Čtvrtletník č. 1/4 , 2015
Novinky a zajímavosti z LaboratořE AGEL a.s.
Nově zavedená laboratorní vyšetření - STR.2 Klíště jako vektor infekčních onemocnění - STR.3 Věděli jste, že: - STR.5
1. číslo, ročník 2015, DUBEN
2 str.
Vážené kolegyně a kolegové, po delší době si Vás opět dovolujeme oslovit s aktuálními informacemi z našich laboratoří. Připravili jsme pro Vás čtvrtletník, jehož název LABAG je inspirován naším profesním zaměřením - laboratoř slengově „labák“ a obchodní jméno naší společnosti „Laboratoře AGEL a.s.“. Prostřednictvím tohoto čtvrtletníku se Vás budeme snažit informovat zejména o novinkách a trendech v laboratorní medicíně, o námi poskytovaných službách a možnostech zlepšení spolupráce. Na konci roku 2014 jsme rozšířili síť našich laboratoří o nově vybudovaný provoz klinické mikrobiologie v Ostravě Vítkovicích, s přímou návazností na plně funkční ATB centrum. Tento provoz, stejně jako celá naše laboratoř, v březnu úspěšně obhájili zavedený systém kvality dle ČSN EN ISO 15189:2013. Udržení této akreditace Vám garantuje rychlé, spolehlivé a vysoce kvalitní výsledky. A právě z výše uvedených důvodu jsme se rozhodli věnovat první číslo klinické mikrobiologii a ATB centru. Rádi bychom přivítali Vaše připomínky, náměty a poznámky, které můžete zasílat na emailovou adresu člena redakční rady - Ing. Arpáda Bódaye (
[email protected]). Budeme na ně pravidelně reagovat. Věříme, že se Vám náš čtvrtletník bude líbit a že Vám bude v naší další spolupráci užitečný. Ing. Luděk Cibulka, MBA Předseda představenstva
SEmináře a konference - registrace a dotazy:
[email protected] Breberkologie - vybrané přednášky mikrobiologických laboratoří LAG KDY: 26.5.2015 / KDE: Laboratoře AGEL a.s., Revoluční 2214/35, Nový Jičín XX. Rožnovské gastroenterologické dny 2015 / konference Věnovaná problematice onemocnění zažívacího traktu z pohledu lékařů a sester KDY: 5. – 6.6.2015 od 9. hodin / KDE: Hotel Eroplán, Rožnov pod Radhoštěm Bronchoskopie a bronchoalveolární laváž: využití pro klinickou a laboratorní diagnostiku MUDr. Ondrejka Gustáv, RNDr. Ondrejková Andrea KDY: 23.6.2015 / KDE: Laboratoře AGEL a.s., Revoluční 2214/35, Nový Jičín Laboratoře AGEL a.s. v roce 2015 KDY: 17.9.2015 / KDE: Beskydské divadlo Nový Jičín Meziregionální sklíčkový seminář KDY: 16.10.2015 od 13.30 hodin / KDE: Žerotínský zámek Nový Jičín, trámový sál Autoimunní onemocnění: etiologie, klinická a laboratorní diagnostika MUDr. Lasota Zenon, Mgr. Krišáková Vladimíra, kol. Laboratoře Imunologie a serologie, kol. Laboratoře lékařské genetiky KDY: 20.10.2015 / KDE: Laboratoře AGEL a.s., Revoluční 2214/35, Nový Jičín Ischemické choroby: etiologie, klinická a laboratorní diagnostika, sledování léčby, prognostika MUDr. Brejcha Martin PhD, Mgr. Kneiflová Michaela, Mgr. Vaníčková Pavla, Ing. Bóday Arpád, kol. Biochemické laboratoře KDY: 24.11.2015 / KDE: Laboratoře AGEL a.s., Revoluční 2214/35, Nový Jičín Hospodská a nehospodská filozofie o genetice: historie oboru, co je jisté a co ne, geny a prostředí Mgr. Váhala Dalibor a kol. Laboratoře lékařské genetiky KDY: 15.12.2015 / KDE: Laboratoře AGEL a.s., Revoluční 2214/35, Nový Jičín
Nově zavedená laboratorní vyšetření Laboratoř klinické biochemie, Úsek instrumentálních metod Vedoucí: Mgr. Barbora Sokolová, Ph.D. tel.: 556 416 249, 556 416 171 mobil: 606 776 290 e-mail:
[email protected] 1. Vigabatrin, Gabapentin, Zonisamid, Lacosamid (biologický materiál k vyšetření: sérum) • antiepileptika • na žádost lékařů • stanovení hladin u pacientů léčených výše zmíněnými léky (periodická kontrola, non-compliance, intoxikace) 2. Methotrexát (biologický materiál k vyšetření: sérum) • cytostatikum, imunosupresivum • na žádost lékařů • stanovení hladin u pacientů léčených výše zmíněnými léky (periodická kontrola, non-compliance, intoxikace)
3. Doxazosin, Irbesartan (biologický materiál k vyšetření: sérum) • antihypertensiva • na žádost lékařů • stanovení hladin u pacientů léčených výše zmíněnými léky (periodická kontrola, non-compliance, intoxikace) 4. Ethylglukuronid (biologický materiál k vyšetření: moč) • marker abuzu ethanolu • stanovení této látky potvrdí či vyloučí požití ethanolu v posledních cca 4 dnech Laboratoř klinické imunologie a alergologie Vedoucí: RNDr. Andrea Ondrejková tel.: 556 416 242 mobil: 725 408 874 e-mail:
[email protected] 1. Specifické IgE proti alergenovým komponentám (biologický materiál k vyšetření: sérum) • inhalační alergeny, potravinové alergeny, latex • na žádost lékařů
1. číslo, ročník 2015, DUBEN
3 str.
Laboratoř lékařské genetiky, Úsek molekulární biologie Vedoucí: RNDr. Radmila Richterová tel.: 556 416 230 - 4 mobil: 724 235 582 e-mail:
[email protected] 1. Vyšetření genu Med12 (biologický materiál k vyšetření: nesrážlivá krev) • lokalizace na chromozomu X (Xq13.1) • Lujan-Fryns syndrom (Marfanoidní habitus s opožděným psychomotorickým vývojem), Ohdo syndrom (X-vázaný), Opitz-Kaveggia syndrom • na žádost klinického genetika • možnost post- i prenatální diagnostiky
2. Vyšetření genu SHOX (biologický materiál k vyšetření: nesrážlivá krev) • lokalizace na chromozomu X (Xp22.33 (pseudoauto zomální oblast chromozomu X) • idiopatická nízká postava postihující obě pohlaví, Leri-Weill dyschondrosteóza, Langer mesomelická dysplázie • na žádost klinického genetika • možnost post- i prenatální diagnostiky
ANTIBIOTICKÁ STŘEDISKA LABORATOŘE AGEL a.s. Antibiotická centra jsou nedílnou součástí nadstandardně vybavených laboratoří klinické mikrobiologie, které se na stanovení diagnózy podílí kultivačními, sérologickými, molekulárně biologickými, mikroskopickými a dalšími moderními vyšetřovacími postupy. Provázanost konzultací s předchozím vyšetřením v našich laboratořích je nezbytná. • • • • •
Poskytují odborné konzultace a konzilia k racionální terapii antibiotiky s písemným záznamem do zdravotnické dokumentace Poskytují interpretace laboratorních výsledků Provádí schvalování vázaných antibiotik k terapii a v perioperační profylaxi Provádí monitoring rezistencí k antibiotikům Spolupracují s ústavními hygieniky a epidemiology
Univerzální telefonní číslo - budete přesměrováni na službu konajícího lékaře/ konzultanta: 606 600 366. Pracoviště
Konzultace, schvalování ATB RNDr. Eva Chmelařová
LAG, a.s. Ostrava, Vítkovice
MUDr. Alena Lautnerová MUDr. Eva Kostřicová
LAG, a.s. Nový Jičín
MUDr. Marie Dovalová
LAG, a.s. Šternberk
MUDr. Hana Dojčárová
Kontakt 800 200 230 595 633 262/263 602 757 709 800 200 230 595 633 262/ 263 724 803 076 800 200 230 595 633 262/ 263 725 438 555 800 700 701 556 416 238 - 241 602 727 704 800 112 210 585 014 112 725 997 233
Konzultační hodiny
Pondělí až pátek: 7:00-18:00 Víkend, svátky: 9:00-18:00 Pondělí až pátek: 11:00 – 15:00 Víkend, svátky: 9:00– 18:00 Pondělí až pátek: 11:00 – 15:00 Víkend, svátky: 9:00– 18:00
Klíště jako vektor infekčních onemocnění Váhala Dalibor / Laboratoř klinické mikrobiologie, Laboratoře AGEL a.s., Ostrava Vítkovice Setkání s klíštětem vzbuzuje u člověka vždy určitou nervozitu. Není divu, neboť klíště a jemu příbuzné organizmy jsou přenašeči mnoha klinicky a veterinárně významných patogenů virového, bakteriálního i protozoárního původu. Výskyt klíštěte Biotopem klíštěte obecného jsou lesy, především listnaté a smíšené, ideálně se silně zastoupeným křovinným a bylinným patrem. V Evropě i v ČR je nejrozšířenějším a epidemiologicky nejvýznamnějším zástupcem čeledi klíště obecné (Ixodes ricinus). Klíšťová onemocnění figurují celosvětově na prvním místě mezi tzv. antropo-zoonózami. Klíště obecné je nejvýznamnějším přenašečem patogenů v Evropě. Odhaduje se, že u nás je borréliemi promořeno až 20 %, virem klíšťové encefalitidy 1 % a ehrlichiemi až 10 % klíšťové populace. Mezi vzácnější klíšťová onemocnění dále řadíme tularémii, Q-horečku, bartonellózu a babeziózu (viz. Tab. 1).
1. číslo, ročník 2015, DUBEN
4 str.
Klíšťáci, klíšťata a jejich patogeny Řád klíšťata (Ixodida) patří mezi parazitující roztoče (Acaria) z kmene pavoukovců (Arachnida). Řád reprezentují dvě čeledi příbuzných organizmů, a to klíšťatovití (Ixodidae) a klíšťákovití (Argasidae). Klíšťata i klíšťáky řadíme mezi hematofágní ektoparazity. Čeleď klíšťatovitých (Ixodidae) zahrnuje asi 650 druhů cizopasníků známých běžně jako klíšťata. Morfologie a životní cyklus klíštěte Tělo dospělého klíštěte je dorzoventrálně zploštělé. Skládá se z hlavové části a vlastního těla (Obr. 1). Hřbetní stranu těla klíštěte kryje pevný chitinový štít kutikulárního původu. Pokrývá téměř celého samce, u samice však kryje pouze třetinu těla, tak aby neznemožňoval nabývání složeného kožovitého vaku během sání krve. K pohybu klíštěti slouží 4 páry končetin vybavené přísavkami. Klíšťata postrádají zrakové orgány. Nejvýznamnějším smyslovým ústrojím klíštěte je Hallerův orgán, který obsahuje receptory čichu umožňující především detekci CO2, amoniaku a vzdušné vlhkosti, a umožňuje tedy úspěšné vyhledání hostitele. Larvy dýchají celým povrchem těla, dospělci vzdušnicemi, jejichž průduchy jsou umístěny za 4. párem končetin. Vývody pohlavních orgánů jsou umístěny na břišní straně těla. Obr.1: Dospělé klíště - samička Dospělé klíště - samička. Tělo se skládá z hlavové části a vlastního těla. Dospělé klíště má čtyři páry nohou. Z hlavové části prominuje dopředu tzv. hypostom, orgán pokrytý četnými nazpět směřujícími háčky sloužícími k vlastnímu průniku kůží a k fixaci klíštěte v ráně. Po stranách hypostomu jsou párové ostré chelicery umožňující proříznutí kůže hostitele. V klidovém stavu je hypostom kryt přilehlými makadly, které se při průniku do kůže odklánějí do stran. Klíště během sání do rány vylučuje látky bránící srážení krve a analgetika. Velikost dospělých samic se pohybuje od 3,5 do 4,5 mm. Plně nasátá samice může svou velikost zvětšit až na 10 mm.
Životní cyklus klíštěte zahrnuje 3 stádia (larvu, nymfu a dospělce) a střídání parazitické, svlékací a rozmnožovací fáze (Obr. 2). Obr. 2: Vývojový cyklus klíštěte - vajíčko - larva - nymfa - dospělec Vývoj v dospělce je přímý a jeho délka může kolísat mezi jedním až šesti lety v závislosti na klimatických podmínkách a přítomnosti potenciálních hostitelů. Přechod z nižšího do vyššího stádia je vždy podmíněn sáním hostitelské krve (parazitická fáze), každé vývojové stádium však saje odlišnou dobu. Klíšťata jsou gonochoristé. Larvy klíšťat se rodí z oplozených vajíček, jež samice nakladla do půdy či vegetace. Larvy jsou anatomicky podobné dospělci, avšak jsou drobnější (0,8 mm), světlejší a mají pouze 3 páry končetin. Po vylíhnutí osidlují bylinné patro a travní porost, kde čekají na prvního hostitele. Zde plní funkci prvního hostitele nejčastěji drobní hlodavci, mohou však sát i člověka. Po absolvování prvního sání, jenž trvá obvykle 3-5 dní, se larva pouští, svléká se a mění se v osminohou nymfu. Nymfa číhá v podrostu na dalšího hostitele. Po druhém sání trvajícím 4-7 dní a následným opětovným svlékáním, se mění v pohlavně dospělého jedince zvaného imago. Klíště je generalista a doposud byl prokázán jeho parazitizmus u tří set druhů obratlovců včetně člověka.
larva nymfa
vajíčka dospělec
Pozor! Klíště je velice odolné a přežívá i teploty hluboko pod bodem mrazu. Aktivita přezimujících klíšťat nastává okamžitě po stání posledního sněhu a vzrůstu teploty nad 5°C, nejčastěji tedy v březnu. Lymeská borelióza je nejčastějším onemocněním přenášené klíšťaty ve střední Evropě. Incidence v ČR osciluje mezi 40 a 60 případy na 100 000 obyvatel za rok. Jedná se o multiorgánové onemocnění, míra poškození jednotlivých orgánů se však může lišit. Nemoc vděčí za svůj název svému etiologickému agens, skupině gramnegativních spirochét rodu Borrelia burgdorferii sensu lato a americkému městu Lyme, ve kterém se v roce 1976 vyskytla epidemie artritidy v následku přisátí klíštěte. V první fázi nemoci se borrélie vniknuvší do těla pomnoží v pokožce následkem čehož se zpravidla během prvního týdne (nejpozději do měsíce) od napadení klíštěte na kůži u zhruba 50 % pacientů vytváří erythema migrans (EM). Souběžně s EM se mohou objevit i nespecifické příznaky jako jsou bolesti hlavy, svalů a kloubů, únava, nechutenství, zvýšená teplota a záněty mízních uzlin. V další fázi (disseminované stádium) borrélie pronikají cévním endotelem a krevním řečištěm či lymfatickým systémem a rozšiřují se dále po těle. Během jednoho až dvou měsíců osidlují nejčastěji centrální a periferní nervový systém, klouby, myokard, kosterní svaly a sekundárně kůži. Ke kožním projevům náleží borréliový lymfocytom. Tato fáze onemocnění je typická vzrůstem protilátek, zprvu třídy IgM poté IgG. V pozdním stádiu nemoci se mohou kožní projevy stupňovat do symptomu acrodermatitis chronica atrophicans, jež postihuje obličej, trup i končetiny postiženého. Až 10-40 % pacientů se symptomem EM postihuje v pozdním stádiu onemocnění Tab. 1: Klíšťaty přenášená onemocnění neuroborrelióza a lymeská artritida.
1. číslo, ročník 2015, DUBEN
5 str.
Obr. 3: Borrelia burgdorferii patří do kmenu Spirochety. Mikroorganizmus byl identifikován v roce 1981 americkým vědcem Wilhelmem Burgdorferem. V současnosti je známo 19 druhů borrélií. Hovoříme-li tedy o Borrelii burgdorferii sensu lato (tedy z lat. „v širším smyslu“), máme na mysli celou skupinu podobných mikrobů, zatímco Borrelií burgdorferii sensu stricto (tedy z lat. „v užším smyslu“) označujeme původní prvotní nález. Borrelie burgdorferii s.l. jsou gramnegativní spirálovité bakterie dosahující délky 4-30 µm a šířky kolem 2 µm. Pohybují se rotací, případně smršťováním a natahováním, k čemuž jim pomáhají i na obou koncích těla přítomné bičíky. Jsou schopny prostupovat lidskou kůží, epitely, překonají i hemoencefalickou bariéru. Rychlostí svého pohybu rovněž unikají imunitnímu systému hostitele, jehož fagocyty se pohybují zlomkovou rychlostí. Imunitnímu systému unikají borrélie i prostřednictvím dalších mechanizmů. Především neustále mění své povrchové antigeny (outer surface proteins A-F). Dále inaktivují komplement a také zasahují do regulačních funkcí imunitního systému. Ačkoliv je borrélie původně extracelulární patogen, je schopna pronikat do fibroblastů, endoteliálních buněk, lymfocytů, neuroglií, a dalších buněk svého hostitele a v nich dále přežívat. Za nepříznivých podmínek, např. působením antibiotik či imunitního systému hostitele, vytváří bezbičíkaté nepravidelné kulovité formy podobné cystám, ze kterých se může opět proměnit v plně metabolicky aktivní buňku. Obrázek převzat z: http://en.wikipedia.org/wiki/ File: Borrelia_burgdorferi_(CDC-PHIL_-6631)_lores.jpg
Klíšťová encefalitida je infekční onemocnění virového původu postihující mozek a mozkové blány. Virus klíšťové encefalitidy patří mezi flaviviry. Je přenášen obvykle klíšťaty, méně často komáry. Popisuje se i alimentární cesta nákazy požitím nedostatečně tepelně zpracovaného mléka. Nemoc se vyvíjí obvykle po uplynutí 7-10 až 14 dnů od přisátí infikovaného klíštěte. Má dvě formy. První forma se podobá virovému onemocnění dýchacích cest. Druhá forma je závažná, postihuje CNS a má dvě fáze. První fáze je netypická, objevují se příznaky chřipky po nichž přichází období (asi 4 - 10 dnů) bez příznaků. Druhou fázi doprovází vysoká horečka a příznaky vztahující se k CNS. Tato fáze může mít čtyři formy: 1) postiženy jsou mozkové blány, 2) dochází k postižení mozkové kůry, 3) postižená je mozková kůra a přední rohy míšní, 4) dochází k postižení center v prodloužené míše.
VĚDĚLI JSTE, ŽE: • • • • • • • • • • • •
Svůj odborný název klíště obecné (Ixodes ricinus) získalo na základě podobnosti s plodem ricinovníku neboli skočce obecného (Ricinus communis), jehož semena nasáté samice klíštěte nápadně připomínají. Klíštětem se při odstraňování nemusí točit, neboť jeho ústní ústrojí je symetrické. Doporučuje se jej přímo vytáhnout kývavými pohyby. Rovněž klíště nezakapávejte olejem či mýdlem. Klíště se poté dusí, vypouští sliny a může vyvrhnout obsah trávící dutiny, čímž se zvyšuje riziko přenosu choroby. Místo okolo před vyjmutím a po vyjmutí pouze dezinfikujte nejlépe jodovým roztokem. Přenos borrélie z infikovaného klíštěte na člověka není automatický. Borrelie prodlévá především v trávicím traktu klíštěte a přesun do krevního řečiště člověka může trvat několik hodin. Včasné odstranění klíštěte (nejlépe do 6 hodin) výrazně zmenšuje pravděpodobnost infikace a naopak nesprávné odstraňování klíštěte napomáhá přenosu, neboť tělního vaku klíštěte napomáháme přesunu obsahu jeho trávicího traktu do svého těla. Odstraněné klíště je schopné dalšího života. Chcete-li klíště po odstranění spolehlivě usmrtit, ponořte jej na pár minut do dezinfekčního prostředku a poté spláchněte do záchodové mísy. Klíště nerozmačkávejte, nepalte ani nevyhazujte do odpadkového koše. Klíště se v minusových teplotách dostává do tzv. kryptobiotického stavu, kdy zmrzne a je takto schopno přetrvat po dlouhou dobu, ale po návratu do normální teploty je opětovně schopno života. Ne vše co na sobě najdeme je klíště obecné, vzácně narazíme na pijáka lužního (Dermacentor reticulatus) či klíšťáka holubího (Argas reflexus), jenž vzácně parazitují na člověku. Larvu klíštěte od dospělce poznáme podle počtu párů končetin. Zatímco larva má tři páry, nymfa a dospělec čtyři. Počáteční příznaky boreliózy i dalších onemocnění přenášených klíšťaty mohou připomínat chřipku. Často se tak onemocnění nepřikládá význam a nechá se zajít do těžce léčitelného stádia. Věnujte proto zvýšenou pozornost prohlídce vlastního těla a to především diskrétnějších míst, která se často opomíjí (podkolenní jamky, třísla, podpaží, genitálie, oblasti za ušima a ve vlasech). Proti viru klíšťové encefalitidy existuje účinné očkování, na které je možné získat příspěvek. Informujte se u své pojišťovny. Naši čtyřnozí miláčci jsou také ohrožení borreliózou a lze je chránit očkováním. Ideálním stanovištěm klíštěte jsou rozhraní mezi jednotlivými krajinnými celky, jako jsou okraje lesa, luk, ploty zahrad, atd. V těchto tzv. ekotonálních pásmech se daří rovněž jedlým houbám, čímž se houbaři vystavují zvýšenému riziku. Vědcům z Jihočeské univerzity, Parazitologického ústavu Biologického centra AV ČR v. v. i., ve spolupráci s University of Arizona se podařilo odhalit dosud neznámy mechanismus, kterým se klíšťata chrání před otravou železem, které přijímají ve velkém množství s nasátou krví. Ochranu má v těle klíštěte na starosti jimi objevena bílkovina feritin 2. Když vědci vyblokovali v organismu klíštěte gen pro klíštěcí feritin 2, došlo u nich k závažnému narušení příjmu potravy. Tento objev, jehož výsledky jsou kryty patentem, otevírá cestu k vývoji vakcíny proti klíšťatům.
1. číslo, ročník 2015, DUBEN
6 str.
Laboratorní diagnostika Lymeské borreliózy a lymeské neuroborreliózy Mgr. Hana Bílková Fránková / Laboratoř klinické mikrobiologie, Laboratoře AGEL a.s., Ostrava Vítkovice Ing. Arpád Bóday / OVV, Laboratoře AGEL a.s. Komplex Borrelia burgdorferi sensu lato zahrnuje celou řadu druhů mikroaerofilních Gram negativní spirochét (B.afzelii, B.garinii, B.burgdorferi sensu stricto, B.valasiana, B.lusitaniae, B.spielmanii, B.andersonii, B.californiensis, B.japonica, B.carolinensis, B.americana…), které jsou původci klíšťaty nejčastěji přenášeného multisystémového onemocnění – lymeské borreliózy. Za spirálovitý tvar borrélií velikosti 10 – 30 x 0,2 µm jsou odpovědny bičíky, které jsou ukotveny v bazálních discích. V nepříznivých podmínkách mohou být bičíky, včetně antigenních epitopů odvrženy. Lymeskou borreliózu mohou přenášet jak larvy, nymfy i dospělé samičky, přenos borrélií se zde děje transovariálně. Pokud dojde k prostupu borrélií, nemusí však ještě nutně znamenat, že dojde k rozvoji infekce. Může ale dojít k rozvoji některé z časných forem onemocnění, u menšího procenta pacientů dochází k rozvoji chronické infekce, která může navazovat jak na časné projevy nemoci, nebo se může rozvinout i při absenci časných stádií. Stádium časné lokalizované je charakterizované vznikem erythema migrans, stádium časné diseminované pak mnohočetnými migrujícími erytémy, borréliovým lymfocytomem, akutní neuroborreliózou, lymeskou artritidou a lymeskou karditidou. U stádia pozdního diseminovaného vzniká acrodermatitis chronica atrophicans, pozdní neuroborelióza či pozdní artritida. Základními laboratorními metodami pro potvrzení či vyloučení diagnózy lymeskou artritidou jsou stále nepřímé metody průkazu = průkazem přítomnosti specifických IgM a IgG protilátek proti spirochétám komplexu Borrelia burgdorferi sensu lato (Borrelia afzelii, Borrelia garinii, Borrelia burgdorferi sensu stricto). Prvním vyhledávacím testem je ELISA test, kde výsledky vydáváme ve formě Indexu Pozitivity (semikvantitativní hodnota). Druhým testem je kvalitativní test - Imunoblot (Western Blot - WB, Blot Line - LB), kdy jsou odečítány reakce na úrovni vysoce specifických antigenů, které jsou naneseny na nitrocelulózovou membránu dle jejich hmotnosti v kDa. Hodnotíme intenzitu reakcí, počet reakcí a jejich kombinace. Tento test slouží jako potvrzovací v případě pozitivních či hraničních nálezů v ELISA reakci, často je však vhodný ve velmi časné fázi onemocnění, nebo u nejasných výsledků. Pro diagnostiku používáme jak rekombinantní tak i druhově specifické imunobloty (Obr. 1). Obr.1: Ukázka jednotlivých typů imunoblotů V klinicky zcela jasných případech jako je erythema migrans či borreliový lymfocytom není laboratorní testování podmínkou pro zahájení terapie. Naopak u nejasného klinického obrazu je vhodné vyloučit i při pozitivitě těchto testů jiné možné nákazy. Známá je zkřížená reaktivita např. u infekční mononukleózy, lues apod. Protilátky lze, zejména v tř. IgG, prokázat i řadu let po nákaze i úspěšné terapii. Jejich přítomnost tedy nemusí ještě nutně znamenat selhání terapie. Zároveň je publikováno, že téměř 10% zcela zdravých osob má protilátky.
Polymerázová řetězová reakce (PCR) je dnes běžně používanou metodou v mikrobiologii. Umožňuje přímou detekci původce Lymeské borreliózy prostřednictvím jeho dědičného materiálu. PCR je schopna amplifikovat (namnožit) vybraný, specifický úsek DNA Borrelia burgdorferi na několik desítek milionů kopii a tak zviditelnit jeho přítomnost. Jedná se o velmi citlivou metodu, ale úspěšnost záchytu borrelií závisí na stadiu onemocnění a na použití vyšetřeného materiálu (Obr. 2). Použití polymerázové řetězové reakce je doporučené v prvních čtyřech týdnech po bodnutí klíštětem, kdy hladiny protilátek mohou být ještě nízké (Obr. 2). Ideálním biologickým materiálem pro PCR je bioptický vzorek z erythema migrans (z okrajové části), kde úspěšnost záchytu se pohybuje mezi 50 - 70%. Na vyšetření z krve nebo z moče se názory odborníků z hlediska záchytu rozcházejí. Nízká senzitivita (10-18%) je dána nízkým počtem cirkulující Borrelia burgdorferi DNA v krvi nebo moče pacienta. Je nutno zmínit, že původce borreliózy lze vyšetřit přímo z klíštěte (senzitivita se blíží k 100%). Tuto analýzu neplatí zdravotní pojišťovny, ale některé laboratoře v ČR provádí toto vyšetření pro samoplátce (včetně naší laboratoře). Zjištěná pozitivita však ještě vůbec nemusí znamenat, že k prostupu borrélií a následnému onemocnění vůbec dojde. Ideálním postupem je následné serologické vyšetření (tento postup platí i v případě PCR negativity). V pozdějším stadiu onemocnění využití se PCR omezuje pro testování synoviální tekutiny (se senzitivitou 76-100%). Vyšetřování mozkomíšního moku nepřináší prozatím uspokojivé výsledky (senzitivita je 25-38%).
1. číslo, ročník 2015, DUBEN
7 str.
Obr. 2: Schematické znázornění hladin antigenu (Ag) a protilátek (IgM a IgG) a možností laboratorní diagnostiky Borrelia burgdorferi. Mezi základní laboratorní metody pro diagnostiku časné i chronické neuroborreliózy patří dle mezinárodního doporučení (www.eucalb.com) průkaz intratekální syntézy specifických protilátek. Pouhé stanovení koncentrace imunoglobulinů v mozkomíšním moku je totiž nedostačující, neodlišíme tak intratekální a krevní původ imunoglobulinů. Pro provedení reakce je nutné souběžně odebrat mozkomíšní mok (nejlépe 2. Zkumavku - mok nesmí být kontaminovaný krví) a srážlivou venózní krev. Z hodnot celkových IgG a IgM, koncentrace albuminu v krevním séru a v mozkomíšním moku a koncentrace specifických IgG a IgM vypočítáme tzv. „Antibody Index“ (hodnota protilátkového indexu dle Reibera), který vyjadřuje poměr koncentrace specifických protilátek v likvoru a v séru ve vztahu ke stavu hematolikvorové bariéry a koncentraci celkových imunoglobulinů v likvoru a v séru. * viz. článek: „Metody buněčné imunologie v diagnostice Lymeské borreliózy“ Obrázek převzat http://www.lymenet.de/terms.htm a upraven
Metody buněčné imunologie v diagnostice Lymeské borreliózy Špačková I., Ondrejková A. / Laboratoř klinické imunologie a alergologie, Laboratoře AGEL a.s., Nový Jičín Chlebková J. / Kožní oddělení, Nemocnice Nový Jičín a.s. Metoda ELISPOT v diagnostice Lymeské borreliózy Nepřímá laboratorní diagnostika Lymeské borreliózy (LB) je v současnosti založena na klasických sérologických metodách. Metodami enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) a Western blot (WB) se detekují hladiny specifických IgM a IgG protilátek proti bakteriím komplexu Borrelia burgdorferi sensu lato. Laboratoř klinické imunologie a alergologie rozšířila toto spektrum laboratorních metod diagnostiky LB o metodu enzyme-linked immunospot assay (ELISPOT). LymeSpot (GenID® GmbH, SRN) test je založen na specifické buněčné odpovědi, kdy pomocí specifických antigenů dochází ke stimulaci Th1 lymfocytů s následnou produkcí cytokinu IFN γ. Výsledkem je odečet antigen specifických efektorových Th1 lymfocytů produkující IFN γ ve formě spotů (Obr. 1). Pozitivní výsledek LymeSpot testu spolu s anamnestickými a klinickými údaji pacienta může indikovat infekci LB. Jedná se o užitečnou techniku pro sledování průběhu nemoci. Laboratoř klinické imunologie a alergologie porovnávala korelaci současných výsledků LymeSpot testu s výsledky metod ELISA a WB. Soubor tvořilo 64 pacientů. Pozitivní výsledky LymeSpot testu byly zjištěny u 16 pacientů (25%), hraniční hodnoty byly zjištěny v 5 případech (7,8%) a negativní výsledky LymeSpot testu byly detekovány v 43 případech (Tab. 1). Ve skupině 16 pacientů s pozitivním LymeSpot testem, byla naměřena vyšší hladina IgM protilátek u 5 pacientů. Vyšší hladiny obou protilátek IgM a IgG byly detekovány u 4 pacientů a zvýšená hladina IgG protilátek byla naměřena u 5 pacientů. Ve dvou případech nebyla pozitivita protilátek zjištěna. Tito pacienti měli klinické projevy LB a následně byli léčeni antibiotiky. Ze 43 pacientů (67,2%) s negativním LymeSpot testem koreloval tento nález pouze u 19 pacientů (séronegativní nález anebo obraz prodělané LB). U 24 pacientů s negativním LymeSpot testem jsme zaznamenali sérologický obraz počínající resp. probíhající LB. Jednalo se o pacienty bez jasných klinických známek aktivní LB, s dlouhodobou pozitivitou specifických IgM protilátek anebo o pacienty po antibiotické terapii. Obrázek 1: Princip metody ELISPOT - Zdroj: úprava dle fa Oxford Immunotec
Tabulka 2: Kazuistika - Laboratorní hodnoty
Tabulka 1: Srovnání výsledků metod ELISA a WB s LymeSpot ELISA & WB
LYMESPOT
Datum
ELISA
WB
IgM
IgG
IgM
IgG
LymeSpot
NEGATIVNÍ
HRANIČNÍ
POZITIVNÍ
IgM+ IgG+
6
0
4
11/2013
Pozitivní
Negativní
Pozitivní (OspC, p41+)
Negativní
-
IgM+ IgG-
18
2
5
01/2014
Pozitivní
Negativní
Negativní
IgM- IgG+
14
3
5
Pozitivní (OspC, p41+/-)
Pozitivní (02/2014) 24 spotů
IgM- IgG-
5
0
2
04/2014
Pozitivní
Negativní
Pozitivní (OspC, p41+/-)
Negativní
Hraniční 11 spotů
Počet
43
5
16
09/2014
Pozitivní
Negativní
Pozitivní (OspC, p41+/-)
Negativní
Negativní 6 spotů
1. číslo, ročník 2015, DUBEN
8 str.
Kazuistika (Tab. 2 a Obr. 2) - 11/2013 laboratorně zjištěna sérologická pozitivita specifických IgM Ab (Tab. 2), do medikace nasazen amoxicillin/ kyselina klavulanová (1g/12hod) po dobu 3 týdnů. - Kontrolní odběr 01/2014 nárůst specifických IgM Ab oproti 11/2013. Proveden LymeSpot test k potvrzení aktivity infekce LB - 02/2014 do medikace nasazen doxycyklin (100mg/12hod) po dobu 3 týdnů. - 04/2014 kontrolní sérologie specifických Ab IgM, IgG a LymeSpot testu (Ag Borrelia lyzát: 11 spotů-hraniční) - nález by mohl svědčit pro doznívající fázi LB. Subjektivní potíže pacientky vymizely. - 09/2014 LymeSpot test již zcela negativní. Obrázek 2: Kazuistika - Mikroskopický odečet LymeSpot testu Z praxe vyplývá, že pozitivní protilátky proti borreliím nacházíme kromě aktivní nebo prodělané LB nespecificky i v řadě zkřížených reakcí anebo při polyklonální aktivaci imunitního systému. Zatímco tvorba specifických protilátek u probíhající LB nemusí odpovídat klasickému sérologickému obrazu od iniciální tvorby IgM až po sérokonverzi na IgG v konečné fázi infekce. Naše zkušenosti ukazují, že výsledky LymeSpot testu lépe korelují s klinickým obrazem i aktivitou LB a zároveň mohou být efektivním markerem úspěšnosti antibiotické terapie (viz kazuistika).
Exprese CD57+ NK buněk u Lymeské borreliózy CD57 je oligosacharid s molekulovou hmotností 110kDa. Vyskytuje se na povrchu NK buněk, T lymfocytů a nervových buněk. Povrchový marker CD57 NK buněk je snižován expresí cytokinu IFN γ produkující Th1 lymfocyty, interleukinem-2 (IL-2) a tumor nekrotizujícím faktorem α (TNFα). U pacientů s chronickou lymeskou borreliózou (LB) (definována jako onemocnění vyskytující se déle než 3 měsíce po infekci) byla prokázána zvýšená produkce Th1 lymfocytů. Tento nález odpovídá nejen dlouhodobé infekci LB, ale také sníženému počtu CD57+ NK buněk. Referenční mez CD57+ NK buněk byla určena na hodnotu > 60 buněk/μl. Stricker s Wingerem zjišťovali hodnoty CD57+ NK buněk u skupiny pacientů s chronickou LB. Pacienti před zahájením antibiotické terapie měli výrazně snížený počet CD57+ NK buněk, zatímco pacienti po ukončené antibiotické terapii měli zastoupení CD57+ NK buněk v normě. U pacientů s neurologickými příznaky zaznamenali výrazně nižší hladiny než u pacientů s postižením pohybového aparátu. Další srovnávání hodnot CD57+ NK buněk u pacientů s chronickou LB a zdravými dobrovolníky provedla Marques. Její zjištění však neposkytuje žádnou shodu se Strickem a Wingerem. Výsledkem jejího srovnávání je nález, že počty NK buněk se nikterak neliší mezi pacienty s chronickou LB a zdravými dobrovolníky. Dle současných dostupných údajů vyplývá, že vyšetření CD57+ NK buněk vzbuzuje spíše rozpaky, než důležitý diagnostický údaj, jak se prvně předpokládalo, což potvrzuje i německá směrnice pro Diagnózu a léčbu Lymeské borreliózy. I přese všechny rozporuplné názory na důležitost tohoto vyšetření, poskytuje naše Laboratoř klinické imunologie a alergologie toto vyšetření svým klientům.
LABORATOŘE AGEL a.s. Revoluční 2214/35 741 01 Nový Jičín Tel: +420 556 416 164 E-mail:
[email protected] Web: laboratore.agel.cz
Redakční rada: Ing. Arpád Bóday RNDr. Lenka Kulíšková Ing. Petra Ćmielová
