OPTICKÉ METODY. NESPEKTRÁLNÍ při interakci nedochází k výměně energie

OPTICKÉ METODY

OM

OPTICKÉ METODY ▫ Identifikace a kvantifikace sloučenin (organických i anorganických) na základě interakce elektromagnetického záření a hmoty ▫ Základní rozdělení optických metod:

NESPEKTRÁLNÍ – při interakci nedochází k výměně energie – dochází pouze ke změnám určitých vlastností záření – např. změna rychlosti záření, otáčení roviny polarizovaného světla, rozptyl záření

SPEKTRÁLNÍ – při interakci dochází k výměně energie – např. změna absorpce či emise záření

OM

PŘEHLED ZÁKLADNÍCH OM NESPEKTRÁLNÍ – refraktometrie (index lomu) – polarimetrie a cirkulární dichroismus (polarizace) – turbidimetrie a nefelometrie (rozptyl) SPEKTRÁLNÍ – atomová spektrometrie – absorpční – s atomizací v plameni (FA-AAS) – s elektrotermickou atomizací (ETA-AAS) – s generování par (VG-AAS) – emisní – s ionizací v plameni (FES) – s ionizací v plazmatu (ICP-OES) – fluorescenční (AFS) – molekulová spektrometrie – absorpční – v ultrafialové a viditelné oblasti (UV/VIS) – v infračervené oblasti (IR) – Ramanova spektrometrie v UV/VIS a IR oblasti – luminiscenční – fluorescence – fosforescence

OM

ELEKTROMAGNETICKÉ ZÁŘENÍ = postupné vlnění elektromagnetického pole složeného z kombinace příčného magnetického a elektrického vlnění ▫ má vlnově-korpuskulární charakter ▫ je nositelem energie E ▫ char. - vlnová délka „λ“ nejčastěji v nm = délka 1 vlny - vlnočet „ṽ“ nějčastěji v reciprokých cm = počet vln na 1 cm

OM

ELEKTROMAGNETICKÉ ZÁŘENÍ

OM

ELEKTROMAGNETICKÉ ZÁŘENÍ ▫ Formy interakce elektromagnetického záření s hmotou závisí na jeho energii ▫ Čím kratší vlnová délka (tím vyšší vlnočet i frekvence), tím vyšší energie

OM

Rozšíření spektrálních čar ▫ spektrální čára by měla být teoreticky nekonečně úzká ▫ ve skutečnosti však je čára rozšířená s určitým profilem ▫ minimální hodnota šířky spektrální čáry je dána přirozenou šířkou, která odpovídá intervalu ∆λ = 10-5 nm

▫ dáno Heisenbergerovým principem neurčitosti ▫ energetické stavy s krátkou dobou života (excitované stavy) budou emitovat či absorbovat s větší přirozenou šířkou než stavy s dlouhou dobou života ▫ přirozená šířky čáry má však téměř zanedbatelný vliv…

▫ významný vliv na šířku spektrální čáry: - Dopplerovo rozšíření (neuspořádaný termický pohyb atomů) - Lorentzovo rozšíření (srážky excitovaných a neexcitovaných atomů)

OM

Rozšíření spektrálních čar ▫ skutečný profil spektrální čáry je tedy kombinací těchto vlivů: - Heisenbergerův princip neurčitosti (přirozená šířka čáry, zanedb.) - Doplerovo rozšíření závisí na teplotě (čím vyšší, tím vyšší vliv) - Lorentzovo rozšíření ▫ … a nazývá se Voigtův profil ▫ … a je charakterizován parametrem pološířka čáry (šířka spektrální čáry v polovině výšky jejího maxima) A - Doplerovo rozšíření (nehomogenní) B - Lorentzovo rozšíření (homogenní)

A

B λ[nm]

OM – NESPEKTRÁLNÍ

OPTICKÉ METODY

NESPEKTRÁLNÍ – refraktometrie (index lomu) – polarimetrie a cirkulární dichroismus (polarizace) – turbidimetrie a nefelometrie (rozptyl)

OM – NESPEKTRÁLNÍ – REFRAKTOMETRIE

Refraktometrie ▫ využívá lomu světla na rozhraní dvou homogenních prostředí odlišné optické hustoty, ve kterých se šíří různou rychlostí

▫ čím vyšší je optická hustota prostředí, tím nižší je rychlost světla ▫ zpomalení světla v určitém prostředí je charakterizuje: (ABSOLUTNÍ) INDEX LOMU

n=c/v

vakuum

c … rychlost světla ve vakuu (299 792 458 m/s) v … rychlost světla v daném prostředí

- je vztažen k vakuu - hodnota udává kolikrát je světlo ve vakuu rychlejší než v daném prostředí

vzduch


SNELLŮV ZÁKON: popisuje lom elektromagnetického záření na rozhraní dvou homogenních prostředí s odlišnou optickou hustotou

n1sinθ1 = n2sinθ2 n2 / n1 = sinα1 / sinα2 = v1 / v2 RELATIVNÍ INDEX LOMU: Popisuje kolikrát se paprsek zrychlí či zpomalí při přechodu z jednoho prostředí do druhého

n21 = n2/n1


Při šíření záření z prostředí opticky řidšího do opticky hustšího prostředí se paprsky lámou směrem ke kolmici.

Při šíření záření z prostředí opticky hustšího do opticky řidšího prostředí se paprsky lámou směrem od kolmice.


Některé důsledky lomu světla

Mozek lovce předpokládá, že světlo se šíří přímočaře, takže vidí rybu v místě modrého obrysu. Ve skutečnosti je ale ryba blíže, protože světlo se šíří po plné čáře.

Předměty ve vodě se zdají dál než ve skutečnosti jsou!


Refraktometrie v analytické praxi ▫ hodnota indexu lomu závisí na – vlnové délce – teplotě – tlaku (významné pouze u plynů)

▫ u každé hodnoty indexu lomu nutné uvést i hodnoty výše uvedených parametrů! ▫ uplatnění v praxi: - hodnocení čistoty chemikálií - v potravinářství pro měření obsahu cukru v ovoci, džusech, vínu, v pivovarnictví, cukrovarnictví

- rychlá a levná orientační analýza


Totální odraz (reflexe)

Při přechodu paprsku z opticky hustšího prostředí do prostředí opticky řidšího dochází od určitého úhlu (mezní úhel) k totálnímu odrazu

θ2 = 90o -> tedy -> sinθ2 = 1 sinθ1 = n2 / n1 = v1 / v2




Totální odraz (reflexe) ▫ Princip totální reflexe se využívá například v konstrukci světlovodičů



EVANESCENTNÍ VLNA

- šíří se podél rozhraní (max. do vzdálenosti 100 nm) - kolmo na rozhraní ubývá exponenciálně se vzdáleností od rozhraní - využívá ji metoda zeslabené totální reflexe (ATR) - uplatnění při analýze vysoce absorbujících viskózních roztoků, gelů, past, polymerních past i práškových materiálů - kontakt vzorku s plochou (ATR krystal) musí být velmi těsný

OM – NESPEKTRÁLNÍ – POLARIMETRIE

Polarimetrie ▫ využívá schopnosti opticky aktivních látek (tzv. chirálních sloučenin) stáčet rovinu polarizovaného světla

▫ molekuly opticky aktivních látek: - nelze otáčením ztotožnit s jejich zrcadlovým obrazem

- nemají střed nebo rodinu symetrie

▫ nejčastější příčinou asymetrie je přítomnost asymetrického uhlíku (např. glukóza, sacharóza) ▫ opticky aktivní jsou i některé anorg. sloučeniny (vápenec, křemen)


Polarizované světlo


Princip měření

Optická otáčivost α … optická otáčivost [°] [α]λ … specifická otáčivost při vlnové délce λ (zpravidla 589,3 nm – sodíkový dublet) a teplotě t (zpravidla při 20°C) vyjádřena ve [°] l … délka kyvety [dm] c … koncentrace [g/ml] Optická otáčivost je aditivní veličina!


Polarimetrie v analytické praxi ▫ hodnota optické otáčivosti závisí na: – asymetrii molekuly – vlnové délce – teplotě – počtu molekul (tj. koncentraci a délce kyvety) – rozpouštědle – stáří roztoku (vliv mutarotace u redukujících sacharidů) ▫ u každé hodnoty optické otáčivosti nutné uvést i hodnoty vlnové délky a teploty! ▫ uplatnění v praxi: - hodnocení čistoty chemikálií - v potravinářství pro měření obsahu cukrů - rychlá a levná orientační analýza

OM – NESPEKTRÁLNÍ – POLARIMETRIE – CIRKULÁRNÍ DICHROISMUS

Cirkulární dichroismum (CD) ▫ CD molekul je způsoben asymetrií molekulárních struktur ▫ součástí biopolymerů jsou také opticky aktivní cukry a aminokyseliny

▫ optická aktivita biopolymerů se používá k popisu její struktury a strukturních změn

Struktura α-helix

Struktura β -sheet


Princip CD - rovinně polarizované světlo lze rozložit na pravotočivou a levotočivou složku kruhově polarizovaného světla

- levotočivá složka prochází prostředím jinou rychlostí než pravotočivá složka, tzn. každá složka má v daném prostředí jiný index lomu a tím dojde ke stočení roviny polarizovaného světla - levotočivá složka je absorbována jinak než pravotočivá složka, tj. každá složka má v daném prostředí jiný extinkční koeficient a tím dojde ke změně z rovinně polarizovaného světla na elipticky polarizované světlo - CD je definován jako rozdíl extinkčních koeficientů levotočivé a pravotočivé složky kruhově polarizovaného spektra … CD = ∆ε = εL – εP - v praxi se měří jako MOLÁRNÍ ELIPTICITA = θ = 3298,2 · ∆ε


Kruhově polarizované složky

Pravotočivá složka

Levotočivá složka


Zjednodušené schéma CD


Určování sekundární struktury bílkovin β - sheet random coil

α - helix


CD v analytické praxi ▫ hodnota molární elipticity závisí na vlnové délce elektromagnetického záření – nutno uvádět!

▫ metodu lze používat při různých pH, teplotách i roztocích ▫ uplatnění v praxi: - sekundární struktura bílkovin (ale není tak specifická jako NMR či RTG) - struktura DNA - studium strukturních změn biopolymerů (např. tepelná či chemická denaturace)

- excitonová interakce mezi molekulami

OM – NESPEKTRÁLNÍ – TURBIDIMETRIE A NEFELOMETRIE

Turbidimetrie a nefelometrie ▫ založené na měření rozptylu světla o určité vlnové délce na jemných nerozpuštěných částicích suspendovaných v tekutině, tj. v (l) i (g) Turbidimetrie – sledování rozptylu ve směru paprsku – měřená veličina TURBIDANCE [T], bezrozměrná Nefelometrie – sledování rozptylu kolmo na směr paprsku – měřená veličina FNU, bezrozměrná – Tyndalův efekt = difuzní rozptyl světla na pevných částečkách


Tyndallův efekt ▫ v přítomnosti nerozpuštěných částic dochází k rozptylu světla ▫ paprsek se stává v přítomnosti nerozpuštěných částic viditelným

Rozpouštědlo Rozpouštědlo + částice


Turbidimetrie a nefelometrie v analytické praxi ▫ rozptyl světla závisí na: - koncentraci částic v tekutině (měřený parametr) - úhlu rozptylu - vlnové délce záření (čím kratší vlnová délka, tím vyšší rozptyl) - vlastnostech částic (velikost, tvar, barva, index lomu…) ▫ problém s reprodukovatelností – nutno zabránit sedimentaci (PEG) ▫ velice citlivé – lze stanovit koncentrace až 10-5 obj. %

▫ uplatnění v praxi: - potravinářství (výroba piva, vína, džusů) - životní prostředí (znečištění vod a vzduchu) - biotechnologická výroba (koncentrace biomasy) - imunochemické metody (zákal po imunoprecipitační reakci)

OM – SPEKTRÁLNÍ – ATOMOVÁ SPEKTROMETRIE

OPTICKÉ METODY

SPEKTRÁLNÍ část 1. – atomová spektrometrie


Metody atomové spektrometrie – absorpční – s atomizací v plameni (FA-AAS) – s elektrotermickou atomizací (ETA-AAS) – s generování par (VG-AAS) – emisní– s ionizací v plameni (FES) – s ionizací v plazmatu (ICP-OES) – fluorescenční (AFS)

OM – SPEKTRÁLNÍ – ATOMOVÁ SPEKTROMETRIE – AAS

Atomová absorpční spektrometrie (AAS) ▫ založené na měření absorbce záření rezonanční spektrální čáry volnými atomy prvku v základním energetickém stavu ▫ absorbováno může být záření pouze o určité energii ▫ přechody pouze valenčních elektronů ▫ zdrojem záření jsou výbojky s dutou katodou (HCL lampy)

▫ Kirchhoffův zákon: „Volné atomy v plynném stavu absorbují záření těch vlnových délek, které by samy vyzařovaly, kdyby byly excitovány“


Atomová absorpční spektrometrie (AAS) ▫ míra absorpce záření se vyjadřuje pomocí:

ABSORBANCE – A – bezrozměrná veličina; tj. [1] – v praxi se používají jednotky AU (absorbance unit)

I0 A  log   log T I Bouguer – Lambert – Beerův zákon

A     l c TRANSMITANCE – T – bezrozměrná veličina; tj. [1] – v praxi vyjádřená po vynásobení 100 v %

OM – SPEKTRÁLNÍ – ATOMOVÁ SPEKTROMETRIE – AAS – FA AAS

AAS s atomizací v plameni (FA-AAS)

OM – SPEKTRÁLNÍ – ATOMOVÁ SPEKTROMETRIE – AAS – FA AAS

AAS s atomizací v plameni (FA-AAS)

OM – SPEKTRÁLNÍ – ATOMOVÁ SPEKTROMETRIE – AAS – ETA AAS

AAS s elektrotermickou atomizací (ETA-AAS) ▫ princip stejná jako AAS – hlavní rozdíl je v atomizátoru (není plamen)

OM – SPEKTRÁLNÍ – ATOMOVÁ SPEKTROMETRIE – AAS – ETA AAS

AAS s elektrotermickou atomizací (ETA-AAS) ▫ princip stejná jako AAS – hlavní rozdíl je v atomizátoru (není plamen) Elektrotermický atomizátor

Teplotní gradient

Vzorek v kyvetě

Absorbance

OM – SPEKTRÁLNÍ – ATOMOVÁ SPEKTROMETRIE – AAS – VG AAS

AAS s generováním par (VG-AAS) ▫ speciální techniky AAS určené pro ultrastopovou analýzu problematických prvků Generování těkavých sloučenin (HG AAS) - převedení analytu na těkavou formu, její oddělení od zbytku vzorku ve formě par - pro As, Se, Sb, Te, Sn, Ge, Bi - o 2 – 3 řády vyšší citlivost a odstranění rušivých vlivů matrice

Metoda studených par (CV AAS) - vyredukování elementární rtuti z kyselého roztoku Hg2+ pomocí SnCl2 vzniklé páry Hg se převedou inertním plynem do křemenné kyvety a měří se A při 253,7 nm - citlivost cca desetiny µg/l

Termooxidační stanovení rtuti (přístroje TMA-254 a AMA-254) - vzorek je spálen v proudu O2 na lodičce při 850 – 900 °C, plyn jde přes katalyzátory do amalgamátoru, kde se postupně Hg zachytává a poté je teplotním šokem vypuzena do tandemových kyvet, kde měří se A při 253,7 nm - citlivost setiny ng, linearita až 4 řády, mikroobjemy vzorku (250 µl, 250 mg)


AAS v analytické praxi (hlavně FA a ETA) ▫ absorpce záření závisí na: - koncentraci měřeného prvku (měřený parametr) - vlnové délce záření (různé λ pro různé prvky) - výšce pozorování záření (různá výška pro různé prvky) - na spektrálních a nespektrálních interferencích ▫ reprodukovatelnost – FA AAS cca 1%, ETA AAS jednotky % ▫ citlivost – FA AAS cca jednotky mg/l, ETA AAS cca 1000 x nižší ▫ linearita – cca 2 – 3 řády ▫ (téměř) vždy lze měřit pouze 1 prvek v čase – velká nevýhoda!

▫ uplatnění v praxi: - stanovení téměř všech kovů, polokovů (B, Si) a někt. nekovů (P) - životní prostředí - klinické analýzy

OM – SPEKTRÁLNÍ – ATOMOVÁ SPEKTROMETRIE – AES

Atomová emisní spektrometrie (AES) ▫ synonymum je optická emisní spektrometrie (OES)

▫ není zde zdroj záření, zdrojem záření jsou samotné excitované prvky ▫ emitováno může být záření pouze o určité energii, tj. určité λ ▫ přechody pouze valenčních elektronů ▫ prvky obsažené ve vzorku se přivádí do budícího (excitačního) zdroje, v němž jim je předána energie k atomizaci (někdy i ionizaci) a excitaci do vyšších energetických stavů. Při návratu do nižších energetických stavů je pak tato energie vyzářena ve formě emisního záření, které je registrováno jako čárové spektrum. ▫ hodnoty emitovaných vlnových délek – kvalitativní údaj (jaký prvek) ▫ hodnoty intenzit vlnových délek – kvantitativní údaj (jaké množství)

OM – SPEKTRÁLNÍ – ATOMOVÁ SPEKTROMETRIE – AES

Emisní čárová spektra prvků

S rostoucím počtem valenčních e- vzrůstá počet přechodů – spektra jsou bohatší

OM – SPEKTRÁLNÍ – ATOMOVÁ SPEKTROMETRIE – AES – FES

Plamenová fotometrie (FES) izolovaná emisní čára emisní spektrum

OM – SPEKTRÁLNÍ – ATOMOVÁ SPEKTROMETRIE – AES – FES

Plamenová fotometrie (FES) ▫ nejjednodušší metoda v AES ▫ budícím zdrojem je plamen o teplotě 2000 – 3150 °C v závislosti na palivu (propan-butan, acetylen) a oxidovadlu (vzduch, oxid dusný) ▫ vhodné pro analýzu snadno excitovatelných prvků (alkalické kovy a kovy alkalických zemin)

plamenový AAS spektrometr lze použít i jako AES spektrometr

OM – SPEKTRÁLNÍ – ATOMOVÁ SPEKTROMETRIE – AES – ICP OES

AES s buzením indukčně vázaném plazmatu (ICP-OES) ▫ nejpoužívanější metoda v AES (možná i v celé AS) ▫ budícím zdrojem je argonová plazma o teplotě až 10 000°C ▫ vhodné pro analýzu téměř všech prvků plazmová hlavice


AES s buzením indukčně vázaném plazmatu (ICP-OES) ▫ Plazma ≠ plamen! Plazma = výboj ▫ ICP = inductively coupled plasma = indukčně vázaná plazma

▫ Plazma - ionizovaný plyn (Ar), který obsahuje dostatečnou koncentraci elektricky nabitých částic , přičemž počet kladných a záporných iontů je stejný - celá soustava je elektricky vodivá, ale nevykazuje náboj = quazineutrální

1 – Analytický kanál 2 – Předehřívací zóna 3 – Počáteční zářivá zóna 4 – Analytická zóna 5 – Chvost výboje 6 – Indukční zóna 7 – Vstup aerosol 8 – Základna výboje


ICP-OES v analytické praxi ▫ Emise záření závisí na: - koncentraci analytu (měřený parametr) - výšce pozorování (zpravidla 5 – 15 mm) - průtoku argonu (10 – 18 l/min) - příkonu (500 – 1500 W)

▫ Umožňuje simultánní multiprvkovou analýzu ▫ Nutno měřit jeden prvek při více vlnových délkách – ověření správ. ▫ Vynikající reprodukovatelnost a minimální vliv matrice ▫ Velice rychlé – všechny prvky v 1 vzorku za cca 1 minutu ▫ Dražší provoz ale nižší DL (jednotky µg/l) a lineární rozsah až 6 řádů! ▫ Využití v praxi – životní prostředí – vodohospodářské laboratoře – klinické laboratoře

OM – SPEKTRÁLNÍ – ATOMOVÁ SPEKTROMETRIE – AFS

Atomová fluorescenční spektrometrie (AFS) ▫ spojuje výhody AES (linearita až 5 řádů) a ETA – AAS (vysoká citlivost) ▫ atom. fluorescenční sp. (AFS) ≠ atom. rentgenfluorescenční sp. (XRF) týká se valenčních elektronů

týká se subvalenčních elektronů

▫ princip – vlivem záření dojde k excitaci e- do vyšších energ. stavů – poté dojde k zářivé deexcitaci – měří se intenzita emitovaného fluorescenčního záření a to pod úhlem 90° vzhledem k budícímu záření! ▫ zdroj záření - výbojka s dutou katodou (HCL lampa) - laser (LIF), je výkonější = vyšší citlivost ▫ atomizace - plameni (jako v FA-AAS) - v grafitové kyvetě (jako v ETA-AAS) ▫ použití – velice málo rozšířené – na speciální ultrastopovou analýzu (AFS s ETA a LIF)


Souhrn základních rozdílů mezi AAS, AES a AFS

OM – SPEKTRÁLNÍ – MOLEKULOVÁ SPEKTROMETRIE

OPTICKÉ METODY

SPEKTRÁLNÍ část 2. – molekulová spektrometrie


Metody molekulové spektrometrie – absorpční – v ultrafialové a viditelné oblasti (UV/VIS) – v infračervené oblasti (IR) – Ramanova spektrometrie v UV/VIS a IR oblasti

– luminiscenční – fluorescence – fosforescence


Úvod do molekulové spektrometrie ▫ princip na základě interakce molekul látky s elektromagnetickým zářením při níž dochází k výměně kvantovaného, přesně vymezeného množství energie ▫ uplatnění hlavně v organické analýze

- identifikace (shoda spektra se standardem či tab. hodnotami) - strukturní analýza (nejsou nutné standardy, náročnější) - kvantitativní analýza (určení obsahu analytu ve vzorku) ▫ typ interakce molekuly látky s elektromagnetickým zářením je dán energií tohoto záření, tj. hodnotou vlnové délky Planckův zákon

E2 – E1 = ∆E = h · ν = h · (c/λ) = h · c · ṽ

„ Čím kratší je vlnová délka λ (nm), tím vyšší je vlnočet ṽ (cm-1) nebo frekvence ν (Hz) a tím větší je i energie E (eV) elektromag. záření“


Metody molekulové spektrometrie


Energetické změny vybraných metod Společné pravidlo absorpční molekulové sp. Projevují se pouze přechody při nichž dochází ke změně dipólmomentu molekuly!


Energetické přechody

V (νn) – elektronové pásy V rozšířené o vibrační hladiny ν ν(Jn) – vibrační pásy ν rozšířené o rotační hladiny J

OM – SPEKTRÁLNÍ – MOLEKULOVÁ SPEKTROMETRIE – ABSORPČNÍ – UV/VIS

UV/VIS spektrometrie ▫ molekulová absorpční spektrometrie v blízké ultrafialové oblasti (200 – 400 nm) a viditelné oblasti (400 – 800 nm) ▫ každá molekula má specifickou absorpci, tzn. že absorbuje v určitých oblastech frekvencí záření, někde více a jinde méně

▫ vlivem absorpce energie fotonu (elektromagnetického záření) dochází k přechodům valenčních elektronů = elektronické přechody ▫ absorpce energie fotonu (elektromagnetického záření) se projeví sníženým zářivým tokem, jehož úbytek se měřen ▫ proč jsou v UV/VIS spektrometrii pásová spektra a nikoliv čárová? Každý elektronický přechod je doprovázen řadou vibračních a rotačních přechodů, jejichž energie se liší o velmi malé hodnoty


Typy elektronických přechodů ▫ σ → σ* - nutná vysoká energie (vzdálená UV oblast; < 150 nm) - jednoduché vazby, nemá téměř význam ▫ n → σ* - nutná menší energie (blízká UV oblast; 150 – 250 nm) - molekuly s heteroatomy (O, S, N, X) s volnými e- páry ▫ π → π* a n → π* - nutná nejmenší energie (blízká UV oblast a VIS) - molekuly s dvoj. a troj. vazbami a funkčními skup.


Absorpce záření ▫ intenzita absorpce záření se vyjadřuje pomocí:

ABSORBANCE – A – bezrozměrná veličina; tj. [1] – v praxi se používají jednotky AU (absorbance unit)

I0 A  log   log T I TRANSMITANCE – T – bezrozměrná veličina; tj. [1] – v praxi se vyjadřuje zpravidla

T%  T 100 

 0

100 [%]


Absorpce záření ▫ intenzita absorpce se řídí Bouguer – Lambert – Beerovým zákonem

A     l c Aλ – absorbance při dané λ λ – absorpční koeficient při dané λ l – optická dráha c – koncentrace absorbující látky

Molární absorpční (extinkční) koeficient  λ – jakou absorbanci při dané vlnové délce má látka o koncentraci 1 mol/l v kyvetě o délce 1 cm

Specifický absorpční (extinkční) koeficient Aλ1% – jakou absorbanci při dané vlnové délce má látka o koncentraci 1 % v kyvetě o délce 1 cm


Absorpce záření ▫ absorbance je aditivní veličina n

n

i 1

i 1

A   Ai ,   1,  l c1   2,  l  c2    n ,  l  cn  l    i  ci Aλ – absorbance při dané λ λ – absorpční koeficient při dané λ l – optická dráha c – koncentrace absorbující látky

Podmínky použití pro výpočet při analýze více látek – změřit absorbanci při takovém počtu vlnových délek jako je počet stan. látek – vlnové délky volit tak, aby se absorpční koeficienty složek co nejvíce lišily – výpočet pomocí soustavy rovnic (analýza 2 látek = 2 rovnice o 2 neznámých)


Typická spektra přírodních barviv


Jednoduchý fotometr ▫ Měření absorbance při jedné vlnové délce ▫ Obsahuje 4 základní části: – zdroj záření – deuteriová nebo vodíková výbojka (UV) – wolframová žárovka (VIS) – monochromátor – optická mřížka – kyveta se vzorkem – křemenná (UV) – skleněná (VIS) – detektor – fotonásobič


Spektrofotometr (s PDA) ▫ Měření absorbance při více vlnových délkách současně ▫ Obsahuje 4 základní části – zdroj záření – deuteriová nebo vodíková výbojka (UV) – wolframová žárovka (VIS) – kyveta se vzorkem – křemenná (UV) – skleněná (VIS) – disperzní prvek – hranol nebo holografická mřížka – detektor – diodové pole (photodiode-array = PDA)

Nyní téměř vždy ve dvoupaprskovém uspořádání - 2 kyvety - pro slepý a měř. vz.


UV/VIS spektrometrie v analytické praxi ▫ Absorpce záření závisí na: - koncentraci analytu (měřený parametr) - vlnové délce (200 – 800 nm) - optické dráze (0,2 – 5 cm) ▫ Pozor na negativní vlivy rozptylu a luminiscence!

▫ Optimální interval měřených hodnot absorbance je cca 0,4 - 1 ▫ Důležitý je výběr vhodné vlnové délky! ▫ Využití v praxi – velmi široké využití v analytické chemii, biochemii... – Měření absorpčních spekter - určování struktury (omezené mož.) – Sledování chem. rovnováh a kinetiky reakcí, stan. fyz. konstant – Kvantitativní organická i anorganická analýza – Detektory u separačních (LC a ELFO) a diagnostických metod

OM – SPEKTRÁLNÍ – MOLEKULOVÁ SPEKTROMETRIE – ABSORPČNÍ – INFRAČERVENÁ SP. (IR)

Infračervená spektrometrie ▫ molekulová absorpční rotačně – vibrační spektrometrie v infračervené oblasti (12 500 – 100 cm-1) ▫ každá molekula má specifickou absorpci, tzn. že absorbuje v určitých oblastech frekvencí záření, někde více a jinde méně ▫ molekula může absorbovat pouze určité kvantum záření: „frekvence záření se musí shodovat s frekvencí vibrace“ ▫ vlivem absorpce energie elektromagnetického záření dochází ke změně molekulových vibrací (a rotací) = rotačně – vibrační přechody ▫ S rostoucím počtem atomů v molekulách značně vzrůstá počet základních vibrací a také počet absorpčních pásů ▫ IR spektra jsou podstatně složitější než UV/VIS spektra, ale poskytují mnohem více informací o struktuře látky


Vibrace v IR spektrometrii valenční (změna délky vazeb)

deformační (změna úhlu vazby)

Frekvence valenčních vibrací jsou vždy vyšší než frekvence deformačních vibrací dané funkční skupiny


Vibrace v IR spektrometrii


Absorpce IR záření


Identifikace látek v IR spektrometrii


IR spektrometr ▫ měření transmitance nebo absorbance ▫ obsahuje 4 základní části: – zdroj záření – elektricky vyhřívaná keramická tyčinka nebo tyčinka z kovů vzácných zemin vyhřívaná až na 1500 °C) – monochromátor – optická mřížka nebo hranol (z NaCl a/nebo KBR) – kyveta se vzorkem – z NaCl nebo KBr

– detektor – využívají tepelných účinků záření (termočlánek)


FTIR spektrometr ▫ měření transmitance nebo absorbance ▫ nemá monochromátor – k rozlišení λ používá princip Michelsonova interferometru ▫ paprsek ze zdroje polychromatického záření vstupuje na polopropustné zrcadlo, kde se 50 % odráží na fixní zrcadlo a 50 % propouští na pohyblivé zrcadlo ▫ vzorkem prochází najednou oba paprsky s dráhovým posunem: - ve fázi (sčítají se = zesílení signálu) - mimo fázi (odečítají se = zeslabení signálu)

Získaný interferogram (funkce času) se převádí pomocí fourierovy transformace na spektrum (funkce λ)

OM – SPEKTRÁLNÍ – MOLEKULOVÁ SPEKTROMETRIE – RAMANOVA SPEKTROMETRIE

Ramanova spektrometrie ▫ molekulová rotačně – vibrační spektrometrie v ultrafialové (UV), ve viditelné (VIS) a infračervené oblasti

▫ vlivem výměny energie elektromagnetického záření a molekuly dochází ke změně molekulových rotací nebo rotací a vibrací = rotačně – vibrační přechody ▫ nevyužívá přímé absorpce záření ale molekulárního kombinačního rozptylu vysoce monochromatického záření na molekulách látek ▫ rozptyl světla - na částečkách - Tyndallův efekt (bez změny λ) - na molekulách - Rayleighův efekt (bez změny λ) - Ramanův efekt (změna λ)


Ramanova spektrometrie ▫ po srážce fotonů s molekulami se převážná část záření (cca 99 %) odrazí beze změny λ (pružná srážka) ▫ malá část záření (cca 1 %) se odrazí s jinou λ (nepružná srážka) ▫ spektrum tohoto záření je tvořeno čárami nebo pásy s λ posunutými oběma směry oproti délce původního záření (Ramanův posun) ▫ měří se závislost intenzity rozptýleného záření na jeho vlnové délce

rozptýlené (Rayleigh) - pružná srážka - stejná frekvence

budící záření

rozptýlené (Raman) - nepružná srážka - různá frekvence


téměř 1%

cca 99 %

téměř 0%

Antistokesovy linie jsou zrcadlovým obrazem stokesových linií


Základní podmínka v Ramanově sp. ▫ při nepružných srážkách dochází ke změně Evnitřní a nikoliv Ekinetická ▫ při srážce s fotonem nedochází k jeho pohlcení (absorpci) molekulou, ale jen ke změně rozložení náboje (elektronové hustoty) v molekule

▫ dochází tedy k polarizaci molekuly ▫ podmínkou aktivity vibrace a/nebo rotace a výskytu odpovídajícího pásu v Ramanově spektru je nenulová změna polarizovatelnosti při vibračním a/nebo rotačním přechodu Rozdíl podmínky IR spektrometrie od podmínky Ramanovy spektrometrie: podmínkou aktivity vibrace a/nebo rotace a výskytu odpovídajícího pásu v infračerveném spektru je nenulová změna dipólmomentu při vibračním a/nebo rotačním přechodu


Význam pro identifikaci a strukturní analýzu ▫ RAMANŮV POSUN (rozdíl frekvencí mezi rozptýleným a budícím z.) - nezávisí na frekvenci budícího záření, ale... - ...odpovídá energii rotačně vibračních stavům mezi nimiž dochází k přechodu - tato energie je kvantována (pouze určité hodnoty energií, tj. určité frekvence) - shoduje se s frekvencí odpovídajícího absorpčního pásu v IR nebo MW spektru - odpovídá určitým vazbám v molekule

▫ RAMANOVO SPEKTRUM - velmi podobné IR spektru - některé pásy se objevují - pouze v Ramanově spektru V závislosti na změně - pouze v IR spektru dipólmomentu a/nebo - v obou spektrech polarizace molekuly - žádném spektru - u molekul se středem symetrie nenalezneme pro žádnou z Ramanových linií odpovídající pás v infračerveném spektru - výrazně se projevují symetrické vibrace


Ramanovo spektrum


Ramanovo spektrum vs. IR spektrum


Ramanův spektrometr ▫ 4 základní části - zdroj budícího záření – plynový laser nebo laditelný barviový laser - kyveta se vzorkem – skleněná nebo křemenná - monochromátor – vysoce kvalitní, 2 mřížky Budící záření musí být: - vysoce monochromatické - detektor - co nejvíce intenzivní

Lze i v provedení s Fourierovou transformací = FTRS spektrometry


Ramanova spektrometrie v analytické praxi ▫ zprac. a interpretace spekter i aplikace metody je stejné jako u IR ▫ Ramanova a IR spektrometrie se vzájemně doplňují!

▫ Výhody oproti IR spektrometrii: - přehlednější spektra (méně pásů) - práce ve VIS oblasti – stačí skleněné nebo křemenné kyvety - celé spektrum v jednom rozpouštědle (voda, CCl4, CHCl3) - stačí i méně než 1 mg vzorku - přesnější kvantitativní analýza ▫ identifikace organických látek pomocí knihoven spekter

▫ strukturní analýza organických látek ▫ pro pevné, kapalné i plynné vzorky ▫ pozor na negativní vlivy fluorescence a rozptylu na pevných částicích

OM – SPEKTRÁLNÍ – MOLEKULOVÁ SPEKTROMETRIE – LUMINISCENČNÍ

Luminiscenční spektrometrie ▫ molekulová luminiscenční (emisní) spektrometrie v blízké ultrafialové oblasti (200 – 400 nm) a viditelné oblasti (400 – 800 nm) ▫ každá molekula má specifickou absorpci, tzn. že absorbuje v určitých oblastech frekvencí záření, někde více a jinde méně

▫ vlivem absorpce energie fotonu (elektromagnetického záření) dochází k přechodům valenčních elektronů = elektronické přechody ▫ po přechodu do excitovaného stavu dochází ihned k deexcitaci, při níž se látka zbavuje energie vyzářením (emisí) záření o jiných, zpravidla delších, vlnových délkách ▫ vyšší hodnoty vlnových délek emitovaného záření jsou důsledkem nezářivých přechodů, které v molekule probíhají a na které je část absorbované energie spotřebována


Luminiscenční spektrometrie ▫ využívá jevu FOTOLUMINISCENCE = sekundární záření, které molekuly látky vyzařují (emitují) po absorpci primárního (budícího) záření z UV/VIS oblasti ▫ Fotoluminiscence se dělí podle doby trvání emise záření (dosvitu):

– FLUORESCENCE (10-9 - 10-6 s) – FOSFORESCENCE (10-6 - 102 s)

▫ Měření fluorescence či fosforescence téměř vždy pod úhlem 90° ve směru paprsku budícího záření!


Jablonského diagram


Excitační a emisní spektrum

Stokesův posun: maximum absorpčního a fluorescenčního spektra látky je posunuto díky vnitřní konverzi a vibrační relaxaci

OM – SPEKTRÁLNÍ – MOLEKULOVÁ SPEKTROMETRIE – LUMINISCENČNÍ – FLUORESC. SP.

Fluorescenční spektrometrie ▫ Excitace molekuly absorpce UV/VIS záření o energii odpovídající elektronovému přechodu

▫ Emise záření vyzáření energie ve formě fotonů při deexcitaci do základního stavu doba emise: 10-9 - 10-6 s

S1

S0


Fluorescenční spektrometrie ▫ vysoká rychlost vnitřní konverze

S1

▫ vždy na nulovou hladinu excitovaného singletového stavu S1

▫ k fluorescenci dochází vždy ze stejné hladiny (exc. singletového stavu S1) bez ohledu na to, na jakou hladinu byla molekula vybuzena ▫ λmax fluorescenčního pásu a tvar pásu nezávisí na λ budícího UV/VIS záření ▫ λ budícího UV/VIS záření ovlivňuje pouze intenzitu fluorescence

S0


Fluorescenční spektrometr

▫ 5 základních částí - zdroj - dříve Hg výbojka - poté deuteriová výbojka nebo wolframová lampa - nejnověji pulsní zdroje (Xe výbojka, lasery) - excitační monochromátor - kyveta se vzorkem - emisní monochromátor - detektor


Měření emisních spekter ▫ při konstantní λ excitačního (budícího) záření

▫ Excitační monochromátor nastaven na fixní vlnovou délku (většinou maximum absorpce) ▫ Emisní monochromátor skenuje spektrum emitovaného záření


Měření excitačních spekter ▫ při konstantní λ emitovaného (fluorescenčního) záření

▫ Excitační monochromátor skenuje spektrum ukazující, které vlnové délky jsou schopné excitovat zkoumanou látku ▫ Emisní monochromátor nastaven na fixní vlnovou délku (většinou dál za maximem emise fluorescence)


Fluorescence v analytické praxi ▫ Intenzita fluorescence závisí na: - koncentraci analytu (měřený parametr) - vlnové délce excitačního a emisního záření (200 – 800 nm) - teplotě (roste s klesající teplotou) - viskozitě (roste s rostoucí viskozitou) ▫ Pozor na negativní vliv látek zhášejících fluorescenci (O2, karb. skup.) ▫ až 1000x citlivější než UV/VIS spektrometrie (LOD až 10-12g = 1 pg) ▫ Využití v praxi – ultrastopová organická analýza v ŽP (PAU ve vodách a půdách), v potravinářském průmyslu (aflatoxiny v oříškách aj.), klinická an. – detektory v kapalinové chromatografii (LC) – studium reakční kinetiky, čistota látek (shoda exc. a em. spektra) – anorganická analýza Al, Be, Ga, Lu aj. jako fluoreskující komplexy po reakci s der. salicylaldehydu či 8-hydroxychinolinu (LOD až 10-7 g/l)

OM – SPEKTRÁLNÍ – MOLEKULOVÁ SPEKTROMETRIE – LUMINISCENČNÍ – FOSFORESC. SP.

Fosforescenční spektrometrie ▫ přechod z nulové hladiny excitovaného singletového stavu S1 do nulové hladiny excitovaného stavu T1 nezářivým mezisystémovým přechodem a následná zářivá deexcitace do různých hladin základního singletového stavu S0

OM – SPEKTRÁLNÍ – MOLEKULOVÁ SPEKTROMETRIE – LUMINISCENČNÍ – FOSFORESC. SP.

Fosforescenční spektrometrie ▫ velice podobné fluorescenční spektrometrii: - měření emitovaného (fosforescenčního záření) kolmo na směr budícího záření - spektra (pásové, vibrační struktura) - zákonitosti (tvar ani λmax emisního spektra nezávisí na λ budícího záření) - vliv teploty (s klesající teplotou roste intenzita fosforescence) - kombinované přístroje pro měření fluorescence i fosforescence

▫ hlavní rozdíl od fluorescence je v delší době trvání emise záření! ▫ lin. závislost IFOSF na koncentraci jen v úzkém rozsahu nízkých konc. ▫ uplatnění v analytické praxi: - podstatně méně rozšířené než fluorescenční spektrometrie - organická analýza: léčiva, polyaromatické uhlovodíky (PAU) - anorganická analýza: prvky vzácných zemin, sloučeniny uranu

Děkuji za pozornost

OPTICKÉ METODY. NESPEKTRÁLNÍ při interakci nedochází k výměně energie

Recommend Documents