízkých bodů se mohou příslušné difrakční kroužky překrývat, až se při jisté minimální vzdálenosti stanou nerozlišitelnými. Kontrast Kontrast (K) je definován pomocí rozdílu mezi jasem pozadí (Ip) a jasem pozorovaného objektu (I) jako poměr: K= (I-Ip)/Ip Wollastonův hranol Wollastonův hranolu rozdělí původně lineárně polarizované zobrazující světlo na dvě vzájemné kolmo polarizované složky (odpovídající řádnému a mimořádnému paprsku), které z děliče vystupují různým směrem. Fluorescence Fyzikální proces při němž dochází k přeměně vlnové délky budícího záření na vlnovou délku luminiscenčního emisního záření, které doznívá delší dobu. Absorpce fotonů molekulami má za následek přechod elektronů do vyšších energetických hladin a při zpětném návratu elektronů dochází k emisi světla. Emisi lze charakterizovat fluorescenčním excitačním spektrem t.j.závislostí intenzity emise na vlnové délce excitačního světla. Když je vzorek ozářen světlem s určitou excitační vlnovou délkou, emituje světlo o viditelně delší vlnové délce (Stokesovo pravidlo) Dichronické zrcadlo

36

Dichronické zrcadlo usměřuje excitační světlo přes objektiv na vzorek, tak aby byl dostatečně osvětlen. Je umístěno se sklonem 45° od optické osy přicházejícího světla, takto nakloněno odráží excitační světlo směrem do vzorku a propouští ostatní vlnové délky

Adresa – maturita.cz Jak vznikl mikroskop? První mikroskop sestrojili kolem roku 1590 bratři Zacharias a Jan Jannesové v Nizozemsku. Pro svou nepatrnou zvětšovací a rozlišovací schopnost nebylo možno tohoto přístroje používat k vědecké práci. Teprve kolem roku 1650 jej zdokonalil Antony van Leeuwenhoek, který jako první objevil neznámý dosud svět drobnohledných ústrojenců a vytvořil základy nejen mikroskopické techniky (mikroskopie a mikrotechnika), ale ve skutečnosti i základy mikrobiologie jako samostatné vědy. Optickou teorii mikroskopu vytvořil kolem roku 1873 německý fyzik E. Abbe. Ve svém dalším velmi živém vývoji se stal mikroskop nepostradatelným prostředkem poznání nejen ve vědách biologických (včetně lékařství), ale i přírodních a technických. Co to vlastně je mikroskop? Mikroskop je dokonalejší přístroj než lupa, určený rovněž k pozorování drobných předmětů. Zatímco lupou lze dosáhnout maximálního zvětšení kolem čtyřiceti, může mikroskop zvětšovat dvoutisíckrát až třítisíckrát. Vlastní mikroskop se skládá ze tří základních částí: - z optické soustavy - Osvětlovací soustavy - Mechanického zařízení Optická soustava mikroskopu je složena ze tří hlavních součástí: objektivu, okuláru a tubusu. Úkolem objektivu je vytvořit zvětšený, skutečný a převrácený obraz předmětu (který se klade za jeho předmětové ohnisko) ve vzdálenosti D od obrazového ohniska. Úkolem okuláru je pak umožnit pozorování tohoto obrazu neakomodovaným okem. Předmětové ohnisko okuláru musí být tedy vzdáleno od od obrazového ohniska objektivu o D . Nastavení této vzájemné polohy objektivu a okuláru zajišťuje tubus. Veličina D se nazývá optickou délkou /intervalem) mikroskopu. Způsob konstrukce optické soustavy jako celku závisí na určení a způsobu využití mikroskopu. Optické soustavy jsou konstruovány buď pro pozorování jedním okem (monokulární mikroskopy), nebo oběma očima (binokulární mikroskopy). Binokulární mikroskopy jsou výhodnější, neboť při pozorování oběma očima dochází k menší únavě. Optická soustava binokulárního mikroskopu je buď složena ze dvou samostatných monokulárních soustav (stereoskopický mikroskop), nebo je tvořena dvěma okuláry a jedním společným objektivem. Všimneme si podrobněji způsobu konstrukce a vlastností objektivu a okuláru. Základními parametry objektivu jsou ohnisková vzdálenost ¦ób , příčné zvětšení bo a číselná apertura A. Pro příčné zvětšení platí vztah bo= D ¤ ¦ób Ohnisková vzdálenost objektivu nebývá zpravidla menší než 1,50mm a pro slabé objektivy může být 20 až 30 mm.Optická délka tubusu leží obvykle v rozmezí hodnot 150 až 200 mm. Odtud pro maximálně dosažitelné zvětšení plyne hodnota poněkud přesahující 100. Ohnisková vzdálenost Zvětšení (délka tubusu D=170mm) Číslo apertura Druh 39,1 3x 0,10 suchý 24,2 6x 0,15 suchý 16,9 10x 0,30 suchý

37

9,1 20x 0,45 suchý 6,1 30x 0,65 suchý 4,1 45x 0,65 suchý 3,1 60x 0,85 suchý 1,95 100x 1,25 Olej.imerse Parametry mikroskopických objektivů Meopta. Jak uvidíme později, je pro posouzení jakosti objektivu velmi důležitá jeho číselná apertura A=N sin sA . Je-li prostor mezi krycím sklíčkem předmětu a objektivem vyplněn vzduchem o indexu lomu N = 1, je teoreticky maximálně dosažitelná hodnota číselné apertury 1. Prakticky je možno získat nejvýše hodnotu 0,95. Hodnotu číselné apertuty lze zvětšit použitím tzv. imerse, která spočívá v tom, že se prostor mezi objektivem a krycím sklíčkem vyplní prostředím o indexu lomu N > 1. K tomuto účelu se obvykle užívá vhodné kapaliny. Tak např. s použitím monobromnaftalenu, který má velký index lomu, je možno dosáhnout hodnoty A=1,6. Kromě monobromnaftalenu se také často užívá vody, nebo cedrového oleje, který má tu zvláštní vlastnost, že jeho index lomu je velmi blízký indexu lomu skla. V tomto případě mluvíme o tzv. homogenní imersi. Dalším kritériem jakosti objektivu je stupeň korekce jednotlivých vad. Podle stupně, jakým jsou korigovány zejména barevné vady, rozeznáváme tzv. achromáty, poloachromáty a apochromáty. Jako okuláru se u mikroskopu užívá pro běžné pozorování okuláru Huygensova. Huygensův okulár je složen ze dvou ploskovypuklých čoček, obrácených rovinnými plochami k oku. První z obou čoček, bližší k oku, se nazývá čočka oční, druhá má název kolektiv. Zvláštností Huygensova okuláru je, že má virtuální předmětovou ohniskovou rovinu mezi kolektivem a oční čočkou. V důsledku toho je u mikroskopů s Huygensovým okulárem nutno umístit clonu zorného pole dovnitř optické soustavy okuláru. Tato clona se zpravidla umisťuje do předmětové ohniskové roviny oční čočky. V tomto případě padne totiž vstupní průhled soustavy mikroskopu do roviny předmětu a zorné pole je ostře ohraničeno.Do předmětového ohniska roviny oční čočky se často vkládá planparalelní deska se stupnicí. Takto vybavený okulár, kterým je možné měřit rozměry pozorovaného předmětu, se nazývá okulární mikrometr. Dělení stupnice bývá zpravidla rovno 1/10 nebo 1/20 mm. Skutečná hodnota jednoho dílku vzhledem k rozměrům předmětu (tzv. mikrometrická hodnota) závisí však na zvětšení objektivu a kolektivu okuláru. Proto je nutné před měřením provést kalibraci tak, že na stolek mikroskopu umístíme mikrometrickou stupnici (objektivový mikrometr) známého dělení a její dělení srovnáme s dělením stupnice okulárního mikrometru. Kromě Huygensova okuláru se v měřicích mikroskopech užívá často okuláru Ramsdenova. Předmětové ohnisko tohoto okuláru je reálné a leží před jeho optickou soustavou. Proti Huygensovu okuláru má tedy nevýhodu v tom, že je optická soustava mikroskopu delší. Na druhé straně dává lepší možnost umístění mikrometrické stupnice, která se v tomto případě pozoruje celou soustavou okuláru. Pro náročnější účely se mimo Huygensův a Ramsdenův okulár užívá složitějších typů okulárů (např. okuláry periplantické nebo ortoskopické), které mají lépe korigovány jednotlivé druhy vad a dovolují použít většího zvětšení a zorného pole. U běžných druhů okulárů se pohybuje ohnisková vzdálenost mezi 50 a 10 mm. Tomu odpovídá zvětšení 5-25 . Pořadové číslo Druh Ohnisková vzdálenost (mm) Zvětšení 1 Huygensův okulár 41,7 6 2 Huygensův okulár 31,3 8 3 Huygensův okulár 25,0 10 4 Huygensův okulár s mikrometrem 31,3 8 5 Periplantický okulár 25,0 10

38

6 Periplantický okulár 16,7 15 7 Periplantický okulár 12,9 20 Parametry okulárů Meopta Pro měřicí úkoly se kromě již popsaných okulárních mikrometrů často používají tzv. měřicí okuláry, které mají v rovině clony umístěnu jednak planparalelní desku se stupnicí, jednak pohyblivou značku, eventuálně nitkový kříž. Pohyb této značky je ovládán mikrometrickým šroubem se stupnicí, takže lze odečítat velmi malé hodnoty posuvu. Na vlastnostech objektivu a okuláru jsou závislé vlastnosti optické soustavy mikroskopu jako celku. Optická soustava mikroskopu je charakterizována hlavně zvětšením , zorným polem a rozlišovací schopností. Osvětlovací soustava mikroskopu zajišťuje osvětlení pozorovaného předmětu. Mikroskopem mohou být pozorovány předměty průhledné i neprůhledné. V prvním případě se předmět osvětluje procházejícím světlem, v druhém případě světlem odraženým. Způsob konstrukce osvětlovací soustavy závisí zřejmě na tom, k jakému druhu pozorování bude mikroskop použit. Především záleží na tom, půjde-li o pozorování v procházejícím nebo odraženém světle. Kromě toho je v obou případech možné konstruovat osvětlovací soustavu pro práci v tmavém nebo ve světlém poli. Velmi často jsou mikroskopy zařízeny pro práci v polarizovaném světle, v takovém případě bývají osvětlovací soustavy vybaveny polarizátorem. Pro náročnější účely se k osvětlení preparátu užívá výhradně umělých zdrojů, které bývají zpravidla malých rozměrů. Aby se využilo celé apertury objektivu, je v tomto případě nutné použít kondenzor, kterým se zobrazí zdroj do roviny předmětu. Optická soustava kondenzoru musí mít ovšem dostatečně velkou aperturu. Dále se budeme podrobněji zabývat jednotlivými parametry optické soustavy jako celku, a to zejména způsoby jejich zjišťování. Zvětšení. Zvětšení mikroskopu Zm je podobně jako u lupy definováno poměrem Zm = u ¤ u´ U´je úhel, pod kterým vidíme obraz předmětu, vytvořený mikroskopem neakomodovaným okem, u je úhel, pod kterým vidíme tentýž předmět prostým okem z konvenční zrakové vzdálenosti. Označíme-li bo příčné zvětšení objektivu a Zo zvětšení okuláru, platí Zm = bo . Zo V případech, kdy nejsou hodnoty bo k dispozici, lze zjistit zvětšení měřením přímou metodou. Uspořádání této metody je modifikací metody použité pro lupu. Při měření položíme nejprve na stolek mikroskopu objektivový mikrometr M. Těsně před okulár umístíme polopropustné zrcátko Z tak, aby svíralo s osou tubusu úhel 45°. Ve vzdálenosti 25 cm od zrcátka umístíme milimetrové měřítko S rovnoběžné s osou tubusu tak,abychom je mohli současně porovnat s obrazem mikrometrické stupnice vytvořeným mikroskopem . Srovnáním dělení obou stupnic lze pak určit zvětšení mikroskopu. Nastavíme-li však mikroskop tak, abychom viděli obě stupnice ostře, pozorujeme obraz v mikroskopu okem akomodovaným na konvenční zrakovou vzdálenost a zvětšení, které takto měříme, není totožné se Zm podle vztahu Zm = bo . Zo . Označíme-li toto naměřené zvětšení Zo a předpokládáme-li, že zvětšení objektivu zůstává v obou případech stejné, dostaneme rovnici: Zd = bo (d ¤ ¦ok + 1 ) = Zm + b Zm = Zd - b K praktickému měření zvětšení mikroskopu přímou metodou lze také použít kreslicího zařízení, které se někdy dodává jako příslušenství mikroskopu. Toto zařízení se skládá ze skleněné krychle složené ze dvou pravoúhlých hranolů a z rovinného zrcadla. Krychle je vsazena v objímce, která se nasadí na tubus mikroskopu tak, aby krychle byla umístěna před okulárem. Vzhledem k tomu, že přeponová stěna jednoho z hranolů je polopropustně pokovena, může krychle působit stejně jako polopropustné zrcadlo. Pomocí kreslicího zařízení je možné současně pozorovat obraz předmětu vytvořený

39

mikroskopem a list papíru položený vedle mikroskopu. Vhodný poměr jasů obou obrazů bývá možné dosáhnout pomocí některého filtru, jimiž bývá zařízení vybaveno. Zorné pole. Předmětové ohnisko celé soustavy leží v blízkosti předmětové roviny objektivu, její obrazové ohnisko leží poblíž oční čočky okuláru; do obrazové ohniskové roviny se zpravidla klade oční pupila. Aperturní clonu mikroskopu tvoří buď obruba některé čočky objektivu, nebo clona umístěná v blízkosti obrazového ohniska objektivu. Vstupní pupila celé soustavy je pak obraz této clony vytvořený čočkami objektivu ležícími „před“ ní a výstupní pupila je obraz vytvořený čočkami soustavy ležícími „za“ ní. Výstupní pupila leží vždy velmi blízko obrazové ohniskové roviny celé soustavy. Průměr výstupní pupily mikroskopu je ve většině případů menší než průměr oční pupily. Vzhledem k uvedeným okolnostem může být oční pupila umístěna vždy do roviny výstupní pupily soustavy. Zorné pole, které můžeme pozorovat, je tedy omezeno jen clonou zorného pole okuláru. Zorné pole mikroskopu je pak v lineární míře definováno jako průměr toho kruhu v předmětové rovině, jehož obraz vyplní celou plochu clony zorného pole okuláru. Jsou 2případy : buď je clona zorného pole umístěna „před“ optickou soustavou okuláru (Ramsdenův okulár), nebo je umístěna uvnitř jeho optické soustavy (Huygensův okulár). Označíme-li dz průměr clony zorného pole, bude v prvním případě zorné pole mikroskopu rovno : rm = dz ¤ bo a v druhém případě : rm = Dz ¤ bo Dz = dz. ¦´ok ¤ ¦ć , ¦´ok je ohnisková vzdálenost okuláru a ¦ć ohnisková vzdálenost oční čočky. Veličina Dz vyjádřená v milimetrech se nazývá číslo zorného pole okuláru Huygensovy okuláry Zvětšení Číslo zorného pole 6 18,4 8 16,2 10 13,4 Periplanatické okuláry Zvětšení Číslo zorného pole 10 16,6 15 13,6 20 8,7 Rozlišovací schopnost. Pro rozlišovací schopnost mezí optické soustavy d byl uveden vztah :d = 0,61. l ¤ A , v němž l je vlnová délka a A číselná apertura. K tomuto vztahu se dospělo ze studia difrakce vznikající při průchodu světelných paprsků vycházejících ze dvou svítících bodů. Při kolmém osvětlení vychází pro rozlišovací dm platí vztah : dm = l ¤ A Menší mez rozlišení lze dosáhnout při šikmém osvětlení. Za předpokladu, že aperturní úhel kondensoru je roven aperturnímu úhlu objektivu, platí pro rozlišovací mez : dm = l ¤ 2A Danou rozlišovací mezí je také omezeno použitelné zvětšení mikroskopu. Úsečku délky do, kterou vidíme z konvenční zrakové vzdálenosti d pod úhlem u = do ¤ d , pozorujeme mikroskopem pod úhlem u´= do Zm ¤ d . Má-li být tato vzdálenost rozlišena okem, musí být u´>1´. Na druhé straně nemá cenu smysl zvětšovat u´daleko nad tuto hranici zvětšování Zm. Při dané vlnové délce a číselné apertuře nelze totiž na předmětu rozlišit více detailů. Obvykle se pro u´volí hranice 1´< u´<4´. Zvětšení, které nevyhovuje nerovnosti 250A < 1000A se nazývá prázdné. Experimentálně se rozlišovací schopnost určuje pozorováním předmětů majících dostatečně jemnou strukturu. Pro kvalitní posouzení se užívá různých přírodních preparátů, jako např. šupin motýlích křídel apod. Kvantitativně je možno rozlišovací schopnost posoudit užitím testovacích desek s dostatečně jemným dělením podobně jako v případě lupy.

40

Druhy mikroskopů.. Optický mikroskop je mikroskop, v němž je obraz zvětšován dvěma sadami spojných čoček:objektivem a okulárem. V biologii se pro účely optické mikroskopie užívají objektivy různé síly, tj. různé zvětšovací schopnosti ; okulár již jen zvětšuje obraz vržený objektivem. Největší zvětšení , kterého jde docílit v obyčejném světle , je asi 1500krát , kdy má optický mikroskop ještě využitelnou rozlišovací schopnost. Při použití nejsilnějších objektivů je nutno vložit mezi frontální čočku a krycí sklíčko mikroskopického preparátu kapku cedrového oleje se stejným lomem světla, jako má sklo,aby se světlo neztrácelo ( imerzní objektivy ) . Vyššího zvětšení lze docílit použitím světla o kratší vlnové délce, jako je ultrafialové světlo. Optický mikroskop byl sestrojen v roce 1590 v Nizozemsku a byl zdokonalen A. van Leeuwenhoekem 1650, v současnosti existuje řada aplikací. Fluorescenční mikroskop – používá se zde ultrafialových paprsků, z elektrických obloukových lamp nebo ze rtuťových výbojek, které vyvolají světélkování předmětu v mikroskopu. Při osvětlení předmětu světlem , které nedopadá do objektivu, lze mikroskopem pozorovat částice průměru asi setiny mikronu, avšak nelze rozeznat jejich tvar.. Ultramikroskop zkonstruoval v roce 1903 H. Siedentopf a R. Zsigmondy. Pro zobrazení ještě menších částic je třeba použít místo světelných paprsků proudu elektronů, které se uvolňují ze žhavých kovů uvedených na záporný potenciál. Proud elektronů prochází elektr. n. magnet. čočkami, tj. elektr. n. magnet. polem, které umožňuje měnit směr pohybu elektronů. Elektronový mikroskop pracuje s proudem elektronů ve vakuu. Proud elektronů –záření velmi malé vlnové délky. Elektronové mikroskopy se dělí na 2 druhy : transmisní elektronový mikroskop Rastrovací elektronový mikroskop TRANSMISNÍ ELEKTRONOVÝ MIKROSKOP : viditelný obraz se vytváří na fluorescenčním stínítku svazkem elektronů, které prošly studovaným vzorkem, nebo které ve vzorku difraktovaly. Zdrojem proudu elektronů je kovová katoda, která po rozžhavení vysílá elektrony urychlované el. polem o napětí 50-200kV. Proud elektronů prochází tzv. elektronovou čočkou, kterou tvoří el. pole zvláštního kondenzátoru, nebo mag. pole cívky. Tato elektronová čočka soustřeďuje elektrony na pozorovaný předmět (preparát). Vrstva preparátu musí být velmi tenká, přibližně 1 mm, aby nepohlcovala elektrony . Proud elektronů pak prochází další elektronovou čočkou- objektivem a vytvoří první elektronový obraz. Část tohoto obrazu se elektronovou čočkou- projektivem- znovu zvětší a výsledný obrazec se promítá buď na stínítko pokryté vrstvou luminoforu, nebo se zachytí na fotografické desce či filmu. Tyto , a samozřejmě i další součásti elektronového mikroskopu jsou uloženy ve vzduchotěsné válcové nádobě, z níž je vyčerpán vzduch, aby se prou elektronů nezeslaboval. K přípravě vzorků pro transmisní elektronový mikroskop se používá několik metod :Metoda obtisků (replik) – povrch silnější než 10-50 nm se pokrývá replikou. To může být např. roztok celulózy, který se nakápne na pozorovaný povrch a nechá se roztéct. Po zaschnutí repliku sejmeme a pozorujeme. : Příprava ultratenkých řezů- používá se zařízení zvané ultramikroton. Obsahuje fixní skleněný nůž a masivní ocelovou tyč, na níž je upevněn vzorek. Tyč se otáčí a je ohřívána průchodem proudu, čímž dojde k jejímu prodloužení a uříznutí části vzorku : elektrochemické leptání – vzorek (cca 100 mm ) je elektrochemicky leptán nebo iontově poprašován. V místě, kde se vzorek proleptá jej pozorujeme. RASTROVACÍ ELEKTRONOVÝ MIKROSKOP : Rastrovací elektronový mikroskop pracuje tak, že na vzorek dopadá tenký svazek elektronů, který dopadá postupně na všechna místa vzorku. Odražený (emitovaný) paprsek se převádí na viditelný obraz. Mechanická clona – vybírá pouze část elektronů, které dopadnou na preparát. Projekční čočka – způsobí, aby zaostřený svazek elektronů dopadl na preparát. Zaostřený svazek elektronů musí po povrchu preparátu rastrovat synchronně s TV.

41

Rozlišujeme 4 skupiny elektronů opouštějící povrch vzorku: 1) zpětně odražené elektrony – poskytují informaci o topografii (reliéfu) vzorku a o materiálovém složení. Jejich rozlišovací schopnost je 50-200nm. 2) Sekundární elektrony – poskytují informaci převážně topografickou. Rozlišovací schopnost je 5-15 nm. 3) Augerovy elektrony – jsou vyráženy z materiálu a zjištěním jejich energie lze provádět prvkovou (kvalitativní) analýzu 4) Primární elektrony – detekují se jako u transmisního elektronového mikroskopu (0,5nm) Dále pak můžeme detekovat i RTG záření nebo i viditelné světlo, což nám umožní získat další informace o zkoumaném vzorku. Vzorek může být 2-3 cm tlustý a 15 cm dlouhý a musí být kvalitně pokoven. Výhody a nevýhody elektronové mikroskopie Mezi největší výhody patří velmi velké zvětšení – řádově až 1 000 000 , což umožňuje pozorovat i opravdu velmi malé částice. U transmisních el. mikroskopů je nutné, aby vzorek byl velmi tenký, což lze považovat za nevýhodu. Další podstatná nevýhoda je to, že preparát musí být umístěn ve vakuu, což neumožňuje pozorovat živé organismy. El. mikroskop má také velké rozlišení (0,1 nm) a velkou hloubkou ostrosti (několik mm). Pohyb svazku elektronů lze řídit pomocí počítače , což umožňuje využít veškerý komfort, který tato technika poskytuje (zobrazit pouze výřez , odstranit šum snížením rastrovací rychlosti, tisknout obraz…). Výhoda je také to, že elektronový mikroskop může dát informaci nejen o topografii vzorku, ale i o jeho materiálovém složení. Za nevýhody lze dále považovat i velké nároky na prostor a vysokou pořizovací cenu. Elektronová mikroskopie se používá při studiu velmi malých částic, například v lékařství při studiu bakterií a virů. Jiné uplatnění nalézá např. v mikroelektronice, kde se využívá při vývoji a studiu čipů a polovodičových materiálů. Vzhledem k tomu, že dráhy elektronů ovlivňují také případné mag. pole povrchové vrstvy vzorku, můžeme např. pozorovat mag. pole, které vytváří pracující polovodičová součástka. Mikroskop se využívá i ke kvalitní (prvkové) analýze např. v chemii, biologii atd. Dále existuje mikroskop interferenční, který se využívá zejména v technické praxi, např. ve strojírenství . Polarizační mikroskop je určen pro studium optických vlastností krystalů. Tento mikroskop má v osvětlovacím zařízení a v tubusu zařazeno dvojí polarizační zařízení, které je otočné kolem optické osy. Stereoskopické mikroskopy dávají plastický obraz. Mikroskopy můžeme i fotografovat, dále se používá přístroj zvaný mikromanipulátor, který umožňuje operaci na buňkách za pomoci speciálních zařízení (mikrurgie).. 7) Vady čoček + typy objektivů Z knížky Hlavní vady čoček Chromatická – způsobena různým lomem světla o různé lnové délce. Paprsky se nesoustřeďují v jediném ohnisku na ose čočky, ale každé světlo určité vlnové délky má své ohnisko.

42

Kulová – paprsky rovnoběžné s osou se lámou různě podle jejich vzdálenosti od středu čočky. Ty, které dopadají dále od středu, se lámou více než středové

Astigmatická – způsobena tím, že se paprsky, které dopadají na čočku ze strany (z bodu ležícího mimo optickou osu) neprotnou v jednom bodě, ale zobrazují se jako dvě linie na sebe kolmé

Vyklenutí zorného pole – vzniká tím, že paprsky dopadající na čočku šikmo mají jiné ohnisko než rovnoběžné paprsky přímé.

43

Koma – bod ležící mimo osu čočky je zobrazen jako protáhlá ploška. Distorze – okraje zorného pole jsou více či méně zvětšené než je střed.

Vhodnou kombinací čoček objektivů a okuláru se v určité míře mohou tyto vady odstranit. Typy objektivů podle způsobu kompenzace optických vad: achromáty - mají barevnou zbytkovou vadu odstraněnou jen pro dvě barvy, optimální barevná korekce je provedena pro žlutozelenou barvu, na kterou je oko nejcitlivější. Korekce pro modrou a červenou barvu nemusí být tak dokonalá. Achromáty jsou nejekonomičtější objektivy, mohou však být výhodné např. při fluorescenci, protože jsou složeny z méně čoček, takže pohlcují méně ultrafialového záření. plan-objektivy, např. planachromáty, mají dokonale odstraněnou vadu sklenutí, používají se hlavně pro mikrofotografické práce. Korekce barevné vady je stejná, jako u achromátů. apochromáty - mají již provedenou korekci barevné vady pro tři základní barvy spektra. Dosahují vyšší numerické aparatury a lepšího rozlišení pozorovaných detailů. planapochromáty spojují vlastnosti apochromátů s plan-objektivy. Patří k nejlepším a k nejdražším objektivům.

Seznam použitých adres: Mikroskopy.cz Zeiss.cz Leica.cz httpmicro.magnet.fsu.eduprimeranatomyanatomy.html 44

httpstaffold.vscht.czktkwwwrootstaffkratkaBrno%202001.htm httpwww.physics.muni.cz~kubenaModerni%20metody31_souboryframe.htm httpwww.physics.muni.cz~kubenaoptika1sld001.htm Maturita.cz Nikonopteoteam.cz Olympus.cz httpwww.arid.cznikcovite.htm httpwww.biomed.cas.czd331vademikroskopy.html#h3_0 httpceg.fsv.cvut.czCZindex.htm

45