STUDI HUBUNGAN KUANTITATIF STRUKTUR-AKTIFITAS (HKSA)SENYAWA TURUNAN 4-AMINOQUINOLIN PIRIMIDIN, DOCKING MOLEKUL, PENELUSURAN FARMAKOFOR, VIRTUAL SCREENING, UJI TOKSISITAS, DAN PROFIL FARMAKOKINETIK SEBAGAI ANTIMALARIA SECARA IN SILICO Nursalam Hamzah, Afrisusnawati Rauf, Ariwanti Jurusan Farmasi, Fakultas Ilmu Kesehatan, Universitas Islam Negeri Alauddin, Makassar ABSTRACT A research of quantitative structure-activity relationship (QSAR), molecular docking, searching pharmacophore, virtual screening, toxicity test, and Pharmacokinetic Profile of 4Aminoquinoline Pyrimidine Derivative Compounds as Plasmepsin enzyme inhibitor as Antimalarial by in silico has been conducted. This study aims to find the QSAR model equation of 4-Aminoquinoline Pyrimidine derivative compounds, to find pharmacophore features of compounds that responsible for inhibition activity of Plasmepsin enzyme in Plasmodium falciparum, as well as to select compounds from virtual screening results then determine the pharmacocinetic profile, and the toxicity of metabolites for malaria treatment. The procedure begins with the modelling and ab initio geometry optimization of the molecular structure by HyperChem 8.0. QSAR descriptors calculation, pharmacophore feature determination and molecular docking are done by using MOE 2009. Furthermore, toxicity testing by Toxtree and AdmetSAR, as well as pharmacokinetic profile determination by using PreADME done to 150.000 natural product compounds from zinc database. From the experiments, the equation obtained: 1/IC50 = 5.3757 + (0.7514 AM1_HOMO) + (-0.3100 log P (o/w)) + (0.0065 vdw_vol), where r2 = 0.9282 dan q2 = 0.9282, beside that molecular docking results for protein code 2IGX compound 13 showed better results with the value of docking score (S) is -129.7491. As for the compounds of zinc database, the result is a compound with code ZINC32501354 and ZINC32501366 are choosen compound among 150.000 compounds in terms of suitability of the pharmacophore query, docking by pharmacophore method, bioavailability prediction using Lipinski rule of five and from the prediction of ADME/T Keywords : QSAR, molecular docking, pharmacophore, antimalarial, Plasmepsin enzyme
JF FIK UINAM Vol.3 No.4 2015
176
PENDAHULUAN Malaria
terlepas dari peran mereka dalam sintesis
adalah
penyakit
yang
asam
nukleat.
Pirimetamin,
analog
digunakan
untuk
disebabkan oleh parasit Plasmodium dan
pirimidin,
ditularkan
oleh
nyamuk
pengobatan malaria dengan keberhasilan
(Lukman
Hakim.
2011:
Anopheles Malaria
yang terbatas. Sebuah review penelitian
merupakan penyakit yang sampai saat ini
oleh Sunny Manohar, et al (2012) yang
masih menjadi masalah utama kesehatan
mengembangkan
penduduk dunia. Selama 100 tahun, dunia
struktural jenis baru untuk pengobatan
belum dapat memberikan kontribusi yang
malaria,
jelas terhadap pengobatan penyakit ini.
menghubungkan
European Commision (2002) mengatakan
pirimidin
bahwa penyakit tersebut tidak hanya
penghubung diaminoalkane-linear yang
menyerang daerah tropis, tetapi juga
tersambung secara fleksibel, sehingga
menyerang daerah subtropis di seluruh
molekul memiliki fleksibilitas yang cukup
dunia.
Hal
1).
telah
perancah
mereka
molekul
mengusulkan
untuk
4-aminoquinoline
bersama-sama
dan
melalui
tersebut
didukung
oleh
untuk muat pada situs pengikatan target,
pernyataan
Reisberg
(1994)
yang
dan sebagai hasilnya, jenis molekul hibrida
mengatakan
bahwa
banyak
dapat menunjukkan aktivitas antimalaria
terjadi pada negara-negara yang menjadi
yang lebih baik. Hal ini penting untuk
daerah
lain
disebutkan di sini bahwa ShikhaChauhan
Negara-negara Asia Tenggara termasuk
et al. melaporkan sintesis konjugat 4-
Indonesia, India, Meksiko, Haiti, Amerika
aminoquinoline
pyrimidine
Tengah,
aminoquinoline
dan
endemik
dan
kematian
malaria,
antara
negara-negara
Afrika
(RahadiHutomo et al. 2005 : 1).
dimana
gugus
4-
pirimidin
dihubungkan melalui cincin aromatik, dan
Terapi golongan 4-aminoquinoline
beberapa senyawa ini telah menunjukkan
tetap menjadi garis depan obat pilihan
aktivitas moderat (Sunny Manohar et al.
untuk memerangi malaria bahkan setelah
2012: 3). Sunny Manohar, dkk (2012) juga
beberapa dekade upaya pengembangan
telah melakukan studi SAR (Structure
obat. Keberhasilan farmakofor antimalaria
Activity Relationship) senyawa-senyawa
ini didasarkan pada kemanjurannya sangat
turunan 4-aminoquinolin pirimidin tersebut
baik
terhadap aktivitasnya sebagai inhibitor
secara
administrasi,
klinis, toksisitas
kemudahan rendah,
dan
Plasmodium
falciparum
sintesis murah (Sunny Manohar et al.
afinitas
2012:
berbasis
sangat baik melalui radiometric assays
berbagai
sehingga
1).
pirimidin
Senyawa-senyawa terkenal
dengan
pengikatan
berdasarkan
reseptornya
dihasilkan
aktivitas
aktivitas biologisnya seperti fungisida,
transkripsional
herbisida,
anti-inflamasi,
Plasmodium f. berupa IC50 hasil evaluasi
antimalaria
secara in vitro yaitu HepG2 cell reporter
antitumor,
analgesik, dan
aktivitas
JF FIK UINAM Vol.3 No.4 2015
antagonis
yang
(inhibisi)
177
Gene assays terhadap satu seri senyawa
pirimidin dari penelitian Sunny Manohar et
turunan 4-aminoquinolin pirimidin.
al (2012). Data ini disajikan pada Tabel 1.
Pada penelitian ini akan dilakukan studi
HKSA
docking
molekuler,
penelusuran farmakofor, virtual screening, uji toksisitas, dan profil farmakokinetik terhadap
senyawa
aminoquinolin Kuantitatif
turunan
pirimidin.
4-
Tabel 0-1. Data aktivitas inhibisi (IC50) senyawa turunan 4-aminoquinolin pirimidin terhadap Plasmodiun falciparum (Sunny
Manohar,
et
al,
2012:
2)
Hubungan
Struktur-Aktivitas
(HKSA),
dalam artian yang paling sederhana, adalah metode untuk membangun model komputasi atau matematika yang mencoba untuk menemukan korelasi yang signifikan secara statistik antara struktur dan fungsi menggunakan
teknik
chemometric
(Jitender Verma, 2010). Docking molekuler adalah penggunaan komputerisasi dalam memasangkan suatu molekul kecil pada reseptor (bagian ini sering didefinisikan sebagai sisi aktif dari enzim) melalui representasi
yang
dihasilkan
komputerisasi, yang diikuti oleh evaluasi struktur molekul dalam hal ini yaitu bentuk
Instrumen
dan karakteristiknya seperti parameter
penelitian ini adalah perangkat keras
elektrostatik (Gao, 2007; Abraham, 2003;
berupa
Nadendla, 2004). Searching farmakofor
(notebook) dengan spesifikasi : Processor
secara hipotetik digambarkan sebagai
Intel® Pentium® Dual Core T4300 @ 2.1
pharmacophore query, yaitu seperangkat
GHz 2.1 GHz, RAM 2,00 GB dan harddisk
fitur query yang biasanya dibuat dari titik
160 GB, yang memiliki perangkat lunak
anotasi ligan.
berupa sistem operasi Windows™ 8.1,
satu
Hyperchem®
METODOLOGI
yang
digunakan
buah
release
dalam
komputer
8.0,
jinjing
Molecular
Operating Environment (MOE) release
Bahan dan Alat
2009.10 dan SPSS 17.0 for Windows.
Pada penelitian ini digunakan base struktur molekul dan aktivitas inhibitor (IC50) hasil eksperimen secara in vitro dari 20
senyawa
turunan
4-aminoquinolin
JF FIK UINAM Vol.3 No.4 2015
178
Prosedur Kerja
Pada docking molekuler setelah
Hubungan Kuantitatif Struktur-Aktivitas Studi
HKSA
diawali
dengan
ligan dalam bentuk struktur tiga dimensi dioptimasi
dengan
metode
Ab
initio,
pemodelan struktur senyawa turunan 4-
struktur diprotonasi dengan Protonasi 3D.
aminoquinolin-pirimidin
menggunakan
Selanjutnya protein diunduh dari situs
program HyperChem. Selanjutnya struktur
RSCB.PDB dengan kode 1G50 dan 3ERT.
senyawa dioptimasi menggunakan metode
Molekul air kemudian dihapus dari struktur.
Ab initio dengan parameter basis set small.
Protein
Senyawa
menggunakan
langkah yang sama pada preparasi ligan.
metode Ab initio dengan parameter basis
Setelah itu dilakukan simulasi docking.
set small.
Posisi docking terbaik dipilih berdasarkan
dioptimasi
kemudian
diprotonasi
dengan
nilai rmsd (≤ 2) dan nilai scoring terendah. Penelusuran Farmakofor Penentuan
Sidik
Jari
Interaksi
Ligan Protein (Protein-Ligand Interaction Fingerprint/PLIF): Sidik jari interaksi protein Gambar 1. Struktur dasar 4-aminoquinolin pirimidin
dengan ligan dibuat dengan menggunakan struktur-struktur
protein reseptor
yang
kalkulasi
diunduh dari situs RCSB PDB. Seluruh
deskriptor menggunakan program MOE.
struktur kemudian dibuka pada Jendela
Deskriptor yang dihitung adalah AM1_E,
MOE dan disejajarkan sehingga rantai
AM1_Eele,
AM1_LUMO,
memiliki struktur yang sama yang akan
AM1_dipole, AM1_HF, log P (o/w), log S,
bergerak bersama-sama sebagai satu unit.
glob, ASA_H, ASA_P, mr, vol, vdw_vol dan
Dengan cara ini kompleks protein-ligan
VSA. Selanjutnya dilakukan perhitungan
dapat disejajarkan. File kemudian disimpan
statistik.
sebagai database.
Setelah
itu
dilakukan
AM1_HOMO,
Semua
variabel
dianalisis
menggunakan regresi multilinear metode
Searching fitur farmakofor : Skema anotasi
backward. Selanjutnya model-model yang
farmakofor
terpilih divalidasi silang dengan metode
pharmacophore, sehingga pada Jendela
Leave One Out. Persamaan HKSA yang
MOE akan terlihat fitur-fitur farmakofor
terpilih adalah persamaan dengan nilai
yang terdapat pada senyawa penuntun.
kriteria statistik terbaik dan memenuhi
Kemudian
kriteria validasi yaitu q2 ≥ 0.5 dan memiliki
search, dan perbaikan query. Setelah itu
jumlah signifikansi tinggi pada analisis
penyelarasan
korelasi pearson.
senyawa dalam database konformasi.
otomatis
dijalankan
membuat
query
pharmacophore
(alignment)
senyawa-
Docking Molekuler JF FIK UINAM Vol.3 No.4 2015
179
Virtual skrining: dengan mendownload
untuk
terlebih dahulu beberapa ribu senyawa dari
membangun
zinc12 database. Senyawa-senyawa yang
menggunakan metode in siliko.
telah
didownload
kemudian
memprediksi
data
sifat
ADME
sifat
dan
drug-like
disimpan HASIL DAN PEMBAHASAN
sebagai database.
Hubungan Kuantitatif Struktur-Aktivitas Studi bioavailabilitas
Dari
Senyawa yang memiliki kelarutan dan
permeabilitas
yang
buruk
sepuluh
kombinasi
tiga
deskriptor yang digunakan, persamaan
dapat
yang dipilih berdasarkan kriteria-kriteria
diprediksi menggunakan rule of 5 lipinski.
statistik yaitu adalah persamaan pertama
Pada rule of 5 lipinski menyatakan bahwa
(Tabel 2) yaitu, log 1/IC50 = 5.3757 +
absorbsi dan permeasi yang kurang baik
(0.7514 AM1_HOMO) + (-0.3100 log P
ketika suatu senyawa memiliki lebih dari
(o/w))
lima donor ikatan hidrogen (ditunjukkan
multilinier terbaik yang berisi tiga deskriptor
dengan jumlah OH dan NH), berat molekul
ini
+
(0.0065
menghasilkan
vdw_vol).
korelasi
Regresi
yang
baik
lebih dari 500, Log P lebih dari 5 (atau
dengan hasil eksperimen (r = 0.9282) dan
MLogP lebih dari 4.15), terdapat lebih dari
validasi silang LOO q20.9282.
2
10 akseptor ikatan H (ditunjukkan oleh jumlah N dan O).
Tabel 0-2. Kombinasi deskriptor dengan nilai kriteria statistik, validasi Leave One
Uji toksisitas Prediksi
ini
dilakukan
dengan
Out (q2), dan jumlah signifikansi pearson
menginput file struktur dalam bentuk *mol. Selanjutnya memilih metode penentuan kriteria toksisitas pada senyawa. Estimasi dilakukan untuk melihat penentuan kriteria toksisitas suatu senyawa berdasarkan toxtre. Sebelum melakukan estimasi maka dipilih
verbose
explanation
untuk
menentukan tingkatan dan detail dari hasil yang
didapatkan.
digunakan
juga
Selain admetSAR
Toxtree, untuk
mengetahui nilai toksisitas.
aktivitas dipengaruhi
Studi farmakokinetik Prediksi
ini
Dari model persamaan yang terpilih,
dilakukan
dengan
bantuan dari situs preadmet.bmdrc.org
senyawa oleh
turunan
OBHS
deskriptor-deskriptor
yaitu AM1_HOMO, log P (o/w), dan vdw_vol, yang artinya dapat diusulkan
yang merupakan aplikasi berbasis web JF FIK UINAM Vol.3 No.4 2015
180
untuk meningkatkan aktivitas senyawa
Tabel 3. perbandingan aktivitas IC50
turunan 4-aminoquinolin pirimidin.
eksperimen dan aktivitas IC50 prediksi
Docking Molekuler Tabel 4 menunjukkan bahwa senyawa turunan 4-aminoquinolin pirimidin dapat mengikat Trp41, Phe111, Asp214 dan Asp34 pada protein kode 2IGX. Dari percobaan yang dilakukan diperoleh hasil dimana senyawa 13 memiliki interaksi dengan ligan protein 2IGX yang kuat dibandingkan
senyawa
lain
dengan
docking score (S) -129.7491. Kecocokan interaksi dari senyawa dan ligan protein dapat dilihat pada interaksi ligan protein 2IGX dimana jika hasil dari docking senyawa memiliki interaksi yang sama dengan interaksi ligan protein 2IGX maka dapat
diperkirakan
senyawa
tersebut
memiliki efek yang sesuai berdasarkan kecocokan pengikatan asam amino.
Gambar 2. Kurva hubungan aktivitas IC50 eksperimen dan aktivitas IC50 prediksi model persamaan terbaik
JF FIK UINAM Vol.3 No.4 2015
181
Tabel 4. Hasil docking senyawa turunan 4aminoquinolin pirimidin dengan protein 2IGX
Gambar 3. Validasi Ligan asli 2IGX
Gambar 4. Interaksi senyawa 13 terhadap protein 2IGX Penelusuran Farmakofor Terdapat
28
struktur
protein
Plasmepsin yang telah dilaporkan dan dapat di download dari situs RCSB PDB (www.rscb.org), tetapi hanya 8 struktur kompleks plasmepsin yang mengikat ligan yaitu dengan kode 1LEE, 1LF2, 1LF3, 1WH6, 2ANL, 2BJU, 2IGX dan 2IGY. Terlihat bahwa Tyr192A (pusat aromatik), Tyr17A (akseptor ikatan hidrogen), Asp214 (akseptor ikatan hidrogen), Asp34 (atom JF FIK UINAM Vol.3 No.4 2015
182
kationik
dan
donor
ikatan
hidrogen)
pharmacophore diperoleh 4 senyawa dan
merupakan asam amino yang penting
2 senyawa dengan angka Lipinski yang
dalam pengikatan antara ligan dan enzim
sama dengan 0, artinya tidak ada satupun
plasmepsin.
aturan Lipinski yang dilanggar dan 2 senyawa tidak mengikuti aturan Lipinski. Dengan demikian 2 senyawa yang sesuai tersebut
diprediksikan
memiliki
bioavailabilitas yang baik sehingga jika dikonsumsi
peroral
dapat
diabsorbsi
dengan baik secara sistemik. Tabel 5. Aturan Lipinski dari 10 senyawa hits terbaik
Gambar 5. Query Farmakofor
Gambar 6. jarak fitur farmakofor dalam query farmakofor
Keterangan: Aturan lipinski: 0 = Tidak ada masalah terdeteksi Gambar 7. sidik jari interaksi ligan-protein
1 = Kemungkinan memiliki absorpsi dan permeasi yang buruk
Studi Bioavailabilitas Dari
28 senyawa
hasil
virtual
screening yang selanjutnya di-docking dan didapatkan hasil docking dengan metode JF FIK UINAM Vol.3 No.4 2015
183
Uji Toksisitas
* Micronucleous assay in rodent
Berdasarkan
toxtree
secara
** The Benigni / Bossa rulebase for
umum, kedua senyawa hits terbaik hasil
mutagenicity and carcinogenicity
virtual screening masuk dalam kelas 3
***Cytochtome
yaitu memiliki risiko toksisitas yang tinggi
metabolism
menurut
- = Baik
aturan
Benigni/Bossa senyawa
Kramer.
Rulebase,
yang
Merurut tidak
bersifat
P450-mediated
drug
√ = Kurang baik
ada
genotoksik
Prediksi Farmakokinetik
karsinogenik. Berdasarkan prediksi Kroes
Berdasarkan
prediksi
TTC, ketiga senyawa memiliki risiko yang
farmakokinetik, 2 senyawa hits hasil virtual
tinggi. Secara umum, 2 senyawa hits
screening
terbaik
hasil
terbaik memiliki persentase
virtual
screening
dapat
penyerapan usus pada manusia berkisar
pada
sitokrom
P450.
antara 70-100% yang menandakan bahwa
Ditinjau dari LD50 pada tikus, berikut
senyawa tersebut dapat diserap dengan
urutan LD50 2 senyawa hits terbaik hasil
baik.
virtual screening dari yang tertinggi hingga
memperlihatkan
yang
sedang pada sel Caco-2. Sel Caco-2
dimetabolisme
terendah
yaitu
ZINC32501354,
ZINC32501366.
Ditinjau
toksisitas
pada
ikan
toksisitas
tertinggi
Sedangkan
seluruh
senyawa
permeabilitas
dari
pLC50
merupakan
dengan
urutan
adenokarsinoma manusia dan memiliki
terendah
berbagai jalur transport obat melalui epitel
hingga
ZINC32501366, ZINC32501354. Ditinjau
turunan
yang
dari
kolon
usus.
dari toksisitas Tetrahymena Pyriformis
Senyawa
ZINC32501354
pIGC50 dari toksisitas tertinggi ke terendah
ZINC32501366
yaitu ZINC32501366, ZINC32501354. Nilai
masing-masing 0.195999 dan 0.254946
dari masing-masing LD50, pLC50, dan
yang berarti kedua senyawa ini memiliki
pIGC50 dapat dilihat pada tabel 6.
absorpsi yang sedang pada sistem saraf
Tabel 6. Hasil prediksi toksisitas dengan menggunakan toxtree dan AdmetSAR
menunjukkan
dan angka
pusat. Senyawa Senyawa ZINC32501354 dan ZINC32501366 menunjukkan persen pengikatan
dibawah
menandakan
bahwa
90% kedua
yang senyawa
tersebut secara kimia terikat lemah pada protein plasma.
Keterangan : JF FIK UINAM Vol.3 No.4 2015
184
Tabel 7. Hasil prediksi farmakokinetik menggunakan PreADMET
2. Senyawa
turunan
Pirirmidin
dapat
4-Aminoquinolin mengikat
Trp41,
Phe111, Asp214 dan Asp34 pada protein 2IGX. Interaksi yang terjadi antara senyawa-senyawa turunan 4Aminoquinolin reseptor
Pirirmidin
ditunjukkan
dengan
dengan
nilai
docking score (S), makin rendah nilai S maka interaksi antara keduanya makin * Blood Brain Barriers, lebih dari 2.0 high
kuat. Dari penelitian yang dilakukan
absorption to CNS, 2.0 ~ 0.1 middle
diperoleh hasil dimana pada protein
absorption to CNS, kurang dari 0.1 low
kode 2IGX senyawa 13 menunjukkan
absorption to CNS
hasil yang lebih baik dengan nilai
** Human Intestinal Absorption, 0-20%
docking score (S) -129.7491.
poorly absorbed compounds, 20 ~ 70%
3. Asam
amino
yang
penting
dalam
moderately absorbed compounds, 70 ~
interaksi reseptor dengan beberapa
100% well absorbed compounds
senyawa inhibitor enzim plasmepsin
*** Plasma Protein Binding, lebih dari 90%
adalah Tyr192A (pusat aromatik), Tyr
chemicals strongly bound, kurang dari 90%
17A (akseptor ikatan hidrogen), Asp214
chemicals weakly bounds
(akseptor ikatan hidrogen), Asp34 (atom
**** Caco-2 cell permeability, kurang dari 4
kationik dan donor ikatan hidrogen)
low
middle
merupakan asam amino yang penting
permeability, lebih dari 70 high permeability
dalam pengikatan antara ligan dan
permeability,
4
~
70
enzim plasmepsin. 4. Hasil virtual screening menggunakan
KESIMPULAN 1.Hubungan kuantitatif struktur-aktivitas senyawa sebagai
turunan inhibitor
Benzimidazole
enzim
pasmepsin
150.000 senyawa natural product dari zinc database menunjukkan senyawa dengan
kode
ZINC32501354
dan
menunjukkan bahwa deskriptor yang
ZINC32501366 merupakan senyawa
berpengaruh
aktivitas
yang terpilih diantara 150.000 senyawa
ditunjukkan
dilihat dari sisi kecocokan pada query
dengan persamaan HKSA terbaik: log
farmakofor, docking dengan metode
1/IC50
farmakofor,
senyawa
terhadap
sebagaimana
=
5.3757
+
(0.7514
prediksi
bioavailabilitas
AM1_HOMO) + (-0.3100 log P (o/w)) +
menggunakan rule of 5 Lipinski, dan
(0.0065 vdw_vol).
prediksi ADME/T.
JF FIK UINAM Vol.3 No.4 2015
185
KEPUSTAKAAN Abraham DJ, Burger’s Medicinal Chemistry and Drug Discovery. 6th ed. Volume 1.. New York Willey Interscience. h. 289. 2003. Gao H, Nishida J, Saito S dan Kawabata J. Inhibitory Effect of 5,6,7Trihydroxyflavones on Tyrosinase. Molecules. h. 12, 90. 2007. Jitender Verma, Vijay M. Khedkar, Evans C. Coutinho. 3D-QSAR in Drug Design - A Review. Medicinal Chemistry. 10: h. 95-115. 2010. Lukman Hakim. Malaria: Epidemiologi dan Diagnosis. Aspirator Vol. 3 No. 2 Tahun. 107-116. 2011. Nadendla RR. Molecular Modelling : A powerfull Tool for Drug Design and Molecular Docking. J. Resonance. 9(5). h. 51-60. 2004. Rahadi Hutomo, Sutarno, Wien Winarno, Kusmardi. 2005. Uji Antimalaria Ekstrak Buah Morinda citrifolia dan Aktivitas Makrofag pada Mencit (Mus musculus) setelah Diinfeksi Plasmodium berghei. Biofarmasi. (2): 61-69. 2005. Shikha S. Chauhan, Moni Sharma, Prem M. S. Chauhan. Trioxaquines: hybrid molecules for the treatment of malaria. Drug News & Perspective, 23(10). 632-646. 2010. Sunny
Manohar, U. Chinna Rajesh, Shabana I. Khan, Babu L. Tekwani, Diwan S. Rawat. Novel 4Aminoquinoline-Pyrimidine Based Hybrids with Improved in Vitro and in Vivo Antimalarial Activity. Medicinal Chemistry. 3: 555-559. 2012
JF FIK UINAM Vol.3 No.4 2015
186
