10.2.2014
Investice do rozvoje vzdělávání
Charakterizace slepičích protilátek proti sarkosinu Dagmar Uhlířová 7.2.2014 Reg.č.projektu: CZ.1.07/2.4.00/31.0023 NanoBioMetalNet Název projektu: Partnerská síť centra excelentního bionanotechnologického výzkumu
Obsah • Sarkosin • Metody stanovení sarkosinu • Imunochemické metody – antigeny – protilátky – příprava protilátek
• Cíle práce
Sarkosin Charakterizace • 1847 izolován Justusem von Liebigem • Přírodní, netoxická, bezbarvá, pevná látka patřící mezi aminokyseliny • Methylderivát glycinu nazýván také N‐methylglycin • Meziprodukt metabolismu cholinu • Hapten Použití ‐ Léčba schizofrenie ‐ Marker rakoviny prostaty
1
10.2.2014
Možnosti stanovení sarkosinu ‐ Enzymově (enzym sarkosin oxidáza) ‐ LOD 100 pg/ml
‐ Imunochemicky (ELISA, EIA) ‐ LOD ‐ 0,1 ug/ml
‐ Chromatografie (GC, UHPLC, HPLC‐VIS) ‐ LOD 1 ‐ 10 ug/ml
‐ Hmotnostní spektrometrie (LC/MS, GC/MS, CE/MS, HPLC/MS) ‐ LOD ‐ 2 ng/ml
‐ Elektrochemické metody ‐ LOD ‐ 10ng/ml
Imunochemické metody ‐ Reakce antigen‐protilátka ‐ Lze stanovit v biologickém materiálu celou řadu cizorodých látek (farmaka, toxické látky…), látky infekčního původu nebo specifických protilátek ‐ Aglutinace ‐ Turbidimetrie a nefelometrie ‐ Imunodifúze ‐ Imunoelektroforéza (IE) ‐ Radioimunolanalýza (RIA) ‐ Enzymová imunoanalýza (EIA) ‐ Heterogenní enzymová analýza (ELISA)
Antigen ‐ Látka, která vyvolává imunitní reakci ‐ Imunogen = kompletní ‐ Hapten = nekompletní – Nízká molekulová hmotnost – Nevyvolává tvorbu protilátek – Potřebuje nosič
2
10.2.2014
Protilátky • Glykoproteiny, které jsou schopny identifikovat a zneškodnit antigen • Těžký (H) řetězec Vazebná místa pro antigen – Složen z 4‐5 strukturně podobných domén – Velikost 50 – 75 kDa
•
Lehký (L) řetězec – Složen 2 imunoglobulinových domén – Velikost přibližně 25 kDa
H2N H2N
NH2 NH2
Lehký řetězec HOOC
COOH
• 1976 Susumu Tonegawa ⇒B‐Lymfocyt dokáže rekombinovat části genomu a dokáže tak vytvořit všechny variace struktur protilátek • Izotypy: IgG, IgE, IgD, IgA, IgM, IgY
Konstantní oblast
Těžký řetězec
Fc fragment
Variabilní oblast
HOOC COOH
Specifita protilátek • Polyklonální protilátky – směs protilátek různé afinity a specifity – vytvořeny v organismu po vpravení cizorodého imunogenu – nehomogennost je způsobena existencí řadou determinantních míst na molekule antigenu – odpověď každého jedince má do značné míry individuální charakter
• Monoklonální protilátky – Všechny molekuly produkovaných Ig jsou identické – Mají shodnou afinitu i specifitu
• Rekombinantní protilátky – při jejich přípravě lze genovými manipulacemi přesněji ovlivňovat specifitu protilátek – postup přípravy je založen na izolaci genů kódujících protilátky, na jejich klonování a expresi
Příprava protilátek Polyklonální protilátky
Monoklonální protilátky
3
10.2.2014
Slepičí protilátky ze žloutku • • • •
Vyrobeny firmou Hena s.r.o. IgY, polyklonální Produkovány ve vaječném žloutku Bez imunoafinitní purifikace
• Sarkosin byl přes oligopeptidové raménko konjugován k proteinu hemokyaninu (KLH)* • Funkčnost byla ověřena pomocí reaktivity k ke konjugátu sarkosin‐BSA pomocí ELISA * • Srovnání koncentrace IgY u slepic před a po imunizaci* kDa Mr Sar1 rSar1 Sar2 • Sar 1, Sar2 260 150 100 • Rozeznávají tyto protilátky volný sarkosin? 75 Sar 1 50 • Jak to ověřit?
rSar2 IgY HC Fab
37
Sar 2
LC
25 20 10
Protilátka Číslo
Protein Reaktivita se (mg/ml) sarkosin‐BSA
Sar 1
211112 19.4
dobrá
Sar 2
251112 18.2
vynikající
*Data od výrobce
• • • • •
ELISA Enzyme‐Linked‐Immunosorbent Assay Imunoenzymatické reakce Reakce antigen‐protilátka Mikrotitrační destička Metody – Sendvičové – Přímá – Nepřímá – Kompetitivní – Dot ELISA
Výhledy do budoucna: • Testování imunoreaktivity připravených protilátek k volnému sarkosinu za použití sendvičové metody ELISA • Použití paramagnetických částic pro imunoanalýzu sarkosinu • Stanovení sarkosinu v živočišných vzorcích
4
10.2.2014
Poděkování • Prof. Ing. René Kizek, Ph.D. • Ing. Soňa Křížková, Ph.D. • Mgr. Ondřej Zítka, Ph.D.
Děkuji za pozornost
Poděkování: Partnerská síť centra excelentního bionanotechnologického výzkumu CZ.1.07/2.4.00/31.0023 NanoBioMetalNet
Reg.č.projektu: CZ.1.07/2.4.00/31.0023 NanoBioMetalNet Název projektu: Partnerská síť centra excelentního bionanotechnologického výzkumu
5
