OPVK CZ.1.07/2.2.00/28.0184
Základy ADME a toxického hodnocení léčiv v preklinickém vývoji OCH/ADME LS 2012/2013
Metabolismus léčiv Indukční potenciál látek a interakce s nukleárními receptory PharmDr.Lucie Stejskalová, Ph.D. Mgr. Alice Rulcová 13.3.2013
Metabolismus léčiv Indukční potenciál látek a interakce s nukleárními receptory
Metabolismus (biotransformace) • metabolismus + exkrece = eliminace • eliminace: je proces, při kterém se odstraňuje aktivní forma léčiva z organismu – eliminace pentobarbitalu (epileptické záchvaty, předoperační sedace) bez metabolismu by trvala 100 let
• exkrece = vyloučení léčiva z organismu (nejčastěji TRANSPORTÉRY podílí se na exkreci močí a žlučí) • metabolismus (biotransformace) = chemická přeměna molekuly léčiva na více hydrofilní a snáze eliminovatelné z těla
• eliminace – lze popsat následujícími farmakokinetickýmu parametry – Systémová clearance (Cl, objem/čas) = objem plasmy, který se ireverzibilně očistí od dané látky za jednotku času • vyjadřuje lépe účinnost vylučování léčiva z organismu než biologický poločas
– Eliminační poločas (t1/2, čas) = čas potřebný ke snížení koncentrace látky v plasmě na polovinu
Biotransformační aktivita v orgánech Orgán
Relativní aktivita (%)
Játra
100 %
Plíce
20 - 30 %
Ledviny
8%
GIT
6%
Placenta
5%
Presystémová eliminace • First-pass efekt: efekt prvního průchodu játry – látka je před vstupem do systémové cirkulace částečně metabolizována v játrech
Metabolismus • Při metabolické konverzi léčiva v organismu dochází k chemické změně molekuly, která může vyústit v přeměnu léčiva na látku s
– výrazně ↓ farmakologickou aktivitou – přibližně stejnou farmakologickou aktivitou – výrazně potencovanou aktivitou (PROLÉČIVO), kdy je látka podáná v neaktivní formě a k projevení účinku musí být nejdříve metabolizována (prontosil na sulfanilamid) – (neaktivní látka se mění na látku toxickou – prokarcinogeny)
Metabolismus • dělí se na dvě fáze: – 1. fáze tzv. nesyntetická - zahrnuje oxidaci, redukci, hydrolýzu – 2. fázi tzv. syntetickou - kam patří konjugace
I. fáze metabolismus • dochází k zavedené polární funkční skupiny do molekuly (např. OH, NH2, COOH) • reakce 1. fáze jsou ve většině případech katalyzovány monooxygenázovým systémem cytochromu P450 – oxidační reakce (hydroxylace, N-dealkylace, Noxidace) – redukční reakce – hydrolytické reakce
I. fáze - oxidační reakce • zavedení hydroxylové skupiny do molekuly léčiva • lokalizovány výhradně v endoplasmatickém retikulu • Mezi oxidační biotransformace řadíme – hydroxylace – N-oxidace – O-deaminace – O-dealkylace – oxidace alifatických alkoholů
• metabolismus endogenních látek – transfer vodíku, enzymy mají vysokou substrátovou specifitu • metabolismus xenobiotik–inserce O2 do substrátu, enzymy mají nízkou substrátovou specifitu (→ umožňuje řadu lékových interakcí) • přenos je katalyzován monooxygenázovým systémem cytochromu P450 (nebo také mixed function oxidase system – MFO)
Cytochrom P450 • hladké ER • Jaterní MFO je složen z: – flavoproteinu (NADPH cytochrom P-450 reduktáza) – hemoproteinu (cytochrom P-450) – lipidová složka (phosphatidylcholin) • Dva atomy kyslíku – jeden do substrátu, druhý redukován na vodu
Cytochrom P450
• CYP1-3 metabolizace xenobiotika • CYP4-27 syntéza endogenních molekul
Podíl enzymů I. a II. fáze biotransformace na metabolismu léčiv
Rodina CYP1 Podrodina CYP1A • isoformy CYP1A1, CYP1A2 – podíl na biotransformaci xenobiotik • inducibilita CYP1A1 a CYP1A2 může korelovat se zvýšenou incidencí onkologických onemocnění (aktivace prokarcinogenů, kontaminantů životního prostředí) • substráty: kofein, paracetamol, omeprazol • indukce: heterocyklické aminy, dioxiny (TCDD), PAH (3MC, β-naftoflavon), PCB, • grilované maso, cigaretový kouř, znečištěné ovzduší, některé druhy zeleniny (květák, brokolice)
Podrodina CYP1A – indukce exprese přes AhR receptor – vzhledem k toxickému účinku CYP1A je jeho indukce nežádoucí (důsledek - výrazné snížení účinků léčiv, které jsou metabolizovány CYP1A u kuřáků, z důvodů jejich rychlejšího metabolismu) • CYP1A1: extrahepatální tkáně (plíce, mozek, GIT, srdce, lymfocyty, placenta), • CYP1A2: primárně exprimovaný v játrech
Podrodina CYP1B • odpovědný za metabolismus endogenních estrogenů. • aktivaci heterocyklických aminů, • kůže, mozek, srdce, plíce, placenta, játra
Rodina CYP2 • nejrozmanitější a nejpočetnější rodina • mnoho podrodin, mezi nejdůležitější patří: • CYP2A, CYP2B, CYP2C, CYP2D, CYP2E
Podrodina CYP2A • Tři základní formy: CYP2A6, CYP2A7, CYP2A13 • CYP2A6: převážně v játrech, biotransformace mnoha karcinogenů (aflatoxin B1, Nnitrosodietylamin)
Podrodina CYP2C • u člověka 4 isoformy: CYP2C8, 2C9, 2C18, 2C19 • významné pouze deaktivačním účinkem, zatím nebyl nalezen žádný substrát, který by byl isoformami metabolizován na toxičtější produkty • CYP2C8: biotransformační procesy xenobiotik se nejeví jako velmi důležité, substráty: kyselina retinová a taxol.
Podrodina CYP2C • CYP2C9: důležitý pro metabolismus léčiv (warfarin, nesteroidní antiflogistika), je polymorfní a klinickým projevem může být krvácení po aplikaci warfarinu nebo zvýšená toxicita fenytoinu (antiepileptikum) – – – –
inhibice vede ke zpomalení metabolismu léčiv (warfarin) exprese je regulována PXR a CAR induktory: barbituráty, rifampicin výrazná stereoselektivita, stereospecifita
Podrodina CYP2D • U člověka nejvíce diskutovaná forma CYP2D6 • CYP2D6: druhý nejvýznamnější enzym, zejména játra, mozek (velké koncentrace jsou popisovány u alkoholiků), plíce, GIT (hladké endoplazmatické retikulum) • v plodu je aktivita nízká a až po narození se zvyšuje • je hlavním biotransformačním enzymem řady významných léčiv, karcinogenů, prokarcinogenů
CYP2D6 • forma CYP2D6 není inducibilní, ale některé léčiva mohou zvýšit její aktivitu • není znám mechanismus regulace exprese • závažná interindividuální variabilita v aktivitě způsobená výskytem mutací vedoucích k modulaci jeho aktivity (nejvýraznější polymorfismus) • další isoformy: CYP2D7, CYP2D8
Podrodina CYP2E • U člověka definovaná jen jedna forma z této podrodiny • CYP2E1: – – – – – – – – –
játra, plíce, GIT (hladké endoplazmatické retikulum) součást systému podílejícím se na odbourávání etanolu biotransformace i jiných xenobiotik: malé, neutrální hydrofilní zjištěna i významná reduktásová aktivita a jeho aktivita je doprovázena tvorbou radikálů aktivace karcinogenů: nitrosaminy indukce dvojím způsobem: zvýšením exprese a stabilizací proteinu indukce: substráty (etanol), hladovění inhibice: česnek, cibule, brukvovité Chronické užívání etanolu vede k indukce
CYP3A4 • nejvýznamnější isoforma z hlediska metabolismu • játra, střevo, menší množství ledviny, placenta, plíce, mozek (hladké endoplazmatické retikulum) • metabolismus až 50% léčiv • substráty: různá struktura (nízká substrátová selektivita) • nebyl popsán polymorfismus, aktivita mezi jedinci je ale variabilní. – příčina: výrazná indukovatelnost i značná citlivost k inhibičnímu působení složek potravy i kontaminantů prostředí
CYP3A4 • exprese regulovaná přes PXR • důsledek indukce a inhibice CYP3A4: interindividuální variabilita • zvýšená či snížená aktivita CYP3A4 je častou příčinou selhání terapie či zvýšeného výskytu nežádoucích účinků • játra plodu a novorozenců exprimují isoformu CYP3A7, krátce po narození přebírají její funkci CYP3A4
Zapojení CYP do endogenního metabolismu Rodina CYP
Funkce
CYP4
ω-oxidace mastných kyselin,, syntéza prostaglandinů a leukotrienů
CYP5
Syntéze tromboxanů
CYP7
7α-hydroxylace cholesterolu
CYP11
11β – hydroxylace steroidů
CYP17
17α- hydroxylace steroidů
CYP19
Aromatizace steroidů
CYP21
21-hydroxylace steroidů
CYP24
Hydroxylace vitaminu D
CYP27
27-hydroxylace cholesterolu
Další typy oxidáz • Flavinové monooxygenázy (FMO) – membránové proteiny, hladké ER – nejvíce exprimované v játrech – monomerní struktura + jedna molekula flavinového koenzymu FAD – 5 isoforem – častý polymorfismus – dosud se nepodařilo nalézt induktora FMO a není známá ani regulace exprese
• Další oxidázy: peroxidázy, alkoholdehydrogenázy, aldehyddehydrogenázy, aldehydoxidázy, xanthinoxidázy, monoaminoxidázy, diaminoxidázy
I. Fáze - reduktivní reakce • • • •
výskyt: ER, cytoplasma, mikroorganismy GITu u člověka má malý význam základními typy jsou azo-,nitro-,keto-redukce (redukční dehalogenace, redukce sulfoxidů, redukce peroxidů, redukce disulfidů,…) • studovány okrajově v porovnání s CYP
I. Fáze - hydrolytické reakce • • • • • •
výskyt mimo ER substráty: estery a amidy ester → alkohol + kyselina amid → amin + kyselina nejvyšší hydrolytickou aktivitu mají játra Esterázy, acetylcholinesterázy, epoxidhydrolázy, …
II. Fáze biotransformace konjugace • konjugační reakce, konjugace reaktivní skupiny s endogenní molekulou: kys.glukuronová, sulfát, glycin, acetát, glutathion • vzniká farmakologicky neaktivní, hydrofilní metabolit • reakce katalyzuji transferázy (cytosolické nebo mikrosomální a vyskytují se v játrech, a v menší míře téměř ve všech orgánech a tkáních)
Typ konjugace
Konjugované sloučeniny
Konjugační činidlo
Konjugace s kyselinou UDP-glukuronovou
Alkoholy, fenoly, thioly, karboxylové kyseliny, aminy
UDP-glukuronová kyselina
Sulfonace
Fenoly, alkoholy, aminy
3´-fosfoadenosin-5´fosfosulfát
Konjugace s glutathionem
Elektrofilni sloučeniny
Glutathion
Konjugace s aminokyselinami
Karboxylové kyseliny
Aminokyseliny
Acetylace
Aminy, hydraziny, hydrazidy
Acetyl-CoA
Metylace
Fenoly, thioly, heterocykly
S-adenosylmethionin
Glukuronidace • nejčastější konjugační reakce • substráty mají ve své molekule: -OH, -NH2, -COOH • glukoronidaci podléhaji sloučeniny obsahujíci nukleofilní heteroatom (O,N,S) – alkoholy, fenoly, karboxylové kyseliny tvořící O-glukuronidy, aminy, amidy tvořící N-glukuronidy a thioly pro tvorbu Sglukuronidů • 9 isoforem • velmi nízká aktivita je u novorozenců
Glukuronidace • enzym:uridindifosfát (UDP) glukuronosyltransferáza • výskyt: játra, ledviny, GIT, plíce, placenta • kofaktor: kyselina glukuronová (tvořena z oxidace UDP-glukózy) • exkrece do žluči → tenké střevo (možnost reabsorbce)
Glukuronidace • aktivita se během života mění • významný polymorfismus • Crigler-Najjar syndrome – úplná deficience jaterní UDPglukuronyltransferázy – žloutenka → kernicterus > smrt • Gilbert syndrome - částečná deficience jaterní UDPglukuronyltransferázy • Kernicterus - ireversibilní poškození CNS • Gray baby - chloramfenikol u novorozenců
Enterohepatální cirkulace • β-glukuronidáza - enzym hydrolyzující glukuronidové konjugáty • nejvíce v jejunu, přítomna i v jiných tkáních • umožňuje enterohepatickou cirkulaci, prodloužení účinku léčiv
Sulfatace (Sulfonace) • druhá nejdůležitější synthetická reakce • enzym: sulfotransferáza (v buněčné cytoplasmě) • kofaktor: (donor sulfátu) 3-fosfoadenosin-5-fosfosulfát (PAPS) • koncentrace PAPS je nízká - limitující faktor pro rychlost sulfonace • saturabilní (na rozdíl od GC) → následkem deplece PAPS • podléhají hlavně alkoholy, aminy, fenoly (obs. OH, NH2)
N-acetylace • enzym:N-acetyltransferáza • kofaktor: acetyl-CoA • výskyt: v cytoplazmě mnoha tkání (játra, GIT, ledviny, plíce) • polymorfismus: rychlí a pomalí acetylátoři izoniazidu • aromatické aminy, hydraziny
Metylace • • • • • •
méně častá reakce enzym: metyltransferáza výskyt:v cytoplasmě nebo ER mnoha orgánů kofaktor: (donormetylu) S-adenosylmethionin různé typy metyl transferáz → různé metabolity jediná reakce kdy dochází ke zvýšení lipofility sloučenin
Konjugace s glutathionem • aromatické sloučeniny (naftalen) jsou vylučovány ve formě derivátů N-acetylcysteinu–kyselina merkapturonová. • důležitá pro detoxifikaci polutantů životního prostředí a chemických karcinogenů • kofaktor: tripeptid glutathion • substráty: epoxidy, alkyl a arylhalogenidy, .. • enzym: glutathiontransferáza
Konjugace s aminokyselinami • nejčastější je glycin (taurine,glutamine) • konjugace mnoha strukturně odlišných kyselin (aspirin) • enzym: vlastní konjugace s aminokyselinami: Nacyltransferáza
Faktory ovlivňující metabolismus • • • • • • • •
Věk Pohlaví Farmakogenetické aspekty Intestinální mikroflóra Potrava Patologické stavy Současné podání více léčiv Mezidruhové rozdíly
Věk • novorozenci mají výrazně nižší aktivitu než dospělí jedinci • ve stáří opět aktivita pozvolna klesá. • snížený jaterní průtok krve u starších jedinců → snížení jaterní biotransformace
Pohlaví • androgeny - stimulující efekt • převážně u experimentálních zvířat (kastrace, sexuální dospívání) nevýznamné u lidí. • Vliv dalších hormonů: kortikosteroidy, tyroxin, insulin → aktivace metabolismu xenobiotik
Farmakogenetické aspekty • N-acetyltransferáza: N-acetylace -rychlí a pomalí acetylátoři isoniazidu (Skandinávci x Asiaté) • pseudocholinesteráza –sukcinylcholin • SNP různých izoforem P450 (CYP2D6, 2C19 …)
Mezidruhové rozdíly • Rozdíly v: – rychlosti metabolismu – produkovaných metabolitech – poměru produkovaných metabolitů
Nemoci
• Nemoci jater: hepatitidy (virové, lékové), rakovina, cirhóza (alkoholová, biliární), hemochromatóza, intoxikace hepatotoxickými látkami → pokles aktivity P450, snížení konjugační přeměny, snížení jaterní eliminace → (některá léčiva - velmi silná farmakologická odpověď organismu) • Nemoci srdce: snížená perfúze jater → nižší metabolismus léčiv závislých na průtoku • Endokrinní poruchy: viz pohlavní a ostatní hormony
Intestinální mikroflóra • přítomnost reduktáz → biotransformace řady xenobiotik (azo-, nitro-redukce) • β-glukuronidáza: štěpení glukuronidů → enterohepatická cirkulace
Současné podávání více léčiv • interakce léčiv: vzájemné působení mezi dvěma nebo více farmaky • Léky s častými interakcemi mají některou z následujících vlastností: – vysoká vazba na bílkoviny – tyto léky lehce vytěsní jiné, u kterých se tak zvýší volná frakce – stimulace metabolismu jiných léků indukcí mikrosomálních enzymů (cytochrom P450) – inhibice metabolismu jiných léků – ovlivnění renální clearance (diuretika, probenecid, aminoglykosidová antibiotika, látky ovlivňující pH v moči)
– léky u kterých malá změna v dávce vyvolá relativně velkou změnu účinku (warfarin) – léky s malým terapeutickým indexem – léky, u kterých je terapeutická hladina jen o málo nižší než toxická hladina (antikoagulancia, antikonvulzíva, antihypertenzíva, digoxin, cytostatika a imunosupresíva)
Potrava • nízký obsah tuků, proteinů, nadbytek sacharidů, nedostatek některých vitaminů, grapefruitová šťáva → inhibice biotransformace • grilované maso a uzené sýry, zelenina → indukce biotransformace • akutní konzumace alkoholu →působí jako inhibitor • chronická konzumace alkoholu → působí jako induktor
Inhibice CYP450 = pokles rychlosti biotransformace jednoho léčiva v důsledku vazby jiného, současně podaného léčiva na stejný enzym • Kompetitivní inhibice: kompetice o stejné aktivní místo enzymu • Nekompetitivní inhibice: vazba na jiné místo enzym, konformační změny, znemožnění vazby substrátu do aktivního místa • vyšší koncentrace mateřské látky a nízké koncentrace metabolitu, zpomalená eliminace léčiva → prodloužení biologického poločasu
Indukce P450 • zrychlený metabolismus induktoru i současně podaných léčiv → lékové interakce • induktoři – léčivo - fenobarbital, fenytoin, rifampin – další - alkohol,cigaretový kouř, zelenina, grilované maso
• Reversibilní děj!!
Mechanismus enzymové indukce • regulace exprese daného genu (transkripční faktory, receptory) – – – –
MECHANISMUS AKTIVACE TRANSKRIPCE vazba indukujícího léčiva na tzv. nukleární receptor komplex receptor + induktor je transportován do jádra vazba na specifický úsek (response element) regulační sekvence genu (promotor) – zvýšení transkripce daného genu (indukce).
• zvýšená transkripce → de novo syntéza enzymu • Post-transkripční mechanismy → mRNA/protein stabilizace
Mechanismy enzymové indukce - některé induktory zvyšují aktivitu pouze jediného enzymu (isoformy) - většinou současně zvyšují aktivitu několika enzymů (transportérů) - mechanismus indukce u některých induktorů prozkoumán, u jiných je naznačen - změna aktivity má vliv na metabolismus endogenních a exogenních láte - modulací je pozměněna: intenzita, doba trváni účinku léčiva (změna plazmatických hladin)
Mechanismus enzymové indukce • strukturní geny → proteiny • regulační geny → molekuly regulující expresi dalších genů
Indukce • regulace na několika úrovních: zprostředkovaná transkripčními faktory a nukleárními receptory, epigenetickaá regulace, regulace na úrovni stabilizace/degradace mRNA, regulace na úrovni degradace proteinu proteosomu • nejdůležitějším mechanismem genové regulace enzymu, transportéru je transkripční regulace prostřednictvím nukleárních receptorů
Nukleární receptory • proteiny regulace – – – –
navázání ligandu v cytoplasmě (často xenobiotikum) aktivace transkripční kaskády vazba na cílový gen v jádře často fenomem autoindukce
• transkripční regulace genové exprese enzymu hlavně prostřenictvím receptoru – – – –
arylhydrokarbonového receptoru AHR pregnanového X receptoru PXR konstitutivního androstanového receptoru CAR glukokortikoidniho receptoru GR.
AhR receptor • nejedná se o jaderný receptor !! • člen rodiny PAS proteinů (obsahující PAS doménu) • PAS: považovány ze proteiny podílející se na regulaci odpovědi organismu na rychlé změny v okolním prostředí • tři domény (bHLH=basic helix/loop/helix, PAS, TAD=transaktivační doména)
AhR receptor • transkripční faktor aktivován specifickými ligandy • regulace exprese cílových genů • neaktivní forma - v cytoplasmě v komplexu s Hsp90, XAP2, p23 • vazba ligandu - translokace do jádra, uvolnění Hsp90 a XAP2. • dimerizace s ARNT. Dohromady vazby na cílové regulační oblasti genu (XREs/DREs) • XREs/DREs = xenobiotické/dioxinove responzivní elementy
AhR receptor • ligandy AhR: – toxické látky antropogenního původu (PCB,TCDD, PAH) – látky přírodního původu (flavony) – látky vznikající přímo v organismu obratlovců (tryptofan, kyselina arachidonová, bilirubin)
• regulované geny: CYP1, UGT, GST, chinonreduktasy • regulace genů podílejících se na zásadních buněčných procesech (buněčná proliferace, diferenciace, apoptóza, mezibuněčná komunikace)
AhR Receptor
AhR receptor
PXR a CAR receptory • nukleární „orphan“ receptory: • CAR (konstitutivní androstanový rec.) – pro CYP2fenobarbital • PXR/SXR (steroidní xenobiotický rec.) – pro CYP3Arifampicin • nukleární receptory jsou aktivovány xenobiotiky → heterodimer s Retinoid X Receptor (RXR) → vazba na XRE → zvýšená transkripce
PXR a CAR • z rodiny transkripčních faktorů aktivovaných nízkomolekulárními látkami a jsou proto označovány jako nukleární receptory. • spolu s CAR, PXR do této rodiny patří i receptor pro vitamin D (VDR), GR, estrogenní receptor (ER) • PXR a CAR působí jako „senzory“ toxických endogenních metabolitů a exogenních chemických látek
PXR a CAR • PXR a CAR = sirotčí (orphan) nukleární receptory, protože u nich nebyl doposud identifikován fyziologický ligand, který by primárně vyvolal svoji fyziologickou funkci prostřednictvím PXR a CAR • v těle je PXR ve velké míře v játrech, méně v tenkém a tlustém střevě, v žaludku a v ledvinách. • tato lokalizace významně koreluje s expresi CYP3A4 a P-gp.
PXR a CAR • PXR a CAR regulují celou řadu genů pro 1. a 2. fázi biotransformace a transportérů: viz tabulka • k nejdůležitějším patří CYP3A4
Nukleární receptor
PXR
CAR
GR
CYP1A2
CYP2B6
CYP2C9
CYP3A4/5
SULT2A1
UGT1A1, 3, 4
ABCB1
CYP3A7
UGT1A1
CYP2C9,19
CYP3A4
CYP2B6
CYP2A6
ABCB1
CYP2C9
CYP2B6
CYP3A4, 5
ABCB1
PXR
CAR
PXR • aktivace PXR probíhá přímou vazbou ligandu na receptor • následně tvorba dimeru s retinoidním X receptorem-α (RXRα) a společně rozpoznávají specifické sekvence promotorové oblasti DNA regulovaných cílových genů označované jako responzivní element PXR-RE (PXR response element).
PXR • ligandy: látky z různých terapeutických skupin, některé toxiny, endogenní steroidy • díky širokému spektru ligandů, množství regulovaných enzymu a transportérů je PXR považován za jeden z nejdůležitějších faktorů ovlivňujících farmakokinetiku léčiv
PXR receptor
PXR receptor
CAR receptor • kromě genů pro enzymy 1. a 2. fázi a transportéry řídí i transkripci důležitých genů podílejících se na metabolismu endogenních látek (bilirubin, žlučové kyseliny, hormony štítné žlázy, steroidní hormony, mastné kyseliny)
CAR receptor • aktivace CAR dvěma způsoby: – přímou aktivací nukleárního receptoru ligandem – tj. vazbou ligandu na nukleární receptor (modelová látka CITCO) – fenobarbital, fenytoin (nejznámější induktory kooperující s CAR receptorem) aktivují transkripci regulovaných genů prostřednictvím tohoto nukleárního receptoru nepřímo bez vazby na nukleární receptor
CAR receptor • po translokaci komplexu CAR a koaktivátorů do jádra se komplex proteinů CAR a RXRα váže na CAR-RE v promotoru regulovaných genů • transkripční aktivace pak probíhá podobně jako v případě PXR receptoru
CAR receptor
GR receptor • převážně v cytoplasmě v komplexu s Hsp90s a imunofiliny • po navázání ligandu oddělení Hsp90s, translokace do jádra a jako homodimer vazba na GRE responzivní elementy dané DNA • GR ubikvitně ve všech typech buněk • endogenní glukokortikoidy řídí glukózovou homeostázu, metabolismus tuků a proteinů, apoptózu, růst, chování, podílí se na imunitní odpovědi buněk řízením exprese mnoha genů pro cytokiny, chemokiny, transkripční faktory
GR receptor • GR se podílí na transkripční regulaci cytochromů CYP2C9, CYP2B6, CYP3A4 a transportéru Pglykoproteinu. • známý crosstalk nukleárních receptoru: AhR, CAR, PXR a GR – glukokortikoidy reguluji vazbou na GR expresi těchto receptorů a tím modulují odpověď jejich ligandů
GR receptor
Metody studia metabolického profilu látky
Metody studia metabolického profilu látky • • • •
In vivo studie na zvířatech In situ perfundované orgány Jaterní řezy In vitro buněčné modely (izolované hepatocyty – suspenze, primární kultury, imortalizované buněčné linie, stabilně transfekované buněčné linie) • In vitro subcelulární frakce (mikrozomy, S9, cytosol) • In vitro rekombinantní xenobiotika metabolizující enzymy • In silico nástroje
Morfologická stavba jater • Základní morfologická jednotka jater - lalůček centrální žíly (lat. lobulus venae centralis) - šestiboký hranol tvořený hvězdicovitými trámci jaterních buněk uspořádaných kolem centrální žíly ve středu lalůčku • mezi trámci - jaterní sinusoidy – zvláštní typ krevních kapilár • Uprostřed trámců – žlučové kapiláry - prostory mezi hepatocyty, kam je produkována žluč http://cs.wikipedia.org/wiki/Soubor:Hepatic_structure.png
Hepatocyt
Perfundovaná játra • Model nejbližší podmínkám in vivo • Výhody: • Zachovaná trojrozměrná architektura tkáně s mezibuněčnými kontakty • Polarita hepatocytu – apikální, bazální • Tvorba a vylučování žluče (analýza) • Metabolismus, jaterní uptake, biliární sekrece
• Nevýhody: • Obtížná manipulace, náročnost, použitelnost několik hodin • Nedostupné lidské vzorky
http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0002961012002097
Jaterní řezy • komplexní model in vitro • zařízení umožňující nakrájet tkáň na 200-500 um řezy (Krumdieckrův mikrotom) → difuze živin k hepatocytům + zachování lobulární struktury • látkou
de Graaf IA, Preparation and incubation of precision-cut liver and intestinal slices for application in drug metabolism and toxicity studies. Nat Protoc., 2010
Krumdieck Tissue Slicer Model MD4000
Jaterní řezy • Inkubace řezů v pufru nebo buněčném médiu s testovanou látkou • Výhody: – intaktní buňky – Jednoduchá manipulace – Redukce počtu zvířat – Lidské vzorky (biopsie)
Izolace primárních hepatocytů
http://www.cyprotex.com
Izolované hepatocyty • Hepatocyty izolovány z jater (potkan, člověk) – Perfuze jater kolagenázou – Izolované hepatocyty – okamžitá inkubace s testovanou látkou nebo kryoprezervace nebo klutivace primární kultury – intaktní buňky → metabolické reakce fáze I + II
• Nevýhody: ztráta diferenciace hepatocytů na krevní a žlučový pól • Lidské hepatocyty: primární kultury dostupné komerčně, interindividuální variabilita, indukce biotransformačních enzymů léky, potravou
Izolované hepatocyty • Hepatocytární suspenze – Méně nákladné – Kulovitý tvar – Pokles viability, použitelnost několik hodin (lze ovlivnit kultivačním médiem) http://www.cyprotex.com
Primární kultury hepatocytů • Kultivace v monolayeru • Dediferenciace – nutné zachovat mezibuněčné interakce, extracelulární matrix (kolagen) – obnova polarity buňky • Glukokortikoidy (dexametazon) a inzulin – nezbytné pro udržení metabolických funkcí http://www.cyprotex.com
Sendvičové kultivace hepatocytů • Hepatocyty – mezi 2 vrstvy kolagenového gelu → zvýšení mezibuněčných kontaktů • Kultivace až 4 týdny • Buňky - polygonální tvar, tvorba žlučových kanálků • Produkce albuminu, aktivita cytochromu P450
3D kultivace hepatocytů • Matrigel – mezibuněčná hmota z myšího EngelbrethHolm-Swarmova sarkomu • Polarita hepatocytů • Funkční parametry – produkce albuminu, udržení exprese a možnost indukce biotransformačních enzymů A – kolagen B – kolagenový gel C – matrigel
http://www.bdbiosciences.com/cellculture/hepatocytes/index.jsp
Mnohobuněčné sféroidy • Kultivace hepatocytů v porézních systémech – porézní polyuretanová pěna • Shluky buněk o velikosti 100 um • ↑ počet mezibuněčných interakcí – udržení polarity buněk • Tight junctions
http://www.integra-biosciences.com/sites/news_08_10_1.html
Subcelulární frakce • Izolace ze zvířecích nebo lidských jater • Studium metabolismu, predikce metaboického profilu látky, potenciální DDI (drug-drug interactions) • Mikrosomy – high-throughput metabolický screening
Jaterní mikrosomy • Ultracentrifugace 100000 x g • Mikrosomy obsahují biotransformační enzymy – CYP, FMO, UDP-GT – vázané na membránu • Studium metabolismu prostřednictvím CYP • Není buněčná membrána → přímý přístup látky k metabolizujícím enzymům
http://www.cyprotex.com
Rekombinantní enzymy • cDNA specifického xenobiotika metabolizujícího enzymu se rekombinuje s expresním vektorem → transfekce buněčné linie schopné produkce velkých množství humánních enzymů → homogenizace, centrifugace, izolace mikrozomů nebo enzymů • Purifikace • Komerčně dostupné
Rekombinantní enzymy
http://www.bdbiosciences.com
Buněčné modely • Imortalizované buněčné linie • Imortalizace – proces, při němž buňky získají HeLa buněčná linie neomezený proliferační potenciál – „znesmrtelnění“ • Transformace chemická nebo virová • Imortalizovaný fenotyp – nádorové buňky, nádorové buněčné linie • Somatické buňky, primární buněčné kultury – po čase proliferačně inaktivní stádium – senescence (stárnutí)
Henrietta Lacks
Buněčné modely • Schopné exprimovat velká množství specifických enzymů • Možnost kultivace velkého množství • Nemusí exprimovat všechny xenobiotika metabolizující enzymy • HepG2 – buněčná linie odvozená od hepatocelulárního karcinomu
Transfekované buněčné linie
Transfekované buněčné linie • Transfekce – vnesení plazmidové DNA do eukaryotní buňky
www.invitrogen.com
http://www.microscopyu.com/print/articles/livecellimaging/fpintro-print.html
• Ovlivnění genové exprese studovaného proteinu
In vitro metabolismus • Rychle metabolizovaní látka – vícenásobné dávkování za den nebo kontinuální infuze pro dosažení požadované koncentrace v krvi • Pomalu metabolizovaná látka – může mít toxický efekt, pokud zůstává v krvi příliš dlouho • Metabolická stabilita in vitro: Mikrosomální stabilita hepatocytární stabilita, S9 stabilita, metabolická stabilita detekovaná pomocí rekombinantních enzymů • Metabolický profil látky • Lékové interakce - DDI
Lékové interakce • Inhibice a indukce xenobiotika metabolizujících enzymů =˃ ↑ nebo ↓ metabolismu léčiva, pokud podány 2 a více léčiv současně • Inhibice CYP - ↑ plazmatická hladina současně podané látky → toxicita • Indukce CYP - ↓ metabolismus současně podané látky → ↓ terapeutický efekt nebo tvorba toxického metabolitu
Lékové interakce • Identifikace enzymů (P450, UGT) metabolizujících látku pomocí rekombinantních enzymů • Indukce P450 • Inhibice P450 • Aktivace PXR a AhR nukleárních receptorů • UGTa1 inhibice
Identifikace enzymů (P450, UGT) metabolizujících látku • Rekombinantní enzymy • P450 – mohou vykazovat polymorfismy – ovlivnění plasmatických hladin → důležité identifikovat v počátečních stádiích vývoje léku • Identifikace enzymu zodpovědného za metabolismus → identifikace potenciálních lékových interakcí
Indukce P450 • CYP1A1, CYP2B6, CYP3A4 • Rekombinantní enzymy nebo v hepatocytech
http://www.promega.com/~/media/Files/Resources/Prot ocols/Technical%20Bulletins/101/P450%20Glo%20Ass ays%20Protocol.pdf
Inhibice P450 The Vivid® screening assay A. The Vivid® Substrate fluoreskuje po oxidaci P450 enzymem B. Výsledná fluorescence odráží stupeň inhibice P450 aktivity
http://www.invitrogen.com/site/us/en/home/Products-and-Services/Applications/DrugDiscovery/Target-Based-ADME-Tox-Assays/p450-assays/P450-MetabolismAssays.html
In vitro intrinsic clearance • Intrinsic clearance – schopnost enzymů metabolizovat léčivo, nezávislá na fyziologických faktorech jako průtok krve játry nebo vazba na bílkoviny • Mikrosomální stabilita • Asi 60% léčiv metabolizováno P450 • Jaterní mikrosomy – obsahují na membránu vázané metabolizující enzymy • Referenční substrát – kontrola aktivity enzymů
In vitro intrinsic clearance • • • •
S9 stabilita S9 frakce - microsomy a cytosol Enzymy fáze I a fáze II Možnost použití suplementů s kofaktory → metabolické dráhy fáze II
In vitro intrinsic clearance • Hepatocyty – všechny xenobiotika metabolizující enzymy (fáze I, fáze II) obsaženy v intaktní buňce • Profil metabolitů tvořených jak enzymy fáze I, tak fáze II
Aktivace PXR, CAR a AhR • Aktivace nukleárního receptoru → ↑ transkripce genu P450 → Indukce P450 • pregnane X receptor (PXR) → CYP3A4 • aryl hydrocarbon receptor (AhR) → CYP1A1 • constitutive androstane receptor (CAR) → CYP2B6
Gene reporter assay • Široké využití - studium genové exprese, buněčné fyzilogie, receptorové aktivity, transkripčních faktorů, inracelulární signalizace… • Vnesení plazmidové DNA do buňky – Reportérový vektor - promotor studovaného genu (CYP)+ strukturní gen reportéru = luciferáza – Transkripční faktor → nukleární receptor
• Látka indukující expresi studovaného CYPu → ↑transkripce → translace reportérového genu (luciferáza) • + substrát luciferin → chemiluminiscence → detekce http://www.nature.com/
Gene reporter assay
http://www.promega.com/
http://www.promega.com/
High-throughput screening
Děkuji za pozornost
