Oktatási segédanyag Összeállították: Cseh Sándor, Horváth András, Nagy Ádám, Solti László, Somoskői Bence, Szelényi Zoltán A segédanyag célja, hogy segítsük a hallgatók felkészülését a vizsgákra, azonban nem helyettesíti az előadásokon elhangzottakat!
BEVEZETÉS AZ EMLŐSÖK SZAPORODÁSBIOLÓGIÁJÁBA
1. Alapfogalmak
Az állatok szaporodása ciklusban ismétlődő körfolyamat. Az ivarérést (pubertást) követően a legtöbb emlősfaj nőivarú egyedei, fajonként változó, 17-28 napos nemi ciklusokat mutatnak. A nemi cikluson belül van egy - általában - rövid időszak, amikor termékenyek, illetve elfogadják a hím közeledését (receptívek) és hajlandóak párosodni a hímmel. A hímek viszont a pubertást követően folyamatosan termelnek spermiumokat, így tulajdonképpen állandóan termékenyek, bár vannak olyan fajok (pl. kiskérődzők) melyek esetében a spermiogenezist/spermiumok termelését befolyásolja az évszak. Az anyajuhok és a nőstény macskák ciklusa átlagosan 17 nap, ezzel szemben a legtöbb házi emlősállatnak 21 napos ciklusa (ivarzási ciklus) van (21 naponta ovulál és mutatja az ivarzás jeleit). A ciklus az ivarzással kezdődik és a következő ivarzásig tart. A főemlősöknek (a ciklus hossza fajtól függően 28-34 nap) és az embernek menstruációs ciklusa van, ami a menstruációs vérzéssel kezdődik és az ovuláció a ciklus közepén van. Emberben a ciklus hossza 28 nap. A nőstények nemi ciklusa egyes fajoknál egész évben ciklusosan ismétlődik (poliösztruszos faj, pl. szarvasmarha), más fajok az évnek csak egy meghatározott időszakában/szakaszában mutatják az ivarzás jeleit (szezonálisan poliösztruszos faj, pl. juh). A szuka ciklusa különösen hosszú és esetében évente 1 (maximum 2) tüzelés/ivarzás fordul csak elő (monoösztruszos faj). A nőivarú állatok ciklikus nemi működését a termékenyülés szakítja meg, amit a vemhesség, az ellés, illetve a szoptatás követ. 1
Egyes fajok ciklusa az ellést követő néhány héten belül magától újraindul, másoknál a szoptatás ideje alatt még nincs ciklikus nemi működés, hanem egy ideig úgynevezett laktációs anösztrusz következik, mikor a nőstények nem mutatnak ciklusos nemi működést. Példának hozható ide élettani körülmények között az összes kérődző (de a tejelő tehén nem!), vagy akár a sertés és az ember is. A szaporodás tehát nemcsak a nőstények rendszeres ciklusai miatt körfolyamat, hanem az első termékenyüléstől, a vemhesség, ellés, szoptatás és újra ciklusba lendülés lépésein keresztül a következő termékenyülésig tartó „nagy ciklus” miatt is. 1.1. A nőivarú emlősök ivari ciklusának alaptípusai
Az emlősök nemi ciklusának két fő típusa különíthető el, kívülről is jól látható jelek alapján. Az elsőnek említendő ezek közül az ösztrusz (ivarzási) ciklus, ami általában 21 napos. Nevét arról kapta, hogy a nőstények az ovuláció körüli időszakban jellegzetes, jól felismerhető viselkedést mutatnak, a ciklus ösztrusz stádiumában. Ilyenkor fogadják csak el a hímek közeledését és ekkor hajlandóak párosodni. Ez a típus jellemző az összes házi és a legtöbb vadon élő emlősfajra. A ciklus hosszát általában a megfigyelhető ivarzás első napjától számítják (ez a ciklus 0. napja). A másik fő típus a főemlősökre jellemző ún. menstruációs ciklus, ami, átlagosan 28-34 napig tart (fajtól függően). A nőstények kívülről is jól látható (viselkedési és nemi szervi) tüneteket a menstruáció időszaka alatt mutatnak, de a menstruációs ciklusnak nincs olyan szakasza, amikor a receptivitás fokozódásával összhangban egyértelmű viselkedésbeli változások jelennének meg. A nő nemi ciklusának hossza 28 nap. A nemi ciklus kezdete (0. nap) a menstruációs vérzés megjelenésének napja. 1.2. A nemi ciklus Az ösztrusz ciklus a petefészken található képletek alapján két részre, az ún. follikuláris (tüszőfázis) és luteális fázisra (sárgatestfázis) osztható. Előbbi a tüszőnövekedéssel fémjelzett, utóbbi pedig a sárgatest által dominált időszak. Az
2
ösztrusz ciklusban a luteális fázis hosszabb a follikuláris fázisnál, a menstruációs ciklusban azonban ezek aránya nagyjából megegyezik (pl. 14-14 nap az emberben). A follikuláris és a luteális fázisok további 2 – 2 szakaszra bonthatók (összesen tehát 4 szakasza van a ciklusnak). A follikuláris fázist a proösztrusz és ösztrusz szakaszokra, míg a luteális fázist a metösztrusz és diösztrusz szakaszokra bonthatjuk. A proösztrusz az előző ciklus sárgatestfázisát lezáró luteolízis után kezdődik. Ilyenkor intenzív a tüszőnövekedés, a további fejlődésre kiszelektált harmadlagos follikulusok egyre közelebb jutnak az ovulációhoz. Hossza jellemzően 2-3 nap, kivéve a szukában ahol átlagosan 9 nap. Az ösztrusz ideje alatt a domináns tüsző által termelt 17β-ösztradiol (E2) hatására megjelennek a fajra jellemző viselkedésbeli tünetek és ezek részeként a nőstények hajlandóak párosodni a hímmel. A legtöbb fajban ilyenkor következik be az ovuláció, kivéve a szarvasmarhában, ahol ez 12-16 órával az (egyébként igen rövid) ösztrusz vége után következik be. Az ösztrusz hossza fajok közt változik, tehénben például átlagosan 0.5-1 napig tart, de kocában 2-3 napos, kancában pedig 5-7 napos. Az ovulációt követő metösztrusz során, nagyjából 2-3 nap alatt fejlődik ki a sárgatest (corpus luteum), majd innentől a diösztrusz következik. A diösztrusz alatt a sárgatest felelős a progeszteron (P4) termeléséért. A P4 előkészíti a méhnyálkahártyát az embrió befogadására. A diösztrusz átlagosan 2 hétig tart, kivéve a kutyában, ahol a normál ciklus részeként is 2-3 hónapos. Tehát a proösztrusz és ösztrusz együtt képezik a ciklus follikuláris- vagy tüszőfázisát, a metösztrusz és diösztrusz pedig a luteális- vagy sárgatestfázist. A fentiek alapján kiszámolható, hogy szarvasmarhánál például 17-18 nap a luteális fázis hossza, míg a follikuláris fázis csupán 3-4 napig tart. Ehhez nagyon hasonló szerkezetet mutat a koca és az anyakecske ciklusa is. Ezzel szemben az anyajuhok rövidebb (17 napos) ciklusa esetében a follikuláris fázis hasonlóképpen 3-4 napig tart, de a luteális fázis rövidebb, csak 13-14 napos. A kancában, ahol a hosszú (5-7 napos) ösztrusz szakasz miatt a follikuláris fázis átlag 7-10 napos is lehet, a luteális fázis csak 11-14 napos. Ettől nagyon eltér a szuka ciklusa, ahol az átlagosan 15-25 napig tartó tüzelést (= follikuláris fázis) egy 70-90 napig tartó luteális fázis követi (diösztrusz vagy metösztrusz; a szakma nem egységes abban a tekintetben, hogy ezt a szakaszt hogyan nevezzük). A macska különlegessége, hogy az ösztrusz szakaszban nem történik meg spontán az ovuláció, mert azt az ismételt párzások által kiváltott neuroendokrin reflexív fogja indukálni. Emiatt a macska a reflexesen ovuláló (indukált ovulátor) fajok közé tartozik, akárcsak a 3
vadászgörény, a házinyúl vagy a tevefélék (láma, alpaka is). Ebből következően macskánál párzás hiányában nem képződik sárgatest, ezért a ciklusnak nincs luteális fázisa, hanem egy rövid, 1-2 hetes, szexuálisan inaktív periódus (ún. interösztrusz) után újra ivarzani kezd az állat. Ezzel magyarázható, hogy kizárólag follikuláris fázisok követik egymást, egészen addig, míg ezeket meg nem szakítja egy párzás, ami legtöbbször vemhességgel végződik. Vadászgörény esetében a folyamatosan ismétlődő follikuláris fázisok komoly patológiai következménnyel is járhatnak. A párzás hiánya miatt folyamatosan ismétlődő, megszakítatlan tüszőnövekedési hullámok/follikuláris fázisok által termelt nagy mennyiségű ösztradiol (hyperoestrogenismus) miatt csontvelő-szuppresszió, alopecia és cachexia jelentkezik, ami az állat életét is veszélyezteti. Ez a kórkép a háziasítás következménye, mert a természetben a párzások által indukált vemhességek rendszeresen megszakítják a görények ismétlődő follikuláris túlsúlyát.
1.3. A menstruációs ciklus A főemlősök menstruációs ciklusa is follikuláris és luteális fázisra osztható. A menstruációs ciklus hossza, fajtól függően tipikusan 25-34 nap között változik. Ezen belül kb. 14 napig tart a sárgatest által dominált luteális fázis és ugyancsak kb. 14 nap hosszú a tüszőfázis is. Az ovuláció a ciklus közepén van. A luteális fázis végén bekövetkező luteolízis miatt csökkenő P4-szint felelős a menstruáció jelenségéért. A hormonális változások hatására a megvastagodott és intenzív vérellátású méhnyálkahártya erei a mestruációt megelőző órákban összeszűkülnek. A romló vérellátás miatt az endometrium sejtjei tömegesen elhalnak (necrosis) és az elhalt felső mucosa-rétegek leválásával megkezdődik a mestruációs vérzés, ami általában 2-6 napig tart. 1.4. Szezonalitás Háziállataink közül poliösztruszosnak tekintjük azokat a fajokat, melyek egész évben, évszaktól függetlenül ivarzanak. Ide tartozik a szarvasmarha, a sertés, a rágcsálók. Ezen állatoknál a nőivarú egyedek ciklikus nemi működésére nem vagy csak minimális hatással van a nappalok hosszának váltakozása az év folyamán. Itt jegyzendő meg, hogy a sertés szaporodási mutatói a nyári időszakban látványosan 4
rosszabbak lehetnek, amiben feltételezés szerint a hőstressz (magas hőmérséklet) mellett az is szerepet játszhat, hogy a házi sertés őse, a vaddisznó mutat kismértékű szezonalitást. A hőstressz a tehenek ciklusára és termékenységére (fertilitására) is kedvezőtlen hatású, ami azonban kevésbé a szezonnal, sokkal inkább az optimálisnál magasabb hőmérséklettel magyarázható. Szezonálisan poliösztruszos fajok a kiskérődzők (pl. juh, kecske), valamint ló és a macska, ezeknél az ivari ciklusok jelentkezése összefüggést mutat a megvilágított órák számának változásával, ami viszont évszakos ingadozást mutat. A változó fényviszonyokkal kapcsolatos információt - a melatonin termelése révén - a tobozmirigy közvetíti a hipotalamusz felé. A melatonin szintézise viszont a megvilágítással van összefüggésben. A retinát érő intenzív fényingerek hatására a kétoldali nervus opticus kereszteződése felett található hipotalamikus mag (nucleus suprachiasmaticus) a nyaki szimpatikus dúc (ganglion cervicale craniale) noradrenerg neuronjainak excitációját egy közbeiktatott gátló interneuron révén csökkenti. Ezek a noradrenerg neuronok a tobozmirigy melatoninerg sejtjeivel (pinealociták) vannak kapcsolatban és fény hiányában (este, sötétben) fokozzák azok melatonin szintézisét. Sok fény (nappal) hatására viszont a melatonin leadása csökken. Szezonálisan ivarzó állatoknál a melatoninnak neurotranszmitterként és hormonként egyaránt fontos szerepe van a hipotalamikus GnRH neuronok aktivitásának szabályozásában. A melatonin azonban nem közvetlenül a GnRH neuronokon hat, hanem az úgynevezett kisspeptin-neuronok aktivitását befolyásolja interneuronokon keresztül (lásd később). Attól függően, hogy a tobozmirigy fokozott aktivitása serkenti, vagy gátolja a nemi működést, beszélhetünk rövid nappalos és hosszú nappalos állatokról. Hosszú nappalosak közé tartozik a ló és a házimacska. Ezekben a fajokban a csökkenő melatonin szint indukálja a ciklikus nemi működést. Ezzel szemben a rövid nappalos kiskérődzőknél a növekvő melatonin szint indukálja a ciklikusságot. Szezonális állatoknál az évszak a hímek spermiogenezisére is hatással van, de ez állattenyésztési szempontból elsősorban kosokban és bakokban jelentős, ahol szezonon kívüli pároztatás esetén a hímek kevesebb anyát tudnak eredményesen befedezni, mint szezonon belül és ehhez kell igazítani az egy kosra jutó csoportlétszámokat. Kifejezett szezonalitás csak a mérsékelt övi területeken figyelhető meg, az egyenlítőhöz közeledve a megvilágított órák számának hatása egyre csökken, helyette az egyes fajok nemi működését főleg a táplálék elérhetősége, s így közvetve az esős és száraz évszakok váltakozása befolyásolja. 5
A szezonálisan ivarzó fajoknak a fentieken kívül további két nagy csoportját lehet megkülönböztetni aszerint, hogy ciklikus működésüket milyen mértékben lehet befolyásolni a megvilágított órák számának változtatásán keresztül. Eszerint cirkannuális fajoknak tekintjük a kiskérődzőket, a lovat és a macskát is (továbbá a szarvasféléket, ürgét, mormotát), melyeknek belső biológiai órájuk van, és ez folyamatos, állandó megvilágítás mellett is nagyjából évente indukálja az ciklikus ivari működést. Ezeknél a ciklikus nemi működést mesterséges megvilágítással sem lehet egész évben fenntartani. Mindazonáltal fényprogramot gyakran alkalmaznak a lovak szaporításában a tenyésszezon előrehozása érdekében, de fontos szem előtt tartani, hogy az eredményes indukcióhoz szükséges egy rövid nappalos periódus megléte is a kezelés előtti időszakban. A megvilágított órák mesterséges növelése, majd csökkentése mellett juhokban a ciklikus nemi működés szezonon kívüli indukciójára melatonin implantátumot is lehet használni. A nem cirkannuális fajok közé tartozik az egér és a patkány, ezek ugyanis egész évben tartó folyamatos megvilágítás mellett is mutatnak nemi aktivitást. 1.5. Anösztrusz Anösztrusznak hívjuk azt az állapotot, amikor a nőivarú állat nem mutat ciklikus nemi működést (nincs ivarzás). Háziállatok esetében viszont tisztázni kell, hogy az állat tényleg nem ivarzik vagy csak nem detektáltuk (nem vettük észre) az ivarzást. Az első csoportba tartoznak a valódi anösztruszos nőstények, a másodikba pedig a látszólag anösztruszos állatok. Ez utóbbiak esetében a petefészkeket vagy a hormonszinteket megvizsgálva rendszeres ciklikus petefészek működést lehet megállapítani. Ez esetben a problémát az alkalmazott ivarzás-megfigyelési módszer elégtelen hatékonysága vagy pontossága okozza, ezért nem vették észre, amikor az állat ivarzott. Az okok között szerepelhet az ún. csendes ivarzás is, ami kifejezetten gyakori tejelő tehenekben az ellés után, vagy például kancában a szezonátmeneti időszakban (lásd később). Csendes ivarzás esetében az állat csökkent intenzitással mutatja az ivarzás külső tüneteit. A valódi anösztrusznak két fő típusát különítjük el. A primer anösztrusz esetében a fiatal állat első ivarzása nem jelentkezik a fajra meghatározott időn belül. Ennek hátterében mindig valamilyen kóros folyamat áll, gyakran ivarszervi fejlődési rendellenességek vagy alultápláltság. Ezzel szemben a szekunder anösztrusz alatt 6
azt értjük, hogy a nőivarú állat mutatott már életében ciklikus működést (ivarzást), de ez jelenleg valamilyen ok miatt szünetel. Szezonális állatoknál esetében az anösztrusz élettani állapot a szezonon kívül, illetve minden fajban a vemhesség alatt és a pubertást megelőzően. Egyes állatokban ezen kívül megfigyelhető ún. laktációs anösztrusz is, mely azt jelenti, hogy a nőstény a szoptatás ideje alatt, vagy annak egy részében nem lendül ciklusba a szopással társuló ingerek hipotalamikus működésre kifejtett gátló hatása miatt. Ez a jelenség kifejezett szoptató húshasznú teheneknél, ahol az ellés utáni anösztrusz hosszát elsősorban a szopások frekvenciája határozza meg. Sertésnél az első ivarzás csak a malacok leválasztását követően várható, de laktációs amenorrhea megfigyelhető az emberben is. A szuka esetében megemlítendő, hogy a ciklus része egy rendkívül hosszú, átlagosan 4-6 hónapig tartó anösztrusz, ami nem számít kórosnak. Az élettani állapotokon kívül számos kóros folyamat társjelenségeként előfordulhat valódi anösztrusz, így fajtól függően a stressz (vagy Cushingszindróma, esetleg iatrogén hypercortisolaemia), hypothyroidismus, méhgyulladások, szisztémás gyulladásos betegségek, petefészek daganatok vagy ciszták, krónikus alultápláltság, illetve bármilyen egyéb energiahiányos állapot következménye is lehet.
1.5. A pubertás
A pubertás (ivarérés) definícióját nő- és hímivarú állatokban is többféleképpen lehet meghatározni. Idejét nőstények esetében meghatározhatjuk az első detektált ivarzás vagy az első ovuláció alapján. A kettő ugyanis gyakran nem esik egybe, így üszőkben például az első ovulációt nem mindig kísérik az ivarzás jellegzetes tünetei, de a másodikat már igen. Tenyésztésbe vételi szempontból mindenképpen figyelembe kell venni az állat testméretét is, hogy képes-e már kihordani egy magzatot. Ebből kifolyólag a pubertás (ivarérettség) után általában még néhány hónapot várnak, mielőtt tenyésztésbe vennék az állatot (tenyészérettség). Hímekben a pubertás ideje meghatározható a hímszerű viselkedésformák (ugrálás, erekció) jelentkezése vagy az első ejakuláció ideje alapján, továbbá úgy is, ha azt vesszük figyelembe, hogy mikor jelennek meg spermiumok, vagy mikor érnek el egy küszöbkoncentrációt először az ejakulátumban. A hímek ugyanis előbb válnak képessé az ejakulációra, minthogy a 7
spermiogenezis teljes intenzitással megindulna a herékben. Akármelyik definíciót is használjuk, a hímek és nőstények esetében is fajonként változik a pubertás körüli átlagos életkor, de kutyafélékben például fajták között is nagy változatosság figyelhető meg. A nőivarú állatoknál egy bizonyos testtömeg elérése elengedhetetlen a pubertás bekövetkeztéhez, amely elsősorban a zsírdepók mennyiségével áll összefüggésben. A zsírsejtek által termelt leptin ugyanis a vér-agy gátat megkerülve hat a hipotalamusz neuropeptid-Y termelő idegsejtjeire és GnRHneuronjaira is, s ezek aktivitását fokozza, ami szükséges a pubertáskori endokrin változások beindításához (lásd később). Ezen kívül fontos tényező a pubertás idejének kialakításában a szezonális fajok esetében az évszak is, de számos fajban kimutatták már, hogy az is hatással van rá, hogy mely hónapban született az egyed. Továbbá az ivarérett hímivarú állatok jelenléte feromonok révén általában serkenti a prepubertális nőstények ivarérését, ahogy az is befolyással van rá, hogy mekkora csoportokban tartják összezárva a még nem ivarérett nőivarú egyedeket. Ez utóbbi az állattenyésztési technológiából fakadóan elsősorban süldők esetén kifejezett, ahol a nagy létszámú csoportokban korábban következik be a pubertás (ivarérés). 1.6. Hormonkezelések a szaporodásbiológiában
A ciklus-indukciós kezelések célja, hogy élettani (pl. szezonon kívül) vagy kóros okok miatt anösztruszos állatokban gyógyszeresen elindítsák a ciklikus petefészek működést. Ezzel szemben a szinkronizálás (ivarzás szinkronizálás) azt jelenti, hogy az egyébként rendszeresen ivarzó nőstényeket (ciklusban lévő nőstényeket) kezelve, azok ivarzását összehangoljuk (hogy egy adott időszakban jelentkezzen az összes állat ivarzása). Sor kerülhet ilyen kezelésre például munkaszervezési okokból vagy embriótranszfer program részeként, stb.. Az ösztrusz indukciónak juhok mellett kutyában is jelentősége van („tüzelés indukciója”), ahol a ciklus része egy igen hosszú (akár 4-6 hónapos) anösztruszos stádium is. A cél ennek lerövidítése, hogy mielőbb újra tüzeljen a szuka. Ennek ellenkezője az ösztrusz szuppresszió, amikor a nőstény ciklikus nemi működését, ivarzását megelőzzük, elnyomjuk. Ennek főleg kedvtelésből tartott állatok esetében (kutya, macska), illetve rendezvényre vitt kancák esetében van jelentősége. 8
Az ovuláció indukciója esetén a megfelelően nagy domináns tüszők ill. anovulációs ciszták fölrepedését szeretnénk kiváltani. Ezt csak azon fajokban alkalmazzák rutinszerűen, amelyekben a petefészek-képletek jól vizsgálhatók (kanca, tehén), így tudjuk, hogy van-e kellően nagy domináns follikulus ill. ciszta, aminek az ovulációját már kiválthatjuk. A ciklus lerövidítése luteolízissel szintén azon fajoknál jön szóba, amelyekben a petefészekképletek rutinszerűen vizsgálhatók (ló, marha), tehát megállapítható a sárgatest jelenléte, amelynek visszaalakulását (a luteolízist) gyógyszeresen indukálhatjuk, hogy ezt követően mielőbb újra legyen ivarzás. Szóba jöhet továbbá a szuperovuláció, vagy az ovuláló tüszők számának növelése. Ezeknek a kezeléseknek főleg monotocous fajok esetében van jelentősége, elsősorban az embriótranszfer programok részeként (az ovulációs ráta növelésére van szükség a juhok ikerellésének indukálásánál is, bár ez nem éri el a szuperovuláció mértékét (korlátozott szuperovuláció). A szuperovuláció célja, hogy ne csak egy, hanem lényegesen több follikulus váljon dominánssá és ovuláljon. Korlátozott szuperovuláció esetén mindössze 2-3 tüsző ovulációját akarjuk elérni (juhokban ikerellések számának emelése) 2. A nemi szervek fejlődéstana A fejlődő embrióban a gasztruláció során (amikor a hólyagcsíra állapotban kialakul a későbbi három csíralemez) keletkeznek a primordiális csírasejtek (ősivarsejtek), melyek amőboid mozgással az utóbél falába, majd onnan a mezenterium mentén a későbbi gonádok területére vándorolnak. Az ott élő stróma-sejtekkel kommunikálva azok fejlődési potenciálját megváltoztatják, így alakul ki belőlük egy speciális szöveti szerkezet, a primitív ivari köteg, melyből (az embrió kromoszómakészletétől függően) fejlődhet petefészek vagy here is. Az embrionális fejlődésnek ebben a szakaszában a primitív ivari kötegek szomszédságában a mesonephros (ősvese) található, amelynek elvezető csöve (ductus mesonephricus, Wolff-féle cső) az urogenitális szinuszba nyílik. Közvetlenül e járat mellett kezd el fejlődni a vakon kezdődő Müller-féle cső. Az emlősök embriogenezise során a mesonephros elsorvad és szerepét a végleges metanephros (utóvese) veszi át, de elvezető csatornája megmarad és szerepet játszik a mellékhere és az ondóvezető kialakulásában.
9
A gonadális nem kialakításában az Y-kromoszóma által kódolt SRY (sex determining region Y, vagy más néven TDF – testis determining factor) proteinnek van fontos szerepe, mely hímekben a primitív ivari köteg sejtjeiben kezd expresszálódni. Ez egy transzkripciós faktor, ami más fehérjékkel komplexben kötődik a DNS-hez és specifikus gének átírását indítja el. Ennek eredményeként az ivari köteg sejtjei csöveket kezdenek formálni és epitheloid morfológiájú Sertolisejtekké fejlődnek. Nőivarúakban az SRY természetesen hiányzik (mivel nincs Y kromoszómájuk), s ilyen körülmények között a primitív ivari köteg sejtjei elkezdenek gócszerűen csoportosulni és kialakítják a kezdetleges petefészektüszőket. Hímivarú állatokban a kezdetleges Sertoli-sejtek által termelt anti-Müllerian faktor (AMF) hatására a Müller-cső sejtjei apoptozison mennek keresztül és ezzel egy időben a Sertoli-sejtek a szomszédos stróma sejtekkel kommunikálva azokat Leydig-féle sejtekké differenciáltatják. Ezek képezik majd a here kötőszöveti állományának alapvázát a csatornák közötti térben (intertubuláris kompartment/interstitialis rész) és elkezdenek tesztoszteront termelni, aminek egy részét a Sertoli-sejtek hatékonyabb formává, dihidro-tesztoszteronná (DHT) konvertálják. A Müller-cső tehát hímekben elsorvad, a primitív ivari köteg területén pedig herekezdemény alakul ki, melynek elvezető csőrendszerét a megmaradó Wolff-cső fogja alkotni. Ez utóbbinak kezdeti szakasza fúziónál a hereszövet tubulusaival, s a kettő találkozásánál alakul ki a rete testisnek nevezett csatornahálózat, ami a here elvezető csatornáiban (ductuli efferentes), távolabb pedig a mellékhere csőrendszerében és az ondóvezetőben folytatódik, és végül ez nyílik majd a húgycsőbe. Ezek a képletek mindegyike Wolff-cső eredetű. A here és elvezető rendszerének fejlődéséhez elengedhetetlen a nagy mennyiségű tesztoszteron, s a külső nemi szervek, így a genitális tuberculumból fejlődő pénisz (mely a nőivarúak csiklójának analógja), illetve a herezacskó, továbbá a járulékos nemi mirigyek fejlődése igényli az aktívabb forma, a dihidro-tesztoszteron jelenlétét is. A here tehát a primitív ivari köteg és a Wolff-féle cső sejtjeiből alakul ki, s ennek megfelelően az embrionális élet során hosszú ideig a hasüregben, retroperitoneálisan helyeződik. A heréket ventrocaudalis irányban az alsó hasfalhoz, a lágyékgyűrű területéhez rögzíti egy kötőszövetes szalag, a gubernaculum testis. Ez a fejlődő hereszövetből származó tesztoszteron és Insl3 (inzulin-szerű faktor 3) hatására fokozatosan megnyúlik, beterjed a lágyékgyűrűbe
10
és magával húzza a heréket is, kinyomja maga előtt az ottani bőrredőt (labiscrotalis ránc), ezzel létrehozva a herezacskót (scrotum). A herék leszállás (deszcenzus) során maguk előtt tolják a hashártyát, mely a lágyékgyűrűbe betüremkedve felgyűrődik, s ennek következményeképpen a leszállt herét kettős savóshártya réteg (egy zsigeri és egy fali lemez) veszi körül. A gubernákulum különben ezt követően hamarosan elsorvad. A folyamat evolúciós jelentősége máig nem teljesen tisztázott, ugyanis egyes emlősökben (például bálnák, delfinek, elefánt) nem szállnak le a herék, de azokban a fajokban, ahol igen, ott ennek a spermatogenezis számára megfelelő hőmérséklet biztosításában van szerepe. Kérődzőkben a herék jellemzően a 2. trimeszter idején leszállnak, míg lóban, főemlősökben, sertésben és ragadozókban csak a harmadik trimeszterben kezdődik a deszcenzus és főleg kutyában és lóban gyakorta a megszületés utáni első napokban fejeződik be. Mivel kutyákban a 6. hónap végéig nyitott a lágyékcsatorna, ezért ezt megelőzően nem lehet egyértelműen kimondani a rejtettheréjűség diagnózisát. Megemlítendő, hogy rágcsálókban ugyan leszállnak a herék, de a lágyékcsatorna egész életükben kifejezetten nyitott marad, ezért azok ki-be vándorolhatnak. A nőivarú állatokban a kromoszóma-állományuknak (XX) megfelelően nem expresszálódhat az SRY protein, s ilyen körülmények között nem alakulnak ki Sertoli-sejtek, így nem termelődik anti-Müllerian faktor sem. Ennek következményeként a Müller-cső fennmarad, a Wolff-cső viszont tesztoszteron hiányában elsorvad. A Müller-féle csőből fejlődik a női nemi traktus nagy része, így a petevezető, a méhszarvak, a méh, a méhnyak és a hüvely craniális része is úgy, hogy a kétoldali járatok a jövőbeli méh tájékán fúzionálnak. Ezért háziemlőseinknek, a nyúl kivételével egyetlen méhe, illetve hüvelye van, azonban két méhszarvval és két petevezetővel rendelkeznek, s ez utóbbiak a kétoldali petefészkek körül vakon kezdődnek. Megemlítendő még, hogy a hüvelytornác (vestibulum) nem a Müller-csövekből fejlődik, hanem ektodermális eredetű és az urogenitális szinuszból alakul ki. Ehhez képest a nemi traktus többi része, akárcsak hímekben, mesodermális eredetű. Az embrionális fejlődés során a női nemi szervek a dorsalis hasfal mentén, a herékhez hasonlóan retroperitoneálisan (hashártyával nem borítottan) indulnak fejlődésnek, de növekedésük során egyre jobban a hasüregbe terjednek, és maguk előtt tolják a peritoneumot, mely így többé-kevésbé körülveszi őket. Idővel ennek 11
egy része fúzionál a petefészek, a petevezető, a méh, a cervix és a vagina craniális része körül, így hozva létre a széles méhszalagot (ligamentum latum uteri). Ez szolgál a kialakult női nemi traktus felfüggesztéséül, s benne erek és idegek, valamint egy különálló szalag, a ligamentum ovarii proprium halad, ez utóbbi összeköti a petefészket és a méhet. A nemi traktus egyes részei esetében különböző névvel illetik a széles méhszalagot, így a petefészek körül mesovarium, a petevezető tájékán mesosalpinx, a méh területén pedig mesometrium a megnevezése. Házi emlősállatoknál a női nemi traktus közvetlenül a rectum alatt helyeződik, amitől a rectogenitalis vakzsák választja azt el. Ez az anatómiai elrendeződés teszi lehetővé tehénben és kancában a nemi szervek végbélvizsgálatát.
3. A női nemi szervek anatómiája
A női nemi szervek közé a petefészek (ovarium), a petevezető (tuba uterina), a méh (uterus) és a méhnyak (cervix), a hüvely (vagina) illetve a péra (vulva) tartoznak. A petefészek kivételével az összes említett szerv egy összefüggő csőrendszer része, mely szimmetrikusan helyezkedik el a hasüregben és az anustól ventrálisan nyílik a testfelszínre. Az ovoid petefészkek felszíne kötőszövetes tokkal (tunica albuginea) borított. Ettől kifelé található egy egyetlen sejtsorból álló, mesothelszerű réteg, a csírahám, melynek elnevezése megtévesztő, mert ennek nincs köze az ivarsejtek produkciójához. A tunica alatt található az ovarium kérge (cortex) mely tartalmazza a petesejteket (oocyta), az őket körülvevő sejtekből kialakuló tüszőket (follikulus) és az ovuláció után létrejövő sárgatestet (corpus luteum). A petefészek legbelső része (medulla) valójában egy sűrű kötőszövet, melyben vérerek, nyirokerek és idegek futnak. A mesosalpinx házi emlősökben kisebb-nagyobb mértékben zsákszerűen körülöleli a petefészket, így segítve a petevezető kezdeti szakaszának megfelelő orientációját, hogy az ovulációt követően a petesejt a tuba uterinába juthasson. Szukában egy, a többi fajtól eltérő jellegzetesség alakult ki, ez a zsákszerű képlet ugyanis, melyet a kutya esetében bursa ovaricanak hívunk, teljesen körülveszi az ovariumot, így az csak a bursa felnyitását követően válik láthatóvá.
12
A cortexben megy végbe a folliculogenesis, melynek során a petesejtet tartalmazó, még az embrionális élet során kialakult primordiális follikulusok növekednek/fejlődnek, közülük fajtól függően egy vagy több kiválasztódik domináns tüszővé és ezekben következik be az ovuláció. A primordiális follikulusok egy nyugvó állapotban lévő primer oocytát (az első meiotikus osztódás profázisában megrekedt petesejtet) tartalmaznak, mely körül a cortex ellaposodott sejtjei, a granulosa sejtek helyezkednek el egy rétegben, s ezeket a környező kérgi kötőszövetes állománytól alaphártya választja el. A primordiális tüszők előbb primer follikulussá (a petesejt megnagyobbodik, körülötte vastag glikoprotein réteg jelenik meg és a granulosa sejtek kuboiddá válnak), majd secunder follikulussá fejlődnek. Ez utóbbi képletben tovább nő a primer oocyta mérete, s ezzel egy időben a granulosa sejtek proliferálnak, így már több rétegben helyezkednek el, valamint az alaphártyán kívül is intenzív mitózis kezdődik, s egy specializált kötőszövetes réteg formálódik, melyet az úgynevezett theca-sejtek alkotnak. A korai tercier follikulusok abban különböznek az éretlenebb másodlagos tüszőktől, hogy ezek falában a theca-sejtek további proliferációja következtében elkülönül egy belső (theca interna) és egy külső (theca externa) réteg, továbbá a granulosa sejtek között megjelenik egy folyadékkal telt üreg (antrum). Késői tercier follikulusnak (Graaf-féle tüsző, antrális tüsző, preovulatórikus tüsző) nevezzük azokat az ovuláció előtt álló tüszőket, melyekben az antrum elérte végső méretét, s a sejtjei már nem proliferálnak és morfológiájuk sem változik (néhány cm átmérőjűek tehénben pl.). Ovulációkor a petefészek felszínén lévő Graaf-tüszők felrepednek (s a belőlük kiszabaduló petesejt a petevezetőbe jut) és helyükön a theca réteg ereinek károsodása miatt vérzés alakul ki, s a visszamaradt theca interna és granulosa sejtek keveredésével alakul ki egy, a petefészek felszínéről kissé kiemelkedő képlet, a corpus haemorrhagicum, mely aztán továbbfejlődik a petefészken megtalálható egyik legjellegzetesebb képletté, a sárgatestté (corpus luteum). A degenerálódó sárgatest maradványa a corpus albicans. A női nemi traktus csőrendszerének fala mindenütt ugyanolyan szövettani szerkezetet mutat, nevezetesen négy rétegre osztható kívülről befelé haladva, a savóshártya rétegre (serosa), az izomrétegre (tunica muscularis), a submucosa rétegre és a nyálkahártya rétegre. A legkülső serosa egyetlen sejtrétegből áll, mely beborítja a komplett nemi traktust. Ez alatt kívülről egy hosszanti, belülről pedig egy körkörös lefutású simaizom réteg helyezkedik el a tunica muscularis részeként. Ez a réteg felelős a nemi utak kontrakciójáért, mely a petevezető 13
esetében kihat a spermiumok és a petesejt, illetve az embrió vándorlására, a méh esetében pedig elsődlegesen az ellésben játszik fontos szerepet. Közvetlenül ez alatt található a submucosa, mely vérerekben, nyirokerekben és idegekben gazdag és alátámasztásul szolgál a legbelső mucosa rétegnek, mely egy kötőszöveti és egy hámrétegből épül fel, s a nemi traktus egészében mirigyeket tartalmaz. A lument minden esetben a nyálkahártya réteg epitheliuma béleli, mely azonban különböző szerkezetű a nemi traktus egyes helyein. A petevezető három fő szakaszra osztható (infundibulum, ampulla, isthmus) és lumenét csillós hengerhám béleli. Az infundibulum a petevezető tölcsérszerűen kitágult kezdeti része, amely szabadon nyílik a hasüregbe és a petefészek közvetlen közelében helyezkedik el. Ide „hullik” be az ovulációt követően a petesejt (s ennek biztosítására a tölcsér majdnem teljesen ráborul a petefészekre). A petevezető szűkebb, csatornaszerű része az ampulla, ahol a megtermékenyülés történik. Az ampulla mirigyei által termelt váladék segíti az ovulált petesejt és a spermiumok életben maradását. A petevezető végső része az isthmus, ahol a járat összeszűkül, s beletorkollik a méhbe. Emlős háziállatainkban a méh méhtestre és kétoldali méhszarvakra tagolható. A méhtest az embrionális fejlődés során a kétoldali Müller-cső fúziójából jön létre, ettől caudálisan (méhnyak, hüvely) a csatornarendszer már „páratlan”. Erszényeseknél azonban ez a fúzió csak a hüvelytornácnál történik meg, így ezeknek a fajoknak két vaginájuk, nyakcsatornájuk és méhük van (uterus duplex), a hímeknek pedig elágazó pénisze. Kevésbé komplex a nyúlfélék nemi traktusa, itt ugyanis a fúzió a hüvely teljes területére kiterjed, így ezekben az uterus duplex mellett csak a cervix páros. Húsevőkben, párosujjú és páratlanujjú patásokban viszont uterus bicornuatust találunk. Ez azt jelenti, hogy a két Müller-cső fúziója közös méhtestet eredményez, melyből cranialisan nyílnak a méhszarvak, s ezekhez kapcsolódnak a petevezetők. A fúzió azonban nem egyenlő mértékű az említett állatcsoportok között, s ennek megfelelően az egyszerre sok utódot szülő (polytocous) fajokban, mint a húsevők és a sertés, a méhszarvak hosszúak, sertésben kifejezetten bélkacs-szerűek. A jellemzően egy utódot szülő (monotocous) kérődzőkben és lófélékben a méhszarvak mérsékelten fejlettek. Tehénben a méhszarvak kosszarvszerűen feltekerednek, kancában viszont a méh függőágyszerűen ívelten helyezkedik el a medencében. A kanca méhe áll különben legközelebb az ember uterus simplexéhez, ahol a közepesen fejlett szarvak mellett septum uterit sem találunk, mely sövény a kérődzők méhtestének üregébe viszont benyúlik, jelezvén a két Müller-cső fúziójának határát. 14
A méh esetében speciális nevekkel illetjük a serosa (perimetrium), muscularis (myometrium) és mucosa+submucosa (endometrium) rétegeket. A myometrium egy külső hosszanti és belső körkörös izomrétegre tagolódik, s felel a méh kontrakcióiért. A méh tónusa különböző az ösztrogén (rigid, tónusos) és a progeszteron (lágy, petyhüdt) hatása idején. Ez biztosítja, hogy az ovuláció idején a tónusos méh kontrakciói hozzájáruljanak a spermiumok transzportjához, vemhesség alatt viszont a progeszteron blokkolja a méhösszehúzódásokat, s ezek csak a terminushoz (vemhesség vége) közeledve, a placenta fokozódó ösztrogéntermelésének hatására indulnak újra, elősegítve az ellést. Az endometrium kötőszövetből és a lument bélelő egyrétegű hengerhámból épül fel, mely mirigyeket alkot. Az endometrium vastagsága, a mirigyek száma és szekréciós működése függ attól, hogy a ciklus mely fázisában (follikuláris, luteális) vizsgáljuk a méhet. Az embriók megtapadása és beágyazódása a méhszarvakban történik meg, tehát a méh a vemhesség szerve (mirigyeinek váladéka, az embriótrofa segíti az embrió életben maradását), de emellett fontos szerepet játszik a luteolízis kiváltásában is (kivéve emberben), az endometrium prosztaglandin F2α termelése révén. A cervix legfontosabb feladata, hogy izolálja a méhet a külvilágtól és ez nemcsak a vemhesség idején fontos az embrió védelme érdekében, hanem az ovuláció környékét leszámítva a ciklus egészében is, hiszen a női nemi traktus tulajdonképpen „átjáróház” a hasüreg és a külvilág között, ezért nagyon fontos egy barrier, mely meggátolja az aszcendáló fertőzéseket. A méhnyak lumenébe ezért a legtöbb állatfajban nyálkahártyaredők ill. –gyűrűk nyúlnak be, melyek szorosan zárnak. A gyűrűszerűen betüremkedő redők a kocában például ujjszerűen olyan szorosan illeszkednek egymáshoz, hogy a kan glans penise („makk”) csavarszerűen tekeredett, s így képes bejutni a cervixbe és deponálni a spermát. A méhnyak mirigyeinek váladéktermelése is függ a ciklus fázisától, továbbá a vemhesség idején progeszteron hatására egy rendkívül viszkózus, ragacsos dugó képződik a méhszájnál, ami fontos barrier a magzat védelme érdekében. A hüvely a kopuláció szerve, ide illeszkedik a hím állatok pénisze és kiskérődzőkben, szarvasmarhában illetve ragadozókban a méhnyak beszájadzásának közelébe ürül a sperma (intravaginális sperma-depozíció). A sertéskan ezzel szemben közvetlenül a cervixbe (intracervikális depozíció) és részben a méhbe, a mén pedig tulajdonképpen közvetlenül az uterusba ejakulál (intrauterinális depozíció). A hüvely izomrétegének kontrakciója a coitus (közösülés) során a péniszre kifejtett nyomás révén elősegíti az ejakulációt. A craniális vagina nyálkahártyája 15
szekretoros hengerhámmal bélelt, a hüvelytornác (mely az urogenitális szinuszból fejlődött!) lumenét viszont elszarusodó laphám határolja. A cervix szájadéka tehénben, kancában és szukában benyomul a craniális vaginába, így körülötte „vakzsákszerű” képződmény található, ez a fornix vaginae. A hüvelytornác hámja ösztrogénhatásra megvastagszik (felkészülés a kopulációra a nyálkahártya sérülések elkerülése érdekében), s ez szukában ciklusdiagnosztikára is felhasználható, amennyiben hüvelykenetet mikroszkóppal vizsgálva értékeljük az elszarusodott sejtek arányát. Szukában a hüvely a péra nyílásához képest 45 fokban dőlt dorzális irányban, s ezt figyelembe kell venni a hüvelytükör/inszemináló katéter bevezetésénél. Kocában és tehénben a húgycső nyílása alatt közvetlenül található egy vakzsák, a diverticulum suburethrale. Ennek főleg szarvasmarhában van jelentősége, mert katéterrel történő vizeletvétel során figyelni kell, hogy a húgycső nyílásába és ne a vakzsákba vezessük az eszközt. A vestibulum mirigyei az ún. Bartholin-féle mirigyek, melyek főleg ösztrusz idején termelnek nyálkaszerű váladékot. A péranyílás (vulva) a nagy- és kisajkakból épül fel, melyeket kívülről bőr borít, s nagy mennyiségű zsírszövetet ill. simaizom elemeket (musculus constrictor vulvae) is tartalmaznak. A csikló (clitoris) hüvelytornác nyílásának ventrális oldalán egy árokban (fossa clitoridis) található. Tele van érzőideg-végződésekkel és erektilis szövettel (a pénisz megfelelője nőivarban). 4. A hím nemi szervek anatómiája A here (testis) legtöbb emlős fajban a herezacskóban helyeződik a hasüregen kívül. Kívülről erős kötőszövet (tunica albuginea) borítja, mely a szerv belsejébe terjedő sövényeket képez (septumok), ezek a here közepén érnek össze és a mediastinum testist képezik. A here állományában, az intertubuláris részben (herecsatornák közötti részben) vannak a tesztoszteron termelő Leydig-sejtek. A szerv állományának fő alkotója viszont a csőrendszer (herecsatornák; tubuláris rész), melynek üregét a herecsatorna hámjában elhelyezkedő Sertoli-sejtek bélelik. A herecsatornák kezdetben kanyarulatosak (tubuli semineferi contorti), majd kiegyenesednek 16
(tubuli semineferi recti) és egy hálózatos rendszerbe (rete testis) nyílnak, amely a mediastinum testis állományában helyezkedik el. A herecsatornácskákat bélelő hámban (a fal lumen felé eső része) megy végbe a spermatogenesis, és a lumenbe jutó spermiumok a rete testis hálózatos csatorna rendszerében gyűlnek össze és a csatorna falának sejtjei által termelt folyadék („rete fluid”) által biztosított közegben kerülnek elszállításra a mellékhere (epididymis) feji részébe (caput) a here elvezető csatornáin (ductuli efferentes) keresztül. Transzport folyamatot a csatornarendszer perisztaltikus mozgása is segíti. A spermiumok a mellékhere feji részéből először annak testébe, majd farki részébe jutnak (amennyi időt ez igénybe vesz, azt „epididymal transit time”-nak hívják, ez fajok közt változó, de nagyságrendileg 5-15 nap közé esik) és közben funkcionális érésen mennek keresztül és megszerzik az ún. „termékenyítő képességet” és a „mozgás-képességet” (tehát a heréből biopsziával vett spermiumok még nem tudnak önmaguktól/önerőből átjutni a zona pellucidán, kizárólag úgy képesek megtermékenyíteni a petesejtet, ha beinjektálják őket a citoplazmájába). Ezt a főleg humán gyakorlatban alkalmazott eljárást hívják ICSInek, intracitoplazmatikus spermium injekció; intra cytoplasmic sperm injection). Ezzel ellentétben a mellékhere farkából biopsziával nyert spermiumok már fertilisek és önálló mozgásra is képesek! A mellékherében a rete folyadék visszaszívódik, a tartalom koncentrálódik és a szállító médium fehérje összetétele, biokémiája is megváltozik. A mellékherén átjutó spermiumok a farki részben tárolódnak (raktározási funkció). Mivel a farki részben található mellékhere cső fala igen gazdag sima izomelemekben (myoepithel sejtek), ezért a szexuális inger hatására felszabaduló oxitocin (pl. a bika spermavételénél emlegetett „potyáztatás”) fokozza a spermiumok kiáramlását a mellékhere farki részéből az ondóvezetőbe. A mellékhere fején és testén való áthaladás/tranzit időtartama nem igazán gyorsítható fel szexuális stimulussal/ingerrel, mert a feji részben és a corpusban nincsenek oxitocin-reszponzív elemek. Szexuálisan aktív hímek esetében a farki részben tárolt spermium tartalék viszont gyorsan cserélődhet, ha gyakran ejakulál az állat. Kisebb mértékű cserélődés kevésbé aktív társaikban is megfigyelhető (spermiumok bejutnak a húgycsőbe és a vizelettel ürülnek). Ez azért van, mert a mellékhere farki részének enyhe, periodikus összehúzódásai miatt ejakuláció nélkül is ki-kimosódnak spermiumok a húgycsőbe és a vizelettel távoznak. Ez a természetes módja, hogy a szervezet megszabaduljon az öregedő spermiumoktól. Ha egy állat sokáig nem ejakulál, akkor gyakori, hogy romlanak a 17
levett sperma paraméterei, mert a mellékherében tárolt sejtek már kiöregedtek, de még nem volt idő, hogy kimosódjanak. Gyakori ejakuláció (sűrű spermavétel vagy gyakori pároztatás) esetén megszaporodnak az ejakulátumban a disztális citoplazma cseppel rendelkező spermiumok az ondóban. Ennek az az oka, hogy a felgyorsult érési folyamat nem teszi lehetővé az ondósejtek számára, hogy megszabaduljanak a felesleges citoplazmától, ami csepp formájában a farok középső részén marad. A fedeztetés szempontjából fontos kiemelni, hogy a hímet a nőstények közé eresztve, az első 10-12 napban még főleg a mellékhere tároló kapacitása fedezi az ejakulációk spermium igényét. A hímek általában hajlamosak több nőstény közül egyet kiválasztani és azt ismételten befedezni, s ez oda vezethet, hogy erre „elpazarolják” a teljes spermium tartalékukat. Azok a nőstények, amelyekkel később párosodnak, üresek maradhatnak, mert nem jutott kellő mennyiségű új (érett) spermium a farki részbe a heréből. A mellékhere farki részéből indul ki az ondóvezető (ductus defferens), mely a húgycső (urethra) kezdeti részébe nyílik és a kiöblösödő részét ampullának hívjuk, ami egyes fajokban nem csak jelen van, de járulékos hím nemi mirigyként is működik (pl. ló). Extragonadalis tartaléknak hívjuk a mellékherében, az ondóvezetőben és az ampullában megtalálható összes spermiumot. A hímivarú állatoknak négyféle járulékos nemi mirigye lehet, ezek megléte azonban fajonként változik. A járulékos hím nemi mirigyek szerepe, hogy az ondóplazmát megtermeljék és így szállítóközeget és tápanyagot (elsősorban fruktóz) biztosítsanak az ejakuláció során távozó spermiumok számára. A páros ampullák a kétoldali ondóvezetők kiöblösödései. A sertéskannak és a kutyának nincsen ampullája (emberben sem szokás elkülöníteni), a többi fajban van, de közülük elsősorban a ménben kifejezettek (az ondóplazma jelentős részét az ampulla termeli). A kétoldali ondóhólyag a húgyhólyag közelében találhatók. Főleg a sertéskan és a bika esetében az ondóplazma nagy részének termeléséért felelősek. A kutyának nincs ondóhólyagja. A prosztata páratlan szerv és a húgycső kezdeti szakaszát veszi körbe. Állatfajoktól függően elkülöníthető egy, az urethrán kívüli része (corpus) és egy másik, az urethra falába terjedő része (disszeminált prosztata). Bikában mindkét rész kifejezett, kiskérődzőkben és sertésben a disszeminált szövet a fő alkotórész, lóban ellenben csak urethrán kívüli része van a prosztatának. 18
A kutyának a prosztata a legfontosabb járulékos hím nemi mirigye és egyben az egyetlen nemi mirigye is. A páros bulbourethrális mirigyek (Cowper-féle mirigyek) az előbbiektől kissé caudálisan találhatók a bulbospongiosus izmok közelében. Az összes faj közül csak kutyában hiányoznak (macskában van). A legkifejezettebbek pedig sertésben, ugyanis ezek felelősek a sertéskan ejakulátumának 3., gélszerű frakciójának termeléséért, melynek fiziológiás szerepe, hogy a cervix szájadékánál koagulálódva lezárja a nyakcsatornát, megakadályozva a spermiumok visszafolyását (ami a sertés esetében sokkal reálisabb veszély lenne, mint a többi fajban, tekintve, hogy 2-3 dl ondót ejakulál!). Érdekesség: egérben és patkányban hatalmas méretű ún. koagulációs mirigyek találhatók, amelyek egy speciális koagulációra képes váladékot termelnek, aminek az a szerepe, hogy a hüvelybejáratot lezárja (kívülről is látható és jelenléte bizonyíték arra, hogy a párosodás létrejött!) A hímek kopulációs szerve a pénisz, mely fejlődéstanilag a nőstények csiklójával (clitoris) analóg, ugyanis mindkettő a kezdetleges genitális tuberkulumból fejlődik ki az embrionális élet során. Az emlősök pénisze a medence ventrocaudális oldaláról ered, s ezt a kezdeti szakaszt hívjuk crus penis-nek (a pénisz szára), ami a corpus penisben („test”) majd a glans penis-ben („makk”) folytatódik, nyugalmi állapotban a praeputiummal (tasak, fityma) fedetten. Egyes fajokban, például kutya-félékben a pénisz állományában csontos váz (os penis) található. Az emlősök pénisze anatómiailag két csoportba sorolható a merevedő szövetek mennyisége alapján és aszerint, hogy ez milyen mértékben játszik szerepet az erekcióban. A csoportosítástól függetlenül mindkét típusú pénisz tartalmaz barlangos testeket/erektilis szövetet (corpus cavernosum) (különbség a mennyiség tekintetében van) amelyek az urethra végső szakaszának falában is jelen vannak (corpus spongiosum). Ezek szövettani szerkezetüket tekintve hatalmas kapacitással rendelkező szinuszoidális hálózatok. A fibroelasztikus típusú pénisz (mellyel a kérődzők és a sertés rendelkezik) kevesebb merevedő szövetet tartalmaz, s ennek erekció közben bekövetkező méretbeli növekedéséért inkább az felel, hogy nyugalmi állapotában egy S-alakú görbülete (flexura sigmoidea) van a hímvesszőnek, mely merevedéskor kinyúlik/kiegyenesedik. Az ún. musculocavernosus penis (ló, kutya, ember) erekció során bekövetkező méretbeli növekedéséért ellenben főként a barlangos testek (erektilis szövetek) vérrel telítődése felel. 19
A glans penis morfológiája állatfajonként változó (sertésben pl. csavart; kankutyában bulbus glandis van /erektilis szövetből álló un. hagyma/, kandúrban tüskék találhatók rajta erektált állapotban – ez utóbbinak fontos szerepe van az indukált ovuláció kiváltásában; a tüskék megléte egyébként androgén dependens), de minden fajban közös tulajdonság, hogy rendkívül sok érzőideg-végződés található az állományában. A glans penis mechanikai stimulációja a legfontosabb inger az ejakuláció kiváltásához/kiváltásában. A péniszhez fajtól függetlenül 4 fő harántcsíkolt izom kapcsolódik (párosak), melyek megfelelő működése az erekcióhoz, illetve az ejakulációhoz szükséges. A musculus retractor penisnek elsősorban a fibroelasztikus típusú pénisz erekciójában van fontos szerepe, ugyanis ez az izom tartja nyugalmi állapotban görbülten a flexura sigmoideát, de az erekció során ellazul. A m. ischiocavernosusnak ezzel szemben a musculocavernosus típusú pénisz erekciójában van döntő szerepe (összehúzódik/kontrakció jön létre és összenyomja a crus penisben lévő ereket, így akadályozottá válik a barlangos testekből a vénás elfolyás). A m. urethralis és m. bulbospongiosus izmoknak főleg az ejakulációban van szerepük, ugyanis ezek ritmikus összehúzódása juttatja - a húgycsövön keresztül - a külvilágra a spermiumokat. A herezacskó (scrotum) bőre rendkívül gazdag szabad idegvégződésekben. Érző neuronjain keresztül az ingerület a hipotalamikus hőközpontokba jut. Ez válaszul perifériás vegetatív rostok irányításával a here bőrében lévő izzadságmirigyek aktiválása révén a hő leadását serkenti, továbbá a herezacskó bőrének simaizmaira (tunica dartos) hatva azok összehúzódását, s így a herék önkéntelen felhúzását váltja ki (ezen simaizmok működése androgénfüggő, így kasztráltakban ez nincs). A hipotalamikus és agytörzsi kommunikáció eredményeként kiemelkedően magas scrotális hőmérséklet esetén a légzés is szaporábbá válik, ezzel is segítvén a hő leadását. Mindez azért szükséges, mert a spermatogenezis megfelelő működéséhez a normális testhőmérsékletnél pár fokkal alacsonyabbra van szükség, s ennek biztosítására számos mechanizmus alakult ki az evolúció során. Megemlítendő, hogy a herezacskó felvarrása egy lehetséges kasztrációs mechanizmus, ami csak a spermiogenezist szünteti meg (magasabb hőmérséklet miatt), de a nemi jellegek megmaradnak, mert a tesztoszteron produkció intakt marad. Ez elméleti lehetőséget ad keresőállatok létrehozására, de a valóságban nem nagyon használják. Az ondózsinór az a kötőszövetes köteg, mely a lágyékgyűrűn keresztül közlekedik a herezacskó belseje és a hasüreg között. Állományában artériát, vénát, vegetatív idegeket, harántcsíkolt izmot (musculus cremaster) és az ondóvezetőt tartalmazza. A musculus cremaster szexuális inger, 20
illetve hirtelen izgalom hatására rövid ideig összehúzódik, ezért a heréket felhúzza. Az ondózsinórban futó, heréből elvezető vénák körbefonják a hereartériákat (repkényfonat, plexus pampiniformis), s mivel az előbbiek által szállított vér hőmérséklete pár fokkal alacsonyabb (hiszen a hasüregen kívülről érkeznek), ezért ellenáramlásos rendszerben az artériák és a vénák hőmérséklete kiegyenlítődik (az artériás vért lehűti a vénás vér). Ennek következtében a herékhez lejutó vér pár fokkal alacsonyabb lesz a testhőmérsékletnél és ez támogatja a spermatogenezist. Az ellenáramlásos rendszernek köszönhető, hogy a vénás vérben (here felől jövő) lévő nagy mennyiségű tesztoszteron nagy része a koncentráció-grádiens következtében átdiffundálhat az artériába, s így visszajut a hereszövetbe, így ott feldúsulhatnak a spermiogenezist támogató androgének (a magas tesztoszteron koncentráció feltétele a hím nemi szervek normális működésének). 5. A központi szabályozásban résztvevő agyi struktúrák funkcionális anatómiája A hipotalamusz, ami a hőszabályozásban, a pszicho-neuro-endokrin-immun tengely összehangolásában és a táplálékfelvétel, valamint a vízháztartás szabályozásában is központi szerepet tölt be, a talamusszal és a tobozmiriggyel együtt a köztiagyat alkotja. Az agy alapján található, és elhelyezkedéséből fakadóan számos egyéb agyterülettel, s a tőle ventrálisan lévő agyalapi miriggyel (hipofízis) is afferens és/vagy efferens kapcsolatban van. A hipotalamikus neuronok (éppúgy, mint a központi idegrendszerben mindenütt) magokat (nucleusokat) alkotnak, axonjaik pedig pályákat képeznek. Anatómiailag számos magot különítettek el a hipotalamusz állományában, melyek többnyire jelentős funkcióbeli eltéréseket is mutatnak. A magok nem egyféle funkcióra specializálódott idegsejtek csoportjai, hanem sokszor igen nagy variabilitást mutatnak a bennük található sejtek funkcióját (és morfológiáját) tekintve. Az idegsejtek az általuk termelt fő neurotranszmitterek vagy hormonok alapján jellemezhetők és típusokba sorolhatók (pl. GnRH-neuronok), s az egyes sejttípusok az adott faj minden egyedében következetesen ugyanazokban a nukleuszokban találhatók kisebb-nagyobb csoportokba rendeződve. Szaporodásbiológiai szempontból kiemelt fontosságúak a nucleus arcuatus, nucleus ventromedialis, nucleus supraopticus, nucleus suprachiasmaticus, nucleus paraventricularis és az elülső hipotalamikus régió, valamint a preoptikus régió magjai. Ezen területek a hím- és nőivarú állatokban egyaránt szabályozzák az agyalapi mirigy és az ivarszervek működését, továbbá felelősek az ivari 21
viselkedésformák kialakításáért. Számos egyéb magcsoport is található a hipotalamuszban, amelyek a hőszabályozásban, a táplálék- és vízfelvétel szabályozásában, a memória kialakításában, vagy egyéb vegetatív funkciók szabályozásában játszanak szerepet. A hipotalamikus neuronok működését szinaptikus kapcsolatok és a vérben keringő molekulák is befolyásolják. Az egyes magok, sőt akár azokon belül a kisebb neuroncsoportok is eltérő agyterületekről származó axonokkal létesíthetnek szinaptikus kapcsolatot, mely funkcionális eltérésekhez vezet. Ezek hátterében az áll, hogy a központi idegrendszer embrionális fejlődése során intenzív idegsejt vándorlás megy végbe. Ennek során az azonos helyen kialakult és bizonyos ideig együtt élő neuronok egymástól eltávolodnak, de szinaptikus kapcsolataikat részben megtartják, miközben új kapcsolatokat is kialakítanak (a GnRH neuronok pl. a bulbus olfactoricus területéről vándorolnak a hipotalamuszba, de továbbra is szinaptikus kapcsolatot tartanak fenn a régi szomszédokkal, ez magyarázza, hogy a szagingerek rendkívül fontosak a szaporodási folyamatokban). A hipotalamusz magjaiba futó szignálok nem csak neuronokból származnak, mert egyes magok környezetében speciális szövetek találhatóak, ezek területén nem érvényesül a vér-agy gát szűrő funkciója. Az úgynevezett cirkumventrikuláris szervek lehetőséget biztosítanak arra, hogy a perifériás vérben keringő hidrofil mediátorok, az itt található speciális szerkezetű érfalon keresztül, megkerülve a vér-agy gátat, közvetlenül hassanak egyes hipotalamikus magok működésére. Így hat a reprodukciós folyamatokra például a leptin is, mely protein hormon révén nem képes átjutni a vér-agy gáton, de ugyanez igaz az immunrendszer egyes mediátoraira is, melyek folyamatosan hatnak a hipotalamikus neuronokra, befolyásolva azok működését (így a GnRH neuronokét is). A gonadotropin releasing hormon (GnRH) termeléséért felelős idegsejtek emlős háziállatainkban a nucleus arcuatusban, nucleus ventromedialisban, illetve a hipotalamusz elülső és preoptikus régióiban találhatók. Didaktikailag az első kettő terület GnRH-termelő neuronjai funkcionálisan az úgynevezett tonic center-t (tónusos központ), míg az utóbbi kettő magcsoport ugyanilyen neuronjai a surge centert („csúcs” központ) alkotják. Az általuk termelt GnRH az axonvégződésekből a hipotalamusz és hipofízis elülső lebenyének határán, az eminentia mediana területén ürül az agyalapi mirigy portális plexusába, megkerülve a vér-agy gátat (az eminentia mediana körül található cirkumventrikuláris szervnek köszönhetően). 22
Az említett tonic és surge központ működését tekintve alapvető különbség mutatkozik a GnRH-leadásban, de ez csak nőivarú állatokban figyelhető meg. Bennük a tonic center neuronjai, ahogy a névből is kiolvasható, kevésbé intenzíven, de fokozatosan ürítik a GnRH tartalmú vezikulumaikat, míg a surge center csak kiemelkedő stimulus (E2 általi pozitív feedback) hatására teszi ezt, akkor azonban sokkal nagyobb mennyiségben adja le raktározott neuropeptidjeit. Hímekben a két központ működésében nincs különbség, náluk az összes hipotalamikus GnRH-termelő neuron tonic centerként működik (ennek okáról később lesz szó). A humán medicinában nem különítenek el tonic és surge központokat, hanem egyetlen ún. GnRH-pulzus generátorról beszélnek. A GnRH hipofízisre kifejtett hatását (inkább LH vagy főleg FSH leadás fokozódjon) a GnRH-pulzusfrekvencia változásával magyarázzák. Összefoglalva: a hipotalamikus neuronokból egységnyi idő alatt leadott GnRH mennyiségének („frekvencia”) változása (nő vagy csökken) különbözőképpen befolyásolja a hipofízis hormontermelését (FSH vagy LH javára)! (Így: alacsonyabb frekvencia inkább FSH, magasabb inkább LH leadást serkent!) A nucleus paraventricularis és supraopticus területén található magnocelluláris („nagy sejtes”) neuronok az oxitocin termeléséért felelősek. Axonjaik a hipotalamusztól ventrálisan helyeződő, idegszövet eredetű hátulsó hipofízislebenybe projektálnak, de a szomszédos agyi magvak felé is adnak kollaterálisokat és idegsejtekkel is képeznek szinapszist. Az oxitocin szintézisét követően az axonvégekben nagy mennyiségben raktározódik és pozitív stimulus hatására a raktár vezikulumok exocitózisával ürül. Az agyalapi mirigy hátsó lebenyében található oxitocin-pozitív axonok vérerek közelében végződnek, így termékük a leadást követően azonnal a véráramba kerülhet, s kifejtheti endokrin hatását (az idegsejtek termékei a perifériás vérbe juthatnak; neuroszekréció. Az oxitocin elsődlegesen a nemi szervek simaizomsejteinek (simaizom elemek) összehúzódását váltja ki, továbbá rendkívül fontos szerepe van a tejleadási reflexben is. Emellett azonban az említett axonális kollaterálisok révén kifejezett központi idegrendszeri hatása is van, s így befolyásolja a szexuális vágyat, és a szociális viselkedésformák, köztük az anyai ösztön kialakulását. Nőivarú állatokban általában sokkal magasabb a vérbeli koncentrációja, mint hímekben, kivéve az orgazmus pillanatát, amikor hímekben is nagyon sok oxitocin kerül leadásra.
23
Az első és legfontosabb különbség a hím és nőivarú állatok agyában az, hogy előbbiekben nincs funkcionális surge center. Ennek oka, hogy magzati korban a herékben termelődő tesztoszteron a keringésből bejut az idegrendszerbe, ahol azt a neuronok aromatáz enzimükkel ösztradiollá konvertálják. E2 hatás alatt a későbbi surge center neuronjai nem megfelelően fejlődnek és teljesen érzéketlenné válnak az E2-által kiváltott pozitív visszacsatolásra („defeminizálódik az agy”). Ez nőstényekben nem következhet be, mert tesztoszteron termelésük nagyon alacsony, a képződő ösztradiol pedig a magzati vérben nagy mennyiségben jelenlévő α-fötoproteinhez (az albumin magzati analógjához) kötődik, s így nem tud bejutni a központi idegrendszerbe. Az agyalapi mirigy közvetlenül a hipotalamusz alatt helyezkedik el és elülső (fejlődéstanilag a bélcső kitüremkedése, tehát endodermális eredetű) ill. hátulsó lebenyből (idegszövet eredetű, ektodermális) áll. Az elülső lebenyben találhatók az FSH (follikulus stimuláló hormon) és LH (luteinizáló hormon) termelő gonadotróp ill. a prolaktin termelő laktotróp sejtek. Előbbiek működését a hipotalamikus neuronokból a hipofízis portális keringésébe kerülő GnRH, utóbbiakét pedig a dopamin szabályozza. A hipotalamo-hipofizeális portális rendszer egy primer és egy secunder plexusból áll, ami az ellátó artéria elágazásának következménye. Ez az ér a hipofízis száránál (ahol a mirigy találkozik a hipotalamusszal) képezi a primer plexust, ide ürülnek a hipotalamikus szabályozó neuronok transzmitterei. Innen a vér továbbhalad a másodlagos plexusba, mely a hipofízis hormontermelő sejtjei körül helyezkedik el, s itt hatnak a releasing (pl. GnRH) ill. inhibitor faktorok (pl. dopamin) azok működésére. A portális keringés biztosítja, hogy a rövid felezési idejű hipotalamikus faktorok a szisztémás keringésben történő felhígulás nélkül hassanak célsejtjeikre. Az agyalapi mirigy hátulsó lebenyének vérereibe az oxitocin termelő neuronok ürítik terméküket. A tobozmirigy melatoninerg sejtjei (pinealociták) révén vállal oroszlánrészt a szaporodás szabályozásában. Ezek a sejtek a környezeti megvilágítás (napi ritmus) függvényében adják le a melatonint, mely részben a szisztémás keringésbe kerülve hormonként (mert a tobozmirigy a vér-agy gáton kívül helyezkedik el), részben pedig szinapszisok révén a központi idegrendszeri neuronokra hat.
6. A szaporodás endokrin alapjai 24
6.1. A hormonhatás mechanizmusai
A hormonok a szervezetben kivétel nélkül sejtfelszíni vagy intracelluláris receptorokon keresztül hatnak, s ezeken keresztül váltanak ki biológiai reakciót. A sejtfelszíni receptorok sokfélék és típustól függően különböző jelátviteli útvonalakat aktiválnak a sejtekben, de általánosságban elmondható, hogy ligandjuk hidrofil, ami nem tud átdiffundálni a plazmamembránon. Velük ellentétben a lipofil molekulák a sejthártyán szabadon átjutva a citoplazmába és a sejtmagba kerülnek, így ezek receptorai jellemzően intracellulárisan találhatók. A szaporodásbiológiai jelenségek tanulmányozása során számos endokrin és parakrin molekulával lehet találkozni, és ezek hatásbeli eltérései receptoraik különbözőségéből fakadnak. Meglepő, hogy az állati szervezet sejtjeinek sokfélesége nem társul nagyszámú, változatos jelátviteli útvonallal (ún. szignál transzdukció), hiszen a receptoraik besorolhatók néhány nagy csoportba, ahol az azonos családba tartozó molekulák hasonló jelkaszkádot indítanak el. Az endokrin szempontból fontos membrán receptoroknak négy alapvető típusa különíthető el, a G-proteinhez kapcsolt receptorok, a tirozin-kináz receptorok, a szerin/threonin kináz receptorok és a citokinreceptorok családja. Ezzel természetesen nem merül ki az ismert receptor típusok tárháza. A hormonok szempontjából a mag receptorok családja ugyancsak fontos, mert az ide tartozó fehérjék közvetítik a szteroid-hormonok jelátvitelét. Megjegyzendő azonban, hogy a szexuál-szteroidoknak vannak sejtfelszíni receptoraik is, amelyek a Gproteinhez kapcsolt receptorok családjába tartoznak és a magreceptoroktól eltérő szignált közvetítenek.
6.2. Tobozmirigy-, hipotalamusz- és hipofízis-eredetű hormonok, extrahipofizeális gonadotropinok
25
1. MELATONIN Szerkezete: Aminosav-származék
Szintézise: A tobozmirigyben keletkezik nagyobb mennyiségben az esti-éjjeli órákban a napi ritmusnak megfelelően. Triptofánból szintetizálódik több lépésben szerotoninon keresztül. Hormonként és szinapszisok révén idegsejteken is fejt ki hatást. Szerepe a szaporodásban: A megvilágított órák számával a keletkező melatonin mennyisége fordított arányosságot mutat, ami irányító szerepet játszik a szezonálisan ivarzó állatok nemi működésének szabályozásában. A melatonin ugyanis közvetve befolyásolja a hipotalamikus GnRH-neuronok aktivitását, a rövidill. hosszúnappalos állatokban éppen ellenkező módon. Gyakorlati alklamazás: A melatonin-kezelést a juhtenyésztésben alkalmazhatjuk. A juhfaj esetében ugyanis törzskönyvezett, természetes melatonint leadó bőralatti implantátum (pl. MELOVINE®) van forgalomban a piacon. A gyógyszer segítségével az anyajuhok ivarzásának kezdete előbbre hozható, sőt szezonon kívül is indukálható, hiszen a rövidnappalos juhoknál az emelkedő melatoninkoncentráció indukálja a nemi működésüket. 2. GONADOTROPIN-RELEASING HORMON (GnRH)
Szerkezete: A GnRH egy 10 aminósavból álló neuropeptid (ún. dekapeptid).
26
Szintézise: A hipotalamusz különböző magcsoportjaiban termelődik, amelyek funkcionálisan egy surge és egy tonic centert alkotnak. Felezési ideje rövid, csupán néhány perc. Szerepe a szaporodásban: A hipotalamikus neuronokból felszabaduló GnRH az agyalapi mirigy portális keringése révén annak elülső lebenyébe jut, ahol az FSH-t és LH-t termelő gonadotróp sejteken fejti ki támogató hatását és fokozza az említett két hormon szintézisét. Gyakorlati alkalmazás: A természetes GnRH-t és szintetikus analógjait széles körben alkalmazzák a gyakorlatban. A szokásos dózisú GnRH-injekció általában a preovulációs GnRH-csúcsot (lásd később) hoz létre és ezért nagymértékű LHleadást és ovulációt fog kiváltani. Szarvasmarhában viszont emellett ellés utáni anösztruszban is adható prosztaglandinnal kombinálva, ahol a hiányos GnRH termelés miatt ezzel próbálják indukálni a tüszőnövekedést. A szintetikus hormonok esetében különben mindig az a cél, hogy egy vagy két aminosav szubsztitúciója révén csökkentsük a lebomlás sebességét. A fentieknek megfelelően szarvasmarha esetében természetes GnRH-t (gyógyszerkönyvi neve gonadorelin, pl. FERTAGYL®, GONAVET VEYX®) vagy ennek szintetikus származékát, a buserelint (pl. RECEPTAL®) önmagában is alkalmazhatjuk anovulációs ciszták kezelésére injekciós készítmények formájában, de PGF2α-val kombinálva ugyanezek használatosak speciális protokollok (pl. Ov-synch) részeként ivarzásindukció vagy -szinkronizálás céljából is. A sertéstenyésztésben újabban lehetőség van buserelin tartalmú injekciós készítményekkel (pl. PORCEPTAL®) indukálni a ciklusos állatok ovulációját, s ennek segítségével optimalizálni a termékenyítés időpontját. Ez a módszer a ló szaporodásbiológiában már régóta bevett szokás, ahol az egyik leghatékonyabb szintetikus származékot, a GnRH-receptorokon szuperagonista deslorelint alkalmazzák injekciós készítmények vagy szubkután implantátumok (OVUPLANT®) formájában az ovuláció kiváltására. Kutyában és macskában ugyancsak a deslorelin-tartalmú készítmények használatosak, elsősorban bőralatti implantátum formájában (pl. Suprerolin®), melyet mindkét nem esetében gyógyszeres sterilizálásra lehet alkalmazni (egyébként görényekben is, s így a bennük gyakori hyperoestrogenizmus kezelésére is alkalmas). Ezen kívül szukákban az implantátum rövid ideig tartó behelyezésével tüzelés indukálható, kankutyákban pedig a benignus prosztata hiperplázia kezelésére is alkalmazható deslorelin-tartalmú készítmény. 27
Megjegyzendő még, hogy GnRH-hatású készítményeket a kriptorchidizmus diagnosztikájában is igénybe vehetünk az ún. GnRH-stimulációs teszt részeként, valamint GnRH-analóggal lehet indukálni a herék leszállását is kriptorchid ménekben. Ezen kívül GnRH-analógok alkalmasak az indukált ovulátor állatfajok (pl. macska, házinyúl) ovulációjának indukciójára is, mely kezelés mesterséges termékenyítés alkalmazásakor mindenképpen szükséges.
3. OXITOCIN
Szerkezete: Az oxitocin egy 9 aminosavból felépülő, ún. nonapeptid. Szintézise: Az oxitocin elsősorban a hipotalamusz paraventrikuláris magjának magnocelluláris neuronjaiban termelődik. Emellett fontos megemlíteni, hogy az oxitocin a sárgatest szövetében is szintetizálódik, melynek a luteolízis szabályozásában van fontos szerepe házi emlősállataink esetében. A hormon felezési ideje nagyon rövid, csak 1-2 perc. Szerepe a szaporodásban: Az oxitocin igen hatékony simaizomösszehúzó hormon, melynek nőivarú állatok esetében kiemelkedő szerepe van a tejleadási reflex irányításában a tőgy intersticiális állományának myoepithel sejtjeire hatva, valamint az ellés során, amikor kiváltja a myometriumon erőteljes összehúzódását (uterotonicum). Hímekben a mellékhere farki részében és a járulékos nemi mirigyek állományában lévő myoepithel sejteken hatva segíti a spermiumok és az ondóplazma ürülését az ejakuláció idején.
28
Gyakorlati alkalmazás: Az állatorvosi szaporodásbiológiai gyakorlatban az oxitocint (OXYVET®) vagy ennek szintetikus analógját, a carbetocint (HYPOPHYSIN®) használhatjuk injekciós formában különböző kórképek kezelésére, annak ismeretében, hogy 1) kiváló uterotonikumok és 2) a carbetocin felezési ideje jelentősen hosszabb az oxitocinénál. Bármely fajban alkalmazhatjuk őket primer vagy szekunder fájásgyengeség kezelésére (bár utóbbi esetében intarvénás kálciuminfúzió adása is szükséges lehet), azzal a megkötéssel, hogy tilos adni abban az esetben, ha a magzat megszületése bármilyen okból kifolyólag akadályozott. Ezen kívül uterotonikumként alkalmas magzatburok visszamaradás kezelésére, s erre gyakorlati körülmények között elsősorban tehénben és kancában használjuk. Sertésben a PGF2α-val szinkronizált ellések közötti időbeli eltérést még jobban le lehet szűkíteni, ha oxitocin-tartalmú készítményt is adunk az állatoknak. Puerperális metritis esetén antibiotikum-kezelés mellett a lochia távozásának elősegítésére megfontolható oxitocin adása is kérődzőkben és lóban (ill. sertésben is, de esetükben ez ritkább kórkép), azonban a méh oxitocin érzékenysége, tehénben legalábbis, jelentősen csökken az ellés utáni 2. naptól kezdve, így a kezelés hatása kérdéses. Ezen kívül az oxitocin alkalmas lehet agalactia esetén a tejelválasztás megindítására, aminek elsősorban szukák vagy kocák esetében van jelentősége. Centrális eredetű, prolaktin-hiányból fakadó agalactia esetén viszont a kezelés hatástalan lesz, ezért a sertés periparturient hypogalactia szindrómája (PHS) esetén bár megpróbálkozhatunk adásával, az esetek egy részében a kezelés eredménytelen lesz.
4. GONADOTROPINOK Szerkezetük: glikoprotein hormonok (erőteljesen glikozilált fehérjék), melyek két peptidláncból épülnek fel (α és β lánc), ezek intenzíven glikoziláltak és hidrogénkötések, ill. van der Waals erők tartják össze őket. Az α lánc mind a négy hormon esetében közös (sőt a TSH-nak is ugyanez az α-lánca), de a β-lánc mindegyiknél különböző. Természetesen minimális eltérések vannak az egyes fajok α és βláncainak szekvenciái, illetve a glikozilációs mintázatai között, de ettől még az adott hormon másik fajnak adva is hatékony (pl. juh FSH-val lehet szarvasmarhát szuperovuláltatni, humán FSH-val lehet szuperovuláltatni főemlősöket is, stb.).
29
Szintézisük: Az ún. hipofizeális gonadotropinok, név szerint az FSH és az LH a hipofízis elülső lebenyében termelődnek. Léteznek azonban ún. extrahipofizeális gonadotropinok is, ezek az eCG és a hCG, melyek szintén az FSH- és LHreceptorokon hatnak, de nem az agyalapi mirigyben termelődnek. Közülük az equine chorionic gonadotropin (eCG), vagy korábbi elnevezés szerint pregnant mare serum gonadotropin/vemhes kanca szérum gonadotrop hormon (PMSG) vemhes kancákban a 35-140. nap között az endometriális kelyhekben szintetizálódik, míg a human chorionic gonadotropin (hCG) a humán embrió trofoblaszt sejtjeiben termelődik. Ez utóbbi mutatható ki terhes nők vizeletből a terhesség 3. hetétől kezdve (vagyis átlagos hosszúságú ciklust feltételezve a 7-8 napos embriók már kimutatható mennyiségű hCG-t termelnek). Az FSH és LH termelődését a GnRH pulzusfrekvenciája szabályozza. Alacsony frekvencia mellett több FSH és kevés LH termelődik, magasabb frekvencia esetén viszont sokkal több LH képződik, mint FSH, ugyanis a GnRH-receptorokon közvetített jel intenzitása befolyásolja, hogy inkább az LH vagy az FSH β-lánca szintetizálódjon az α-lánc mellett. A gonadotropinok felezési ideje általában rövid (FSH <30 perc, LH ~ 2 óra), de szénhidrát-tartalmuk (főleg a sziálsavtartalom) emelkedésével a felezési idejük nő. Így a leginkább glikozilált gonadotropinnak, az eCG-nek már több mint egy nap a felezési ideje és a hCG felezési ideje is az eCG-éhez közelít. Szerepük a szaporodásban: Az FSH nőivarú állatokban a tercier tüszők granulosa sejtjein fejti ki hatását, elősegítve azok proliferációját és működését, ezzel serkentve a tüszőnövekedést. Ugyanez a hormon hímivarú állatokban a Sertolisejteket stimulálja. Mindkét esetben fokozza az androgének ösztrogénekké történő aromatizációját (lásd később). Az LH ezzel szemben nőstényekben a domináns tüsző granulosa és theca interna sejtjeire hat és elengedhetetlen a domináns tüsző végső éréséhez és ovulációjához, majd ezt követően stimulálja a sárgatest progeszteron-termelését. Hímekben célsejtjei a Leydig-sejtek, melyekben stimulálja a tesztoszteron-produkciót. Az eCG és a hCG egyaránt képes kötődni az FSH- és LH-receptorokhoz is, azonban eltérő affinitással, így az eCG főleg az FSH-receptor agonistája és LH-szerű hatása kisebb, a hCG viszont sokkal erőteljesebb hatást vált ki az LH-receptorokon. Ez különben biológiai szerepükkel is összefüggésben van, az eCG ugyanis a vemhes kanáckban főleg tüszőnövekedést indukál és kiváltja ezek ovulációját, a hCG pedig terhes nőkben azért felelős, hogy a luteális fázis végén csökkenő LH-koncentráció 30
ellenére továbbra is fennmaradjon a corpus luteum progeszteron-termelése, ami elengedhetetlen a terhesség fenntartásához. Gyakorlati alkalmazás: Az állatorvosi gyakorlatban sokszor alkalmazunk eCG és hCG kezelést a follikulus-növekedés serkentése (eCG) és az ovuláció indukciója (hCG) érdekében, főleg ezek könnyű hozzáférhetősége és hosszú felezési ideje miatt. FSH-t ezzel szemben szinte csak a kérődzők szuperovuláltatására veszünk igénybe, kihasználva a tüszőnövekedésre kifejtett pozitív hatását, LH-tartalmú készítményeket pedig nem (nagyon ritkán, kivételes esetekben) használunk (hiszen a hCG/GnRH könnyen hozzáférhető). Mivel az eCG könnyen kinyerhető vemhes kancák szérumából, a hCG pedig terhes nők vizeletéből, ezért az áruk kedvezőbb. Az FSH-t ezzel szemben főleg vágóhídi sertések hipofíziséből szokták kinyerni, viszont rendkívül nehézkes az FSH és LH kémiai elkülönítése a preparátumokból (tisztítás), így általában LH-val többé-kevésbé szennyezett FSH készítmények kerülnek forgalomba (minél tisztább FSH szempontjából egy készítmény, annál hatékonyabb). Ehhez hasonló összetételű az ún. human menopausal gonadotropin (hMG, menotropin), ami idős nők vizeletéből kinyert FSH-t és LH-t tartalmazó gonadotropin keverék. A humán asszisztált reprodukciós és nőgyógyászati gyakorlat számára ma már gyártanak rekombináns technikával előállított hFSHt vagy hLH-t tartalmazó készítményeket is, melyek azonban magas áruk miatt az állatorvoslásban nem használatosak. Az eCG tartalmú injekciós készítményeket (pl. FOLLIGON®) kérődzőkben szuperovuláció kiváltására vesszük igénybe, de ugyanerre alkalmazható hipofízisből tisztított FSH-t tartalmazó gyógyszer is (pl. FOLLTROPIN®). Kiskérődzőknél szintén eCG-vel szokás kiváltani a szuperovulációt, de mindig kombinálni kell gesztagén-kezeléssel is (ivarzás indukciója szezonon kívül vagy szinkronizálás szezonban) úgy, hogy a gesztagén megvonása előtt két nappal kapják az eCG-t az állatok a tüszőnövekedés serkentése érdekében. A hCG tartalmú készítményeket (pl. CHORULON®) ezzel szemben LH-szerű hatása miatt anovulációs ciszták, ill. vemhes állatoknál korai luteális elégtelenség kezelésére vehetjük igénybe szarvasmarhában, továbbá ovuláció-indukció céljából adhatjuk sárló kancáknak, a termékenyítés idejének optimalizálása érdekében. Megemlítendő továbbá, hogy hCG-vel indukálhatjuk a nőstény macska ovulációját, de ugyanez használható a szintén indukált ovulátor házinyúl esetében is. A nyúltenyésztésben gyakorta indukálják előbb PMSG/eCG-vel a tüszőnövekedést, amit 2-3 nap múlva hCG injekció követ. Végül, a kriptorchidizmus diagnosztikájára fajtól függetlenül igénybe lehet venni hCG31
tartalmú készítményeket a stimulációs teszt elvégzéséhez, valamint kriptorchid ménekben indukálni lehet vele a herék leszállását. Sertésnél az előzőekkel ellentétben gyakran kombinálják az eCG-t és a hCG-t egyetlen injekció részeként (PG-600®, 2/3 rész PMSG-t és 1/3 rész hCG-t tartalmaz), amivel prepubertális süldők vagy választott kocák ivarzását lehet indukálni. Hasonlóképpen a kutyában is lehetőség van az extrahipofizeális gonadotropinok kombinációjával az anösztruszos szukák tüzelését indukálni úgy, hogy több napon keresztül adunk önmagában eCG-t, majd ezt kiegészítjük egy későbbi időpontban adott hCG injekcióval. Bármely fent említett felhasználási lehetőségről legyen is szó, figyelembe kell venni, hogy komplex szerkezetű glikoproteinek révén az eCG és a hCG is jó immunogének, így ismételt alkalmazásukat követően nagy valószínűséggel hatáscsökkenés fordulhat elő, a lassan kialakuló neutralizáló ellenanyagok megjelenése miatt. 5. PROLAKTIN (PRL) Szerkezete: Protein hormon, mely a növekedési hormonnal rokon szerkezetű. Szintézise: A hipofízis elülső lebenyének laktotróp sejtjei. Szintézisét a hipotalamusz aszcendáló neuronjaiból felszabaduló dopamin gátolja. Szerepe a szaporodásban: Pubertás után megnő az alapszekréciója és ez nőivarú állatokban a növekedési hormonnal ill. a ciklikus ösztrogén- és progeszteron-hatással karöltve az emlők növekedését segíti elő. Ezen kívül a vemhesség végén fontos szerepe van a tejtermelés megindításában (lactogenesis). A placenta egyébként nagyon hasonló szerkezetű és funkciójú placentáris laktogént termel, mely a PRL-receptorán keresztül hat és ugyancsak szerepe van a tejtermelésben. Továbbá egyes fajokban (pl. kutya, ember) negatív hatással van a GnRH neuronok aktivitására, ezért magas koncentrációban a ciklikus működést gátolja. Szoptató anyákban a magas prolaktin szint a libidót általában csökkenti. Gyakorlati alkalmazás: A prolaktint terápiás célból nem használják, azonban közvetve befolyásolni tudjuk a szintézisét dopamin-receptorokon ható gyógyszerek segítségével, elsősorban kutyákban, hiszen köztudott, hogy a hipotalamikus-eredetű dopamin gátolja a PRL felszabadulást. Így a dopamin32
agonista bromokriptin és cabergolin (GALASTOP®) vagy a szerotonin és dopamin receptorokon is ható metergolin (CONTRALAC®) tartalmú készítmények szájon át történő adagolásával kezelhető a szukákban gyakori álvemhesség. Tekintve, hogy kutyafélékben a prolaktin fontos luteotróp hormon, ugyanezek a gyógyszerek igénybe vehetők a szuka (esetleg macska) nem kívánt vemhességének megszakítására, illetve más hatóanyagokkal kombinálva használhatjuk őket a szukák pyometrájának konzervatív kezeléséhez is, továbbá alkalmazhatók anösztruszos szukák tüzelésének indukciójára is. 6.3. Szteroidhormonok
1. PROGESZTERON (P4) Szerkezete: szteroid hormon, tehát lipofil, így átmegy a membránokon. Ennek megfelelően receptora, a progeszteron-receptor (PR) is a magreceptorok családjába tartozik. Fontos megjegyezni, hogy emellett a P4 a mineralo-kortikodreceptorok antagonistája is, valamint sejtfelszíni, G-proteinhez kapcsolt receptora is van, melynek funkciójáról egyelőre azonban keveset tudunk. Szintézise, metabolizmusa: A progeszteron LH-hatására a sárgatest luteinizálódott szövetében, továbbá vemhes állatokban a placentában termelődik a sejtek által felvett, LDL-ből származó vagy lokálisan szintetizált koleszterinből, pregnenolon intermedieren keresztül. A sárgatestben a follikulusokkal ellentétben alig expresszálódnak a progeszteron androgénekké alakításához szükséges enzimek, ezért a P4 nagy mennyiségben kerülhet a vérbe a luteális fázisban, ahol főként transzkortinhoz, de kis mértékben albuminhoz kötötten is szállítódik. A progeszteron koncentrációja a vérben ng/ml-es nagyságrendű, ellentétben a 17β-ösztradiollal, amely csak pg/ml-ben mért mennyiségben van jelen. A progeszteron metabolitjai hidroxilációt, majd glükuronsavval vagy szulfáttal történő konjugációt követően a vizelettel, ill.
33
bélsárral ürülnek. .
Koleszterin
Pregnenolon
Progeszteron
Szerepe a szaporodásban: A sárgatest eredetű P4 legfontosabb hatása, hogy felkészíti a méhet a embrió/magzat/vehem befogadására, majd ezt követően fenntartja a vemhességet. Hímekben a nőivarú állatokhoz képest csak kis mennyiségben keletkezik, és a nemi szervekre kifejtett hatása elenyésző. Kisebbnagyobb mértékben azonban mindkét nemben hatással van a központi idegrendszeri magcsoportok működésére, s így az állatok viselkedését és a GnRHszekréciót is befolyásolja. Ez legkifejezettebb luteális fázisban lévő vagy vemhes nőstények esetében, melyek receptivitása elenyésző, s közben a GnRH pulzus frekvenciájuk is erőteljesen lecsökkent. A vér (esetleg tej, bélsár) progeszteron-koncentrációjának ELISA vagy RIA módszerrel történő mérése a ragadozók kivételével minden fajban segíthet a vemhesség diagnosztizálásában, vemhes állatokban ugyanis a várható visszaivarzás idején is még magas progeszteron koncentrációt mérhetünk. A tesztek specificitása azonban változó. Szukában ez a módszer nem működik, mert a vemhes és nem vemhes állatok progeszteron-profilja hasonló, ezért nem lehet e két állapot között a P4 alapján differenciálni. Helyette azonban egy kutyára jellemző speciális jelenség, a kifejezett preovulációs luteinizáció miatt a P4 koncentráció mérése nagyon fontos és pontos eszköz a szuka ovulációjának előrejelzéséhez. Gyakorlati alkalmazás: A progeszteront és szintetikus analógjait együttesen gesztagéneknek nevezik. Ezek széles körben használt készítmények, amelyek beadási/szervezetbe való bejuttatásának módja állatfajonként változik. A lényeg minden esetben az, hogy nagyjából a luteális fázis hosszának megfelelő időtartamig kezelik az állatokat gesztagénnel és ezzel egy „mesterséges sárgatest fázist” hoznak létre. A gesztagén kezelés ideje alatt a tüszőnövekedés megtartott, 34
de a domináns tüszők ovulációja gátolt (lásd később) a P4 GnRH-neuronokra kifejtett gátló hatása miatt (negativ feedback a GnRH-termelésre + kibocsátásra). A gesztagén megvonását követően viszont a kezelt állatok GnRH-termelése felszabadul a blokk alól („rebound hatás”), emiatt azok néhány napon belül ivarzani kezdenek. A szarvasmarha esetében ez akkor is megtörténik, ha előzőleg anösztruszos volt a tehén. Kiskérődzőknél pedig akkor is, ha szezonon kívül vagyunk (ekkor azonban gonadotrop hormonnal együtt ajánlatos alkalmazni a gesztagén kezelést). A fentieknek megfelelően szarvasmarhánál ciklusos tehenek ivarzásának szinkronizálására, illetve anösztruszos egyedek ivarzás-indukciójára alkalmazhatók természetes progeszteronnal impregnált, hüvelybe helyezhető eszközök (pl. EAZI-BREED CIDR®, PRID®), vagy a szintetikus származék norgesztomet-et tartalmazó bőralatti implantátumok (pl. CRESTAR®, SYNCHROMATE-B®). Kiskérődzőkben hasonlóképpen szinkronizálásra vagy szezonon kívüli ivarzásindukcióra használhatók a gesztagén készítmények (természetes vagy szintetikus progeszteron) hüvelyszivacs formájában, mely szintetikus fluorogeszton-acetáttal (pl. CHRONOGEST®) vagy medroxiprogeszteron-acetáttal (pl. VERAMIX®) van átitatva, továbbá itt is alkalmazható természetes progeszteront tartalmazó, hüvelybe helyezhető eszköz (EAZI-BREED CIDR SHEEP®). Sertésnél és lónál a gesztagéneket elsősorban szájon át alkalmazzuk, takarmányra önthető oldat formában és az aktív hatóanyag esetükben a szintetikus származék altrenogeszt (REGUMATE EQUINE® és REGUMATE PORCINE®). Az aglepriston (ALIZINE®) egy progeszteron-receptorokhoz kötődő specifikus antagonista, melyet elsősorban a kisállatgyógyászatban vetélés indukciójára használnak. 2. DEHIDROEPIANDROSZTERON (DHEA), ANDROSZTENDION, TESZTOSZTERON Szerkezetük: Szteroid hormonok (lipofilek, átmennek a membránokon). Androgéneknek hívják őket együttesen. Szintézisük helye: Theca sejtek. De DHEA és androsztendion keletkezik nagy mennyiségben a mellékvesekéregben is, ami a petefészektüszőkbe jutva főleg ösztrogénekké aromatizálódik.
35
Szintézisük prekurzora: Az androsztendion több lépésen keresztül pregnenolonból szintetizálódik progeszteron intermedieren vagy DHEA intermedieren keresztül és ebből alakul ki a tesztoszteron. 5α-reduktáz enzim hatására a tesztoszteron egy nála 5x hatékonyabb androgénné, a dihidrotesztoszteronná (DHT) alakulhat a perifériás szövetekben. Szállításuk a vérben: főleg sex hormone-binding globulinhoz (SHBG), kisebb mértékben albuminhoz kötődve. A DHEA hímekben és nőstényekben egyaránt az egyik legnagyobb mennyiségben jelenlévő szteroid hormon a vérben. A tesztoszteron és androsztendion vérbeli mennyisége azonban nőivarú állatokban csak tizede a hímekben mérhető értékeknek, mert a follikulusok granulosa sejtjei nagyon hatékonyan ösztrogénekké aromatizálják őket! Receptoruk: androgén receptor (AR, magreceptor család). A DHEA és androsztendion csak parciális agonistái a receptornak, de a DHEA az ösztrogén receptoroknak is teljes agonistája! Metabolizmusuk: ösztrogénekké konvertálódnak és konjugáció után főleg a vizelettel ürülnek. 3. ÖSZTRADIOL Szerkezete: Szteroid hormon (lipofil, átmegy a membránokon) Szintézisének helye: Tercier follikulusok granulosa sejtei, illetve vemhes állatokban a placenta. Szintézisének prekurzora: A theca sejtekből származó androgénekből (tesztoszteronból, ill. androsztendionból) keletkezik az aromatáz enzim segítségével. Szállítása a vérben: főleg sex hormone-binding globulinhoz (SHBG), kisebb mértékben albuminhoz kötődve Receptora: ösztrogén receptorok (ERα és β, magreceptor család), a szervezet szinte minden sejtjében megtalálhatók. De van sejtfelszíni G-proteinhez kapcsolt receptora is! Metabolizmusa: általában kevésbé aktív ösztronná (E1) vagy ösztriollá (E3) alakítást követően kénsavval vagy glükuronsavval konjugálódik és így ürül a vizelettel vagy kisebb mértékben a bélsárral.
36
6.4. Egyéb szerkezetű hormonok 1. INHIBIN, ACTIVIN Szerkezetük: Protein hormonok, melyek két alegységből állnak és a transzformáló növekedési faktorok (TGF) családjába tartoznak. Szintézisük helye: A domináns tüsző granulosa sejtjeiben illetve a placentában termelődnek. Ezen kívül az inhibin a sárgatest luteinizálódott sejtjeiben is képződik. Szerepük a szaporodásban: a két hormonnak közös a receptora, mégpedig az aktivin-receptor, melynek az aktivin agonistája, az inhibin viszont antagonistája. Az aktivin a hipofízis elülső lebenyében fokozza az FSH szintézisét és leadását, az inhibin pedig kompetitív antagonistaként értelemszerűen ezt gátolja. Emellett az aktivin a TGF-család számos más tagjával együtt (pl. Bone morphogenetic proteinek) a petefészektüszők granulosa sejtjeire is hat, támogatva bennük az FSHreceptor által közvetített szignálokat. Mivel az inhibinnek nagyon fontos szerepe van a domináns tüsző kiválasztódásában és a többi tüsző atréziájában, ezért a juhtenyésztésben kidolgoztak egy módszert az inhibinnel való vakcinázásra. Ez elvileg (a gyakorlatban nem terjedt el) lehetőséget biztosít az állatok inhibin szintjének csökkentésére (mert a vakcinázás eredményeként autoantitestek képződnek ellene), ami többszörös ovulációhoz, s így ikerfogamzáshoz, a bárányszaporulat növekedéséhez vezet. A Booroola juhfajtákban fellelhető mutációk (FecB, FecX gének) egyébként közvetve az inhibin-szint csökkenésén keresztül okoznak ikervemhességeket. 2. PROSZTAGLANDINOK PGF2α Szerkezete: Arachidonsav-származék (eikosanoid) Szintézisének helye: endometrium. Szerepe a szaporodásban: A PGF2α legfontosabb feladata a luteolízis kiváltása. Emellett simaizom-összehúzó is, s így a méhkontrakciókat fokozza, ezzel a már ciklusba lendült szarvasmarhában elősegíti az involúciót (a méh regenerációjának időszaka az ellést követően). Egyéb szöveteken (pl. bélcsatorna, erek) található 37
receptorai viszont mellékhatások okozói lehetnek exogén prosztaglandin adagolásakor (luteolízis indukciójának céljából), melyre például a lovak kifejezetten érzékenyek. Felezési ideje rövid, alig fél perc. A prosztaglandin E2 (PGE2) szintén egy eikosanoid, mely minden állatfajban szerepet játszik az ovuláció kiváltásában (lásd később). Kutyában emellett autokrin luteotróp faktorként feltételezik a hipofízis-eredetű luteotróp faktor, a PRL mellett (melyet a sárgatest önmaga fenntartása érdekében termel; tudniillik kutyánál a nem vemhes állatokban is a vemhességgel megegyező hosszúságú luteális fázis van, amit diösztrusznak vagy metösztrusznak hív a szakirodalom). Lóembriók esetében pedig valószínűleg azok petevezetőbeli vándorlásában játszik szerepet, ugyanis vizsgálatok szerint az ampulla és isthmus közötti szűkületen csak az élő, kellő mennyiségű PGE2-t termelő embriók tudnak átjutni a petevezető simaizomzatának ellazítása révén (a PGE2 ugyanis a PGF2α-val ellentétben simaizom relaxáns). 3. RELAXIN Szerkezete: Protein hormon Szintézisének helye: A sárgatest és a placenta. Szerepe a szaporodásban: az uterus simaizomzatának ellazításán keresztül segít fenntartani a vemhességet. Ezt a hatást csak az ellést megelőző ösztrogénszint emelkedés tudja majd ellensúlyozni, ami az oxitocin receptorok expresszióját és következményesen a szülőfájások megindulását okozza. A terminus közeledtével a relaxinnak más szerepe is van. A kollagén-anyagcserére, szövetátépítő folyamatokra és az angiogenezisre is hat, s így ez a hormon elősegíti a medencei szalagok megnyúlását, a symphisis pelvis fellazulását és a nyakcsatorna tágulását is, melyek mind elengedhetetlenek az ellés megindulásához. Háziállataink közül a kutya az a faj, melyben a relaxinnak klinikai jelentősége is van. Bennük ugyanis a relaxin vemhesség-specifikus hormon (macskában is, de itt a gyakorlatban nem olyan jelentős), melynek vérbeli szintje csak vemhesség esetén emelkedik meg igazán. Ennek nagy jelentősége van, mert a vemhes és nem vemhes kutyák között a progeszteron szintben, sőt a luteotróp faktorként ható PRL szintjében sincs különbség. A relaxin-teszt azonban specifikusan jelzi a 38
vemhességet és az ultrahang-vizsgálat alternatívájaként is felmerülhet a vemhesség diagnosztizálásában. 4. INZULIN, IGFs, LEPTIN Szerkezetük: protein hormonok Szintézisük helye: Az inzulin a pancreas β-sejtjeiben, az IGF-2 (inzulin-szerű növekedési faktor 2) növekedési hormon hatására a májban, illetve a petefészektüszők theca sejtjeiben is termelődik. A leptin az érett (magas lipidtartalmú) adipocyták terméke. Szaporodási jelentőségük: a részletek nélkül meg kell emlékezni ezekről a hormonokról is. Bár hagyományosan nem reproduktív hormonként kezelik őket, mégis fontos szerepet játszanak a szaporodásban. Az inzulin és a leptin a tápláltsági állapot fontos jelzői, s közvetve a hipotalamikus GnRH leadást serkentik. Ugyanis a nőstények csak kielégítő tápláltság mellett mutatnak ciklikus nemi működést. A leptin különben a pubertás indukciójában részt vevő egyik legfontosabb faktor (lásd később). Az IGF-2, mely az inzulinhoz hasonló szerkezetű protein, bizonyítottan szerepet játszik a follikuláris fejlődésben, így például a granulosa sejtek proliferációjában. Ugyanígy lehetne említeni citokineket vagy a glükokortikoidokat is, melyek valószínűleg hipotalamikus szinten vannak hatással a reproduktív folyamatokra. 7. Nőivarú állatok ciklikus nemi működésének hormonális szabályozása
A nőstények hipotalamuszában tonic illetve surge centert egyaránt találunk (ellentétben a hímekkel, ahol csak tonic center van). A tonic center felelős a GnRH folyamatos, de alacsony pulzusfrekvenciával történő leadásáért. A folyamatosan, kis mennyiségben jelenlévő GnRH az agyalapi mirigy elülső lebenyéből FSH és LH leadását serkenti (ilyen frekvencia mellett kicsivel több FSH, mint LH termelődik/kerül leadásra). A vérbe kerülő FSH a petefészek tüszőinek növekedését segíti. 39
Nem minden tüszőnek van FSH-receptora. A follikulusok csak a másodlagos harmadlagos átmenet környékén kezdik expresszálni FSH-receptoraikat. Egészen eddig a pontig a tüszők fejlődése és életben maradása független a központi szabályozástól. A nőivarú állatokban - embrionális korban - a fejlődő petefészek milliós nagyságrendű primordiális őssejtet (oogóniumot) tartalmaz, amelyek rendkívül intenzíven osztódnak, előbb mitózissal, majd egyre inkább a meiózis válik jellemzővé. Az oogóniumok azonban nem fejezik be a meiózist, hanem az 1. meiotikus osztódás profázisában fejlődésük megáll, és nyugvó állapotba kerülnek. Az oogóniumok legnagyobb része apoptozison megy keresztül ebben az időszakban (oogóniális atresia), tehát a születéskori petesejtkészlet nagyságát a mitózis, meiózis és apoptózis együttesen határozza meg. Ennek eredményeképpen születéskor néhány millió körüli (de már redukált mennyiségű), a profázisban megrekedt petesejt (ezeket hívjuk primer oocytának) található a petefészken, melyek egyrétegű granulosa sejtsorral körülvéve alkotják a primordiális follikulusokat. A follikulusok egy csoportja lokális növekedési faktorok hatására tovább fejlődik egészen a tercier follikulus stádiumig, amikortól kezdve a granulosa sejtek felszínén megjelenő FSH-receptorok elengedhetetlenné válnak a túlélésükhöz. A pubertás előtt nagyon alacsony a keringő FSH koncentráció, ezért az FSHszenzitív tüszőknek nincs esélyük domináns follikulussá fejlődni, így az élet ezen időszakában ezek a tüszők mind elsorvadnak (follikuláris atresia). A pubertás körül rendelkezésre álló petesejt-készlet ezért jelentősen redukált, kb. százezres nagyságrendű a folyamatos atresia miatt. Az elégtelen FSH produkció hátterében az áll, hogy a tonic center neuronjai a pubertást megelőzően rendkívül érzékenyek az ösztrogének általi negatív visszacsatolásra (valószínűleg kifejezett ösztrogén receptor expressziójuk miatt). A tonic center GnRH pulzusfrekvenciája tehát mindvégig alacsony marad (a negatív visszacsatolás lényege, hogy a sejtek GnRH szintézise csökken), ami éppen csak arra elég, hogy kis mennyiségű FSH-t és LH-t juttasson az agyalapi mirigyből a vérkeringésbe. Ez a kevés FSH kötődik a receptorához a tercier follikulusokon és kicsit fokozza azok E2 termelését, ill. segíti életben maradásukat. A vérbe jutó ösztrogének egyből „visszacsatolnak” a tonic centerre (negatív feedback) és visszafogják/csökkentik a GnRH leadást, ami az FSH és LH szint csökkenéséhez, következményesen a follikulusok atresiájához vezet. Ez az ördögi kör tartja fenn a pubertás előtti állapotot. 40
Pubertáskor azonban jelentősen megváltozik a tonic center neuronjainak működése és ezt követően sokkal kevésbé lesznek érzékenyek az ösztrogénekre. Az ivarérettséghez nem elég egy bizonyos életkor elérése, fontos emellett a megfelelő kondíció (ezt a zsírraktárakból felszabaduló leptin jelzi!), illetve ezen túl a fajtársaktól származó szagingerek és főleg a szezonális állatok esetében az évszak. Mindezen ingerek feltehetően nem (vagy nem kizárólag közvetlenül) ezekre a GnRH-neuronokra hatnak, hanem az úgynevezett kisspeptin-neuronokra, melyek szinaptikus kapcsolatban vannak a GnRH termelő neuronokkal. Feltehetően a kisspeptin-neuronok integrálják a melatoninerg sejtek (szezonális hatás), a metabolikus állapotot jelző leptin és a vércukor, ill. vérbeli zsírsav szint által közvetített információkat. Annyi bizonyos, hogy pubertás idején és azt követően a kisspeptin expressziója megnő az idegszövetben. A neurotranszmitter hiányában viszont nem következik be a pubertás. Valószínű, hogy a kisspeptinerg-neuronok váltják ki a GnRHneuronok aktivitásának emelkedését (tonic center) a pubertás utáni időszakban (a negatív visszacsatolásra való érzékenység csökken). Fontos még a feromonok hatása is, melyek szintén befolyásolják a GnRH neuronok aktivitását, hiszen a bulbus olfactoricus idegsejtjei is kapcsolatban vannak a tonic center területével. A pubertást követően a tonic center alap GnRH-pulzusfrekvenciája megemelkedik. Ez több FSH és LH leadását indukálja, ami elegendő a gonadotropin-érzékeny tercier follikulusok egy csoportjának „besorozásához” (recruitment). Ez a tüszőcsoport (ún. cohort) az FSH hatására növekedésnek indul (nő az antrum mérete is) és a tüszők egyre több ösztradiolt termelnek. Közülük egyesek atretizálnak, mások szelektálódnak a további fejlődéshez és ez utóbbiak közül egy (monotocous fajokban) vagy több (polytocous fajokban) tüsző dominánssá válik, a többiek atretizálódnak. Az előrehaladott szelektált tüszők granulosa sejtjein az FSH hatására fokozatosan elkezd megjelenni az LH-receptor is, mely elengedhetetlen szignálokat biztosít majd a domináns tüsző végső éréséhez és az ovulációhoz. A szelektált tüszők, de leginkább a domináns tüsző igen nagy mennyiségben termel ösztradiolt és inhibint. Az ösztradiol negatív visszacsatolással csökkenti a tonic center GnRH-leadását (így kevesebb FSH jön a hipofízisből), illetve pozitívan csatol vissza a surge centerre! Ez egyre fokozódó GnRH-leadáshoz vezet, s a nagy pulzusfrekvencia következtében az agyalapi mirigyben inkább LH szintetizálódik az FSH-val szemben! Az inhibin pedig az agyalapi mirigy elülső lebenyén hatva szelektíven tovább gátolja az FSH-szintézisét (de nincs hatással az LH szekrécióra). 41
Az említett tényezők oda vezetnek, hogy a keringő FSH szintje lecsökken, ami az FSH-szenzitív szelektált tüszők atréziájához vezet, azonban a domináns tüsző életben maradhat és befejezheti fejlődését a granulosa sejtjeinek a felszínén lévő LH-receptoroknak köszönhetően. A follikuláris fejlődés dinamikáját legjobban a tehénben vizsgálták, ahol egyértelművé vált, hogy az említett tüszőfejlődés ciklusonként nemcsak egyszer megy végbe, hanem kétszer vagy akár háromszor ismétlődhet ugyanazon cikluson belül. Azonban a tüszőfejlődési hullámok közül mindig csak egy (az utolsó) fejeződik be ovulációval! Ennek oka az, hogy a luteális fázis alatt, vagyis amikor egy korábbi ovuláció eredményeként sárgatest van jelen a petefészken, az általa termelt progeszteron negatív visszacsatolással gátolja a surge center működését, a tonic centerét viszont nem! Mivel a domináns tüsző ovulációjához elengedhetetlen az LH-csúcs (kancában viszont egy elnyújtott LH-plató van!), ami a surge center nagy pulzusfrekvenciájú GnRH leadásának következménye, ezért P4hatás alatt gátolt az ovuláció, de a domináns tüszővé fejlődés nem (mely főként a tonic center működésén alapszik). A luteális fázis során tehát a tüsző eljuthat a domináns állapotig, de a GnRH-surge hiányában nincs elegendő LH ennek életben maradásához és ovulációjához, így atretizálni fog (ez az első hullám eredménye). Ezt követően egy újabb korai tercier follikulusokból álló cohort indul növekedésnek FSH-hatásra (második hullám), melyből pár napon belül szelektálódik egy domináns follikulus és amennyiben ekkorra a sárgatest már elkezdett sorvadni (luteolízis) és P4-termelése lecsökkent (tehát az előző ciklus diösztrusz stádiumából a következő ciklus proösztrusz stádiumába jutottunk), úgy a surge center képes lesz válaszolni (reszponzív) a domináns tüsző által termelt E2re és bekövetkezhet az ovuláció. Amennyiben még mindig a corpus luteum dominenciája alatt érik meg a második hullám domináns tüszője is, úgy ennek atréziáját követően egy harmadik hullám indul fejlődésnek, melyből már biztosan a proösztrusz időszakában alakul ki a domináns tüsző, így alacsony P4 szint mellett bekövetkezhet az ovuláció. Tehénben az esetek nagy részében a második hullámból megtörténik az ovuláció, de a maradék esetben egy harmadik hullámra is szükség van/lehet. A pubertást megelőzően (ahogy már szó volt róla), a vemhesség alatt, anösztruszos állatokban illetve az ellés után (puerperium időszaka) is folyamatosan jönnek létre tercier follikulusok a primordiális tüszőkből. Ezen időszakokban azonban a tonic center GnRH leadása alacsonyabb frekvencián működik, így a korai tercier follikulusokból soha nem alakulhat ki dománs tüsző, hanem a fejlődésnek induló cohortok tüszői még a korai harmadlagos stádiumban 42
atretizálnak a nem megfelelő FSH-ellátás (alacsony GnRH frekvencia a tonic centerből) következtében. Az ovuláció előtt álló antrális tüsző életben maradásához tehát LH-ra van szükség. A granulosa sejtek azonban eleinte nem expresszálnak LH-receptorokat, ezek csak az érett és szelektált/kiválasztott follikulusokban jelennek meg. A tüszőfejlődés elején ugyanis a tercier tüszők granulosa sejtjeinek felszínén FSHreceptorok, a theca sejtek felszínén pedig LH-receptorok találhatók. A theca sejtekben az LH-receptorok jelátvitelének hatására azok az enzimek expresszálódnak (3β-hidroxiszteroid dehidrogenáz ill. 17α-hidroxiláz), amelyek a keringő LDLből felvett koleszterint pregnenolonon, majd progeszteronon keresztül androsztendionná ill. tesztoszteronná képesek alakítani. Ez a két androgén diffundál be a granulosa sejtekbe (melyeknek nincs közvetlen vérellátása, hisz bazális membránnal vannak elválasztva a kötőszövettől) és az azok felszínén lévő FSH-receptor jelátvitelének hatására a bennük (granulosa sejtek) expresszálódó aromatáz enzim igen nagy százalékban ösztronná illetve ösztradiollá konvertálja az említett két androgént (androsztendion és tesztoszteron). Ez az úgynevezett „két sejt - két gonadotropin modell”. Az FSH hatására azonban fokozatosan elkezd expresszálódni az LH-receptor is a granulosa sejteken, így az érett szelektált tüszőkön már nagy számban lesznek ezek is jelen. LH-hatására fokozódik a sejtek PGE2 termelése, mely vasodilatatorként fokozza a helyi véráramlást/vérellátást, illetve angiogén faktorokat is termelnek a granulosa sejtek. A tüszők fokozott vérellátása és a következményes helyi nyomásnövekedés, ill. ödéma a granulosa sejtek alatti bazális membrán részleges károsodásához vezet, ennek révén a granulosa sejtek is képesek egyre inkább hozzájutni a vérbeli LDLhez és képessé válnak, az LH-hatásra expresszálódó 3β-hidroxiszteroid dehidrogenáz révén, a progeszteron szintézisére. Azonban a progeszteront nem tudják tovább alakítani androgénekké, mert a granulosa sejtekben nem expresszálódik a 17α-hidroxiláz enzim (de emellett tovább folyik a theca sejtek felől érkező androgének aromatizációja is!). Így az eleinte még csak kis mennyiségben termelődő progeszteron lokálisan fokozza a szövetbontó enzimek (pl. kollagenáz) termelését, ami egyre fokozódó szövetkárosodáshoz vezet, s ezt csak súlyosbítja a hyperemia miatti nyomásemelkedés és a tüsző sejtjeinek PGF2α-termelése, ami a petefészek szövetében található myoepithel sejtek kontrakcióját idézi elő. Ezen tényezők együttesen vezetnek a domináns tüsző felrepedéséhez, az ovulációhoz, ami után a korábbi granulosa és theca sejtek 43
teljesen összekeverednek, közöttük rengeteg ér lesz (az LH hatására és a szöveti reparáció részeként termelődő angiogén faktorok miatt), emiatt van az ovulált tüsző helyén maradó képletnek pirosas színe (corpus haemorrhagicum). Az ovuláció eredményeként a petevezető infundibulumába jut a petesejt (a cumulus oophorus granulosa sejteivel körülvéve; ezek azok a sejtek melyek az antrális tüsző üregébe türemkedő petesejtet vették körbe), mely onnan az ampullába kerül, ahol megtörténik a megtermékenyülés. A legtöbb emlősfajban az ovuláció spontán következik be, egyesekben azonban (pl. macskafélék, görény) indukált ovuláció történik a párzás hatására. Ez egy neuroendokrin reflexíven alapul, mely során a hüvely ismételt ingerlését követően lesz nagy frekvenciájú GnRH leadás a hipotalamuszból, ami kiváltja az LH csúcsot. Ahogy arról korábban szó volt, a tüszőkben primer oocyta van, ami annyit jelent, hogy a petesejt az I. meiotikus osztódás profázisában megakadt. Ezt a nyugalmi szakaszt a granulosa sejtek által termelt gátló faktorok biztosítják (a petesejttel való gap junction kapcsolatok révén) egészen az LH-csúcs bekövetkeztéig. Ekkor ugyanis a granulosa sejtek felszínén lévő LH receptorok szignálja megváltoztatja azok aktivitását, s a primer oocyta felszabadul a gátlás alól és befejezi az I. meiózist, hogy azután ismét megakadjon/megálljon a fejlődése, immár a II. meiotikus osztódás metafázisában (ekkor már secunder oocytának hívjuk). Ebben a stádiumban történik meg az ovuláció. Kutyafélékben azonban a petesejt „éretlenül” (primer oocytaként) ovulál), ezért a petevezetőben egy érési folyamaton keresztülmenve el kell jutnia a II. metafázisig, mielőtt megtermékenyülhetne (ez kb. 2 napot vesz igénybe). Ezt követően minden fajban a spermium behatolása lesz a meiózis befejezését indukáló inger. Az ovulációt követően kb. 3-5 napig tart a sárgatest kialakulása, majd ezt követően mérete még pár napig növekszik és eléri maximális progeszteron termelését („virágzó sárgatest”). Ez a folyamat a luteinizáció, mely során az ovuláció környéki szövetkárosodás eredményeként a granulosa és theca sejtek összekeverednek, vérellátásuk fokozódik és LH hatására egyre több P4-et termelnek. Bizonyos mértékű preovulációs luteinizáció minden fajban megtörténik (szó volt róla, hogy a progeszteron szintézis már az ovulációt megelőzően megindul), ez azonban a legkifejezettebben a kutyafélékben történik így, ahol a P4-szint emelkedéséből előre jelezhető az ovuláció időpontja. A sárgatest színét a sejtekben felhalmozott karotin származékok biztosítják (és az A-vitamin fontos a corpus luteum megfelelő működéséhez is). Az ún. nagy lutein sejtek a granulosa sejtekből, a kis lutein 44
sejtek pedig a theca sejtekből alakulnak ki, s ezek szövettanilag megkülönböztethetők. Mindkét sejttípus képes progeszteron termelésére, de emellett a nagy lutein sejtek oxitocint, inhibint , vemhes állatokban pedig főleg relaxint is termelnek. Ismétlésképpen: a luteális fázis alatt nincs ovuláció! FSH-dependens hullámszerű tüszőfejlődés (szarvasmarhában legalábbis biztosan) viszont továbbra is történik (ennek jelentősége van, mert a szuperovulációs kezelések során ezekből a hullámokból nyerjük a nagyszámú preovulációs tüszőt!). Az ovuláció gátlásához a corpus luteum által termelt progeszteron és inhibin járul hozzá, ugyanis ahogy nő az előbbi mennyisége, egyre inkább gátolja a hipotalamikus GnRH-leadás pulzusfrekvenciáját (kevesebb LH és FSH lesz). Az inhibin pedig alacsonyan tartja az FSH szintet. Az idő előrehaladtával a luteális fázis végéhez közeledve bekövetkezik a sárgatest sorvadása (luteolízis), amennyiben nincs jelen a méh üregében embrió. A luteolízis egy 2-3 napig tartó folyamat a luteális fázis végén (melyről azt mondtuk, hogy szarvasmarhában kb. 17-18 nap hosszú). Kiváltásában, a legtöbb emlősben az endometrium által termelt PGF2α-nak van kulcsszerepe (a méh eltávolítása a luteális fázis hosszabbodásához vezet), kivéve a főemlősöket és a kutyaféléket. Ezekben ugyanis a luteolízis petefészekbeli (belső) folyamat és nem az endometrium, hanem maga a sárgatest termeli a luteolitikus faktort (PGF2α). A kutyafélékben történtekről annyit tudunk, hogy a méh nem szükséges a petefészek normális ciklikus működéséhez, de a luteolízis folyamatáról szűkös ismereteink vannak (kutyában a luteális fázis vemhes és nem vemhes állatokban is nagyjából ugyanolyan hosszú!). Kérődzőkben és sertésben egy speciális mechanizmus alakult ki, hogy a rövid felezési idejű PGF2α-t az uterusból mielőbb a petefészekbe juttassa. A méhből elvezető véna és a petefészek artéria ugyanis szorosan egymás mellett futnak, így a lipofil prosztaglandinnak lehetősége van ebben az ellenáramlásos rendszerben az uterinalis vénából az ovarialis artériába diffundálni, s így anélkül, hogy a szisztémás keringésben felhígulna, közvetlenül a sárgatesthez juthat. Kancában nincs ilyen rendszer, valószínűleg azért, mert a lófélék kevésbé gyorsan metabolizálják a PGF2αt és egyébként is jóval érzékenyebb a sárgatestjük ennek hatásai iránt. Természetes vagy szintetikus prosztaglandint gyakran használnak luteolízisre. Tudni kell azonban, hogy a sárgatest a luteális fázis első kb. 4-5 napjában nem érzékeny a PGF2α-ra (refrakter periódus), s ugyanígy a már hanyatló sárgatest 45
lízisét sem lehet felgyorsítani exogén prosztaglandinnal. Ez a legtöbb állatfajra igaz, fontos kivétel azonban a sertés, a kocában a sárgatest ugyanis 12-14 napon keresztül refrakter, tehát majdnem a luteális fázis teljes hosszában! Ezért a sertésnél ilyen készítményeket nem alkalmazunk (csak a fialás indukciójára!). Felmerül a kérdés, vajon mi indukálja az endometrium prosztaglandin szintézisét? A nagy lutein sejtek által termelt oxitocin. A pontos mechanizmus nem tisztázott, de a luteális fázis második felében megnő az oxitocin receptorok expressziója a méhben, amit ezt megelőzően valószínűleg a progeszteron tart alacsony szinten, de nem tudjuk, hogy a továbbra is magas P4 koncentráció ellenére miért emelkedik a receptorok expressziója az idő előrehaladtával. Mindenesetre az oxitocin hatására nő a prosztaglandin leadás az endometriumból, ami pozitív feedback-el fokozza a sárgatest oxitocin termelését. A PGF2α jelenléte nem vezet azonnal luteolízishez, előbb ugyanis el kell érni egy kellően nagy pulzusfrekvenciát, ami elindítja a sárgatest hanyatlását, s ezt az oxitocin és PGF2α közötti pozitív visszacsatolási hurok biztosítja. A ciklus 16-17. napjára (ahol a 0. nap az ovuláció) a prosztaglandin leadás már kellően nagy frekvenciával történik, mely elegendő a luteolízis indukciójához. A luteális sejtek felszínén lévő PGF2α-receptor valószínűleg igen intenzív Ca2+ beáramlás indukciója révén a P4-szintézis blokkjához és a sejtek apoptózisához vezet. A sejttörmelék eltávolítását követően egy hegszövet-szerű képlet, az ún. corpus albicans marad hátra és ezzel egy időben véget ér a hipotalamohipofizeális tengely progeszteron általi blokádja. A blokád megszűnése révén befejezheti végső érési folyamatát egy új, ovulációra kész domináns tüsző. Mindezek természetesen nem vemhes állatokban történnek így, hiszen vemhesség esetén nincs luteolízis! A petefészek ciklusát az ösztrogén túlsúly (follikuláris fázis) ill. progeszteron túlsúly (luteális fázis) következményeként a nemi traktus ciklikus változása követi. Ennek megfelelően az alábbiak a legfontosabb változások a ciklus két fő szakaszában: Follikuláris fázis (E2 hatás idején): -
A péraajkak ödémásak, duzzadtak és intenzíven kipirulnak.
-
A vestibulum laphámja megvastagszik (védelem a kopuláció okozta sérülések ellen), a Bartholin-mirigyek szekréciója fokozódik (a kopuláció elősegítése).
46
-
A cervix és a craniális vagina intenzív váladéktermelésbe kezd (ez síkosítja a hüvelyt a kopuláció idején, valamint kimossa a baktériumokat a párzás után)
-
A nyakcsatorna kissé fellazul és váladéka kevésbé sűrű, hogy a spermiumok könnyebben átjussanak rajta.
-
Az endometrium proliferációs fázisban van, mirigyei felszaporodnak és növekednek.
-
A petevezető váladéktermelése is fokozódik, valamint a hám felszínén lévő csillók mozgása intenzívebb lesz.
-
A teljes nemi traktus vérellátása megnő (hyperaemia), ami fokozza a váladéktermelést, továbbá fehérvérsejtek lokális felszaporodását okozza (leukocytosis). Ez azért fontos, hogy a kopuláció során bekerülő idegen anyagokat (spermiumok, mikrobák) fagocitózissal eltávolítsa a lumenből. A nemi utak immunológiai ellenállóképessége fokozódik ösztrogén-hatás idején!
-
Ugyancsak nő az egész traktusban az izomtónus (főleg azért, mert az E2 fokozza az oxitocin-receptorok expresszióját), ami elősegíti a spermiumok transzportját.
Az ösztradiol felelős továbbá a nőstények megváltozott viselkedéséért és szexuális receptivitásukért az agyi idegsejtekre kifejtett hatásai révén. Luteális fázis (P4 hatás idején): -
A méh szekréciós fázisba kerül, mirigyei nagy mennyiségű váladékot termelnek, melynek elsődleges feladata, hogy az uterusba leérkező embriók életben maradását elősegítse („embriótrofa”).
-
Ezzel egy időben a progeszteron csökkenti a myometrium oxitocin-receptor expresszióját, ami az izomtónus csökkenéséhez vezet (a folyamatos kontrakció az embrió ill. magzat halálához vezetne). Kancánál azonban a myometrium kontrakciói nem teljesen gátoltak, mert az embrió intrauterin migrációjához (a vemhesség 12-14. napja között) gyenge összehúzódások szükségesek. Ez a jelenség lófélékre specifikus és elengedhetetlen a vemhesség anyai felismeréséhez.
-
Sárgatestfázis idején a szexuális receptivitás lecsökken, valamint a surge center aktivitása is blokkolt. Így a luteális fázis alatt nem lesz újabb ovuláció (de tüszőnövekedési hullámok igen!). 47
-
Vemhesség alatt a progeszteronnak fontos szerepe van az emlők fejlődésében (egyébként az emlők pubertás körüli fejlődéséért is részben az E2-P4 ismételt váltakozása felelős).
Megemlítendő még, hogy pubertáskor vagy szezonális anösztruszt (kiskérődzők, ló) követően gyakran előfordul, hogy az első ovuláció nem jár együtt az ösztruszra jellemző viselkedésbeli változásokkal (csendes ivarzás), a második vagy harmadik ovuláció viszont már igen. Ennek oka, hogy az első ovuláció után képződő sárgatest P4-termelése érzékenyíti az agyat az ösztrogénhatásra. Mivel az anösztrusz idején nem volt P4 (sárgatest hiányában), így az első ciklusban termelődő E2 bár kiváltotta az LH-csúcsot, de az ivarzási tüneteket még nem tudta indukálni. 8. A hímivarú állatok nemi működése és annak regulációja
EREKCIÓ A fibroelasztikus (kérődzők, sertés) és musculocavernosus (kutya, ló; sok erektilis szövetet tartalmazó) pénisszel rendelkező állatok esetében az erekció mechanizmusa részben eltérő. Előbbi esetben ugyanis a méretnövekedésért főleg a pénisz S-alakú görbületének kiegyenesedése (a m. retractor penis ellazulása miatt), utóbbianál pedig a barlangos testek (erektilis szövet) vérrel telítődése felel. Fontos megjegyezni, hogy az erekció a keresztcsonti gerincvelői szakasz felől érkező paraszimpatikus idegek irányítása alatt áll, míg az ejakuláció a szimpatikus tónus fokozódásának következménye (ágyéki gerincvelői központok). Legtöbb emlősnél az erekció kialakulásában vizuális (látás), olfaktorikus (szaglás), auditorikus (hallás) és taktilis (érintés) ingerek játszanak szerepet. A barlangos testeket ellátó artériák kontraktilitását paraszimpatikus, nonadrenerg-nonkolinerg neuronok (NANC) és szimpatikus adrenerg neuronok szabályozzák. Nyugalmi állapotban az ágyéki gerincvelőből kiinduló szimpatikus rostok adnak le noradrenalint, ami az artériák α1-receptorain keresztül azok kontrakcióját váltja ki, ezért a vérátfolyás csökkent mértékű, jól szabályozott, nem telítődnek a szinuszok. Szexuális ingerek hatására az agy felől jövő leszálló kötegek a keresztcsonti paraszimpatikus neuronokat ingerlik, s ezek a pénisz artériáinak falán végződve 48
NO-t adnak le mediátorként (ezért hívják nonadrenerg-nonkolinergnek őket). Ennek hatására ezek kitágulnak, nő a vérátfolyás és vérrel töltik meg a barlangos testek szinuszoid rendszerét. Nem csupán a térfogat növekedés vezet erekcióhoz, hanem hozzájárul az is, hogy a tág sinusok az elvezető vénákat összenyomják, amihez hozzájárul az ischiocavernosus izom összehúzódása is, s ez tovább csökkenti a vénás elfolyást a crus penis területének összenyomása révén. Következményesen a merev péniszben a nyomás óriásira nő. Fibroelasztikus péniszű fajok (kérődzők, sertés) esetében a barlangos testek tágulása, s így a pénisz térfogat-növekedése sokkal kisebb jelentőségű, bennük viszont a flexura sigmoidea nyúlik meg (S alakú görbület megnyúlása/kiegyenesedése).
HÁGÓMOZGÁSOK A vér magas tesztoszteron koncentrációjának tulajdoníthatóan a hímek agresszívabbak a nőstényeknél (azt feltételezik, hogy ezt a hatást központi idegrendszeri aromatizációt követően ösztradiolként váltja ki). A tesztoszteronnak a libidó kialakításában is fontos szerepe van (aromatizáció). A jellegzetes hím viselkedésformák három nagy csoportba sorolhatók: prekopulatorikus, kopulatorikus és posztkopulatorikus viselkedésformákat különböztetünk meg. A prekopulatorikus csoportba a keresés/udvarlás tartoznak, ami alatt a hím többször mutatja az ún. Flehmen reakciót. A Flehmen-reakció során a női feromonokat szippantja be és juttatja a vomeronasális szerv területére, amelyek a sajátos reakciót azután kiváltják (fej megemelése és oldalra fordítása, felső ajkak felhúzása). Az ivarzó nőstények attraktivitásáért a feromonok mellett pl. a villogtatás, sajátos testtartás – lordosis - és viselkedés (pl. egymásra ugrálás), gyakori vizelés, a hím társaságának keresése, a hím lökdösése + felugrás a hímre, leguggolás, stb. is felelősek. A nőstények a feromonok termelésével, valamint a sajátos/jellegzetes viselkedéssel felhívják magukra a hím figyelmét és stimulálják a hímeket a kopulációra/párosodásra/párzásra (pl. felugranak rájuk). A párosodásra kész nőstények receptívek a hímmel szemben (elfogadják a hím közeledését és hajlandóak párosodni vele), vagyis megállnak neki (lordosis). A prekopulatorikus 49
viselkedés az erekcióban csúcsosodik ki, ami egy vegetatív szabályozás alatt álló komplex reflex folyamat. A kopulatorikus csoport a felugrást, a behatolást és a hágómozgásokat foglalja magában. Ezek mind szomatikus, gerincvelői reflexek. A hágómozgások intenzitása és időtartama állatfajonként változó, de végül egységesen az ejakulációban teljesednek ki. A kérődzők kopulációja gyors, 1-2 másodpercig tart és a bika, ill. kos egyetlen erőteljes lökést követően adja le a spermát. A mén ezzel szemben 0.5-1 percen keresztül végez hágómozgásokat, s ezt követi az ejakuláció. A sertéskan csak a kopuláció kezdeti szakaszában végez intenzív hágómozgásokat, utána azonban megnyugszik, lecsendesedik és az 5-20 percig tartó ejakuláció alat már nem végez hágómozgásokat. A kan kutyák a hosszú ideig tartó kopuláció/párzás első 1-2 percében végeznek hágómozgásokat. A posztkopulatorikus viselkedés lényegében azt jelenti, hogy a lemagzást (ejakulációt) követően a hím állat leszáll a nőstényről. Ebben a szakaszban következik be az ún. refrakter periódus és az „élmény memorizálása”. EJAKULÁCIÓ Az ejakuláció egy szomatikus reflexív, amelyet neuroendokrin folyamatok (oxitocin felszabadulás) előznek meg. Az ejakulációt megelőzik a hágómozgások, amelyek az ejakulációban csúcsosodnak ki. A legtöbb állatfajban a reflexív elindításához szükséges végső ingert az jelenti, hogy a glans penis érintkezik a hüvely falával. Ennek hiányában általában nem jön létre az ejakuláció. Az erekció kialakulása során a környezeti ingerek (látás, szaglás, az előjáték és a hágómozgások alatti taktilis ingerek) hatására a neurohipofízisből oxitocin szabadul fel. Az oxitocin elősegíti a mellékhere farki részében, illetve a járulékos nemi mirigyek állományában lévő simaizomelemek összehúzódását és a spermiumok (mellékhere farki része) ill. az ondóplazma (járulékos hím nemi mirigyek) a húgycsőbe juthatnak. Mindeközben az ingerek összessége olyan intenzívvé válik, hogy agyban található magcsoportok irányításával beindul egy reflexív, ami a gerincvelői központokon keresztül a m. bulbospongiosus és m. urethralis izmok ritmikus összehúzódásához vezet, és amelynek eredményeként bekövetkezik az ejakuláció: a sperma kilövell a péniszből. 50
NEUROENDOKRIN REGULÁCIÓ Alapvető különbség a hím és nőivarú állatok között, hogy amíg a petefészek tüszőiben keletkező androgének lokálisan - nagy hatékonysággal - ösztrogénekké alakulnak, addig a herében termelődő tesztoszteronnak csak kis százaléka válik helyben ösztradiollá. Ennek következményeként a nőstények vérében keringő tesztoszteron koncentrációja kb. egy nagyságrenddel kisebb, mint hímekben. Az androgének pregnenolonból, illetve progeszteronból képződhetnek, s legfontosabb képviselőik a tesztoszteron, a dehidroepiandroszteron (DHEA) és az androsztendion. A tesztoszteron két, nála sokkal hatékonyabb vegyület: a dihidrotesztoszteron (DHT) és az ösztradiol (E2) prekurzora. Nőstényekben a tesztoszteront a petefészek tüszők theca-sejtjei termelik, hímekben pedig az ezekkel analóg Leydig-sejtek, amelyek a here interstíciumában helyezkednek el (a here ún. intertubuláris kompartmentjében/herecsatornák közötti területen). A tüszők theca-sejtjei által előállított tesztoszteront a granulosa sejtekben termelt aromatáz enzim E2-vé alakítja, s ez a hormon jut legnagyobb mennyiségben a keringésbe (ezért alacsonyabb a tesztoszteron szint a nőstényekben). A herében termelődő tesztoszteron átalakításáért a herecsatornácskák lumenét bélelő hámréteg legfontosabb sejtes alkotóelemei, a Sertoli-sejtek a felelősek. Ezek azonban a termelődő hormonnak kis százalékát képesek DHT-vé alakítani, s még sokkal kisebb részét aromatizálják ösztradiollá. Hímekben tehát a keringésbe főként a tesztoszteron jut, s ez a tény radikálisan megváltoztatja a szervezet számos sejtjének működését (hímekben nagyságrendekkel magasabb a tesztoszteron szint a vérben). A fejlődő hím magzatokban a here tesztoszteronja szabadon átjut a véragy-gáton (ellentétben a nőivarúakban domináns ösztradiollal, ami alfa-foetoproteinhez kötődik a vérben, s ez megakadályozza diffúzióját). A hipotalamuszba kerülő tesztoszteron lokálisan E2-vé aromatizálódik és defeminizálja (masculinizálja) a fejlődő GnRH surge centert, ami így érzéketlenné válik az ösztradiol általi pozitív visszacsatolásra. Ennek következménye, hogy a pubertás után a hímek GnRH leadása tónusos és bennük nem alakul ki csúcs (nincs surge center). Nagyjából 2-6 óránként történik GnRH leadás a hipotalamikus idegvégződésekből, ami FSH és LH leadást indukál az adenohipofízisből. Ezek közül az FSH receptorai a Sertolisejteken, az LH receptorai pedig a Leydig-sejteken találhatóak (az FSH célsejtje a Sertoli-sejt, míg az LH-célsejtje a Leydig sejt). LH-hatásra a Leydig-sejtek tesztoszteront termelnek, ami lokálisan az FSH által aktivált Sertoli-sejtekből 51
felszabaduló androgén-kötő proteinhez (ABP) kötődik/kapcsolódik, s így a herében a tesztoszteron koncentráció sokszorosa a vérben mérhető értéknek. Ez a normális spermatogenesis előfeltétele. A tesztoszteron különben a Sertoli-sejtek működése révén DHT-vé és E2-vé is alakulhat, de legnagyobb részt átalakulás nélkül kerül a keringésbe. Meg kell még említeni, hogy a Sertoli-sejtek inhibint is termelnek, ami az adenohipofízisben gátolja az FSH leadását. Ennek tulajdonítható, hogy bár hímekben a GnRH leadás tónusos, a hipofízisből főleg LH szabadul fel ingerlés hatására. A szervezet sejtjeiben a tesztoszteron receptora a számos sejt citoplazmájában megtalálható androgén receptor (AR), ami transzkripciós faktorként működik. Ehhez kötődve a tesztoszteron tulajdonképpen az összes szövet génexpressziós mintázatát befolyásolja. Bizonyos szövetekben, például a járulékos hím nemi mirigyekben, dihidro-tesztoszteronná konvertálódik és ez a vegyület ötször erősebb agonistája az androgén receptornak. Az androgének egyik legfontosabb tulajdonsága, hogy nagymértékben fokozzák az anabolikus folyamatokat, így növelik az izomtömeget, továbbá kapcsolatba hozhatók a hím állatokra jellemző agresszivitással és libidóval. Az idegszövet, a zsírszövet, a csontszövet, a máj, illetve a bőr számos sejtje viszont aromatáz enzimmel rendelkezik, ami a tesztoszteront ösztradiollá alakítja át. Az ösztrogének az ösztrogén receptorokon (ER) keresztül fejtik ki hatásukat. Ilyen átalakuláson alapul a tesztoszteron GnRH szekrécióra gyakorolt negatív visszacsatolása is, ugyanis a hormon a hipotalamuszban E2-vé alakul és ez utóbbinak van hatása a neuronok működésére, akárcsak a nőivarú állatokban. Összefoglalva: a hímekben keringő tesztoszteron célsejttől függően két különböző receptoron is kifejtheti hatását (AR vagy ER), ugyanakkor a nőivarú állatokban nagy mennyíségben jelen lévő ösztrogén célpontja csak az ösztrogén receptor lehet. Emellett eltörpül a nőstények vérében kisebb koncentrációban jelenlévő androgének hatása. Így a hímek és nőstények közti különbségek az androgén és ösztrogén receptorok eltérő mértékű eloszlásán alapulnak.
52
Hormonhatású készítmények a szaporodásbiológiai gyakorlatban A kezelések célja - alapfogalmak I. Ciklus indukció: A cél az, hogy anösztruszos (pl. ellést követő időszakban, ill. pathológiás okok miatt vagy szezonon kívüli) állatokban elindítsuk a ciklikus nemi működést. Ehhez a hipotalamikus GnRH leadást kell módosítani, mert a ciklikus működés hiánya (függetlenül attól, hogy élettani vagy pathológiás acikliáról van-e szó), gyakran a GnRH-szekréció hiányával van összefüggésben. Tartós gesztagén adagolás által kiváltott rebound hatás szinte minden fajban használható. Ezen kívül tehénben még GnRH és PGF2α adásán alapuló kombinált protokollokat, illetve szezonális állatokban a melatonin implantátum (kiskérődző) vagy fényprogram (ló, kiskérődző) használata jöhet még szóba. //A gyakorlatban az ivarzásindukciót gyakran összemossák az ivarzásszinkronizációval!// Az ösztrusz indukciója: Ennek elsősorban kutyában van jelentősége, ahol a ciklus része egy igen hosszú (akár 4-6 hónapos) anösztrusz stádium. A cél ennek lerövidítése, hogy mielőbb újra tüzeljen a szuka. Ezt a 1) GnRH-szint emelésével próbálhatjuk meg elérni (rövid időre behelyezett GnRH-analóg implantátum) vagy a 2) GnRH leadását gátló PRL blokkolása révén (cabergolinnal ill. bromokriptinnel) vagy 3) az FSH és LH hatásának mimikálásával (eCG+hCG). Ez utóbbi kombinációt használják tenyészsüldők és választás utáni kocák ivarzásának indukciójára is (PG-600). Ösztrusz szuppressziója: A cél az, hogy a ciklikus nőstény ivarzását megelőzzük, elnyomjuk. Ennek főleg kedvtelésből tartott állatok esetében (kutya, macska) illetve pl. rendezvényre vitt kancák esetében van jelentősége (főleg gesztagének tartós adagolása – GnRH neuronok blokkolása révén - vagy hosszú hatású GnRHanalóg implantátum jöhet szóba – ez utóbbi deszenzibilizálja az FSH és LH termelő sejteket.). Macskákban álvemhességet is indukálhatunk, mert ez is gátolja a további ivarzást. A kezelések célja - alapfogalmak II.
53
A ciklus szinkronizálása: Ciklusban ivarzó nőstények nemi ciklusát szeretnénk összehangolni, hogy egy időben történjen meg az ivarzás (ösztrusz – ovuláció). Leggyakrabban munkaszervezési okokból vagy embriótranszfer program részeként kerül rá sor (gesztagének tartós adagolása vagy tehénnél GnRH és PGF2α-tartalmú készítmények használatán alapuló protokollok jöhetnek szóba). //A gyakorlatban sokszor összekeverik/összemossák a ciklus indukcióval!// Szuperovuláció kiváltása, ovulációs ráta növelése: Főleg monotocous fajok esetében van jelentősége, elsősorban az embriótranszfer programok részeként. Célja, hogy ne csak egy, hanem több follikulus váljon dominánssá és ovulálhasson. Az FSH-szint fokozása a cél, hiszen így több szelektált tüsző maradhat életben és válhat dominánssá, majd ovulálhat. Szuperovulációra természetes (sertés, juh agyvelőből kivont) vagy mesterséges FSH-t (rekombináns technikával előállított hFSH; nagyon drága) vagy FSH-szerű hatással bíró PMSG-t (eCG-t) alkalmaznak. Ovuláció indukciója: A cél az, hogy nagy domináns tüszők ill. anovulációs ciszták ovulációját kiváltsuk. Ezt csak azokban a fajokban alkalmazzák rutinszerűen, amelyekben a petefészekképletek jól vizsgálhatók (kanca, tehén), így tudjuk, hogy van-e kellően nagy domináns follikulus ill. ciszta a petefészken, vagy sem. Egy LHcsúcsot kell produkálni, hogy a tüsző/ciszta fala felrepedhessen (ovuláció), azonban az LH rövid felezési ideje miatt közvetlenül LH-t nem szokás adni. Helyette GnRH-hatású injekciót alkalmaznak (a GnRH kezelés során egyszerre nagy adagban visszük be a hormont, mintha nagy pulzusfrekvenciával ürült volna a hipotalamuszból és nagy frekvencia/magas szint mellett főleg az LH termelődését váltja ki a hipofízisben) vagy LH-szerű hatással bíró hCG jöhet még szóba. A ciklus lerövidítése luteolízissel: Azokban a fajokban (ló, marha), amelyekben a petefészekképletek rutinszerűen vizsgálhatók (ismerjük, hogy mikor van sárgatest a petefészkeken), a ciklus lerövidítése céljából (minél korábban újból ivarzása legyen az állatnak) PGF2α kezelést alkalmazhatunk (természetes v. szintetikus), amivel luteolízist indukálunk. A sárgatest azonban nem érzékeny (refrakter) a kezelésre a luteális fázis első 4-5 ill. utolsó 2-3 napjában! A kezelések célja - alapfogalmak III.
54
A nem kívánt vemhesség megszakítása: szinte csak kutyában, ill. lóban jön szóba. Szukák esetében leggyakrabban PGF2α-val indukálnak luteolízist, ami a vemhességet terminálja, de a prolaktin-gátlók (bromokriptin, cabergolin) ill. a progeszteron-receptor blokkoló aglepriszton is lehet alternatíva. Kutyában régebben a nidáció gátlására ösztrogén-származékokat alkalmaztak, de a pyometra fokozott kockázata miatt ma már ellenjavallt. Kancában az ikervemhesség megszakítása (amennyiben nem tudunk megszabadulni csak az egyik magzattól) szintén PGF2α-val történhet. Egyéb állatfajokban, ha valamilyen okból kifolyólag mégis meg kell szakítani a vemhességet, azt kell mérlegelni, hogy a vemhesség adott időszakában (és az adott fajban!) a sárgatest felel-e elsősorban a progeszteron hormon termelésért. Ha igen, akkor PGF2α–val luteolizist indíthatunk el és megszakíthatjuk a vemhességet. Ha viszont már inkább a placenta termeli a P4-t, akkor glükokortikoidokat kell/lehet alkalmazni. Ellés indukciója: Sertésben a vemhesség teljes ideje alatt a corpus luteum termeli a P4-t, ami a zavartalan vemhességhez szükséges (corpus luteum dependens). Ezért PGF2α-val meg lehet indítani az ellést (ennek az ún. „programozott elletésnél” van jelentősége, de csak a vemhesség 111. napját követően, mert ekkorra lesznek teljesen fejlettek a malacok). Tehénben viszont a vemhesség végén már a placenta felel elsősorban a progeszteron termelésért (corpus luteum independens), ezért leggyakrabban glükokortikoidokat használunk, amit általában PGF2α-val kombinálhatunk (ez pl. akkor lehet indokolt, ha az anyaállatot vágóba kellene küldeni, de a borjút meg szeretnék megmenteni).
A kezelések célja - alapfogalmak IV.
Fájásgyengeség kezelése: Bármely állatfajban, ha előfordul, leggyakrabban oxitocin adásával próbáljuk serkenteni/erősíteni a méhkontrakciókat. Hosszantartó vajúdás miatt kialakuló secunder fájásgyengeség esetén viszont előfordulhat, hogy a vér lecsökkent Ca2+ szintje miatt az oxitocin önmagában nem vált ki teljes hatást, ezért Ca2+ tartalmú infúzió adásával kiegészíthető a kezelés. Az oxitocint alkalmazhatjuk szarvasmarhában a magzatburkok visszamaradásakor azok eltávozásának elősegítésére/felgyorsítására. Az oxitocin mellett az ilyen 55
esetek kezelésére a prosztaglandin is használható. E két szer jó hatással van a méh involúciójára, mivel a kontrakciók fokozása révén segítik a baktériumokban rendkívül gazdag lochia (ellés utáni méhváladék) eltávolítását. Szukában az involúció támogatására ergot alkaloidok is szóba jöhetnek, amelyek ugyancsak méhösszehúzók ill. érösszehúzó hatásúak is. Álvemhesség kezelése: a probléma gyakran merül fel nem vemhesült szukákban, tulajdonképpen egy élettani jelenség, ami viselkedésbeli változásokkal és a tejelválasztás megindulásával jár. Az említett folyamatok hátterében a PRL áll. A megoldásnál a cél a PRL gátlása. Ez két úton valósítható meg: 1) a prolaktin szekréciót gátló hipotalamikus inhibitor faktor alkalmazása, a dopamin hatását erősítjük fel dopamin agonistákkal (bromokripitin, cabergolin), 2) a PRL leadását serkentő szerotonint blokkoljuk ennek antagonistájával (metergolin). Főbb indikációk hatóanyag-csoportonként I. GnRH és analógjai Kancában és tehénben egyszeri injekcióját ovuláció indukcióra (LH csúcsot, ill. lóban az LH-platót váltja ki) használják. Emellett nagyon fontos szerepet játszik speciális szinkronizációs protokollokban szarvasmarha esetében (pl. Ovsynch, Cosynch, Resynch), ahol prosztaglandinnal kombinálva adják. A hatás időtartamától függően tüzelést indukálhat (rövid ideig van bent az implantátum), vagy azt gátolhatja (hosszú ideig van bent az implantátum). Gonadotropinok Az LH-t rövid felezési ideje miatt a gyakorlatban nem használják. Az FSH-t, bár szintén néhány óra a felezési ideje, kérődzőkben szuperovulációra alkalmazzák. Ez utóbbi hatás kiváltható PMSG-vel (eCG-vel) is. A hCG az LH helyettesítőjeként ovuláció indukcióra (vagy ehhez hasonlóan anovulációs ciszták kezelésére/repesztésére) használható tehénben vagy kancában.
56
Az eCG+hCG kombináció kiemelten fontos a sertésnél, ahol a tenyészsüldők ill. választott kocák esetében ciklus indukcióra használják. Ugyanez szukában az anösztrusz alatt adva tüzelést indukálhat. Főbb indikációk hatóanyag-csoportonként II. Szexuálszteroidok Gesztagén hatású készítmények: Kérődzőkben, sertésben és lóban ivarzás-szinkronizálásra és a ciklus indukciójára használhatók, úgy, hogy a kezelés időtartama tág határok között változhat (10-18 nap között általában). Az adminisztráció módja (per os, implantátum, hüvelybe helyezhető eszköz) fajonként eltérő! A hatásmechanizmus lényege, hogy a kb. 2 hétig adott P4-el a luteális fázist szimuláljuk, ezalatt a P4 blokkolja a GnRH leadást, ami azonban a gesztagén hatás elmúltával újraindul („rebound hatás”). Kutyában és kancában a tüzelés szuppressziójára használható (mert a P4 elnyomja a GnRH leadást). Androgén hatású készítmények: Kanspray komponenseként illetve androgenizált nőstények (keresőállatok, amiket ivarzó társaik detektálására alkalmaznak) előállítására használhatók. Ösztrogén tartalmú készítmények: Manapság az EU-ban szinte semmilyen formában nem adnak E2-tartalmú hormonkészítményeket, de régen használták pl. hüvelybe helyezhető eszközök részeként ivarzás-szinkronizálásra, ill. kutyában nem kívánt vemhesség megszakítására (nidáció gátlás). De az EU-ban élelmiszer termelő állatoknak ma már nem adható, kutyában pedig nem javasolt az alkalmazása, mert fokozza a pyometra kialakulásának kockázatát. Főbb indikációk hatóanyag-csoportonként III. Prosztaglandin-származékok
57
A PGF2α-t luteolízisre (a ciklus lerövidítésére vagy lutein ciszták kezelésére) használják tehénben és kancában. Corpus luteum dependens fajokban (vagy legalábbis a vemhesség sárgatesttől függő szakaszában) a vemhesség megszakítására, ellés indukciójára is alkalmas. Szarvasmarhában szinkronizációs protokollok részeként gyakran használják önmagában vagy GnRH-hatású készítményekkel kombinálva. A PGF2α uterotonikumként jó hatással van az involúcióra is. Dopamin agonisták, szerotonin antagonisták Kutyában az álvemhesség kezelésére használják a bromokriptint, a cabergolint és a metergolint, de a luteotróp faktorként ható PRL-gátlása révén szóba jöhetnek nem kívánt vemhesség megszakítására is kutyában. A cabergolinnal meg lehet próbálni kimozdítani a szukát az anösztruszból és tüzelést indukálni. Oxitocin Uterotonikumként fájásgyengeség kezelésére, ill. szarvasmarhában a magzatburok-visszamaradás megszűntetésére adható. Melatonin Elsősorban a juh ágazatban van jelentősége a melatonin tartalmú implantátumoknak, melyek szezonon kívüli időszakban indukálják az anyaállatok ciklikus működését. Nőivarú házi emlősök szaporodás-élettanára vonatkozó alapadatok
Ahol nincs külön említve, ott a proösztrusz és metösztrusz is kb. 1-3 nap hosszú!
Szarvasmarha (a ciklus hossza 21 nap) 58
•
Pubertás ideje: ~ 11 hó (de fajtától is függ); tenyésztésbe vétele viszont csak kb. 15 hónaposan (~24 hónaposan legyen az első ellése)
• • •
Ciklikusság: Poliösztruszos
•
Embrió bejutása az uterusba: kb. 5 nappal a termékenyülés (0. nap) után (ezért az embriókinyerést a 7. napon végzik /az első termékenyítés napja a 0. nap/!) Vemhesség anyai felismerése: trophoblast által termelt bovine IFNτ (vemh. 15-16. napján)
•
Ösztrusz hossza: ~ 15 óra Ovuláció időpontja: ~12-16 órával az ösztrusz vége után (!) – termékenyítés az am/pm szabály alapján!
•
Placenta típusa: placenta cotyledonaria (anatómiailag), placenta synepitheliochorialis (szövettanilag)
•
Vemhesség hormonális háttere: Corpus luteum independens (~200. naptól veszi át teljesen a progeszteron termelést a placenta)
• •
Vemhesség hossza: ~285 nap
•
Ellés utáni újra ciklusba lendülés időpontja: Élettanilag a szarvasmarhának van bizonyos fokú laktációs anösztrusza. De ez csak húsmarhában jelentkezik, mert a szopások gyakoriságával van összefüggésben! (A tejelő tehén napi 2x-i fejése nem blokkolja a petefészek működését.) Tejelő tehénben (ha nincs kóros állapot): ~21. nap, Húsmarha: ~50-60. nap Involúció hossza: Tejelő tehénben ~42 nap; Húsmarhában ~30 nap, mert a gyakori szopások fokozzák az oxitocin leadást, ami segíti az involúciót.
Juh, Kecske (a ciklus hossza 17 nap juhban, 21 nap kecskében)
•
Pubertás ideje: kb. 7 hónapos korban
•
Ciklikusság: Szezonálisan poliösztruszos (rövid nappalos)
•
Ösztrusz hossza: Átlagosan 30 óra (kecskében pár órával hosszabb)
•
Ovuláció időpontja: Az ösztrusz utolsó óráiban (kb. 24-30. órában)
59
•
Embrió bejutása az uterusba: kb. 3-4 nappal a termékenyülés (0. nap) után
•
Vemhesség anyai felismerése: A trophoblast által termelt ovine ill. caprine IFNτ (a vemhesség 13-14. napján)
•
Placenta típusa: placenta cotyledonaria (anatómiailag), placenta synepitheliochorialis (szövettanilag)
•
Vemhesség hormonális háttere: a juh corpus luteum independens (kb. 50. naptól átveszi a placenta a P4 termelés szerepét), kecskében végig corpus luteum dependens. •
Vemhesség hossza: kb. 150 nap
•
Ellés utáni újra ciklusba lendülés időpontja: Az évszaknak megfelelően a következő szezonban.
•
Involúció hossza: Juhban kb. 30 nap, kecskében kicsit több, inkább 40 nap körül van. Sertés (a ciklus hossza 21 nap)
•
Pubertás ideje: 5-6 hónapos korban, de tenyésztésbe vétel csak a 2-3. ciklusban (~210 napos kor), mivel az ovulációs ráta a 3. ciklusra éri el a maximumát
•
Ciklikusság: Poliösztruszos
•
Ösztrusz hossza: Átlagosan 50 óra
•
Ovuláció időpontja: Az ösztrusz utolsó harmadában (36-44. óra)
•
Embrió bejutása az uterusba: A 2-3. napon a fertilizációt (0. nap) követően
•
Vemhesség anyai felismerése: Az embriók által termelt E2 (a vemhesség 1112. napján). Méhszarvanként legalább 2-2 embrió kell a vemhesség fennmaradásához.
•
Placenta típusa: Placenta diffusa (anatómiailag), placenta epitheliochorialis (szövettanilag)
•
Vemhesség hormonális háttere: Végig corpus luteum dependens 60
•
Vemhesség hossza: 114 nap
•
Ellés utáni újra ciklusba lendülés időpontja: Általában a választás után 4-10 nappal.
•
Involúció hossza: ~28 nap Ló (a ciklus hossza 21 nap)
•
Pubertás ideje: Nagyon változó lehet, de kb. 1-1,5 éves korban.
•
Ciklikusság: Szezonálisan poliösztruszos (hosszú nappalos)
•
Ösztrusz hossza: átlagosan 5-7 nap
•
Ovuláció időpontja: 1-2 nappal a sárlás vége előtt
•
Embrió lejutása az uterusba: Csak kb. az 5. napon! Ez fontos, mert a kancában gyakran fordul elő a párzás után 1-2 napig tartó endometritis (mivel a mén pénisze behatol a cervixbe és sok baktériumot visz be). Az endometritis rendszerint élettani körülmények között viszonylag gyorsan szokott oldódni, így mire az embrió az 5. napon az uterusba ér általában megszűnik.
•
Vemhesség anyai felismerése: Nem egyértelmű, hogy milyen faktor szükséges hozzá (40 kD-os fehérje? E2?), de az embriónak a termékenyülés utáni 12-14. nap közötti intenzív intrauterin migrációja fontos szerepet tölt be benne.
•
Placenta típusa: Placenta diffusa = microcotyledonaria (anatómiailag), placenta epitheliochorialis (szövettanilag)
•
Vemhesség hormonális háttere: Corpus luteum independens (kb. a 70. naptól fokozatosan átveszi a placenta a P4 termelést)
•
Vemhesség hossza: Átlagosan 330 nap (de nagyon széles sávban változhat fiziológiás körülmények között is. Akár 310 vagy 360 nap is lehet!)
•
Ellés utáni újra ciklusba lendülés időpontja: 7-10 nappal az ellés után (csikósárlás!)
•
Involúció hossza: ~21 nap 61
Kutya (speciális a ciklusa!)
•
Pubertás ideje: Nagyban függ a fajtától, de a középérték kb. 1 év.
•
Ciklikusság: Általában kétévente kb. 3-szor tüzel, főleg (de nem kizárólag) a tavaszi időszakban. A proösztrusz átlagosan 9 napig tart. Ösztrusz: 9 nap. A metösztruszt nem különítjük el a diösztrusztól, hanem a kettőt együtt hívjuk metösztrusznak/diösztrusznak (egyesek diösztrusznaknak hívják). Ez a hormonális profilok alapján kb. 90 napig tart, ami után egy 2-6 hónapig tartó anösztrusz szakasz következik, mielőtt a következő tüzelés elkezdődne.
•
Ösztrusz hossza: Átlagosan 9 nap. A tüzelés szó a proösztruszt és ösztruszt együtt jelenti.
•
Ovuláció időpontja: Nagyon változónak tűnhet, ha csak a külső tüneteket nézzük, de eléggé standard, hogy az LH-csúcs után 2-3 nappal (ez ugyan praktikusan nem mérhető, a következményes P4 emelkedés viszont igen, s így az ovuláció előre jelezhető!)
•
Vemhesség anyai felismerése: Nem szükséges! A vemhes és nem vemhes ciklus (ez utóbbi esetében a metösztrusz/diösztrusz) hormonális profilja megegyezik (magas P4 szint)!
•
Placenta Placenta
• •
Vemhesség hormonális háttere: Végig corpus luteum dependens.
•
Ellés utáni újra ciklusba lendülés időpontja: Az anösztrusz szakaszt követően (2-6 hónap).
•
Involúció hossza: ~90 nap kell a teljes involúcióhoz.
típusa: Placenta zonaria endotheliochorialis (szövettanilag)
(anatómiailag),
Vemhesség hossza: Ha a fedezéstől számítjuk, akkor nagyon változó lehet, de az LH csúcstól számítva elég konstans, 64-66 nap.
Macska (indukált ovuláció!)
•
Pubertás ideje: Átlagosan 8 hónapos korban.
• Ciklikusság: Poliösztrusz, azonban a legtöbb macskában egy tavaszi-nyári csúccsal (ahogy a nappalok hosszabbodnak). A proösztrusz 1-4 nap hosszú, ezt követi az ösztrusz (nagyon változó, 3-10 nap), majd párzás hiányában egy 62
1-2 hétig tartó inaktív időszak (interösztrusz = posztösztrusz). Nincs metösztrusz és diösztrusz párzás hiányában, mert nem képződik sárgatest, hiszen indukált ovulátor a macska! A fentiek alapján egy ciklus átlagosan 17 napig tart és egészen addig ismétlődik, míg nincs párzás, vagy a szezon véget nem ér, mert novembertől februárig jellemzően 3-4 hónapig tartó anösztrusz van.
• •
Ösztrusz hossza: Nagyon változó, 3-10 nap.
•
Vemhesség anyai felismerése: Nem szükséges, mert ovuláció, s így sárgatest csak párzást követően lesz és ez fenn is marad a vemhesség végéig.
•
Placenta típusa: Placenta zonaria endotheliochorialis (szövettanilag)
•
Vemhesség hormonális háttere: Végig corpus luteum dependens. De érdekes, hogy a kutyával ellentétben, ahol az álvemhesség kb. olyan hosszú mint a vemhesség, macskában ez csak nagyjából a vemhesség hosszának felével megegyező ideig tart (pl. steril kandúrral párzást követően) és nem jár olyan kifejezett tünetekkel.
•
Vemhesség hossza: Átlagosan 63 nap.
•
Ellés utáni újra ciklusba lendülés időpontja: Átlagosan kb. 30 nappal az ellés után. (A szoptatás nem gátolja a ciklusba lendülést)
•
Involúció hossza: ~30 nap
Ovuláció időpontja: Csak többszöri, ismételt kopuláció hatására történik meg!
(anatómiailag),
63
placenta
A ló szaporodása Összefoglalás (21 napos a ciklusa)
• • • • •
Pubertás ideje: Változó, kb. 1-1,5 éves korban.
•
Vemhesség anyai felismerése: Nem egyértelmű, hogy milyen faktor szükséges hozzá (40kD-os fehérje? E2?), de az embrió intenzív intrauterin migrációjának (a 12-14. nap között) fontos szerepe van.
•
Placenta típusa: Placenta diffusa = microcotyledonaria (anatómiailag), placenta epitheliochorialis (szövettanilag)
•
Vemhesség hormonális háttere: Corpus luteum independens - a lutealis P4 vemhesség-fenntartó szerepét kb. a 70. naptól fokozatosan, a vemhesség második felében teljesen átveszi a foetoplacentaris egység
•
Vemhesség hossza: Átlagosan 330 nap (széles sávban változhat fiziológiás körülmények között is, akár 310 vagy 360 nap is lehet!)
•
Ellés utáni újra ciklusba lendülés időpontja: 5-15 nappal az ellés után (csikósárlás!)
•
Involúció hossza: ~21 nap
Ciklikusság: Szezonálisan poliösztruszos (hosszú nappalos) Ösztrusz (sárlás) hossza: átlagosan 5-7 nap (szélső értékek: 2-11 nap) Ovuláció időpontja: 1-2 nappal a sárlás vége előtt Embriónak az uterusba érkezése: Csak kb. az 5. napon! Ez fontos, mert a kancánál gyakran előfordul, hogy a párzás/MT után 1-2 napig endometritis alakul ki. Ez élettani körülmények között általában spontán és hamar rendeződik, így mire az 5. napon az embrió az uterusba érkezik megszűnik.
A kanca nemi ciklusa Hosszú nappalos, szezonálisan poliösztruszos állatfaj. Az északi féltekén márciusáprilistól szeptemberig sárlanak a kancák, a déli féltekén 6 hónappal elcsúsztatva (a mén spermatermelése is ilyenkor maximális). A kora őszi, illetve kora tavaszi periódus úgynevezett szezonátmeneti időszak, ilyenkor fiziológiás a rendszertelen 64
ivarzás, ami változó hosszúságú sárlásban és ezen belül változó időpontban bekövetkező ovulációkban nyilvánul meg. A tüszőnövekedés szarvasmarhához hasonlóan bizonyítottan hullámszerű, a késői diösztruszban induló ún. major hullám vezet majd a következő sárláshoz és ovulációhoz. Ezt megelőzően általában egy minor hullám van a korai diösztruszban, mely még nem eredményez domináns tüszőt. A korai diösztruszban elinduló major hullám egyes kancáknál ún. diösztrális ovulációhoz vezethet! Az ösztrusz átlagos hossza 5-7 nap, de sok mindentől függ és a szezonátmeneti időszakban jellemzően hosszabb (7-10 nap), mint a nyáron (4-5 nap). Az ovuláció elég standard módon az ösztrusz vége előtt 1-2 nappal következik be. A szezonalitás egyik (de nem egyetlen!) mozgatórugója a nappalok hosszabodása (fotoperiódus), de kisebb részben az emelkedő hőmérséklet és a tápláltsági állapot (bővebb takarmány) is szerepet játszik. Az anösztruszból szezonba történő fokozatos átmenetet a melatonin szint csökkenése, és az ennek hatására bekövetkező nagyobb frekvenciájú GnRH leadás jellemzi. Gyakran előfordul, hogy a szezonátmenet első 1-2 domináns tüszője (amelyek szteroid-termelése sem kielégítő) az elégtelen LH-emelkedés miatt nem képes ovulálni (anovulációs follikulus). Emiatt az előzőleg közel fél évig anösztruszos kancák első 1-2 szezonbeli ciklusa szabálytalan. Bizonyított, hogy az ivarzási tünetek jelentkezését elősegíti, ha az agyi központokat az ösztrogénhatást megelőzően a korábbi ciklusból származó progeszteron érzékenyíti (priming), ami itt még nyilván nem történhetett meg, következésképpen a szezonátmenetben a csendes ivarzás is gyakoribb. A téli anösztrusz során egyébként nincsenek igazi tüszőnövekedési hullámok, ilyenkor a petefészek kisméretű és képletszegény (a méh tónusa minimális). A szezonátmenet idején eleinte megjelennek kisebb, rektálisan már tapintható follikulusok, amelyek eleinte atretizálnak, később egy-egy eljut domináns stádiumig, azonban (bár 70%-uk már sárlik) a kancák fele márciusban még nem ovulál. Az ivarzás ellenőrzése Az optimális tenyésztés-szervezés szempontjából fontos tudni, mikor sárlik a kanca. Ehhez folyamatos monitorozásra és az eredmények pontos feljegyzésére van szükség, ami a ciklus gyógyszeres szabályozásának is előfeltétele.
65
A ciklus monitorozása nem csak a szűz kancáknál fontos, akik életükben először lépnek be a szezonátmeneti időszakba és kezdenek sárlani (vagy idősebbeknél, akiket csak most veszünk tenyésztésbe), hanem az ellett kancáknál is! Ugyanis a kanca az ellést követő 10 napon belül újra ciklusba lendül, amit csikósárlásnak hívunk. Mivel a tenyészkancákat mielőbb vemhesíteni akarjuk, a csikósárlás várható idején már fontos a monitorozás. A csikósárlás egyébként fertilis ivarzás, amiből lehet utód. Mindazonáltal, ha ultrahang vizsgálattal nagyobb mennyiségű folyadék látható a méhben és endometritis feltételezhető bármi okból (bennmaradt magzatburok darabok, involúciós zavar, stb.), akkor a csikósárláskor nem tanácsos fedeztetni/termékenyíteni, inkább majd a következő sárláskor. (a csikósárlás és az involúció kapcsolata később még szóba kerül). A kanca ciklus-vizsgálatához az alábbi módszerek állnak rendelkezésre:
1.
Próbáltatás naponta vagy kétnaponta (a sárló kanca elfogadja a mén közeledését, farkát felemeli, villogtat, vizeletet ürít, míg a nem sárló agresszíven fogadja a mén közeledését). A szezonátmeneti időben, ill. az ovulációtól még távolabb a reakció kevésbé intenzív, emellett a sárló kanca sem annyira toleráns, amikor csikója van! Előfordulhat az is, hogy egyes anösztruszos kancák is pozitívan reagálnak.)
2.
Rektális vizsgálat (az ivarzó kanca cervixe és méhe tónusos; a petefészken kisebb-nagyobb tüszők tapinthatók) - hány ujjnak megfelelő vastagságú a cervix, plusz milyen puhák a tüszők (a tenyér 3 pontjának puhaságához hasonlítva)
3.
Rektális ultrahang vizsgálat (a ló szaporodásbiológiai menedzsment legjobb eszköze, mert a tüszők nagysága pontosan mérhető, és ehhez lehet igazítani az ovulációt indukáló hormonkezeléseket; lásd később) – plusz a méh ödémája is detektálható, ami az ovuláció előrejelzésének egyik tényezője kancában
4.
Progeszteron mérése ELISA-val (eldönthető, hogy diösztruszban vagy sárlás környékén vagyunk)
66
A kanca ciklusának szabályozása
1.
A szezon előbbre hozása
2.
Ovuláció indukciója a termékenyítés/fedeztetés optimalizációjához
3.
A ciklus megrövidítése luteolízissel
4.
Gesztagén tartamkezelés (az ivarzás elnyomása vagy szinkronizációja, ill. a szezonátmeneti rendellenességek kezelése céljából) 1. A szezon előbbre hozása
A lótenyésztésben a természetes szezon előbbre hozása a februári időszakra nagy jelentőségű. Tekintve, hogy a vemhesség 11-12 hónapos, a februárban vemhesülő kancák a következő januárban - februárban fognak elleni. Ennek különösen versenylovak esetében van jelentősége, mivel a januárban és a májusban született csikók ugyanabban a korcsoportban versenyeznek és egyidősnek számítanak. Tehát minden tenyésztő azt szeretné, ha januárban születnének csikói! Fotostimuláció – a szezon előrehozása (az indukció előtti rövid nappalos időszak is szükséges!) Mivel a szezon beindításában a fokozatosan csökkenő melatoninszint nagy szerepet játszik, mesterséges fényprogramokkal utánozni lehet a tavaszi fényviszonyokat. Itt elsősorban nem a megvilágított órák száma fontos, hanem az, hogy mikor van világos! A kancák ún. „fényérzékeny ablaka” a sötétedést követő 10. órában van. Ha a sötétedést követő 10. órában már világos van, azt a tobozmirigy úgy értelmezi, hogy hosszabbodnak a nappalok. Tehát ha kb. december elejétől 8-10 héten keresztül minden nap biztosítunk fényt a kancának a fényérzékeny időszakában, akkor a ciklikus nemi működés már februárban elkezdődhet! A fény intenzitásáról azt szokták mondani, hogy ha el tudunk olvasni egy újságot az istállóban, az elegendő. A gyakorlatban kb. 100 luxos fénnyel napi 16 óra megvilágítást kap a kanca december elejétől kb. 10 hétig, amit az első ovulációt követően is folytatni kell egy darabig. 67
Újabban vannak speciális „szemellenző” fénymaszkok (Equilume), amelyek meghatározott hullámhosszú kék fénnyel ingerlik a kanca egyik szemét a megfelelő időszakban, ugyanis a fotostimulációra a 446-477 nm hullámhosszú fény a leghatékonyabb. 2. Ovuláció indukálása a termékenyítés/ fedeztetés optimalizációjához A kanca sárlása változó hosszúságú, ezért nem tudható előre, hogy mikor fog ovulálni! Viszont a legjobb fogamzási arány akkor érhető el, ha a fedeztetés legkorábban 30 órával az ovuláció előtt, de legkésőbb 12 órával azután történik (friss vagy hűtött spermás termékenyítésnél -12-től +6-ig). Fagyasztott sperma esetén az ovuláció körüli +/- 6 órás intervallumban kell termékenyíteni! Ahol helyben van a kanca és a mén is, ott a biztonság kedvéért 2 naponta lehet fedeztetni az ovulációig, de ez nem mindenütt valósítható meg! Ezért szükség van olyan eszközre, amivel ki lehet váltani a megfelelő méretű praeovulációs tüszők ovulációját! Rendelkezésre álló hormonok: hCG ill. GnRHanalógok (mindkét módszer alkalmazásának előfeltétele a sárló kanca petefészkének folyamatos UH-os monitorozása!)
•
hCG: ha >35 mm-es tüsző van, akkor az iv. beadott hCG átlag 36 óra múlva ovulációt indukál. Bár vannak eltérések, de ehhez már időzíthető akár az egyszeri MT, főleg ha ezután 6 óránként petefészek vizsgálat is történik!
•
GnRH-analóg (deslorelin): injekciós készítmény, s.c. implantátum, illetve újabban pulzatilis adagolást lehetővé tevő minipumpa is létezik. Egyetlen injekció általában nem elég, mivel lónál az ovulációhoz hosszabb LH-plató kiváltása szükséges. Ha a tüsző mérete >30 mm, akkor implantátum behelyezés vagy napi legalább kétszeri injekció után 40-48 órán belül várható az ovuláció. Az MT lehető legpontosabb időzítéséhez a petefészkek 6 óránkénti UH ellenőrzése javasolt az ovulációig.
Kísérletek alapján pulzatilis GnRH minipumpákkal (esetleg fotostimulációval kombinálva) a szezon is előre hozható. Ugyanez igaz, ha hónapokon keresztül napi legalább 3x-i GnRH injekciót adnak, mivel ez a gonadotropin leadást fokozva lassan beindítja a tüszőnövekedést. Azonban ezek a módszerek egyelőre a gyakorlat számára kevésbé elérhetők. 68
3. A ciklus lerövidítése luteolízissel A kanca ovulációját követően fejlődő sárgatest az 5. naptól érzékeny a prosztaglandin luteolitikus hatására. Az indukált luteolízis célja a diösztrusz rövidítése, ezáltal a következő sárlás mielőbbi kiváltása! Általában az im. injekciót követő 3-4. napon kezdődik a sárlás.
•
A csikósárlást követő diösztrusz lerövidítése Problémamentes csikósárlásnál lehet fedeztetni vagy termékenyíteni, azonban a második sárlás általában jobb fertilitást eredményez, főleg ha az első sárláskor a méhben patológás jelek látszanak. Ezért a csikósárlás után gyakran szükséges luteolizist kiváltani. Bár ezt nem feltétlenül lehet kihasználni, de nem akarunk sok időt veszteni!
•
Valamiért nem tudtunk termékenyíteni az előző ovulációkor és le kell rövidítenünk a ciklust
Itt gondot jelenthet a már említett diösztrális ovuláció. Tanulmányok szerint a ciklusok 5%-ában történik diösztrusz idején ovuláció (egy korai major tüszőnövekedési hullámból) és ez okozhatja a prosztaglandin kezelés látszólagos hatástalanságát (mert bár luteolizált, de közben új CL fejlődött!) A PGF2α egyébként a kanca ciklusának szinkronizálására is alkalmas. A szarvasmarhához hasonlóan (bár ott 11 napos időköz van), ~15 napos időközzel adott kétszeri prosztaglandin injekcióval a kancák is szinkronizálhatók pl. embrió átültetéshez. A gyakorlatban azonban a szinkronizálás főleg per os gesztagénnel történik. Feltétlenül megjegyzendő, hogy a prosztaglandinok a beadást követő 15-30 percen belül kifejezett izzadást és enyhe kólikás tüneteket váltanak ki a kancából! Erre a tulajdonost föl kell készíteni, egyébként más teendő nincs, mert a mellékhatások rövidesen maguktól megszűnnek. A mellékhatások jelentkezése legerősebb a természetes prosztaglandin (dinoprost) használata esetén, de a lóra fejlesztettek kevesebb mellékhatással járó analóg származékokat is pl. fluprostenol. 69
4. Gesztagén tartamkezelés (az ivarzás szinkronizációja vagy elnyomása, ill. a szezonátmeneti szabálytalan ciklusok kezelése céljából)
A progeszteron tartalmú, hüvelybe helyezhető (intravaginalis) eszközök, ill. bőr alatti implantátumok nem elterjedtek a lótenyésztésben (főleg mert a PRID, kevésbé a CIDR enyhébb-súlyosabb vaginitist okozhat a kancában)! Helyette a sertéshez hasonlóan etetjük a gesztagéneket, konkrétan az altrenogestet (Regumate equine)! Ez a GnRH pulzusfrekvencia csökkentése révén gátolja az ivarzást, majd az etetés abbahagyását követően a rebound-hatás révén sárlást indukál. Lehetséges alkalmazások:
•
• •
A szezonátmenet rendszertelen ivarzásai és cikluszavarai csökkenthetők 1215 napos altrenogest kezeléssel. A gesztagén etetés utolsó napján PGF2α is adható, hogy az esetleg meglévő CL regressziója beinduljon (luteolizis). Ezt követően 4-5 nap múlva jelentkezik sárlás (ivarzás indukció). MT-hez (értékes ménnel való fedeztetéshez) vagy embrió átültetéshez több kancát egymáshoz, ill. a termékenyítéshez/fedeztetés időpontjához lehet szinkronizálni a fent említett protokoll segítségével. Ha versenyre vagy egyéb rendezvényre viszik a kancát, akkor altrenogest etetésével a sárlás elnyomható és jelentkezése késleltethető. A kanca vemhessége, ellése és involúciója
1.
A vemhesség jellegzetességei
2.
Vemhességi diagnózis
3.
Korai embrionális mortalitás és ikervemhesség
70
Ikervemhesség lehet szink többes ovulációból vagy a egymáshoz képest több n elcsúszott ovulációból (~k diösztrális) is.
4.
Vetélés
5.
Az ellés
6.
Involúció, csikósárlás
1. A vemhesség jellegzetességei Az embriónak a méhbe történő lejutásához min. 5 napra van szükség. Ez különleges, de a többi fajhoz hasonlítva megvan az evolúciós oka. A kancában ugyanis a természetes fedezés és MT is kivétel nélkül enyhe fokú endometritishez vezet (post-mating endometritis). Ez lényegében önmagától gyógyuló fiziológiás jelenségnek tekinthető, ami az embrió méhbe érkezésének idejére már elmúlik (ezért kell ehhez kicsit több idő). A mén péniszéről származó normál baktériumflóra befertőzi a méhet, amihez hozzájárul a spermiumoknak ill. a hígító komponenseinek irritáló hatása. A kedvezőtlen pérakonformáció miatt pneumovaginára hajlamos egyedekben ez a gyulladás perzisztálhat, ami embrionális mortalitáshoz és visszaivarzáshoz vezet. A vemhesség anyai felismeréséhez a lóembrió (mely a párosujjú patásokkal ellentétben hatching után is gömbszerű marad és egy glikoprotein burok – kapszula – veszi körül) intrauterin vándorlása elengedhetetlen a 12-14. nap között, és nincs egyértelműen azonosított specifikus szignál (egy 40kDa-os fehérjéről és/vagy ösztrogénekről többen említést tesznek, de nincs még tisztázva teljesen ez a kérdés). Valószínűbb, hogy az embrió és az endometrium közötti komplex kommunikáció a fontos. Az embriónak a méh minden részébe el kell jutnia, ezért pl. ha (UH-val is látható) endometriális ciszták akadályozzák az embrióvándorlást, akkor a luteolízist az embrió nem tudja meggátolni. Bár a ciklikus sárgatest luteolízisét a 12-13. nap között vándorló embrió megakadályozza, a primer sárgatest progeszteron termelése a 40. napra fokozatosan lecsökken, és a vemhesség fenntartását más mechanizmus veszi át. A fertilizációt követő 17. nap körül az embrió megtapad az endometriumon (fixáció), a tényleges beágyazódás (implantáció) azonban jóval később, az 50-60. nap között történik. Eközben az allantois és a szikhólyag találkozásánál 71
elhelyezkedő övszerű sávból („chorionic girdle”) származó trophoblast sejtek egy csoportja az endometriumba vándorol és kialakítja az ún. endometriális kelyheket. Az endometriális kelyhek a vemhesség 35. napjától kb. a 100-120. napig egy eCG (korábbi nevén PMSG) nevű extrahypophysealis gonadotrop hormont termelnek. Az eCG legnagyobb koncentrációját a 40-70. nap között éri el és a hullámszerű növekedésből származó másodlagos-harmadlagos tüszők granulosa sejtjeinek FSH-receptoraira hatva indukálja azok növekedését, valamint (mert részben az LH-receptorokon is hat) a domináns tüszők ovulációját. Így folyamatosan biztosít posztovulatorikus (járulékos) sárgatesteket, melyek a szokásos módon luteolizisen mennek keresztül, de helyettük mindig újabbak fejlődnek. Az eCG termelődése a 70-120. nap között csökken, de az endometriális kelyhek végleges nekrózisa és leválása csak a 120. nap körül történik meg. Ezután már nincs több járulékos CL fejlődés, viszont ekkortól a foetoplacentaris egység fokozatosan átveszi a vemhességet fenntartó gesztagének termelését. Mind a primer, mind a járulékos sárgatestek a 180. vemhességi nap után teljesen eltűnnek, tehát a vemhesség második fele CL-independens. 2. Vemhességi diagnózis Az üresen maradt állatok mielőbbi felismerése és újra termékenyítése mellett, a korai vemhességi diagnózis másik fontos jelentősége az ikervemhességek felismerése vagy kizárása. A vemhesség megállapítására több módszer létezik.
1.
Visszaivarzás elmaradása vagy non-return rate: a ciklushosszra (19-22 nap) vissza nem ivarzó egyedeket vemhesnek tekintik. Az ivarzási tünetek változó intenzitása, ill. a perzisztáló sárgatestek előfordulása miatt ez a módszer megbízhatatlan, hiszen pl. vemhesek is mutathatnak ivarzási tüneteket és az üres egyedek sem feltétlenül sárlanak vissza időben).
2.
Progeszteron meghatározás vérből (ELISA-val vagy RIA-val). Az ovuláció után 17-22 nappal mért magas (>2ng/ml) szérum progeszteron szint vemhességre utal, de a perzisztáló sárgatestek, ill. a megrövidült ciklus itt is bezavarhatnak!
3.
eCG mérése vérből (ez a vemhesség-specifikus hormon a 40. naptól detektálható). Egyrészt azonban ikervemhesség esetén ez már késő, másrészt pedig magzatvesztés esetén a magas eCG szint és a járulékos sárgatestek fennmaradnak, ami miatt a magzatvesztés felismerése és az újravemhesítés késedelmes lehet.
72
4.
Ösztronszulfát kimutatása plazmából vagy vizeletből: a foetoplacentaris egység termeli, tehát vemhességre specifikus, a vérből a 60. nap után kimutatható, de ekkor még nem elég biztosan, vizeletből viszont csak a 150. nap után. A vizeletből való kimutatás Cuboni-teszt néven ismert. Ma már nem használják, mert túl későn mutatja a vemhességet.
5.
Rektális vizsgálat (tapasztalt vizsgáló legkorábban a 28. nap körül tudja kitapintani az embrióhólyagokat, de biztonsággal csak a 45. nap után lehet, viszont ez is vizsgálótól függ. Mindezek miatt a rektális tapintás önmagában nem elterjedt.)
6.
Transzrektális valós idejű (real time) ultrahang (gyakorlott vizsgáló már a 12-15. naptól tud vemhességet diagnosztizálni. Manapság leggyakrabban ezt használják, mert az ikervemhesség felismeréséhez csak ez megbízható) 3. Korai embrionális mortalitás és ikervemhesség Korai embrionális mortalitás alatt kancában hagyományosan a 40. vemhességi nap előtti embrió-felszívódást értik, a 40-300. vemhességi nap között abortuszról beszélünk. Kancában a korai embrionális mortalitás gyakorisága 5-15% között mozog, leggyakoribb két oka a korai luteális elégtelenség és az ikervemhesség. A korai luteális elégtelenség kancákban aránylag gyakori. Korábban említettük, hogy a vemhesség anyai felismerése dacára a ciklikus sárgatest progeszterontermelése a 40. nap körül már csökken, és a járulékos sárgatestek nélkül a vemhesség nem maradna fenn. Amennyiben a primer sárgatest progeszteron termelése még az endometriális kelyhek kialakulása előtt jelentősen lecsökken, embrionális mortalitás következhet be. A 20-40. nap közötti korai időszak tehát instabil, mivel az embrió megakadályozta ugyan a luteolízist, de nem elégséges a sárgatestet fenntartó luteotróp szignál. Ilyenkor bármilyen szisztémás prosztaglandin felszabadulás (pl. enyhe fokú gyulladásos betegség) luteolizist (a CL regresszióját) indíthatja el. Bár a CL insufficientia tényleges előfordulási gyakorisága nem ismert, gyanú esetén (tapasztalati alapon) szoktak altrenogestet etetni, ezzel támogatva a progeszteron-termelést, amíg az endometriális kelyhek és a járulékos sárgatestek kialakulnak. Az ikervemhesség nem kívánatos a lótenyésztésben, ugyanis nagy százalékban elhal a korai embrionális korban az egyik vagy mindkét embrió, de ha mégis megmaradnak, akkor viszont a kancák többsége elvetél. Ha (ritkán) terminusig kitart a vemhesség, akkor rossz életképességű csikók születnek. 73
Hagyományosan az ultrahangos vemhességi diagnózist már a 15. nap körül elvégzik, ekkor azonban még nem biztos, hogy az ikrek láthatók, ezért a vizsgálatot a 26-27. napon meg kell ismételni! Ugyanakkor lényeges, hogy a 28-30. nap (de legkésőbb a 35. nap) előtt megszabaduljunk az egyik (vagy ha másképp nem megy, mindkét) vehemtől, manuális lezúzással vagy prosztaglandinnal! Az endometriális kelyhek a 35. nap körüli kialakulása után az eCG újabb és újabb járulékos sárgatesteket indukál, amelyek között mindig lesz refrakter (a kialakulását követő első 5 napban), ezért nem lehet már prosztaglandinnal hatásosan luteolizist kiváltani! Ha külön méhszarvban vannak az embriók, akkor az egyik manuálisan lezúzható, de ezt a 28. nap előtt kell végezni, hogy ne vezessen a másik elhalásához. Ha nem tudunk úgy megszabadulni az egyiktől, hogy a másikat ne bántanánk, akkor pedig a 35. nap előtt adott PGF2α injekcióval a ciklikus sárgatest luteolízisét indukáljuk, még mielőtt a járulékos sárgatestek elkezdenének kialakulni (ilyenkor mindkét vehem elvész, és a kancát újra kell fedeztetni/MT). Az ikervemhesség megszüntetése a 35. nap előtt lehetővé teszi, hogy a kanca az embrióvesztés után hamar vissza tudjon sárlani. Az endometriális kelyhek kialakulása után ugyanis azok sorvadásáig (~100-120. nap) biztosan nem lesz újra sárlás (tehát csak a szezon végén, vagy ha késői ciklusból lett az ikervehem, akkor lehet, hogy csak jövőre). 4. Vetélés A vemhes kancákat ajánlott tetanusz toxoiddal vakcinázni, ugyanis a lófélék igen érzékenyek a tetanusztoxinra és ez potenciális veszély egy nehézellésnél, puerperális metritisnél, méhelőesésnél, stb.) Legfontosabb nem fertőző okok:
• • •
Nem diagnosztizált és így nem megszűntetett ikervemhesség
•
Stressz miatti placentaleválás
Méhtest vemhesség (de egyes kancák kihordják) Köldökzsinór csavarodás (normális vemhességben is előfordulhat, de csak akkor okoz bizonyítottan vetélést, ha a köldökzsinór fala ödémás, vérzéses és a benne lévő erek trombotizáltak)
74
•
Csenkeszfélék etetése (mert ezeken lehet toxikus anyagot termelő egy gombafaj!)
Legfontosabb fertőző okok:
•
EHV-1 fertőzés (általában nem társul a rhinopneumonitises tünetekkel és az utolsó trimeszterben vetél) – a vemhes kancákat az 5., 7. és 9. hónapban vakcinázni kell!
•
Vírusos arteritis (általában néhány nappal-héttel a fertőzés klinikai tünetei után vetél el) – legjobb védekezés, ha nem fedeztetnek szeropozitív ménnel! Vakcina van, de csak még nem vemheseknek adható, viszont nem marker vakcina, így a vakcinázott állat szerológiailag nem különíthető el a fertőzöttektől.
•
Potomac láz (Neorickettsia risticii) ill. Leptospirosis, esetleg Brucellosis vezethet vetéléshez
•
Bakteriális (Streptococcusok, Salmonella, Pseudomonas, E. coli, Klebsiella…) vagy gombás (Aspergillus, Mucor…stb) placentitis és következményes placentaleválás (erre utal, ha a péranyílásból előtüremkedik a sötétvörös színű chorioallantois) miatti vetélés általában ascendáló fertőzés eredménye, amire egy rossz pérakonformáció és pneumovagina hajlamosíthat, ezért ezt Caslick-plasztikával meg kell előzni (de akkor az ellés előtt 2 héttel episiotomia!)! A diagnózishoz a kórokozót ki kell tenyészteni/izolálni, vagy PCR-el kimutatni a vetélt magzati szövetekből. 5. Az ellés A kanca vemhességének átlagos hossza ~335 nap. A 300. nap előtt vetélésről, a 360. nap után pedig túlhordásról beszélünk. A két határérték között azonban fiziológiásan nagy szóródás figyelhető meg a kancák között. Ha kórelőzményi adatok alapján a kanca ellési komplikációkra hajlamos, mindenképpen ajánlott felügyelni az ellését, amihez viszont szükséges tudni, mikorra várható. Elvileg egy majdnem 2 hónapos intervallumon belül ez bármikor bekövetkezhet. Az ellés előrejelzésének nem feltétlenül a legmegbízhatóbb módja a tejmirigy fejlődése és a kolosztrum elválasztás megindulása. A tőgyszekrétum elektrolit koncentrációjának változása viszont elég jól jelzi a közelgő ellést. Különféle tesztekkel ugyanis az ellés 1-4 napos pontossággal (teszttől függően) előre jelezhető a kancatej emelkedő kalcium koncentrációja alapján! Másik lehetőség, 75
hogy egy digitális eszközt rögzítenek a péranyílásba, ami a szülőút feltágulásakor sms-t küld. Elvi lehetőség van arra is, hogy a legalább 330 napos vemhes kanca ellését indukáljuk, ha már kitőgyelt, beindult a kolosztrum elválasztása, a medencei szalagok és a cervix fellazult és a tőgyszekrétum kalcium koncentrációja kellően magas. Vagyis amikor már magától is hamarosan megellik. Ennek az az értelme, hogy az ellés ne éjszaka, hanem napközben legyen, és szükség esetén legyen kéznél megfelelő segítség. A glükokortikoidok nem működnek jól, az oxitocin igen (de túlterheli az anyát az erős kontrakciókkal), viszont optimális megoldás a kevés mellékhatású szintetikus prosztaglandin-származékok adása (esetleg kisebb mennyiségű oxitocinnal kombinálva). Az ellés első (előkészítő) szakaszában (max 3-4, de lehet, hogy csak fél óra) folyik el a magzatvíz és ezzel kezdődik a második (kitolási) szakasz, ami a fehér színű amnion megjelenésével jár a péranyílásban (a csikó magzatok az amnionnal borítottan születnek). A csikónak a magzatvíz elfolyását követő fél órán belül meg kell születnie. Nem jó, ha sötétvörös hólyag (chorioallantois) jelenik meg a péranyílásban a fehér amnion helyett, aminek fel kellene repednie, hogy elfolyjon a magzatvíz. A tünet korai placenta leválásra utal és azonnal fel kell szakítani manuálisan a chorioallantoist. Az ellés 3. szakaszában eltávoznak a magzatburkok, aminek 1-2 órán belül meg kell történnie. Ha 3 órán belül nem megy el, akkor szoktak adni fél óránként oxitocint, hogy segítsék az eltávozást.
6. Involúció, csikósárlás A méh involúciója ~21 napot vesz igénybe. A legtöbb kanca viszont már az ellést követő 10 (5-15) napon belül újra sárlik, ez a csikósárlás, ami termékeny, bár a 2. ivarzás jobb fogamzási arányt eredményez. Eseménytelen ellés és zavartalan involúció után (nem volt nehézellés, nincs magzatburok visszamaradás, és ultrahangos vizsgálattal már csak kevés folyadék látszik a méhben), a kanca a csikósárlás során termékenyíthető vagy fedeztethető.
76
Ha ugyanis az ellés utáni 10. napon kezd sárlani, akkor az ovuláció (ami indukálható is) várhatóan a ~15. napon következik be. Mivel az embriónak a méhbe érkezésig a termékenyülést követően további 5 napra van szüksége, addigra tulajdonképpen befejeződik az involúció. Ha azonban a 10. napnál előbb sárlik a kanca, akkor még tökéletes involúció esetén is lehet embrióvesztés, mert az involúció vége előtt, a 17-18. napon ér a méhbe az embrió, amikor még nem optimálisak a viszonyok a fogadására. Ezért javasolt, hogy a 9-10. nap előtti csikósárlást inkább ne használjuk fedeztetésre/termékenyítésre (a 10-15. napon kezdődő sárlást egészséges involúció esetén viszont igen!). Ha a korai csikósárlás során nem termékenyítettek, akkor a CL 5 napos refrakter periódusa után adott prosztaglandin 3-4 napon belül újabb sárlást indukál és így az ellést követő 25. napig jó eséllyel megint ovulál a kanca (immáron másodszorra) és termékenyíthető, ami elősegíti a lehető legrövidebb időveszteséget és évi 1 csikó születését! Kancákban előfordulhat a humán Turner szindrómának megfelelő kromoszóma rendellenesség, amikor az egyik nemi kromoszóma hiányzik (XO). A kórkép veleszületett petefészek hypoplasiával jár és teljes acikliát eredményez. Semmit sem lehet vele csinálni.
Pyometra előfordulhat kancában is, ellentétben) nem jellemző a háttérb sőt a kanca sokszor normálisan ivarz nincsenek, max. rossz az állat kondíc legtöbbször fibrotikus, így a méhet n pyometra kiújul. Vemhességtől el ke val!
A kanca cikluszavarai és ivarszervi kórképei
1.
Cikluszavarok
2.
Granulosa-sejtes tumor
3.
Magzatburok-visszamaradás és puerperálismetritis
4.
Mastitis
Méhelőesés az ellés után közvetle nyitott cervix és méhatónia miatt előfordulhat. Le kell tisztítani, viss Caslick-technikával a pérát összeö
77
5.
Endometritis
6.
Endometriosis
7.
CEM (Contagious Equine Metritis, ragályos méhgyulladás)
1. Cikluszavarok A szezonátmenetre jellemző a rendszertelen ivarzás, ami szabálytalan, sokszor elhúzódó sárlásban nyilvánul meg. Az első néhány ciklusban ugyanis még elégtelen a GnRH frekvencia ahhoz, hogy elegendő LH-t termeljen az ovulációhoz. Ezért a nagy, preovulációs follikulus perzisztál a petefészken és a termelődő ösztrogén miatt állandósulnak az ivarzási tünetek (nimfománia). Bár idővel magától is rendbe jönne, a probléma általában gesztagén etetéssel kezelhető. Ez ugyanis elnyomja az ivarzási tüneteket és a gonadotropin szinteket is csökkenti, tehát a nagy tüsző atretizál, majd a gesztagén etetés befejezése után új ciklus indul. Elméletileg GnRH analógokat (implantátumot, vagy többszöri injekciót) vagy hCG-t is lehet alkalmazni az ovuláció kiváltására, amelyek azonban nem feltétlenül tudnak tüszőrepedést kiváltani. Lóban a természetes GnRH produkció az átmeneti időszakban még gyenge, így egyetlen hCG/GnRH injekció nem oldja meg a helyzetet, mert önmagában nem képes tartósan magas LH-platót okozni. Ezért inkább a gesztagének használatosak. Perzisztáló sárgatestek aránylag gyakran (nem csak a szezonátmenetben) fordulnak elő kancában, azonban ezektől prosztaglandin injekcióval könnyű megszabadulni (a diagnózis ultrahanggal történik, ugyanis a ló CL-je nem jól tapintható). Külsőleg csak annyi látszik, hogy a kanca nem ivarzik vissza időre. Egyébként a ciklusok ~5%-ában előforduló diösztrális ovuláció a CL látszólagos perzisztenciáját okozhatja, mert bár a ciklikus ovulációból származó CL luteolizál, a diösztrális ovuláció eredményeként kialakuló újabb CL viszont ekkor még refrakter lehet, tehát tovább fennmarad. Az ellést követően ritka, hogy a kanca nem sárlik vissza 20 napon belül (postpartum anösztrusz). Gyakoribb, hogy a csikósárlás után perzisztens sárgatest 78
marad vissza és emiatt késik a következő ivarzás, ezt prosztaglandinnal lehet megoldani. Ha a kanca egyáltalán nem sárlott a 20. napig és inaktív a petefészke (nem csak csendes ivarzás volt), akkor napi 2-3 GnRH injekcióval lehet próbálkozni, amíg el nem kezdődik a sárlás, vagy GnRH implantátum/minipumpa használható (mindenképpen egy hosszabb ideig fenntartott magas GnRH-frekvenciát kell elérni). 2. Granulosa sejtes tumor (GCT)
A lóban nem jellemző a petefészekciszták előfordulása! A szezonátmeneti időszak perzisztáló follikulusai nem felelnek meg a tehén cisztás petefészekelfajulásának! Kancában elsősorban nem az ovuláció kiváltása a cél (GnRH-val vagy hCG-vel), hanem inkább gesztagén etetéssel próbáljuk rendbehozni a ciklust, ami egyébként idővel magától is rendbe jönne! Granulosa sejtes tumor viszont előfordulhat a kanca egyik petefészkén és ez a kórkép a szezonátmeneti időszak perzisztáló follikulusaihoz hasonló nimfomániás tüneteket és elhúzódó sárlást okoz, azonban ettől el kell különíteni. Többnyire csak az egyik petefészek kifejezett megnagyobbodása (a neoplasztikus granulosa sejtek ösztrogént és inhibint termelnek) és az ellenoldali ovarium inaktivitása tapasztalható. A tumor eredetű inhibin ugyanis gátolja a tüszőnövekedést a másik petefészekben is. Ultrahanggal biztosan diagnosztizálható. A kórkép általában jóindulatú, de műtéti eltávolítása szükséges a tünetek megszüntetése érdekében. Ismeretes, hogy az ösztrogének androgénekből aromatizálódnak a granulosa sejtekben, tehát nem meglepő, hogy egyes granulosa sejtes tumorok a kifejezett tesztoszteron produkció miatt mén-szerű viselkedéssel járnak.
79
3. Magzatburok-visszamaradás és puerperális metritis Lónál a magzatburkoknak legkésőbb az ellést követő 1-2 órával (de általában 30 percen belül) el kell távozniuk! A magzatburok visszamaradás háttere kevésbé ismert, de nehéz ellést, méhatóniát, túl hosszú vemhességet stb. feltételeznek. A kórkép nem feltétlenül okoz puerperalis metritist, de mindenképpen nő ennek kockázata. Egyes esetekben egyszerűen csak lelassul az involúció, aminek következtében a méh nem felel meg a csikósárlás kihasználására (időveszteség!).
Ha 3-4 órával az ellést követően még nem távoztak el a burkok, rendszerint oxitocint és profilaktikus antibiotikumot adnak a kancának. Az oxitocin általában néhány órán belül a burok távozását idézi elő. Profilaktikusan NSAID készítmények is adhatók, elsősorban a magzatburok-visszamaradáshoz és metritishez gyakran társuló laminitis megelőzésére.
Ha mégis kialakul metritis, akkor lóban ez nagyon gyakran társul laminitissel a kialakuló endotoxinaemia miatt, és akár súlyos szeptikus sokkhoz is vezethet. Ilyenkor intrauterin lavage és/vagy szisztémás antibiotikum, NSAID és intenzív folyadékterápia szükséges. 4. Mastitis
Akut mastitis előfordulhat laktáló kancákban az egyik vagy mindkét tejmirigyben, de gyakrabban jelentkezik a választást követően. Leggyakoribb kórokozó a Streptococcus zooepidemicus, de egyéb streptococcusok és coliformok is szerepet játszanak (mindegyik bőr ill. nyálkahártyaflóra alkotó). Az érintett tőgy duzzadt, fájdalmas, esetleg láz és elesettség is előfordulhat. A kórokozó a tőgybimbó fertőtlenítését követően kifejt tejből kitenyészthető (de nem az első cseppekből), a rezisztencia vizsgálható.
80
A kezeléshez szisztémásan és/vagy tőgyinfúzióban adott antibiotikumot kell használni, célszerűen a rezisztencia-vizsgálat eredményének figyelembe vételével. Kancában a szubklinikai mastitis előfordulásáról keveset tudunk. 5. Endometritis A fedeztetést/termékenyítést követő endometritis diagnózisa és mielőbbi kezelése fontos, ugyanis amíg endometritis van, nem lesz fogamzás. A perzisztáló gyulladásra fedeztetéstől/MT-től függetlenül is hajlamosít a nem megfelelő péra-alakulás és a pneumovagina/urovagina, ilyen esetekben ezért a pérát Caslick-technikával plasztikázni kell! A kórokozók jellemzően a normál flóra alkotói, leggyakrabban Streptococcus zooepidemicus, Klebsiella, E. coli, stb. A hüvelykifolyás ritka, az első ráutaló jel, hogy nem vemhesült a kanca a termékenyítést/fedeztetést követően. Rektális tapintással folyadékkal telt méh érezhető és ez UH-val is jól látható. A biztos diagnózishoz citológiai mintát kell venni és megfesteni. Ha ebben több mint 5% neutrofil van, az endometritisre utal. A méhfalból biopsziás minta is vehető (általában nem rutin vizsgálat, csak hosszú ideje diagnosztizálatlan, meddő kancákban szokás nézni), hogy szövettannal is megnézzük van-e gyulladás (valamint a később tárgyalandó endometriosis diagnózisa csak így lehetséges!). A kórokozó kitenyésztése általában nem sokat segít, mert normál flóra alkotók felelősek érte, ezért sokszor nem lehet eldönteni, hogy melyikük kontaminálja a mintát és melyikük a kórokozó (de elérhetők a piacon speciális intrauterin mintavevő tamponok). A salzollal vagy jódoldattal történő méhöblítést rutinszerűen alkalmazzák a fedeztetést követő 2. napon, a post-mating endometritis gyógyulásának elősegítése és az embrióvesztés megelőzése érdekében. Ehhez egyidejűleg oxitocin ill. prosztaglandin injekciót is adnak. Az embrióra ez nem káros, hiszen ekkor még nincs a méhben, így a méhkontrakciók nem okoznak kárt, továbbá a PGF2α sem indukál luteolízist, mert még refrakter a CL!
81
Ha bebizonyosodik a hosszabb ideig fennálló endometritis diagnózisa, akkor széles spektrumú intrauterin antibiotikumokkal (rezisztencia alapján) plusz oxitocinnal/prosztaglandinnal kezelhetjük a kancát. 6. Endometriosis Ha a citológiai/szövettani gyulladás jelenlétében vagy akár hiányában az endometriumból vett bioptátum vizsgálata során a mirigyek cisztás kitágulása, nekrózisa, illetve azok körül kifejezett fibrózis (periglanduláris fibrózis) látszik, akkor a kórkép endometriosis. Általában krónikus gyulladás következtében alakul ki középkorú vagy idősebb kancákban, erre utal a jellemző lymphoplasmocytás beszűrődés is a metszetben (bár éppen zajló akut folyamat esetén lehet sok neutrofil is). A szövettan alapján az endometriosisnak négy stádiuma különíthető el, ami segít megjósolni, hogy a kancának mekkora esélye van a fogamzásra.
• • • •
I-es kategória: egyáltalán nincs periglanduláris fibrózis IIA kategória: enyhe fokú fibrózis és cisztásodás (esély: 50-80%) IIB kategória: súlyosabb elváltozás (esély: 10-50%) III-as kategória: ez a legsúlyosabb (esély: <10%)
A korral előre haladva nő a periglanduláris fibrózis gyakorisága, amely irreverzibilis kórkép, visszafordítására semmilyen kezelés nem alkalmas. Az I-es kategória esetében kezelés nem szükséges, a IIA fokozat esetében viszont a méhet DMSO vagy jódos oldattal át lehet mosni. Ettől azt várjuk, hogy az endometrium ingerlésével enyhe gyulladást indukál, ami talán majd valamiféle regenerációt is elindít. A legtöbb kanca IIA vagy IIB kategóriába tartozik! 7. Ragályos méhgyulladás (Contagious Equine Metritis, CEM) A lovak Taylorella equigenitalis által előidézett igen ragályos, venereális betegsége, amely kifejezett mucopurulens hüvelykifolyással jár (ez ritka a lovak egyéb méhbetegségeinél!). A beteg kancák a termékenyítést/fedeztetést követően visszaivarzanak, vagy mert a spermiumok eleve nem jutnak át a 82
gyulladásos területen, vagy ha mégis, akkor a méhbe lejutó embrió elhal. A mének tünetmentes hordozók (a péniszen, tasakban, főleg a fossa urethralisban). Egy idő után a kancákban is megszűnik a gennyes váladékozás, de az állatok krónikusan fertőzöttek maradva terjesztik a kórokozót. A kórokozó természetes fedeztetéssel terjed. Hordozó ménnel történt fedeztetés után a kanca akkor szinte biztosan CEM-es lesz. Kb. 2 héttel a fedezést követően a profúz gennyes hüvelykifolyás kezdődik, ami néhány napon-héten belül többnyire elmúlik, de egyes kancák krónikusan fertőzöttek maradnak és terjesztők lesznek (+ általában infertilisek is). A kórokozót igen nehéz kitenyészteni (de ez kell a definitív diagnózishoz, mert más jó teszt nincs), egyrészt speciális igényei miatt, másrészt mert kedvezőtlen környezetben elpusztul, mire a laborba érkezik). Tamponmintát kancák esetében a fossa clitoridisból, ménekben pedig a fossa urethralisból kell venni és megfelelő transzportmédiumban 4 fokon kell a laborba juttatni. Csokoládé-agaron, 5-10% szén-dioxid jelenlétében nő ki. A krónikus hordozó kancák és mének esetében a fossa clitoridist ill. fossa urethralist kell klórhexidines fertőtlenítő oldattal átmosni, majd bekenni nitrofurazonos kenőccsel és ezt ismételni legalább 5 napig.
A mén
A herék leszállása méncsikóknál csak az ellés körüli időben vagy azután indul meg. Ha egyik vagy mindkét here a lágyékcsatornában vagy a hasüregben marad, az a kriptorchidizmus. A fizikális vizsgálattal nem egyértelmű kórkép hCG/GnRH-stimulációs teszttel diagnosztizálható. Ha szemikriptorchid állat kasztrációja során csak a leszállt herét távolítják el, a bennmaradó here által termelt tesztroszteron miatt az állat agresszív lehet. A hasüregben maradt kriptorchid here daganatos transzformációra prediszponált. Amennyiben a mént tenyésztésre akarják használni, akkor kutyával ellentétben hCG-vel vagy GnRH-val 2 éves kor előtt (hogy a spermatermelés ne szenvedjen permanens károsodást) indukálni lehet a here
83
leszállását, ami főleg akkor működik, amikor here már a lágyékcsatornában helyezkedik el. A szarvasmarha szaporodása Összefoglalás (a ciklus hossza 21 nap)
•
Pubertás ideje: kb. 11 hónap (de fajtától is függ); tenyésztésbe vétele viszont csak kb. 15 hónaposan (kb. 24 hónaposan legyen az első ellése)
• • •
Ciklikusság: Poliösztrusz
•
Embrió lejutása az uterusba: ~4-5 nappal a termékenyülés után (embrió kinyerés átültetéshez a 7. napon!)
•
Vemhesség anyai felismerése: trophoblast által termelt bovine IFNτ (a vemhesség 15-16. napján)
•
Placenta típusa: placenta cotyledonaria (anatómiailag), placenta synepitheliochorialis (szövettanilag)
•
Vemhesség hormonális háttere: Corpus luteum independens (kb. 200. naptól veszi át teljesen a progeszteron termelést a placenta)
• •
Vemhesség hossza: kb. 285 nap
•
Involúció hossza: Tejelő tehénben kb. 42 nap; húsmarhában kb. 30 nap, mert a gyakori szopások fokozzák az oxitocin leadást, ami segíti az involúciót.
Ösztrusz hossza: kb. 15 óra Ovuláció időpontja: kb. 12-16 órával az ivarzás vége után (!) – termékenyítés az am/pm szabály alapján!
Ellés utáni újra ciklusba lendülés időpontja: Élettanilag a szarvasmarhának van bizonyos fokú laktációs anösztrusza, ami azonban csak húsmarhában jelentkezik, mert a szopással/szopások gyakoriságával van összefüggésben! (A tejelő tehén napi kétszeri fejése nem blokkolja a petefészek működését.) Tejelő tehénben (ha nincs kóros állapot): kb. 21. nap, Húsmarha: kb. 50-60. nap
84
A tejelő tehenészet menedzsmentje Tejelő teheneknél a termelési csoportok szerinti takarmányozás (szárazon álló, fogadó, a termelt tej mennyisége alapján kialakított csoportok, stb.) azért fontos, hogy biztosítani tudjuk a tejtermelés, illetve a magzati növekedés feltételeit/tápanyag igényét és szinten tudjuk tartani az elvárt kondíciót! Az egyes csoportokat külön fejik. A BCS (body condition score) értékelése során az állatnak mindig a BCS 2.5-3.5 közötti kell lennie! A tejelő és húshasznú teheneknél célkitűzés, hogy évente egy borjú szülessen, tehát a két ellés közötti idő 365 nap körül legyen. Tejelő teheneknél a 365 napból kb. 305 nap jut a laktációra és kb. 60 nap a szárazonállásra. Ezért 285 napos vemhességi idővel kell számolni, amiből max. 80 nap lehet az elléstől az újratermékenyülésig eltelt idő (üresen töltött napok száma szervizperiódus). Az állományok átlagát tekintve a hazai és a külföldi tejelő tehenészetek is messze járnak a 365 napos két ellés közötti időtől. A reális célkitűzés állományszinten még Nyugat-Európában is kb. 380-410 között van, nálunk sajnos kb. 410-30 körül van jelenleg. Ha valaki 70-80 nap körül tudja tartani az elléstől az első inszeminálásig (vagyis az első detektált ivarzásig) eltelt időt és kb. 2-es termékenyítési indexet (TI) (hogy hányadik MT-re vemhesül a tehén) tud hozni, az már jó eredménynek számít (a tejelő teheneknél átlagban nem reális cél a 2 alatti TI, hiszen legfeljebb 50-60%uk fogamzik elsőre, így ezt csak üszőknél lehet lejjebb vinni). Húshasznú állományokban más a helyzet, ott a magas tejtermelés nem hátráltatja a szaporodási folyamatokat + fedező bikákkal vagy MT-vel és egy jól megszervezett menedzsmenttel biztosítható, hogy a tehenek legkésőbb az ellést követő kb. 60. nap körül ciklusba lendüljenek és termékenyüljenek, de még ha csak a második ivarzásukkor termékenyülnek is, az is benne van a 365 napos két ellés közti időben.
Ivarérés, nemi ciklus, ivarzás és ivarzásdetekció Repeat breeding
85
A tehén ivarérése és nemi ciklusa Átlagosan 21 napos a ciklus, poliösztruszos állat, de csökkent fertilitási mutatókkal a nyári időszakban. A follikuláris fázis kb. 3-4 nap hosszú, a luteális pedig 17-18 napos. Az ösztrusz (ivarzás) átlagosan 15 órás, és ennek befejeződése után kb. 10-16 órával következik be általában az ovuláció. A tüszőfejlődés hullámszerű (a nőivarú élettani részben van erről szó), leggyakrabban a 3., ritkábban a 2. hullámból történik meg az ovuláció. A sárgatest az 5. napig refrakter, prosztaglandin adására nem reagál. Az üszők pubertása fajtától is függően a 10-12. hónap körül következik be (ekkor van ez első ovuláció), azonban a tenyésztésbe vétel csak a 15. hónap körül történik, hogy az első ellése 2 éves korára megtörténjen. Az üszők takarmányozásánal fontos, hogy nem lehet hizlalni őket (BCS 4 fölé ne menjen), részben mert a kövér üszőnek gyakrabban van nehézellése (üszőkben általában is több nehézellés szokott lenni, még akkor is, ha nem kövérek), részben pedig az elhízás hajlamosít ellés körüli zsírmájra, ami késlelteti a ciklusba lendülést, stb.. Fontos, hogy az első termékenyítésre elérjék a 350 kg körüli testtömeget, ami kb. a felnőttkori testtömeg 65-70%-a. A vemhesítést követően közepes intenzitású takarmányozással kell biztosítani, hogy ne legyen kövér az állat, de azért közben a maga fejlődésére is tudjon még energiát fordítani. Az üszők fogamzási rátája jelentősen magasabb a tehenekénél (nincs negatív energiamérleg, nincs szubklinikai endometritis, kevesebb a csendes ivarzás), ezért a termékenyítési indexük (hányadik MT-re vemhesül) alacsonyabb. Ezért lehet a szexált spermát elsősorban üszőkben eredményesen alkalmazni. Ivarzás, ivarzásdetekció Az egyik legkardinálisabb kérdés tejelő tehenészetekben (húshasznú állományokban is, ha MT-t használnak)! Ezen nyugszik az eredményes szaporodásbiológiai munka. A tehenek ösztrusza/ivarzása átlagosan 12-15 óra hosszú. Az ivarzó tehén megáll (álló ivarzás) a társainak, engedi, hogy azok ugrálják őt (aki ugrál az általában proösztruszban van)! A péra duzzadt (kipirult), hiperémiás és jellegzetes ivarzási nyálka ürül a hüvelyből. Az ivarzó tehenek aktívabbak (ezért lehet használni ivarzás-megfigyelésre a pedométert), többet mozognak, valamint a tejtermelésük is kicsit lecsökken átmenetileg. 86
Sajnálatos módon az intenzív tejtermeléssel együtt jár, hogy nő a csendesen ivarzó tehenek aránya! Ezért egy jó telepi ivarzás-megfigyelő rendszer elengedhetetlen/nagyon fontos! Lehetséges technikák:
•
Ivarzás-megfigyelés (kijelölt telepi dolgozók munkájának része, hogy körbe mennek a telepen és keresik az ivarzó egyedeket, felírják a fülszámát. Ezt naponta min. 2x megteszik, de jobb, ha 3-4x körbejár valaki!)
•
A hatékonyságot lehet javítani, pl. ha be van kamerázva a telep és a napi felvételeket mindig kielemzi valaki
•
Lehet ivarzókat keresni kereső állatokkal (vazektomizált bika vagy androgenizált nőstény – olyan tehén, amit vágóba küldenének, de helyette tesztoszteronnal kezelik, így masculinizálódik és felhasználható az ivarzó egyedek kiválogatására)
• •
Krétával megjelölik a tehén hátát és ez elkenődik, ha felugrottak rá.
•
Pedométer (a tehenek lábára tehető digitális lépésszámláló eszköz, melyet általában a fejőházba belépve olvas le egy számítógép > a leolvasott érték jelzi, ha az állat sokat mozog)
•
Hüvelyi ellenállás mérése alapján is lehet ivarzást detektálni, de ez kevésbé gyakorlatias
Vannak a tehén hátára helyezhető digitális eszközök, amelyek rádió jelet küldenek egy adóvevőnek, ha nyomás éri őket (vagyis, ha ráugrottak a tehénre)
Összegezve: Magyarországon általában a vizuális megfigyelés vagy a krétázás a két leggyakrabban használt technikák. Az ivarzás-megfigyeléssel megbízott embereket érdekelté kell tenni az eredményes termékenyítésekben (plusz pénz). Magyarországon is használják a pedométert, ez is jól bevált módszer. Inszeminálás, repeat breeding A tejelő tehenészetekben szinte kizárólag fagyasztott spermával történik a mesterséges termékenyítés (MT). A húshasznú állományokban is elterjedt a MT, de itt lehet természetes fedeztetéssel is találkozni. 87
A tehén 12-16 órával az ösztrusz vége után ovulál! Tehénben a petesejt életképessége csak kb. 12 óra az ovuláció után és a spermiumok sem maradnak sokáig (12-24 óra) életben (ráadásul fagyasztott spermával termékenyítenek). Ezért kell az ösztrusz végéhez képest +/- 6 órás intervallumban termékenyíteni. Ennek gyakorlati kivitelezéséhez az am-pm szabályt használják (ha reggel detektálják az ivarzást, aznap du. kell termékenyíteni, ha du. detektálják, másnap korán reggel kell inszeminálni). REPEAT BREEDERNEK nevezzük azokat a ciklusban ivarzó teheneket (nincs klinikailag megnyilvánuló pathológia lelet/tünet), amelyek egymást követő 3x-i termékenyítésre sem vemhesülnek. Repeat breederként fog jelentkezni az a tehén is, amelyik vemhesült, de a 28. nap előtt (amikor a korai UH-s vemhességi vizsgálatot végzik) korai embrionális mortalitás következett be, ezért visszaivarzik! Tehát nem lehet eldönteni, hogy tényleg nem vemhesült, vagy korai embrionális mortalitás történt! Okok:
•
Rosszkor inszeminálták (az egyedek között nagy a variabilitás az ösztrusz hosszát és az ovuláció időpontját tekintve, így egy kicsit késve bekövetkező ovulációkor már nem biztos, hogy még életben lesznek a méhbe inszeminált spermiumok; a fix idejű termékenyítéses protokollok – pl. Ovsynch, lásd később – segíthetnek kiküszöbölni a problémát; az is segíthet, ha a MT-sel egyidőben GnRH-val kezelik a tehenet, de ezt ritkán alkalmazzák)
•
Hőstressz (ezért csökken a fertilitás nyáron), energiahiány-NEB, fehérjetúletetés, szubklinikai endometritis vagy valamilyen fertőző ok (BVD, IBR pl) miatt elhal az ovulált petesejt, vagy a spermium vagy az embrió
•
Elégtelen CL-funkció a korai vemhességben, ami embrionális mortalitást okozhat. Hőstressz: a nyári és kora őszi időszakban bizonyítottan rosszabb a tehenek szaporodásbiológiai teljesítménye, mint télen. Ez részben azért van, mert melegben kevésbé intenzívek az ivarzási tünetek (pl. kevésbé ugrálják egymást) így romlik az ivarzás-megfigyelés hatékonysága. Emellett a hőstressz késlelteti az LH-csúcs bekövetkeztét is, ami elnyújtott follikuláris fázisban (de kevés tünettel!) és kései ovulációban nyilvánul meg (ami miatt nehéz jókor inszeminálni + a petesejtek is rosszabb minőségűek lesznek) Valószínűleg a CL P4-termelése is rosszabb hőstresszben, de erre egyelőre kevesebb bizonyíték van. Melegben nem esznek annyit az állatok, emiatt is lehet NEB. 88
Vitaminellátotság szerepe a tejelő tehenészetekben A legfontosabb a béta-karotin ellátottság! Önmagában a szilázson és abrakon alapuló TMR általában karotin-szegény, ezért az állományoknak kiegészítés adása javasolt! A béta-karotint a tehenek bélfala vagy retinollá alakítja, vagy eredeti formájában felszívódik, de nem csak azért fontos, mert az A-vitamin prekurzora, hanem önmagában (β-karotinként) is szerepe van a szaporodásbiológiai folyamatokban. A béta-karotin hozzájárul a tüszők normális fejlődéséhez, hormontermeléséhez, ovulációjához, és a sárgatest működését is segíti. Kimutatták, hogy a CL-ben felhalmozódik. Feltételezik az oxidatív stressz elleni védőhatását is, illetve biztosan szerepe van a szteroid hormonok normális szintézisében is. Valószínűleg a csökkent karotin ellátottságú tehenekben gyakoribb a csendes ivarzás, elnyújtottabb az ivarzás, és később következik be az ovuláció, valamint a sárgatest is kevesebb progeszteront termel. Látható, hogy ezek a tényezők rontják a telep szaporodásbiológiai mutatóit (legfontosabb, hogy a két ellés közötti idő megnyúlik). Az állomány béta-karotin ellátottságát laborvizsgálatokkal fel lehet mérni szérumból, azonban gyakorlati körülmények között az is igen jól tájékoztat, ha csak ránézünk a levett vérmintákra és a szérum színe alapján (mennyire sárgás) megítéljük a béta karotin ellátottságát az állatnak. A vemhes állatokban a belőle képződő A-vitamin származék retinsav nagyon fontos szereppel bír (egyébként minden fajban), ugyanis ez a faktor elengedhetetlen az embrió/magzat normális fejlődéséhez. Vitaminok közül fontos még az E-vitamin > antioxidáns, hőstressz kivédése, csökkenhet a magzatburok visszatartásos esetek száma (ugyanígy a szelén is segít, ami a glutation reduktáz működéséhez kell). A cink és réz ellátottság (mivel ezek számos enzim prosztetikus csoportjai) is hozzájárul a jó reprodukciós paraméterek eléréséhez. D-vitamin injekcióval az ellési bénulás megelőzhető (de itt meg inkább a szárazonálló táp Ca/P aránya és K tartalma döntő a megelőzésben). A tehén vemhessége és involúciója
1.
A vemhesség fiziológiája, endokrinológiája. Gyógyszeres abortusz ill. ellés indukciója tehénben
2.
Vemhességi diagnózis 89
3.
Korai és késői embrionális mortalitás, elégtelen luteális működés
4.
Abortusz
5.
A fiziológiás involúció és újra ciklusba lendülés 1. A vemhesség fiziológiája, endokrinológiája. Gyógyszeres abortusz ill. ellésindukció tehénben A tehén vemhessége 280-290 nap, az embrió 4-5 naposan, általában morula stádiumban érkezik a méh üregébe. A trofoblast a 12. naptól kezdve termel bovine IFN-taut, de a legmagasabb koncentrációkat a 15-16. napon éri el és ekkor történik a vemhesség anyai felismerése. Az bIFNτ gátolja a vemhes endometrium oxitocin receptorainak expresszióját, ezért nem tud emelkedni a prosztaglandin termelés, így nem lesz luteolízis. Az embrió a 20. nap körül kezd el megtapadni az endometriumon. A vemhességi sárgatest általában a kb. a 200. napig felelős a progeszteron termelésért, ezt követően a föto-placentáris egység termeli a P4-et. Ennek megfelelően a következő gyógyszerekkel lehet indukálni abortuszt vagy ellést:
•
A 150. napig egyszeri prosztaglandin injekcióval tudunk vetéltetni, ha valamiért szükséges.
•
A 150. nap után (mivel egyes egyedekben már ekkor is elég lehet a placenta által termelt P4 a vemhesség fenntartásához) dexamethasont kell adni vetéltetéshez vagy ellés indukciójához (7-10 nappal a várható ellés előtt adva, 3 napon belül megellik). Ezt egyébként lehet kombinálni prosztaglandinnal is, ami javítja a hatékonyságot.
•
A vemhesség utolsó hetében újra elég önmagában is a prosztaglandin az ellés indukciójához (48 órán belül megellik az injekció után), de általában továbbra is dexamethazonnal együtt adják.
Az ellés indukciójára sor kerülhet tehenészetekben, hiszen ha van egy vemhes tehén, amit le kell vágni, viszont közel van az ellés ideje, a borjút meg kell menteni és indukálni kell az ellést. Egyébként a dexamethazon arra is jó, hogy elősegítse a magzati szövetek (főleg az alveolusok) érését, így kevésbé lesz fejletlen a születendő borjú. 2. Vemhességi diagnózis
1.
Vissza nem ivarzás (nem specifikus és nem szenzitív) – erre nem lehet alapozni egy modern tehenészetben. A vemhesek elég nagy százaléka 90
mutathat ivarzási tüneteket a vemhesség elején, és ha ezeket az állatokat MT akkor az az embrió elhalásához vezethet.
2.
Rektális tapintás - Az amnionhólyagot a 30. naptól tudja tapintani egy tapasztalt vizsgáló, a membrán-slip módszerrel (az ujjak között át kell csúsztatni a magzatburkokat) a 45. naptól lehet ezt biztosan megtenni. A méhszarvak részaránytalansága alapján is diagnosztizálható a vemhesség.
3.
Progeszteron mérése tejből vagy vérből – az MT utáni 24. napon a legcélszerűbb vizsgálni (korábban a hosszabb ciklusok fals pozitív eredményt adhatnak). Egyáltalán nem specifikus a vemhességre (perzisztáló sárgatest, vagy luteális ciszta bezavar pl.)
4.
Vemhesség-specifikus fehérjék mérése (PAG = pregnancy associated glikoproteinek, enzimatikus aktivitását elvesztett aszpartát proteáz, melyeket az endometriumba vándorló binukleáris trofoblaszt sejtek termelnek) – tehát specifikus a vemhességre és elég szenzitív is, ezért a 2830. naptól az anyák szérumából kimutatva jó diagnosztikai értékű. Problémát jelent, hogy az ellést követően is kb. 100. napig még kimutathatók a tehenek véréből, tehát a postpartum korán vemhesülő teheneknél elvesziti értékét a teszt!
5.
Rektális ultrahang vizsgálat – A korai UH-s diagnózis a 27-28. naptól nagy biztonsággal lehetséges. A hazai telepeken is szinte mindenhol ezt használják. 3. Korai és késői embrionális mortalitás, elégtelen luteális működés Tehénben az embrionális kor a 42. napig tart (ezután magzat!), idáig beszélünk embrionális mortalitásról. Ennek gyakorlati szempontból két nagy csoportját különítjük el. Beszélünk korai embrionális mortalitásról, ami a 28. nap (tehát az UH-s vemhességi diagnózis) előtt következik be. Feltételezhető előfordulására vonatkozó adatokkal rendelkezünk csak (mivel a gyakorlati életben nem tudjuk elkülöníteni a repeat breedingben megnyilvánuló egyéb okoktól!). A tanulmányok szerint jó ivarzásdetekció mellett a termékenyülési ráta 90% körüli lehet, viszont tejhasznú marhában (főleg tehénben, mert üszőknél ez nem olyan nagy probléma) akár 30-40%-os is lehet a korai embrionális mortalitás (ez igen magas más fajokhoz képest!!), aminek legnagyobb része a 8-16. nap között következik be! Emiatt tűnik úgy, mintha az állatoknak csak 50-60% vemhesülne!
91
A késői embrionális mortalitás (az UH-s diagnózis ideje és a 42. nap között) esetén vemhesnek nyilvánított tehén a 35-50. nap között visszaivarzik (az embrionális szövetek nyom nélkül felszívódnak).
1.
2.
3.
4.
5.
Korai embrionális mortalitás okai (akár 30-40% is lehet) Fehérjetúletetés: Ha nagy mennyiségű fehérjét kap a tehén, csökkent energiaellátottság mellett, úgy a bélbaktériumok a felszabaduló aminósavakból kevesebbet tudnak hasznosítani, helyette azok felszívódnak és májbeli lebontásukból nő az állat ammónia és karbamid terhelése! Ezek a szervezetben felhalmozódó vegyületek részben az endometriális szövetek pH-jának megváltoztatása révén rontják a beágyazódás hatékonyságát/esélyét, részben direkt embrió-toxikusak is (petesejtre/spermiumokra toxikus, gátolja a fertilizációt). Szubklinikai endometritis: Feltételezhetően gátolja az embrió beágyazódását, de kevés erre vonatkozó tanulmány van. Korai luteális elégtelenség: Tanulmányok arra utalnak, hogy nagytejű szarvasmarhákban a máj fokozott metabolikus aktivitásának (a tejtermelés energiaigényének fedezése miatt) az is következménye, hogy a progeszteron májbeli metabolizmusa és inaktivációja fokozódik. Emiatt az anyai vérben csökken a P4 koncentráció, ami csökkent endometriális szekrécióhoz, így rosszabb életképességű embriókhoz vezet. Ezek a rosszabb életképességű embriók kevesebb IFN-τ-t termelnek, így nem tudják megakadályozni a luteolízist és az embrió végül elhal. (Marhában nem olyan elterjedt a progeszteron kiegészítés a korai vemhesség fenntartására, mint pl. kancában, emberben, de elvi lehetőség van rá. Feltételezhetően korai vemhességben, pl. 5 vagy 12 nappal az MT után hCG-vel ill. GnRH-val növelhető a sárgatest hormon produkciója.) Hőstressz: A hőstressz az eddig leírtak mellett a méhnyálkahártya vérellátását ill. prosztaglandin termelését is befolyásolja, s csökkent életképességű embrióhoz, rossz implantációhoz, korai luteolízishez vezethet. Genetikai abnormalitás, kromoszóma rendellenesség Ezek leggyakrabban korai embrionális mortalitásban nyilvánulnak meg. 92
6. Ikervemhesség - Bár egyelőre nem tulajdonítanak akkora jelentőséget neki, mint lóban, de fontos! 4. Abortusz Lista a lehetséges kórokokról (lásd még járványtan): Nem fertőző: • Ikervemhesség, kromoszóma rendellenességek, mérgező növények, nitrát/kadmium/ólommérgezés, béta-karotin/E-vitamin/szelén hiányos táplálás Legfontosabb fertőző okok:
• • • • • • • •
IBR
• • • •
Neospora caninum (ritkábban Toxoplasma gondii is)
BVD Brucella abortus Leptospirák Listeriosis Campylobacter fetus venerealis Chlamydophila abortus Felszálló gombás (pl. Aspergillus, Mucor), ill. bakteriális (coliformok, Streptococcusok pl.) placentitis miatti vetélés Tritrichomonas fetus Bluetongue Bunyavirusok (Akabane, Schmallenberg…stb)
5. Az involúció élettana és az ellés utáni újra ciklusba lendülés A tehén (és más fajoknál is) méhének involúciója során három feltételnek kell teljesülnie: A vemhes méhnek vissza kell nyernie közel eredeti méretét, az ellés során a méhbe került baktériumoknak távozniuk kell, és az endometriumnak regenerálódnia kell.
93
A tehenek involúciója kb. 42 napig tart, ennek korai 1-14. napig, középső 15-28. napig, illetve késői 29-42. napig terjedő szakaszai különíthetők el, de talán gyakorlatiasabb az első feléről (21. napig) és a második feléről (21-42. napok között) beszélni, ugyanis ezek az involúciós eseményekben és a lehetséges kórképekben (puerperális metritis<-->klinikai endometritis) is különböznek egymástól. Elsőként a lochia távozik a méhből (sárgás-vöröses-barnás váladék, kb. 0.5-2 liter) az involúció első 7-10. napja között, majd az involúció első felének végére (21. napig) a méh többé-kevésbé visszanyeri normális/eredeti méretét. A második szakaszban inkább csak az endometrium regenerációja zajlik. Az involúció fiziológiás levezénylésében kifejezetten nagy szerepe van a 21. napig jelentősen megemelkedett prosztaglandin szintnek (a post partum endometriumból jön), ami uterotonikumként segíti a lochia távozását, de a neutrofilek fagocitotikus működésére is pozitív hatással van. Tejelő tehenekben az állatok 50-60%-ában a 21. nap körül már ovulálnak follikulusok (bár az első ivarzás sokszor csendes > nincs P4 előkészítés!), a 40. nap környékére pedig az állatok 90%-ának ivarzania kell. Egyedi esetekben postpartum 10-14 nap körül is lehet ovuláció. Ennek az a jelentősége, hogy a domináns follikulusok miatt megemelkedő ösztrogénszintek immunstimulánsként és uterotonikumként hatva segítik az involúciót. Természetesen egy involúciós szövődmény (lásd később) illetve a NEB nagyban hátráltatja az első ovuláció bekövetkezését. A negatív energiamérleg lehető leggyorsabb leküzdése érdekében (teljesen elkerülni nem lehet, mert minden postpartum tehénben bekövetkezik) az a szabály, hogy ne hízlaljuk a tehenet 4 BCS (body condition score) fölé az ellést megelőzően, az ellés után viszont maximálisan kell takarmányozni és a maximumra kell emelni a szárazanyag bevitelt, hogy amennyire lehet, fedezzük a tejtermelés óriási energiaigényét. Nem szabad hizlalni a tehenet az ellés előtt, de azt feltétlenül meg kell próbálni elérni, hogy ne veszítsen 1-nél több kondipontot az ellés körüli időszakban (ne a saját tartalékait bontsa, hanem főleg abból legyen energiája, amit megeszik). A laktációs teljesítmény csúcsát a 4-6. héten éri el, de ha 3-3.5-es BCS-s (body condition score) volt a tehén ellés előtt és utána maximálisan etetjük + nincs involúciós szövődménye, + mastitise + valamilyen lábbetegsége, akkor erre az 94
időre kikerül a NEB-ből és a tejtermelés energiaigényét jól tudja fedezni abból a takarmányból, amit megeszik innentől kezdve. Ha viszont még ekkor is NEB-ben van, akkor klinikai/szubklinikai ketózisos lehet, ennek mértékétől függően (lásd később). Amíg NEB van, addig nem lesz ovuláció!, mert a normális follikuláris fejlődéshez megfelelő inzulin és IGF-1 koncentrációk kellenek a vérben, melyek részben a granulosa sejtek növekedési faktorai, részben a GnRH neuronok leadási frekvenciáját fokozzák. Amíg viszont az állat relatíve éhezik (=NEB), addig nem lesz magas az inzulinja, mert esélye sincs rá, hogy magas vér glükóz szintje legyen, ami az inzulint indukálná + a növekedési hormon hatására a májban termelődő IGF-ek is csökkent mértékben lesznek jelen. Természetesen egyedenként változik, hogy ki mikor tud majd ovulálni (akármennyire egységes is a takarmányozás), de a cél az, hogy a 40. napra az állatok 90%-a ovuláljon (sokan már a 20. nap körül ovulálnak). Ez a normális, mivel nem szoptat a tejelő tehén, de a durva NEB hátráltatja. Az involúciós szövődmények (magzatburok visszatartás, puerperális metritis, klinikai/szubklinikai endometritis) is jelentősen késleltethetik az első ovuláció időpontját. Húsmarhában a szoptatás gyakorisága befolyásolja az első ovuláció idejét, ugyanis ez kifejezetten gátolja a GnRH-leadást, annak frekvenciáját, ami csak akkor emelkedhet meg, ha a szopások ritkábbá válnak. Ezért a legtöbb húsmarha az ellés utáni 50-60. nap körül ovulál először fiziológiás körülmények között (egyegy egyed persze azért előbb is). A tejelő tehenészetekben az egyedi kórtörténet (szaporodásbiológiai események, kezelések, MT ideje, ivarzási időpontok, vemhesség vizsgálat ideje és eredménye, vizsgálat ideje + eredménye + mivel kezelték, ellés várható ideje, stb.) nagyon fontos, hogy rögzítve legyen. Az adatoknak be kell kerülnie a számítógépes nyilvántartásba. A tehén ciklusának gyógyszeres manipulációja
1.
A detektált tüszők és sárgatestek menedzsmentje
2.
Prosztaglandinnal történő ivarzás-szinkronizáció
95
3.
Ivarzás-szinkronizáló (és ciklus indukciós) protokollok prosztaglandinnal és GnRHval (Ov-synch, Co-synch, Pre-synch…stb.)
4.
Ivarzás-szinkronizálás és ciklus indukció gesztagénekkel
1. A detektált tüszők és sárgatestek menedzsmentje Tejelő tehenek aktív petefészkein fiziológiásan tüszőket vagy sárgatesteket találunk rektális tapintással vagy UH-val. Húsmarha állományokban ritkábban van egyedi vizsgálat, általában állomány szintű kezeléseket alkalmaznak, pl. ivarzásszinkronizálás. A nem termékenyített, ciklusban ivarzó tehenek esetében a legfontosabb cél a petefészken lévő sárgatest luteolízise, hogy lerövidítsük a ciklust és mielőbb újra ivarzása legyen (pl. csendes ivarzás volt és ezért nem volt termékenyítve, hibáztak/nem vették észre az ivarzást + nem történt inszeminálás és az állat ovulált és CL-je van). A tehén esetében a sárgatest refrakter periódusa (nem reagál a PGF2 alpha kezelésre) a ciklus első 5 napja (és a ciklus utolsó 3-4 napja), de ezt csak abban az esetben tudjuk figyelembe venni (erre találták ki a 2x PGF2α injekciós szinkronizálást) ha napra pontosan ismerjük az egyed ciklusát, és tudjuk mikor volt az ovulációja. A luteolízishez prosztaglandint használunk. Ha van sárgatest a tehén valamelyik petefészkén (és tudjuk, hogy őt nem termékenyítették), akkor prosztaglandinnal kezelhetjük. Gyakran kisebb-nagyobb tüszőket is lehet találni a virágzó sárgatest mellett (vagy a másik petefészken), de ezek úgysem fognak ovulálni (atretizálnak) amíg van CL, tehát egy prosztaglandinnal az ő fejlődésüket is elősegíthetjük. Tejelő teheneknél a termékenyítést ivarzásdetekció alapján végzik, és nem GnRH/hCG injekciót követő fix idejű MT-vel, mint ahogy kancában, vagy marhában szinkronizálásnál (pl. húsmarha). A később tárgyalandó Ov-synch protokollnál része az eljárásnak a GnRH/hCG kezelés (a kezelés végén fix idejű MT van GnRH/hCG kezeléssel egybekötve). Ha jó nagy tüszőt (~20 mm) található a petefészken és mellette sűrű ivarzási nyálka is ürül, akkor azonnal inszeminálható a tehén, de nem adnak GnRH-t/nem 96
indukálják az ovulációt. Nincs is rá szükség, mert az ovulációt megelőzik az ivarzás detektálható jelei és az am-pm szabály alapján jó eredménnyel termékenyíthetők. 2. Ivarzás-szinkronizáció prosztaglandinnal Egyszeri prosztaglandin injekcióval a ciklus 6-16. napja között luteolízist tudunk indukálni (rendszerint rektális vizsgálattal van egybekötve a kezelés, hiszen CL-nek kell lenni valamelyik petefészken). Ha valamiért szükség van egy csapat aktív petefészkű (!) tehén ciklusának szinkronizálására, akkor kétszeri PGF2α injekcióval erre lehetőség van, amennyiben a két injekciót 11 napos időközzel adjuk. A 11 napos különbség miatt nem kell rektálisan megvizsgálni a teheneket (a 11 napos különbség biztosítja azt, hogy a második injekció beadásakor biztos, hogy érzékeny sárgatest van valamelyik petefészken, függetlenül attól, hogy kapott-e korabban PG-t az állat vagy sem). Nézzünk példákat, ha random adjuk az 1. injekciót:
•
Az első injekciót az ovulációját megelőzően kapja a tehén. Akkor kb. 3 napos follikuláris fázissal és 5 napig refrakter CL-el a 11. napon biztos érzékeny lesz a CL.
•
Ha az első injekciót a ciklus 5. napján (még refrakter a CL) kapja, akkor 11 nappal később a 16. napon még pont érzékeny lesz az indukált luteolízisre (meg amúgy is mindjárt magától elindulna a luteolizis).
•
Ha a ciklus 8. napján kapja az elsőt, akkor érzékeny volt a CL, ezután luteolízis, majd tüszőnövekedés és mondjuk 4-5 nap múlva ovuláció, így a 11. napon megint az 5 napos refrakter perióduson kívül leszünk.
A luteális fázis alatti tüszőnövekedési hullámok miatt a szinkronizált tehenek ovulációja 1-2 nap eltérést mutathat. Ezt az befolyásolja, hogy a második PGF2a injekciót mikor kapja az állat (van-e éppen jó nagy tüszője egy növekedési hullámból vagy épp most kezdődött egy új hullám egyelőre pici tüszővel), az ovuláció 2-3 vagy 4-5 nappal később fog bekövetkezni (mert az éppen növekvő tüszőnek különböző idő kell, hogy domináns legyen és ovuláljon). Ezért csak a detektált ivarzáskor érdemes termékenyíteni am-pm alapján. Üszőkben egységesebb lehet a válasz, így bennük 72. és 96. órában történő fix MT-s protokoll használható.
97
3. Ivarzás-szinkronizáló protokollok prosztaglandinnal és GnRH-val (Ov-synch, Cosynch, Pre-synch…stb.) GnRH és PGF2α hatású készítmények kombinálásával szinkronizáló protokollokat alakítottak ki. A GnRH miatt ezeket inaktív petefészkű (anösztruszos) teheneken is lehet alkalmazni, melyeknél a tüszőnövekedési hullámok hamar terminálódnak elégtelen FSH-produkció miatt (a GnRH ezt indukálni fogja és éppen ezért ivarzás indukcióra is alkalmasak). Plusz ugyancsak a GnRH miatt a kezelt tehenek ovulációjának időpontja sokkal egységesebb lesz, ezért fix idejű termékenyítésre (is) alkalmasak ezek a protokollok. Ov-synch: 0. napon GnRH, 7. napon PGF2a, 9. napon GnRH majd ~16 óra múlva fix MT. Ez az alapja az összes további protokollnak (GPG protokollként is emlegetik; GnRH – PG - GnRH). Általában olyan teheneken alkalmazzák, amelyek petefészke inaktív, vagy van rajta tüsző, de nincs CL. Bármelyik esetben a GnRH a tüszőnövekedést segíti és ovulációt indukál, ami után 7 nappal szenzitív CL lesz a petefészken, és ekkor adjuk a PG-t. Majd az újonnan növő domináns tüszőre rásegítünk a 2. GnRHval, amitől az ovulálni fog. Természetesen az egyedek közötti variabilitás a válaszkészség tekintetében elég nagy lehet. Az Ov-synch protokoll fontosabb változatai: Co-synch: Ez a legegyszerűbb módosítása az Ov-synchnek, csak annyi a különbség, hogy itt a második GnRH injekcióval egyidőben, a 9. napon történik a termékenyítés is! Pre-synch: Ezt azért fejlesztették ki, hogy jobban el tudják találni az első GnRH injekció beadásának optimális időpontját, ezért a teheneket előzetesen szinkronizálták. Ezért 2x-i prosztaglandin injekciót építettek be az első GnRH elé. -26. napon PGF2α, -12. napon PGF2α, 0. napon GnRH, 7. napon PGF2α, 9. napon GnRH, majd Co-synch vagy Ov-synch-szerűen MT. 98
Select Synch: Ez az Ov-synch lerövidített változata, ahol a PGF2α után nincs második GnRH injekció és fix idejű MT, hanem ivarzásdetekció alapján termékenyítenek. Heat-Synch (az EU-ban tilos, mert ösztrogént használ!): 0. nap GnRH, 7. nap PGF2α, 8. napon Ösztradiol, 10. napon fix idejű MT. Az ösztrogén nagy koncentrációban GnRH csúcsot (surge) indukál, ami ovulációhoz vezet. 4. Ivarzás-szinkronizálás és ciklus indukció gesztagénekkel A progeszteron „mesterséges sárgatestként” fog viselkedni és gátolja az ovulációt (az LH csúcs kialakulását). Az eltávolítást követően a hypothalamus felszabadul a gátlás alól, fokozott gonadotrop hormon kiáramlás indul el (rebound hatás) és az aktuális tüszőnövekedési hullámból ovulációra alkalmas stádiumú follikulus fejlődik. A gesztagének képesek előzőleg anösztruszos állatokban is ivarzást és ovulációt indukálni, mert a fenntartott hipotalamikus blokk hirtelen megszűnése (amikor megvonjuk a progeszteront) a korábban kevésbé aktív GnRH-neuronok fokozottabb működését is váltja ki. A gesztagének hatására kiváltott ivarzás sokkal kisebb százalékban lesz csendes; jól kifejezett tünetek kísérik az ivarzást (ami anösztruszos tehenek indukciójánál fontos, mert ha detekció alapján termékenyítünk, akkor ez kívánatos)! A gesztagéneket hordozó/tartalmazó/leadó eszközök (pl. fül implantátum, hüvelybe helyezhető szivacs/implantátum) eredetileg tartalmaztak ösztrogénszármazékot is (pl. ösztradiol-valerát, stb.). Okok: luteolizis kiváltása, a P4 hipotalamusra kifejtett negatív visszacsatoló hatásának támogatása, az FSH-szint alacsonyan tartása. Ez utóbbi azért fontos, hogy a tüszőnövekedési hullámok ne tudjanak eljutni késői szelektált/domináns tüszőig, mert ezek a P4 miatt bár nem fognak tudni ovulálni (nem lehet LH-csúcs) viszont néha napokig perzisztálhatnak mielőtt atretizálnak és ez a tanulmányok szerint rontja a kezelésre adott választ. Az ösztrogének alkalmazását élelmiszer-termelő állatokban azonban az EU-s szabályozás tiltja! Ezért Európában csak az ösztrogént nem tartalmazó, kizárólag
99
P4-et tartalmazó implantátumok /hüvelybe helyezhető eszközök (szivacs/implantátum) használhatók. A húsmarhákban a gesztagének alkalmazása a leggyakorlatiasabb szinkronizáló és ivarzás indukáló technika, mert ez igényli a legkevesebb munkát (nem kell sokszor kezelni az állatokat). Gyakran használják szoptató anösztruszos hústehenekben az ivarzás indukciójára (hogy postpartum 60 napon belül ovuláljon és lehessen fedeztetni/MT). Tejelő tehenészetekben Magyarországon inkább Ov-synch alapú protokollokat használnak, de a világ egyéb tájain ugyanúgy elterjedtek a gesztagén kezelések is (mert az USA-ban pl. lehet használni az E2-t is tartalmazó eszközöket!). Applikálási módok: hatásmechanizmus azonos! • Hüvelybe helyezhető CIDR (Controlled intravaginal drug release, Y alakú)
•
Hüvelybe helyezhető PRID (Progesterone releasing intravaginal device, spirál alakú)
•
Bőr alá helyezhető implantátum
Lehetséges alkalmazások: A CIDR és a PRID is természetes progeszteront tartalmaz. Hüvelybe helyezésükhöz speciális eszköz áll rendelkezésre. A PRID hagyományosan tartalmazott egy ösztadiol kapszulát is, ma már azonban enélkül hozzák forgalomba Európában (a luteolizis PG beiktatásával megoldható). A spirál alakú PRID kicsit jobban irritálja a hüvelyt, mint a CIDR. A bőr alatti implantátumok főleg Norgestomet-et (szintetikus gesztagén) tartalmaznak és egyes termékekhez (Pl. Crestar / Norgestomet / Chronogest) az implantátum mellett injekciót is be kell adni (norgestomet + ösztradiol-valerat), ez azonban ösztradiolt is tartalmaz, ezért az injekció mellőzésével lehet ezt a készítményt csak használni Európában. A CIDR-t 7 napig kell bent tartani, de ajánlott a kivétel előtti napon (6.) prosztaglandin injekciót is adni, hogy az esetlegesen meglévő sárgatestet luteolizáljuk. Ezt követően ivarzásdetekció alapján lehet termékenyíteni, de lehetőség van fix idejű MT-s protokoll használatára is (MT ~kb. 50 órával a CIDR eltávolítása után).
100
A PRID-et hagyományosan 10 napig kel bent hagyni és a 9. napon ugyancsak prosztaglandint kell adni. Ezt követően ivarzásdetekció alapján vagy a 48. és 72. órában 2x-i fix MT-vel lehet termékenyíteni. (A bőr alatti implantátumot is 9-10 napig szokás bent hagyni és a kezelés 1. napján egy P4+E2 tartalmú injekciót is kellene adni, amit az ösztradiol tartalom miatt az EU-ban nem szabad használni. A kivétel előtt itt is kell PGF2 alpha, különösen ha nem kezelünk ösztradiollal.) A CIDR és PRID alkalmazása lehetséges kombinációban is az Ov-synchel Ilyenkor pl. a 0. napi GnRH injekcióval egy időben teszik be az intravaginális eszközt és a 7. napon veszik ki, amikor beadják a prosztaglandin injekciót az Ov-synch részeként. Ezután a 9. napon következik a GnRH + MT (vagy Cosynch esetén a 9. napon MT). Ez nyilvánvalóan drágább, de egységesebben reagálnak a tehenek. A kóros folyamatok áttekintése
I.
Az involúció szövődményei tehénben
II.
Elfekvéssel járó anyagforgalmi kórképek az ellés körüli időszakban
III.
A petefészek-működés zavarai az ellést követő időszakban
IV.
Mykotoxinok hatása a szaporodásra
A méhelőesés a háziállatok közül leggyakrabban a tejelő és a húshasznú szarvasmarhában fordul elő az ellést követő néhány órában. Ekkor a cervix még teljesen nyitva van, a méh kifáradt és atónusos és így előeshet a hüvelyen keresztül. Az előesett méhet le kell mosni, majd fertőtleníteni és végül vissza kell helyezni (az aprócska invaginációkat ki kell egyengetni). A péra összeöltése segíthet megelőzni az ismételt előesését. A hüvelyelőesés kövér állatokban a vemhesség utolsó trimeszterében jelentkezhet. Megoldás: lásd fent. I. Az involúció szövődményei Mind a 4 kórkép elsősorban tejelő tehenekben okoz óriási gazdasági problémát! Sporadikus puerperális metritisek persze húshasznúban is előfordulhatnak, főleg nehézelléssel kapcsolatban. A klinikai endometritis viszont alig jelent problémát. 101
1. 2. 3. 4. 5.
Magzatburok-visszamaradás Puerperalis metritis Klinikai endometritis és pyometra Szubklinikai endometritis Az involúciós időszak vizsgálatainak szervezése tejelő tehenészetekben
1. Magzatburok-visszamaradás (MBV) Tehénben a magzatburkoknak legkésőbb az ellést követő 24 órán belül el kell távoznia. Ennek hiányában magzatburok visszatartásról beszélünk. Számos dolog állhat a hátterében (indukált ellés, császármetszés, stb.), amitől kifejezetten gyakorivá válik az előfordulása tehenekben. Ikerellés, nehézellés, genetikai prediszpozíció is hajlamosíthat a magzatburkok késleltetett leválására. Azért probléma, mert a méhben maradó magzatburkok kiváló táptalajt szolgáltatnak baktériumoknak, azok elszaporodására, így az MBV hajlamosít puerperális metritisre és a gyulladásos folyamatok révén kihat a petefészek ellés utáni aktivitására is (késve lendül újra ciklusba a tehén). A visszamaradt magzatburok általában kilóg a tehén hüvelyéből, aminek erőltetett eltávolítása azonban semmiképpen sem javasolt! A komolyabb problémák elkerülése érdekében egyébként is nagyon sok helyen/telepen post partum nem nyúlnak a hüvelybe (hisz ez nem a leghigiénikusabb megoldás), hanem hagyják, hogy a burok szép lassan magától eltávozzon, elsősorban prosztaglandin injekciót követően. Tehát az újabb felfogás szerint jobb, ha nem nyúlunk a tehén hüvelyébe, csak uterotonikumot (=prosztaglandin/oxitocin) adunk az állatnak (minden nap egyszer, amíg eltávozik a magzatburok) és hagyjuk, hogy a burok néhány napon belül leváljon magától. Ha nagy része már kijött, akkor a hüvelyből kilógó burok nagyobbik részét le kell vágni és várni kell, hogy magától eltávozzon (a cél, hogy a méh csak minimális szöveti traumának legyen kitéve, és ha késve is, de a burok „fiziológiás-szerű” körülmények közt távozzonl). Melyik az ideális uterotonikum? Sokak szerint a prosztaglandin. Ezt naponta egyszer adva hatékonyan elő lehet segíteni a burok eltávozását! Az oxitocin is használható (vannak telepek ahol ezt adják), de inkább csak az ellés utáni 24 órán belül hat amikor még nem beszélünk MBV-ről. Újabb tanulmányok a PGF2a-t preferálják. Vannak azonban, akik azon a véleményen vannak, hogy a 102
prosztaglandin szintek eleve magasak az ellés utáni időszakban, ezért kérdéses, mennyire lehet erre még gyógyszeresen rásegíteni. Hagyományosan antibiotikumot is szoktak adni az MBV-s teheneknek intrauterin méhtabletta formájában (főleg tetraciklin típusú). Ehhez viszont bele kell nyúlni a méhbe (ami viszont nem számít higiéniás megoldásnak). Kutatások bizonyítják viszont, hogy parenterális antibiotikumok is pontosan ugyanolyan hatásosak és nem kell a hüvelyen keresztül be kell nyúlni a méhbe. Nem feltétlenül kell a magzatburkos tehénnek rögtön a második napon antibiotikum (hagyományosan ekkor szokták behelyezni a méhtablettát megelőzésképpen). Prosztaglandin készítmények önmagukban elégségesek az MBV menedzsmentjéhez az ellést követő 2-3 napban. Ha azonban ezt követően sem ment el még a burok (amikor kijön az elletőből a tehén, és nem mehet termelő csoportba, hanem betegbe kell rakni) és esetleg már szisztémás tünetek is vannak, akkor meg kell kezdeni az antibiotikumos kezelést, parenterálisan adagolva az AB-ot (pl. III. gen. cephalosporin), tovább prosztaglandint is adjunk. 2. Puerperális metritis (PM) Akut, szisztémás tünetekkel járó méhgyulladás, ami az esetek többségében az ellést követő 10-14 napban (de max. a 20-ig) jelentkezik. Könnyen diagnosztizálható a barnás-vöröses, bűzős, vízszerű hüvelykifolyás és a szisztémás tünetek alapján (elesett, bágyadt, nem eszik, lázas – ezt hőmérőzéssel, vagy a rektális vizsgálat során érezni lehet, hogy nagyon meleg az állat!). Súlyosabb esetekben a tejtermelés is jelentősen visszaeshet és akár az állat elhullásához vezető szeptikus sokk is kialakulhat. A puerperális metritisre nyilvánvalóan hajlamosít minden folyamat, ami a méh lumenének fokozott bakteriális kontaminációjához hozzájárul (nehézellés és ellési segítségnyújtás, MBV, postpartum hüvelyvizsgálat, stb.). A PM-es esetekből leggyakrabban kitenyészthető kórokozók az Trueperella (Arcanobacterium) pyogenes, az E. coli (és más coliformok) illetve a Fusobacteriumok (és anaerob társaik, pl. Bacteriodesek). Ezek mindegyike egyébként az ellés közben kerül a méh lumenébe (számos más baktériumfajjal együtt), a kérdés csak az, hogy melyik bizonyul közülük a legellenállóbbnak, melyik tud kolonizálni és méhgyulladást kialakítani/okozni. A klinikai endometritishez képest az a különbség, hogy az involúció későbbi szakaszában a coliformok szisztematikusan eltűnnek majd és minimális lesz a kóroktani szerepük a CEMben. A Trueperella pyogenes és a Fusobacteriumok együtt hatnak. A T. pyogenes termel növekedést elősegíti faktorokat a Fusobacteriumok/Bacteroidesek 103
számára, ezek meg leukotoxinok termelése révén elősegítik az Trueperella méhbeli kolonizációját (mert pusztitják a neutrofileket). A puerperális metritis esetében parenterális antibiotikummal kell kezelni az állatot. Hagyományosan főleg oxitetraciklin-t használtak, azonban az évtizedek alatt fokozódott a rezisztencia vele szemben és manapság a III. generációs cefalosporinok (pl. ceftiofur) az elsőként választandók (jók a Gram pozitívakkal és negatívakkal szemben egyaránt, ami nagyon fontos, mert a T. pyogenes +, a többi főleg -). Azt viszont tudni kell, hogy az ebbe a csoportba tartozó gyógyszereket (bár magát a ceftiofurt nem) a humán orvoslás is széles körben használja. A széles körben történő állatorvosi használat viszont elkerülhetetlenül elősegíti a velük szemben a rezisztencia kialakulását. Természetesen ettől még ez a választandó szer, de mindig gondolni kell antibiotikum esetében arra, hogy humán orvosi tekintetben miként befolyásoljuk ezzel a rezisztenciát! Az antibiotikum mellett egyébként prosztaglandin készítményt is szoktak adni, hogy elősegítsék a lochia ürülését az uterotonikus hatása révén. 3. Klinikai endometritis (CEM) Szisztémás tünetekkel nem kísért, de gennyes vagy mucopurulens hüvelykifolyással járó kórkép, ami az involúció 21. napjától kezdve jelentkezik. Az eseteknek csak kb. 60%-ában látható egyből a gennyes hüvelykifolyás, sok állatban viszont rektális masszázzsal kell kipréselni a kórjelző értékű váladékot. Ha így sem ürül, akkor még az is előfordulhat, hogy kis mennyiségű a váladék és csak vaginoszkópiával látható (valamint van egy erre kifejlesztett eszköz, a Metricheck – egy fém pálca-szerű eszköz, amit a hüvelybe tolva és visszahúzva, ki tudjuk nyerni a vaginából a gennyet, ha van, így vaginoszkópia nélkül is látjuk a kifolyást még nem mutató egyedekben, hogy van-e CEM vagy sem). Azért fontos ez, mert így detektálható a hüvelyben lévő (nem kifolyó) genny! Az involúciónak ebben a szakában már nem annyira az MBV, nehézellés, stb. jelent kockázati tényezőt (bár valamilyen mértékű késői hatása nyilván ezeknek is van), sokkal inkább a méhbeli relatív immunszuppresszió, ami késlelteti a baktériumok „eltakarítását” és így prediszponál az endometrium gyulladására. Két fő dolog állhat ebben az időszakban az immunszuppresszió hátterében. (1) A tejtermelés a laktáció 4-6. hetében éri el a csúcsát, ezért az ekkor még mindig negatív energiamérlegben lévő tehén ketózisos lehet, a vérglükóz szintje alacsony, s a rossz metabolikus háttér rontja a neutrofilek funkcióját is (amiknek a méhet kellene tisztítani). (2) Ha viszont a tehén metabolizmusa már kezd helyrerázódni, 104
akkor egy jó telepen az állatok felének már a 20. nap körül lehet ovulációja, tehát következményesen CL-je is. A sárgatest által termelt progeszteron viszont kifejezetten immunszuppresszív, így bennük emiatt lehet, hogy egyesekben lassabban lesz „kitakarítva” a méh. Az involúció 20. napját követően legfontosabb kórokozóként a T. pyogenest és a Gram-negatív anaerobokat (Fuso/Bact) kell említeni. Ha ezek ekkor még mindig kitenyészthetők a méhből, az szinte biztosan szubfertilitáshoz vezet a későbbiekben (még ha nem is nyilvánul meg klinikai endometritisben), valószínűleg a krónikus gyulladás tüszőnövekedésre kifejtett közvetett gátló hatása miatt, ami késői ciklusba lendülést eredményez (a gyulladásos mediátorok hatnak a hipotalamuszon – közvetve a GnRH neuronokon - és a tüsző granulosa sejtjein is). A méhnyálkahártya gyulladása azt is jelenti, hogy annak élettani funkciója károsodik. Ismert, hogy az endometrium a felelős a luteolitikus PGF2α szintéziséért. A gyulladt méhben ez csökkent mennyiségben termelődik, s ez a már ciklusba lendült állatok esetében elégtelen luteolízishez és perzisztáló CL kialakulásához vezethet. Perzisztáló CL jelenlétében kialakulhat az endometritisnek egy speciális formája, az ún. pyometra is, ami azt jelenti, hogy a progeszteron szorosan zárva tartja a cervixet, ezért nem tud kiszivárogni a gennyes váladék, helyette felhalmozódik a méhben. Ilyen esetekben a kitelt méh rektálisan tapintható (+ CL a petefészken). Háttérinformáció a PGF2 alphához: A PGF2a egy általános gyulladásos mediátor, ami a gyulladásos szövetekben is termelődik. Kérdés, hogy akkor az endometritis miért vezet csökkent luteolízishez? Azért mert a gyulladt méhfalban keletkező inflammatórikus prosztaglandin nagy része helyileg felhasználódik, és ami még megmarad, az pillanatok alatt lebomlik, így nincs esélye megfelelő mennyiségben az ellenáramlásos rendszerbe jutni és elérni a petefészket, ahol beindíthatná a luteolizist. Ló esetében a gyulladásos folyamatok miatt a prosztaglandinnak kifejezett luteolitikus hatása lehet, mivel bennük nincs ellenáramlásos rendszer, így a prosztaglandinnak a szisztémás keringés révén kell eljutnia a CL-hez, ami feltételezi, hogy a PGF2a lassabban metabolizálódik a szervezetben és a CL is érzékenyebb. A fentiek miatt egy colitis, elhúzódó endometritis vagy laminitis, stb esetén is luteolizisen mehet keresztül a CL a lóban (lásd a lovas részt). Tehát, ha az involúció második felében (>21 nap) végzett vizsgálatok során gennyes hüvelykifolyás tapasztalható (klinikai endometritis), akkor 105
antibiotikummal kell kezelni az állatot (a cél, hogy hatékony legyen a fő kórokozók ellen és a méh anaerob környezetében is hasson). Ennek legelterjedtebb módja az intrauterin Metricure kezelés. Másik lehetőség, hogy parenterális ceftiofurral (III. gen cefalosporin) kezelik a CEM-es teheneket intramusculárisan. A Metricure egy műanyag katéter, amit bevezetnek a méhbe és a végére illesztett fecskendőből benyomják a méhbe az antibiotikumot, ami egyébként első generációs cefalosporin (cefapirin). Az első generációs cefalosporin főleg Gram+ baktériumok ellen hatékony (tehát az egyik fő kórokozóra, a T. pyogenesre jól hat), emellett viszont jól hat a méh anaerob környezetében is, s elég jó hatása van a másik fő csoport, a Fusobacterium/Bacteroides ellen is, annak ellenére, hogy azok Gram negatívak. Összességében a Metricure és a parenterális kezelés egyaránt jól működik. Ha a CEM mellett sárgatest is tapintható a petefészken (lehet akár pyometra is), akkor mindenképpen kell adni prosztaglandint is, hogy elindítsuk a luteolizist. Tehát a PG kezelés megszűnteti a CL-t, és ezzel együtt a progeszteron termelést + a méhbeli immunszuppresszív környezetet, de emellett uterotonikumként is számíthatunk rá, vagyis segíti a gennyes váladék eltávozását. Vita tárgyát képezi, hogy CL hiányában érdemes-e prosztaglandint adni vagy sem, mert egyesek szerint pusztán az uterotonikus hatása nem segít olyan sokat. Mindezek ellenére nagyon sokan javasolják használatát uterotonikumként! A CL regresszója utáni tüszőnövekedési fázisból származó ösztrogén immunstimulánsként hat és segíti a méh regenerációját.
4. Szubklinikai endometritis Az involúciónak ugyanabban az időszakában jelentkezhet, mint a klinikai endometritis (tehát a 21. naptól kezdve, de az involúció befejeződése után is lehet). A szubklinikai endometritis azonban nem jár együtt gennyes hüvelykifolyással (sem rektális masszázzsal, sem vaginoszkóppal nem detektálunk ilyet). Ennek megfelelően a klinikai tünetek hiányában csak és kizárólag citológiai mintavételt követően (Cytobrush kefével a méh lumenéből vett minta megfestése után) a kenet mikroszkópos vizsgálatával diagnosztizálható. A
106
kritérium az, hogy a sejtek több mint 18%-a (21-33. napok közt), ill. több mint 10%-a (az involúció 34. napjától) neutrofil granulocyta legyen a kenetben! Tekintetbe véve, hogy csak citológiával lehet diagnosztizálni, a gyakorlatban ritkán kerül diagnosztizálásra (Cytobrush). Ha nem látható genny az állaton (pératájék, fartájék, stb.) egészségesnek nyilvánítják! A probléma az, hogy egyes tanulmányok szerint a tehenek nagy százalékában lehet citológiai vizsgálat alapján szubklinikai endometritis-t diagnosztizálni a 40-60. nap között. Erre az időre az összes tehéntől elvárjuk az első ciklusát. Ezeknél az eseteknél tapasztaljuk azt, hogy ivarzik az állat és MT, de nem vemhesül, ezért nő a termékenyítési index vagy repeat breeder lesz, esetleg nem is ivarzik magától a 60. napig és gyógyszeresen indukálni kell az ivarzást. Összefoglalva: a szubklinikai endometritis igen fontos, de „láthatatlan”, alattomos tényező, ami elnyújthatja a szervíz periódust! Tehenek vaginitise Előfordulhat, hogy klinikai endometritissel együtt, vagy attól függetlenül gyulladást detektálunk a tehén hüvelyében is (ezt ugyanúgy okozhatják környezeti kórokozók). Nehéz elkülöníteni a klinikai endometritistől, mert ugyanúgy lehet gennyes váladékozás, de itt igencsak kipirult a hüvely nyálkahártyája is. Ha nincs látható kifolyás, rektálisan se masszálható ki genny és vaginoszkóppal/Metricheckel sincs genny, de a hüvely nyálkahártyája eléggé kipirult, akkor pl. jódos oldattal (egy vödör víz+egy kis fertőtlenítő) át kell öblíteni a hüvelyt, ami általában megoldja a problémát. 5. Az involúciós időszak vizsgálata tejelő tehenészetben A legtöbb tejelő tehenészetben heti rendszerességgel (általában heti egy alkalommal) kell elvégezni az ún. ivolúciós vizsgálatokat, amikor az involúció különböző stádiumában lévő teheneket megvizsgálják és ellenőrzik, hogy a méhek visszaalakulása időarányosan megfelelő-e. Minden tehenet illik legalább 2x ellenőrizni/megvizsgálni az involúciós időszak alatt. Egyszer a 1012. nap körül, majd a 20-30. nap között is. Minden esetben ellenőrizni kell, hogy van-e gennyes hüvelykifolyás, milyen a méh mérete (megfelel-e a méh visszaalakulása/involúciója az elléstől eltelt napok számának /időarányosan/).
107
Azokat az állatokat, amelyeknél gennyes kifolyás látható kezelni kell Metricurral vagy szisztémás antibiotikummal (+ mérlegelni kell a prosztaglandin alkalmazását is, annak ismeretében, hogy van-e CL). Az involúciós vizsgálat egyébként remek alkalom arra, hogy pl. egy vizeletcsíkkal ellenőrizzük a tehenek energetikai állapotát (van-e ketonuria ill. acidózis), és szükség esetén parenterális vagy orális (drencselés) kiegészítést is adhatunk. Az involúciós időszak végéhez közel, valamikor a 40-50. nap között ismét megvizsgálják az állatot. Ilyenkor már nem az involució ellenőrzése az elsődleges cél, hanem a ciklus ellenőrzése. Ahhoz azonban, hogy idáig eljussunk az involúciós gondokat ki kell szűrni és időben elkezdeni a kezelést. Mitől lehet elfekvő („Downer cow syndrome”) egy tehén közvetlenül az ellés után (1-2 napon belül)? A legfontosabbak: Diagnosztika: Láz van-e? , Keton/glükóz/Ca szint ellenőrzése? (1) Ellés előtt elhízott – zsírmájas - ketózisos; (2) Ellési bénulás; (3) Szeptikus Trauma? puerperális metritis; (4) Szeptikus coliform mastitis; (5) Ellés közbeni traumás sérülések (idegek sérülése vagy csonttörések, ízületi problémák)
II. Anyagforgalmi kórképek az ellés körüli időszakban 1. Zsírmáj betegség A máj elzsírosodása szarvasmarhákban leggyakrabban az ellés körüli időben fordul elő, mert az utolsó trimeszter és a laktációs csúcs olyan energiahiányos állapotok, amelyek erre prediszponálják az állatokat. A mindennapi életben nem diagnosztizálható ez a kórkép - (nincsenek egyértelmű és specifikus tünetek, nem önállóan fordul elő, általában a rossz kondícióban / rossz állapotban lévő tehenek egyéb pathológiás állapotainak a hátterében húzódhat). Májbiopsziával (vagy boncolással) lehet csak igazolni, ilyenkor látjuk/tudjuk megállapítani a májelzsírosodás mértékét. Ezen kívül legfeljebb a vér NEFA (non108
esterified fatty acids)- ill. BHB (β-hidroxi butirát)-koncentrációinak mérése alapján lehet következtetni a májelzsírosodásra (bizonyos referenciaérték felett indikatívak), de az egyedek között nagy eltérések tapasztalhatók, ezért csak standardizált időpontokban és módszerekkel vett, szakképzett ember által értékelt eredmény segíthet felmérni, hogy az állományunk (vagy egyes egyedek) mennyire veszélyeztetett ténylegesen a zsírmáj betegséggel. FONTOS!!! Minden tényező, ami relatív energiahiányt/energiahiányos állapotot okoz a tehénben, az együtt jár a zsírsavak májban történő lerakódásával. Miért? Azért, mert energiahiány alakul ki, nincs elég vérglükóz, ezért zsírsavat kell égetni, illetve glükoneogenezis indul be. A zsírsavak (NEFA) főleg az adipocyták lipolíziséből származnak és egyes szövetek elégetik őket, mások azonban glükózt igényelnek. Ezért a máj glükoneogenetikus vegyületekből (pl. oxálacetát) glükózt épít fel. Azzal, hogy az oxálacetát a citrátkörből a glükoneogenezisbe megy, csökken a citrátkör acetil-koA felvevő képessége (mert az oxálacetát kötné ezt meg és így lenne citrát). A máj képes lenne elégetni a zsírsavat, ezért fel is veszi őket a vérből, és béta-oxidációval acetil-koA-vá bontja őket, viszont ezek a citrátkör csökkent felvevő képessége miatt nem tudnak elégni vízzé és széndioxiddá, hanem a májsejtekben felhalmozódnak. A sok acetil-koA ketontesteket (pl. BHB) képez, melyek a vérbe jutva az éhező szövetek fontos energiaforrásai. Közben folyamatosan érkezik zsírsav a májba és bár a máj igyekszik lebontani a zsírsavat a béta-oxidáció keretében, a felhalmozódó zsírsavak folyamatosan észterifikálódnak is a hepatocitákban (lipogenesis trigliceriddé), és azok elzsírosodását okozza. Ezek a trigliceridek ezután elméletileg LDL-be épülve visszamehetnek a perifériára a zsírraktárakba, szarvasmarhában azonban ez az export a többi fajhoz képest igen lassú, ezért a tehén, a többi fajhoz képest, sokkal hajlamosabb/veszélyeztetettebb a zsírmájra (májelzsírosodásra), ami ha egyszer kialakult, csak több hét alatt oldódik, amikor már visszament pozitív energiamérlegbe az állat. Összességében a szarvasmarha ketonémiája és májelzsírosodása tehát egymástól igazából elválaszthatatlan folyamatok, minden zsírmobilizációs jellegű állapotban bekövetkeznek kisebb nagyobb mértékben. FONTOS!! A szárazonállás alatt elhízott tehenek sokkal hajlamosabbak az ellés utáni zsírmájra/májelzsírosodásra (mert a korábbi plusz takarmányozás / a korábban adott, az indokoltnál több takarmány miatt a leptin szint felmegy, így nem akarnak enni az állatok, ugyanakkor az energiára nagy szükség lenne/van az intenzív tejtermelés beindulása miatt, ezért megindul a zsírmobilizáció…stb). Az 109
ellés körül amúgy is minden tehénben intenzíven megindul a NEFA-mobilizáció a hormonális változások miatt (ilyenkor fiziológiásan is igen magas NEFA értékek lehetnek) és egy kövér tehénben ez igen kifejezetté válhat. Azonban nem lesz minden kövér tehén zsírmájas és nem csak a kövérek lehetnek zsírmájasak. FONTOS!! Az ellés körüli májelzsírosodás (ami tehát közvetlenül nem látható, max. a vér NEFA és BHB alapján lehet következtetni a kialakulására) hajlamosít egy későbbi klinikai endometritisre, oltógyomor helyzetváltozásra, megkésett ciklusba lendülésre vagy klinikai ketózisra. 2. Vemhességi toxaemia A bántalom kialakulásának háttere nagyon hasonló az ikervemhes kiskérődzőkben, ill. sok magzattal vemhes szukákban diagnosztizált állapotéhoz. Az utolsó trimeszterben a magzati fejlődés energiaigényét az anya nem tudja fedezni, ezért zsírmobilizáció és ketonaemia lesz. Ugyanolyan következményekkel, mint a laktáció alatti ketózisban, csak ez sokkal intenzívebb, mert az anyai szervezet mindenáron fedezni akarja a magzati igényeket, míg a később tárgyalandó laktációs ketózisnál az energiahiány következtében a tejtermelés csökkenhet, így részben enyhítve a helyzetet. Ez a probléma a TMR-el etetett tejelő tehenekben igazából nem fordul elő. Maximum húshasznúaknál jelentkezhet sporadikusan, vagy igen gyenge takarmányozás esetén állományszinten (de összességében ritka!). A betegség kialakulására utal, hogy a magas vemhes állat rövid időn belül láthatóan veszít a kondíciójából, nem akar enni, elfekvő lesz a végén pedig görcsök és komatózus állapot következik (emellett pedig ketonémiás). Boncoláskor zsírmája is lehet (érthető, hiszen durva relatív energiahiánya volt). Egyedi kezelésként koncentrátum etetése (ha még eszik) vagy iv. glükóz jöhet szóba, amennyiben még időben észlelik a probléma kialakulását. 3. Ellési bénulás Elsősorban a tejhasznú tehenek ellését követő 1-3 napon belül kialakuló, láztalan, elfekvéssel járó generalizált petyhüdt bénulásról van szó. Gyakrabban fordul elő multipara tehenekben és Jerseyben gyakoribb, mint Holsteinben. A hátterében a tejjel történő óriási kálcium-veszteség áll. 110
A tehenek eleinte ataxiásak, nyugtalanok, majd terápia nélkül elfekszenek, tachycardia lesz, végül komatózus állapotba kerülnek és elpusztulnak. A kezelés i.v. kálcium-glükonát infúzió (lassan! Kardiotoxikus), ami mellé magnézium és foszfor kiegészítést is ajánlott adni. Gyorsan reagálnak az állatok a kezelésre (felállnak, keringésük helyre áll, minimális mértékű izomgörcsök lehetnek, ahogy visszarendeződik az izomfunkció). FONTOS!! A megelőzésre kell fektetni a hangsúlyt! Egy jól menedzselt telepen nem szabad előfordulnia az ellési bénulásnak. Megoldás: csökkent kálciumbevitelt kell biztosítani a szárazonállás alatt, illetve a Ca/P arányt 1.5-2.5 / 1 környékén kell tartani, így nem lustul el a parathormon. Ez működik is, de valószínűleg fontos az ellés környéki időszakban az is, hogy a pH viszonyok milyenek a tehénben. Újabban azt gondolják, hogy főleg a tehén takarmányok magas kálium koncentrációja miatt az ellés körüli időszakban a legtöbb tehén metabolikus alkalózisban van és ilyen körülmények közt a parathormon működése sem ideális. Emiatt a szárazonállás alatt sok kukoricaszilázst javasolnak, mert ez csökkenti a vér pH-t tehénben (ennek van az elérhető takarmányok közül a legkisebb K-tartalma). Sőt van, aki már odáig megy, hogy a lucerna jó a szárazonálló tehénnek (amiről eddig mindenki azt mondta, hogy tilos, mert magas a kálcium koncentrációja), mert úgy néz ki, hogy ez is segít helyretenni a pH-t és a nagy kálcium konc. ellenére nem biztos, hogy rossz. Összességében a lényeg: nem szabad sok kálciumot adni a szárazonálló tehénnek + el kell kerülni a K gazdag táplálást, mert ez elléskörüli alkalózishoz vezet(het), ami prediszponál az ellési bénulásra a parathormon receptorok érzékenységének megváltoztatása révén. D-vitamin készítmények adása előnyös lehet!!! pl. i.v. vagy szubkután az ellést megelőző időszakban. 4. Klinikai és szubklinikai ketosis A klinikai ketózisos esetek az ellést követően két fő „hullámban” fordulnak elő tejelő tehenekben. A szárazonállás alatt kövérre hízlalt állatokban általában közvetlenül az ellés után alakul ki klinikai ketózis, azért mert nincs nagy étvágyuk, helyette zsírmobilizációból próbálják fedezni a tejtermelés energiaszükségleteit. A 111
másik nagy csoport pedig inkább a laktáció 4-6. hetében, a laktációs csúcs elérésekor produkálhat klinikai ketózist, és ez főleg azzal függ össze, hogy nem kap a tehén elegendő energiaforrást a TMR-el, ahhoz hogy a nagy tejtermelést ebből fedezni tudja (különösen veszélyeztetettek a kiugróan magas termelésű egyedek). A biokémiai folyamatok ugyanazok, amit a zsírmájas összefoglalónál leírtunk. A klinikai ketózis tünetei pedig csökkent tejtermelés, bágyadtság, kifejezett kondícióvesztés, elfekvés, idegrendszeri tünetek és végül komatózus állapot és elhullás. Intenzíven tejelő állományokban a klinikai ill. szubklinikai ketózisnak igen komoly gazdasági hatása van, ugyanis lényegében minden laktáló tehén prediszponált erre a kórképre az ellés utáni első 40 napban. Elkerülhető a bántalom előfordulása, ha (1) nem hízlaljuk 3.5 fölé a tehenet szárazonálláskor (illetve már előtte is odafigyelünk erre, mert a szárazonállás általában már késő, hogy jelentősen csökkentsük a kondíció) és (2) maximális takarmány-bevitelre kell törekedni (max. TMR) a csúcslaktációkor. Persze emellett is lesznek egyes tehenek, amelyek így is ketózisosak lehetnek (és főleg gyakori a szubklinikai forma!) a 4-6. hétben, ugyanis a kialakulás hátterében nem minden tényező ismert. A pontos diagnózis a vér/vizelet/tej emelkedett BHB/aceton/acetoacetátkoncentrációja és csökkent vércukorszint alapján lehetséges (valamint az emelkedett NEFA is indikatív). Azonban nem csak a klinikai ketózisos eseteket kell diagnosztizálni, hanem észre kell venni az állományban megjelenő szubklinikai ketózisos (tehát még nem mutat klinikai tüneteket!) egyedeket is és kezelni kell őket! A klinikai ketózis természetesen csak a jéghegy csúcsa, ugyanis a csúcslaktációban lévő tehenek elég nagy része szubklinikai ketózisos! Amit csak úgy lehet észrevenni, ha az involúciós vizsgálatokkal egyidőben megnézzük a tej/vér/vizelet acetoacetát/aceton/BHB-szintjét, amit gyakorlati körülmények közt talán legpraktikusabban vizeletből lehet megnézni tesztcsíkkal (az előregyártott csíkokon van aceton- vagy acetoacetát-uriát jelző sáv). Van számos más kereskedelmi forgalomban kapható gyorsteszt is, melyek valamelyik típusú ketonanyagot mutatják ki általában tejből vagy vizeletből. Az acetoacetát és aceton általában jobban kimutathatók tejből, mint vizeletből (tehát ha vizeletcsíkkal vizsgálunk és pozitív az már egy fokkal intenzívebb ketonuria). A BHB 112
elsősorban tejből/vérből mutatható ki és magasabb is a koncentrációja a tejben, mint a másik kettőé, ezért előbb jelzi a ketózist (szenzitívebb). Mindent egybevetve azonban a szubklinikai ketózis megállapítására legérzékenyebbek a vérvizsgálatok (BHB szérumból). Azonban ezt érthető okokból nem lehet a napi rutinban használni, viszont alkalmanként / tájékoztató jellegű állomány-szintű vizsgálatra ez nagyon jó (jól felszerelt laborok ezt elvégzik, pl. egyetem). A mindennapi életben az állat melletti tej/vizelet tesztek hasznosak és bőven megfelelőek is. Marhában a többi fajjal ellentétben egy enyhébb ketonaemia nem jelent egyből metabolikus acidózist is, mert ketoacidózis csak az előrehaladottabb esetekben fordul elő. Ezért ha pl. vizelet csíkkal ketonuriát találunk, de nincs mellette acidózis (ezt is látnánk a csíkon), akkor egy enyhébb esetről van szó. Ilyenkor a szubklinikai ketózisos teheneket pl. Duphalyte-os szubkután injekcióval (glükóz, aminósavak, stb.) és dexamethasonnal (glükoneogenezist fokozza majd) jól lehet kezelni (de drencselni is lehet). Ha a szubklinikai ketózis (gyakorlati körülmények között tehát van ketonuria vagy határérték feletti tejketon) mellett aciduria is van, az súlyosabb esetnek számít és nem árt, ha az előbbiek mellett szájon át is kap koncentrátumot (drencselés = szonda és ezen keresztül adjuk a vízben feloldott propilénglikol). Látható, hogy a tejelő állományban elég jól lehet menedzselni a szubklinikai ketózist. Ha mégis lesznek klinikai esetek, akkor mielőbbi i.v. glükózt kell adni + dexamethazon. De ha már komatózus, akkor rossz a prognózis, viszont egy nem régóta elfekvő tehén esetében esetleg eredményes lehet. ÖSSZEFOGLALVA, TEHÁT ÉSZRE KELL VENNI A SZUBKLINIKAI KETÓZIST! Ez ugyanis nemcsak klinikai ketózisban csúcsosodhat ki, de az energiahiány miatt késlelteti a ciklusba lendülést és prediszponál oltó helyzetváltozásra is (+ általában picit az átlagnál kevesebb tejet is termelnek). Érdemes itt bevezetni az önkéntes várakozási idő fogalmát, ami azt jelenti, hogy egy tejelő telepen mennyi időt várnak, hogy a tehénnek magától ivarzása legyen az ellést követően, mielőtt gyógyszeres kezeléssel ivarzást/ciklust indukálnának. Ha a tehénnek nincs megfigyelt ivarzása kb. az 50-60. napig (teleptől is függ, hogy a szapbiológiai protokolljukban milyen határidő szerepel). Ha ezen belül nem ivarzik, poszt partum anösztrusz-ról beszélünk. III. A petefészek ellést követő működési zavarai
113
1.
Látszólagos anösztrusz az ivarzásdetekció hiányosságai miatt („szubösztrusz”)
2.
Valódi post partum anösztrusz
3.
Cisztás petefészek betegség
1. Látszólagos anösztrusz az ivarzásdetekció hiányosságai miatt („szubösztrusz”) Számos post partum anösztruszt mutató tejelő tehénnek normális, ciklusban működő petefészke van, azonban alig vagy egyáltalán nem mutatja az ivarzás (külső) jeleit, vagy jól ivarzik és mutatja az ivarzás tüneteit, csak az ivarzásmegfigyelés nem jól működik. Tehát azok a tehenek, amelyek időben ovulálnak az ellés után (értsd: kb. 60 napon belül), de mi nem vesszük észre a tüneteket valamilyen okból, ide tartoznak. Sajnos sokkal gyakorabban fordul elő, mint a valódi post partum anösztrusz (lásd később)! Az egyre növekvő tejtermelés fordított arányban áll az ösztrusz tünetek intenzitásával, így a legtöbb modern tehenészetben ez komoly problémát jelent. Az ivarzásdetekciós technikák javításával, pontosításával csökkenteni lehet a látszólagos anösztruszok számát, a gyakorlatban viszont nyilván mindenki azt hiszi, hogy az ő ivarzásdetekciója hibátlanul működik és az összes ilyen tehenet valódi anösztruszosnak gondolják. Ezért általában ezek a tehenek is kapnak Ov-synchet, ami végülis nem rossz, mert ezzel fix időben lehet termékenyíteni, ivarzás-detekciótól függetlenül, tehát lényegében áthidaljuk a problémát. Viszont egy kifinomultabb (pl. pedométer) telepi ivarzásdetekciós rendszer nagyon sok pénzt hozhat közvetve a konyhára, mert a szerviz periódus telepi átlaga csökkenthető, ha a szubösztruszos teheneket pontosabban lehet detektálni. Ez viszont pénzbe kerül, igaz x idő alatt megtérülhet a befektetés.
114
2. Valódi post partum anösztrusz
Jól menedzselt tejelő tehenészetekben az állatok kb. 50%-a már az ellést követő 20. nap körül ovulál, a 40. napig pedig a tehenek 90%-a már legalább egyszer ovulál. Más kérdés, hogy az első ivarzás gyakran csendes (P4 hiány). Az 50-60. napig (telepi menedzsmentől függ, hogy mennyi az önkéntes várakozási idő, mikor avatkoznak be) még mindig van ideje a tehénnek, hogy ciklusba lendüljön. Amelyik viszont idáig nem teszi és nem azért, mert mi rosszul detektálunk(!), az tekinthető valódi anösztruszosnak (az állományok kb. 5%-a). Húshasznú tehenekben a 40. nap körül csak az állatok 30-40%-a kezd ivarzani, hiszen náluk a szoptatás (ennek is a frekvenciája fontos!, hogy naponta hányszor szopik a borjú) gátolja a GnRH-csúcs kialakulását. Fiziológiásan az várható el, hogy az 50-60. nap körül kezdjen ciklusba lendülni a hústehenek többsége (általában ekkorra csökken a szopások frekvenciája annyira, hogy már nem gátol). Viszont az évi egy borjúhoz a 60. nap körül már fedeztetni/MT-i kell, mert pl. MTvel nem biztos, hogy elsőre vemhesül és így még a második termékenyítéssel is időhatáron belül leszünk/lehetünk (1 év). Ezért húsállományokban gyakran rutinszerűen kezelik progeszteront leadó CIDR-el/PRID-el/implantátummal a 40. napig nem ivarzott állatokat, hogy a 60. nap környékéig biztosan legyen első ivarzásuk, amikor fedeztethetők/MT-ők. Az eszköz eltávolításakor a borjú időszakos elválasztása (1-2 napig) az anyától, kifejezetten javítja a hústehenek válaszkészségét. A post partum időszakban az 50-60. napig nem ivarzó tehenek 4 fő csoportba sorolhatók, aszerint, hogy milyen képleteket lehet találni a petefészkeiken. Follikulus növekedés folyamatosan van, de ezek nem fejlődnek nagyobbra a korai harmadlagos tüsző stádiumnál, hanem igen kicsik maradnak (néhány milliméter, tehát UH-val is teljesen inaktívnak tűnnek a petefészkek) és korán atretizálnak. -
115
Ez valószínűleg olyan tehenekben fordul elő, melyek még az 50-60. nap körül is komoly negatív energiamérlegben vannak és emiatt a GnRH pulzusfrekvenciájuk nagyon alacsony. A pp. anösztruszos tehenek egy csoportjában folyamatosan eljutnak a harmadlagos tüszők a szelektált stádiumig (10-12 mm), de innen nem tudnak preovulatórikussá fejlődni. Ezért a petefészken folyamatosan megtalálhatók közepes méretű tüszők, de ezek atretizálnak és nagy preovulatórikus follikulus nem lesz belőlük. Ez lényegében azt tükrözi, amikor a tehenek már túl vannak a negatív energiamérlegen, de valami miatt (pl. a tüszők elégtelen E2 produkciója; nem megfelelő parakrin növekedési faktor produkció…stb) még nem „fut” végig egy ciklus zavartalanul. Ugyanez megy végbe minden tehénben a pubertás előtt és ez a szakasz megtörtént a 40. napra ivarzókban is, mielőtt eljutottak az első ovulációig, csak korábban. Egyes tehenek follikuláris ciszták miatt nem ivarzanak (lásd később). Mások pedig már ovuláltak egyszer, csak nem vettük észre, viszont perzisztens corpus luteum maradt vissza és emiatt nem tud újra ivarzani (lásd később). Amiről a húsmarháknál az előző oldalon szó volt, hogy fiziológiásan később lendülnek ciklusba, az lényegében azt jelenti, hogy az 50-60. nap körül a 2-esnek megfelelő képleteket találunk a petefészkeken (a szoptatás még gátlólag hat, viszont szép lassan maguktól is rendbe jönnének). A húsmarhákban ezt nagyon jól lehet menedzselni (felgyorsítani) a 40. nap után adott gesztagénnel és a borjú időszakos leválasztásával. A 2-es típus tejelő pp. anösztruszos tehenekben is lehet, de bennük általában a teljesen inaktív, vagy cisztás, vagy CL perzisztens /állandosult/ formák (1totálisan inaktív, 3-cisztás, 4-perzisztens CL) is sokkal gyakrabban fordulnak elő (ez főleg a lezsarolásukkal van összefüggésben (rossz energetikai állapot, korábbi méhgyulladások hatásai…stb). A gyakorlatban a tejelő tehenészetekben az inaktív petefészkű (1-es típus) vagy tüszőnövekedést mutató, de nem ovuláló (2-es típus) teheneket az önkéntes várakozási idő után kivétel nélkül Ovsynchel kezelik. Természetesen lehet használni CIDR-et vagy PRID-et is, sőt akár a CIDR+Ovsynchet is (lásd korábban), de Magyarországon az Ov-synch a legelterjedtebb, ami jól is működik. 116
Azonban azt tudni kell, hogy egy teljesen inaktív petefészkű, még negatív energiamérlegben lévő, lezsarolt, 1-2-es kondíció pontú tehénen az Ov-synch se fog nagy valószínűséggel működni, amíg rendbe nem hozzák a takarmányozását. Mivel a húshasznú állományokban az energiahiány nem jelent olyan nagy problémát (szemben a tejelőkkel), a szoptatás miatti anösztrusz viszont igen!!, ezért a gesztagén kezelés+borjú időszakos választása náluk a korábbiakban leírtaknak megfelelően igen fontos a gazdaságos menedzsment szempontjából. Perzisztens corpus luteum: Ahogy arról korábban az involúciós szövődményekkel kapcsolatban már szó volt, perzisztens CL leggyakrabban valamilyen méhbeli patológiával van összefüggésben, ekkor ugyanis akadályozott lehet az endometrium prosztaglandin termelése, s így a luteolízis. Ez a probléma állományszinten elsősorban az involúciós időszakban jelent problémát (20. nap körül), amikor a klinikai endometritis előfordulhat! Az 50-60. napon detektált posztpartum anösztruszos tehenekben már nem. Mindazonáltal vannak olyan tehenek, akiknek az önkéntes várakozási időszak végéig nem volt detektált ivarzásuk, így nem voltak inszeminálva, ezért a meddőségi vizsgálat során CL-t detektálnak a petefészkükön (tehát már ovulált). Megoldás: prosztaglandinnal kezelni. Mérlegelendő azonban, hogy a tehénnek rendes ciklusa van-e (csak csendesen ivarzik és emiatt nem detektáltuk/vettük észre), vagy még régebben ovulált egyet, amit nem detektáltunk, és abból fennmaradt egy perzisztens CL és azóta tényleg nem ivarzott vissza. 3. Cisztás petefészek betegség A petefészek ciszták tehénben >20-25 mm-es képletek (egyes esetekben 5-10 cm is lehet), melyek óriási gazdasági veszteséget okoznak tejelő tehenészetekben (az üres napok számának növelésével). Húshasznú állományokban kisebb a jelentőségük. Mi áll a háttérben? Egyértelműen pozitív kapcsolat figyelhető meg a fokozott tejtermelés és a ciszták kialakulása között. Azonban nincs egyértelműen azonosított ok, valószínű számos hatás befolyásolja/áll a háttérben. A bántalom kialakulásában tejelő tehénben fontos szerepet játszik az energetikai állapot (negatív energiamérleg), ami az inzulin és IGF-1 szintek befolyásolása 117
révén a tüszőfejlődésre is hatással van (hiszen ezek a granulosa sejtek növekedési faktorai). Ugyanígy a méh postpartum gyulladásos betegségeivel (pl. klinikai endometritis) és magzatburok-visszatartással is összefüggésbe hozható a ciszták gyakori előfordulása nagy tejtermelésű tehenekben, továbbá meghúzódhat a hátterében genetikai prediszpozíció és takarmányozási anomália is (pl. β-karotin deficiencia). A petefészek ciszták lehetnek luteális (posztovulatorikus) illetve follikuláris (preovulatorikus) eredetűek. Rektálisan ezeket elkülöníteni szinte lehetetlen. UHval viszont látható, hogy a luteális ciszták fala vastagabb, mint a follikuláris eredetűeknek. Az üreges sárgatestek is nagyon hasonlóak, a hagyományos CL-től csak UH-val különíthetők el. Összességében a follikuláris ciszták sokkal gyakoribbak, viszont ezek falában is mindig bekövetkezik kisebb-nagyobb mértékű luteinizáció. A cisztás petefészkű állatok mutathatnak fokozott ivarzási tüneteket, nymphomániát, rendszertelen ivarzást vagy teljes anösztruszt is – lásd az anösztrusz csoportosítását az előző diákon (a luteális ciszták főleg ez utóbbit okozzák). A ciszták előfordulása állományszinten nagyon gyakori az involúció 20-30. napja környékén ill. ezt megelőzően, amikor a tehenek többsége elkezd ciklusba lendülni. Az első ovulációt megelőzően valószínűleg sok tehénben van egy-egy ciszta-szerű képlet, azonban ezek többsége spontán elmúlik. Ezt az időszakot különben az állatorvos nem is látja annyira át, mert az involúció alatt úgysem szokás kifejezetten nagy figyelmet fordítani a petefészek képletekre! Az állatorvosok főleg azokat a cisztás teheneket látják, amelyeknek a 42. napot követő vizsgálatok során is cisztát találnak valamelyik petefészkén és emiatt nem ivarzanak rendesen. A gyakorlatban ha cisztát találnak a tehén petefészkén, akkor GnRH-val kell kezelni! Miért GnRH? Mert ez LH-csúcsot fog indukálni, ami kiváltja a ciszta ovulációját, majd egy 17-18 napos luteális fázis után újra ivarzik a tehén. Mi történik a luteális cisztákkal? Azt várnánk, hogy a luteális ciszta adekvát terápiája (ugyanúgy mint a CL, üreges sárgatest esetében) a prosztaglandin. Ez így is van (működik), de a gyakorlati tapasztalat az, hogy a GnRH is jó a luteális ciszta kezelésére, és hatékony a follikuláris ciszta terápiájára is! De tudni kell, hogy a 118
PGF2α a jó megoldás a luteális ciszta esetében, amit azonban egy telepen/a gyakorlatban csak akkor lehet szelektíven alkalmazni, ha vér/tej progeszteron koncentráció vagy UH alapján egyértelműen kijelenthető, hogy luteális cisztáról van szó. Ezért a gyakorlatban GnRH-t használják (itt nem kell a megerősítés). Egyébként a GnRH alternatívájaként hCG-t is alkalmazhatunk, ami ugyan olyan jó, mert ez is kiváltja az LH-csúcsot. Másik megoldás: a GnRH után folytatjuk Ovsynch-el (a többi meddő tehénnel együtt), s így a kezelés utáni 10. napon termékenyíthető már a tehén. A manuális lezúzást (annak ellenére, hogy sokan még ma is alkalmazzák) nem javasolja a szakirodalom!! Nem azért mert 1-1 leírt eset van, hogy elvérzett utána az állat (nagyon kicsi az esély erre), ha nem a repesztés helyén, a vérzés miatt kialakuló hegszövet és letapadások, összenövések komoly kockázatot jelentenek, ami után lehet, hogy végleg meddő lesz a tehén. FONTOS: a cisztát ne repesszük fel!!! A gesztagén kezelés mellékhatása cisztás petefészek kialakulása lehet. Bár a legtöbb kereskedelmi forgalomban kapható készítmény (pl. CIDR, PRID) úgy van dozírozva, hogy ez ne legyen probléma. (Ugyanis elsősorban szuboptimális P4 cc. mellett alakulhatnak ki follikuláris ciszták, annak köszönhetően, hogy a gesztagén blokkolja a GnRH neuronokat, így nincs LH-csúcs, de ha kicsit alacsonyabb a koncentrációja a szükségesnél, akkor nem blokkol eléggé ahhoz, hogy a fejlődő tüszők hamar atretizáljanak, s egyesek preovulatórikus stádiumban megrekedhetnek.) IV. A mykotoxinok hatása a szaporodásra Zearalenon (F2-toxin – Fusarium fajok termelik): Mivel a tehén bendője elég jól lebontja a takarmánnyal felvett mikotoxinokat, így az F2-toxint is sokkal jobban tolerálja, mint pl. a sertés. Üszők a teheneknél kicsit érzékenyebbek, de így is nagyon ritka, hogy látványos hatása legyen a mikoösztrogéneknek a szarvasmarha szaporodására (reprodukciós teljesítményére). Elméletileg azonban korai embrionális veszteséget okozhatnak, mert az ösztrogén hatás alatt álló méhnyálkahártya nem megfelelő az embrió befogadására (implantáció), illetve elvileg lehetségesek cikluszavarok is (pl. perzisztáló follikulusok, cisztás képletek). De nem látványos! 119
Sertéshez képest viszont relatíve nagyobb lehet a szerepe a növényi ösztrogéneknek, mert lucernát simán etethetnek nagy mennyiségben marhával. A DON (deoxinivalenol)-nak és T2 toxinnak (Fusarium fajok termelik őket) közvetve az immunszuppresszív tulajdonságuk révén lehet hatásuk a szaporodásbiológiai teljesítményre (csökkent tejtermelés, rosszabb involúció pl.). Ugyanígy egyébként az Aspergillusok által termelt aflatoxinoknak (és esetleg ochratoxinoknak) közvetett hatásuk lehet a szaporodásbiológiára. Ez megnyilvánulhat pl. abban, hogy toxikusak az embrióra és az ovulált petesejtekre is. Szarvasmarha állományokban viszont soha sem fog a mikotoxikózis olyan egyértelmű tüneteket mutatni, mint sertésben!! Sokkal inkább valószínű, hogy a fokozottabb, hosszabb ideig tartó mikotoxinterhelés esetén romlanak az állomány szaporodásbiológiai mutatói, hosszabb lesz a szervízperiódus, nő a két ellés közti idő. Nagy gazdasági kárt okozhat!
A szaporodásbiológiai gondozás rendszere tejelő és húshasznú állományokban 1. Tejelő állományok
•
15 hónapos korig termékenyíteni kell az üszőket, hogy megelljenek 2 éves korukra.
•
Termékenyítést követően kb. 28. napon korai UH-os vemhességi diagnosztika (hetente egy meghatározott napon végzik a vemhességi vizsgálatokat)
•
Általában van még egy második manuális rektális vemhességi vizsgálat is a 60-70. nap körül (hogy észrevegyék nem történt-e vetélés/késői embrionális mortalitás miatt).
• •
Majd egy utolsó a szárazra állításkor
•
Az ellést követő 1-2 napon belül a magzatburok visszatartást kell ellenőrizni és kezelni Az involúció alatt legalább 2x kell vizsgálni a teheneket (a 12. és a 20-30. nap körül), hogy kiszűrjük a méhgyulladásokat, szubklinikai ketózist és kezeljük az 120
•
érintett állatokat. Az involúciós vizsgálat is hetente egy napra van beütemezve a tejelő tehenészetekben A 42. nap körül van egy újabb involúciós vizsgálat. Ekkorra már befejeződik az involúció és a tehenek többségénél már aktív petefészeknek kell lennie. Ilyenkor már a petefészek van a vizsgálat középpontjában. Az ivarzókat inszeminálni kell, a sárgatest esetében luteolizist indukálunk, cisztát gyógyszeresen repesztjük, stb.. A hatékony ivarzásdetekciós rendszer megléte a telepen kiemelkedően fontos ebben az időszakban.
•
A meddőségi vizsgálatok az önkéntes várakozási idő leteltével (50-60 nap körül) válnak aktuálissá. Azokat a teheneket kell megvizsgálni, amelyek nem ivarzottak/nem termékenyítették/nem vemhesültek. Meg kell nézni a petefészkeket, aktív/nem aktív, van-e rajta képlet, ha igen mi van rajta, van-e ciszta/CL, a diagnózisnak megfelelően kezelni kell az állatot. A meddő (anösztruszos) teheneknél el kezdeni az Ov-synch kezelést.
•
Az Ov-synch kezelés alatt/után automatikusan termékenyíteni kell a teheneket. Egyesek persze ezután se vemhesülnek, repeat breederek újraújra visszajönnek meddőségi vizsgálatra.
•
Minden kezdődik előlröl, ha sikerült vemhesíteni a tehenet. 2. Húshasznú állományok
Általánosságban elmondható, hogy kevesebbszer látja állatorvos a teheneket, mert kevesebb a probléma is. Miért: nincs a nagy tejtermelés, kötetlen tartás, több mozgás, amelyek együttesen nagyban hozzájárulnak ahhoz, hogy kevesebb a szaporodási probléma. Egyebek:
• •
Üsző termékenyítés, vemhesítés hasonló a tejelő tehenészetekhez.
•
A magzatburok visszatartás itt nem szokott gondot jelenteni. A szoptatás miatt olyan mértékű oxitocin felszabadulás van, hogy az nagyban elősegíti a burkok eltávozását.
•
A szisztematikus involúciós vizsgálatok sem szükségesek hústehenekben, pontosan az oxitocin involúciót segítő hatásai miatt. Egyedi puerperális metritis esetek előfordulhatnak, ekkor az érintett állatokat kezelni kell. A
UH-os korai vemhességi diagnosztika, majd egy ismételt későbbi időpontra ütemezett manuális rektális vizsgálat hasonló a tejelő tehenészetekhez
121
klinikai endometritis nem jelent tényleges problémát, mert a húshasznú tehenek nem fognak ovulálni a 20. nap körül.
•
A 40. nap körül viszont állományszinten kezelni kell a teheneket gesztagénekkel (CIDR, PRID vagy implantátum), hogy „kiemeljük” őket a laktációs anösztruszból. A gesztagén megvonását követően a borjút 1-2 napra időszakosan le szokás választani, mert ez segíti a ciklus beindulását.
•
Így az 55-60. napra majdnem minden tehén ivarzik (persze előfordul egy-egy cisztás, stb., de ez minimális a meddő tejelő tehenekhez képest). Ekkor elkezdődik a fedeztetés, termékenyítés.
•
Így biztosítani lehet, hogy legkésőbb a második ciklusában (max. a post partum 80. nap körül) minden tehén vemhesüljön és ez kell az évi egy borjú előállításához (285 nap vemhesség + 80 nap =365 nap).
A sertés szaporodása Összefoglalás (a ciklus hossza 21 nap)
•
Pubertás ideje: 5-6 hónapos korban, de tenyésztésbe vétel csak a 2-3. ciklusban (~210 napos kor), mivel az ovulált tüszők száma a 3. ciklusra éri el a maximumát
•
Nemi ciklus: Nem szezonális, poliösztruszos állatfaj (de a meleg nyári hónapokban csökken a fertilitás – „nyári meddőség”, ami részben a hőstressz miatt van, részben azért, mert enyhe fokú nyári anösztruszt a házisertés örökölt a vaddisznótól)
• • • •
Ösztrusz/ivarzás hossza: Átlagosan 50 óra (2.0 nap) Ovuláció időpontja: Az ivarzás utolsó harmadában (kb. a 36-44. órában) Embriók leérkezése az uterusba: A fertilizációt követő 2. napon Vemhesség anyai felismerése: Az embriók által termelt E2 (a vemhesség 1112. napján). Méhszarvanként legalább 2-2 embrió kell a vemhesség fennmaradásához.
122
•
Placenta típusa: Placenta diffusa (anatómiailag), placenta epitheliochorialis (szövettanilag)
•
Vemhesség hormonális háttere: Végig corpus luteum dependens (csak az ellés előtti emelkedő glükokortikoid szint indukálja az endometrium prosztaglandin szintézisét, s így a luteolízist)
• •
Vemhesség hossza: 114 nap
•
Involúció hossza: kb. 21-28 nap
Ellés utáni újra ciklusba lendülés időpontja: Általában a választás után 4-10 nappal. (laktációs anösztrusz: a PRL gátolja a nagy frekvenciájú GnRH szekréciót!).
A telepi menedzsment legfontosabb paraméterei Választott malac/koca/év (cél: 25-30 malac) – két fő összetevője:
•
Választott malac/alom (ezt befolyásolja az élve született malacok száma/alom és a választást megelőző mortalitás) – jó célérték a 10
•
Fialások száma/koca/év (befolyásolja a vemhesség hossza, a választás időpontja és a választást követően üresen töltött napok száma): 2,3-2,4 (2,5 a biológiai maximum!)
A profit szempontjából fontos, hogy mikor veszik tenyésztésbe a süldőket. Ideálisan 210-220 napos életkorban (a 2-3. ivarzáskor, mert az első ovuláció általában még nem eredményez maximális számú petesejtet)! A szaporodásbiológiai menedzsment szempontjából lényeges a választás időpontja is. Ez reproduktív szempontból ideálisan az ellést követő 21-28. nap között történik, rendszertől függően (a korai választás nem hoz jobb eredményt, sőt fokozódik az embrionális mortalitás, mert a teljes involúcióhoz minimum 21 nap szükséges! Ezért az USA-ban egyes helyeken alkalmazott 12-14 napos választás – betegség-megelőzésként – nem javasolt!)
123
Kocákban a választás természetes módon szinkronizálja az ivarzást - többségük a választás után 5-6 napon belül ivarzik, optimális esetben elsőre termékenyül, és nem tölt a szükségesnél több napot üresen (de átlagosan 1.5-2.5-ös az index). A malacok 20. napot megelőző, vagy a 40. nap utáni elválasztása esetén a ciklikus nemi működés újraindulása 5-6 napnál tovább tart, ezért ezek a választási rendszerek nem javasolhatók. Ivarzás indukció süldőknél Fontos a 210-220. nap körüli termékenyítés elérése süldőknél, ekkorra már legalább másodszor kell búgniuk. Az első ivarzás indukálásának egyik legjobb módja a „kocsikáztatás”, ugyanis a 6 hónapos süldők kb. 70%-a szállítási stresszre (pl. egyik istállóból a másikba) néhány napon belül ivarzással reagál. Tovább fokozható az ivarzók aránya, ha ebben az időben kan jelenlétét („kanhatás”) is biztosítják (vagy kanspray-vel imitálják) naponta 10-15 percre, különösen, ha újonnan leválasztott kocákkal közös helyiségbe kerülnek a prepubertális süldők, ekkor ugyanis a szociális hatások (főleg feromonok révén) a választott kocák 5-6 napon belül újrainduló ciklusához szinkronizálják a süldők első ivarzását! Ezáltal biztosítható, hogy a legtöbb süldőnél 185-190 napos életkor körül megtörténjen az első ivarzás. Így a második (vagy ha nagyon korán érő, akkor esetleg már a 3.) ivarzás épp a kívánt 210-220. nap köré esik! Ezeket a technikákat számos sertéstelepen alkalmazzák a szaporodási mutatók javítása érdekében. A tenyészsüldők kiválasztása a kifejezett növekedési erélyük (ez mutat a legjobb korrelációt a korai pubertással), felépítésük, a csecsbimbók száma és elhelyezkedése, ill. anyjuk korábbi teljesítménye alapján történik. Ilyenkor hízó- és süldőtáp keverékét ad libitum etetik 70-90 kg-os korukig (3-5 hónapos), ezután speciális tenyészsüldő-tápot kell etetni. Az állomány utánpótlásra szánt süldőkből akkor szoktak selejtezni, ha 130-140 kg-os súlyban még nem kezdtek el ivarzani, ill. ha az egymás után következő három ivarzáskor végzett termékenyítésből sem vemhesültek (+ persze ha egyéb mozgásszervi bajuk van). Ivarzás és ivarzásdetekció Egy sertéstelepen mindennapos program az ivarzók keresése, a megfelelő életkort betöltött süldők és a választott kocák közül. 124
A keresés jellemzően keresőkanokkal történik (a telepi dolgozók minden reggel végigmennek az istállókon a kocával és a kan jelenlétében próbálják kiváltani a lordosis reflexet = hátalási próba /tűrési reflex/). Egyes helyeken naponta kétszer van ivarzásmegfigyelés. A koca/süldő csak az ösztrusz alatt áll meg kan jelenlétében a hátára kifejtett nyomás hatására, a proösztruszban nem (bár ekkor már kicsit kipirult, duzzadt lehet a péra, de ezek a tünetek főleg az ösztruszban kifejezettek). A koca/süldő egyébként kan hiányában is megáll a hátalási próbára, de csak az ösztrusz közepén, az ovuláció körüli időszakban. Ezért van, hogy a gyakorlatban keresőkan jelenlétében nézik a lordosis próbát, mert ekkor az egész ösztruszban pozitív lesz a tünet (nemcsak egy részében), és így könnyebb detektálni az ivarzást! Ha nincs kan, akkor kanspray-vel (szintetikus androgént – feromon tartalmaz) ki lehet váltani hasonló hatást, de nem lesznek olyan pontosak a detektálás eredményei, mint kannal. A sertés ösztruszának hosszára kb. 50 órás átlagot jó megjegyezni (2-3 nap), de ez meglepően széles határok között mozoghat! Az viszont elég standard, hogy az ovuláció az ösztrusz 2/3-ánál következik be. Mivel nehéz pontosan eltalálni az ovuláció időpontját, amihez a legjobb eredmények érdekében időzíteni kell a termékenyítést (mert nem tudjuk, hogy az adott állat ösztrusza éppen milyen hosszú lesz), ezért a gyakorlatban 2x-i termékenyítés terjedt el, félnapos időközzel. Termékenyítés A sertéstelepeken jellemzően mindig tartanak néhány kant is, mivel a sertésondó nem fagyasztható jól, tehát a süldők és kocák inszeminálását főleg a helyben levett és ott higított, 16-18 fokon tárolt spermára alapozzák (a nagyüzemekben nincs természetes fedeztetés). A süldőknél egyszerű a szisztéma (náluk kisebb a variabilitás is az ösztrusz hosszában), ha már legalább másodszor búg életében, és ezt ma reggel detektálták, akkor délután, majd másnap reggel termékenyítik. Legtöbb helyen ugyanezt a protokollt alkalmazzák a választott kocáknál is (amelyik reggel búg, azt délután és másnap reggel berakják). Érdekes megfigyelés, hogy a választást követően minél később búg a koca, annál rövidebb lesz az ivarzása (tehát a detektálás időpontjához képest hamarabb következik be az ovulációja!). 125
Ennek alapján javítani lehet a termékenyülési arányt, a következő logika szerint haladva:
- Ha a választás utáni 4. napon reggel búg a koca, akkor másnap reggel és ugyanaznap délután rakják be.
- Ha az 5-6. napon reggel búg, akkor aznap délután és másnap reggel rakják be. - Ha a 7-8. napon reggel detektálják, akkor azonnal berakják és még aznap délután megismétlik. A megfelelő időpontot eltalálva egyetlen termékenyítés is elég volna, mivel az ovulációt megelőző 24 órán belül végzett egyetlen MT is kiváló fogamzást produkál. Ezt azonban telepi viszonyok között nehézkes kivitelezni. Bár újabban GnRH-analóg gyógyszerekkel ovulációt lehet indukálni (lásd később), egyelőre a legtöbb helyen marad a 2x-i MT. Vemhességi diagnózis A sertés vemhessége átlag 114 napos. Az embriók korán, már a 2. napon lejutnak a méhbe, de csak a 13. naptól kezdődik meg az implantáció (a köztes időszakban vándorolnak ide-oda a lumenben). Ezt megelőzően, a vemhesség anyai felismeréséhez már a 11-12. naptól szükséges az embrionális eredetű ösztrogének jelenléte, aminek feltétele, hogy legalább 4 (méhszarvanként 2-2) embrió legyen a méh lumenében. A korai embrióelhalás elsősorban a fent leírt időszakban, tehát az első 2-3 hétben jelentős, ekkor a házisertésben 20-30% veszteség is előfordulhat (részben fiziológiás az embrióredukció, mert vaddisznóban is több tüsző ovulál, mint amennyi malac végül megszületik, főleg a méh korlátozott befogadóképessége miatt). A fokozott mértékű mortalitás alomszám csökkenésben és vagy (ha mind elhalt) ciklushosszra, vagy kicsit későbbi időre visszaivarzásban nyilvánul meg. Legfontosabb okai: a nyári hónapokban a hőstressz miatti embrió reszorpció, vagy - túlzott energiabevitel hatására - bármikor bekövetkezhet, ezért ha flushingolják a sertést (mert lehet!), akkor a termékenyítést követően vissza kell állni a normál etetésre! A vemhesség fenntartásáért végig a corpus luteum által termelt progeszteron felelős! A vemhesség diagnózisa: 126
•
Vissza nem ivarzók keresése (Mivel az UH-nál előbb mutatja a nem vemhes állatokat, ezért a termékenyítettek között mindig végeznek a keresőkannal való detekciót is. Ha nem ivarzik vissza, jöhet a 30. nap körül az UH, hogy biztos legyen a diagnózis!)
•
Vér progeszteron szint mérése (nem gyakorlatias egy sertéstelepen, meg nem is specifikus, de egyébként a 17-18. nap után érdemes csak elvégezni, mert a nem fogamzottaknál ekkor kezd el csökkenni a progeszteron)
•
Transzabdominális (nem rektális!) ultrahang – ez a legelterjedtebb és a legbiztosabb is! Telepi menedzsmenttől függően, de a 25. naptól már nagyon biztos eredményeket ad!
•
(3 módszerre még szoktak hivatkozni, de ezeknek a gyakorlati jelentősége csekély: (1) ösztron-szulfát mérése vérből; (2) rektális tapintással a 4. héttől érzékelhető az arteria uterina media fremitusa vagy (3) hüvelybiopszia)
•
Az viszont érdekes, hogy PG-600-at (hCG+eCG, lásd később is) adva a sertésnek a feltételezett vemhessége 20. napja után (tehát ha eddig nem ivarzott vissza), segíthet diagnosztizálni a vemhességet. A vemhesekben ugyanis az injekció semmit sem okoz, mert a petefészkük nem válaszol az eCG+hCG-re, elvileg a vemhességre sem hátrányos. Üresekben viszont néhány napon belül visszaivarzást indukál! A sertés ellése, laktációja
A megelőző 24 órában nyugtalan lesz, és megindul a tejelválasztás (mint más fajokban…). A malacok általában 10-15 percenként születnek meg, a magzatburkok pedig az utolsó malac után 4 órán belül el kell, hogy távozzanak. Az egész ellés 2-5 óráig tart. A halvaszületés jobb helyeken 5 %-on belül marad. Egyébként az elletős jelenléte nagyon sokat számít, mert átlag 1-el több élő malacot produkálnak így a kocák! A nehéz ellés (dystocia) sertésben nem túl gyakori, ha előfordul, akkor az elletős manuálisan általában világra tudja segíteni a malacot (minél több idő telik el, annál rosszabbak az esélyeik azoknak a malacoknak melyek még bent vannak). Oxitocint elakadáskor ne adjunk!
127
Gyakoribb probléma a másodlagos fájásgyengeség (kifárad a koca), amin oxitocinnal segíthetünk (persze Ca is adható, de ezt nem szoktak). Egyes telepeken a fájásgyengeség megelőzésére – helytelenül - rutinból oxitocint adnak a kocáknak, hogy gyorsabb legyen az ellés. Sertésben a visszamaradt magzatburkok (nem gyakori) vagy malacok az ellést követően szisztémás tünetekben is megnyilvánuló puerperális metritist okozhatnak. Antibiotikumra azonban a kocák meglepően jól gyógyulnak. Dajkásítás: sertéstelepen túl kicsi vagy túl nagy almok esetén gyakran átcsoportosítják a malacokat a más kocákhoz, hogy mindegyiknek legyen esélye a jó/kiegyensúlyozott fejlődésre. Általában 11-12 malac felett (a fölösleget) és 5-6 alatt (az összeset) szoktak dajkásítani. Így azonos létszámú almokat csinálnak, és a malacok gyarapodása is egységesebb lesz. A koca tejtermelése a laktáció 3. hete körül éri el a csúcsát. A laktáció alatti takarmányozás hiányosságai a tejtermelést csökkentve nemcsak a malacok fejlődését rontják, hanem a választást követő visszaivarzást is késleltetik, mert az állat összes tartalékát kénytelen felélni, s így a leptin szint csökken, ami viszont a GnRH pulzusfrekvenciát is csökkenti! Ezért az ellés előtt (hátszalonna vastagság alapján) 3-as - közepes/jó - kondíciót kell elérni, de túletetni sem szabad, mert akkor meg nem akar majd enni a laktáció alatt!).
A reprodukciós teljesítményt rontó tényezők sertéstelepeken
1. Anösztrusz, repeat breeding (= infertilitás) 2. Infertilitást/vetélést okozó fertőző ágensek 3. Mycotoxinok szaporodásbiológiai hatásai
128
Anösztrusz, repeat breeding = INFERTILITÁS Anösztrusz: Lehet, hogy az állat valóban nem ivarzik, de az is lehet, hogy csak gyenge tüneteket mutat („csendes ivarzás”). A csendes ivarzás felelős az esetek kisebb részéért, sertésben ugyanis gyakoribb, hogy a petefészkek teljesen inaktívak (főleg fiatal, prepubertális állatokban) vagy cisztásak. Sertésben egyébként a stressz vagy F2-toxikózis fokozza a cisztás petefészkek előfordulását (persze ezt nem lehet diagnosztizálni, csak majd a vágóhídon látják; az esetek egy részében azonban magától elmúlik.) A ciszták lehetnek soliterek vagy multiplexek. 1-2 ciszta még nem okoz anösztruszt, inkább csak fokozza a visszaivarzók arányát, de sok follikuláris ciszta már igen (az elég gyakran előforduló részleges luteinizáció és következményes P4 termelés GnRH-gátló hatása miatt). A választás időpontja befolyásolja az ivarzás újraindulásának idejét, ezért választást követő anösztrusz főleg korán választott kocákban fordulhat elő. Emellett első vemhesekben gyakoribb, mivel ők még növésben vannak és a tejtermelés mellett magukra is kell energiát fordítaniuk, tehát többet vesztenek a raktáraikból! A megfelelő korú, de még inaktív petefészkű prepubertális süldők esetén a háttérben lehet takarmányozási hiányosság vagy hőstressz. Ezeket meg kell próbálni megoldani + használni a kocsikáztatást, kanhatást, kocákkal összerakást, és ha ezek sem működnek, akkor jöhet a gyógyszeres indukció (lásd később), mielőtt selejteznénk. Repeat breeding: Amikor a sertés ivarzott és termékenyítették, de később visszaivarzik. Ez történhet a várt 21. nap körül, vagy kicsit később (25. nap körül), ez utóbbi esetében valószínűleg embrióelhalás áll a háttérben (ez persze a normális időre visszaivarzóknál is előfordulhat). A 30. nap után ritka a visszaivarzás, ezt követően, ha valami gond van, jellemzően vetélés lesz. Nyári in(szub)fertilitás:
129
Részben a hőstressz, részben a vaddisznótól származó enyhe fokú szezonalitás miatt fordul elő (késő nyár, kora ősz). Fontos kiemelni, hogy ez ritkán nyilvánul meg teljes anösztruszban. Gyakoribbak a visszaivarzások, ill. a részleges embrióelhalás miatt kis létszámú almok vannak. Fertőző ágensek Az alább felsorolt legfontosabb kórokozók korai embrionális mortalitást (és így visszaivarzást, tehát infertilitást), vetélést, halvaszületést, mumifikált magzatokat, gyenge újszülötteket eredményezhetnek.
1.
PRRS (90. napig általában nem jut át a placentán, ezért főleg késői vetélés, halvaszületés vagy gyenge magzatok + infertilitás)
2.
Sertés parvovirosis (először vemhes állatokban! Magzatsorok jellemzőek, mert a 70. nap előtt fertőződött malacok elhalnak, a többi viszont élve, egészségesen születik)
3.
Aujeszky-betegség (bármikor elvetélhet vagy embrió-veszteség és infertilitás)
4.
Klasszikus sertéspestis (az erősen pathogén törzsek okoznak főleg vetélést, a gyengébbek halott vagy satnya, perzisztensen fertőzött malacot produkálnak)
5.
PCV-2 (a vetélés főleg a vemhesség végén lehet halvaszületés + infertilitás, de a reproduktív teljesítmény romlása nem olyan jellegzetes, mint a vírus egyéb következményei)
6. 7. 8. 9. 10.
Leptospirosis (főleg a pomona szerotípus) Brucellosis (B. suis) Sertésorbánc Sertésinfluenza (a kitörések során elvetélhetnek a kocák) Japán encephalitis (mivel a flavivirusoknak a célszerve az agy, ezért a vetélt vagy halvaszületett malacoknak jellemzően hydrocephalusa van, Mo-n ez a betegség nem fordul elő)
11.
Afrikai sertéspestis Orbánc, Leptospirosis, Parvovirosis és PCV ellen indokolt vakcinázni minden állományt! 130
Mycotoxinok A sertéseket érintő mycotoxikózisok (aflatoxikózis, ergotizmus, F2-toxikózis, T2toxikózis, Fumonizintoxikózis, ochratoxikózis, stachybotriotoxikózis) közül szaporodásbiológiai következményei az F2toxikózisnak és az ergotizmusnak vannak. Ösztrogénizmus és vulvovaginitis (F2-toxikózis): A zearalenont (F2-toxint) főként a Fusarium graminearum gombafaj termeli elsősorban a szántóföldön („szántóföldi penész”), de részben raktározás közben is (búza, árpa, kukorica, stb. is kontaminált lehet). Ugyanez a faj és rokonai termelnek trichotecén-vázas toxinokat is, pl. T2-toxint, deoxynivalenolt (DON), ezek immunoszuppresszívek és nem közvetlenül a szaporodást befolyásolják. A zearalenon az ösztrogén receptorok igen potens agonistája (myco-ösztrogén), s így nagy mennyiségben reprodukálja az ösztrogén-túlsúly tüneteit. Jól látható tünetek elsősorban a választott malacokban és a prepubertális süldőkben figyelhetők meg, bennük a péra duzzadt, hyperaemiás, a fiatal süldők ivarzási tüneteket is mutatnak. Az emlők is hipertrofizálnak, a méh fala szintén megvastagodik az ösztrogén hatására, esetleg hüvelyelőesés is kialakulhat. Üres, de ivarzó süldőkben/kocákban a ciklus 12-14. napján az ösztrogén hatású zearalenon a „vemhesség” anyai felismerését váltja ki, ezért a sárgatestek fennmaradnak és az üres koca nem ivarzik vissza (anösztrusz lesz). A zearalenon növeli a petefészekciszták kialakulásának a valószínűségét is sertésben. Vemhes állatnál az ösztrogén hatás alatt álló méhnyálkahártya alkalmatlan az implantálódó embriók befogadására, s emiatt embrióelhalás következik be. A takarmányból kimutatható a toxin a definitív diagnózishoz, de gondolni kell arra, hogy a lucerna és a lóherefélék is termelnek ösztrogén-hatású vegyületeket (fitoösztrogének), így ez is lehet a háttérben.
Ergotizmus: Ha Claviceps purpurea (anyarozs) által termelt ergot-alkaloidok vannak a takarmányban, akkor dopamin agonistaként gátolják a PRL termelést az ellett kocákban, s ez agalactiához, a malacok éhezés miatti pusztulásához vezethet.
131
Az alábbi kezeléseket rutinszerűen alkalmazzák a sertéstenyésztésben, hogy javítsák a mutatókat (pl. az üresen álló napok számának csökkentése, vagy a születendő malacok számának növelésén keresztül a választott malac/koca/év mutató növelése). A valóságban ez úgy történik, hogy gyógyszercégek komplett protokollokat kínálnak a saját termékeikkel, melyek optimalizálják a termelést.
A szaporításnál használatos hormonkezelések
1. Gesztagén etetés (Regumate) 2. eCG+hCG injekció (PG-600) 3. Ovuláció indukálása GnRH analóggal 4. Fialás szinkronizálás PGF
2α –val
1. Gesztagén (altrenogest) etetése
Ciklusban ivarzó süldőkben és kocákban az ivarzás 18 napos altrenogest (Regumate porcine) etetéssel szinkronizálható (kocában rövidebb idő is elég). A kezelés a progeszteron által kiváltott anti-GnRH hatáson alapszik, ami az etetés abbahagyásával megszűnik, és 4-5 nap múlva ivarzás lesz. Így kb. egyszerre fognak ivarzani a sertések, és könnyebben lehet szervezni a termékenyítéseket. A szinkronizációra szükség lehet, amikor embrió-átültetést akarnak végezni.
132
Munkaszervezés szempontjából könnyebbség, ha az utánpótlás süldőket altrenogeszttel a választott kocákhoz szinkronizálják. Pl. ha 28. napon választanak, akkor a 10. naptól a 28.-ig közben a süldőket altrenogeszttel kezelik, így őket a kocákhoz (kocák ivarzásához) szinkronizálják, akiket viszont a választás természetes úton szinkronizál (mert mind a választás, mind a Regumate után kb. 5 nap múlva várható az ivarzás). Prepubertális süldőknek nem adjuk, nincs is semmi indikációja!
2. eCG+hCG injekció (PG-600) A két gonadotropin kombinációja elérhető a piacon (PG-600) és az FSH és LH hatás révén igen jó hatásfokkal indukál átlagosan 3-7 napon belül ivarzást! Az eCG és hCG külön injekciókban is alkalmazható, de ez alaposabb szervezést igényel a jó eredményekhez, ezért többségében a kombinációs készítményt használják telepeken. Csak anösztruszos állatoknak (süldőknek vagy kocáknak választáskor) adjuk!
•
Ha megfelelő kondíciójú süldő elmúlt 7 hónapos és még nem ivarzott, és nem tudják, hogy miért nem ivarzik (nincs hőstressz, megfelelő minőségű az etetett takarmány. stb.), akkor selejtezés előtt indokolt egy PG-600-as kezelést alkalmazni. Rossz kondíció esetén azonban a nutritív háttér olyan kedvezőtlen, hogy a PG-600 nem fog tüszőnövekedést indukálni!
•
Ha a koca választás után 8-10 napon belül nem ivarzott, PG-600-at lehet adni. (előfordulhat, hogy csendesen ivarzott és ezért CL-ek vannak a petefészkén, amikor beadják a PG-600-at, ilyenkor a kezelés nem ér semmit. Ezt nehéz kivédeni, törekedni kell rá, hogy a 10. nap előtt kapja az injekciót, mert így kisebb az esély erre. Általánosságban a PGF2α sertésben más fajokhoz képest kevésbé hatékony, mert a CL- 12 napig refrakter a prosztaglandin luteolitikus hatására!!! Így a PGF2α kezelés csak az ovuláció utáni 12. naptól képes luteolizist indukálni; a sárgatestek visszaalakulásának elindítása; erre figyelni kell!)
•
A PG-600 vemhesség ellenőrzésére is jó (a vemhesek nem reagálnak, az üresek viszont visszabúgnak)
133
Egyes sertéstelepeken a választással egy időben automatikusan benyomják a PG600-at a kocának, hogy biztosra menjenek és mielőbb mindegyik újra búgjon. Az altrenogeszt etetés abbahagyása utáni napon adott PG-600 fokozza a szinkronizáció eredményességét.
3. Ovuláció indukciója GnRH analóggal GnRH-analóg (buserelin) tartalmú készítmény, sertésre kifejlesztett injekció, melyet szinkronizációt követően lehet adni és 30 óra múlva ovulációt indukál. A kezelés révén pontosan tudjuk, hogy mikor van/lesz az ovuláció, tehát fix idejű 1x-i termékenyítéssel is jó eredményt lehet elérni. Kocák esetében a választás nagyon jó természetes szinkronizáló hatás, süldőkben viszont a buserelin injektálását megelőzően altrenogesttel szinkronizálni kell a ciklust. A választás, illetve az altrenogeszt etetés után 3.5 nappal kell adni a buserelin injekciót (tehát ha péntek délután választanak, akkor a következő kedd reggel adják a buserelint és szerda délután fix időben történik a termékenyítés – persze ellenőrizve, hogy tényleg ivarzik-e.) A sertéstelepeken egyébként általában naptárral kiszámolják a legjobb időzítéseket, mert senki nem akar vasárnap termékenyíteni! 4. Ellés indukció PGF2α-val A sertésnél nem lehet jól kihasználni a prosztaglandinok luteolitikus hatását a ciklus manipulációjára, a CL hosszú refrakter periódusa miatt! Helyette arra használják a PG-t, hogy szinkronizálják a fialásokat (mivel CL dependens végig a vemhesség!). „Programozott elletés”.
134
Miért van erre szükség? Mert a malacok túlélése szempontjából sokat számít, hogy van-e jelen elletős, aki segít, ha baj van (+ dajkásít). Ugyanakkor munkaszervezési szempontból nem szerencsés, ha a dolgozónak hétvégén is bent kell lennie. Tehát a gyakorlatban tényleg jelentősége van, hogy a kocák ellését úgy tudjuk időzíteni, hogy ne hétvégére essen! Fontos, hogy 1-3 nappal a várható fialás előtt álló vemhes kocák esetében szabad alkalmazni! A 112. nap előtt indukált ellés éretlen malacok születését eredményezi. Az állatnak beadott PGF2α 1-1,5 napon belül ellést fog indukálni! Ha még így is túl nagy az időbeli különbség az ellések között, akkor a prosztaglandin után 24 órával adott oxitocin segít még jobban beszűkíteni az ellések időpontját. (Zárójelben megjegyzendő, hogy lehetőség van prosztaglandint adni a szoptatás időszakában is, ha enyhébb-súlyosabb metritis van, vagy az involúciót szeretnénk serkenteni, bár ezt nem nagyon használják a gyakorlatban Az uterotonikus hatás mellett luteolitikus hatása is szerephez juthat, ugyanis egyes idősebb kocákban előfordulhat, hogy az elléskor nem tűnik el az összes CL, s a fennmaradó P4termelés immunszuppresszív környezetet teremt a regenerálódó méhben.)
• •
Hüvelyelőesés előfordulhat a mikösztrogének hatására.
•
Sertésben akut puerperális metritis más fajokhoz hasonlóan az ellést követő 1 héten belül szokott jelentkezni, amire hajlamosít, ha magzatburok vagy malac maradt a méhben. Ilyen eseteknél antibiotikumokkal meglepően jó eredményeket lehet elérni.
Méhelőesés ritkán (de mint bármely állatfajban) az ellést követő néhány órán belül előfordulhat.
A sertés ivarszervi kórképei
1.
Postpartum dysgalactia syndrome (PPDS) 135
2.
Mastitis
3.
Fedezés vagy MT indukálta endometritis
Sertésekben előfordulhat hermafroditizmus (intersexualitás) a pubertás körüli korban lévő süldők anösztruszának hátterében.
1. Postpartum dysgalactia syndrome (PPDS) Sertéstelepeken nagy gondot jelent, hogy a koca (főleg a fiatalok) az ellést követő 2-3 napban nem termel elég tejet (hypogalactia, vagy pontosabban dysgalactia), ezért a malacai nem fejlődnek, nő a mortalitás! Ez a probléma a legtöbb állományban a kocák 10-15 %-át érinti, tehát nagy a gazdasági jelentősége! Komplex oktanú kórkép, amit sokan sokféleképpen emlegetnek (egy másik elnevezés, amit sokan használnak a PPDS helyett, az a PHS – periparturient hypogalactia syndrome) és amiről legtöbbször nem derül ki pontosan, hogy mi van a hátterében. A patofiziológiát tekintve megjegyzendő, hogy más fajokhoz képest sertésben a PRL-szekréció kifejezetten érzékeny a gyulladásos citokinek hipotalamuszra kifejtett gátló hatására. Ezért ha bármely okból a fiziológiásnál több LPS jut a vérbe, az fokozza a TNF-α, IL-6…stb termelődését, melyek a hipotalamikus dopaminszekréció indukálása révén gátolják a PRL-leadást. („a fiziológiásnál több LPS kerül a vérbe” kifejezés arra utal, hogy mindannyiunk vérében kering belőle folyton, hisz a kommenzalista baktériumokban is van, és egy kevés felszívódik, ami hozzájárul az immunrendszer tónusának beállításához.) Honnan tud felszívódni a kelleténél több LPS? -metritises méhből -mastitises emlőből -pangó béltartalomból (konstipáció-obstipáció) -húgyúti vagy hüvelyi gyulladásból (cystitis, vaginitis) 136
A hypogalactia/dysgalactia szindróma hátterében legtöbbször a felsorolt tényezők valamelyike áll. Minden rizikófaktornak számít, ami A gyakorlatban ritkán előforduló részben hozzájárul ezekhez. ergotizmus is agalactiáthypogalactiát okoz (lásd előbb!) Pédául: -elhízott koca (mert valószínűleg jobban tele van a bele és pang a bélsara, ezért szokás rostgazdagon táplálni a vemhes kocákat) -elhúzódó fialás (metritisre hajlamosít) -a szülőút manuális vizsgálata elléskor (metritisre hajlamosít) -nagy alomlétszám (mastitisre hajlamosíthat a csecsek sérülése miatt) stb. A csökkenő PRL-leadás miatt a kolosztrum és a normál tej mennyisége is kevesebb, s mindez hozzájárul az alulfejlett, pusztuló malacokhoz (hasmenéses betegségek gyakoribbak a rossz kolosztrum ellátottság miatt)! Fontos azonban megjegyezni, hogy nagyon ritkán fordul elő tényleges agalactia (sokkal inkább csak csökkent mennyiség). Ezért a régies MMA-szindróma (mastitis-metritis-agalactia) elnevezés, amit korábban a PPDS/PHS helyett használtak, sok tekintetben hibás is hibás. Igaz ugyan, hogy a PPDS/PHS-nek gyakran áll a hátterében mastitis, ellenben metritis kifejezetten ritka, akárcsak a teljes agalactia. Ezért újabban az MMA-t csak a postpartum dysgalactia szindróma egyik változatának tekintik (amikor van mastitis is, metritis is és teljes agalactia). A háttérben lévő ok kitalálásában egyébként segíthet, hogy gyulladtak-e az emlők, van-e hüvelykifolyás, stb. A legjobb megoldás, ha az érintett kocák malacait azonnal dajkásítjuk. Ezen túl persze antibiotikummal lehet kezelni a háttérben lévő okot a kocában, plusz meg kell próbálni csökkenteni a hajlamosító tényezőket (pl. az ellési higiéniát javítani) Bár nem nemiszervi kórkép, de a kocák húgyúti fertőzéseiről (UTI-urinary tract infection) annyit, hogy leggyakoribb okozója a hüvelynyálkahártya-flóra alkotó Actinobaculum (régebben Eubacterium) suis. Ez okozza a sertések cystitispyelonephritisét, ami bármely életkorban előfordulhat, de az ellés okozta stressz és a közbeni kontamináció természetesen hajlamosító tényezőként hatnak. Már 137
csak emiatt is az ellési, ill. egész vemhesség alatti higiéniára különös figyelmet kell fordítani. A tünetek változók lehetnek, akár hirtelen elhullás is előfordulhat a felszálló fertőzés miatti pyelonephritis következményeként, de lehet, hogy csak gyakori vizelési inger van és véres-opálos vizeletet ürít az állat. Ha korán észreveszik, antibiotikumokra gyógyulhat. Természetesen az enyhébb-súlyosabb húgyúti fertőzések állhatnak a dysgalactia hátterében (lásd előbb)! 2. Mastitis Sertésben gyakran fordul elő mastitis az ellést ill. választást követő időszakban. Ki kell azonban emelni, hogy a gyakorlatban a mastitisek a dysgalactia/hypogalactia szindróma részét alkotják, és ritkán különítik el a mastitist a dysgalactia egyéb okaitól, ezért a megnevezésekben is nagy a kavarodás, de a gyulladt emlőből lokális folyamatok miatt sem ürül tej (nemcsak a ↓PRL miatt!) Kórképek, amelyeknél a mastitis miatt csökken a tejtermelés! Egy-két emlőre kiterjedő uniglandularis mastitis gyakori a sertésekben a szoptatás alatt vagy a választás után (utóbbinál főleg krónikus tályogok vagy granulomák maradnak vissza), elsősorban idősebb állatokban. A kórokozók környezeti és normális flóra alkotó mikróbák (Escherichia, Klebsiella, Staphylo, Pseudomonas, stb.). Ennek általában egyetlen jele az, hogy 1-1 malac alulfejlett (amelyik csak a gyulladt emlőhöz fér hozzá), ezt dajkásítani kell.
1.
Az akut multiglanduláris mastitis jellemzően szisztémás tünetekkel is jár. Ez kifejezetten az ellést követő 3 napon belül fordul elő, főleg sporadikusan, akármilyen jó is a higiénia (ha pedig rossz, akkor sok koca érintett). Lehet valamely szisztémás betegség (pl. Aujeszky vagy PRRS) része, de gyakrabban ugyanazok a környezeti baktériumok okozzák, mint az uniglandulárisat. Tekintve, hogy kiterjedtebb az elváltozás, itt gyakoribbak az általános tünetek (láz, elesettség, konstipáció-obstipáció), esetleg szepszisig is fajulhat. Emellett az emlők ödémásak, fájdalmasak, tömött tapintatúak. A tejleadás megszűnik, a koca összes malaca legyengül (éhezés), ami igen komoly választás előtti mortalitást eredményez. Azonnal antibiotikumot kell adni és dajkásítani kell a malacokat, továbbá feltétlenül indokolt a higiéniát javítani!
2. Előfordulhat az emlők ödémája mastitises tünetek nélkül is, főleg előhasi kocákban, ezt szokás „hard udder syndrome”-nak („kemény tőgy szindróma”) 138
nevezni. Ilyenkor nemhogy nem csökken, de inkább kifejezett lesz a tejtermelés, bár átmehet akut multiglanduláris mastitisbe, sőt ettől gyakorlati körülmények közt nehéz elkülöníteni.
3. A fedezés vagy MT által indukált endometritisSertésben előfordulhat, hogy az ivarzás kezdetekor kifejezett hüvelyváladékozás jelentkezik. Ennek hátterében jellemzően a megelőző ciklusban végzett fedeztetés vagy termékenyítés által kiváltott endometritis áll (gyakori okozó lehet a Staphylococcus hyicus vagy E. coli), ami a fertőzést követő 15-20 nap között, tehát pont a következő ösztrusz idején jelentkezik. Infertilitáshoz vezet és ez számos cikluson keresztül fennmaradhat (a hüvelyi váladékozással együtt), de egyes kocák maguktól meggyógyulnak. Amelyek nem, azokat selejtezni kell őket. Megjegyzés: a hím malacokban gyakori a lágyéksérv, amit általában a heréléssel egybekötve korrigálnak. Kanok menedzsmentje
•
Természetes fedeztetést nagyüzemekben nem használnak (ha mégis sor kerülne rá valamilyen okból, akkor 1 kan jusson kb. 25 kocára).
•
MT használata mellett 5-6 kannal (hetente 2 ugratással) el lehet látni egy nagyobb telepet is!
•
A hőstresszre és a jó takarmányozásra (különösen a kanok esetében) figyelni kell.
•
Az asszisztált reprodukciós részben nincs részletezve, de úgy tűnik, hogy technikai szempontból megoldódni látszik a sperma fagyasztás kérdése. Gyakorlati bevezetését nagymértékben gátolja, hogy használata üzemi körülmények között nem lenne gazdaságos (ma még). Ezért üzemi körülmények között még nem alkalmazzák. Jó eredményeket egyelőre csak úgy lehet elérni, ha a méhtestbe (intrauterin) vagy a méhszarvakba (deep intrauterin) deponáljuk a spermát, mert a felengedés után életképességük rosszabb, mint más 139
fajoknál. A hagyományos cervikális katéterekkel (pl. Melrose vagy ma már inkább szivacsos) való termékenyítésnél a fagyasztott sperma nem jól „működik”. Külön gond, hogy fagyasztott spermás MT-nél nagyon magas spermiumszámot kell használni (min. 5 milliárd/dózis), ezért egy ejakulátumból csak kevés kocát lehet termékenyíteni. Reményre adhat okot, hogy a fagyasztás előtt alkalmazott bizonyos kezelések javíthatják a spermiumok felengedés utáni életképességét, így várhatóan a cervikális termékenyítés is egész jó eredményeket hozhat a jövőben.
140
A kiskérődzők szaporodása (juhban a ciklus hossza 17 nap, kecskében 21 nap) Összefoglaló
•
• • • • • • • • • •
Pubertás ideje: kb. 7 hónapos korban, de tejelő kecskéknél javasolt megvárni, amíg elérik a felnőttkori testtömeg kb. 70%-át, ami kb. 30-35 kg; ezt 7-8 hónapos korra elérik (az ellés kori évszak/szezon is befolyásolja a pubertás kezdetét! A márciusban született bárányok pl. októberben kezdenek el ivarzani. A kos/bak jelenléte is indukálja/stimulálja a jerkék/gödölyék ivarérését!) Ciklus: Szezonálisan poliösztruszos (rövidnappalos) Ösztrusz/ivarzás/űződés hossza: Átlagosan 30-36 óra (kecskében pár órával hosszabb) Ovuláció időpontja: Az ösztrusz utolsó óráiban (kb. 24-30. órában, kecskében kicsit később) Embrió bejutása az uterusba: kb. 4-5 nappal a termékenyülés (ovuláció) után Vemhesség anyai felismerése: A trophoblast által termelt ovine ill. caprine IFNτ (a vemhesség 13-14. napján) Placenta típusa: placenta cotyledonaria (anatómiailag), placenta synepitheliochorialis (szövettanilag) Vemhesség hormonális háttere: A juh corpus luteum independens (kb. az 50. naptól átveszi a placenta a P4 termelés szerepét), kecske corpus luteum dependens (végig a CL termeli a P4). Vemhesség hossza: kb. 150 nap Ellés utáni újra ciklusba lendülés időpontja: Befolyásolja a szezon!! Általában a következő szezonban lendül ciklusba ismét az anyajuh. Ha azonban a szezon elején van az ellés, akkor előfordulhat, hogy még ugyan abban a szezonban termékenyülhet az anyajuh (a szezon stimulál). Nem szezonális fajtáknál sem lesz egyből visszaivarzás az ellés után, mert ekkor 141
•
laktációs anösztrusz van a választásig! De szezonális fajtáknál ez nem szembetűnő, mert az ellés úgyis az anösztruszos időszakra esik, a bárányt meg leválasztják mire újra ivarzani kezdene az anyajuh. Involúció hossza: Juhban kb. 30 nap, kecskében kicsit több, inkább 40 nap (szezon stimulál).
Szezonalitás, ciklikus nemi működés A juhok és kecskék nemi működése szempontjából fontos a szezonalitás (rövidnappalos állatok). A fotoperiódus a legfontosabb tényező a szezonalitás kialakításában, de genetikai különbségek is vannak az egyes fajták között. Vannak olyan fajták melyek gyakorlatilag egész évben képesek ivarzani (pl. merinó juh vagy hús-típusú kecskefajták, melyeknek max. tavasszal van 1-2 hónapos anösztrusza), a többségnek azonban van egy 4-5 hónapos aktív szezonja az évben (szeptember-január), melynek csúcspontja október-novemberre esik az északi féltekén. Trópusi-szubtrópusi vidékeken a kiskérődzők többsége nem mutat fotoperiódushoz köthető szezonalitást, a nemi aktivitást ezeken a helyeken inkább a táplálék elérhetősége befolyásolja. Ugyanakkor az egyenlítőnél egész évben folyamatosan ciklusban ivarzanak a juhok (nincs változás a fotoperiódusban. A hosszúnappalos időszak alatti anösztrusz idején a kiskérődzők nem ivarzanak, a petefészkükön nem alakulnak ki domináns follikulusok, azonban tüszőnövekedési hullámok ekkor is folyamatosan vannak (endoszkópos vizsgálatokkal ezt igazolták), csak éppen minden harmadlagos follikulus atretizál még relatíve korai fázisban. A szezonalitás a kosok/bakok libidójában (tesztoszteron-produkcióban), spermaminőségében is megfigyelhető, ezért bár egész évben képesek fedezni, a feltételek az őszi szezonban a legideálisabbak (a sperma minőségében különbség van attól függően, hogy szezonban, vagy szezonon kívül gyűjtöttük; pl. ha fagyasztani akarunk, jobb ősszel venni a spermát). A juh ciklusa átlagosan 17 nap (a luteális fázis rövidebb a többi kérődzőhöz képest!, csak kb. 12-13 nap), de a szezonátmeneti időszakokban nem ritkák a 12 napnál rövidebb ciklusok sem. 142
A kecske ivarzási ciklusának a hossza átlagosan 21 nap (viszont nem ritkák itt sem a 12-nél rövidebb vagy akár 30-nál hosszabb ciklusok). Általában a szezon elején rövidebbek, a végén pedig hosszabbak a ciklusok. A szezonbeli első ivarzás általában csendes (mert a progeszteron nem tudja érzékennyé tenni az agyat az ösztrogén okozta viselkedés-változások iránt). Egyébként a szezon alatt egy cikluson belül a marhához hasonlóan hullámszerű a follikulusok növekedése (változó számú, átlag 2-4 hullám figyelhető meg UH-val és az utolsóból lesz ovuláció) Ivarzásdetekció és pároztatás A juhok és kecskék ivarzása kevésbé jellegzetes külső tünetekkel jár, mint marhában. A kos/bak jelenlétében a nőstények csóválják a farkukat, gyakran vizelnek, és keresik a hímek társaságát, továbbá megállnak nekik (tűrik a fedezést/párzást; álló ivarzás). Ha azonban nincs kos/bak, vagy a kos/bak tapasztalatlan, akkor a nőstény ivarzása könnyen észrevétlen maradhat. Ennek a juhtenyésztésben azonban csak akkor van jelentősége, ha kézből pároztatást vagy MT-t használnak (amit Mo.-n azonban csak néhány juhászatban alkalmaznak), mert természetes háremszerű pározatatáskor a kos megoldja a helyzetet. Ha viszont keresni kell az ivarzókat MT-hez akkor ún. „kötényes kost” (a péniszét a „köténnyel” elfedik, hogy ne tudja befedezni az anyajuhot) vagy vazektomizált kost szoktak alkalmazni. Ez azonban kevésbé gyakorlatias, így MT esetén általában gyógyszeres ivarzás-szinkronizálást alkalmaznak, és fix időpontban termékenyítenek (lásd később). Kecskék esetében előfordul, hogy a péra beödémásodik és ivarzási nyálka ürül (juhokban ritkán vehető ez észre), de ez nem törvényszerű. A szarvasmarhához képest nagy különbség, hogy az anyák nem ugrálják úgy egymást, mint a tehenek/üszők. Gyakorlati körülmények között azonban nincs nagy jelentősége annak, hogy nehezen kereshetők az ivarzók/űződők, mert a háremszerű pároztatás terjedt el. Szezonban háremszerű pároztatás esetén egy tapasztalt kosra/bakra átlag 50 anyát számolnak, ami nem szinkronizált ivarzás esetén azt jelenti, hogy naponta a hímeknek kb. 3-4 anyát kell befedezni és a szezon csúcsán lévő libidójuk és spermatermelésük bőven megfelel ehhez! Ha a kos fiatal, tapasztalatlan, akkor szezonon belül is csak 20-30 nőstényt raknak be mellé. 143
Ha szinkronizált a nőstények ciklusa a szezonon belül, akkor 1 kosra/bakra csak 10-20-at nőstényt lehet számolni, ami érthető, hiszen egyszerre több nőivarú állat fog ivarzani. Ha pedig szezonon kívül és gyógyszeresen indukált ciklusról van szó, akkor csak 510 anya/kossal v. bakkal lehet kalkulálni, mert a ciklusindukció általában szinkronizáltan történik + szezonon kívül rosszabb is a hímek fertilitása. Az MT-ről és típusairól az asszisztált reprodukciós anyagban van szó! Vemhesség A juh és a kecske vemhessége egyaránt kb. 145-150 nap, azonban különbség van a hormonális háttérben! A juh vemhessége csak az 50. napig függ a corpus luteum progeszterontermelésétől, ezt követően a placenta átveszi a feladatot (tehát ezután CLindependens!). A kecske vemhessége viszont végig igényli a sárgatest által termelt progeszteront (CL-dependens), itt a placentának az a szerepe, hogy placentáris laktogént és placenta eredetű LH-t termel, melyek fenntartják a CL szekréciós működését. Ezek alapján, ha ellést kell indukálni valamilyen okból, hogy biztosan ott legyen valaki felügyelni (bár nem szokták alkalmazni a gyakorlatban), akkor a 144. naptól kecskében prosztaglandinnal, juhban pedig glükokortikoddal lehet ezt megtenni. Vemhességi diagnózis:
•
Visszaivarzás (kecskében kb. 17-23, juhban kb. 13-14 napon belül) – kecskében kifejezetten gyakori hogy a vemhesek is mutatnak ivarzási tüneteket
• •
Rektális ultrahang vizsgálattal (kb. 23. naptól, főleg juhban)
• •
Ösztron-szulfát kimutatása tejből/plazmából – nem gyakorlatias
•
Ovine Pregnancy specific protein B (tejből/vérből, csak juhban, 26. naptól) – nem gyakorlatias
Transzabdominális ultrahang vizsgálattal (kb. 35-40. naptól juhban és kecskében) – ez a legjobb és az 50. naptól biztosan meg tudjuk mondani a magzatok számát is! Progeszteron szintek mérése vérből (ELISA, RIA) – nem gyakorlatias (kecskénél álvemhességtől nem lehet elkülöníteni! Lásd később!)
144
A kiskérődzőknél a legfontosabb mérőszám, hogy egy anyára hány megszületett bárány/gida jut évente. Megoldás: 1) meg kell kerülni valahogy a szezonalitást (pl. 2 évente 3 ellés), és 2) növelni kell az ovulációs rátát (minél több legyen az ikerellés). Kiskérődzők szaporodásbiológiai menedzsmentje Kecskékben európai viszonyok között min. 4 hónap anösztrusznak el kell telnie, hogy bármelyik módszerrel hatékonyan tudjuk indukálni a szezont, ezért főleg az anösztrusz végén hatékonyak a kezelések. Juhban viszont jól sikerülnek akár az anösztrusz derekán is. 1. Ivarzás indukciója szezonon kívül (cél: megfelelni a piac elvárásainak, akkor tudjunk bárányt produkálni, amikor a legnagyobb rá a kereslet; ill. hogy gyakoribbá tudjuk tenni az elléseket – ez főleg a juhászatokban fontos, mert kecskékben nem lehet elég hatékonyan indukálni a szezont) 2. Ivarzás szinkronizációja szezonban (tenyésztésszervezési szempontból az MT/fedeztetés és ellések szinkronizálására – juh és kecsketenyésztésben egyaránt) 3. Ovulációs rátát befolyásoló tényezők/kezelések (az ikervemhesség arányának növelése a cél, s így több bárányt lehet értékesíteni – elsősorban a juhászatokban)
1. Ivarzás indukciója szezonon kívül Fotoperiódus megváltoztatása: Természetes hosszúnappalos időszakot követően, ha rövidnappalos jellegű mesterséges megvilágítást alkalmazunk (kevesebb a világos órák száma az istállóban), az előre fogja hozni a szezon kezdetét. Ennek gyakorlati jelentősége, csak intenzív termelési rendszerekben van, mert egyedül itt szabályozható a megvilágított órák száma (legelő juhoknál nyilván nem). Egyébként az előrehozott szezon pontos kezdete megjósolhatatlan és nagy egyedi variabilitást mutat (tehát nem szinkronizál!), ezért inkább csak más módszerekkel kombinálva jön szóba. Koshatás/bakhatás: Csak az anösztrusz vége felé hatékony, amikor már eleve hamarosan kezdődne a szezon. Ha az anyákat min. 3-4 hétig elkülönítjük a 145
kosoktól/bakoktól (ne lássák/halják egymást, messze legyenek egymástól, hogy a feromonhatás se tudjon érvényesülni), majd újra összerakjuk őket, akkor főként a feromonhatás miatt, hamarabb következik be az aciklusos anyák első ciklusa/ivarzása és ovulációja. A többség 1 héten belül ovulálni fog, azonban ez gyakran csendes ivarzás (az első ivarzást megelőzően nincs P4) és az sem ritka, hogy az első 1-2 ciklus csak 6-7 napos (rövid ciklus), és nagy az egyedi változatosság, pl. a takarmányozás, fajta, életkor miatt (tehát ez sem szinkronizál!). Melatonin tartalmú inplantátumok: Bőr alá behelyezve a hatóanyag lassú leadása biztosítja, hogy heteken keresztül magas legyen a melatonin koncentráció, ami a természetes rövidnappalos állapotot mimikálja, s így előbbre hozza a szezonkezdetet (de ehhez minimum 5-6 hétig bent kell lennie). Önmagában viszont nem szinkronizálja jól az állatokat! Kecskékben csak akkor működik, ha legalább 2 hónapos hosszúnappalos időszak megelőzi az implantátum behelyezését. Gesztagén-kezelés (pl. fluorogeszton-acetat, medroxiprogesteron-acetat) + PMSG/eCG: Szezonon kívül kb. 14 napig történő progeszteron adagolással (ez kiskérődzők esetében leggyakrabban hüvelyszivacs, aminek a behelyezéséhez van egy speciális eszköz, de lehet esetleg szubkután implatátumot vagy hüvelyimplantátumot is használni; pl. CIDR). Az eltávolításkor adott PMSG/eCG injekcióval (nagyobb dózis, mint amit a szezonban, szinkronizációkor használunk) 1-2 napon belül szinkronizált (!) ivarzást lehet kiváltani/indukálni szezonon kívül. Ezt koshatással (vagy melatonin implantátummal-ez utóbbit ritkán) lehet kombinálni a jobb hatás érdekében (és a gesztagén miatt szinkronban jelentkezik az ivarzás és csökken a csendes ivarzások aránya!) 2. Az ivarzás szinkronizációja szezonban Cél: Az, hogy jobban tudjuk szervezni az MT-t (ha ezt használjuk), illetve, hogy a leendő elléseink azonos időre essenek! Ivarzás-szinkronizációval az ellések lényegében 1 héten belül fognak megtörténni az összes kezelt és vemhesült anya esetében! Hüvelyszivacs használatával lehet fix időpontban termékenyíteni (erre vannak különböző protokollok, kb. a szivacs kivételét követő 50. óra körül van mindig az 1 v. 2 MT, de kisebb nagyobb eltérések vannak attól függően, hogy melyik cég termékéről van szó). Ugyanígy a kossal való fedeztetést is lehet időzíteni. 146
Gesztagén-kezelés (+ PMSG/eCG): Kiskérődzőkben leggyakoribban a hüvelyszivacsot alkalmazzák, amit kb. 14 napig tartanak bent (kecskében 17-18 napig, mert hosszabb a CL élettartama és ezt az időszakot mindenképpen le kell fedni). Akkor lehet 11-12 napig (rövidebb ideig) bent tartani, ha a kivételkor PGF2a-t adunk!). A felszabaduló gesztagén (természetes vagy szintetikus származék) a már ciklusos (tehát szezonban lévő) állatokban negatív visszacsatolás révén gátolja a gonadotropinok leadását (P4 hatás), így nem alakul ki domináns tüsző, nincs ovuláció. A szivacs eltávolítását követően viszont 1-2 napon belül ivarzani kezdenek a juhok, ráadásul szinkronban! Tehát tenyészszezonon belül az anyajuhokat lehet szinkronizálni gesztagénekkel, ami elengedhetetlen MT esetén, de a kossal való fedeztetést is megkönnyíti. Viszont oda kell figyelni a megfelelő kos:anya arányokra (lásd előbb). PMSG/eCG adása a szivacs eltávolításakor nem kötelező jellegű, úgy, mint szezonon kívül, hiszen itt ciklusban ivarzó anyákról van szó és a tüszőnövekedési hullámból várhatóan azonnal lesz domináns tüsző, ha megvonjuk a progeszteront, de azért szokás adni szezonban is eCG-t, bár kisebb dózisban, mint szezonon kívül, mert ez biztosítja az igen pontos szinkronizációt (az ovulációban). Prosztaglandinnal: Szarvasmarhához hasonlóan kétszeri, 10-12 napos időközzel (juhban és kecskében is jól működik a 11 napos időköz, mint tehénben) adott PGF2α injekcióval lehet szinkronizálni az ivarzásokat (a két injekció biztosítja, hogy a másodikra minden anyának szenzitív legyen a CL-je a luteolízisre), de csak a szezonon belül (hiszen anösztruszban nincs CL és semmit sem ér a prosztaglandin). A gyakorlatban azonban ez sokkal ritkábban használt, mint a gesztagén kezelés és nem is ad olyan jó eredményeket. 3. Az ovulációs rátát befolyásoló tényezők/kezelések Fontos, hogy az eddig ismertetett kezelések közül az ovulációs rátára (hány tüsző ovulál) egyiknek sincs lényegi hatása. Ezért nincs szerepük az ikervemhesség és a bárányozási ráta befolyásolásában. Az ovulációs rátát az alábbi hatások befolyásolják. Plusz általánosan igaz, hogy szezonban jobb az ovulációs ráta, mint szezonon kívül.
147
•
Fajták közti különbségek: Mivel fajták (és fajtán belül egyedek) közt is nagy különbséggel fordul elő ikerellés, ezért az egyik legjobb mód, ha az állományon belül szelektálunk az ikervemhes anyákra ill. keresztezünk nagy termékenységű fajtákkal. Legjobb példa a fajták közti eltérésekre a Booroola merinónak a FecB génje (van FecX, FecG, FecH is más fajtákban), ami fokozott ovulációs rátát eredményez (maga a mutáció a follikulus növekedést szabályozó auto- és parakrin faktorokra van hatással, s következményeként több tüsző ovulál).
•
Flushing: 3-4 héttel a tervezett fedeztetés/termékenyítés előtt plusz (megemelt) energia és fehérje bevitellel lehet fokozni az ovulációs rátát. Legjobban a közepes kondíciójú anyajuhok reagálnak rá (de a válaszkészségben fajták között is eltérés lehet). Fontos, hogy időben kell abbahagyni, mert a fedeztetés utáni nagy energia bevitel fokozza az embrionális mortalitást!
•
Gesztagén + PMSG/eCG alkalmazásával történő szinkronizációkor ha nagyobb dózisban alkalmazzuk a PMSG/eCG-t akkor szuperovulációt/korlátozott szuperovulációt indukálunk és növeljük az ikerellések számát.
•
Inhibin elleni vakcinázás: Teoretikus jelentősége van csak (mivel a gyakorlatban nem igen használják, főleg Mo.-n), de működik. Ezzel csökkenthető az inhibin negatív feedback hatása, így több FSH lesz, több tüsző juthat el a domináns stádiumba. (Hasonló módon egy ovariális szteroid, az androsztendion ellen is fejlesztettek vakcinát, mert az ösztrogén és inhibin mellett ennek is szerepe van az FSH-ra kifejtett negatív visszacsatolásban.) Kiskérődzők ivarszervi kórképei
1. 2. 3. 4.
Hermafroditizmus kecskékben A kecske álvemhessége Embrionális mortalitás és vetélés kiskérődzőkben A juhok vemhességi toxaemiája 148
5. 6. 7. 8. 9.
Hüvelyelőesés és méhelőesés juhban (és kecskében) Magzatburok-visszatartás, endometritis, pyometra Juhok balanoposthitise és vulvovaginitise Mastitis kiskérődzőkben Brucella ovis okozta here- és mellékheregyulladás kosokban
1. Hermafroditizmus kecskében
Egyes kecskefajtákban (főleg szarvatlan) az infertilitás hátterében álló gyakori ok lehet az intersexualitás (hermafroditizmus). A rendellenesség genetikailag összefügg a „szarvatlansággal” számos tejtermelő fajtában (mert ezekben szelektálnak a szarvtalanságra). Mivel az intersexualitás recesszíven öröklődik, a szarvatlanság pedig domináns, ezért szarvalt bakkal való fedeztetéssel el lehet kerülni a problémát. Ekkor ugyanis a születő gidák szarvatlanok lesznek, és heterozigóták az intersexualitásra. Így a recesszíven öröklődő hermafrodita fenotípus nem tud megjelenni. Mindkét nemben infertilitásban nyilvánul meg, a nőstények (XX ivari kromoszómájú állatok) általában masculinizáltak (mivel hereszövet is van a petefészek mellett), a hímek (XY kromoszómájúak) pedig jellemzően kriptorchidok. 2. A kecske álvemhessége Főleg tejelő kecskében a tenyészszezonon belüli meddőség egyik igen fontos oka az álvemhesség (elsősorban idősebb állatokban). A petefészken perzisztáló sárgatest van, de nem vemhes az anya (viszont vissza sem ivarzik!), s közben a méhben változó mennyiségű steril (tehát nincs infekció!) folyadék-felhalmozódás látható ultrahanggal („hydrometra”), a cervix zárt. Kialakulhat olyan ciklusban ivarzó kecskékben is, amelyeket nem fedeztettünk, de vemhesült állatokban is, amelyekben korán elhaltak, valamilyen okból kifolyólag, 149
az embriók. A lényeg, hogy a corpus luteum valamiért nem alakul vissza a luteális fázis végén, ahogy azt fiziológiásan várnánk! A méhben, a sokáig fenntartott és magas progeszteron szint következtében halmozódik fel a folyadék, és ha észrevétlenül marad, pár hónap alatt több liter is összegyűlhet, amikor már kifejezett hasi terime növekedést okoz, ami a vemhességgel külsőleg simán összetéveszthető (főleg mert az álvemhesek tőgye is megduzzadhat). Csak ultrahanggal diagnosztizálható a bántalom, de a korai UH-s vemhességi diagnózis szokásos időpontjában még nem biztos, hogy elkülöníthető a vemhességtől (ezért későbbi időpontban, az 50-100. nap között ismételni kell)! A progeszteron-vérszintek mérése alapján nem különíthető el a vemhesség és az álvemhesség (mert CL mindkettőnél van és P4 is magas). A sárgatest egy idő után (néhány hónap) magától is visszaalakul és ez a cervix fellazulását (tágulását) és a méhbeli folyadék spontán ürülését eredményezi. De ha diagnosztizáltuk, akkor PGF2α-t kell adni, hogy luteolizist (a sárgatest visszaalakulása) váltsunk ki és ennek eredményeként 1-2 napon belül a folyadék is kiürüljön a hüvelyen keresztül. A kezelést vagy spontán „gyógyulást” követően a kecskék fertilitása nem csökken, nyugodtan fedeztethetők a következő ivarzáskor. 3. Embrionális mortalitás és vetélés kiskérődzőkben A korai embrionális mortalitás egyik fontos tényezője a termékenyülés környéki és azt követő energiában gazdag táplálás, ezért ahogy sertésben is, a flushingot abba kell hagyni a pároztatás körüli időszakban (feltételezhetően a máj metabolikus kapacitása nő ennek hatására, ami fokozott P4 metabolizmushoz vezet és így lesz embrionális mortalitás)! Emellett szóba jöhet még esetleg a hő stressz (bár a szezonális fajtáknál az őszi tenyészszezonban ez természetesen kevésbé probléma, annál inkább a majd nem egész évben ivarzó fajtáknál), viszont a kiskérődzők embrionális mortalitásáról összességében nem tudunk olyan sokat. A vetélés legfontosabb fertőző okai (a nem fertőzők lehetnek pl. növényi toxinok…stb):
•
Campylobacter fetus fetus (vagy C. jejuni) – főleg juhban, de nem venereális, mint marhában, hanem a bélből! 150
•
Chlamydophila abortus – Juhok enzootiás abortusa, de kecskében is ugyanolyan fontos (ez egy mentes állományba bekerülve igen súlyos járványos vetélést tud okozni és az egész világon problémát jelenthet; főleg a vemhesség végén vetélnek)
• •
Listeriosis – juh, kecske is, de sporadikus (általában takarmányozási eredetű)
• • • • •
Salmonellosis (pl. Abortusovis) – főleg juh
•
Bunyavirusok - szúnyogok! Gyakori a hydrocephalus a vetélt ill. halvaszületett magzatban.
•
Toxoplasmosis – kecskében és juhban egyaránt (az anya lényegében tünetmentes, de a primer fertőzést követően elvetél). Juhban egyszeregyszer Neospora caninum is vetéltethet.
Brucellosis (főleg melitensis!) juh, kecske is, de ritkábban B. abortus is okozhat, vagy juhban esetleg B. ovis is (de ez primeren a kosok here-és mellékheregyulladását okozza!) Coxiella burnetti – juh és kecske is Caprine herpesvirus 1 – az IBR virus rokona, kecskében lehet vetélés Bluetongue Border betegség – juh! Bármikor vetélést idézhet elő, vagy alulfejlett utód születik („hairy shaker bárány”)
4. A juhok vemhességi toxaemiája Ez a kórkép a vemhesség végén (főleg 1-3 héttel az ellés előtt) fordulhat elő idősebb és elsősorban ikervemhes anyajuhokban. Érintheti a rosszul táplált egy magzattal vemhes anyákat is, de gyakran a kövér, ikervemhes anyák betegsége. A lényeg, hogy az anyajuh relatíve energiadeficitbe kerül vagy azért mert nem kap elég és jó minőségű táplálékot, vagy azért mert eleve kövér és magas a leptinszintje és már nem akar többet enni, vagy azért mert 2-3 bárány van a hasában és ők összenyomják a bendőt és ezért nem tud sokat enni. A vemhesség végén az anya által felvett energia legnagyobb része a magzatok növekedésére fordítódik (ami ekkor a legintenzívebb), és különösen ikrek esetén ehhez igen intenzív takarmányozás kell. Mivel az anyai szervezet a saját kárára is nevelni akarja a magzatokat, ezért lipolízis lesz, a zsírsavak a májban zsírmájat okozhatnak + a felhalmozódó Ac-KoA-ból ketontestek képződnek.
151
Következményesen az anyajuhnak idegrendszeri tünetei lesznek (ennek részeként egyre bágyadtabb, nem akar enni, ami tovább ront a helyzeten), lassanként elfekvő állapotba kerül és elpusztul. Még élő állapotban biztosan csak a vér béta-hidroxi-butirát (BHB) koncentrációja alapján lehet diagnosztizálni. Komatózus állapotban nem nagyon lehet mit csinálni, de ha UH alapján élnek a magzatok és 2-3 nap múlva amúgy is megellene, akkor a császármetszés szóba jöhet. Ha még nagyon kezdeti állapotban van a betegség, akkor parenterális propilénglikol + kálcium és magnézium szupplementáció növeli a túlélés esélyét. Esetleg szájon át is táplálhatod koncentrátummal (mint marhánál a „drencselés”). Egy igen legyengült állat esetében viszont nem jó a prognózis, sokszor visszafordíthatatlan és elhullanak. Intravénás glükóz infúzióval lehet próbálkozni, esetleg kálcium kiegészítéssel együtt. A megelőzés nagyon fontos!! El kell érni, hogy a vemhesség 100. napja körül az állat kondíciója 2.5-4 között legyen. Javasolt UH-al az ikervemheseket külön válogatni, majd takarmányozni (a fokozottabb igényeik kielégítése érdekében)! 5. Hüvelyelőesés és méhelőesés juhban és kecskében Hüvelyelőesés: A szarvasmarha mellett elsősorban idősebb juhokban fordul elő, a vemhesség utolsó trimeszterében. A hátterében az intraabdominális nyomásnövekedés áll (a vemhes méh megnagyobbodása miatt vagy kövér állatokban a hasűri zsírraktárak nagy tömege miatt), amihez a vemhesség végén emelkedő relaxinszint miatt a medenceűri lágy szövetek fellazulása is társul. Mindezek együttesen prediszponálnak/hajlamosítanak a hüvelyelőesésre. Juhoknál még az is fontos, hogy szeretnek úgy lefeküdni a legelőn, hogy a fejük legyen felfelé, így a gravitáció is segít a hüvelyelőesésben. Egyedi esetekben a következőket tehetjük: lemosni és fertőtleníteni az előesett hüvelyt, majd visszahelyezni és Bühner-féle varrattal összeölteni a péra tájékot. Juhokban gyakran több állatot érint a bántalom az állományban. Méhelőesés: Bármely fajban előfordulhat az ellés után, amikor a nyakcsatorna még nyitott, a méh pedig még nem nyerte vissza tónusát és „kicsusszan” a 152
hüvelyen keresztül. Leggyakrabban azonban marhában és juhban jelentkezik. Megoldás: lásd előbb. 6. Magzatburok-visszamaradás, endometritis, pyometra Magzatburok-visszamaradás ikerellések ill. ellési segítségnyújtás következményeként fordulhat elő leggyakrabban. De közel sem olyan gyakori kiskérődzőkben, mint marhában. Akut puerperális metritis lehet belőle, ha befertőződik, de általában adnak profilaktikus antibiotikumot a nehézellések után, így ez elkerülhető.
Endometritis előfordulhat juhokban és kecskékben, de általában nem tudjuk diagnosztizálni, csak post mortem. A jelentősége nem nagy. Ha perzisztáló mucopurulens hüvelyváladékozás van, akkor gondolni kell rá.
Szintén a „nem diagnosztizált” kategória, de előfordulhat a gennyes tartalom felhalmozódása a méhben, zárt cervix és perzisztáló sárgatest mellett, ami pyometrához vezet. Ennél gyakoribb kecskékben az álvemhesség, ami viszont steril (nincs fertőzés) és a folyadék nem gennyes! 7. Juhok balanoposthitise és vulvitise Hímekben a penis és praeputium, nőstényekben pedig a hüvely nyálkahártyájának irritációjával, gyulladásával járó kórképek előfordulnak juhokban. A pénisz/tasak ill. hüvely nyálkahártyája kipirult, fekélyes/erodált területek találhatók rajta. A következő kórokozók lehetnek a háttérben: -Genitális parapoxvirus fertőzés (orf-vírus) -Corynebacterium renale (a juhok ún. enzootiás posthitise és vulvitise) -Mycoplasmák (ritkábban egyéb baktérium) által okozott ún. ulceratív balanoposthitis és vulvovaginitis Mindegyik hasonlóan néz ki külsőleg. Ha Orf-ról van szó, akkor az egész állományt érinti (bárányokat is). Feltételezett bakteriális esetekben antibiotikum kezelésre gyógyul. Az enzootiás posthitisről/vulvitis 153
Maga a baktérium (C. renale) nem obligát pathogén, de ureolitikus, ezért a vizelet karbamidjából ammóniát képez. A problémát igazából ez okozza. Jelentősége csak fehérje gazdagon táplált állatokban van, amelyekben a nyálkahártyán megtelepedő (állatról állatra átvihető) baktériumok nagy mennyiségű ammóniát szabadítanak fel, s ez lokális irritációhoz és következményes gyulladáshoz vezet. Kosokban a hosszúszőrű fajták prediszponáltak, mert a vizelet jobban átitatja a környező területeket (emellett a kasztráltakban is gyakoribb). Általában szezonalitást mutat az előfordulása, az év azon szakában (tavasszal, kora nyáron) érint nagyobb létszámú állatot, amikor a legelőn fehérje gazdag növények nőnek nagy számban. A fehérje gazdag takarmány megvonására és penicillinekre jól gyógyul. 8. Mastitis
Főleg a szarvasmarhánál tanult kórokozók által okozott mastitisek fordulnak elő kiskérődzőkben is. Kórokozótól függően perakut (pl. coliform mastitis), akut, szubakut krónikus és talán szubklinikai forma is előfordul. Diagnózis, kezelés: mint szarvasmarhában. Tejelő kecskében van igazán jelentősége (hús és gyapjútermelő kiskérődzőkben legfeljebb rosszul fejlettek az érintett anyák bárányai, mert éheznek). Tejelő kecskékben legnagyobb gondot a koaguláz-negatív Staphylococcusok okozzák, míg a S. aureus és Streptococcus agalactiae ritkább. Mycoplasmák marhához hasonlóan okozhatnak nagyobb járványos kitöréseket. A legfontosabb Mycoplasma kiskérődzőkben a M. agalactiae, ami az ún. juhok/kecskék járványos elapasztását okozza (de a M. mycoides capri és M. capricolum capricolum is hasonló problémát idéz elő, elsősorban kecskékben). Szomatikus sejtszám alapján nehezebb diagnosztizálni kecskében, mint marhában, mert fiziológiásan is magasabb az epithel eredetű sejtek aránya a tejben, ezért a laktáció végén előfordulhat SCC>1 millió/ml teljesen egészséges egyedekben is.
154
9. Brucella ovis okozta here- és mellékheregyulladás kosokban A Brucellákról általában ismert, hogy háziállatainkban vetélést okoznak, de van egy faj, amelyik elég speciális (mert nem elsősorban vetélést produkál, bár lehet ez is ritkán) és ez a kosok here- és mellékheregyulladásának egyik legfontosabb okozója, a Brucella ovis. A kosok általában egymást fertőzik direkt kontaktus útján (a kor előrehaladtával nő a fogékonyságuk). A kosokban a baktérium évekig perzisztálhat és intermittálóan ürül. Anyaállatokban viszonylag ritka, hogy aktív fertőzés alakul ki fertőzött kossal való fedeztetést követően. Nem minden esetben alakul ki tapintható elváltozás (megnagyobbodás, atrófia, fibrózis…stb) a herékben, mellékherékben (persze sokszor előfordulnak óriási mellékherék is), de a spermaminőség viszont jellemzően romlik. A kórokozó az ejakulátumból kitenyészthető, de a szerológiai módszerek a legmegbízhatóbbak. Kezelése nem gyakorlatias és egyébként is nehéz, célszerűbb a fertőzött állatokat selejtezni kell. A Brucellosis diagnózisa azonban fontos, mert egyéb baktériumok pl. Histophilus somni, Actinobacillus seminis is okozhatnak sporadikus here- és mellékheregyulladást az állományban.
A kutya szaporodása Összefoglaló
•
Pubertás ideje: Fajtától függő (általában 6-18 hónap), középérték kb. 1 év. Nőivarúakban időpontját az első ivarzás jelzi. Hímekben megjelenik a nőivar iránti érdeklődés és a felemelt hátsó lábbal történő sajátos vizeletürítési mód. Kis testűek: 6-9 hónap (Törpe uszkár, Pekingi palotakutya, Yorkshire terrier, stb.) Nagy testűek: 12-18 hónap (Dog, Komondor, Kaukázusi juhászkutya, stb.) Környezeti hatások befolyásolhatják, pl. évszak, tartásmód, stb.. Ivari ciklus és ciklusfázisok: Nem szezonálisan ivarzó, monösztruszos, spontán ovuláló állat. A nemi ciklus hossza: 6 hónap, ebből előivarzás 155
(proösztrusz) átlagosan 9-12 napig (3-17 nap) tart; ivarzás (ösztrusz) átlagosan 9 nap (3-21 nap); sárgatestfázis (metösztrusz/diösztrusz) 2 hónap; nyugalmi szakasz (anösztrusz) 4-5 hónap.
•
Ciklikusság: Általában kétévente kb. 3-szor tüzel, főleg (de nem kizárólag) a tavaszi időszakban.
• •
Tüzelés: a tüzelés szó a proösztruszt és ösztruszt együtt jelenti.
•
Vemhesség anyai felismerése: Nem szükséges, mert a vemhes és nem vemhes egyedek hormonális diösztrusz profilja hasonló (magas P4 szint)!
•
Placenta placenta
• •
Vemhesség hormonális háttere: corpus luteum dependens.
•
Ellés utáni újra ciklusba lendülés időpontja: A vemhességet követő anösztrusz után (2-6 hónap).
•
Involúció hossza: ~90 nap kell a teljes involúcióhoz.
Ovuláció időpontja: kizárólag a külső tünetek alapján változónak tűnhet, azonban eléggé standard, hogy az LH-csúcs után kb. 2 nappal következik be. Az LH csúcs alapján (a nagyjából egy időben tapasztalható következményes P4 emelkedés mérésével) a várható ovuláció időpontja előre jelezhető!)
típusa: Placenta zonaria (anatómiailag), endotheliochorialis (szövettanilag).
Vemhesség hossza: a fedezéstől számítva változó lehet (ennek okáról később), de az LH csúcstól számítva elég konstans, 64-66 nap. Az ellést megelőzően 5-7 nappal megkezdődik a tejelválasztás. Az anya testhőmérséklete 12-24 órával az ellés megkezdése előtt az élettani 3839oC-ról 37oC alá csökken (előrejelzés). Az 58. vemhességi nap előtt született kölykök életképtelenek (a tüdő fejlődése/érése nem fejeződik be > surfactant-nak nevezett felületaktív anyagok beépülése zavart szenved.
A szuka ciklusa Nem szezonálisan ivarzó, monoösztruszos, spontán ovuláló állatok (bár egyes szukáknál átlag 1.5-2 tüzelés is juthat egy évre). A tüzelések száma egy kicsit
156
megnő a tavaszi időszakban (érdekességképpen: a Basenjik teljesen szezonálisak, tehát az északi féltekén ősszel tüzelnek!). A ciklus részeként van egy hosszú anösztruszos periódusuk (átlag 2-6 hónap), amit a proösztrusz (átlagosan 9 nap; 3-17 nap) szakít meg (külsőleg a péra duzzanata és véres-savós hüvelyváladék /nem vér!/ megjelenése a legnyilvánvalóbb jele!). Ilyenkor a szuka vonzza a kanokat, de még nem áll meg nekik. A proösztruszt az ösztrusz követi - a szuka ebben a szakaszban áll meg a kannak. A proösztrusz és ösztrusz együttes megnevezése a tüzelés. Az ovulációt követő rövid diösztrusz/metösztrusz során alakul ki a corpus luteum és a sárgatestfázist diösztrusznak nevezik. A CL + a P4-által dominált időszak mind a fogamzott, mind a nem fogamzott állatokban kb. 2 hónapig fennmarad. Ezért az álvemhesség progeszteron profil alapján megkülönböztethetetlen a vemhességtől. Érdekes, hogy a diösztruszban/metösztruszban a méh szöveti szerkezete is átalakul és nem vemhes szukákban is lesz egy involúció-szerű időszak. A progeszteron értékek a 20-30. naptól elkezdenek csökkenni, de azért egy vemhességnyi ideig még elég magasan maradnak, csak ezt követően kezdődik el az endometrium desquamatioja, és a teljes regeneráció („involúció”) kb. a 150. napig tart. Az anösztruszt a 80-90. naptól kezdve számítjuk (amikor a P4 már alacsony). A szuka esetében nagyon fontos szem előtt tartani, hogy a ciklus egyes szakaszainak hossza egyedek között igen változó lehet (kivéve a viszonylag standard 80-90 napos sárgatest-fázist)! Továbbá a proösztrusz (péraduzzanat és vérzés) és ösztrusz (megáll a kannak) külső jeleinek intenzitása is széles spektrumban változhat, az ösztrusz-metösztrusz átmenetnek pedig nincs semmilyen nyilvánvaló külső tünete. Az anösztrusz vége felé fokozatosan emelkedik a GnRH pulzus-frekvencia, amit (már a proösztruszt megelőző 1-2 hétben) az FSH szint emelkedése követ és ez a tüszőnövekedési hullám elindulásához vezet. Az ösztrogén és inhibin általi +/visszacsatolás és lassanként az LH-szint növekedése más fajokhoz hasonlóan történik. Az ösztrogén hatása elsősorban a proösztruszban kifejezett, az ösztrusz alatt szintje már elkezd csökkenni azzal párhuzamosan, hogy a negatív visszacsatolás miatt az FSH szintek csökkennek és helyette inkább az LH kezd emelkedni (mert a surge centerre az E2 egyre inkább pozitívan csatol vissza, így nő a GnRH pulzusfrekvencia, a magasabb frekvenciák pedig inkább LH-t indukálnak a 157
hipofízisből). Szukában LH hatására a növekvő, de még nem ovulált follikulusok falában is intenzíven megkezdődik a luteinizáció (ún. preovulációs luteinizáció, mely más fajokban is van, de nagyon kis mértékben), így az ösztrusz idején már elkezd emelkedni a progeszteron szintje és az ösztrusz második felében ez a hormon lesz a domináns és az elkövetkező metösztruszban/diösztruszban is. Szukában az ovuláció az LH csúcs (hossza 12-24 óra) után 2-3 nappal következik be. Ki kell azonban emelni, hogy még további 2 napig nem tud megtermékenyülni a petevezetőben a petesejt, mert a többi háziállatfajtól eltérően a szuka petesejtjei „éretlenül” ovulálnak. Vagyis nem jutnak el az ovuláció környékén az I. profázisból a II. metafázisba, ez csak később, a petevezetőben következik be (ehhez kell a 2 nap). Az ovulált tüsző helyén kialakuló sárgatest progeszteron-termelését a vemhesség/diösztrusz 30-35. napjáig az LH tartja fenn. Ezt követően azonban a P4-általi negatív visszacsatolás az LH-leadásra olyan intenzív lesz, hogy nem képes tovább fenntartani a CL-t. Ezzel párhuzamosan viszont megemelkedik a prolaktinszekréció és a vemhesség/diösztrusz hátralévő szakaszában ez a hormon a luteotróp faktor a kutyafélékben (valamint az ellés után a tejtermelésért is felelős)! A szukában tehát az endometrium nem termel luteolitikus faktort (ellentétben a többi háziemlőssel), ezért van, hogy a nem vemhes ciklus nagyon hasonló a vemhességhez. A diösztrusz végén, ill elléskor bekövetkező luteolízisről keveset tudunk, de feltehetően az endometriumtól függetlenül, a sárgatesten belüli intrinsic mechanizmus révén következik be (vagy vemheseknél a fötoplacentáris egységből jöhet a terminuskor PGF2α). A ciklikus működés zavarai szukában Infertilitáshoz vezetnek A pubertás fajtánként eltérő időpontban (többnyire 4-24 hónapos korban), kistestű fajtákban általában korábban, nagytestűekben később következik be (ez kanokra is ugyanígy igaz). Anösztrusz
158
Kórosnak tekinthető, ha a 2. életévét betöltött szuka még nem tüzelt, ez az ún. primer anösztrusz (a kanoknak is ilyen korukban már normális spermát kell produkálniuk). A primer anösztrusz hátterében fejlődési rendellenességek, pl. hermafroditizmus (heréje és petefészke is kifejlődik az állatnak) ill. pseudohermafroditizmus (petefészkei vannak, de a másodlagos nemi jellegek nem ennek felelnek meg, pl. a clitoris kifejezetten nagy és „pénis-szerű”) vagy hormonális zavarok (pl. hypothyroidismus, Cushing) állhatnak. A már ivarérett szuka ciklikus működése normálisnak tekinthető addig, amíg két tüzelés között nem telt el több, mint 1 év (ennyit az egyedek/fajták közötti változatosság okozhat). Ha >12 hó eltelik két tüzelés között, az a secunder anösztrusz. Oka lehet hypothyroidismus, Cushing (iatrogén is), éhezés, stb. Természetesen lehet, hogy az állat azért nem tüzel, mert már korábban ivartalanítva volt (csak a tulajdonos ezt nem tudja) vagy ovuláció történt, csak nem látszódtak kívülről a tüzelés tünetei (csendes ivarzás: pl egy kortikoszteroiddal kezelt Cushingos szukában a gyógyszer elnyomhatja az ivarzási tüneteket)! Perzisztens ösztrusz Az első két ivarzás során előfordulhat, főleg kistestűekben. Ilyenkor a tünetek ellenére a tüzelés 1. napjától számított 25. napig nem történik ovuláció. (GnRH/hCG adása talán ovuláltathat, de nem igazán jó) Split ösztrusz Ez is főleg az első két tüzelés során fordul elő. Ilyenkor a szuka szabályosan tüzel, de a proösztrusz klinikai tünetei 1-2 hét után ovuláció nélkül megszűnnek/abbamaradnak. Később, néhány nap/hét múlva a tüzelés újra kezdődik és ebből már lesz ovuláció is! Háttér: tüszőnövekedés megindul majd megszakad. A tüszőnövekedés eredményeként kialakuló harmadlagos tüszők elsorvadnak (nincs ovuláció), majd néhány nappal/héttel később új tüszőnövekedési hullám kezdődik.
Ciklusdiagnosztika szukában
159
Klinikai tünetek Vaginoszkópia Hüvelycitológia Hormonszintek (elsősorban P4) mérése
Klinikai tünetek: Proösztrusz alatt a kanok érdeklődést mutatnak a szuka iránt, duzzadt péra és véres-savós váladék ürülése látható, a hímek közeledését nem fogadja. Ösztrusz során a váladékozás csökken, illetve megszűnik. A péra duzzanat csökken. A szuka a farkát emeli és eltűri a kanok közeledését. Vaginoszkópia: A ciklusdiagnosztika kizárólag erre nem alapozható, bár gyakorlott vizsgáló kezében hatékony lehet, ha a proösztrusz első néhány napja után legalább másnaponta ellenőrzi a hüvely képét (egyidejűleg citológiát és P4-et is!). Az ösztrusz vége felé haladva a ráncok (hosszanti és harántirányú begyűrődések egyaránt) egyre kifejezettebbé válnak. Citológia: A 45 fokban dorsálisan a hüvelybe vezetett tampont a nyálkahártyának érintik és megforgatják. Utána tárgylemezhez érintve ismét megforgatják úgy, hogy a mintával a tárgylemezt összekenik, majd a kenetet megfestik pl. Diff-Quick-el. A parabasalis és intermedier sejtek a hüvely-nyálkahártya jellemző köbös (kerekded), magvas sejtjei, melyek ösztrogén hatására kezdenek proliferálni, úgy, hogy a felső réteg később elszarusodik és kialakítják a jellegzetes keratinizált superficiális sejteket (szögletes öszecsapódott pacák a kenetben, alig vagy nem látható sejtmaggal). A hüvelynyálkahártya rétegvastagsága és a keratinizálódott sejtek aránya egyre fokozódik a korai proösztrusztól a késői proösztrusz stádiumig (ekkor már 70-80%uk keratinizálódott). Legnagyobb vastagságát ill. szinte 100%os keratinizációs indexet (amikor a mintában lévő szinte minden sejt elszarusodott és köztük >50% mag nélküli) az ösztrusz idején láthatunk. A fogamzás szempontjából optimális időszak közeledtével a keratinizációs index a 100-hoz közelit! Vörösvérsejtek a proösztrusz alatt végig láthatók (illetve főleg a korai szakaszban leukocyták is!!) és előfordulhatnak az ösztruszban is (bár számuk ezalatt fokozatosan csökken, de egyáltalán nem biztos hogy hiányoznak a vvs-ek!). 160
Az ösztrusz - metösztrusz közötti határt (ami az ovuláció után ~ 6 nappal következik be) úgy lehet meghúzni, hogy hirtelen drasztikusan lecsökken az elszarusodott sejtek aránya és sok leukocytát látunk, mert ezek takarítják el a törmeléket. Az anösztrusz alatt a kenetben néhány parabasális vagy intermedier sejt látható, amelyek egyike sem kornifikálódott. Önmagában ezzel a módszerrel sem lehet megmondani nagy biztonsággal, hogy mikor lesz az ovuláció, márpedig a termékenyítés/fedeztetés időpontjának meghatározásához erre szükség van! Hormonszintek vizsgálata: Klinikai szempontból a szérum progeszteron koncentrációjának mérése a legmegbízhatóbb az ovuláció időpontjának előrejelzéséhez. Bár a rövid ideig tartó, átmeneti LH-csúcs közvetlenül is mérhető, viszont emiatt igen gyakran kellene mintát venni a pontos diagnózishoz, ezért a gyakorlatban inkább a P4vizsgálat terjedt el. Általában főleg ELISA-val mérjük a P4-et, ng/ml-es nagyságrendben! 1 ng/ml érték alatt a szuka még anösztruszos vagy korai proösztruszos. A P4 legtöbbjüknél a tüzelés kezdete után lassan kezd emelkedni ~ 2 ng/ml határértékre, az LH csúcs valamikor a 2-3 ng/ml progeszteron érték környékén van. Az ovuláció két nappal az LH csúcs után következik be (ez >5 ng/ml körüli P4 értéket jelent, >5 ng/ml progeszteron tehát a lezajlott ovulációra utal). Összefoglalva: 1-ről 2 ng/ml-re sokszor csak napok alatt (vagy 1 hét esetleg még több) megy fel a P4, annak ellenére, hogy a kutya lehet, hogy már régóta tüzel. 2-ről 5 ng/ml-re 2-3 nap alatt fog megemelkedni. 5-ről 15-re viszont 1 nap alatt fölmehet (Innentől meg „pillanatok alatt” 20 felett van, amelyik tartományban már nem annyira szoktunk mérni). Látható tehát, hogy az emelkedés üteme gyorsul. Ezért legjobb úgy ütemezni a P4 méréseket, hogy 2-3 ng/ml-ig kétnaponta, utána meg a biztonság kedvéért naponta!
1. Ha csak egyszer tudunk termékenyíteni (friss vagy hűtött spermával), akkor az 2 nappal az ovuláció után javasolható (vagyis ha 5-15 ng/ml közti értéket mér a labor /van aki > 6 ng/ml értékben határozza meg/, akkor kb. másnap termékenyítenek/fedeztetnek). Ha van lehetőség második termékenyítésre, arra 2 nappal később kerül sor.
161
2. Fagyasztott sperma esetén valamivel később kell termékenyíteni (az LH csúcs után 5-6 nappal), vagyis ha a labor 5-15 közti értéket mér, azután kb. 1.5-2 nappal később rakják be (a spermiumok csökkent élettartama miatt!). Természetes fedeztetéskor a „termékeny ablak” sokkal szélesebb, mivel a spermiumok és a petesejt legalább 6-7 napig életképesek a nemi utakban (ezért akár egy proösztruszban, vagy egy látszólag későn történt fedeztetés is lehet fertilis!). De ilyenkor is 5-15 ng/ml progeszteron érték mellett célszerű fedeztetni. A fedeztetés 2 nap múlva a biztonság kedvéért természetesen megismételhető. A szuka vemhessége és ellése
A spermium és az oocyta egyaránt sokáig életben maradnak a petevezetőben „így várhatnak egymásra”, ezért a szuka vemhességének hossza látszólag széles határok (57-70 nap között) kőzött mozog. A valóságban azonban elég standard (plusz/mínusz 2 nap) a hossza, ha az alábbi konkrét eseményekhez kötjük:
-
Az LH-csúcstól számítva: ~65 nap Az ovulációtól számítva (2 nappal az LH csúcs után): ~63 nap A citológiai diösztrusz kezdetétől (6 nappal az ovuláció után): ~57 nap
A nem vemhes és vemhes szukák hormonális profilja szinte megkülönböztethetetlen. A vemhességhez végig szükség van a petefészkeken lévő sárgatestekre (bár a 30. nap után az LH helyett a PRL válik a fő luteotróp faktorrá), tehát a szuka vemhessége corpus luteum dependens. A progeszteron és a prolaktin szint alapján tehát a vemhességet nem lehet diagnosztizálni! A beágyazódás a 20. nap körül történik meg. Vemhességi diagnózis Fizikális vizsgálat: a hasfal áttapintásával (nem megbízható, bár a méhmegnagyobbodása akár már a 4. hét végétől érezhető; van aki 23-24. napban határozza meg; nagy mértékben függ a vizsgáló tapasztalatától)
162
Transzabdominális ultrahanggal (20. nap környékétől már látszanak az embrionális hólyagok, egy héttel később pedig már a szívverés is észlelhető. A szívverés a magzatok életképességére is utal: <150-170/perc már nem jó!) Röntgenvizsgálat (csak a 45. naptól, amikor már kialakult a csontváz! A magzatok számának megítélése szempontjából ez a legmegbízhatóbb – megszámolják, hogy hány fej van, míg UH-nál ez nehézkes!) RELAXIN-teszt vemhesség-specifikus endokrin vizsgálat, amit laborban vagy akár gyorsteszttel is el tudunk végezni A relaxin a placentában termelődik (tehát vemhesség specifikus, mert a nem vemhes diösztruszban nincs!), és a 26-28. naptól kezdve kimutatható a vérből! Megjegyzés: koncentrációja egy vetélést követően is változó ideig magas marad! Drága!! Felmerülhet a kérdés, hogy milyen idős a vehem. Erre akkor van igény, amikor a fajtánál/egyednél ellési komplikáció várható (pl. angol bulldogban és társaiban gyakran kell elektív császármetszést végezni), ezért pontosan kell előre tudni, hogy mikor várható a terminus (márpedig ezt legtöbbször nem lehet pontosan kiszámolni, hacsak nem P4-profil alapján termékenyítették). Erre vannak módszerek, hogy hogyan lehet UH-gal nagy biztonsággal megmondani (pl. eleinte az embrió hossza alapján, vagy a magzat fejének, később hasának átmérőjéből megállapítható) Eőfordul, hogy a tulajdonos azért fordul állatorvoshoz, mert a vemhes szukának valamilyen váladék ürül a hüvelyéből. Kis mennyiségű, tiszta és szagtalan váladék normális (főleg a vemhesség késői szakaszában). A rendellenes kifolyás legfontosabb okai a következők: -Nem a nemi szervekből, hanem a húgycsőből jön a váladék húgyúti fertőzés, esetleg neoplázia miatt (általában dysuria és haematuria van) -Brucellosissal fertőzött a vemhes szuka (ez szinte mindig vetéléshez vezet a 45. nap után, ezért abnormális kifolyás esetén nem árt tesztelni rá a vemhes szukát) -Azért ürül sötétvörös/barna váladék, mert a szuka elvetélt (okait lásd később!) -Pyometra ritkán ugyan, de előfordulhat vemhességgel együtt! (gennyes kifolyás) Az ellés előrejelzői 2-3 nappal megelőzően (mint a legtöbb fajban): A péra ödémája, savós hüvelykifolyás (nem feltétlenül kell kórosnak gondolni, mert a szuka legtöbb genitális betegségében nem savós a kifolyás) nyugtalanság, testhőmérséklet csökkenése (nem olyan megbízható, mint sokan gondolják), tejelválasztás megindulása (szintén nem megbízható). 163
Az ellés 1. szakasza (előkészítő fázis): átlag fél-egy napig tart (4-36 óra is lehet), enyhe méhkontrakciókkal. A 2. szakasz (kitolási fázis): A magzatvíz elfolyása után 4 órán belül meg kell születnie az első kölyöknek (sötétzöld váladék ürülése a placenta leválására utal. Egy órán belül meg kell születnie az első magzatnak, hogy ne fulladjanak meg). A további kölykök átlag 30 perces nyugalmi szakaszt követően jönnek a világra. 3. szakasz (utófázis): A kölykök vagy burokban születnek (erre egyébként még lóban lehet példa, egy fejlődéstani jellegzetesség miatt, a mesamnion ugyanis ebben a két fajban eltűnik, így a csikó és kutya magzatokat teljesen körülveszi az amnion) vagy anélkül, csak a köldökzsinór által tartva, ekkor a magzatburkok a következő kölyök előtt (vagy azzal együtt, esetleg azután is) távozhatnak. Nehézellés Egyes kutyafajták esetében különösen gyakori lehet a nehézellés (így pl. a brachicephal fajták, yorkshire, tacskó, csivava, stb.). A magzat részéről leggyakrabban az abnormális prezentáció okozhatja, de a relatíve nagy magzatok is (ez főleg kis alomszám esetén fordul elő. Kis alomszám pl. következhet rosszul időzített fedeztetésből, ill. MT esetén általában kisebb az alomszám. Ezek tehát részben megelőzhető okok). A túlhordás (az ovulációtól eltelt 64 nap után még semmi jel nem utal ellésre) is eredményezhet nagy magzatot. Túlhordás fordulhat elő, amikor a tulajdonos nem a P4-profil alapján fedeztetett és ennek következtében nem tudjuk, hogy a fedeztetés az ovulációhoz képest mikor történt. Javasolt beavatkozni, ha a fedeztetés óta már eltelt 63-64 nap, mert feltételezni lehet, hogy a fedeztetés pont az ovuláció időpontjában történt és ez azt jelenti, hogy lassan túlhordja az anya a magzatokat és császármetszést kell végezni. Az anya részéről a primer fájásgyengeségnek (az ellés 2. fázisának a kontrakciói eleve nem indulnak el), azaz a méhkontrakciók hiányának több oka, többek között örökletes oka is lehet. Mivel ekkor az anyai vér Ca-szintje túl alacsony, az oxitocin önmagában legtöbbször nem segít (mert ez Ca nélkül nem tudja összehúzni a simaizmokat), viszont ha iv. kálciumot is adunk lassan, az fokozhatja/javíthatja a hatást. A primér fájásgyengeség gyakran császármetszéssel fejeződik be, főleg ha a placenta-leválás már elkezdődött (sötétzöld váladék ürülése)! A másodlagos fájásgyengeség az anya méhizomzatának kifáradásából ered (tehát születtek már meg kölykök, de van még magzat a méhben, ami nem születik meg). 164
Ilyen esetekben jól működik az oxitocin. DE!!! Ha a magzat elakadt és ezért nem TUD megszületni akkor az oxitocin ellenjavallt!!, mert méhrepedést okozhat. Ilyenkor császármetszést kell végezni! A magzat szülőútban történő elakadásának okai: nagy méret, rendellenes fekvés vagy tartás, stb.. Magzatburok visszamaradás előfordulhat, ekkor oxitocin (esetleg prosztaglandin) adása segít + AB. Láz és étvágytalanság társulhat a problémához. Diagnózis: számolás + UH. Makacs/szövődményes esetben ovariohysterectomia. Hormonkezelések indikációi szukában 1. Ösztrusz indukció 2. Ösztrusz szuppresszió 3. Nem kívánt vemhesség megszakítása 1. Ösztrusz indukció Primer vagy szekunder anösztrusz esetén, ha részletes kivizsgálással semmilyen primer kórok (pl. hypothyroidismus) nem található, akkor szóba jöhet a tüzelés gyógyszeres kiváltása. Ugyancsak sor kerülhet rá, ha szeretnénk lerövidíteni a szuka anösztruszát, hogy mielőbb újra tüzeljen/fedeztethessük. Az anösztrusz kezdetekor egyik kezelés sem vezet jó eredményhez (ha indukál is ösztruszt, a termékenyülési ráta rossz lesz). Nagyobb siker érhető el az anösztrusz második felétől, amikor már csak 1-2 hónap van hátra a következő spontán ovulációig. Cél: érett tüszők létrehozása (az ösztrogén csak ivarzási tüneteket okoz).
• •
•
GnRH-agonista szubkután implantátum 1 hétig (tovább bent hagyva elnyomja az ivarzást!), a proösztrusz kezdetéig. Bromokriptin vagy cabergolin (utóbbinak a mellékhatásai enyhébbek, ezért inkább ezt preferálják) tartamkezelés után (főleg az anösztrusz közepénvégén) jó eséllyel bekövetkezik ivarzás (ez is mutatja, hogy a PRL-nek fontos szerepe van az anösztrusz fenntartásában is). Cabergoline 5 ug/kg po, a proösztrusz első jeléig > interösztrusz megrövidítése. PMSG néhány napig adagolása, majd az utolsó napon hCG (a napok száma protokollonként változhat) 165
2. Ösztrusz szuppresszió A tüzelés gyógyszeres elnyomása akkor szükséges, amikor pl. rendezvényre viszik a szukát és nem szeretnék, ha azalatt kezdene ivarzani. Ezeket a gyógyszeres protokollokat csak akkor használják, ha egyszer még tenyészteni akarják a szukát. Amennyiben a szaporulat megakadályozása a cél, akkor inkább megfontolandó az ivartalanítás. Összességében elmondható, hogy a kívánt és biztos hatás elérése elég nehéz és nincs igazán jó megoldás rá. A gesztagén készítmények (ahogy más fajokban is használják pl. szinkronizálásra a GnRH pulzusfrekvenciára kifejtett negatív hatása miatt) és androgén-származékok hatékonyan képesek késleltetni az ivarzást (elsősorban akkor, ha még annak kezdete előtt, az anösztrusz végén adjuk). Azonban mindkettőnek súlyos mellékhatásai lehetnek, ezért használatuk nem javasolt! A gesztagének (Medroxyprogesteron acetat /Depo-Promone/ 1-2 ml s.c., csak anösztruszban; Megesztrol-acetát /Ovarid Pill’Kan) fokozzák a pyometra kialakulásának veszélyét, valamint szukában kifejezetten diabetogének is (a kutyák II. típusú non-inzulin dependens diabetese elsősorban szukákban fordul elő és az inzulinrezisztencia kialakulásában a progeszteronnak – a természetes ciklus részeként is – nagy szerepe van). Az androgének pedig kifejezett maszkulinizációt és viselkedési változásokat okozhatnak. A gesztagének közül még talán a hosszúhatású proligeston injekció (Covinan, 1-6 ml s.c., proösztrusz elején is adható) a legkevésbé kockázatos. Van azonban egy sokkal veszélytelenebb opció, ez pedig a GnRH-agonista bőralatti implantátum (amit akár 1 évig is bent lehet hagyni). Folyamatosan magas GnRH szint alakítható ki, ami deszenzibilizálja a hipofízis GnRH-receptorait, így az első egy hét után az LH és FSH szintek drasztikusan csökkennek (down reguláció). Hátránya viszont, hogy az első 1 hétben ivarzást tud indukálni, ami akár fertilis ovulációval is járhat! GnRH-agonista bőralatti implantátum: Deslorelin (Suprelorin) 4.7 mg implantátum. Előnyök: reverzibilis szupresszíó, mindkét nemben használható, „vértelen” ivartalanítás, testtömegtől független hatás. Hátrány: behelyezés után fertilis ivarzás (első hét), tesztoszteron átmeneti emelkedése, hosszú távon here atrófia (kiállítás, fertilitás?).
166
(Egyes nagytestű - OHE utáni inkontinenciára kifejezetten hajlamos - fajtáknál előbb kipróbálhatjuk implantátummal, hogy az ösztrogén hiányra inkontinenciával reagálnak-e és ha igen, akkor az ivartalanítás megfontolandó).
3. A nem kívánt vemhesség megszakítása Ha a tulajdonos behoz egy befedezett tüzelő szukát és az a kérése, hogy vetéltessük el, mert nem akarják, hogy vemhes legyen, akkor javasolt elsőként ellenőrizni hüvelycitológiával és progeszteron szint megállapítással, hogy tűzel-e + mikor várható (vagy mikor volt) az ovulációja. Mivel a spermiumok 6-7 napig is életképesek a nemi utakban, ezért ovuláció vagy LH csúcs előtt történő fedezésből is lehet fogamzás. Ugyanakkor gyakori a téves riasztás is! A vemhesség megszakítására szolgáló módszerek többsége csak a vemhesség 3035. napja körül/után hatásos. Ezért bőven belefér, hogy UH-val a 20 napos vemhességet megállapítsuk és utána indukáljuk az abortuszt. Az egyetlen szer, ami a megtermékenyülés idejében, amikor a szuka még ösztruszban van (100% körüli kornifikáció) hatásos, az az ösztradiol (a nidáció gátlása révén hat). Használata megfontolandó, mivel fokozza a pyometra kockázatát és a súlyos csontvelő-szupressziót okoz. Vetéltetés az UH-diagnózis után:
•
Prosztaglandin származékok adása több napon (kb. 9 nap) keresztül változatos protokollok -(luteolízis indukciója); mellékhatásként hányás, hasmenés, stb. lehet. Cél: CL működésének megszüntetése! Kezelés 1: 0,25 mg/kg, sc. 12 óránként; Kezelés 2: 0,25 mg/kg sc., naponta 4 napon keresztül; Kezelés 3: 0.1 mg/kg 8 óránként, majd 0.2 mg/kg a 3. kezelési naptól. Mellékhatások: simaizom görcsök, nyálzás, hányás, hasmenés, vizeletürítés, szaporalégzés, brachycardia).
•
Cabergoline (5 ug/kg, po) több napon át (5 nap) a vetélésig, ami 3-5 napon belül bekövetkezik, minimális mértékben idéz elő kellemetlen tüneteket (PRL luteotróp hatásának felfüggesztése); bromokriptint is lehetne, de ennek több negatív mellékhatása van (pl. hányás, stb.).
•
Progeszteron-blokkolók (pl. aglepriszton) adagolása több napon keresztül. 167
•
Fenti kezelések kombinációja, pl. cabergoline (1.0 ug/kg 2 sc. injekció, 4 nap különbséggel) + szintetikus PGF2 alpha (Cloprostenol)
•
Dexamethasone: 5 mg im., naponta kétszer 10 napon keresztül → 1-3 napon belül vetélés.
A vemhesség 40. napjáig végzett vetéltetés után felszívódnak a magzatok, bár később magzati szövetek távozhatnak a hüvelyen keresztül. Az 55. nap után hüvelyi úton, akár élve távozhatnak a magzatok (eutanázia kell!)! Ovari(ohyster)ectomia (OHE) A szuka ivartalanítása részben populáció-szabályozási eszköz (nem kívánt vemhesség megakadályozása), részben gyógyító-terápiás eljárás (pyometra, petefészekciszták, diabetes mellitus), részben pedig betegség prevenciójára (méhdaganatok, emlődaganatok, pyometra) szolgál. Az ivartalanítás javasolt időpontjára vonatkozó vélemények eltérőek. Az egyik iskola szerint 6-14 hetesen már el kell végezni a műtétet, azzal az indokolással, hogy így szinte nullára csökken az emlődaganatok előfordulási valószínűsége. A korai műtét azonban fokozott inkontinenciát eredményez, és együtt jár a külső nemi szervek fejlődési zavarával (egy alulfejlett, befordult hüvelyben a krónikus vaginitis sokkal gyakoribb; miközben a juvenilis vaginitist egyébként az elsőmásodik tüzelés után jellemzően „kinövik” az állatok). A másik vélemény az első tüzelés után javasolja elvégezni a műtétet. Ilyenkor nem annyira csökken az emlődaganatok előfordulása (a 3. tüzelés után ivartalanított állatoknál pedig egyáltalán nem), de cserébe már fejlettek a külső ivarszervek, a következményes inkontinencia pedig ritkább és kevésbé intenzív. Az ovariectomia és ovariohysterectomia a hatások/mellékhatások tekintetében nem különbözik lényegesen egymástól(az elváltozás mentes méh nyugodtan bent hagyható). Fontos viszont, hogy a ciklus melyik szakaszában végzik a műtétet! A legjobb anösztruszban csinálni! Diösztruszban végzett ovariectomia esetén gyakori az álvemhesség (a P4-szint lemegy a műtét után, mintha közelegne az ellés és el kellene kezdeni tejelni)! Proösztruszban vagy ösztruszban végzett műtét 168
esetében viszont megnő a posztoperatív vérzések veszélye (ekkor ugyanis sokkal vascularizáltabbak a szövetek). Egyébként az állat érdekeinek figyelembe vétele is fontos (egyes nagytestű fajták pl. kifejezetten hajlamosak inkontinenciára), ugyanis az ivartalanításnak komoly következményei vannak (egy ivartalanított szuka hormonálisan nagyon hasonló a postmenopauzális emberhez; az E2 és P4-szintek lemennek, negatív visszacsatolás megszűnik, az FSH és LH szintek ezért megemelkednek). Az ösztrogének csontfejlődésre, anabolikus folyamatokra, immunrendszerre kifejtett hatásai tehát megszűnnek. Egyértelmű és többször bizonyított mellékhatás a szuka inkontinenciája (de megfigyeltek emelkedést egyes daganatok - pl. osteosarcoma - előfordulásában is), ami elhízással és gyakoribb húgyúti fertőzésekkel járhat együtt. Bár nem egyértelműen bizonyított, de az elülső kereszteződő szalag szakadás valószínűleg gyakoribb ivartalanított szukákban. Az inkontinencia az ösztrogén hatás kiesése miatt jelentkezik (részben a sphincter urethrae ösztrogén-dependenciája miatt) és ösztrogén-pótlással elvileg javítható (mint postmenopauzális nőknél), de az ösztrogének hosszútávú csontvelőszuppresszív hatására emlékezni kell! A hagyományos műtéti komplikációk mellett (pl. vérzések a lekötések mentén a méhcsonkból/petefészek csonkból, stb.) gyakori posztoperatív komplikáció a petefészekdarab vagy darabok bennmaradása, például azért, mert rossz helyre került lekötés és emiatt nem vágták ki a teljes szervet („ovarian remnant szindróma”). Ilyenkor az operált állatban maradt hormontermelő szövet később ivarzási tüneteket okozhat, illetve pyometra kialakulásához vezethet Ez intakt méh mellett (ovariactomia) is előfordul, ha a méhet is kivették, ugyanis nem lehet a csonkból maradéktalanul eltávolítani a nyálkahártyát (csonk-pyometra). Előfordulhat még vérzés a hüvelyből, vagy fonálsipoly is.
A szuka ivarszervi kórképei 1. 2. 3. 4.
A nemi traktus fejlődési rendellenességei Vaginitis Juvenilis vaginitis Hüvelyelőesés (vaginal hyperplasia) 169
5. CEH (HGCE)/Pyometra 6. Álvemhesség 7. Az abortus lehetséges okai 8. Szubinvolúció 9. Puerperalis metritis 10.Puerperalis eclampsia 11.Mastitis és agalactia 12.Petefészekciszták és tumorok 13.Hüvelydaganatok 14.Emlődaganatok 1. A nemi traktus fejlődési rendellenességei A részletek nélkül megemlítésre kerülő rendellenességek többsége nyilvánvalóvá válik a fizikális/vaginoszkópos klinikai vizsgálat során.
•
Hüvely hypoplasia (az alulfejlettség itt pl. szűk keresztmetszetben nyilvánulhat meg)
•
A kétoldali Müller-cső inkomplett fúziója (az erszényeseknél fizológiás vagina duplexet eredményezhet)
•
Péra hypoplasia (egy alulfejlett péra lehet a túl fiatalon végzett ivartalanítás következménye is, mivel a másodlagos nemi jellegek nem fognak kialakulni)
•
Perzisztáló, átjárhatatlan hymen (a vestibulum és craniális vagina határán található „fal” elzárja a lument – ez akadályozza a termékenyülést, de fájhat is + a tüzeléskor a véres-savós váladék sem tud ürülni.)
• •
„Kötőszövetes gyűrű” (a hüvely gyűrűszerűen beszűkül)
Rectovaginális fistula (általában atresia ani-val jár együtt - a rectum a végbélnyílás helyett a hüvelybe nyílik) A fentiek többsége hajlamosít vaginitisre az anatómiai rendellenességek miatt!
(A hüvely hypoplasia és a duplex vagina műtétileg nem oldható meg, a többi általában igen). 2. Vaginitis
170
Bármely korú állatban (intakt és ivartalanított szukában is) előfordulhat, legfőbb tünete a nyálkás-hurutos/hurutos-gennyes hüvelykifolyás (+ vaginoszkóppal kipirult a nyálkahártya) A szuka intenzíven nyalogatja a pératájékot, ami akár clitoris hypertrófiához is vezethet, s ez a kanok fokozattabb érdeklődését válthatja ki. Szisztémás tünetek nincsenek (vérkép is normális), ez alapján a nyitott-cervixű pyometrától (lásd később, ahol szintén gennyes kifolyás van) elkülöníthető. Oktanát tekintve a hüvely/húgycső flóra baktériumai (Strepto, Escherichia, Proteus, Pseudomonas, Mycoplasma, Ureaplasma…stb) vagy gombái (esetleg egyes vírusok) okozzák a gyulladást. Idegen test, hüvely/péra hypoplasia ill. daganat prediszponálhat rá. A mintát kontamináló egészséges flóra miatt nehéz definitív mikrobiológiai diagnózishoz jutni, de a craniális vaginából vett tamponmintából megpróbálható (kritikusan kezelendő!). A (1) postpubertális vaginitis széles-spektrumú AB kezelésre általában jól gyógyul. Az (2) ivartalanított szukák krónikus vaginitise gyakran társul húgyúti fertőzéssel (ennek tüneteivel), illetve inkontinenciával. AB kezelés (de ha néhány hetesenhónaposan végzett ivartalanítás miatt nem fejlődött ki a másodlagos nemi jelleg, ami prediszponál fertőzésre, akkor a siker kérdéses). Külön kell szólni a (3) juvenilis vaginitisről, amelynek hajlamosító tényezőit kevéssé ismerjük (anatómiai okok lehetnek a háttérben). Prepubertás szukákban fordul elő (a péraajkak jellemzően összetapadtak és kis mennyiségű kifolyás van). Legtöbbször enyhe fokú, nem igényel kezelést (legfeljebb le lehet mosni naponta 1-2x a vulva környékét) és magától elmúlik az 1. tüzelést követően! Súlyosabb esetekben AB terápia segíthet. 4. Hüvelyelőesés (vaginal hyperplasia) Proösztruszban vagy ösztruszban fordulhat elő (elsősorban nagytestű fajtákban), mert a magas ösztrogén-szint intenzív proliferációra ösztönzi a hüvelyi hámsejteket, továbbá ödémás beszürődést idéz elő.
171
Általában a hüvely ventrális falából indul ki (a húgycső nyílásának környékéről), de ennek ellenére ritka a dysuria. A diagnózisa elég egyértelmű, a tüzelés alatt kisebb nagyobb rózsaszínű képlet lóg ki a hüvelyből (hüvelyelőesés), ami tulajdonképpen a hüvely fala! (differenciál diagnózisként hüvelydaganat jöhet szóba, de a magas keratinizációs index a hüvelykenetben és esetleges biopszia megerősíti a hüvelyelőesés diagnózisát). Negatív következmények: keringési zavar, nyálkahártya kiszáradása, szennyező anyagokkal való kontamináció, sérülések/kimaródások. Az enyhe fokú hüvelyelőesés terápiát nem igényel (legfeljebb gallért kell rakni a kutyára), a tüzelés végeztével magától elmúlik (bár az ellés körül kiújulhat, az ideiglenesen megemelkedő E2-szint miatt!). Problémát jelenthet azonban, hogy a természetes fedeztetés akadályozott lehet, ezért súlyosabb esetekben mesterséges termékenyítést kell alkalmazni. Nagyfokú prolapsusnál a húgycsövet katéterezzük és medián episiotomia (gátmetszés) után óvatosan visszahelyezzük a helyére az előesett hüvelyfalat, majd egy-egy öltéssel a pérát zárjuk. A kórkép a következő tüzelések során kiújulhat, ezért ha nem tenyészállatról van szó, érdemes megfontolni az ivartalanítást, ami végleg megszünteti a problémát, mert többé nem lesz magas ösztrogén koncentráció. A fentiek miatt vannak olyan vélemények, hogy az előesett részt műtéti úton el kell távolítani. Ez az egyedüli helyes megoldás. Visszahelyezés + hüvely varratokkal történő zárása helytelen megoldás. 5. CEH (HGCE)/Pyometra A pyometra a diösztruszban, leggyakrabban 4-8 héttel a tüzelést követően jelentkező potenciálisan életveszélyes betegség. A hátterében a méhnyálkahártya cisztás degenerációja áll (CEH - cystic endometrial hyperplasia = HGCE - hyperplasia glandularis cystica endometrii). A tüzelés kezdetekor megfigyelhető magas ösztrogén-koncentrációt hosszú ideig tartó progeszteron-hatás követi, és a méhfal a nem vemhes diösztrusz alatt is kifejezett átalakuláson megy keresztül. Mindez az ismételt ciklusokat követően az endometrium cisztás degenerációjához vezet, és 9-10 éves korára az intakt szukák 2/3-ában megfigyelhető valamilyen mértékű endometrium hiperplázia! A pyometrás kutyák többsége középkorú vagy idős (>4-5 év), azonban előfordulhat fiatal állatokban is. A vemhességnek valamilyen szintű védőhatása lehet (talán máshogy zajlik le az „involúció” a diösztruszt ill. vemhességet 172
követően?), ugyanis soha nem vemhesült intakt szukákban gyakoribb a betegség! A cisztás degeneráció kórfejlődése nem tisztázott eléggé, éppen ezért azt sem tudjuk, hogy mitől lesz egyik szukának pyometriája, a másiknak meg nem (a HGCEpyometra valószínűleg nem különálló és stagnáló állapot, hanem egy évek során progrediáló kórfolyamat az egészségestől a degenerálton keresztül a befertőződött pyometrás méhig). Az azonban biztos, hogy az ösztrogén ill. progeszteron-kezelések, vagy az ösztrogéntermelő anovulációs petefészekciszták fokozzák az előfordulását (ezért ezeket a hormonkezeléseket nem javasolt használni szukában). A méhdegeneráció elváltozások mértékétől függő (Dow-féle) besorolása lényegében a folyamat súlyosbodását tükrözi: • Dow-I. kategória: enyhe endometrium hipertrófia és lumen tágulat, de nincs infekció! • Dow-II. kategória: intenzívebb hipertrófia és cisztás degeneráció, de nincs infekció! • Dow-III kategória: a cisztás degeneráció (a romlott ellenállóképesség miatt) felülfertőződik a hüvely/húgyúti flóra baktériumaival (Streptococcus, Escherichia, Bacteroides, Mycoplasma…stb)! Van még egy Dow-IV. kategória is, mely egy szubklinikai, krónikus, fertőzés nélküli III-asnak felel meg. Klinikai tünetek: Attól függően változó, hogy nyílt- vagy zárt-cervixű pyometráról van-e szó. Láz csak az esetek kisebb százalékában van, még zárt pyometra esetén is! Jellemző tünet viszont a polydipsia/polyuria, letargia, étvágytalanság és a hányás. Nyílt pyometra esetén gennyes-véres (sárgásbarnás), sűrű, esetleg bűzös hüvelykifolyás figyelhető meg, de az általános állapot gyakran egész jó. Zárt-cervixű pyometra esetén a tünetek sokkal nyilvánvalóbbak és a hasi diszkomfort érzés is kifejezett (a gennyel kitelt méh miatt, ami nem tud kifolyni a cervixen keresztül). A pyometra legfontosabb komplikációja a veseelfajulás (de gyakran lehet peritonitis és akár endotoxin shock is), ami a méh lumenéből felszabaduló endotoxinok közvetett károsító hatásának, illetve a betegség részeként kialakuló immunkomplex-glomerulonephritisnek a következménye. 173
Diagnózis: A legjobb eszköz a transzabdominális ultrahang, amivel (főleg zárt cervixű pyometra esetén) gyorsan meg lehet találni a kitelt méhet (nyílt cervixű vagy kevésbé kitelt méh esetén már több rutint igényel). Mindenképpen kell vérképet nézni, elsősorban a máj és veseparaméterek (jelzik a társult szervkárosodás mértékét) ill. a vérkép vizsgálata miatt (jellemzően leukocytózis – főleg neutrofilek -, balra tolódott vérképpel, ill. enyhe nonregeneratív anémia figyelhető meg súlyosságtól függően). A vemhességtől mindenképpen el kell különíteni, de ritkán a kettő egyszerre is előfordulhat (a differenciál diagnózisba minden, polydipsia/polyuriával járó endokrin betegség , pl. diabetes, Cushing, meg a hüvelykifolyással járó kórképek pl. vaginitis) bevehető! Ultrahang híján szóba jöhet még hason keresztüli palpáció, röntgen vagy a hüvelyi váladék festése a diagnózishoz. Kezelés: Kezelés nélkül akár halálos endotoxin-shockhoz vezethet. Az elsőként választandó terápia az ovariohysterectomia, melynek során figyelünk rá, hogy ne maradjon benn petefészekdarab és méhnyálkahártya rész, mert csonk-pyometrává fejlődhet!). A műtét után napokon belül rendeződik a vérkép és minden rendbejön. A műtétet megelőzően és közben iv. folyadékterápia indokolt, főleg a súlyos esetekben. Természetesen post-operatív antibiotikumot (pl. amoxicillin) kell adni. A tulajdonos kifejezett kérésére konzervatív (gyógyszeres) terápia is megkísérelhető, az endometrium irreverzibilis cisztás degenerációja miatt a fertilitás nem lesz a régi, de azért még elfogadható maradhat), a csak a gennyes méhváladék eltávolítását és a fertőzés kezelését tudja elősegíteni. Zárt pyometra esetén a gyógyszeres terápiát ne javasoljuk, mert a genny nem fog rendesen kiürülni, sőt a méh összehúzódások hatására a másik irányba, a hasüregbe ömölhet! Gyógyszeres kezelés esetén széles-spektrumú antibiotikumot mindenképpen kell adni! Emellett leggyakrabban prosztaglandint szokás adni egészen addig, amíg UH-lelet alapján nem normalizálódik a méh folyadéktartalma (luteolitikus, így megszűnteti 174
a P4 hatást, ezzel csökkenti annak immunszuppresszív hatását + a PGF2α a méhkontraktilitást is fokozza, ezért segíti a gennyes váladék ürülését). Sikeresen lehet kezelni akkor is, ha prosztaglandin és amoxicillin mellé cabergolint is adunk (PRL luteotróp hatásának felfüggesztése). Elvileg működhet még az aglepriszton (P4-receptor antagonista) + széles spektrumú antibiotikum kombináció is. A gyógyszeres kezelés után a kiújúlás veszélye nagyon nagy! Ezért ha kölyköt akarnak még, akkor gyorsan fedeztessenek és aztán mielőbb ivartalaníttassák az állatot. 6. Álvemhesség Nem vemhes szukákban a diösztrusz végén előforduló, relatíve gyakori, tulajdonképpen fiziológiás jelenség (a diösztrusz végén /ivarzás utáni 30. nap körül/ csökkenő progeszteron koncentráció indítja el, mert ennek hatására a luteotróp faktorként működő PRL korábban is magas szintje tovább emelkedik), ami azonban kellemetlen az állattartók számára. Ezt a kutyák a farkastól örökölték, mert ott az alfa nőstény kölykeinek szoptatásába a többiek is besegítenek és ehhez szükséges, hogy a nem vemhes nőstények is elkezdjenek tejet termelni. A tejelválasztáshoz (és az emlők hiperpláziájához; emlő duzzanat) viselkedésbeli változások is társulhatnak (fészeképítés, babázás, anyai ösztön élettelen tárgyak iránt, agresszivitás, stb). A változó intenzitású tünetek többnyire néhány héten belül gyógyszeres kezelés nélkül elmúlnak (kifejni nem javasolt, mert ez csak tovább serkenti a tejleadást). További teendők: az állat által összegyűjtött tárgyakat el kell venni, gyakori/fárasztó séta, ne simogassák. Egyéb tünetek: PU/PD, polyphagia, hányás, súlynövekedés. A kezelés célja: PRL szekréció gátlása!! Mivel a dopamin a PRL leadást gátolja, súlyosabb tünetek ellen dopamin-agonistákat, pl. bromocriptint, cabergolint (utóbbinak kevésbé kifejezett a hányáskeltő mellékhatása) vagy szerotonin antagonista metergolint lehet adni. Agresszív szukák elsősorban benzodiazepinekkel nyugtathatók (acepromazinnal semmiképpen se, mert a PRL-leadást fokozhatja) 7. Az abortusz lehetséges okai kutyákban 175
Vetéléstől akkor lehet tartani, ha elkezd váladékozni a hüvelyéből a szuka (de ennek lehetséges okairól korábban már volt szó - nem biztos, hogy vetélés miatt van) és ha a kölykök szívverése 200/perc alá megy (ezután folyamatos monitorozás). <150-170/perc szívfrekvencia esetén haláluk szinte elkerülhetetlen és a szuka biztosan elvetél. A legfontosabb fertőző okok:
•
Brucella canis
– Jellemzője a vemhesség alatti perzisztáló gennyes váladékürülés, majd a 45. nap után az anya elvetél. Nem vemhes kanokban és szukákban a fertőzés általában tünetmentes, legfeljebb infertilitásban nyilvánulhat meg. A kórokozót kitenyészteni nehéz, ezért a kórképet főleg agglutinációs szerológiai tesztekkel szokás diagnosztizálni. A Brucellákat teljesen eltűntetni antibiotikummal igen nehéz, és mivel zoonózisról van szó, megfontolandó az eutanázia.
• • •
Salmonellosis (a szuka GI-tüneteivel társul) Leptospirosis (a leptospirosis tüneteivel társul) Canine herpesvirus
– Egészséges felnőtt állatok a fertőzést tünetmentesen átvészelik. A vemhesség utolsó 3 hetében bekövetkező fertőződés után azonban vetélés következik be vagy életképtelen magzatok születnek. A „3 hetes szabály” alapján egyébként még az életük első 3 hetében fertőződő kölykökre jelent halálos veszélyt a vírus (a környezeti hőmérséklet 3637 fokon tartása véd valamennyire), más esetben alig pathogén.
• •
Toxoplasma gondii (esetleg Neospora, Leishmania)
•
CL elégtelensége (vetélés gyanúja esetén ELISA-teszttel mérik a P4 szintet, ami nem mehet 5 ng/ml alá hosszú távon! Szívverés alapján még életképes magzatoknál progeszteron-pótlással (per os vagy injekciós szupplementáció) fenntartható a vemhesség.
Emellett aspecifikus, ascendáló fertőzések (a hüvelyi/húgyúti flórából, pl. Streptococcus, Mycoplasma, Ureaplasma) is okozhatnak vetélést a kialakuló placentitis miatt Leggyakoribb nem fertőző okok:
176
•
Vemhességi diabetes mellitus (a magas progeszteron-szint mindig valamilyen mértékű inzulin-rezisztenciával jár - II-es DM -, ami súlyosabb esetekben vetéléshez vezethet. Diagnózis vércukorszint és glükózuria alapján, a prognózis nagyon rossz).
•
Vemhességi toxaemia (nagy létszámú alom esetén a szuka energiaraktárai nem tudják fedezni a kölykök növekedését a vemhesség utolsó szakaszában. Az energiahiány miatt elvetélhet. Erre utal a súlyos ketonuria. Parenterális táplálás megmentheti.)
•
Fejlődési rendellenességek
•
CEH/pyometrával társult vemhesség
A CL-insufficiencia kivételével a magzatok megmentése érdekében nem sokat lehet tenni. Herpesvirus ellen van vakcina (2x oltunk, a tüzeléskor és a vemhesség alatt). 8. Szubinvolúció (SIPS – subinvolution of placental sites) Ez a kórkép elsősorban fiatal szukákban, az első két ellést követő időszakban jelentkezik véres hüvelykifolyás formájában! A hátterében az áll, hogy a kutya endotheliochoriális típusú placentája miatt az anyai és magzat szövetek közötti kapcsolat elég szoros, ugyanakkor a placenta zonaria csak egy sávban tapad az endometriumhoz. Az ellést követően a levált placenta helyén a szöveteknek gyógyulniuk kell és ennek a folyamatnak az elégtelensége vezethet a véres hüvelyváladékhoz. Hajlamosító tényezők: kitágult méh – nagy alomszám (több mint 12 kölyök, méh kontrakciók hiánya, anyagforgalmi zavarok) Szisztémás tünetei nincsenek az állatnak (csak a véres váladék!). Ha ellést követően hosszabb ideig véres váladék ürül, az minden valószínűség szerint SIPS, de nem árt megvizsgálni, mert néha a metritises gennybe is keveredhet vér. Elkülönítő kórjelzésként gondolni kell a von-Willebrand betegségre ill. warfarin-mérgezésre is (véralvadási zavar), hátha ez okozza az ellés utáni vérzést.
177
Specifikus terápia nincs rá, de érösszehúzó és részben méhösszehúzó hatásuk miatt lehet alkalmazni az involúciót elősegítő ergot-alkaloidokat (Ergam cseppek). A kórkép legtöbbször magától elmúlik, de folyamatos kontroll javasolt (nézni kell vérképből, hogy nem lesz-e anémiás ill. a szubinvolúciós helyek prediszponálnak fertőzésre is, úgyhogy ezt is nézni kell a kontrollok során). 9. Puerperális metritis A betegség az ellést követő időszakban fordul elő, leginkább gennyes hüvelykifolyás mellett. A szukában a lochia jellemzően mucoid, szagtalan váladék (színe zöldtől barnáig változhat, akár vércseppekkel), és mennyisége fokozatosan csökken, a 3. hét végére pedig teljesen megszűnik (a teljes szövettani involúcióhoz kell ~ 90 nap, de ezután már nem ürül váladék). Puerperális metritis gyanúja akkor merül fel, ha a kifolyás gennyessé válik, vagy hosszabb ideig eltart, illetve az anyaállat bágyadt, elesett, lázas is lehet, és a kölyköket elhanyagolja. A keringésbe jutó endotoxinok miatt ritkán szeptikus shock is előfordulhat. Ha véres váladék ürül az ellést követően, akkor inkább szubinvolúció a diagnózis (nincsenek szisztémás tünetek)! A metritis kialakulására kifejezetten hajlamosít, ha kölykök vagy placenta darabok maradtak a méhben (ez UH-val látható!), de minden esetben a hüvely/húgycső flórából történik ascendáló fertőzés a méh lumene felé. Diagnózishoz citológiával (nagyszámú neutrofil az ürülő váladékban), esetleg tenyésztéssel lehet jutni (de itt a normál flórából származó mindenféle kontamináló baktérium előfordulhat). Súlyosabb szisztémás esetekben a balra tolódott vérkép kifejezett leukocytosist mutat (neutrophilekkel). Terápia: Empirikus antibiotikum-terápia pl. amoxicillin-klavulánsavval, szükség esetén iv. folyadékterápia. Emellett méhösszehúzó hatása miatt prosztaglandin is adható, hogy elősegítsük a váladék ürülését. A gyógyulási arány jellemzően nagyon jó. 10. Puerperális eclampsia (hypocalcaemia)
178
Az ellést követő 2-3 héten belül jelentkezik, főleg kistestű (nagy létszámú almot nevelő) fajtáknál. Kóroktani háttere, hogy a tejjel - az anya ion-raktárainak rovására - rengeteg Ca ürül (a vér ionizált Ca koncentrációja drasztikusan lecsökken). Így az extracelluláris kálciumkoncentráció lecsökken és ez tetániás görcsökben és következményes hyperthermiában, tachycardiában nyilvánul meg. További tünetek: agyödéma, nyálzás, ataxia, nyugtalanság. eszméletvesztés, elhullás. Vannak korábbi jelek is (remegés, izomgyengeség, a kölykök elhanyagolása), de ezek észrevétlenek maradhatnak. A definitív diagnózishoz a vér kálciumszintjét mérik (elsősorban az ionizált forma csökken radikálisan /0,6 mmol/l alatt/, a totál /1,75 mmol/l alatt/ nem annyira) A kezeléshez azonnali iv. kálcium-glükonátot adnak lassú infúzióban folyamatos szívmonitorozás mellett), majd stabilizálás után szubkután depókészítmény következik. Végül orális Ca és D-vitamin utánpótlással tartjuk fenn a megfelelő ionszinteket a választásig. (A görcsöket szükség esetén pl. diazepammal lehet kontrollálni) A vemhesség alatti kálcium-utánpótlás nem segít, sőt ront a helyzeten (a parathormon „ellustulása” miatt)! 11. Mastitis és agalactia A mastitis az emlők bakteriális eredetű gyulladása, ami az ellést követő időszakban fordul elő. A fertőzést jellemzően a rendes bőr és nyálkahártyaflóraalkotó baktériumok alakítják ki (Streptococcus, Staphylococcus, E. coli, stb.). Érinthet csak egy, vagy több emlőt is (a tej nem feltétlenül darabos állagú, akár normális is lehet). Enyhébb lefolyású, krónikus formájának legfőbb tünete, hogy a kölykök nem nőnek megfelelően, akut formája tapintásra kifejezetten fájdalmas, nem ritkán lázzal, szisztémás tünetekkel jár. Bakteriológiai diagnózist a kifejt tejmintából kaphatunk. Széles-spektrumú antibiotikum kezelésre jól gyógyul! Figyelni kell azonban az ABos kezelésnek a még szoptató szukák kölykeire gyakorolt hatására. Endotoxin sokkos állapot esetén intenzív folyadékterápia is szükséges. Gyulladáscsökkentőket (NSAID) is adhatunk. Elválasztás és a tej kifejése.
179
(Toxic milk syndrome = azt jelenti, hogy a mastitises szuka tejét szopó kölykökben - a bakteriális exo- és endotoxinok következményeként - hasmenéses tünetek jelentkezhetnek. Ez azonban nem gyakori és hacsak nem gangrénás mastitisről van szó, a szukától általában nem választják el a kölykeit.) Előfordulhat, hogy a szuka tejelválasztása nem indul meg. Ez lehet mastitis/metritis miatt, energiahiányból fakadóan, egyéb szisztémás betegség következményeként (hátterében csökkent PRL vagy a leadáshoz szükséges oxitocin termelés zavara áll). Megprobálhatjuk oxitocinnal beindítani a tejleadást. Ha nem indul be a tejleadás akkor a PRL szekréció nem kielégítő. Kezelés: emelni kell a táplálék bevitelt + meg kell szüntetni a háttérben lévő kórokokat. (Off-label gyógyszerként gondolhatunk itt dopamin-antagonisták adására, így pl. a domperidon is működhet, bár nincs törzskönyvezve!) 12. Petefészekciszták és tumorok A perzisztens ösztrusz hátterében ösztrogéntermelő tumor (granulosa sejtes tumor) vagy anovulációs petefészeciszták állhatnak. (A kóros E2 hatást a vérkép is jelezheti a csontvelő-szuppresszió miatt, pl. anémia!) A perzisztens ösztrusz definíciója szerint: „a tüzelés 1. napjától számított 25. napig nem történik meg az ovuláció”. A tulajdonos behozza a kutyát azzal, hogy régóta tüzel, de nem feltétlenül tudja pontosan, mikor volt a kutya ovulációja. Ha a tüzelés (proösztrusz + ösztrusz) már legalább 40 napja tart, mindenképpen gondolni kell perzisztens ösztruszra. Bár mind a proösztrusz, mind az ösztrusz átlag 9-9 nap, de ez széles határok közt változhat, ezért szokás a 40 körüli értéket mondani). Mások a perzisztens ösztrusz diagnózisát úgy határozzák meg, hogy 1) a szuka már több mint 3 hete megáll a kannak (ösztrusz) vagy, 2) min. 6 hétig kornifikálódott citológiája van. Látható, hogy ez mind kb. ugyanazt jelenti! A kóros petefészekképletek jelenléte UH segítségével állapítható meg (ezzel el lehet különíteni a cisztát a daganattól), ha a fentiek alapján sejtjük, hogy perzisztens ösztruszról van szó. Tumor esetében a kezelés mindenképpen OHE, ciszta esetében is ezt kell javasolni, de tenyészállatnál hCG-vel vagy GnRH-analóggal történő ovuláltatással is meg lehet próbálkozni. 180
A ciszták másik típusa a lutein ciszta, ami UH-gal nem jól látszik, de a hosszútávon magas P4-szintek jelenlétét jól jelzik. A kórkép elsősorban másodlagos anösztruszban nyilvánul meg (tüzelt már életében, de a legutóbbi óta >1 év eltelt). 13. Hüvelydaganatok
A daganat gyanúja fizikális vizsgálat, UH lelet vagy vaginoszkópia alapján merül fel, de a kórhatározás biopsziával történik. Elkülönítendők a hüvelyelőeséstől (ciklusdiagnosztika!). A kezelés minden esetben a képlet eltávolítása (medián episiotomia és a húgycső katéterezése után). A hüvelydaganatok véres váladékozást okozhatnak, illetve prediszponálnak vaginitisre. Benignus szövettan: • Leiomyoma • Fibroma Malignus szövettan: • •
Leiomyosarcoma Fibrosarcoma
Sticker sarcoma: jellegzetes karfiolszerű képleteket képező speciális, nem tisztázott eredetű – feltételezhetően vírusos - transzmisszibilis tumor. Angol neve is utal erre: canine transmissible venereal tumor. Nem csak a külső genitáliákon és a hüvelyben, hanem más nyálkahártyákon is előfordulhat, kontakt érintkezés útján állatról állatra vagy egy állaton belül egyik helyről a másikra. Általában nem malignus, csak kis százalékban képez metasztázist. Spontán gyógyulás bekövetkezhet, de legtöbbször eltávolítják + kezelik kemóvagy sugárterápiával. 14. Emlődaganatok
181
Előfordulásuk valószínűségét a 3. tüzelést megelőzően végzett ivartalanítás csökkenti, de a legnagyob hatása a prepubertás idején végzett műtétnek van. A harmadik tüzelést követő OHE-nek nincs hatása a gyakoriságára! Jellemzően középkorú, idősebb állatokban fordulnak elő. Változatos méretű nodulusokról van szó az emlők területén (mivel ez lehet más típusú tumor is, pl. mastocytoma, ezért citológia, illetve biopszia kell a diagnózishoz, függetlenül attól, hogy úgyis eltávolítják). Szövettanilag négy nagy csoport különíthető el: sarcomák, carcinomák, vegyes típusú (carcinoma és sarcoma is), illetve adenoma. Léteznek itt nem részletezett protokollok a stádiumba sorolásra (tumor mérete, nyirokcsomó érintettség - biopszia, áttét alapján - rtg). Az emlőtumorok elég nagy százalékban malignusak (30-40 %), ezért az áttétre mindig gondolni és vizsgálni kell, elsősorban mellkas röntgennel. Ha távoli áttétek találhatók, akkor a műtét/tumor eltávolítása mellett, sugárkezelést és/vagy kemoterápiát is kell alkalmazni. Áttét hiányában javasolt a daganatos emlő eltávolítása, lehetőség szerint az őrszem nyirokcsomóval együtt. Arra, hogy az adott emlő érintettsége esetén melyik szomszéd emlőket javasolt kivenni, vannak protokollok. Egyszerűsítve, ha a legelső vagy leghátsó, akkor csak azt veszik ki az axiális vagy inguinális nyirokcsomóval együtt. Ha pedig a középső 3 közül valamelyik, akkor a középső hármat együtt veszik ki az axiális és inguinális nyirokcsomóval egyetemben! A tumor kiújulására nézve nincs egyértelmű hatása az emlődaganat eltávolításával egyidejű ivartalanításnak! A kanok betegségei
1. 2. 3. 4.
Fejlődési rendellenességek Orchitis, epididymitis Heredaganatok Phimosis, paraphimosis, priapismus 182
5. 6. 7. 8.
Balanoposthitis Benignus prosztata hiperplázia Prosztatitis Prosztata ciszták és daganatok 1. Fejlődési rendellenességek
A kanok fejlődési rendellenességei közül a cryptorchidizmust és a pszeudohermafroditizmust kell kiemelni, mert ezekkel van esély találkozni a praxisban (előbbivel sokkal gyakrabban). A hím pszeudohermafroditizmus azt jelenti, hogy a hasüregben vagy a scrotum bőre alatt herék találhatók, ugyanakkor a külső nemi szervek a nőivarra hasonlítanak (gyógykezelésre nincs esély). Cryptorchidizmus: Gyakori rendellenesség kutyában: egyik vagy mindkét here rejtett lehet (pl. hasüregben, ágyéki régióban, vagy a lágyékcsatornában), ezek általában atrofizáltak és kifejezetten hajlamosak daganatos transzformációra. Az unilaterális rejtettheréjű állatok fertilisek ugyan, de kasztrációjuk javasolt, mivel a kórkép öröklődik, ezért az ilyen kanokat a tenyésztésből ki kell vonni (egy – és kétoldalit is)! UH-val elvileg lehetséges, de sok esetben nehéz diagnosztizálni, ezért a rejtettheréjű állatok elkülönítése a kasztráltaktól általában GnRH- vagy hCGchallenge teszttel történik (megmérik a vér tesztoszteron alapkoncentrációját, majd GnRH/hCG-t i.m. kezelés után 1 óra múlva újra megmérik és a tesztoszteron szint emelkedése hereszövet jelenlétére utal!). Kutyákban a here a vemhesség 3. trimeszterében kezd leszállni, viszont a lágyékcsatorna 6 hónapos korig még nem záródik be teljesen. Mivel elvi esély van a herék leszállására, cryptorchidizmust 6 hónapos életkor előtt nem lehet biztonsággal diagnosztizálni. Gyógyszeresen (GnRH vagy hCG kezeléssel) nem etikus elősegíteni a herék leszállását, mert ezzel esélyt adunk a cryptorchid kutyák továbbtenyésztését is (lásd korábbi megjegyzést a betegség genetikai hátteréről)! 183
2. Orchitis, epididymitis A here- ill. mellékheregyulladás esetén a kanok heréje duzzadt, meleg és fájdalmas tapintatú. UH-al látható , ha a here megcsavarodása vagy tályog áll a háttérben (de el lehet különíteni pl. egy haematomától vagy sérvtől, amik ritkábbak). A fertőzés lehet aszcendáló, ekkor a kórokozók általában a húgyúti flóra alkotói (pl. Mycoplasmák, gombák), vagy haematogén (pl. egyes szisztémás tünetekkel is járó vírusfertőzések – jó példa a szopornyica). Előfordulhat here megcsavarodás steril gyulladással járhat együtt (UH-val és tapintással ezt észre lehet venni). Diagnózisban segíthet az ondó citológiai vizsgálata és baktérium- ill. gombatenyésztés a mintából. De legjobb, ha citológiai mintát tudunk venni a heréből (és ebből tenyésztésre is küldünk), viszont ez nehézkes, tekintve, hogy fájdalmas az állatnak. Széles spektrumú antibiotiumot adunk rá első körben, és amikor megkapjuk a tenyésztés eredményét célzottan folytathatjuk az AB-os kezelést (+ esetleg kivehetjük az érintett herét, ha csak egyoldali, hogy a hő stressz miatt ne károsítsa a másikat). Előfordulhat, hogy a szubklinikai krónikus here- és mellékheregyulladás fennmarad (biopsziával igazolható), ennek egyetlen tünete az infertilitás. A fertilitás helyreállítására kicsi az esély. Brucella canisra mindig ajánlott vizsgálni (ez venereálisan és szájon át is fertőzhet, tehát aszcendáló és haematogén fertőzésre egyaránt képes)! Nőivarúakban gennyes hüvelykifolyás és vetélés, kanokban főleg here- és mellékheregyulladás a jellemző + szisztémás nyirokcsomó duzzanattal vagy anélkül. Láz ritkán fordul elő. Kitenyészteni nehéz, de meg lehet próbálni, hímek esetében az ondóból. A szerológia általában megbízhatóbb. A Brucella canissal fertőzött állatok kezelése nagyon nehéz, ki kell őket zárni a tenyésztésből! 3. Heredaganatok
184
A here szövettani felépítéséből fakadóan a heredaganatoknak szövettanilag 3 fő típusa különíthető el. Ezek elsősorban crytporchid herékben (prediszponáltak a daganatokra) vagy ritkán idős állatokban fordulnak elő.
• • •
Sertoli-sejtes tumor (E2-termelő, feminizációt okoz, relatíve gyakran képez áttétet, elég nagyra tud nőni) Leydig-sejtes tumor (az intersticiális sejtekből fejlődő, jóindulatú daganat, ami általában nem okoz kifejezett tüneteket, ezért ritkán diagnosztizálják) Seminoma (a tubulusok hámjából fejlődik, jóindulatú, általában nem okoz hereduzzanatot ezért tüneteket is alig produkál, tehát ritkán diagnosztizálják).
4. Phimosis, paraphimosis, priapismus Phimosis: A szűk praeputium nyílás miatt a pénisz nem ölthető ki megfelelően. Lehet veleszületett vagy pl. daganatos/gyulladásos háttér miatti duzzanat. Általában akkor fedezik föl, amikor a kan eredménytelenül próbál fedezni egy szukát. A tasakban felhalmozódó vizelet prediszponálhat balanoposthitisre. Ha nem fedező kan és semmilyen problémát nem okoz, akkor nem igényel kezelést. Egyéb esetben műtétileg plasztikázni lehet. Paraphimosis: Képtelen teljesen visszahúzni a nem erektilis péniszt a tasakba. Leggyakrabban fedezést vagy ondóminta-vételt követően fordul elő, az erekció enyhülésekor. Lehet, hogy a tasaknyílás csak egy picit szűkebb a kelleténél, esetleg daganatos szövet vagy haematoma akadályozza a visszahúzást. A keringési zavarok és kiszáradás veszélye miatt mielőbb le kell tisztítani és benedvesíteni a péniszt, majd manuálisan óvatosan megpróbálni a visszahelyezést a tasakba (ritkán anesztézia és sebészi beavatkozásra is szükség lehet). 185
Priapismus: Perzisztens, szexuális ingertől független erekció. Hátterében pl. gerincvelői elváltozások (reflexközpont!) állhatnak. Kezdetben próbálkozhatunk az erekciót gátló szerek alkalmazásával (pl. adrenalin, gabapentin), de nagyon hamar vészhelyzet alakulhat ki, amikor amputálni kell a péniszt. 5. Balanoposthitis
A pénisz vagy a praeputium nyálkahártyájának gyulladása, mely leggyakrabban mucopurulens váladékozás formájában jelentkezik. A praeputium környéki hosszú szőrök, idegen testek, trauma vagy phimosis hajlamosító tényezők lehetnek (alaposan illik átvizsgálni a péniszt és a praeputiumot, hogy megtaláljuk az esetleges idegen testet, sérülést). Enyhe formája (kis mértékű praeputialis váladék tenyészérett kanokban, egyéb tünetek nélkül) legtöbbször magától gyógyul, kezelést nem igényel. Kórokozókat kitenyészteni nehéz, mivel nem tudjuk, hogy a normális flórából minek lehet szerepe (a tenyésztés végén szinte bármi kinőhet). Ha kezelésre van szükség, akkor általában elég enyhe fertőtlenítőszeres Salsollal átmosni a tasak üregét. 6. Benignus prosztata hyperplasia (BPH) Nagyon gyakori, a legtöbb 6 évesnél idősebb intakt kanban előfordul (a prosztata fejlődése, működése és időskori hiperpláziája dihidrotesztoszteron-függő). Lehet teljesen tünetmentes vagy járhat haematuriával (egyszer-egyszer vércsepegés), dysuriával, hemospermiával és tenezmussal is.
186
Rektálisan tapintható a megnagyobbodott prosztata (a diagnózis kialakításához a vizsgáló módszer nem elég megbízható). Az UH és a röntgen megbízható technikák, az elváltozás jól látható. Szisztémás tünet nem jellemző. Citológiával elég jól ki lehet zárni a neopláziát, de definitív diagnózis csak biopsziával nyerhető. Sok esetben enyhe krónikus prosztatitis társul a BPH-hoz, aminek jelei a citológiai mintákban is láthatók. Nem tenyészállatoknál a legmegfelelőbb kezelés a kasztráció. Ezt követően heteken-hónapokon belül visszafejlődik a prosztata (súlyosabb gyulladás esetén AB-os kezelés is indokolt). Tenyészállatok gyógyszeres kezelésére alkalmas szerek (egyik sem olyan hatásos, mint a kasztráció):
•
Finasterid (5-alfa reduktáz gátló; tesztoszteronból nem lesz dihidrotesztoszteron)
• •
Osaterone (gesztagén származék; androgén receptor antagonista) Deslorelin implantátum (GnRH receptorok downregulációja, aminek következtében csökken az LH és tesztoszteron produkció, illetve szint) 7. Prosztatitis
Az akut prosztatitis (1) általában szisztémás tünetekkel (láz, elesettség) jár, a haemospermián, haematurián kívül. Súlyos esetekben szepszis is bekövetkezhet. Enyhe fokú, csak a citológiai mintából látható gyulladás a prosztata hyperpláziának gyakori kísérője, ez legtöbbször tünetmentes krónikus prosztatitis (2). Minden esetben a húgyutak normál flórája által kialakított, felszálló fertőzésről van szó. Az akut prosztatitis sokszor társul alsó húgyúti infekcióval is. A klinikai tünetek mellett a masszázzsal nyert prosztata-váladékból és a vizeletből elvégzett tenyésztés segít a diagnózisban és a kórokozó megtalálásában, következményesen az AB terápia leszűkítésében. Prosztata citológia, UH (pl. láthatók tályogok, ha vannak) itt is segíthet.
187
Az AB kezelés után érdemes kasztrálni, hogy megszüntessük a háttérben esetleg meghúzódó prosztata hiperpláziát is. A krónikus, szubklinikai, BPH-val (jóindulatú prosztata megnagyobbodás) társult prostatitis nem fog meggyógyulni, amíg nem kasztrálják az állatot. 8. Prosztata ciszták és daganatok
Ciszták előfordulhatnak a prosztata állományában, vagy annak környékén (ha kellően nagyok, akkor hasi fájdalmat okoznak). Sebészi eltávolításuk szükséges. A prosztata daganatok előfordulási gyakorisága kasztrált állatokban kissé növekszik! Összességében viszont még így is ritkának számítanak. Leggyakoribb a húgycső falából vagy a prosztata elvezető járatainak hámjából kifejlődő prosztata carcinoma. Rektális tapintással vagy UH-val irreguláris, aszimmetrikus képlet érezhető/látható (ellentétben pl. a BPH-val, amelyre a szimmetrikus megnagyobbodás jellemző). A tünetek a BPH-hoz hasonlóak, ezért a két kórkép biztonsággal csak biopsziával különíthető el. A prosztata carcinoma gyakran képez áttéteket! Nincs jól bevált terápiája.
A macska szaporodása Összefoglalás
•
Pubertás ideje: Átlagosan 8 hónapos korban.
• Ciklikusság: Poliösztrusz, azonban a legtöbb macskában jelentkezik tavasszal-nyár elején egy csúcs (ahogy a nappalok hosszabbodnak). A proösztrusz 1-4 nap hosszú, ezt követi az ösztrusz (nagyon változó, 3-10 nap), majd párzás hiányában egy 1-2 hétig tartó inaktív időszak (interösztrusz =posztösztrusz). Nincs metösztrusz és diösztrusz párzás hiányában, mert nem képződik sárgatest, hiszen indukált ovulátor a macska! A fentiek alapján egy ciklus átlagosan 17 napig tart és egészen addig ismétlődik, amíg nincs párzás, vagy a szezon véget nem ér. Novembertől februárig jellemzően 3-4 hónapig tartó anösztrusz van. 188
• •
Ösztrusz hossza: Nagyon változó, 3-10 nap.
•
Vemhesség anyai felismerése: Nem szükséges, mert ovuláció és sárgatest csak párzást követően lesz. A sárgatest a vemhesség végéig működik (jelen lesz a petefészken).
•
Placenta Placenta
•
Vemhesség hormonális háttere: Végig corpus luteum dependens. De érdekes, hogy a kutyával ellentétben, ahol az álvemhesség kb. olyan hosszú, mint a vemhesség, macskában ez csak nagyjából a vemhesség hosszának felével megegyező ideig tart (pl. steril kandúrral való párzást követően) és nem jár olyan kifejezett tünetekkel.
• •
Vemhesség hossza: Átlagosan 63 nap.
•
Involúció hossza: ~30 nap
Ovuláció időpontja: Csak többszöri, ismételt kopuláció hatására történik meg az ovuláció!
típusa: Placenta zonaria endotheliochorialis (szövettanilag)
(anatómiailag),
Ellés utáni újra ciklusba lendülés időpontja: Átlagosan kb. 30 nappal az ellés után. (A szoptatás nem gátolja a ciklusba lendülést)
A macska ciklusa Az északi féltekén a legtöbb macska szezonálisan poliösztruszt mutat állat, tehát az ivarzás jellemzően február és szeptember között van (nagy melegben szünet!), és szeptembertől januárig tart az anösztrusz időszaka (amikor nem lesz ivarzás és „megpihen” a macska). Az aktív reproduktív időszakban ivarzási (proösztrusz+ösztrusz) és nyugalmi periódusok (interösztrusz) váltogatják egymást és nincs ovuláció ha nincs párzás (mert a macska indukált ovulátor)! Tehát az interösztrusz nem egyenlő a többi fajban lévő diösztrusszal, mert interösztrusz idején nincs sárgatest! A proösztrusz (1-4 nap) a tüszőnövekedés időszaka, ekkor kezdenek el érdeklődni a kandúrok a nőstények iránt, viszont nincs savós-véres váladékozás és péraduzzanat, mint a szukában. A proösztrusz elég rövid ideig tart, ezért nehezen detektálható. Legtöbbször mire a tulaj észreveszi, hogy ivarzik a macskája, az már az ösztrusz szakaszba lépett (ez átlagosan 6-8 napig tart, de egyedenként igen 189
változó!). Csak az ösztrusz idején áll meg a kandúrnak (lordosis)! Ettől eltekintve nem nagyon vannak külső jelei az ösztrusznak, leszámítva, hogy folyton nyávog. Amennyiben nem történt párzás, úgy az ösztrusz végeztével a follikulusok atrofizálnak, elkezdődik a nyugalmi szakasz, amit interösztrusznak (=posztösztrusz) hívunk. Ez 1-2 hétig tart és ennek a végén újabb tüszőnövekedési hullám indul, ami a következő proösztrusz és ösztrusz tüneteit indukálja. A párzás tehát csak az ösztrusz alatt történhet (ekkor áll meg a kandúrnak), és az indukált ovuláció kiváltásához legalább 3-4 aktus kell (ezért párzanak sokat a macskák; egyébként a pénisz tüskéi (erektált péniszen alakulnak ki) androgéndependensen fejlődnek, elengedhetetlenek a neuroendokrin reflex kiváltásához). Amennyiben volt ovuláció és fertilizáció is, úgy a macska vemhes lesz. Ha azonban az ovulációt nem követi fertilizáció (steril kandúr vagy mesterséges ovuláció indukció pl.) vagy korai embrió elhalás van, akkor a nőstény macska sárgatestjei fennmaradnak kb. 35 napig (~ a vemhesség hosszának feléig) és ezt szokás diösztrusznak is hívni, vagy másképp mondva ez a macska álvemhessége! Álvemhesség Macskában ciklusdiagnosztikát nem nagyon használunk a gyakorlatban. A preovulatórikus P4-profilok eleve nem működnek, a hüvelycitológia viszont hasonlóan a szukához, nagyszámú kornifikálódott sejtet mutat az ösztrusz idején, de erre a vizsgálatra általában nem kerül sor. Legfeljebb akkor, ha a mi kiscicánk nagyon nem szokott jellemző ösztrusz viselkedést produkálni, így nem tudjuk mikor kellene vinnünk fedeztetni (ha erősen kornifikálódott, akkor ideális). A tényleges párzás 0.5-1 percig tart átlagosan és utána a nőstény jellegzetes viselkedése (átfordul, odakap a hímnek, nyávog, nyalogatja a pérát) egyértelműen jelzi, hogy megtörtént a párzás (min. 3-4 aktus, de inkább több kell az ovulációhoz). A progeszteront csak akkor van értelme mérni, ha nem biztos benne a tulajdonos, hogy volt-e párzás, tehát volt-e ovuláció (ha 5 ng/ml feletti értéket mérünk, akkor volt, ezután érdemes vemhességi diagnózist is csinálni). Az álvemhesség ritkán fordul elő macskában (az indukált ovuláció miatt) és alig jár tünetekkel. Mesterséges indukciója azonban kívánatos, mert ezzel kb. 40-45 nappal késleltetni tudjuk a következő ösztruszt (ha zavar a macska viselkedése) a szexuálisan aktív időszakban (ha meg aztán már a szezon végén járunk, lehet hogy vissza sem ivarzik utána, mert egyből anösztrusz lesz). 190
-hCG vagy GnRH injekció egyszeri adása ovulációt vált ki, és 1-2 napon belül megszünteti az ivarzási tüneteket, álvemhességet produkál -A hüvely mechanikai stimulációja (üvegpipettával pl. többször egymás után 1520 perces intervallumokkal kiváltjuk a neuroendokrin reflexet) Vemhesség A macska vemhessége 63-65 nap hosszú az ovulációtól számítva (de nem mindig tudjuk, hogy az ösztrusz alatti hányadik párzás indukálta éppen az ovulációt, ezért kisebb-nagyobb eltérések adódhatnak, ha egy adott párzáshoz viszonyítunk). A beágyazódás kb. a 15. napon történik meg. Anyai felismerésre nincsen szükség, hiszen csak akkor lesz sárgatest, ha párzás is volt. Alapvetően azt jegyezzétek meg, hogy végig CL-dependens a macska vemhessége (bár nincs egyértelmű szakirodalmi állásfoglalás, de a CL biztos végig fennmarad!), de azért eltér a kutyától, ahol ez tényleg kifejezetten így van. Macskában a placenta is termel elég sok progeszteront a 40. naptól. Ráadásul az is a CL ellen szól, hogy az álvemhesség nem ugyanúgy néz ki mint kutyában (ahol ez olyan hosszú, mint a vemhesség). Macskában a vemhesség 25-30. napja után kutyához hasonlóan fokozatosan átveszi a PRL a luteotróp faktor szerepét, ez azonban álvemhes macskában nem történik meg, ezért tart csak ~35 napig az álvemhesség. Tehát látszik, hogy a vemhes és nem vemhes macska hormonális profiljai nem pont ugyanolyanok, viszont a progeszteron-profil alapján nem lehet diagnosztizálni a vemhességet! Vemhességi diagnózis: -Transzabdominális palpáció (a 25 nap körül már érezhetők az aminonhólyagok) -Transzabdominális UH (16-20. naptól már jó, ugyanaz igaz rá, mint kutyában, itt is >150170-nek kell lennie a magzati szívverésnek) -Röntgen (40. nap után, mikor már vannak csontok) -Relaxin teszt (a kutyára kitalált relaxin teszt a macskában is működik, mert a relaxin itt is a placenta-által termelt vemhesség specifikus hormon!, ~28-30. naptól) Abortusz Tünetek hasonlóak mint kutyában (szisztémás lehet + hüvelykifolyás, magzati szívverés lemegy). Definitív diagnózis a fertőzők esetén a vetélt magzatok szöveteiből lehet pl. 191
Legfontosabb fertőző okok (a kórokozóra jellemző szisztémás tünetek kíséretében): -FeHV-1 (rinotracheitis virus) -FIV, FeLV -Feline Parvovirus (panleukopenia) -Feline Coronavirus -Toxoplasma reaktiváció -A normál hüvelyflórából befertőznek aspecifikus baktériumok és placentitis miatt lesz vetélés Nem fertőző okok: -Hypoluteoidismus (sokszor a vemhesség második felében, mikor már a placenta is elég sok progeszteront kellene, hogy termeljen, de senki nem tudja biztosan, hogy a vemhesség végén milyen arányban felel a CL és a placenta a fenntartásért) -Genetikai/toxikológiai hátterű fejlődési rendellenességek -CEH van macskában is (és ha eljutunk egyáltalán vemhességhez, akkor ez okozhat vetélést) Hogyan lehet vetélést indukálni? (a luteolízist okozó prosztaglandin származékok nem olyan hatékonyak, mint kutyában, ez is kicsit affelé mutat, hogy a CL nem bír kizárólagos szereppel) -Ugyanazok a szerek, mint kutyában (prosztaglandin - luteolízis, cabergolin-PRL gátlás, agleprisztonprogeszteron receptor antagonista) - önállóan vagy kombinációs protokollok is lehetségesek -Ösztradiol itt is szóba jöhetne nidációgátlásként, de a CEH-ben játszott szerepe miatt ne használjuk Ellés, nehézellés
Az 1. szakasz 0.5-1 napig tart (nyugtalan, nyávog, fészket épít). A 2. szakasz kezdetét jelzik az aktív kontrakciók. Ha ezek elkezdődtek, akkor 4 órán belül meg kell születnie az első kölyöknek. Ezután átlag fél óránként születik egy kölyök, de 2 óránál több nem telhet el két egymás utáni között.
192
A magzatburkok általában az egyes kölykök után távoznak (a 2 és 3. szakaszok váltogatják egymást, mint kutyában), de születhetnek burokban is a kölykök. Az első kölyök megszületése előtt normálisan nem ürülhet zöldes/zöldesbarna színű váladék (ilyen a placenta normális színe), mert ez placenta leválást jelez, ami után vagy gyorsan megszületnek a kölykök, vagy császármetszés. Nehézellés típusai, okai, kezelése ugyanaz, mint kutyában. A magzati szívverés + az anya tünetei alapján dönteni kell a császármetszésről. A nőstény macskák átlagosan 1-2 hónappal az ellést követően újra ivarzani kezdenek (lehet sokkal előbb is), ha még benne vagyunk a szezonban. Ez nagyjából összhangban van az involúcióhoz szükséges 30 nappal. Zona pellucida proteinek ill. GnRH elleni immunizálás itt sem működik egyelőre a gyakorlatban. A reprodukció kontrollja Az álvemhesség mesterséges indukciójáról (hCG/GnRH vagy hüvelyi stimuláció) már volt szó. Ezzel késleltetni lehet szezonon belül 40-45 nappal a következő ivarzást. Az OHE-t ill. kasztrációt a kutyákhoz hasonlóan el lehet végezni prepubertálisan és az első ivarzást követően. Itt a prepubertális mellett kicsit több érv szól, mivel az emlődaganatok valószínűségét nagyon lecsökkenti (emellett még a CEH/pyometra prevenciójára is jó) és nem fokozza annyira az inkontinenciát mint kutyákban. Sőt az inkontinencia egyébként sem olyan kifejezett mellékhatás macskák esetében, náluk a legnagyobb problémát az elhízás okozza (bármely korban végzett OHE). Az OHE-t legjobb interösztruszban vagy anösztruszban elvégezni (proösztrusz/ösztrusz idején intenzívebb a vascularizáció az E2 hatás miatt és vérzések lehetnek a lekötések helyén) Az ovarian remnant szindrómára mindig gondolni kell OHE-n átesett, de ivarzó macska esetében! Mivel macskákban a petefészek szövet az egyetlen hely, ami elegendő mennyiségű ösztrogént tud termelni az ivarzás kiváltásához, ezért ebben az esetben tuti, hogy maradt benn petefészekdarab. Definitíve úgy határozzuk meg (ha nem akarunk egyből exploratív laparotómiát), hogy ivarzáskor hCG/GnRH193
t adunk, majd 2-3 hét múlva megmérjük a P4-et és ha magas, akkor van CL, tehát maradt benn petefészek darab! Gyógyszeres alternatívák: (hasonló lehetőségek, mint kutyákban, de itt is nehéz ügy a mellékhatások, vagy a nehezen elérhetőség miatt) – ezek nyugalmi szakaszban adva késleltetik, ösztruszban adva pedig elnyomják az ivarzást! -gesztagének (p.o. vagy injektábilis, de CEH/pyometra, fibroadenomatosus emlőhiperplasia ill. II-es diabetes mellitus súlyos mellékhatások lehetnek!) -androgének (macskákban nem elég hatékonyak, az effektív ösztruszszuppresszióhoz majdnem a toxikus dózist kéne adni; meg egyébként is sok mellékhatás) -GnRH agonista implantátumok sokáig bennhagyva (kezdetben ovulációt indukálnak, ami miatt álvemhes lesz, de ezután sem ivarzik újra, amíg benn van az implantátum) A nőstény macska ciklusának zavarai, nemi szervi betegségei Puerperális metritis és vaginitis ritkán előfordulhat macskákban is. Ha ez van, akkor ugyanazok igazak, mint szukánál.
1. 2. 3. 4. 5.
Kóros anösztrusz Perzisztens ösztrusz CEH/Pyometra Fibroadenomatosus hyperplasia Mastitis, emlődaganat 1. Cikluszavarok – Kóros anösztrusz
Emlékezzünk, hogy a szezonális anösztrusz nem kóros macskákban!. Ha viszont a várható szezonon belül sem ivarzik (perzisztens anösztrusz), annak több oka lehet. Elsőként kérdezzünk rá, hogy nem volt-e korábban ivartalanítva. Fontos az, hogy beltéren tartják-e vagy kint, mert a megfelelő szezonalitáshoz kell a retina nucleus suprachiasmaticus – tobozmirigy – melatonin tengely megfelelő 194
működése is, tehát ha kevés fényt kap az állat, akkor nem biztos hogy elkezd ivarzani. Ha mindez oké, akkor lehet, hogy egyszerűen csak olyan kevés tünetet mutat a cica miközben tüzel, hogy nem vesszük észre (hüvelycitológiával a kornifikáció viszont detektálható és ez jelzi, hogy van tüszőnövekedés). Érdemes mérni ELISAval vér progeszteron-szintet is, mert egy konstans 2 ng/ml feletti érték P4-termelő tumor vagy luteális ciszta (ez utóbbi UH-val nem nagyon látható) jelenlétét jelzi (a sok P4 elnyomja az ivarzást). Luteális ciszta esetén prosztaglandin-hatású késztíményekkel luteolízis váltható ki. Ritkán kromoszóma-rendellenességek (pl. XO) is állhatnak a háttérben (gondolsz rá, ha már minden egyebet kizártál), de ezt hazai körülmények között sose fogod diagnosztizálni :D Ha nincs ismert ok a háttérben, de tényleg anösztrusz van, arra nincsenek egyöntetűen jól működő protokollok, hogy hogyan tudnál ivarzást indukálni (esetleg FSH-t/PMSG-t megpróbálhatsz adni néhány napig majd a végén hCG-t és akkor el is ovuláltatod, ha termékenyíteni akarod; vagy fényprogramot használhatsz stimulációra) 2. Cikluszavarok – perzisztens ösztrusz
Először el kell dönteni, hogy a tulajdonos tényleg perzisztens ösztrusszal hozta-e be a macskát, vagy az normális időközönként ivarzik, csak éppen annyira hevesen, hogy a tulaj falra mászik tőle. Perzisztens ösztrusznak tekinthető, ha > 4 hétig kornifikálódott a hüvelycitológiája a macskának. Ennek hátterében leggyakrabban follikuláris ciszták vagy tumorok (granulosa sejtes tumor) állnak, melyek UH-val elkülöníthetők, de nem mindig. A krónikus ösztrogénhatás okozza a folyamatos ivarzást, ami mellett a csontvelő szuppresszió jelei is jelentkeznek. Ha nem tenyészállat, akkor OHE a terápia (tumor esetében tenyészállatnál is). Ciszta esetén, ha tenyészállatról van szó, akkor GnRH-val vagy hCG-vel lehet 195
ovuláltatni a tüszőt, de egyesek szerint ez fokozza a CEH/pyometra kialakulásának kockázatát. 3. CEH/Pyometra Macskában ritkábban fordul elő, mint kutyában, de hasonló oktana van. Mivel az ivarzások gyakran ismétlődnek ezért az ösztrogén szépen megalapozza a méhelváltozásokat, amit az ovulációt követő P4 hatás cisztás degenerativvá tesz. Elsősorban idősebb macskákban fordul elő, melyek korábban nem voltak vemhesek, jellemzően az ivarzást követő 4-5 héten belül. Felmerülhet a kérdés, hogy ha a vemhesség védő hatású, nem vemhesültekben pedig nincs ovuláció sem általában, így a P4 alacsonyan marad, akkor hogy lehet mégis, hogy egyes intakt, soha sem vemhesült macskákban idős korra eljutunk CEH/pyometráig? Hát feltételezik, hogy ritkán a párzástól független hatások is indukálhatnak ovulációt és így álvemhességet, tehát életük során egyes macskák párzástól függetlenül is kerülhetnek P4 hatás alá, és ezt alátámasztja, hogy sok idősebb macskában láthatók szövettani jelei CEH-nek. A Dow-III-as típusú, befertőződött pyometra kifejezetten ritka és nem jár olyan súlyos tünetekkel (polydipsia/polyuria pl. sokkal ritkább), mint kutyákban. Ha nyitott-cervixű, akkor gennyes-véres hüvelyváladék, ha zárt-cervixű, akkor intenzívebbek lehetnek a szisztémás tünetek. A Dow-IV kategória (krónikus endometrium degeneráció fertőzés nélkül) macskákban gyakoribb mint kutyákban (ún. mucometra). És tüneteket nem produkál általában. Mivel a tünetek ritkák, gyakran csak OHE során vesszük észre, hogy elváltozott a méhe. Diagnózisa egyébként hasonlóan lehetséges mint kutyákban. Terápiája elsősorban OHE, de tenyészállat esetén meg lehet próbálni a kutyánál leírt gyógyszeres protokollokat. 4. Fibroadenomatosus hyperplasia
196
Ez a betegség csak macskákra jellemző és az emlőmirigyek nem daganatos megnagyobbodásával jár (bármely korú állatban). A megnagyobbodott emlők kifekélyesedhetnek, ödémásak, fájdalmasak lehetnek. Az emlők mirigyállományának hiperpláziája progeszteron-dependens folyamat (részben a PRL is szerepet játszik benne), tehát 1-2 héttel az ivarzást vagy progeszteron-hatású kezelést (ösztrusz szuppresszióra ezért sem javasolt) követően alakul ki. Ha progeszteron-kezeléssel próbálják gyógyszeresen sterilizálni a kandúrokat, akkor bennük is előfordulhat. A kezeléshez meg kell szüntetni a progeszteron hatást, tehát legjobb az OHE ill. a progeszteron kezelés megvonása, ha ez okozta. Progeszteron hiányában hamar visszafejlődnek az emlők, de támogató kezelésként szokás adni agleprisztont (P4 receptor antagonista), hogy leszorítsa a még jelenlévő molekulákat a receptorokról. 5. Mastitis, Emlődaganat
Mastitis
Az ellést követő időszakban fordul elő szoptató nőstényekben a bőr ill. nyálkahártya flórából való befertőződést követően. Diagnózis, terápia ugyanaz mint kutyában
Emlődaganat:
Minden hasonló, mint kutyáknál. Macskákban is relatíve gyakoriak az emlődaganatok, elsősorban idős, intakt állatokban. Az esetek többsége malignus adenocarcinoma.
197
Nincs bizonyított pozitív hatása az emlődaganat eltávolításával párhuzamosan végzett OHE-nek a relapszusra nézve. (de akárcsak kutyában, el szokták végezni, hogy ne kelljen kétszer altatni)! A kasztrációt elsősorban az aggresszivitás és a „mindent megjelölök az igen büdös vizeletemmel” típusú viselkedés elkerülése miatt végzik. Gyógyszeresen gesztagénekkel lehet elnyomni ezt (de mellékhatások miatt nem javasolt) vagy diazepammal, clomipraminnal (humán triciklusos antidepresszáns) lehet nyugtatni az állatot. De preferált a kasztrálás (csak ne hagyjunk benn hereszövetet!).
A kandúrok nemi szervi betegségei
Here és mellékheregyulladás (ha van, főleg trauma miatt) ill. balanoposthitis ritkán fordul elő kandúrokban. Diagnózis/kezelés hasonló mint kutyában . Cryptorchidismus szintén ritka (a herék a születéskor már leszálltak), a kasztrálást követően bennmaradt hereszövet viszont problémát jelenthet ha továbbra is aggresszív a kandúr vagy még mindig vizeletével jelöli meg a területét (hCG/GnRHstimulációs teszttel bizonyítható, ill. ha van androgén hatás, akkor tüskés a pénisz, de ennek hiányában nem!!!). A prosztata betegségei itt nem jellemzőek, ahogy nincs phimosis, paraphimosis, priapismus sem. ASSZISZTÁLT REPRODUKCIÓ ÉS ÁLLATBIOTECHNOLÓGIAI MÓDSZEREK Az asszisztált reprodukciós technikákat (ART) a szaporodási folyamatok támogatására vesszük igénybe. Az ART alkalmazásának célja, hogy a természetes körülmények között (természetes pároztatás eredményeként) születendő utódok számát lényegesen meghaladó számban legyünk képesek utódokat előállítani. Kombinálva a biotechnológiai eljárásokkal lehetőség nyílik genetikailag módosított állatokat is előállítani. Az ivarsejteket és az embriókat mélyhűtve génbankokat hozhatunk létre, amelyekben a genetikai anyagot tartósan tudjuk tárolni (spermium, petesejt és embrió formájában) és bármikor mozgósíthatjuk 198
őket. A fagyasztással elősegíthetjük a kihalással veszélyeztetett állatfajok/fajták fennmaradását. A mélyhűtés másik előnye, hogy áthidalhatjuk a nőstény és a hím közti földrajzi távolságot. Nem utolsó sorban meg kell említeni, hogy ezeknek a technikáknak a használatával kontrollálható és minimálisra csökkenthető a nemi úton (venereális) terjedő betegségeknek a veszélye (annak idején elsősorban ezért vezették be a gyakorlatban az MT-t). A következőkben a legalapvetőbb technikák kerülnek bemutatásra, kiemelve, hogy az egyes módszerek mely fajokban alkalmazhatók sikeresen és milyen célból. Végül egy pár mondat erejéig a humán orvosi vonatkozásokról is lesz szó. 1. Krioprezerváció 2. Spermavétel, mesterséges termékenyítés és a spermiumok fagyasztása 3. Szuperovuláció és embrió-átültetés 4. In vitro fertilizáció 5. Embriók és petesejtek fagyasztása 6. Klónozás 7. Embrionális őssejtek kinyerése, felhasználása 8. Transzgénikus állatok létrehozás 9. A humán asszisztált reprodukcióban használt fontosabb echnikák
1. Sejtek mélyhűtése (fagyasztás/krioprezerváció) A krioprezervációt az asszisztált reprodukció (AR) számos területén széles körben használják a sejtek tartós tárolására. Az AR-s gyakorlatban elsősorban spermiumok, petesejtek és embriók fagyasztásával foglalkoznak, hogy biztosítsák ezek tartós tárolásának/felhasználásának lehetőségét. Fagyasztást követően, a tartós tárolást -196 fokon (folyékony nitrogénben) végzik. Ezen a hőmérsékleten elméletileg végtelen ideig eltarthatók a sejtek (pl. ezért lehet a fagyasztott spermiumok, petesejtek és embriók felhasználásával génbankokat kialakítani). A fagyasztás során, a hőmérséklet csökkenésével, az extra- és intracelluláris térben egyaránt, a vízből jégkristályok keletkeznek, amelyek fizikailag károsítják/roncsolják a sejtalkotókat (pl. mitokondriumok, endoplazmatikus retikulum, stb.). A jégképződés miatt a még folyékony fázisú vízben az oldott 199
anyagok besűrűsödnek (nagymértékben megemelkedik a koncentráció). A koncentráció megemelkedése szintén káros a sejt biokémiai folyamataira, mivel megemelkedik az ozmotikus nyomás (hipertoniás környezet alakul ki). Ezek a „besűrűsödött” területek hatással vannak a víz - ozmózisos nyomáskülönbségen alapuló – áramlására (a vízmozgásra), így az extracelluláris kristályképződés (és következményesen az extracelluláris térben oldott anyagok koncentrációjának növekedése) a sejt dehidrációjához vezet (kiáramlik a víz a sejtből). Összefoglalva: az extra- és intracelluláris jégkristályképződés és a nagyfokú dehidráció elpusztítja a sejteket. A fagyasztás veszélyeit azonban ki lehet küszöbölni/védeni a krioprotektív anyagok adagolásával. Könnyebb megérteni ezek jelentőségét, annak ismeretében, hogy a sarkkörök környékén élő egyes élőlények folyamatosan halmoznak fel krioprotektív anyagokat a sejtjeikben, hogy a téli hónapokban védekezzenek a fagyás okozta károsodás ellen. Ezek legfontosabb szerepe az, hogy ozmotikusan aktív anyagként folyékony állapotban tartják a vízmolekulákat, csökkentve ezzel a jégkristályok képződését. A krioprotektív anyagoknak két típusát különböztetjük meg: intracelluláris és extracelluláris védőanyagok. Több krioprotektív anyag (pl. glicerin, etilén-glikol, propilén-glikol) képes hidrogénkötéseket létrehozni a sejtek makromolekuláival, ami azért fontos, mert normális körülmények között a fehérjék és nukleinsavak vízmolekulákkal hoznak létre hidrogén kötéseket és ezek tartják a funkciójuknak megfelelő szerkezetben a makromolekulákat, hogy azok elláthassák feladatukat a sejtekben. A fagyasztás közben mindenképpen bekövetkezik valamilyen mértékű kristályképződés, ez elkerülhetetlen, de a krioprotektív anyagok képesek helyettesíteni a kristályosodó vízmolekulákat hidrogén-kötés donorként és akceptorként. A sejtek túlélését két módszerrel lehet elősegíteni a krioprezerváció során. Az egyik a már említett krioprotektív anyagok adagolása, a másik, hogy szabályozzuk a hűtés sebességét, és mindkettővel az a célunk, hogy az intra- és extracelluláris jégkristályképződést, továbbá a túlzott dehidrációt megakadályozzuk.
A krioprotektív anyagoknak két fő típusa különböztethető meg: 1. Amelyek képesek átjutni a plazmamembránon, és így bejuthatnak a sejtek
belsejébe (ezek jellemzően kicsi molekulák, melyek a hidrofil üregű csatornákon keresztül jutnak át a membránokon): pl. dimetil-szulfoxid (DMSO), glicerin, etilénglikol, propilénglikol. 200
Közös jellemzőjük, hogy ozmotikus aktivitásuk révén az intracelluláris térben lévő vizet folyékony állapotban, valamint hidrogén-kötés donorok és akceptorok is. 2. Amelyek nem képesek bejutni a sejtekbe, helyette az extracelluláris térben
halmozódnak fel (ezek jellemzően nagyobb molekulák, pl. diszacharidok vagy polimerek): szaharóz, trehalóz, polietilén-glikol Az extracelluláris térben feldúsulva ozmotikus aktivitásuk révén vizet vonnak el az intracelluláris térből, így közvetve csökkentik az intracelluláris kristályképződést (kevesebb víz lesz a sejtben). Fontos kiemelni, hogy a krioprotektív anyagokra általánosan jellemző, hogy koncentrációtól függően ugyan, de citotoxikusak, mert megzavarják az ozmotikus viszonyokat, valamint direkt károsító hatásaik is vannak. A gyakorlatban két módszer terjedt el a toxicitás kivédésére: 1) intracelluláris (pl. glicerin, DMSO, stb.) és extracelluláris (pl. szaharóz) krioprotektív anyagokat kombinálva (együtt) alkalmazzák, így kisebb koncentrációban lehet őket használni, vagy 2) alacsonyabb hőmérsékleten adják a sejtekhez a krioprotektív anyagokat (pl. kb. 5 fok körüli hőmérsékleten; az alacsonyabb hőmérsékleten kevésbé toxikusak ezek az anyagok). A védőanyagot a fagyasztás előtt kell a sejtekhez adni. A gyakorlatban alkalmazott mélyhűtési eljárásoknak két típusát különböztetjük meg: az ún. programozott hűtést (hagyományos, lassú fagyasztás, slow-rate freezing) és az un. ultra-rapid fagyasztást, a vitrifikációt. A spermiumok tűrőképessége általában nagyobb, valamint ilyenkor sokkal több sejtet fagyasztunk egyszerre, s ezért nagyobb fokú veszteség is megengedhető. Az ondó fagyasztása már régóta megoldott. Lassú fagyasztás, programozott hűtés: Elsősorban oocyták/petesejtek és embriók esetében alkalmazott technika, melynek során az a célunk, hogy minimálisra csökkentsük az elsősorban -5 és -40 fok között bekövetkező intracelluláris kristályképződést. A lényeg az, hogy kontrollált körülmények között (ehhez programozható hűtőberendezések állnak rendelkezésre) 0.5 – 2.0 C/perc sebességgel leviszik a minta hőmérsékletét mínusz 5-7 C-ra. Ezen a hőmérsékleten indukálni kell a mintában a jégkristályképződést, amit „SEEDING-nek hívunk” (lefagyasztott csipesszel vagy valamilyen más hideg eszközzel a sejteket tartalmazó tartályt meg kell érinteni). A spermafagyasztáskor nem kell a jégképződést mesterségesen indukálni, de a petesejt és az embrió 201
esetében feltétlenül szükséges, hiszen az időben elindított extracelluláris jégkristályképződés elősegíti a sejtek dehidrációját. A SEEDING után lassan csökkentjük a hőmérsékletet (kb. 0,5-1 fok/perc), közben az extracelluláris kristályképződés miatt az embriók belsejéből víz fog eltávozni (hogy hígítsa a sűrűsödő extracelluláris teret). A folyamat vége az lesz, hogy -40 fok körül az intracelluláris térben alig fog jégkristály képződni és így fog „megfagyni”. Ezt követően a mintát már belerakhatjuk a folyékony nitrogénbe. Vitrifikáció, ultra-rapid freezing: Az 1980-as évek második felétől kezdett el terjedni egy új fagyasztási módszer, a vitrifikáció. Ennek a technikának van két nagy előnye a hagyományos eljárással szemben: 1) nincs jégkristályképződés, 2) nem kell programozott hűtést alkalmazni (lásd később). Hátránya: a védőanyagokat nagy koncentrációban kell alkalmazni, ezért toxikusak lehetnek a hűtött sejtre/sejtekre. A sikeres vitrifikációnak két feltétele van: (1) nagyon gyorsan kell csökkenteni a hőmérsékletet (ez gyakorlati körülmények között azt jelenti, hogy a mintát minden előzetes hűtés nélkül a folyékony nitrogénbe kell helyezni, s így a folyamat nem igényel drága hűtőberendezéseket), illetve (2) nagyon sok krioprotektív anyagot kell hozzáadni a sejtekhez, hogy ezt a halálos stresszt mégis kibírják. Pontosan ebből a második feltételből fakad a módszer hátránya is, konkrétan az, hogy a több krioprotektív anyag (nagy koncentráció), nagyobb toxicitást is eredményez. 2. Spermavétel, spermiumok fagyasztása, mesterséges termékenyítés (MT) A MT legfőbb előnye az állattenyésztés szempontjából, hogy a kiemelkedő genetikájú apaállatoktól lényegesen nagyobb számban tudunk utódokat előállítani, mint ahogy az a természetes pároztatással lehetséges lenne. A MT esetében azonban az anya génjei is befolyásolják majd a végső fenotípust, ezért a MT kevesebbet „tud”, mint az embrióátültetés (EÁ), ahol mindkét ivar legjobb genetikájú egyedeit összepárosítva tudjuk előállítani az utódokat, és ráadásul nagy számban. A fagyasztott sperma egyre több fajban válik elérhetővé a mindennapi gyakorlat számára, ezáltal szélesebb körben válik felhasználhatóvá technika és megkönnyíthető a MT alkalmazása. Felgyorsítható a genetikai előrehaladás, hiszen
202
az apaállatok utaztatása helyett elegendő csupán a termékenyítő anyagot szállítani, amit ráadásul megtehetünk akár a kontinensek között is. A különböző fajok ejakulációjának (időtartam, frakciók száma), és ejakulátumainak (pl. mennyiség, spermiumok koncentrációja és motilitása, stb.) összehasonlítása. Kék színnel van kiemelve az adott kategóriában a legnagyobb érték.
203
Ejakuláció időtartama
Ejakulátum mennyisége
Mén
Bika
Kos
Sertéskan
Kan kutya
fél-1 perc
1-2 sec
1-2 sec
5-20 perc
1-35 perc
70 ml
5 ml
1 ml
1-80 ml (ebből csak 12 ml a 100-300 ml spermiumban gazdag frakció) 3 3
Ejakulátum frakcióinak 3 1 1 száma Spermiumok mennyisége 1 ml ejakulátumban (!) = 120 millió 1.5 milliárd 2 milliárd 400 millió 100-400 átlagos koncentráció millió Elvárt progresszív >60% >70% >90% >60% >70% motilitás Javasolt progresszív 5 millió (friss 500 millió mozgást mutató 300 millió spermát spermiumszám egy (vaginalis (hűtött gyakorlatilag 2 milliárd 200 millió inszemináló dózisban depozíció esetén 1 nem (!) (friss esetén) milliárd) használnak) sperma esetén) Javasolt progresszív Nem mozgást mutató fagyasztható 200 millió spermiumszám egy jól! 2 X 20 inszemináló (bár egyesek millió dózisban(!) már 600 millió 20 millió (intrauterin (fagyasztott sperma megoldották technika ) esetén és 5 esetén) milliárd spermával működik)
204
A gyűjtött sperma (ejakulátum) minőségét a következő három alapadattal tudjuk jellemezni: a spermiumok koncentrációja, és morfológiája, valamint a progresszív motilitást mutató sejtek száma. Ezen alapadatok birtokában tudunk dönteni arról, hogy használható-e a sperma termékenyítésre és/vagy fagyasztásra, stb.. A spermabírálathoz fázis-kontraszt mikroszkópot kell használni!! Mi a próbafagyasztás: A MT állomásokon az apaállatok spermájával, mielőtt az apaállatot betennék egy sperma termelési (fagyasztási) programba, un. próbafagyasztást végeznek, hogy egyértelműen megállapíthassák, hogy az apaállat spermája fagyasztható-e (pl. a bikák 20%-nak a spermája nem fagyasztható jó hatékonysággal). A próbafagyasztás során nyert tapasztalatok birtokában eldönthető, hogy mélyhűthető-e a sperma, valamint a fagyasztási protokoll finomítható is a minél jobb eredmény érdekében. Koncentráció: Legegyszerűbben sejtszámláló kamrák segítségével van lehetőség a mintában található spermiumok számának objektív meghatározására. Ugyancsak objektív eredményt ad az áramlási citométer is. Hátránya a technikának, hogy nagyon drága műszerrel kell elvégezni, és speciális fluorokróm festés alkalmazását is igényli. A koncentráció pontos/objektív meghatározására alkalmas módszer a CASA (Computer-assisted sperm analysis) is, amivel a spermiumok mozgását is objektíven tudjuk értékelni. A mesterséges termékenyítő állomásokon, ahol „nagyüzemben” végzik a tenyészállatok pl. bika, sertéskan, stb. spermájának a feldolgozását (bika esetében fagyasztás) a koloriméter használata terjedt el a spermiumok koncentrációjának a megállapítására. A koloriméter alkalmazása a fényelnyelésen alapul; minél több a spermium, annál több fényt nyel el a minta. Progresszív motilitás (PM): A mozgó spermiumok aránya és ezen belül a progresszív (előrehaladó) mozgást mutató spermiumok aránya fáziskontraszt mikroszkóppal szubjektíven elbírálható/megbecsülhető (megfelelő tapasztalatok birtokában). A motilitás objektív bírálatához, valamint az egyéb specifikus mozgási paraméterek (lassan és gyorsan előrehaladó spermiumok száma/aránya, helyben mozgó, stb.) objektív értékelésére elsősorban a CASA használható. Ez lényegében nem más, mint egy számítógépre kötött mikroszkóp, s itt a minta értékelését egy speciálisan ilyen célból fejlesztett szoftver végzi el. Morfológia: Legegyszerűbben a minta megfestését követően fénymikroszkóppal vizsgálható. Ezzel kiszűrhetők a spermium fejének, nyakának, farkának rendellenességei, illetve nagyjából megítélhető a holt sejtek aránya. Az egyes spermiumok minőségét (fertilizációs potenciálját) természetesen számos más paraméter is befolyásolja, így például a membránok-, az akroszóma-, a 205
mitokondriumok- és a DNS integritása, továbbá érdemes lehet még az élő és elhalt sejtek arányát is meghatározni. Természetesen ezek a módszerek széles körben alkalmazhatók diagnosztikai célból is, a spermiogenezis zavarainak kiszűrésére tenyészállatokban. Az ondó hígítása: A hígítót főként azért adjuk a spermához, hogy a volumenét megnöveljük és így több inszemináló dózist tudjunk készíteni belőle. Természetesen a hígítónak biztosítania kell a megfelelő izoozmotikus és pH viszonyokat (citrát, egyéb pufferek..stb), tápanyagot kell biztosítania a spermiumoknak (ez főként fruktóz és glükóz) és meg kell akadályoznia a mikrobák elszaporodását (antibiotikumok). Emellett jellemzően tartalmaz még valamilyen lipidforrást is (pl. tojássárgája; lipoprotein), ami a sejtek membránjának védelméhez járul hozzá. A legtöbb faj esetében kereskedelmi forgalomban kaphatók gyárilag összeállított készítmények, azonban házilag is előállíthatók jó minőségű ondóhígítók a fajok közti apróbb különbségek figyelembe vételével, például PBS puffer, citrát oldat, glükóz oldat, hőkezelt tehéntej, tojássárgája és antibiotikumok felhasználásával. A hígítót természetesen olyan arányban kell hozzáadni az ismert koncentrációjú ejakulátumhoz, hogy a hígítás után lehetőleg több (bika esetén pl. 200-300) termékenyítő adagot tudjunk készíteni belőle, amely tartalmazza a sikeres inszemináláshoz minimálisan szükséges mennyiségű, progresszíven mozgó spermiumot. Amennyiben a hígítást követően az ondót fagyasztani kívánjuk, valamilyen krioprotektív anyagot is kell biztosítani. Ez spermiumok esetében elsősorban a glicerin. A spermiumok összességében jól tolerálják a fagyasztást (ráadásul sokan is vannak, így nagyobb arányú veszteség sem óriási probléma), ezért itt nem szükséges annyira lassan haladni a fagyasztással, mint a petesejteknél, embrióknál, ahol a programozott hűtés széles körben elterjedt. Helyette a fagyasztani kívánt ondót valamilyen tárolóeszközbe töltve (a legtöbb állatfaj esetében a szarvasmarha tenyésztésben széles körben használatos 0.25 ml-es vagy 0.5 ml-es szalmát használják), azt közvetlenül a folyékony nitrogén gőzébe lehet helyezni kb. 10 percig, mialatt a minta -40 fok környékére lehűl, s ezután a minta átrakható folyékony nitrogénbe.
206
Az ondó fagyasztása: A fagyasztott spermát leggyakrabban a szarvasmarha-tenyésztésben alkalmazzák. Az eljárás röviden a következő főbb lépésekből áll (ugyanez a metódus kisebb módosításokkal igaz a többi állatfajra is): 1. Hozzáadják a mintához a hígítót. 2. Lehűtik 5 fokra és ott hozzáadják a glicerint is. Ezután pár óra (kb. 2-4) un. ekvilibráció következik ezen a hőmérsékleten (ezalatt bemegy a glicerin a sejtbe, ami fokozza a spermiumok túlélését a fagyasztás során) 3.Szalmába töltik a spermát. 4. Folyékony nitrogén gőzében lehűtik kb. 10-15 perc alatt kb. mínusz 120 C-ra. 5. Áttesszük folyékony nitrogént tartalmazó konténerekbe és tároljuk. 6. A felhasználást megelőzően felengedjük, meleg vízbe (35 C) helyezve a szalmát.
2.1. A szarvasmarha mesterséges termékenyítése Spermavételi technika: A spermavétel műhüvellyel történik, aminek a belseje kb. 40-45 fokos vízzel van feltöltve, ami a megfelelő belső hőmérsékletet (35-37 C) biztosítja. Másik bikára vagy fantomra szokás ugratni az apaállatokat. Az un. „potyáztatás” (az első felugráskor nem engedik meg a bikának, hogy a péniszét a műhüvelybe vezesse, ezért hiányzik a végső impulzus, ami az ejakulációs reflexet kiválthatná, és ezért nem ürül a sperma) arra való, hogy: 1) a Cowper-mirigy működése beinduljon és az intenzív váladéktermelés kimossa/kitisztítsa a húgycsövet, ill. 2) az állat fokozott izgalmi állapotba kerüljön, ami serkenti a neurohipofízisből az oxitocin-leadást, ami viszont összehúzza a mellékhere és az ondóvezető simaizom elemeit és így több spermiumot mozgósít az ejakulációhoz (magasabb lesz az ejakulátum spermium koncentrációja). Azért potyáztathatunk, mert a végső ingert az ejakulációhoz az „szolgáltatja”, amikor a pénisz hozzáér a (mű)hüvely falához, és amíg ez nem következik be, nincs ejakuláció. A műhüvely mellett, elsősorban húsbikáknál (nincsenek betanítva arra, hogy műhüvelybe adják le a spermát) és 207
főleg az USA-ban viszonylag gyakran alkalmazzák az elektroejakulációt spermavételre. A sperma hígítása, fagyasztása és felhasználása: A jó mintára azt szokás mondani, hogy fáziskontraszt mikroszkóppal nézve olyan, mint a viharos égbolt (magas koncentráció + rengeteg progresszíven motilis spermium van jelen és örvénylik a minta, hullámszerű mozgást végeznek a sejtek). A szarvasmarha mesterséges termékenyítésére tejelő tehenészetekben szinte kizárólag fagyasztott spermát használnak a világ minden táján (ezenkívül persze lehetőség van friss vagy 4 fokon tárolt hűtött sperma felhasználására is, de ezek csak kis százalékban fordulnak elő). A húshasznú állományokban is legelterjedtebb a fagyasztott spermával történő inszeminálás, itt azonban bevett gyakorlat, hogy a többszöri MT-t követően üresen maradó tehenek közé beengedik az ún. „söprögető bikákat”, így a termékenyítési szezon végére maximalizálható a vemhes egyedek száma. Ez természetesen nem kivitelezhető a tejhasznú tehenészetekben ott ugyanis az intenzív rendszerben nem tartanak hím állatokat – a bikaborjakat leszámítva. A hígításhoz kereskedelmi forgalomban kapható hígítókat használnak, majd az ondót -196 fokra hűtik több lépcsőben. Egy ejakulátumból átlagosan 200-300-400 termékenyítő adagot lehet készíteni (a spermiumok számától függ), amit negyedes (0.25 ml) vagy feles (0.5 ml) műszalmába töltenek a hígítás után és a fagyasztást megelőzően. Egy termékenyítéshez egy szalmát használnak felengedést követően, és a tehenet jellemzően csak egyszer termékenyítik gyakorlati körülmények között, az un. „am-pm szabály” alapján. Ez azt jelenti, hogy amennyiben reggel ivarzik a tehén (az ivarzók vizuális keresése vagy valamelyik ivarzás megfigyelő eszköz – pl. pedométer – segítségével történő detektálást követően), akkor aznap délután termékenyítik, ha pedig délután volt megfigyelt ivarzása, akkor másnap reggel van a MT. Ennek a hátterében az áll, hogy a tehén esetében az ovuláció jellemzően az ösztrusz/ivarzás vége után (nincsenek már tünetek) 12-16 órával következik be, tehát a detektálást követően ideálisan egy fél nap múlva a legjobb termékenyítenünk. Az inszeminálást különben az ún. rektovaginális technikával kell elvégezni, ennek során egyik kezünkkel transzrektálisan fixáljuk a (külső) méhszájat (porcos tapintat), míg a szabad kezünkkel a hüvelyen keresztül vezetjük be az inszemináló katétert a cervixbe, s azon keresztül a méhbe. A spermát az uterusba kell juttatni.
208
Ivarzás-detekciós módszerek: Tejelő tehenészetekben az ivarzásdetekció az egyik legfontosabb kérdés, és általában ez az első dolog, amin javítani kell, ha eredményes szaporodásbiológiai gondozási rendszert szeretnénk kialakítani a telepünkön (amitől a telep termelésének hatékonysága nagyban függ). Ennek egyik legfontosabb oka, hogy az intenzív tejtermeléssel együtt jár, hogy nő az állományban a csendesen ivarzó tehenek aránya (melyek nem vagy alig mutatnak detektálható tüneteket az ösztrusz idején), ezért egy jó telepi ivarzás megfigyelő rendszer működtetése elengedhetetlen. Ennek hiányában látványosan megnyúlik a két ellés között eltelt idő, a látszólagos posztpartum anösztruszt (ún. szubösztrusz) mutató tehenek számának emelkedése miatt (melyek az előbbiek miatt nem kerülnek időben termékenyítésre). Természetesen az ivarzás detekciónak húshasznú állományokban is jelentősége van, azonban itt nem olyan nagy probléma a csendes ivarzás, mint a tejelő állományokban, hisz kevésbé hajtatottan/intenzíven vannak tartva az állatok. Alternatív módszerként ivarzás-szinkronizáló protokollal (pl. CIDR vagy PRID illetve az Ov-synch és változatai) összekötött fix idejű MT-t is széles körben alkalmaznak a tejelő és a húshasznú állományokban egyaránt. Ezek segítségével csökkenthetők az ivarzásmegfigyelés hiányosságaiból fakadó veszteségek. A tehenek ösztrusza átlagosan 12-15 óra hosszú, ami gyakorlati szempontból azt jelenti, hogy egy nagyjából fél napos intervallum áll rendelkezésünkre, hogy detektáljuk a jellegzetes tüneteket (ez a többi fajhoz képest kifejezetten rövid). Ezalatt a tehén megáll a társainak (állóivarzás), melyek ugrálják őt (amelyik ugrál, az jellemzően a ciklusának proösztrusz stádiumában van, tehát 1-2 nap múlva várható az ivarzása). A péra duzzadt, hiperémiás, kipirult és jellegzetes ivarzási nyálka ürül a hüvelyből. Az ivarzó tehenek aktívabbak, többet mozognak (pedométer használata), valamint a tejtermelésük is általában lecsökken az ivarzás idején (számítógépes rendszer rögzíteni képes a fejt tej mennyisége alapján). A vizuális ivarzásmegfigyelés (a felugrás detektálása, a megállás észrevétele) a mai napig is az egyik legelterjedtebb technikának számít az ivarzók kiszűrésére, ez azonban csak akkor igazán jó hatékonyságú, ha rendszeresen, naponta legalább kétszer, de inkább háromszor-négyszer aktívan keresi az ivarzókat, az erre beosztott/megbízott, megfelelően motivált és kiképzett (!) személy. Hátránya, hogy a csendes ivarzók komoly problémát okozhatnak. A felugrások indirekt detektálására több módszert is kidolgoztak, melyekkel szignifikánsan javítható az 209
ivarzásdetekció hatékonysága. Ilyenek például a keresztcsonti tájékra kenhető kréták, ill. festékek, melyek elkenődnek, ha a tehenet megugrották társai vagy éppen a távolról is látható színreakciót adó nyomás érzékeny detektorok (pl. KAMAR®). Ugyanennek egy kicsit „feljavított”, okosabb változata az, amikor a tehén hátára olyan digitális eszközt helyeznek, ami nyomás esetén rádiójelet küld egy távoli adóvevőnek (pl. HeatWatch®). Lehet továbbá ivarzókat keresni keresőállatokkal, például vazektomizált bika vagy androgenizált nőstény (selejtezett tehén, melyet tesztoszteronnal kezelnek, így maszkulinizálódik a viselkedése) segítségével is, ez azonban nem igazán terjedt el a tejelő tehenészetekben, legfeljebb húshasznú állományokban használatosak. Annál gyakoribbak viszont a pedométeren (a tehenek lábára helyezhető digitális lépésszámláló eszköz) alapuló telepi rendszerek, amelyek használata azon alapul, hogy az ivarzó tehenek aktívabbak, többet mozognak, s ez az aktivitás-növekedés a lépésszámlálók segítségével kimutatható. Elméleti lehetőség van még az ivarzást hüvelyellenállást mérő eszközök segítségével is detektálni, ennek értéke ugyanis lecsökken az ösztrusz idején, továbbá szóba jöhet indirekt módszerként a vér progeszteron-tartalmának mérésére alkalmas ELISA-kitek használata is, ezek azonban nem gyakorlatiasak. Tény, hogy az egész állományra kiterjedő pedométeres, vagy rádiófrekvenciás nyomás érzékeny detektorokon alapuló rendszerek (ahol minden állatnak egyedileg azonosított detektora van) jelentősen drágábbak a hagyományos módszereknél. Azonban az is tény, hogy ezekkel a befektetendő emberi munka (és rizikófaktor, tévedések lehetősége, nem lelkiismeretes munkából fakadó hibák) minimálisra csökkenthető és egy központi vezérlésű számítógépből minden nap egyszerűen hozzá lehet jutni az éppen ivarzó egyedek listájához (az adatokhoz). 2.2. A kiskérődzők mesterséges termékenyítése Spermavételi technika: Műhüvelyt használnak és a kost/bakot jellemzően ivarzó nőstényre vagy fantomra ugratják. A alkalmazható még az elektroejakuláció is azokban az esetekben, amikor a kos nincs arra betanítva, hogy műhüvelybe adja le a spermát. Ha MT-hez kell spermát venni, jobb, ha műhüvellyel vesszük (nagyobb mennyiséget kapunk és jobb a minősége)!! Minőségbírálatra megfelelő az elektroejakuláció is (nem tudunk semmit a kosról, de természetes pároztatásra akarják használni szezonban, elektroejakulációval levesszük a spermát és eldöntjük 210
használható-e a kos). Egyébként a kiskérődzők ondójának az a „különlegessége” hogy nagyon koncentrált, kis mennyiségben rengeteg spermiumot tartalmaz, ezért egy jó minőségű levett spermát fény felé tartatva szabad szemmel lehet látni, ahogy gomolyog/örvénylik a minta. A sperma hígítása, fagyasztása és felhasználása: Az ondót a hígító hozzáadását követően frissen vagy hűtötten (4 fokon, 12-24 óráig tartható el) ill. fagyasztást (-196 fok) követően lehet felhasználni. A kecske spermájának van egy különlegessége, nevezetesen, hogy tojássárgáját tartalmazó hígító használata esetén, el kell távolítani az ondóplazmát, mert a bulbourethralis mirigyekből származó foszfolipáz spermiotoxikus lizolecitint hoz létre a tojássárgájából. Kiskérődzőknél a friss vagy hűtött spermát általában a hüvelybe injektálják (az anyajuhot a hátsó lábainál fogva megemelik, a hüvelytükröt behelyezik és egy MT pipettával becseppentik a spermát a cervix nyílásának környékére/közelébe), vagy intracervikálisan fecskendezik be (az előzőhöz hasonló módon, de vizuálisan lokalizálják a külső méhszájat és azon keresztül óvatosan bevezetik a MT pipettát /annak hegyét/ a nyakcsatornába addig, amíg finoman/sérülésmentesen lehet ezt megtenni, mert nem szabad erőltetni, majd következik a sperma befecskendezése). Ezek a módszerek jó fogamzási arányt (70-80%) eredményeznek friss vagy hűtött (4 C) spermával, fagyasztottal azonban nem. Elméleti lehetőség van arra, hogy a cervixen keresztül katéterrel a méhbe fecskendezzük a spermát. Ez a módszer juhokban az esetek zömében nem kivitelezhető a cervix anatómiai struktúrája miatt (kanyarulatos lefutású és zárt). Érdekes, hogy a másik kiskérődzőben, a kecskében az esetek 80-90%-ban keresztül tudjuk vezetni a MT katétert a nyakcsatornán. Ennek a problémának a kiküszöbölésére találták ki a juhban alkalmazandó laparoszkópos termékenyítési technikát, amikor az ondót intrauterin fecskendezik be. Fagyasztott ondó használatakor csak az intrauterin MT (a spermát közvetlenül a méhszarv lumenébe helyezik) ad kielégítő eredményeket a gyakorlatban. A MT-nél biztosítandó mozgó spermiumszám: vaginális MT = 300-400 millió; cervikális = 100-200 millió; intrauterin = 20 millió per méhszarv = 40 millió összesen. Miért van szükség a fagyasztott sperma esetében az intrauterin befecskendezésre? Nem intrauterin inszeminálásnál kifejezetten rosszak a vemhesülési eredmények (ha a fagyasztott spermát intravaginálisan vagy 211
intracervikálisan próbáljuk befecskendezni). A laparoszkópos technikával azonban eredményesen termékenyíthetők fagyasztott spermával is az anyajuhok, és hasonló vemhesülési ráta érhető el, mint intravaginális, friss/hűtött spermával történő termékenyítés esetén, ráadásul csökkenthető a szükséges spermiumszám. A beavatkozást teljes anesztéziában, telepi körülmények között viszonylagos sterilitás mellett gyorsan (5-10 perc alatt), apró hasi seben keresztül laparoszkóp segítségével el lehet végezni, s ennek során közvetlenül a méhszarvakba kell injektálni a spermát. A gyakorlatban azonban Magyarországon nem terjedt el a laparoszkópos módszer használata, sőt igazából a hagyományos mesterséges termékenyítés sem (alig van juhászat, amelyben MT az anyajuhokat), helyette a legtöbb gazdaságban természetes fedeztetéssel (pl. háremszerű, vagy kézből pároztatás) dolgoznak. Az alábbi táblázat összefoglalást nyújt a kiskérődzők mesterséges termékenyítéséhez használt inszemináló dózisok elvárt spermiumszámaival kapcsolatban. vaginális
cervikális
friss sperma
300 millió
100 millió
hűtött sperma
400 millió
200 millió
fagyasztott sperma
laparoszkópos intrauterin
20 millió
200 millió
Az ivarzásdetekcióra alkalmas módszerek: Ha sor kerül MT-re, akkor a juhászatokban ezt általában ivarzás-szinkronizálással (gesztagénnel impregnált hüvelyszivacs vagy CIDR/hüvelyimplantátum) kötik össze, ami után fix idejű MT alkalmaznak. A kiskérődzők ivarzási tünetei elég jellegtelenek, nehezen detektálhatók gyakorlati körülmények között (tovább nehezíti a helyzetet a nagy létszám). A kecskék esetében azért előfordul, hogy a péra beödémásodik és ivarzási nyálka ürül, viszont a nőstények nem ugrálják egymást, úgy mint a tehenek, a juhoknál pedig jellemzően még ennyi sem látható. Az ivarzás átlagosan 30-36 órán át tart (kecskében kicsit hosszabb) és az ovuláció az ösztrusz utolsó óráiban (24-30. óra körül) következik be.
212
Tapasztalt kos illetve bak beeresztését követően viszont az üzekedő anyák keresik velük a kapcsolatot és megállnak nekik, s éppen ezért vazektomizált vagy ún. kötényes kosokat (ez utóbbinak a péniszét egy „köténnyel” elfedik, hogy ne tudja befedezni a nőstényt) hatékonyan lehet alkalmazni az ivarzók keresésére, ha az állományban mesterséges termékenyítést vagy kézből pároztatást alkalmaznak. 2.3. A sertés mesterséges termékenyítése Spermavételi technika: A kandisznót általában fantomra ugratják és az angol nyelvű irodalomból átvett ún. „kesztyűs kéz technikával/gloved hand technique” veszik a spermát. Ez azt jelenti, hogy nincs műhüvely, helyette kézzel közepesen erős nyomást kell kifejteni a pénisz spirális végére (ezzel stimuláljuk az állatot, a hüvely funkcióját átvéve) és egy poharat kell a pénisz alá tartani, aminek a tetején egy szűrő (gézlappal is megoldható) van. Erre azért van szükség, mert a sertésondó frakcionáltan ürül és nekünk csak a spermiumban gazdag részre van szükségünk (2. Frakció), a sűrű mucinózus utolsó frakciót (3. Frakció = a Cowper-mirigy gélszerű váladékát) ki kell szűrnünk. Amikor az 1. frakció ürül erős hágómozgásokat produkál az állat. Mialatt a spermiumban gazdag 2. frakció ürül, nincsenek hágómozgások (csendes szakasz). Ez percekig is eltarthat. Amikor a 3. frakció ürül ismét erős hágómozgásokat mutat az állat. A sperma hígítása és felhasználása: A kandisznó spermiumai nem tűrik jól a fagyasztást (15 C fok alatt elpusztulnak!!), bár számos kutatócsoportnak kísérleti körülmények között sikerült már megoldania a problémát és malacok születtek fagyasztott ondóból, viszont a módszer még nem eredményez annyira jó alomszámot, hogy érdemes legyen adaptálni/bevezetni a mindennapi gyakorlatba. Fagyasztott spermiumok használata esetén (hagyományos fagyasztási protokollok használatával) viszont csak az intrauterin termékenyítés jöhet szóba, s erre új típusú katétereket fejlesztettek, amelyekkel az ún. intrauterin (méhtestbe) vagy deep intrauterin (a méhszarvakba történő) sperma depozíció megoldható. 16-18 fokon, gyári oldatokkal történő hígítást követően viszont napokig (akár egy hétig is) eltartható a levett ejakulátum. Ebből kifolyólag az a megszokott gyakorlat, hogy a sertéstelepeken tartanak néhány kant is, ezektől meghatározott 213
időközönként (hetente 1x vagy 2x) vesznek le spermát és erre alapozzák az ivarzó kocák/süldők termékenyítését. A nagyüzemi sertéstelepeken a természetes fedeztetést jellemzően nem használják, a fagyasztott sperma pedig még nem terjedt el. A termékenyítő adagot jellemzően műanyag tasakokba/poharakba/zacskókba (pl. Flat-Pack) helyezik, és egy adag kb. 70-80 ml térfogatú lesz, ennek megfelelően egy ejakulátumból átlagosan 5-10 adag készíthető. A hagyományos intracervikális inszemináló katétert (pl. ún. Melrose típusú csavart végű katéter, vagy újabban már elérhetők a szivacsos vagy gombos végű katéterek is) a nyakcsatornába vezetik, s ennek a másik végére csatlakoztatják a műanyag tasakot/poharat/zacskót, felfüggesztve, így az inszemináló dózis a gravitáció és a búgó koca méhkontrakcióinak hatására (vákuum-hatás) lassan beáramlik a méhbe (ez akár 15-20 percet is igényelhet, hiszen a párosodás is hosszú ideig tart a sertésben). A méh szívóhatását elősegíti, ha nyomást gyakorolunk a koca hátára, de a sperma beáramlását nem szabad erőltetni (ne nyomjuk meg a tasakot!), időt kell hagyni arra, hogy a méh szívó hatásának eredményeként jusson be, lassan a sperma a méhbe/kocába. A gyakorlatban jellemzően 2-szer termékenyítik az ivarzó kocákat. Általános szabályként elmondható, hogy amennyiben az adott napon reggel detektálható először az ivarzás, akkor aznap délután, majd másnap reggel kell termékenyíteni. Érdekes tény azonban, hogy a választást követően visszabúgó kocák ösztrusz stádiumának/ivarzásának hossza (átlagosan nagyjából 50-55 óra, vagyis 2-3 nap) függ attól, hogy azok hány nappal a választást követően búgnak be (az átlag különben 5-6 nap). Az egyedek közti eltérés viszont kevésbé kifejezett a süldők esetében. Ennek megfelelően a választás utáni 4. Napra ivarzó állatok ösztrusza jellemzően hosszabb (3-4 nap), mint a 7-8. napra búgóké (1-2 nap), viszont az ovuláció standard módon mindig az (változó hosszúságú) ösztrusz 2/3-ánál következik be. Ennek ismeretében lehet kicsit finomítani az általános szabályon és a választás után hamar (~4. napra) ivarzó kocák esetében többet kell várni a detekció és az első MT között (ha reggel búgott, akkor elég másnap reggel majd délután berakni), mint a 7-8. napon búgók esetében (ilyenkor jellemzően a detektált búgással egy időben meg is történik az első MT, majd fél nap múlva a második). Erre részletesen kidolgozott protokollok, ajánlások vannak kialakítva. Ma már egyértelmű az is, hogy egy MT-vel is el lehet érni nagyon jó termékenyülési rátát, ennek viszont előfeltétele, hogy azt nagyon pontosan kell 214
időzíteni (az ovulációt megelőző 24 órán belül kell legyen az egyetlen MT). A gyakorlatban viszont ez nehézkes, ezért egyelőre marad a kétszeri termékenyítés. Az ivarzásdetekcióra alkalmas módszerek: A sertéstelepeken minden reggel (és gyakorta délután is) keresik az ivarzó süldőket és választás utáni kocákat, általában kereső kan segítségével és a detektált búgás időpontjához időzítik a termékenyítést. A nőstények csak az ösztrusz idején állnak meg (lordosis-reflex) kan jelenlétében a hátukra kifejtett nyomás hatására (ez az ún. hátalási próba / tűrési reflex kiváltása), a proösztruszban nem, bár ekkor már enyhén kipirult és duzzadt lehet a péra. Ezek a tünetek azonban főleg az ösztruszban jellemzőek. Egyébként a kocák és a süldők kan hiányában is pozitív hátalási próbát mutatnak, de kizárólag az ovulációt megelőző és követő néhány órában. Ez az oka, hogy a gyakorlatban használják a kereső kant és ennek jelenlétében próbálják kiváltani a lordosis-reflexet/tűrési reflexet, mert ilyen formán az ösztrusz teljes hosszában pozitív lesz a próba, tehát kisebb az esély a hibázásra és nagyobb hatékonysággal lehet detektálni az ivarzást. Kan hiányában egyébként szintetikus androgént tartalmazó kanspray (melyek feromonként működnek) segítségével is lehet tesztelni a kocákat, de jellemzően így sem lesz olyan hatékony az ivarzásdetekció, mintha azt kereső kannal végeznénk. 2.4 A ló mesterséges termékenyítése Spermavételi technika: Műhüvely használatával történik, de fontos, hogy az ejakulációt követően szűrővel eltávolítsuk a sűrű gél frakciót, ugyanis frakcionáltan ürül a mén ejakulátuma/spermája. A mént különben általában fantomra ugratják sárló kanca jelenlétében. A sperma hígítása, fagyasztása és felhasználása: Mesterséges termékenyítésre három típusú sperma használható: friss, hűtött (4 fokon 1-2 napig eltartható) és fagyasztott (-196 fok). Friss és hűtött sperma esetén kb. 20 ml az inszemináló dózisnak térfogata (500 millió mozgó spermiumot kell tartalmaznia). Ha fagyasztjuk, akkor általában feles (0.5 ml) szalmában tároljuk az 215
ondót, így egy termékenyítéskor 6-7 db feles szalmát kell felhasználni. A spermát az uterusba kell injektálni úgy, hogy egyik kezünkkel a hüvelybe nyúlunk, és a mutató ujjunkkal irányítjuk a katéter végét/hegyét a cervixbe, míg a másik kezünkkel kívülről mozgatjuk azt. Friss spermát elsősorban akkor használnak, ha a mén és a kanca egy telepen vannak, vagy földrajzilag közel egymáshoz. A hűtött sperma messzebbre is elszállítható speciális konténerekben (pl. Equitainer®) és ugyanolyan vemhesülési ráták érhetőek el vele, mint friss spermával. A fagyasztott sperma kicsit rosszabb eredményeket produkál és egyelőre még nem is igazán elterjedt, mert nincs olyan jól kiépített terjesztői hálózat, mint például a szarvasmarha tenyésztésben (de terjedőben van). Nem utolsó sorban pedig az is meggátolja a technika széleskörű adaptációját, hogy egyes tenyésztőszervezetek nem ismerik el az asszisztált reprodukcióval születő csikókat. A termékenyítés idejének meghatározása lóban kicsit nehézkes, mert hosszú az ösztrusz/ivarzás/sárlás és ezen belül külső jelek alapján nem lehet megállapítani az ovuláció időpontját. A gyakorlatban lehetőség van arra (elsősorban olcsó és könnyen elérhető friss spermás termékenyítés esetében), hogy a sárló kancát kétnaponta termékenyítik, így biztosítják, hogy mindenképpen legyen kellő számú fertilis spermium az ovuláció idején a petevezetőben. Amennyiben korlátozottak a lehetőségeink, úgy az egyszeri termékenyítést (friss vagy hűtött sperma esetén) az ovuláció előtti 30. órától az utána következő 12. óráig tartó intervallumba kell időzíteni, mert ilyenkor lehet jó vemhesülési eredményt elérni. Fagyasztott sperma használata esetén az optimális időszak még jobban beszűkül és ebben az esetben az ovuláció körüli +/- 6 órás periódusban ajánlott termékenyíteni. Az ivarzásdetekcióra alkalmas módszerek: A legegyszerűbb módszer a sárlás diagnosztizálására a próbáltatás, melynek során naponta vagy kétnaponta egy keresőmént a kanca mellé vezetve keressük az ivarzás jeleit. A kancát mindenképpen kalodában kell tartani, hogy ne okozhasson sérülést a ménnek, mivel a nem ivarzó kanca lerúgja magáról a hímet. A sárló kanca viszont elfogadja a mén közeledését, farkát felemeli, villogtat, vizeletet ürít. Fontos megjegyezni, hogy a szezonátmenetben illetve abban az esetben, ha még csak a sárlás elején járunk, kevésbé intenzívek a tünetek, valamint kifejezetten agresszív lehet akár a sárló kanca is, amennyiben csikója van. Előfordulhat továbbá az is, hogy egyes anösztruszos kancák is pozitívan reagálnak. 216
A próbáltatáson túl lehetőségünk van rektális vizsgálatot végezni, melynek során a cervix és a méh tónusára (sárló kancánál alig van tónusa, kifejezetten lágy, ami fontos különbség a tehénhez képest) illetve a petefészken található képletekre vagyunk figyelemmel (kisebb-nagyobb tüszők tapinthatók). A tüszők tapintata jól jelzi, hogy milyen távol vagyunk az ovulációtól, ehhez közeledve ugyanis a domináns follikulus jellemzően felpuhul. Szóba jöhet még a vér progeszteron szintjének mérése is speciális ELISA-kitek segítségével, ezzel azonban az ovuláció időpontját nehéz előre jelezni, csupán arra alkalmas, hogy eldöntsük, diösztruszban (magas cc.), vagy proösztrusz-ösztruszban (<2 ng/ml alatt) van-e a kanca. Tekintve, hogy a kanca sárlása relatíve hosszú, átlagosan 5-7 napig tart, azonban ennek hossza egyedek között is változó lehet, így az ovuláció pontos idejének meghatározása nagyon nehéz, még annak ismeretében is, hogy ez jellemzően a sárlás vége előtt 1-2 nappal következik be. Amennyiben rendelkezésre áll ultrahang a ménesben, úgy a termékenyítés idejének optimalizálására a legalkalmasabb módszer az, ha UH-val rendszeresen ellenőrizzük a kanca petefészkét és hCG-vel vagy deslorelinnel indukáljuk a megfelelően nagy tüszők ovulációját. A hCG kezelést 35 mm-nél nagyobb follikulusok esetén ajánlott elvégezni (intravénásan kell beadni), s ezt követően átlagosan 36 óra múlva várható az ovuláció. Hasonlóképpen a deslorelint (injekciós készítmény, szubkután implantátum vagy minipumpa) 30 mm-nél nagyobb tüszők ovuláltatására javasolt adni, ami a kezelést követően 40-48 óra múlva fog bekövetkezni. A nagyjából meghatározott időre bekövetkező indukált ovulációhoz már jól lehet időzíteni a MT-t, de a legbiztosabb módszer az, ha a gyógyszerek adagolását követően még 6 óránként ellenőrizzük a petefészkeket ultrahanggal, így biztosan nem tévesztjük el az ovulációt. 2.5. A kutya és a macska mesterséges termékenyítése
Spermavételi technika: A kantól általában tüzelő szuka jelenlétében veszünk spermát, speciális spermavételi pohárba vagy pl. centrifuga csőbe vagy a humán gyakorlatban használt spermavételi edénybe, stb.. Alternatív megoldásként lehetőség van ivarzó szukától vett hüvelyváladékkal stimulálni a kant, de kereskedelmi forgalomban is van olyan készítmény, amit feromon tartalma miatt a kanok 217
stimulálására használhatunk. Az alkalmazott módszertől függetlenül a feromonoknak nagy jelentőségűk van a stimuláció miatt. Kezdetben a praeputiumon keresztül gyengéd masszírozással stimuláljuk a kant és indukáljuk az erekciót. Az erekció kialakulásával párhuzamosan vissza kell húzni a fitymát, mivel ha ezt nem sikerül időben megtennünk és a bulbus glandis (hagyma) erekciója a fitymán belül alakul ki, akkor ez komoly fájdalmat okoz a kannak és nem alakul ki erekció + nem sikerül a spermavétel (+ rossz emlék!!, ami a későbbi sperma vételeknél okozhat gondot). Miután kialakult az erekció + visszahúztuk a fitymát, közepes erősségű nyomást gyakorolunk a szabaddá váló bulbus glandisra (hagyma) és folyamatos nyomással + ritmikus szorítással stimuláljuk a kant. Eközben lehetnek hágómozgások. Hamarosan jön az átlépő reflex (1-2 percen belül), ekkor segítünk a péniszt 180 fokban caudalisan fordítani, továbbra is nyomás alatt tartva a hagymát. Ezt követően még 5-30 percig folytatódik az ejakuláció, de ekkor hágómozgások már nincsenek. A kankutya ejakulátuma 3 frakcióban ürül. Az első (0.5-5 ml) és a harmadik frakció (2.5-50 ml) víztiszta prosztataváladék (ez nekünk további felhasználás szempontjából nem kell) és külön gyűjtjük őket. A második, a tejszerű frakció (0.53 ml), a spermiumban gazdag fázis és ezt fogjuk később termékenyítésre használni. Az első és a második frakció nagyon hamar, pár percen belül ürül, még az átlépést megelőzően. Az átlépés jelzi nagyjából az átmenetet a második és harmadik frakció között, ami után még hosszú perceken át ürül a harmadik frakció. Ha lehet, az összes frakciót gyűjtsük külön csőbe. Megkülönböztetésük könnyű, mert először jön egy vízszerű váladék (fél-1 perc alatt ürül), azután még az átlépést megelőzően a tejszerű (spermiumban gazdag) második frakció (fél perc alatt ez is ürül), majd az átlépést követően már csak a harmadik, ismét víztiszta frakció jön, de ez hosszú perceken át ürül. A kandúrtól való spermavétel elég körülményes, sok türelem, tréning és egy ivarzó nőstény kell hozzá. Az ondót le lehet venni nyúlra méretezett műhüvellyel vagy esetleg elektroejakulációval (de ehhez el kell bódítani az állatot). A sperma hígítása, fagyasztása és felhasználása: Hígítást követően a kutya spermája friss (néhány órán belül, akár hígítás nélkül is felhasználható), hűtött (5 fokon 4-5 napig eltartható) állapotban, vagy fagyasztást-felolvasztást követően (-196 fok) használható fel. Jellemző a kutyára, hogy a gyűjtött ejakulátumot csak egy szuka MT-re szokták felhasználni (1 ejakulátum/1 szuka; csak a második frakciót, ami 1-2 ml). 218
A hüvelybe történő inszeminálás vaginoszkóppal/hüvelytükörrel egyszerűen kivitelezhető és friss vagy hűtött spermával jó eredményeket is ad (50-90%). A fagyasztott spermát azonban intrauterin kell injektálni, hogy a termékenyítés eredményes legyen. Az intravaginális sperma befecskendezést (friss vagy hűtött) műanyag katéterrel végzik, úgy, hogy pár percig (5-10 perc) megemeljük a szuka hátsó lábait, hogy ezzel elősegítsük a spermiumok transzportját (bejutását a nyakcsatornán keresztül a méhbe). Intrauterin befecskendezéshez (főleg fagyasztott sperma esetén) speciális katéterek kellenek, mert nehézkes bejutni a szuka méhébe a nyakcsatornán keresztül. Használhatunk Foley-katétert, amit egy levegővel felfújható ballonnal tudunk rögzíteni a hüvelyben. A ballon a bulbus glandis (hagyma) szerepét pótolhatja (stimulálás). A sperma befecskendezése megtörténhet a Foley-katéter felhelyezése után, vagy a Foley-katéteren keresztül egy második katétert vezethetünk be a cervix külső nyílásához/vagy a cervixbe (ha tudjuk) és ezután történhet meg a sperma befecskendezése. Használhatjuk a fémből készült ún. norvég katétert is, ami az előbbihez hasonlóan egy külső katéterben (hüvely; általában műanyag) bevezetett második, belső fém katéterrel manipulál (ezt a technikát Norvégiában, a prémjükért tartott rókák MT-re fejlesztették ki). Vannak kidolgozott protokollok transzcervikális, endoszkópos intrauterin, illetve teljes altatásban végzett sebészi szintén intra uterin inszeminálásra is (ez utóbbit medián laparotómiával végzik, majd közvetlenül a méhszarvakba fecskendezik a termékenyítő adagot). Etikai aggályok miatt viszont a sebészi módszer nem terjedt el, sőt visszaszorulóban van, mivel több országban tiltják!!. A transzcervikális technika viszont terjedőben van, kellő gyakorlat megszerzése után jó hatékonysággal alkalmazható fagyasztott spermás MT-ekre. Amennyiben nőstény macskát tervezünk inszeminálni, úgy elsősorban friss spermával dolgozhatunk, amit intravaginálisan kell elhelyezni. Fontos azonban kiemelni, hogy ezzel párhuzamosan hCG-vel vagy GnRH hatású készítménnyel ovulációt kell indukálnunk, mivel náluk ez spontán nem következik be, hiszen indukált ovulátorok. A szuka mesterséges termékenyítésének időzítése: Szukában ciklusdiagnosztika céljából a tüzelés látható tünetein kívül (a proösztruszban véres-savós hüvelyváladékozás és péra duzzanat, majd az ösztrusz idején megáll a kannak) vaginoszkópiát, a citológiai minta értékelését és a 219
progeszteron-szint mérését vehetjük igénybe. Ezek közül csak a P4-szint emelkedése jelzi megbízhatóan az ovuláció időpontját, amit pontosan ismernünk kell, ha MT-t akarunk alkalmazni, ugyanis az ösztrusz hossza, s ezen belül az ovuláció időpontja az egyedek között nagy változatosságot/eltérést mutat. A ciklusdiagnosztika ugyanebből az okból kifolyólag természetes fedeztetés alkalmával is nagyon fontos, mert bár a kanspermiumok és a petesejtek egyaránt akár 6-7 napig is életképesek lehetnek a női nemi utakban, s emiatt a „termékeny ablak” rendkívül széles, a legideálisabb mégis a progeszteron-szintek figyelembe vételével fedeztetni, főleg, ha ehhez nagy földrajzi távolságra utaztatjuk a kutyát. Vaginoszkóp segítségével (45 fokos szögben cranio dorsalisan bevezetve, majd vízszintesen előretolva) az anösztrusz alatt a hüvely nyálkahártyáját élénk rózsaszínűnek, sima felületűnek és száraznak látjuk. A proösztrusz kezdetén a nyálkahártya ráncokat vet, nedvessé, fényesen csillogóvá válik, savós-véres ivarzási nyák látható. Az ösztrusz idején a színe elhalványul, száraz, tapadós lesz és a nyálkahártya redőzöttsége ekkor lesz a legkifejezettebb, a redők felszínén hosszanti és haránt irányú barázdák is láthatók. A diösztrusz vaginoszkópiás képe nagyon hasonlít az anösztruszéhoz, élénk vöröses, száraz, sima felületű a nyálkahártya. Pusztán a vaginoszkópiás leletre nem lehet alapozni a ciklusdiagnosztikát, bár gyakorlott vizsgáló kezében jó eszköz lehet, ha a proösztrusz első néhány napja után legalább minden másnap ellenőrizzük a hüvely képét. Mindenképpen ajánlatos azonban a citológia és a szérum-progeszteron mérés eredményét is figyelembe véve meghatározni a fedeztetés/termékenyítés időpontját. A citológiai mintavételhez egy tampont szükséges a hüvelybe vezetni és mintát venni a nyálkahártyáról, majd ezt követően a kenetet valamilyen Romanowskytípusú festéssel (pl. Diff-Quick) kell megfesteni. Az ún. parabasalis és intermedier sejtek a hüvelynyálkahártya jellemző köbös (kerekded), magvas sejtjei, melyek ösztrogén hatására kezdenek proliferálni, úgy, hogy a felső réteg elszarusodik és belőlük kialakulnak a jellegzetes keratinizált szuperficiális sejtek, melyek nagy része anukleárissá válik. Ez utóbbiak szögletesek a kenetben általában összecsapódottan figyelhetők meg, alig vagy nem látható maggal. A hüvely rétegvastagsága és a keratinizálódott sejtek aránya egyre fokozódik a koraitól a késői proösztrusz stádiumig (ekkor már 70-80% keratinizálódott) és a legnagyobb vastagságot ill., >90%-os keratinizációs indexet (és köztük >50% mag nélküli) az ösztrusz idején láthatunk.
220
Vörösvérsejtek a proösztrusz alatt végig láthatók, illetve főleg a korai szakaszban leukocyták is. Előbbiek előfordulhatnak az ösztruszban is, bár számuk ezalatt fokozatosan csökken, de egyáltalán nem biztos, hogy teljesen eltűnnek. Citológiailag úgy lehet az ösztrusz és a diösztrusz közti határt (ami egyébként elég standard módon az ovuláció után kb. 6 nappal következik be) meghúzni, hogy ekkor hirtelen drasztikusan lecsökken az elszarusodott sejtek aránya és sok leukocytát látunk, mert ezek takarítják majd el az ösztrusz során felhalmozódott sejttörmeléket. Az anösztrusz alatt különben alig pár parabasális vagy intermedier sejt látható a kenetben és ezek egyike sem kornifikálódott. A citológia nagyon informatív módszer, önmagában viszont ez sem alkalmas arra, hogy nagy pontossággal meg tudjuk jósolni az ovuláció időpontját. Klinikai szempontból a szérum progeszteron koncentrációjának mérése a legmegbízhatóbb vizsgálat az ovuláció időpontjának meghatározásához. Ennek értékelésekor természetesen figyelembe kell venni a már említett két módszer adta eredményeket is, de a szuka mesterséges termékenyítését (különösen a drága, nehezen hozzáférhető fagyasztott sperma esetén) elsősorban a P4koncentráció alapján ajánlott ütemezni. A gyakorlatban főleg ELISA-val mérjük a P4-et, ng/ml-es nagyságrendben. 1 ng/ml alatti érték jellemzően azt jelenti, hogy a szuka még anösztruszban van. Általában a tüzelés kezdete után lassanként elkezd emelkedni a P4, nagyjából 2 ng/ml érték környékéig. Ez az emelkedés sokszor több napot, akár 1-2 hetet is igénybe vesz, annak ellenére is, hogy a kutya látszólag már régóta tüzel. Az LH csúcs idején a P4 érték 2-3 ng/ml körül alakul, s a szuka ovulációja jellemzően két nappal az LH csúcs után történik meg. Az a jellemző, hogy 2-ről 5 ng/ml-re általában 2-3 nap alatt emelkedik meg a progeszteron-koncentráció, ezt követően viszont felgyorsul az emelkedés üteme, s 5-ről 15 ng/ml-re már egy nap alatt felugrik a mért érték. Mindezeket figyelembe véve az ovuláció valószínűleg akkor következik be, amikor a mért P4-érték 4-10 ng/ml között van. 10 ng/ml feletti érték esetén az ovuláció már biztosan megtörtént, viszont figyelembe kell venni, hogy a szuka petesejtjeinek az ovulációt követően még nagyjából 2 napos érési perióduson kell átesnie, mielőtt megtermékenyíthetővé válnak (majd ezt követően akár 5-6 napig is életképesek maradnak). A fentiekből levonható az a következtetés, hogy gyakorlati körülmények között legjobb, ha a tüzelő szukának kétnaponta méretjük a progeszteron-szintjét, amíg az el nem éri a 2-3 ng/ml-es határt, majd ezt követően ideális esetben naponta 221
kellene végeztetni a vizsgálatot, hogy nyomon tudjuk követni a várhatóan gyorsuló tendenciát mutató P4 koncentráció-emelkedést. Amennyiben csak egyszeri termékenyítésre van lehetőségünk (friss vagy hűtött spermával), akkor 4 nappal az LH csúcs után javasolt elvégezni a MT-t (ami gyakorlati szempontból azt jelenti, hogy a laborból visszakapott 5-15 ng/ml-es érték esetén aznap délután vagy másnap érdemes termékenyíteni). Ha friss, vagy hűtött spermával több termékenyítésre is van lehetőségünk, akkor ajánlott 2 nappal az előző MT-t követően ismételten inszeminálni, ezzel ugyanis növelni lehet a vemhesülés valószínűségét. Természetes fedeztetés esetén különben ugyanezek a számok az irányadók, így a legideálisabb akkor fedeztetni, ha 10-15 ng/ml körüli szérum progeszteron értéket mérünk, s amennyiben alkalmunk nyílik rá ezt 2 nap múlva megismételhetjük. Fagyasztott sperma esetén a spermiumok csökkent életképessége miatt az LH csúcs bekövetkezte után 5-6 nappal kell elvégezni a termékenyítést, vagyis az 515 ng/ml-es eredmény kézhezvételéhez képest 1.5-2 nappal később kell inszeminálni. Természetes fedeztetésnél persze a termékeny ablak sokkal szélesebb lehet.
2.6. A nyúl mesterséges termékenyítése Spermavételi technika: Speciális, nyúlra méretezett műhüvellyel történik. A baknyúl átlagosan 0,5 ml spermát ejakulál, s ebben a mennyiségben összesen kb. 250 millió spermium van. Egy ejakulátumból 10-15 termékenyítő dózist szokás készíteni hígítással, szem előtt tartva, hogy legalább 10 millió progresszíven mozgó spermiumnak kell lennie egy inszemináló dózisban. A sperma hígítása, fagyasztása, felhasználása: A nagyüzemi nyúltenyésztésben a természetes pároztatás nem jellemző, helyette friss (hígítva is csak néhány óráig eltartható), hűtött (5 fokon 1-2 napig eltartható, hígítást követően) vagy fagyasztott spermát lehet használni. A friss és hűtött spermával ugyanolyan vemhesülési rátát lehet elérni, mint természetes fedeztetéssel, de a fagyasztást nem tolerálják jól a nyúl spermiumok. A nyúl sperma fagyasztása esetén különben főleg DMSO-t használnak krioprotektív anyagként.
222
Az anyaállatok MT-e általában az előző ellést (a vemhesség 31 napos) követő 10. Napon (fél-intenzív, 42 napos ciklusokkal dolgozó rendszerben) vagy szinte rögtön, 2 nappal azután (intenzív, 33 napos ciklusokkal dolgozó rendszerben) történhet. A két időpont közti időszakban viszont nem receptívek az anyák. A fiatal állatokat először 16-17 hetesen szokás termékenyíteni. A spermát a kettős méhszáj (uterus duplexe van) nyílásának közelébe kell injektálni. Mivel a nyulak indukált ovulátorok, ezért a sikeres MT-hez a termékenyítés előtt 2-3 nappal PMSG-t, az inszeminálással egy időben pedig GnRH-hatású készítményt kell adni az anyáknak. 2.7.
Az ivardeterminált (szexált) sperma előállítása
Ennek a technikának a potenciálját gyakorlati körülmények között csak a szarvasmarha tenyésztésben használják ki, de ott fontos, hogy a tejelő tehenészetekben több legyen az üsző-, mint bikaborjú. Régen ülepítették vagy centrifugálták a spermiumokat és az X ill. Y tartalmú genomok közti minimális tömegbeli különbség alapján szelektáltak, de ezek az eljárások nem voltak elég egyszerűek, vagy megbízhatók. A sperma szétválasztására ma ismert legmegbízhatóbb módszer az áramlási citometria, amely a háziállatok gyno- és androspermiumának csekély DNSkülönbségét is ki tudja mutatni. Az eljárás során a spermiumokat vitális fluorokrómmal (Hoechst 33342) megfestik, majd egy lézerrel összeépített sejtválogató berendezéssel (Fluorescence Activated Cell Sorter, FACS) szétválogatják. A Hoechst 33342 azon kevés fluoreszcens festékek egyike, amelyik a DNS-spirál adenin-timidin régiójához kötődik, de nem befolyásolja lényegesen a sperma motilitását. A fluorokrómmal megfestett spermamintát a FACS készülékbe fecskendezik, ahol az keresztülfolyva a számítógép vezérlése szerint pozitív vagy negatív töltést kap, DNS tartalmától függően. Ezután a most már elektromos töltéssel rendelkező spermiumok erős egyenáramú mezőn keresztülhaladva a pozitív vagy negatív eltérítő lemezek irányába elhajlik a függőlegestől és így szétválogatva a gyűjtőcsövekbe folyik. Mivel az áramlási citometria jelenlegi kapacitása kezdetben csupán mintegy 100 spermium volt másodpercenként, a szarvasmarha mesterséges termékenyítéséhez szükséges 6-10 millió élő ondósejt kiválogatása 17-28 órát vett igénybe. Emiatt az eljárás elsősorban in vitro fertilizációval kombinálva volt használható, ahol egy petesejt megtermékenyítéséhez csupán 2 - 5.000 ondósejtre van szükség. A technika fejlődésével azonban ma már üszők termékenyítését is jó eredménnyel végzik. 223
A szétválogatott spermával IVF útján előállított életképes borjak azt bizonyítják, hogy a fluorescens festékkel kezelt spermiumok az áramlási citometria során nem veszítik el termékenyítőképességüket. Szarvasmarhán kívül juhnál, sertésnél és nyúlnál sikerült már eredményesen termékenyíteni ivardeterminált spermával. Bár áramlási citometriával szeparált, ivarspecifikus sperma segítségével több speciesnél sikerült ivardeterminált utódokat nyerni, számos kérdés (egy termékenyítő adag szétválasztási költsége, a szeparálás sebessége, az eredményességi mutatók ellenőrzése nagy létszámon, stb) még megoldásra vár a széleskörű bevezetést megelőzően. A módszer >90%-os hatékonysággal állít elő szexált spermát, tehát alkalmas az ivararány eltolására. Ezt két tényező akadályozza: (1) a szexált sperma egyelőre drága, hogy egy szarvasmarha-telepen minden inszemináláshoz ezt használják, illetve (2) üszőkben sokkal hatékonyabban működik mint tehenekben, utóbbiakban ugyanis nagyon meg tud emelkedni a termékenyítési index szexált sperma használata esetén. Mindazonáltal, jobb üzemekben Magyarországon is eltolható az ivararány azáltal, hogy az üszőket szisztematikusan szexált spermával termékenyítik. 3. Szuperovuláció és embriótranszfer Az embrióátültetés célja az, hogy kihasználjuk a jó genetikájú nőivarú egyedek potenciálját is, és a lehető legtöbb utódot nyerjük tőlük. A mesterséges termékenyítésnél egy-egy jó bikától rengeteg utód nyerhető, amelyek öröklik ugyan a kiváló apai géneket, ám a fenotípusuk az inszeminált anyaállat genotípusától is függ. Az embrióátültetés során már a legjobb anyákat is ki tudjuk válogatni és nem kell lezsarolnunk őket vemhességgel, amiből különben csak korlátozott számú lehetne egy állat életében. Helyette a termékenyítést követően az anyákból (embrió-donor) az embriókat kinyerjük és beültetjük őket genetikailag gyengébb (recipiens) egyedekbe, melyek kihordják a vemhességet, miközben a jó genetikájú nőstényekből újabb és újabb utódok nyerhetők. Ehhez viszont szükség van egy plusz eszközre, a szuperovulációs kezelésre, illetve arra, hogy a donor és recipiens állatok ciklusa szinkronizálva legyen. A szuperovulációs protokollok arra szolgálnak, hogy több petesejt érjen meg az 224
egyébként monotocous (egyet ellő) fajokban is, hogy gazdasági szempontból érdemes legyen az embrióátültetéssel foglalkozni. Jelenleg a szuperovuláltatás csak kérődzőkben működik jól. Ezért az embrióátültetés valódi lehetőségeit csak bennük tudjuk kiaknázni, közülük is főleg szarvasmarhában, mert itt sokat nyerhetünk a szuperovuláltatással, míg egy juhászatban flushinggal ill. jó tenyésztés-menedzsmenttel is el lehet érni nagyszámú kettes/hármas-ikerellést az állományban. Sertésben nem szuperovuláltatnak a gyakorlatban, mert minden ciklus során eleve sok petesejt érik meg, így nem lenne nagy a nyereségünk a kezelést követően. Lóban pedig egyetlen protokoll sem működik, részben anatómiai okok miatt (a fossa ovulationison egyszerűen nem tud egyszerre több petesejt ovulálni), részben pedig mert az eCG (PMSG) ennél az állatfajnál nem képes szuperovulációt kiváltani. Húsevők esetében az embriótranszfernek nincs gyakorlatias protokollja. Nehézséget jelent, hogy a donor és recipiens szukákat szinte lehetetlen szinkronizálni, mivel a tüzelésük egyedileg változó hosszúságú és kontrollált ovuláció-indukcióra ebben a fajban nem nagyon van lehetőség. Az indukált ovulátor macskafélékben más a helyzet, itt a szinkronizáció elméletileg megoldható, viszont erre meg nincs kereslet a mindennapi életben. Mindazonáltal a technika bizonyítottan működik kihalással veszélyeztetett macskafélék (tigrisek) esetében.
3.1. Embrióátültetés szarvasmarhában Szuperovuláció: A gyakorlatban mindig valamilyen szinkronizációs protokollba kell beilleszteni, ugyanis a donor állatoknak (amelyet termékenyítünk, majd kimossuk belőle az embriót) embriómosáskor és a recipiens állatoknak (amelyekbe a kinyert embriókat átültetjük) beültetéskor a ciklus azonos stádiumában kell lenniük. Szuperovulációra alapvetően kétféle gonadotrop készítmény használható, vagy FSH, vagy eCG. Ezek a granulosa sejtek FSH-receptorain keresztül hatva elősegítik, hogy egy adott tüszőnövekedési hullámból több follikulus fejlődjön és érje el a szelektált, majd domináns tercier follikulus stádiumot. Az FSH felezési ideje rövid, ezért ebből a megfelelő vérszint fenntartásához 3-4 napon át napi 2 injekció szükséges, hogy. Ha ritkábban akarjuk adni munkaszervezési okokból kifolyólag, 225
akkor nő az egyedek közti variabilitás és romlik a kezelés hatékonysága. Az eCG (PMSG) viszont a gonadotropinok közül a leghosszabb felezési idővel rendelkezik, ezért ezt elegendő egyetlen injekcióval beadni az állatoknak és ez fenntartja a szükséges vérszintet. Donoroknál az első FSH injekciót (eCG esetében az egyetlent) a ciklus 8-12. napján adják, hogy a legjobban érvényesüljön a gonadotropinok tüszőnövekedési hullámra kifejtett hatása (0. nap az előző ovuláció). Majd az első injekciót követő 3. napon prosztaglandint adnak és ezután 2-3 nappal termékenyítik a donor állatot. A recipienst állatok gonadotrop kezelésben nem részesülnek, de a prosztaglandint a donorokkal egy időben kapják. Ezeket az elveket az ismert szinkronizációs protokollokkal is össze lehet egyeztetni. Ennek megfelelően CIDR vagy PRID használata esetén a protokollba épített prosztaglandin kezelést (általában a hüvelyi eszköz eltávolítása előtti napon) megelőző harmadik napon célszerű elkezdeni a gonadotróp-kezelést. Hasonló elvek alapján lehet kétszeri, 11 napos időközzel adott prosztaglandin injekcióval vagy akár az Ovsynch protokoll valamely változatával is szinkronizálni az állatokat. A lényeg az, hogy bár a szinkronizációt a recipiensen és donoron egyszerre kell elkezdeni, a szuperovulációs kezelést és termékenyítést csak a donor állatokon végezzük el (a legtöbb szarvasmarhára kidolgozott szinkronizációs protokoll fixidejű termékenyítéssel dolgozik, ezért az inszeminálás ideje adott, azt nehéz eltéveszteni). A recipienst termékenyítés nélkül egyszerűen hagyják ovulálni és nincs vele más teendő. Az embriók kinyerése: Jellemzően a termékenyítést követő 7. napon végzik, amikor az embriók többsége már a méh üregében található, késői morula vagy korai blasztociszta stádiumban (de még hatching előtt). A kimosás során általában epidurális érzéstelenítés mellett a speciális Foleykatétert transzcervikálisan vezetik föl a méhszarvakba. A katéter felfújható ballonja elzárja a méhszarv lumenét, így nem folyhat vissza a mosófolyadék. A mosófolyadék általában valamilyen pH-stabil módosított PBS puffer (glükóz, piruvát és szarvasmarha marha szérum albumin tartalmú, emellett izotóniás és izo-ozmózisos. A méhfertőzések elkerülése érdekében általában antibiotikumot is tartalmaz. A testmeleg mosófolyadék beáramlik a méhszarv üregébe, amelynek teltségét közben rektálisan ellenőrzik. Amikor már elég sok bement, akkor leeresztik és egy 226
külön csövön keresztül egy konténerbe gyűjtik. A folyamatot többször megismétlik, mert a jó hatékonyság érdekében mindkét méhszarvat egymás után többször át kell mosni. Kimosás során vagy után a kinyert mosófolyadékot egy szűrőn át kell áramoltatni, ami az embriókat visszatartja. A szűrőn fennmaradó rész tartalmazza az embriókat, a továbbiakban ezzel dolgozunk. A szuperovulációs kezelés hatékonysága nagy egyedi variabilitást mutat. Egyes állatokban számos tüsző fejlődik, másokban akár egy sem. Átlagosan 8-10 embriót sikerül kimosni, amiből a morfológiai bírálat után nagyjából 5 bizonyul beültethetőnek. Az embriók bírálata: A kinyerést követően az embriókat steril, kontrollált pH-jú, ozmolalitású és megfelelő tápanyagtartalmú médiumban tartva vizsgálatukat mielőbb javasolt elvégezni, s dönteni fagyaszthatóságuk, beültetésük lehetőségéről. A legtöbb embrió tehát a 7. napon késői morula vagy korai blasztociszta stádiumban van, de ritkán előfordulhatnak már kikelt hólyagcsírák is. Az embriók fejlődési stádiumát sztereomikroszkóp alatt nemzetközi standardok alapján értékelik, és 1-8-ig kódszámokkal jelölik. A fejlettségi kódok az oocytától kezdve hatched blastocysta stádiumig egy-egy fejlődési állapotnak felelnek meg. Az embriók minőségét (hogy küllemük megfelel-e az adott stádiumnak) és 1-4-ig terjedő skálán értékelik, ahol 1 a kiválót jelenti (csak ezek az embriók fagyaszthatók), a 2-es érték megfelelőnek számít, de fagyasztásra nem, csak azonnali átültetésre alkalmas, mivel kevésbé bírná a krioprezerváció okozta stresszt. A 3-as kategóriába már rossz minőségű embriók tartoznak, ezek legfeljebb azonnali beültetést követően eredményezhetnek utódot, a 4-essel jelölt embriók pedig életképtelenek (esetleg eleve csak oocyta vagy zigóta stádiumúak). Az embriók beültetése: A donornak és a recipiensnek napra pontosan szinkronban kell lennie, bár 1-es minőségű embrióknál akkor is lehet utód, ha 1-1,5 nappal eltér az állatok ciklusa. A beültetést régebben (főleg fagyasztott embriók esetén) sebészi úton végezték (horpaszmetszést, majd méhpunkciót követően közvetlenül a méhszarvba ültetve az embriót). Sokkal egyszerűbb azonban transzcervikális katéterrel, nem invazív módon, az ipszilaterális méhszarvba (tehát amelyik a sárgatestet tartalmazó petefészek oldalán van) beültetni recipiensenként egy-egy embriót. A módszerrel
227
50-70%-os vemhesülést lehet elérni úgy, hogy a fejlődési rendellenességek aránya elfogadható határokon belül marad. Bár a mindennapi gyakorlatban a szarvasmarha embrióátültetés a mesterséges termékenyítésnél sokkal kevésbé elterjedt, jelentősége mégis óriási. Mégpedig azért, mert embrióátültetést követően születik a legtöbb igazán nagyértékű bika (együttesen kihasználva a kiváló tehenek és kiváló bikák genetikáját), melyek nemzetközi spermagyűjtő állomásokon termelik a szaporítóanyagot, hogy azt a világ minden táján felhasználják. Ezen kívül az embriók lefagyasztása és szállítása sokkal egyszerűbb módja a nagyértékű állatok szállításának, mintha azokat már kifejlett korukban akarnák hordozni a világban. Végezetül az sem elhanyagolható szempont, hogy embrióátültetésnél a fertőző betegségek átvitelének kockázata elhanyagolható. Multiple ovulation and embryo transfer (MOET): A módszert a 80’-as években azért találták ki, hogy a bikák hagyományos teljesítmény értékelését leányaikon keresztül (ami a bika születésétől kezdve legalább 5 évet is igénybe vett) felgyorsítsák. Kiváló tehenek és bikák keresztezéséből származó sok embriót nyertek, amiket recipiensbe ültettek. Így megszülettek az utódok, s természetesen voltak köztük várhatóan nagyon jó genetikájú bikaborjak is, de nem kellett megvárni, hogy a lányaik 5 év múlva megkezdjék első laktációjukat és ez alapján megállapítható legyen a bika értéke, helyette ezt meg tudták jósolni a bika lánytestvéreinek teljesítményéből (mivel embriótranszfer révén egyszerre születtek közös szülőktől). Így három év alatt kaptak releváns információt a bikák várható teljesítményéről, és beigazolódott, hogy a lánytestvéreik is jó biztonsággal értékelik őket. Aztán ezt lehetett a generációkon keresztül folytatni, hogy az első embriótranszferből született legjobb tehenekből ismét kinyertek embriókat és megismételték a procedúrát a következő generációban is. Persze manapság, a genomvizsgálat idejében ennek már kisebb jelentősége van, mert ennek részeként molekuláris biológiai eszközökkel (például a tejtermelésért felelős néhány markergén vizsgálata alapján) a bika valódi értéke 70%-os biztonsággal megjósolható és nem kell kivárni a fent említett három évet sem, mire elkezdhetik árusítani a spermát. Helyette lehetőség van azonnal értékesíteni a genomvizsgált bikából származó örökítőanyagot.
228
3.2. Embrióátültetés kiskérődzőkben
Szuperovuláció: A szuperovulációt a szarvasmarhához hasonló készítményekkel, szinkronizációval egybekötve lehet elvégezni. Kiskérődzőknél leginkább intravaginálisan behelyezendő progeszteron tartalmú szivacs vagy CIDR jöhet szóba az anyajuhok szinkronizálására, melyeket kb. 14 napig kell bennhagyni a hüvelyben, majd a kivétel előtt 2-3 nappal kezdhető az állat a gonadotropin (FSH vagy eCG) kezelése. Embriók kinyerése: Altatásban, sebészi úton nyitjuk meg (medián laparotómia) és mossuk ki egy bemetszésen át a méhszarvból az embriókat. Embriók beültetése: Altatásban, sebészileg helyezzük be az embriót az ipszilaterális méhszarvba. Megemlítendő, hogy a mesterséges termékenyítéshez hasonlóan itt is működik a laparoszkópos technika. Magyarországon sajnos nem használják az embrióátültetést kiskérődzőknél. Nagy juhtenyésztő országokban azonban igen, mert nagyon jó eszköz az értékes genetikai állatok távoli földrészek közti szállítására, hiszen nem kell az anyaállatot meg az apát mozgatni, csak néhány lefagyasztott embriót. 3.3. Embrióátültetés sertésben Szuperovuláció, szinkronizálás: Hormonális kezelést többnyire nem használnak szuperovuláltatás céljából, mert a sertés enélkül is nagyszámú petesejtet ovulál (igény szerint természetesen ugyanúgy lehet alkalmazni FSH-t vagy eCG-t, csak előbb érdemes megfontolni gazdasági szempontból). Szinkronizációs protokollok ellenben süldőknél használhatók (pl. altrenogest etetése 18 napig), kocáknál azonban a recipienseket leggyakrabban választással szinkronizálják, mert a malacok egyidejű elválasztása jól szinkronizálja az ivarzásukat. Embriókinyerés: Sebészi technikával, általános érzéstelenítésben (medián laparotómia, aztán kimossák a méhszarvakat egy bemetszésen keresztül). 229
Embrióbeültetés: Altatásban, sebészi technikával a méhszarvakba történik. Összességében elmondható, hogy a mindennapi életben nem használják ki az embrióátültetést a telepek, számukra nincs is igazán nagy potenciál benne. A technikának a kutatási szférában van létjogosultsága. A sertésből kimosott embriókból a jövőben talán embrionális őssejt (ESC) vonalakat lehet nyerni kiméra egyedek előállításához (egyelőre ez nem megoldott sertésnél esetén). Amíg viszont ez nincs, addig a protokollnak a beültetés részét tudják kihasználni. Nagy potenciál van ugyanis abban, hogy egy transzgénikus, tenyésztett fibroblaszt sejtekből származó sejtmagot szomatikus sejtmagátültetéssel petesejtek magjának helyére beültetve olyan embriók előállítására és beültetésére nyílik lehetőség, melyekből transzgénikus sertések fejlődnek majd, s ezek a humán orvosi viszonylatban rendkívül fontos xenotranszplantáció donorjaivá válhatnak (a részleteket lásd később). 3.4. Embrióátültetés lóban Szuperovuláció: Ahogy arról korábban szó volt, a kanca esetében nem működik a szuperovuláltatás, részben anatómiai (fossa ovulationis), részben élettani (nincs extra hatása az eCG-nek) okok miatt. Ezért az embriókat jellemzően kezeletlen kancákból nyerik, azonban itt is fontos a donor és recipiens állatok szinkronizációja (például 14 napig tartó altrenogest etetéssel). Meg kell azonban jegyezni, hogy kancáknál nagyobb eltérések megengedhetők a szinkronizációban, tehát az átültetés akkor is sikeres lehet, ha a recipiens a donornál 2-3 nappal később ovulál. Embriók kinyerése: A szarvasmarhánál leírt technikának megfelelően, transzcervikálisan bevezetett Foley katéterrel mossák ki a termékenyítést követő 7. napon az embriókat a méh üregéből. A mosófolyadék, majd a tároló médium (az embriók értékelésének idejére a beültetésig) összetétele hasonló elvárásoknak kell megfeleljen, mint szarvasmarhában. Az embriók értékelése is hasonló szempontok szerint zajlik. Az embriók beültetése:
230
Ugyancsak a szarvasmarhánál leírt technikával, transzcervikálisan, katéterrel történik az embriók beültetése, de kancában a méhtest üregébe és nem a méhszarvakba ültetik az embriókat. Az embrió-átültetésnek azon kancák esetében van gyakorlati jelentősége, melyeknél - jó genetikai értékük ellenére - nem kívánatos, hogy maguk hordják ki a vehemet. Így alkalmazható már többször ellett, idős (esetleg krónikus endometritisben szenvedő, szövettanilag kifejezett periglanduláris fibrózist mutató) vagy akár egészséges, fiatal, sportoló kancák esetében, melyeket nem akarnak a vemhesség miatt kiszakítani a versenyzésből. Ugyanakkor szem előtt kell tartani, hogy egyes tenyésztői szervezetek (angol telivér) nem ismerik el az asszisztált reprodukcióból származó csikókat. Összességében: ez a módszer a lótenyésztésben egyelőre nem túl elterjedt, bár egyre gyakoribb. 4. In vitro fertilizáció (IVF)
Az in vitro fertilizáció (humán medicinában „lombikbébi program”) lényege, hogy a nőivarú állatok petefészkéből kinyert petesejteket in vitro termékenyítik a kívánt apától levett spermával. Háziállataik közül szarvasmarhára jól működő protokoll áll rendelkezésre, amivel kiváló életképességű embriók hozhatók létre, ennek ellenére nem igazán terjedt el a technológia a gyakorlatban. Sertés embriók szintén előállíthatók in vitro, de ezek életképessége sokkal rosszabb, mint a természetes úton létrejött embrióké, ezért esetükben az IVF-nek tényleges gyakorlati jelentősége ma még nincs. A többi háziállatfajban ehhez képest még gyerekcipőben jár az IVF technológia. Fontos azonban kiemelni, hogy rágcsálókban és emberben a módszer kiválóan működik és széles körben használják a humán IVF klinikákon. A szarvasmarha embriókhoz visszatérve hangsúlyozni kell, hogy bár az IVF-et a kutatási célra intenzíven hasznosítják (a korai embrionális fejlődés vizsgálatára), a mezőgazdasági gyakorlatban még nem terjedt el. Ez főleg annak köszönhető, hogy IVF embriók esetében gyakran fordul elő az ún. „large offspring syndrome” (LOS): a borjak abszolút nagy magzattá fejlődnek és ez csökkent fájástevékenységgel és nehézelléssel jár.
231
Az IVF protokolloknak mindig 4 fő lépést kell biztosítaniuk: A petesejtek kinyerése a donorok petefészkéből, ill. ejakulátum gyűjtése a hímektől. 1.
A petesejteket el kell juttatni a II. meiotikus osztódás metafázis stádiumáig (in vitro maturáció), ameddig természetes körülmények között az ovulációkor érnének el. Kutyafélékben különben épp ez a lépés nehezen kivitelezhető, esetükben ugyanis a petesejt csak az ovuláció után 2 nappal, a petevezetőben jut el ebbe az osztódási stádiumba és nagyon szűkösek az ismeretek arról, hogy ezt a folyamatot milyen körülmények befolyásolják, így optimális tenyésztő médiumot szinte lehetetlen összeállítani. 2.
Mesterségesen kapacitálni kell a spermiumokat, majd ezeket az oocytákkal közös médiumba helyezve időt hagyni az in vitro megtermékenyülésnek. 3.
A létrejött embriókat tenyészteni kell blasztociszta stádiumig, hogy azok beültethetőek legyenek valamely, az embriótranszfernél már korábban tárgyalt (adott fajra kidolgozott) módszer segítségével. 4.
4.1. IVF szarvasmarhában Az oocyták kinyerése: Gyakorlati körülmények között két módszer közül lehet választani. Az első, hogy vágóhídi petefészkekből fecskendővel szívjuk ki a szabad szemmel látható (>2-3 mm-es) follikulusok üregéből a petesejteket – ez a módszer értékes genetikájú állatoknál nem jöhet szóba. A másik esetben értékes, élő tenyészállatoktól ultrahang ellenőrzés mellett nyerünk in vivo körülmények között petesejteket a tüszőkből (UH-vezérelt ovum pick-up). Ez utóbbit eredetileg humán alkalmazásra dolgozták ki, de szarvasmarhában is jól működik. Lényege, hogy transzrektálisan kell bevezetni az ultrahangot és mindeközben manuálisan rögzíteni a petefészket, úgy hogy a folyamat az ultrahang képernyőjén végig nyomon követhető. Ezt követően katétert vezetnek a hüvelybe és a hüvelyfalon keresztül megszúrják a rögzített petefészket (UH-képen ellenőrizve), majd leszívják a follikulusokból az oocytákat. A humán gyógyászatban a beavatkozás előtt FSH-val kezelik a donorokat (hyperstimuláció), valamint a spontán ovuláció megakadályozása érdekében a GnRH-agonistával vagy GnRH-antagonistával történő kezelést is alkalmaznak. Így biztosítható, hogy nagyméretű preovulációs tüszők álljanak 232
rendelkezésre a kinyeréshez. Szarvasmarhában ez egyelőre kevésbé elterjedt, s emiatt leggyakrabban késői másodlagos vagy korai tercier follikulusokból kell kiszívni az éretlen petesejteket. A kinyert, cumulus sejtekkel körülvett oocytákat sztereomikroszkóp alatt vizsgálják és kiválogatják azokat, melyek körül több rétegű, ép a cumulus réteg látható. Ha a cumulus réteg sérült vagy hiányzik, akkor a petesejtek nagy valószínűséggel atretizáló follikulusokból származhatnak. Petesejtek in vitro maturációja (érlelése): A következő fázisban a kinyert petesejteket (amelyek a granulosa sejtek gyűrűjében a sejtciklus profázis I. stádiumában várakoztak) mesterségesen el kell juttatni az I. meiotikus osztódás profázisából a II. meiotikus osztódás metafázisába, ugyanis csak ebben az állapotban termékenyülhet meg a petesejt. Természetes körülmények között az osztódási blokk az LH-csúcs hatására, az ovulációkor oldódna, és ezt követően tudna csak eljutni a petesejt a kívánt metafázis II. stádiumba, hogy aztán itt újra megálljon, ilyen formán várva a behatoló spermiumra. A meiózis befejezését indukáló végső szignált a behatoló spermium indítja majd el, ami után megjelenik a második sarki test. Ahhoz, hogy az in vitro maturációs folyamat végbemenjen, a petesejteket 24 órára FSH-t és LH-t (alternatívaként eCG-t és hCG-t) tartalmazó médiumba kell helyezni. A médiumnak ezen kívül izoozmotikusnak, semleges kémhatásúnak és sterilnek is kell lennie, továbbá tápanyagot biztosítania a sejtek számára. A maturációs kezelés hatására a petesejtek kb. 90 %-a eljut a metafázis II-be, mely a cumulus sejtek látható expanziója mellett az első sarki test megjelenésével is detektálható.
A spermiumok kapacitációja és in vitro fertilizáció: A spermiumoknak jól meghatározott érési folyamaton kell átesniük ahhoz, hogy termékenyítőképessé váljanak. Élettani körülmények között ez a női genitáliákban játszódik le és két lépésből áll: a kapacitáció folyamata során a spermiumok motilitása megnövekszik, az akroszóma reakció pedig a petesejtbe való behatolás előfeltétele. A spermiumok in vitro érleléshez leggyakrabban használt eljárás a fölúsztatás (swim up), amelynél a legaktívabb spermiumok egy órás inkubálás alatt a föléjük rétegzett tápfolyadékba vándorolnak. A tápfolyadék heparint is tartalmaz, ez a női nemi utak váladékában is jelen lévő glukóz-aminoglikán vegyületekkel rokon összetételű. Heparin helyett a spermiumok motilitását fokozó egyéb faktorokat, például adrenalint, hipotaurint is lehet adni a közeghez. 233
A swim-up + heparin kezeléssel, vagy a sperma egyes laboratóriumokban használt üveggyapot-szűrését követő heparin kezelésével a kapacitálás is leegyszerűsödött. Harmadik módszer, hogy a (friss vagy fagyasztásból felolvasztott) spermát különböző sűrűségű rétegeket tartalmazó Percoll grádiensben centrifugálják. A centrifugálás során a sűrű rétegeken át a médium felszínére fölúszni képes spermiumok jó hatékonysággal felhasználhatók. Ezt követően közös médiumba kell helyezni a kapacitált spermiumokat az érett petesejtekkel átlagosan 24 órára. A humán gyakorlatban széles körben elterjedt technika során a mellékheréből kinyert spermiumokkal végeznek in vitro fertilizációt. Erre azért van lehetőség, mert a cauda epididymidisben tárolódó hímivarsejtek már fertilisek, tehát kapacitációt követően önállóan átjutnak a granulosa rétegen és a zona pellucidán, ellentétben a heréből nyert spermiumokkal, melyek csak akkor képesek termékenyíteni, ha a petesejt citoplazmájába injektálják őket. Ez utóbbi technika az ICSI, az intracitoplazmatikus spermium injektálás. Érdemes megjegyezni, hogy IVF során átlagosan 3-4 nagyságrenddel több spermium jut egy petesejtre, mint in vivo, ahol közülük rengeteg elpusztul a női nemi utakban történő vándorlás során. Erre azonban szükség is van, mert a tapasztalatok egyelőre azt mutatják, hogy az in vivo rendelkezésre álló spermiumszámmal általában nem sikerül in vitro megtermékenyíteni a petesejteket. Az embriók tenyésztése: Jellemzően 7 napon át, blasztociszta stádiumig tenyésztjük a megtermékenyült petesejteket, mert ilyen stádiumban az embrióátültetésnél leírt módon egyszerűen berakhatók a recipiens tehenek méhszarvába. Ha korábbi stádiumban akarjuk beültetni, akkor a petevezetőbe kell bejuttatni az embriókat és ez csak sebészi úton lehetséges. Szarvasmarha esetében azonban nem terjedt el a humán gyógyászatban egyébként használatos laparoszkópos technika, mely segítségével ivarsejteket (GIFT – gamete intrafallopian transfer), zigótát (ZIFT – zygote intrafallopian transfer) vagy embriót (TET – tubal embryo transfer) is be lehet ültetni a petevezetőbe. Két lehetőség kínálkozik az embriók tenyésztésére: 1. Az ismert összetételű komplex médium (synthetic oviduct fluid, SOF)
tartalmazza az embriók növekedéséhez legszükségesebb faktorokat és tápanyagokat. 234
2. Az embriókat olyan sejttenyészetekkel tenyésztik együtt, amelyek
támogatják a fejlődésüket (ezeknek nyilván nem ismert pontosan az összetétele). Petevezető hámsejtek, cumulus sejtek, méh fibroblast sejtek, de számos egyéb sejtvonal is alkalmas e célra. Ezen módszerek használatával a megtermékenyült petesejtek nagyjából 50%-a beültetésre alkalmas blasztocisztává fejlődik. 4.2. IVF a többi háziállatfajban
Elméleti lehetőség szintjén az IVF csak sertésekben jöhet szóba, esetükben van kidolgozott, többé-kevésbé működő protokoll, de a többi háziemlős fajban egyáltalán nem használatos. A sertés IVF esetén a fő lépések ugyanazok, mint a szarvasmarhánál említettek, de a kinyert petesejteket pár órával tovább kell érlelni, hogy eljussanak a metafázis II-ig. Sertésnél különben IVF technika azért sem működik jól, mert gyakori a polispermiás fertilizáció. 4.3. Az embriók ivarának meghatározása
In vitro előállított morula vagy blasztociszta stádiumú embriókból biopsziával 1-1 sejtet kinyerve, azokból az embrió ivara meghatározható. Az állatbiotechnológiai gyakorlatban két módszer terjedt el, az egyik, hogy a morula állapotú embrió zona pellucidáját valamilyen módon (pl. enzimes emésztéssel) elvékonyítják, majd megbontják, s az így kialakított résen át vákuum segítségével egy blasztomer kiszippantható. A másik lehetőség, hogy blasztociszták külső trofoblaszt rétegéből nyerünk ki egy-egy sejtet további vizsgálatra. Ez utóbbit embrióátültetési program részeként is lehet alkalmazni, tekintve, hogy ilyenkor általában blasztociszta stádiumú embriókat nyernek ki. Akármelyik protokollt használják is, a kinyert sejtek ivara legegyszerűbben PCR segítségével határozható meg. Ennél az eljárásnál olyan specifikus primereket adnak a mintához, amelyek csak az Y-kromoszómán géneken találhatók, s hímivarú embrió esetén az adott DNS-szakasz amplifikálódik. Nőivarú embriókban azonban (ahol ezek hiányoznak), nem detektálható reakciótermék. Hasonlóan elterjedt módszer a FISH (fluorescent in situ hybridization) is, melynek során fluoreszcens aktivitású, RNS vagy DNS probe-t adnak a mintához, melynek 235
szekvenciája komplementer egy adott vizsgálandó génszakasszal szemben, s e DNS szakasz jelenlétében a probe kötődik a genomhoz és fluoreszcens aktivitás mutatható ki. Humán asszisztált reprodukciós programokban ugyanilyen módon végzik a preimplantációs genetikai diagnózist az IVF embriók anyába ültetése előtt. A módszer segítségével kiszűrhetők a legfontosabb monogénes öröklődésű illetve aneuploid rendellenességek (az aneuploid azt jelenti, hogy a kromoszómaszám nem kétszerese a fajra jellemző haploid értéknek; ilyen pl. a Down-szindróma, a 21-es kromoszóma triszómiája). Az orvosi gyakorlatban három jól bevált módszer áll rendelkezésre, hogy individuális sejteket nyerjenek a vizsgálathoz. Ebből kettő megegyezik a fent már tárgyalt módszerekkel (morulából blasztomert vagy blasztocisztából trofoblaszt sejtet kinyerve), de ezen kívül gyakran a megtermékenyült petesejt sarkitestjét veszik ki biopsziával, s ezen végzik el a (többnyire PCR vagy FISH) vizsgálatokat. 5. Embriók és petesejtek fagyasztása A mélyhűtéssel foglalkozó technikák célja, hogy későbbi beültetéshez raktározni lehessen a donor állatokból kimosott vagy IVF-el létrehozott embriókat. A petesejt fagyasztásnak egyelőre csak humán viszonylatban van jelentősége, elsősorban olyan fertilis korú nők esetében, akiknél neoplasztikus kórképet diagnosztizáltak, vagy akik bármilyen okból szeretnék megőrizni termékenységüket évtizedek múltán is. A betegekből a kemoterápia megkezdése előtt ugyanis ovum pick-up segítségével ki lehet nyerni petesejteket, s ezek konzerválása révén biztosítható, hogy a sugárkezelt beteg gyógyulás után vállalhasson gyermeket, annak ellenére, hogy a kemoterápia az ivarsejtjeinek többségét elpusztítja. Ma már a világ minden táján születnek fagyasztott petesejtekből származó kisbabák. Petesejteket megbízhatóan csak az egér és az ember esetében tudnak fagyasztani. Az embriók és petesejtek fagyasztása a korábban bemutatott programozott, lassú fagyasztással vagy a vitrifikációs technológiával lehetséges. Krioprotektív anyagként főleg DMSO-t, propilén-glikolt, etilén-glikolt vagy glicerint (intracellulárisak), illetve szacharózt (extracelluláris) alkalmaznak. Természetesen vitrifikáció esetében sokkal nagyobb koncentrációban van szükség krioprotektív anyagokra.
236
Amikor szalmába töltik a fagyasztáshoz az embriót illetve petesejtet, egymástól légbuborékokkal elválasztott kompartmenteket hoznak létre a szalmában. Az egyik részben található az embrió az intracelluláris térbe bejutó krioprotektív anyagokat tartalmazó oldatban, a másik kompartmentben pedig a szacharóz tartalmú közeg. Felolvasztáskor a kompartmentek összekeverésével biztosítják a sejtek életben maradását, különben ugyanis az ozmotikus különbség miatti nagy mennyiségű víz intracelluláris beáramlásától szétdurrannának. A keveredést követően az extracelluláris szacharóz azonban ozmotikus aktivitása révén vizet tart vissza az extracelluláris térben, így stabilizálva a sejtmembrán két oldalán az ozmotikus viszonyokat. Összességében elmondható, hogy a szarvasmarha, juh, egér és humán embriók lassú fagyasztással és vitrifikációval is fagyaszthatók. IVF-ből származók és donor állatokból kimosottak egyaránt, bár az in vitro fertilizációval létrehozott embriók fagyasztása igazából csak vitrifikáció használatával ad értékelhető eredményt. Ezzel ellentétben a sertésembriók csak a vitrifikációt bírják ki. Bár a ló esetében már voltak próbálkozások, a többi fajban jellemzően nem fagyasztanak embriókat. A lóembriók fagyasztása azért is nehéz, mert azokat egy speciális a glikoprotein kapszula veszi körül a hatchinget követően, amely a krioprotektív anyagok számára kevéssé átjárható. 6. Klónozás A részletek előtt érdemes leszögezni, hogy a klónozás kapcsán leggyakrabban emlegetett technika, a szomatikus sejtmagátültetés önmagában nem más, mint egy biotechnológiai eszköz, amelyet csak a transzgenezis metodikájának ismeretében lehet reálisan értelmezni. E két technika kombinációja ugyanis nagyon sok lehetőséget rejt magában. A klónozásról a társadalmi köztudatban kialakult kép rendkívül felszínesen mutatja be és értékeli a 20. század egyik legnagyobb felfedezésének számító módszert. Fontos tisztázni továbbá, hogy a klónok genetikai állományukban bár azonosnak tekinthetők, sejtjeik epigenetikai mintázata természetesen különbözik, ezért nem lehet a klónozással létrehozott egyedeket sem egymással, sem a sejtmagdonor állattal identikusnak tekinteni. Inkább az egypetéjű ikrekhez hasonlóan kell gondolni rájuk, mint, melyekről egyre inkább nyilvánvalóvá válik, hogy a környezetnek igen fontos befolyásoló szerepe van egyedi fenotípusuk kialakításában.
237
Mostanra már szomatikus sejtmagátültetéssel szinte minden házi emlősállatot sikerült klónozni, s e technikának fontos szerepe lehet egyes veszélyeztetett fajok megóvásában és fenntartásában is, az orvosbiológiai kutatásokban rejlő potenciálja mellett. A technika ismertetését megelőzően érdemes néhány szót ejteni az epigenetikáról. 6.1. Epigenetikai mechanizmusok
A sejtekben a génexpressziót nem kizárólagosan a genom összetétele, a tulajdonképpeni bázissorrend határozza meg, hanem számos egyéb tényező is, melyek adott sejtre jellemző összességét hívjuk epigenomnak, s az ezt vizsgáló tudományterületet epigenetikának. Az alábbiakban a didaktikai szempontból legfontosabb két epigenetikai mechanizmusról, a DNS metilációról és a hisztonacetilációról ill. -metilációról lesz szó. A DNS-metiláció megértéséhez tudni kell, hogy számos emlős gén promoter régiójában vannak olyan citozinban és guaninban gazdag területek (ún. CpG szekvenciák), melyek a sejtben mindenütt jelen lévő DNS-metitranszferázok célpontjai. Ezen enzimek a CpG szigetek citozin bázisaira képesek az 5-ös pozícióba metilcsoportot kapcsolni, így 5-metil citozint hozva létre. Az 5-metil citozin molekulákhoz ezután olyan regulatorikus faktorok kötődnek, amelyek képesek hiszton-deacetiláz enzimeket hozni az adott gén közelébe. Ez utóbbiak a hisztonacetiltranszferáz enzimek hatását ellensúlyozzák, melyek egyes hiszton fehérjék lizin aminosavainak oldalláncához (az aminocsoporthoz) acetilcsoportot kapcsolnak, így semlegesítve az aminocsoport fiziológiás pH-n pozitív töltését. Következményesen, ha egy gén promoterében nagymértékű a CpG szigetek metilálóciója, akkor a gén közelében sok hiszton-deacetiláz lokalizálódik, ami oda vezet, hogy a hisztonok lizinjéről lehasadnak az acetil-csoportok, tehát a lizin aminocsoportja visszakapja pozitív töltését. Így a magas foszfáttartalma miatt kifejezetten negatív össztöltésű DNS-hez sokkal szorosabban lesznek képesek kapcsolódni az egyes hiszton fehérjék az elektromágneses vonzás miatt, ami a transzkripciót az adott génről lehetetlenné teszi, ugyanis ilyen formán nem férhetnek hozzá a transzkripciót elindító molekula-komplexek a promoterhez. 238
Tehát a DNS-metiltranszferázok és az ezek hatását ellensúlyozó DNS-demetilázok, működésének eredőjeként egyes - az adott sejt homeosztatikus működéséhez nem szükséges - gének promotere intenzíven metilálódik, ami hiszton molekulák deacetilációjához, s következményesen a gén elcsendesítődéséhez vezet. Ezzel ellenkezőleg, más sejttípusokban talán ugyanezek a gének elengedhetetlenek a fiziológiás funkciók megtartásához, s ezért promotereik aktívan demetilálódnak, ami fokozott hiszton-acetilációval jár együtt, emiatt folyamatosan mehet róluk a transzkripció. Valószínűleg nincs két olyan sejt a szervezetünkben, melyek epigenetikai mintázata az élet egy adott pillanatában tökéletesen megegyezne (nem is beszélve arról az abszurd kijelentésről, hogy a klónok teljesen identikusak), hiszen a fent említett folyamatokra közvetlenül hatással van a sejtek tápanyagellátottsága, az őket érő stressz, a más sejtekkel történő kommunikáció és még számtalan egyéb faktor is. Így ezen tényezők dinamikusan szabályozzák egyes gének elcsendesítését és aktivációját. Azt azonban tudni kell, hogy a meiózis során a petesejt és a hímivarsejtek génjei szisztematikusan demetilálódnak, és ez szükséges ahhoz, hogy az egyesülésüket követően kialakuló zigóta totipotens jelleggel kezdje meg osztódását. Természetesen, az embrionális fejlődés során létrejövő sejtek differenciálódásuk során fokozatosan újra felépítik majd az adott funkciójú sejtre jellemző DNS metilációs és egyéb epigenetikai mintázatokat. Érdekes azonban, hogy az ivarsejtek fent említett szisztematikus demetilációja során néhány gén promoterének metilációja intakt marad, ezek az ún. imprinted gének, melyeknek valószínűleg muszáj elcsendesítve maradniuk a normális embrionális és magzati fejlődéshez. Ezen gének eloszlása viszont eltérő az oocytáknál és spermiumoknál, tehát más gének maradnak elcsendesítve a petesejtekben, mint a hímivarsejtekben. Az imprinted gének esetében tehát vagy csak az apai vagy csak az anyai allélek expresszálódnak, ellentétben a legtöbb egyéb génnel, melyek jellemzően mindkét kromoszómáról átíródnak, így a géntermék két kópiában lehet jelen a sejtekben. A genomikai imprinting a klónozás sikerességének szempontjából is nagyon fontos. 6.2. A klónozás technikája
Régebbi módszer a morula stádiumú embriók darabolása, melynek során egy morula stádiumú embriót megfelezve, a blasztomerek egyik felét átültették egy 239
üres zona pellucidába, melyből előzőleg a petesejtet eltávolították. A sejtek másik fele az eredeti zona pellucidában maradt. Ez az eljárás technikailag egyszerű és kiválóan alkalmas mesterségesen létrehozott egypetéjű ikrek előállítására, amelyek genetikai anyaga azonos, tehát valódi klónoknak tekinthetők. A módszer használhatóságát azonban korlátozza, hogy a szedercsíra stádiumú embriók kielégítő hatásfokkal csak egyszer, legfeljebb két nagyjából egyenlő részre oszthatók. Később azzal is megpróbálkoztak, hogy a petesejtnek csak a magját távolították el és egyetlen blasztomert helyeztek a zona pellucida alá, a magnélküli oocyta (ún. „cytoplast”) mellé. Ezután elektromos áram segítségével fúzionáltatták az oocyta cytoplastot a blasztomerrel, s így kaptak egy diploid sejtet a zona pellucidán belül. Differenciálódott, felnőtt szervezetből származó sejtekkel a módszer sokáig eredménytelennek bizonyult, ezért dogmatikusan mindenki úgy gondolkodott, hogy egy immáron differenciálódott sejtből már nem lehet létrehozni egy teljesen új szervezetet. Áttörést jelentett, amikor ugyanezt a technikát kipróbálták úgy, hogy nem embrióból származó blasztomerrel, hanem már differenciálódott fibroblaszttal fúzionáltatták az enukleált petesejtet. Ezért hívják „szomatikus” és nem „embrionális” sejtmagátültetésnek. A próbálkozásokat siker koronázta és nyilvánvalóvá vált az is, hogy sokkal könnyebben kivitelezhető ez a módszer, mert nem kell embrió-eredetű donor sejteket gyűjteni a végrehajtásához. Mindezek miatt manapság tulajdonképpen egyetlen technikát használnak klónozáshoz és ez a szomatikus sejtmagátültetés (somatic cell nuclear transfer, SCNT). A szomatikus sejtmagátültetés lépései: 1. A petefészkéből kiszippantott, I. profázisban pihenő petesejteket megfelelő (FSH+LH tartalmú) médiumban el kell juttatni a II. metafázisba. Természetesen a klónozandó állattal megegyező fajú oocyta kell. Sem éretlen, sem már megtermékenyült petesejttel egyelőre nem sikerült a szomatikus sejtmagátültetést kivitelezni. 2. Ebből az érett petesejből eltávolítják az 1. sarki testet és a mellette elhelyezkedő citoplazma kromoszómákat tartalmazó részét. Itt igazából 240
már nem a sejtmagról van szó, mert a metafázis során lebomlik a maghártya és a sejt közepére rendeződnek a kromoszómák. a. Így kapjuk az ún. enukleált petesejtet (= citoplaszt). 3. Ezt követően a donor sejt biztosítja majd a genetikai állományát a létrejövő organizmusnak, hisz a petesejtet enukleáltuk. A sejtmag donor lehet tenyésztett fibroblaszt vagy más szomatikus sejttípus is, azonban furcsamód a több száz ismert emlős sejtvonal közül csak néhány bizonyult alkalmasnak a procedúrához. Követelmény továbbá, hogy a donor sejteknek a sejtciklus G0 vagy G1 fázisában kell lenniük. A reprodukciós célból végzett klónozás során a donor sejtet a klónozandó állatból nyerik ki, állatbiotechnológiai manipulációkhoz viszont általában a kísérleti állat fajával megegyező in vitro sejttenyészeteket használnak. 4. Következő lépésként a donor fibroblasztot bejuttatják a zona pellucida alá, és elektromos áram segítségével fúzionáltatják az enucleált petesejt citoplasztjával. Ez az inger szükséges az osztódás megindulásához is, ezért ezt a lépést szokás a „petesejt aktivációjának” is hívni. Az így kialakított diploid sejt tartalmazza a petesejt citoplazmájában felhalmozott miRNS (mikro-RNS), mRNS és protein állományt is, melyek megléte szükséges az első néhány sejtosztódás levezényléséhez a genom aktivációját megelőzően. 5. Az így létrejött, osztódásnak indult embriókat az IVF-nél ismertetett médiumokban (synthetic oviduct fluid vagy sejttenyészet segítségével) kell tenyészteni blasztociszta stádiumig, amikor már recipiens anyaállatba beültethető. Bár sertésben és szarvasmarhában már egész jó eredményeket tudtak elérni, a klónozás összességében csak kis százalékban sikeres. Klónozott állatokban mindemellett gyakori az in vitro fertilizációnál már tárgyalt large offspring szindróma, továbbá ezek az egyedek általában a vártnál korábban pusztulnak, és sokszor krónikus betegségekben szenvednek. Mindezek a beültetett szomatikus sejt magjának epigenetikai rendellenességeivel, valamint a telomerek megrövidülésével magyarázhatók. Nyilvánvaló, hogy a szomatikus sejtmagátültetés donor sejtjei nem képesek úgy kitörölni a metilációs mintázatukat, mint ahogy azt az ivarsejtek teszik a meiózis során (lásd fent). Ugyan a génexpressziós mintázatuk nagymértékben megváltozik a petesejt citoplazmájában jelenlévő fehérjék és miRNS-ek hatására, 241
ez a folyamat azonban közel sem olyan tökéletes, mint az ivarsejtek képződése során. Ez valószínűleg fontos oka lehet annak, hogy a lehetőségekhez képest egyelőre még rossz hatékonysággal működik a klónozási technika. Mindazonáltal a tudomány jelenlegi állása szerint nagyon távol vagyunk attól, hogy ezen folyamatokat részleteiben is megértsük, így a klónozás reprodukciós célra történő alkalmazása csupán távoli perspektíva lehet. A szomatikus sejtmagátültetés technikája azonban még visszaköszön a későbbiekben, mert a transzgénikus technikákkal kombinálva nagy szerepe lehet a kutatási célra történő laborállat előállításban. 7. Embrionális őssejtek Azokat a sejteket hívjuk őssejteknek, melyek aktívan fenntartják többé-kevésbé differenciálatlan állapotukat, továbbá időközönként asszimetrikusan osztódnak, úgy, hogy az egyik utód mindig megmarad differenciálatlan őssejtnek, a másik utódsejtből pedig valamilyen differenciált sejt jön létre. Jelen tudásunk szerint az őssejt differenciálatlan állapotát és potenciálját a folyamatosan osztódásra, jól meghatározott autokrin, parakrin faktorok tartják fenn. Amennyiben ezek nem biztosítottak, minden őssejt differenciálódik és idővel elveszti önmegújító képességét. A differenciálatlanság megtartása tehát rendkívül nehéz feladat. Differenciáltsági sorrendben az alábbi fő őssejt-típusok különböztethetők meg: 1. Totipotens sejtek: teljesen differenciálatlanok, s képesek új szervezetet
létrehozni önmagukból. Totipotens a zigóta és az embrionális sejtek első 12 generációja. 2. Pluripotens sejtek: korai embrionális sejtek, melyek mindhárom csíralemez
létrehozására képesek. Legújabb kutatások szerint nagyjából a 8 sejtes állapotban a sejtek fejlődési potenciálja már különbözik. Egyesek már csak a trophoblaszt réteg, s így a későbbi extraembrionális szövetek létrehozására képesek, mások pedig csak a tényleges embriót tudják majd létrehozni. Ez utóbbiak a pluripotens embrionális őssejtek (ESC – embryonic stem cell). 3. Multipotens sejtek: leszűkült fejlődési potenciálú őssejtek, melyek csak egy
adott csíralemez valamely sejttípusait tudják létrehozni. Ilyenek például a haematopoetikus őssejtek (HSC – haematopoetic stem cell), melyekből az összes vérsejt kialakulhat. 242
4. Oligopotens sejtek: valójában már nem is őssejtek, hanem ún. progenitor
sejtek. Már annyira differenciáltak, hogy csak 2-3 sejttípus létrehozására képesek. Jó példa rájuk az ún. Common lymphoid progenitor (CLP) sejt, melyből kizárólag B, illetve T lymphocyták jöhetnek létre. A pluripotens embrionális őssejtek (embryonic stem cells, ES cells) tehát az embrió összes sejtjét létre tudják hozni, de az extraembrionális membránokat már nem. Ilyen embrionális sejteket aránylag könnyű blasztociszták embriócsomójából kinyerni, de differenciálatlan állapotban fenntartani annál nehezebb. Folyamatosan osztódó, differenciálatlan állapotukat megtartó embrionális őssejtvonalakat alig néhány faj esetében (pl. ember, egér) tudtak létrehozni. Két fő okból lenne mégis szükség embrionális őssejt-tenyészetekre: először is a regeneratív gyógyászat kiemelkedő potenciált lát bennük, másodszor pedig az embrionális őssejtek nagyon jó alapanyagok transzgénikus állatok létrehozásához (lásd később). Az embrionális őssejtvonalak létrehozásának főbb lépései egér esetében: 1. Az ivarzó nőstényeket a hímekkel egy éjszakára közös térbe helyezik.
Másnap reggel a bepárzott nőstényeket vizuálisan könnyű detektálni, hogy mely, péranyílásukban ugyanis egy fehér, gélszerű dugó (plug) látható, mely a hímek speciális koagulációs mirigyének a váladéka. 2. A megtermékenyült nőstényből blasztociszta stádiumú embriókat
nyernek. 3. A blasztocisztákat Petri-csészébe, fibroblaszt-sejtrétegre helyezik, s ilyen
körülmények között a külső, trophoblaszt sejtek lenőnek a tápláló sejtrétegre és az embriócsomó sejtjei szabadon hozzáférhetővé válnak. 4. Ezt követően valamilyen proteázzal (pl. tripszin) kezelik a kiszabaduló
embriócsomókat, aminek következtében a pluripotens embrionális sejtek elválnak egymástól. 5. Végül megfelelő összetételű tenyésztő médiumban tartják fenn az
embrionális őssejteket, mely amellett, hogy izotóniás, semleges pH-jú és kiváló tápanyagösszetételű, tartalmaz differenciálódást gátló faktorokat is. 243
Ez utóbbiak okozzák a legnagyobb fejtörést a kutatóknak, ugyanis a legtöbb faj esetében nem ismert, hogy mely szignálmolekulák tartják pluripotens állapotban az őssejteket, ezért nem tudjuk a megfelelő faktorokat hozzáadni az in vitro tenyésztőmédiumhoz sem. Egérnél és emberben ez a probléma megoldott, és a kinyert embrionális őssejtek egy jó médiumban differenciálódás nélkül folyamatosan osztódnak. Egér esetében általában nem vet fel komoly etikai kérdéseket, hogy őssejttenyészet létrehozása céljából embriókat pusztítunk el, ezt a társadalom elfogadja, mint a kutatással járó szükséges rosszat. Ember esetében viszont ugyanez igen komoly aggályokat vet fel, éppen ezért a humán embrionális őssejtekhez való hozzájutás nagyon sok propagandát, papírmunkát és kitartást igényel. Márpedig a regeneratív gyógyászat és a humánbiológiai kutatások szempontjából ezekben a sejtekben nagy lehetőségek rejlenek, mert jelen tudásunk szerint elvileg bármely sérült szövet pótlására képesek. Intenzív kutatások történtek egy alternatív módszer érdekében. A megoldást az indukált pluripotens őssejtek (iPSC) felfedezése jelentette, mely megdöntött egy újabb régóta fennálló dogmát a biológiában. Sokáig ugyanis a kutatók meg voltak győződve róla, hogy egy differenciált sejtet lehetetlen visszafordítani őssejt állapotba. Az indukált pluripotens őssejteket terminálisan differenciálódott szomatikus sejtekből, például fibroblasztokból lehet létrehozni úgy, hogy vírus-vektorok (pl. retrovirusok, adenovirusok) segítségével nagy mennyiségben expresszáltatnak bennük négy meghatározott transzkripciós faktort (ezek az Oct4, Sox2, cMyc és Klf4). Előbbiek ugyanis teljesen átrendezik a szomatikus sejt epigenetikai mintázatát és elcsendesítik a differenciáltsági géneket, de átíratják az embrionális őssejtekre jellemző géneket. Az említett négy transzkripciós faktorral egyébként rokon fehérjék tartják fenn az embrionális őssejtek pluripotens állapotát is. Az így létrehozott traszfektált sejtek minden tulajdonságukban, így differenciálatlanságukban és végtelen osztódási potenciáljukban is emlékeztetnek az embrionális őssejtekre. Megjegyzendő egyébként, hogy egér esetében az embriókból kinyert primordiális csírasejtek (embryonic germ cells, EG cells) is az ESC és iPSC-hez hasonló pluripotenciát mutatnak in vitro, ennek megfelelően sejtvonalak tarthatók fenn belőlük. Háziállatoknál egyelőre nem megoldott az embrionális őssejtvonalak fenntartása és az indukált pluripotens őssejtek kialakítására is csak emberben és laboratóriumi rágcsálókban van bevált módszer. 244
Ezeket a technikákat egér és ember esetében is elsősorban a különböző szövettípusok irányába történő differenciálódást kutatására és modellezésére használják fel. Meghatározott, differenciálódást elősegítő faktorok hozzáadásával a Petri-csészében tartott embrionális (vagy iPSC) vonalakat ugyanis egy adott szövettípus irányába történő differenciálódásra lehet serkenteni, így ma már létre tudják hozni in vitro a legkülönfélébb szövettípusokat. A jövőben talán képesek leszünk in vitro teljes szerveket is létrehozni, melyek a betegek károsodott szerveinek helyére ültethetnek be. Az is fölmerült, hogy sérült szervek vagy szövetek regenerálódását elő lehetne segíteni embrionális őssejtek transzplantációjával, ez azonban a gyakorlatban még nem működik. Ennek legfőbb oka, hogy végtelen osztódási potenciáljuk miatt az állati szervezetbe ültetett ESC-k nagy százalékban okoznak daganatokat, főleg teratomákat. Megjegyzendő viszont, hogy ezzel ellentétben a felnőtt szervezetből származó multipotens őssejtek alkalmazása a gyógyászatban már régóta bevált eljárás, hiszen a csontvelő-átültetés sem más, mint haematopoetikus őssejtek beültetése a donorból a recipiensbe egyes leukémiák vagy immunhiányok kezelése érdekében. 8. Transzgénikus állatok előállítására alkalmas módszerek
Transzgénikus az az élőlény, melynek sejtjei valamely idegen gént (transzgén) tartalmaznak. Az ilyen egyedeket létrehozására szolgáló folyamat a transzgenezis. Amennyiben az egyed összes sejtje egyféle, tehát mindegyikük tartalmazza az idegen gént, akkor egyszerűen transzgénikus állatnak hívjuk. Ha viszont két különböző genetikai állományú sejttípus található a szervezetében, melyek közül az egyik típus tartalmazza a transzgént, a másik viszont nem, akkor kiméra állatról beszélünk. Akkor is kiméra az egyed, ha két különböző fajból származó sejtek építik fel a szervezetét. Később látni fogjuk, hogy a létrehozott kísérleti állat transzgénikus, illetve kiméra volta az alkalmazott biotechnológiai módszertől függ. A valódi kiméráktól, melyek biotechnológiai módszerekkel létrehozott élőlények, elkülönítendő az ún. mozaicizmus, mely azt a jelenséget hivatott jelölni, hogy a normális embriófejlődés során bekövetkezhetnek mutációk vagy sejtosztódási zavarok az embriócsomó egyes (de nem az összes) sejtjeiben, s a kialakuló utódsejtek emiatt genotípusukban különbözni fognak az embriócsomóban lévő 245
többi őssejt utódaitól. Tehát a kimérákhoz hasonlóan két különböző genotípusú sejtpopuláció építi majd fel az állat szervezetét. Ez a jelenség különben kifejezetten gyakori az in vitro fertilizációval létrehozott embriók esetében. Ugyanakkor megjegyzendő, hogy az élővilágban természetes körülmények között sem ritka az ún. mikrokimérizmus, ugyanis magzati korban vagy a születés során gyakorta előfordul, hogy a placentán keresztül átjut néhány memória lymphocyta az anyából az újszülöttbe (és fordítva), melyek hosszú éveken át fennmaradnak a születést követően. Az elnevezés abból fakad, hogy nagyon kis számban vannak jelen eltérő genotípusú sejtek az élőlény szervezetében. Az alább részletezendő génmódosítási technikák elsősorban laboratórium rágcsálók esetében kidolgozottak, a transzgénikus egerek nagyon fontosak az orvosbiológiai kutatások számára. Potenciális lehetőség rejlik azonban a technikában, mert segítségével könnyen elő lehetne állítani olyan bioreaktor állatokat, melyek valamely váladékukkal választanak ki gyógyászati célból felhasználandó fehérjéket, enzimeket. A sertésnek azonban fontos szerep juthat a jövőben a transzgenezis orvosi gyakorlatában is. A sertés szervei ugyanis méretükben nagyon hasonlóak az emberéhez, ezért potenciális szervdonornak számítanak a xenotranszplantációhoz (más fajból történő szervátültetés), miáltal megoldódna az átültethető szervek hiánya. Transzgénikus sertések alkalmazásával el lehetne kerülni a xenotranszplantáció során legnagyobb problémát jelentő hiperakut kilökődést. Ennek oka az, hogy a sertés sejtek felszínén az emberétől eltérő glikozilációs mintázat jellemző, ami ellen minden embernek vannak természetesen előforduló, preformált antitestjei, mint az AB0-vércsoportrendszer esetében. A transzgénikus sertések sejtjeinek genomjából célzottan ki lehet ütni (ún. „knock-out”) az α-galaktozid tartalmú oldalláncok képződéséért felelős enzimet. Az ilyen transzgénikus sertések szerveit xenotranszplantáció után nem fenyegetné a hiperakut kilökődés, mert a preformált ellenanyagok ligandjaik, az αgalaktozid tartalmú cukrok, hiányában nem indukálnák azok kilökődését. Természetesen ez esetben is meg kellene oldani az akut és krónikus kilökődés kérdését, melyek azonban gyógyszeres kezeléssel menedzselhetők. 8.1. A transzgén beépülésének mechanizmusai
246
Alapvetően kétféle úton épülhet be az idegen gén a manipulálandó sejtek genomjába, random inzercióval vagy homológ rekombinációval. A random inzerció során a bejuttatott gén véletlenszerűen beépül a genomba egy DNSkettőstörés területére, melyek folyton létrejönnek minden sejtben és azonnal reparálódnak is, ilyenformán a javításért felelős enzimek az éppen ott lévő transzgént aspecifikusan összekötik az egyik törött véggel, ami így beépülhet a DNS-be. A másik lehetséges út a homológ rekombináció, mely fiziológiás jelenségnek számít a meiotikus osztódás során, de nagyon ritka egyéb körülmények között. Ezen folyamat révén a homológ kromoszómák közt allél-kicserélődés (crossingover) mehet végbe a meiózis idején, mely kicserélődés feltételezi, hogy az apai és anyai kromoszómán lévő genomrészletek struktúrája nagyjából megegyező. A homológ rekombinációnál azt a megfigyelést használják ki, hogy a folyamat meiózistól függetlenül is végbemehet, de ritkán. Így célzottan lehet beépíteni a transzgént egy kívánt gén helyére, ami nagyon nagy előny számos kutatás során. Ugyanis kíváncsiak lehetünk például arra, hogy az egerek milyen fenotípusúak lesznek egy adott gén hiányában, ilyenkor célzottan kiüthetünk egy gént úgy, hogy a helyére egy nem funkcionális transzgént építünk be (génkiütés = „knock-out”). Másrészről viszont kutatási szempontból nagyon érdekes az is, miként hat az egér életére, ha módosítjuk az adott gént, ilyenkor egy módosított allélt építünk be a célpont gén helyére (génmódosítás = „knock-in”). Ahhoz azonban, hogy az transzgén homológ rekombinációval történő beépülésére egyáltalán esély legyen, a beültetendő DNS darabnak nem csak a transzgént kell tartalmaznia, hanem 5’ és 3’ irányban is lenniük kell mellette olyan területeknek, melyek szekvenciája megegyezik a kicserélendő gén környezetében lévő elemekkel (homológ szekvenciák). Még így is csak kis százalékban történik tényleges homológ rekombináció. 8.2. A transzgén bevitelére alkalmas módszerek Az idegen gén bevitelére alkalmas módszerek aszerint sorolhatók két fő csoportba, hogy milyen sejtekbe juttatják be azokat. Alapvetően két típus létezik, használhatunk megtermékenyült petesejteket vagy embrionális őssejteket recipiensként. A megtermékenyült petesejteket a nőstény és hím egerek összeeresztését követően befedezett állatok petevezetőjéből nyerjük ki, vagy in vitro fertilizációs technikával hozzuk létre. A DNS mikroinjektálásos technika során 247
mikromanipulátor segítségével, mikroszkóp alatt a zigóta jobban látható hím pronukleuszába injektálunk néhány pikoliternyi, transzgént tartalmazó oldatot. A transzgén még az első sejtosztódásokat megelőzően random integrálódik a genomba, ezért az így létrejött állatok többsége minden sejtjében hordozza a transzgént. Egy másik gyakran alkalmazott módszer a retrovirusok, ezen belül is gyakorta Lentivirus vektorok segítségével történő génbevitelt használja ki. Ilyenkor a zigóta zona pellucidája alá juttatott vírusok tartalmazzák a transzgént, amelyek bejutnak a sejtbe és reverz transzkripciót követően integrálódnak a genomba. A folyamat azonban általában lassan megy végbe és nem fejeződik be az első osztódásig, tehát a transzgén nem lesz ott az állat minden sejtjében, amely következményesen nagy valószínűséggel kiméra lesz. Az integrálódás természetesen random, ugyanis nem lehet előre meghatározni, hogy a vírusból származó DNS a genom mely részébe fog integrálódni. Eddig a gén a megtermékenyült petesejtbe történő bejuttatásról volt szó, de van egy másik nagy csoport is, amikor embrionális őssejteket használunk recipiensként. Előfeltétele, hogy a korábbiakban leírt módon nyert embrionális őssejttenyészetet állítsunk elő, ám éppen ennek nehézségei miatt az alábbi módszer egyelőre csak laboratóriumi rágcsálókban használhatók. Előnye viszont, hogy a megtermékenyült petesejten alkalmazott technikákkal ellentétben lehetőség van homológ rekombinációt előidézni. Ilyenkor elektroporátor segítségével juttatják be a transzgént a sejtekbe. Ennek során az embrionális őssejteket speciális berendezésbe helyezik olyan médiumban, ami tartalmazza a homológ szekvenciákkal kétoldalról határolt transzgént, majd elektromos áram segítségével permeabilizálják a sejtmembránt. Így a transzgén a sejtmagba juthat és a homológ szekvenciák által kijelölt régióban célzottan integrálódik. A technikának azonban nagyon rossz a hatásfoka, hiszen meiózistól független homológ rekombináció rendkívül ritkán következik be, tehát a recipiens sejtek többségében az elektroporációt követően random inzerció történik. Az individuális transzgénikus őssejteket mindenesetre valahogy egy gazdaembrióba kell majd visszajuttatni (lásd később) annak érdekében, hogy utód legyen belőlük, ami így tehát kiméra lesz, mert a gazdaembrió sejtjeinek és az immár transzgénikus őssejteknek a genomja különbözik. Érdemes megemlíteni, hogy elektroporációval nem csak embrionális őssejtekbe, de indukált pluripotens 248
őssejtekbe, sőt bármely differenciált szomatikus sejtbe is lehetséges bejuttatni a transzgént, melyet homológ rekombinációval kívánnak beépíteni. Bár a fenti technikák (DNS-mikroinjektálás, lentivirus-vektorok közvetített génbevitel és elektroporáció) széles körben használatosak, ma már léteznek újabb, terjedőben lévő módszerek is. Ezek közül említésre méltók a CRISPR associated protein 9-en (Cas9), a TALEN nukleázokon és a cinkujjas nukleázokon (ZFN) alapuló rendszerek. Nagy előnyük, hogy a homológ rekombináció jelenségétől függetlenül, és sokkal jobb hatásfokkal képesek célzott génmódosításokat (knock-out vagy knock-in) létrehozni és a reakciót irányító enzimek injektálhatók megtermékenyült petesejtbe is. Segítségükkel tehát át lehet hidalni azt a problémát, hogy a célzott génmódosítások létrehozásához eddig embrionális őssejt-tenyésztésre volt szükség, mely azonban csak néhány fajban megoldott. Hiszen így egy in vitro fertilizáció részeként is lehet célzottan transzgénikus állatokat létrehozni, és így legalábbis elméleti síkon már elrugaszkodhatunk a kizárólagosan laboratóriumi rágcsálókban történő felhasználástól. 8.3. A homológ rekombináció detektálása az embrionális őssejtekben A legtöbb orvosbiológiai kutatásban célzott génmódosítást használnak. A rendkívül ritka homológ rekombinációra tekintettel viszont valahogy ki kell szűrni, mely őssejtekbe sikerült homológ rekombinációval beépíteni a transzgént és melyekbe csupán random inzercióval. Hiszen csak az előbbiekre lesz szükség, kizárólag ezek kerülnek beültetésre gazdaembriókba. Ezért a DNS darab nem csak a kívánt transzgént, hanem egy ún. neomicinrezisztencia jelzőgént is tartalmaz a transzgéntől 5’ és 3’ irányban elhelyezkedő homológ szekvenciák között, melynek terméke elbontja a toxikus neomicint. Ezen felül a konstrukció homológ szekvenciákon kívüli részébe egy vírus eredetű timidin-kináz gént is beépítenek, mely segíti a ganciclovir beépülését a szintetizálódó nukleinsavakba, éppen ezért toxikus. Így, ha a DNS-darab homológ rekombinációval épül be, akkor csak a transzgén és a neomicin-rezisztencia gén fog integrálódni, mivel ezek a homológ rekombináció határait jelentő 3’ és 5’ homológ szekvenciák között voltak. Random inzerció esetén viszont az egész DNS-konstrukció, tehát a timidinkináz gén is változatlan formában integrálódik, Ezután neomicint adnak a sejtekhez, miáltal elpusztulnak azok, melyekbe egyáltalán nem integrálódott a transzgén, így nincs bennük rezisztenica gén. Ha 249
ezután még ganciclovirt is adnak hozzájuk, akkor pedig elpusztulnak azok, melyekbe random integrálódott, mert ezekben a timidin kináz génje is jelen lesz, mely enzim felelős a ganciclovir toxicitásáért. Az ezt követően életben maradó sejtek tartalmazzák a homológ rekombinációval beépült transzgént, de természetesen teljes bizonyosságot a transzgén beépüléséről csak egy PCR vagy Southern blot módszer tud szolgáltatni. 8.4. Transzgénikus vagy kiméra embriók létrehozása A megtermékenyült petesejtbe történő DNS-mikroinjektálás vagy retrovírusmediálta géntranszfer (ill. az újabb Cas9, TALEN és ZFN-technikákkal indukált célzott génmódosítás) esetén a protokoll a továbbiakban nagyon egyszerű, ugyanis az embriókat elegendő morula vagy blasztociszta stádiumig tenyészteni, majd sebészi úton beültetni azokat álvemhes, előzőleg vazektomizált hímmel pároztatott nőstény egerekbe. Az embrionális őssejtekbe épülést követően azonban egy extra lépést kell a protokollba illeszteni, mégpedig azt, hogy a transzgenikus sejtet egy morula vagy blasztula stádiumú gazdaembrióba kell beültetni, hogy abból utód születhessen, hiszen egyetlen sejtből lehetetlen egy új blasztocisztát növeszteni. Ennek azonban egyértelmű következménye, ahogy arról már szó volt, hogy a létrejövő utód kiméra lesz. Két fő módszer áll rendelkezésre, az első az ún. aggregációs technika, melynek során morula stádiumú embrióknak el kell távolítani a zona pellucidáját, majd a sejtcsomóhoz hozzáadni a transzgénikus őssejteket. A zona-mentes morulák képesek egymással és a jelenlévő embrionális őssejtekkel is aggregálódni, s az így létrejövő kiméra embriók álvemhes nősténybe ültethetők. A másik technika során pedig blasztociszta stádiumú embriónak a blasztocöljébe injektálják a transzgénikus őssejteket. Újabban használnak egy harmadik technikát is, ami azon alapul, hogy a recipiens embriókat fejlődésük korai szakaszában elektromos árammal kezelik, ezért a sejtjeik fúzionálnak, következményesen tetraploidok lesznek és így fejlődnek tovább. Amennyiben az előzőekben leírt aggregáltatást ilyen tetraploid embriókkal végzik, kimérák helyett teljes egészében transzgénikus állatok jönnek létre. Ennek hátterében az áll, hogy a tetraploid sejtek bár képesek az extraembrionális membránok kialakítására, az embrió szöveteinek létrehozására már nem, így a fejlődő utódnak minden sejtje biztosan a beépített transzgénikus embrionális őssejtekből fog származni. 250
8.5. Transzgénikus állományok létrehozása célzott génmódosítást követően Mivel a tetraploid embriókkal való aggregáltatást kivéve az utódok kimérák lesznek, azok primordiális csírasejt populációja is kiméra lesz, tehát a létrejövő haploid ivarsejtek közül egyesekben lesz transzgén, másokban nem. Így ha az egeret pározatjuk egy nem transzgénikus (vad típusú) egérrel, akkor az utódai közül egyesek transzgénikusak lesznek, egészen pontosan heterozigóták a transzgénre nézve, mások viszont nem. Külsőleg az esetek döntő többségében lehetetlen megállapítani, hogy az F1 populációban mely egyedek transzgénikusak, ezért nagyon gyakori, hogy a transzgén-konstrukciót (amit a folyamat elején elektroporációval az embrionális őssejtekbe juttatnak) eleve úgy készítik el, hogy az tartalmazzon egy zöld fluoreszcens proteint (GFP) kódoló gént is, amely a homológ rekombinációt követően szintén beépül a genomba. A tengeri medúzafajból izolált gén terméke egy olyan protein, mely látható kék fény vagy UV-fény hatására zölden fluoreszkál. Segítségével kiszűrhetők a heterozigóta transzgénikus F1 egerek, mert az említett hullámhosszú fény hatására ezek zöldnek látszanak, vad típusú társaikkal ellentétben. Természetesen a GFP génjének hiányában lehetőség van arra is, hogy PCR segítségével mutassuk ki a transzgént az F1 egerekből. Így tehát az első generációs kimérák helyett heterozigóta transzgénikus egereket sikerült létrehozni, melyekből beltenyészetet kialakítva idővel olyan állományt lehet tenyészteni, melyben az utódgenerációk a transzgént már homozigóta formában fogják tartalmazni. Ezek az ún. transzgénikus egértörzsek, melyekben egy-egy vizsgálandó gén célzott knock-outtal vagy knock-innel van módosítva. Ma már több tízezer különféle transzgénikus, célzottan génmódosított egértörzs áll rendelkezésre, melyek segítségével specifikusan lehet vizsgálni adott gének hiányának vagy módosított allélok jelenlétének hatását az egerek biológiájára. A modern orvosbiológiai kutatások egy jelentős része megvalósíthatatlan lenne transzgénikus egerek hiányában, ezért a transzgenezis technikája számos kutatási területen rendkívül fontos szerepet tölt be. Transzgénikus egértözsek előállítására egyébként multinacionális cégek szakosodtak, így ilyen laborállatok kereskedelmi forgalomban is beszerezhetők vagy igény szerint akár új transzgénikus konstrukciók is létrehozhatók. 8.6. Kondícionális knock-out és szövetspecifikus transzgén expresszió
251
Sok esetben nem kívánatos, hogy a transzgénnek az embrionális őssejtekbe épülését jelző riporter gének (például a neomicin-rezisztencia gén vagy a zöld fluoreszcens proteint expresszáló gén) is kifejeződjenek a vizsgálandó egértörzsben, ez ugyanis megzavarhatja a normális sejtélettani folyamatok vizsgálatát. Ezért találták ki az ún. kondicionális knock-out technikát. Ilyenkor a riporter géneket egy speciális szekvenciával („loxP”) határolják és a fent leírt lépéseken keresztül hoznak létre beltenyésztett egértörzset. Majd ezt az egétörzset keresztezik egy olyan homozigóta transzgénikus törzzsel, melybe egy speciális bakteriális rekombináz („Cre”) génje lett korábban beépítve transzgenezissel. A létrejövő utódok sejtjeiben ott lesz a szülőkből származó kétféle transzgén, így a loxP-vel határolt neomicines knock-out konstrukció és a Cre rekombinázt expresszáló transzgén is. Mivel a Cre-rekombináz specifikusan hasítja a loxP szekvenciákat, ez az enzim az utódok minden sejtjében kivágja a genomból a loxP-vel határolt neomicin-rezisztencia gént, de változatlan formában meghagyja a kívánt transzgént. A riporter gén expressziója ezután nem fogja zavarni a további vizsgálatokat. Ezen kívül a transzgén elé szövet-specifikus promoterek beillesztése is lehetséges, hogy ilyen konstrukcióban juttassuk be azt a sejtekbe. Ezt követően a transzgén csak azokban a szövetekben expresszálódik majd, melyekben kifejeződik a promoterhez kötődő és azt aktiváló specifikus transzkripciós faktor is. Ilyenformán meg lehet csinálni, hogy adott sejttípusra (pl. hízósejt) specifikus promoter szekvenciával kombinálják a diftéria-toxin receptorának a génjét és ez így együtt lesz a transzgén konstrukció. Ez utóbbi különben egy emberi fehérje, mely számos fajban (így egérben) sincs jelen, viszont emberekben ez felelős a Corynebacterium diphteriae által termelt toxin károsító hatásának közvetítéséért. A fenti konstrukciót tartalmazó egértözset, ha bármely életpillanatában diftériatoxinnal kezeljük, akkor az összes olyan sejtje (a példának megfelelően hízósejtek) elpusztul, melyekben a sejtspecifikus promoter jelenléte miatt expresszálódik a diftéria-toxin receptor. Ezután vizsgálható, hogy miként változnak az egér immunfunkciói hízósejtek hiányában például féregfertőzéseket követően. 8.7. Transzgénikus sejtek, mint a szomatikus sejtmagátültetés donorjai
Végezetül pár szót kell arról ejteni arról, hogy miként lehet a klónozás technikáját kombinálni a transzgenezissel és, hogy miért fontos ez. A fentiek alapján 252
nyilvánvaló, hogy transzgénikus állatok létrehozásához embrionális őssejtekre vagy megtermékenyült petesejtre van szükség. Mint azonban tudjuk, néhány faj (pl. egér, ember) kivételével nem tudunk embrionális őssejtvonalakat fenntartani, továbbá az egéren kívül a legtöbb emlősnél nincsenek protokollok ezek kinyerésére. Másik lehetőség az IVF, ezt azonban a hagyományos módszerekkel (kivéve Cas9, TALEN, ZFN) nem lehet célzott génkiütésre használni, valamint a legtöbb emlősfaj esetében az in vitro fertilizációra sincsenek jól működő, hatékony módszerek. Ennek következménye az, hogy a kutatási gyakorlatban célzott génmódosítás vizsgálatára igazából csak transzgénikus egerek (újabban patkányok is, de korlátozott számban) használhatók modellállatként. Márpedig számos élettani folyamat működését jobb lenne más kísérleti állatfajokban vizsgálni, és a xenotranszplantációhoz is elsősorban génmódosított sertések tudnának donor szerveket szolgáltatni. Sertés eredetű embrionális őssejteket viszont egyelőre nem tudunk fenntartani és az IVF sem működik olyan hatékonyan, hogy erre lehessen adaptálni a célzott génkiütést eredményező legújabb molekuláris biológiai technikákat (Cas9, TALEN, ZFN). Ezért potenciális lehetőség rejlik a transzgenezis és a szomatikus sejtmagátültetés kombinációjában, melynek főbb lépései a következőkben foglalhatók össze (példának véve a sertést a xenotranszplantáció donorállataként): 1. Egy donor sertésből fibroblaszt sejteket kell izolálni, sejtvonal
létrehozására. 2. A fibroblaszt sejtekbe elektroporációval bejuttatni az α-galaktozil-
transzferázt kiütő homológ transzgénikus szekvenciát. 3. Vágóhídi sertés petefészekből kinyert petesejteket in vitro érlelni a sejtosztódás metafázis II. stádiumáig. 4. A petesejtből eltávolítani a sarki testet és a metafázisos kromoszómákat
tartalmazó citoplamza részt (enukleáció). 5. A zona pellucida alá injektálni egy transzgénikus fibroblaszt sejtet, majd
elektromos árammal fúzionáltatni és aktiválni. 6. A létrejött embriókat in vitro tenyészteni blasztociszta stádiumig. 7. A blasztocisztákat be kell szinkronizált kocák méhszarvába ültetni. 8. Az így születő knock-out malacok olyan transzgénikus sertések lesznek,
melyek felnevelésüket követően potenciális szervdonorok lehetnek, mert a szerveik biztos nem lökődnek ki hiperakut rejekcióval, hisz a sejtjeik 253
felszínén hiányzik majd az a glikozilációs mintázat, ami ellen humán preformált ellenanyagok vannak. 8.8. A humán asszisztált reprodukcióban leggyakrabban használt technikák A humán gyógyászatban legfőbb cél, hogy szub- vagy infertilis egyéneknek is születhessen gyermeke, s léteznek kifejezetten erre szakosodott IVF-klinikák. Ennek elérése érdekében a mesterséges termékenyítést a humán gyógyászatban is gyakran alkalmazzák, melynek során katéterrel a hüvelybe, a cervixbe vagy transzcervikálisan a méhbe lehet injektálni a friss vagy fagyasztott spermát. A mesterséges termékenyítés mellett a leggyakrabban alkalmazott technika az in vitro fertilizáció, amihez ultrahang által vezérelt transzvaginális ovum-pickupal nyerik ki a petesejteket FSH-val valamint GnRH-agonistával/antagonistával történő petefészekstimulációs kezelést követően, melynek célja a tüszőnövekedés serkentése. A petesejtek ezután többféle módon is megtermékenyíthetők. Hagyományosan a hímivarsejtek in vitro kapacitációját követően, amennyiben a férfi spermiumai még elfogadható motilitást mutatnak, a petesejtet és a spermiumokat fél-egy napig közös médiumba helyezik (kokultiváció). Ha azonban a hímivarsejtek rossz életképességűek, alkalmazható az ún. intracitoplazmális sperma injektálás (ICSI), melynek során a spermiumot mikropipettával juttatják az oocytába. Azoospermia esetén az ICSI mellékheréből vett spermiumokkal is kivitelezhető. Ehhez nagyon hasonló, szintén elterjedt technika, a szubzonálisan történő spermium injektálás (SUZI), amikor a hímivarsejtet nem a petesejt citoplazmájába, hanem a zona pellucida alá juttatják be. A zigóta kialakulását követően több lehetőség is kínálkozik a korai stádiumú embrió beültetésére, de az irányelv minden esetben az, hogy a férfi szubfertilitása esetén az IVF-el létrehozott embriót vissza lehet ültetni az egészséges párjába, női eredetű terméketlenség esetén viszont szükség lehet béranyára is. A korai (főleg morula) stádiumú humán embriók jól tolerálják a donor és recipiens közti aszinkroniát, tehát a béranya felkérése esetén sem ütközünk nagyobb akadályokba. Az embriók beültetése leggyakrabban nem sebészi úton történik, melynek során transzcervikális katéterrel injektálják a méh üregébe az in vitro tenyésztett, jellemzően morula stádiumú embriókat. Ritkábban blasztociszta stádiumig is tenyésztik őket, ilyenkor viszont általában elvégzik a zona mesterséges 254
felrepesztését a beültetés előtt (asszisztált hatching), ez ugyanis fokozza a módszer sikerét. Ezen kívül azonban megoldott a laparoszkópos beültetés is, melynek során a petevezetőbe injektálják a zigótát (ZIFT, zygote intrafallopian transfer) illetve a 24 sejtes embriót (TET, tubal embryo transfer), vagy az is lehet, hogy a hímivarsejteket és a petesejtet in vitro fertilizáció nélkül, érlelést és kapacitációt követően azonnal visszaültetik a tuba uterinába, hogy a fertilizáció folyamata már in vivo menjen végbe (GIFT, gamete intrafallopian transfer). Megemlítendő még, hogy a beültetést megelőzően rutinszerűen végeznek preimplantációs genetikai diagnózist, amivel a legfontosabb monogénesen öröklődő betegségeket, illetve az aneuploidiát is ki lehet szűrni.
255
