SZENT ISTVÁN EGYETEM
A KORAI EMBRIÓELHALÁS GENETIKAI OKAINAK VIZSGÁLATA LÚDBAN
Doktori értekezés
LIPTÓI KRISZTINA
Gödöllő 2004
A doktori iskola megnevezése:
Állattenyésztési Doktori Iskola
tudományága:
Mezőgazdaságtudomány
vezetője:
Prof. Horváth László, D.Sc. tanszékvezető egyetemi tanár, az MTA doktora Szent István Egyetem, Gödöllő, Mezőgazdasági- és Környezettudományi Kar, Halgazdálkodási Tanszék
Témavezető:
Dr. Hidas András, Ph.D. a mezőgazdaságtudomány kandidátusa, igazgató, Kisállattenyésztési és Takarmányozási Kutatóintézet, Gödöllő, Baromfitenyésztési és Genetikai Osztály
.................................................................... A programvezető jóváhagyása
.................................................................... A témavezető jóváhagyása
Tartalomjegyzék
i
TARTALOMJEGYZÉK
1. BEVEZETÉS..................................................................................................... 2. IRODALMI ÁTTEKINTÉS.............................................................................. 2.1. A termékenységet és az embrionális elhalást befolyásoló tényezők áttekintése lúdban........................................................................................... 2.2. Madarak korai embrionális fejlődésének sajátosságai............................ 2.2.1. A megtermékenyítéstől a hypoblast kialakulásáig...................... 2.2.2. Az embriogenezis időszaka: az inkubáció első három napja...... 2.2.3. Az embrionális fejlődés faji sajátosságai.................................... 2.3. Az embriológia és a kromoszómavizsgálatok kapcsolata....................... 2.3.1. A madarak genomjának speciális tulajdonságai......................... 2.3.2. Kromoszóma-rendellenességek előfordulása különböző baromfifajok embrióiban, és ezek hatása a korai embrióelhalásra.. 2.4. Korai embrionális rendellenességek fenotípus szerinti csoportosítása... 2.5. Korai embrióelhalást okozó mutációk különféle baromfifajokban........ 2.6. A rendellenes kariotípusok eredete a madárembriókban........................ 2.7. Kromoszóma-rendellenességek előfordulása a baromfifajok kifejlett egyedeinél................................................................................................ 3. ANYAG ÉS MÓDSZER................................................................................... 3.1. A vizsgálatban résztvevő fajták bemutatása......................................... 3.1.1. Fehér lengyel (4-es vonal)......................................................... 3.1.2. Szürke landesi (7-es vonal)....................................................... 3.1.3. Fehér lengyel (4-es vonal) és szürke landesi (7-es vonal) keresztezése (9-es vonal)......................................................... 3.2. Első kísérlet............................................................................................. 3.2. Második kísérlet...................................................................................... 3.4. Harmadik kísérlet.................................................................................... 3.5. Negyedik kísérlet.................................................................................... 3.6. Embriók vizsgálata.................................................................................. 3.7. Kromoszómavizsgálat............................................................................. 3.8. Tojáskezelés, inkubáció.......................................................................... 3.9. Ondóvétel, ondóminősítés, inszeminálás technikája.............................. 3.10. Definíciók............................................................................................. 3.11. Statisztikai analízis................................................................................ 3.12. Ötödik kísérlet..................................................................................... 4. EREDMÉNYEK................................................................................................ 4.1. Első kísérlet........................................................................................... 4.2. Második kísérlet..................................................................................... 4.3. Harmadik kísérlet................................................................................... 4.4. Negyedik kísérlet................................................................................... 4.5. Ötödik kísérlet....................................................................................... 4.6. Megfigyelt tipikus megjelenésű elhalási formák……………………... 4.7. Az embrionális elhalás fenotípusai........................................................ 4.7.1. Embrió nélküli blasztoderma változatai....................................
1. 3. 3. 4. 6. 7. 9. 10. 12. 14. 16. 18. 19. 20. 21. 21. 21. 22. 23. 25. 25. 26. 27. 28. 29. 30. 30. 31. 31. 32. 35. 35. 44. 48. 51. 55. 56. 58. 58.
ii
Tartalomjegyzék
4.7.2. Differenciálatlan embrionális szövet változatai........................ 4.7.3. Rendellenes fejlődésű embrió változatai................................... 4.7.4. Embrionális elhalások az inkubáció 1-5. napján....................... 4.7.5. Ikrek........................................................................................... 4.8. Új tudományos eredmények.................................................................. 5. KÖVETKEZTETÉSEK ÉS JAVASLATOK.................................................... 5.1. Eredmények értékelése és következtetések........................................... 5.1.1. Első kísérlet............................................................................... 5.1.2. Második kísérlet......................................................................... 5.1.3. Harmadik kísérlet....................................................................... 5.1.4. Negyedik kísérlet....................................................................... 5.1.5. Ötödik kísérlet........................................................................... 5.1.6. A kísérletek eredményeinek szintézise……………………….. 5.2. Javaslatok............................................................................................... 6. ÖSSZEFOGLALÁS.......................................................................................... 7. SUMMARY....................................................................................................... 8. IRODALOMJEGYZÉK…… ......................................................................…. 9. SAJÁT PUBLIKÁCIÓK................................................................................. 10. KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS.........................................................................
63. 64. 66. 72. 75. 77. 77. 77. 79. 80. 81. 82. 82. 85. 87. 91. 95. 107. 109.
Bevezetés
1. BEVEZETÉS
A lúd a gyenge szaporaságú baromfifajok közé tartozik. A keltethetőség, amely az egyik legfontosabb tulajdonság a baromfitenyésztésben, 60% körül alakul lúdban, míg ugyanez házityúk esetében 80-90%. A keltethetőség rendkívül komplex értékmérő tulajdonság, mert nagyon sok tényező befolyásolja, így a genetikai háttér, a rokontenyésztés, illetve keresztezés, a tenyészállatok kora és termelésben eltöltött ideje, a tojások minőségi jellemzői (tömeg, alak, héjszilárdság, szennyezettség, stb.), éghajlati tényezők, évszak, a tojásgyűjtés gyakorisága, a tojástárolás időtartama és körülményei, a keltetési technológia, a tenyészállatok takarmányozása, egészségi állapota (Bogenfürst 1992). A lúdfaj szaporasága a termékenységhez hasonló jelentőségű. Örökölhetőségi értéke kicsi, h2 = 0,10-0,2, ennek ellenére a szelekció folyamán nem szabad figyelmen kívül hagyni. A keltethetőséget befolyásoló számtalan tényező közül vizsgálataim a keltetés során, az inkubáció első öt napján bekövetkező korai embrionális elhalások genetikai hátterének tanulmányozására irányultak. Ugyanis az előírásoknak megfelelő tartási és keltetési technológia betartása mellett egy állományon belül fellépő embrionális elhalás genetikai hátterének vizsgálata indokolt. A legtöbb szerző korai és késői embrionális mortalitást különböztet meg, míg néhányan az inkubáció második hetén történő elhalásokat külön kategóriába sorolják (Shook et al. 1971, Jassim et al. 1996). Az embrionális elhalás szakaszai összefüggést mutatnak az embrió anyagcseréjében történő jelentős változásokkal (Jassim et al. 1996). Az első kritikus szakasz a véredényrendszer, a vérkeringés kialakulásával (Bogenfürst 1992), a tejsavtermelés csúcsával (Romanoff 1949), valamint a keletkező CO2 kiválasztás megváltozásával (Landauer 1951) és a mesonephros, az embrionális vese működésének megindulásával (Byerly 1931) esik egybe. A második kritikus szakasz a tüdőlégzésre való áttérés, valamint a kibújás időszaka (Rol’nik 1970, Bogenfürst 1992). A keltetés első hat napján bekövetkező korai embrionális elhalás gyakran genetikai rendellenességekre vezethető vissza, mint az autoszómális, vagy ivarhoz kötött recesszív letális gének jelenléte, a genetikailag hajlamos abnormális meiózisokból származó kromoszómarendellenességek vagy a korai osztódáskor bekövetkező hibák (Somes és Smyth 1967, Zartman és Smith 1975, Savage et al. 1988, Savage et al. 1992). Az embrionális, vagy kromoszómális rendellenességek kialakulására való hajlam öröklődhet (Zartman és Smith 1975, Telloni et al. 1976, Blazak és Fechheimer 1979), az állományban felhalmozódhat (Hidas et al. 1996, Liptói és 1
Bevezetés
Hidas 1998). Beaumont et al. (1997) úgy találták, hogy a korai embrionális mortalitás örökölhetősége magasabb, mint a későbbi fázisban bekövetkező elhalásoké. A korán elhalt baromfi embriók citogenetikai vizsgálata a hatvanas évek végén kezdődött tyúkban (Bloom és Buss 1966, Fechheimer et al. 1970). A rendellenes fenotípusú embriókban haploid, poliploid és aneuploid rendellenességeket találtak (Bloom 1969, Mong et al. 1974). Bizonyított, hogy összefüggés lehet az embrionális és a kromoszómális rendellenességek között a különböző baromfifajokban (Bloom 1970). Az elhalt embriók és a differenciálatlan, embrió nélküli szövetek vizsgálata rámutathat arra, hogy az embrió- veszteség részben a kromoszómális rendellenességeknek tulajdonítható (Fechheimer 1990). A pedigré keltetés során minden embrió szülője ismert. Ezeknek az embrióknak a tanulmányozása alapján kiválaszthatók azok a gunarak és tojók, amelyek nagyobb arányban hoznak létre embrionális és/vagy kromoszómális rendellenességeket (Szalay 1989). Ezek a szülők általában normál feno- és genotípusúak. Munkám célja az volt, hogy megvizsgáljam az inkubáció ötödik napjáig bekövetkező embrionális és kromoszómális rendellenességek előfordulását és variabilitását három lúdvonalban. Megkíséreljem kiválogatni azokat a tojókat és gunarakat, amelyek feltételezhetően felelősek ezen tulajdonságok felhalmozódásáért, valamint tanulmányozzam a kiválasztott állatok szerepét a különféle típusú rendellenességek kialakításában és öröklődésében. Finomítsam, és fotókkal dokumentáljam a korai embrionális rendellenességek fenotípus-kategóriáit. Vizsgálataim során szükségessé vált a megtojás előtti, még a tojócsőben történő embrionális elhalások kimutatási módszerének fejlesztése. Ezeknek a nagyon korai elhalásoknak rendkívül nehéz a meghatározásuk. Sztereomikroszkóp használatával az esetek egy részében kimutathatóak, de a csírakorong propídium jodiddal való festése sokkal megbízhatóbb eredményt ad az embrionális elhalás megállapítására. A citogenetikai és embriológiai vizsgálati módszerek alkalmazása és az embriók vizsgálata, valamint az embrionális elhalás és kromoszómális rendellenességek öröklődésének ismerete ígéretes lehet a lúdfaj szaporasági mutatóinak javításában, mivel nagyon kevés adattal rendelkezünk ebben a vonatkozásban.
2
Irodalmi áttekintés 2. IRODALMI ÁTTEKINTÉS
2.1. A termékenységet és az embrionális elhalást befolyásoló tényezők áttekintése lúdban
A lúd tojástermelésében megőrizte a szezonális jelleget. Magyarországo ez január végétől június közepéig tart, 15-22 hét időtartamig. A tojó a nap 24 órájában bármikor tojhat, napszakos ritmust nem találunk. A tojásrakásban a tojások közötti egy nap szünet dominál, de előfordul, hogy a tojó több napig nem tojik, majd pedig két egymást követő napon is van tojás (Bogenfürst 1992). A lúd monogám természetű állat, ami a pedigré fülkékben, 1:4-es, 1:5-ös ivararányban történő tartás során problémát okozhat (a gúnár egyes tojókat esetleg nem kedvel) (Rouvier 1987). A párzószerv lúd-alkatúakban kifordítható, mintegy 5-10 cm hosszúságú, amely nyugalmi állapotban a kloáka bal oldalán lévő ventrális fekvésű tasakban helyezkedik el (Péczely 1987). Erektált állapotban, a phallus az óramutató járásával egyező irányban 2 - 2,5 -szeres csavarulatot képez (Dobos-Kovács et al. 1985). A gunarak phallusának morfológiai változásai követik a ludak szezonális szaporodási jellegét. A phallus hossza termelési időszakban 46-60 mm lehet (Kisné 1988, Kisné és Péczely 1989). Januárban a termelési ciklus előtt, illetve elején a phallus még fejletlen (10-25 mm), február és április között fejlődik ki teljesen, amikor 50-60 mm hosszúságot is elérhet (Klosowska et al. 1979). A nyári fotorefakter fázisban és decemberben a phallus atrofizál, hossza csak 20-30 mm (Do thi Dong és Péczely 1989). Öt lúdfajta átlagos ondótermelését a 2/1. táblázat mutatja be.
2/1. tábálázat: Öt lúdfajta átlagos ondómennyisége (µl) ejakulációnként Ondómennyiség Hivatkozás Fajta (µl) fodrostollú magyar lúd 120-412 Varga et al., 2003 fehér olasz 160-230 Lukaszewicz, 2001 kubáni 400-1300 Kurbatov, 1976 Sellier et al., 1995 szürke landesi 300-720 Nickolova és Guerzilov, 2000 fehér benkovsky 660 Nickolova és Guerzilov, 2000
3
Irodalmi áttekintés A korai embrióelhalás genetikai háttere akkor tanulmányozható objektíven, ha az azt esetlegesen kiváltó technológiai hibákat kiküszöböljük. A tenyészállomány toxinoktól, fertőző anyagoktól mentes, optimális összetételű takarmányozása, megfelelő méretű és almozású tojófészkek kialakítása és a tojások naponta többszöri gyűjtése elengedhetetlen (Bogenfürst és Ballay 1990, Bogenfürst 1992). Az állomány fertőzésektől való mentessége meghatározó, mivel például a Mycoplasma sp. és Salmonella sp. rontják a keltethetőséget is (Bogenfürst 1992). A keltetőben gondos tojáskezelés szükséges. A keltetésre alkalmas tojások tisztítása és fertőtlenítése után nem elhanyagolható kérdés a tárolás időtartama, a tárolási hőmérséklet és páratartalom, a tárolás során történő előmelegítés szerepe (Bogenfürst 1989, Fasenko et al. 1992, Bakst 1996, Bakst és Akuffo 1999, Fasenko et al. 2001, Kuurman et al. 2002). A mikrobiális fertőzések megváltoztatják a tojástartalom kémiai összetételét és akadályozzák a tápanyagok áramlását a fejlődő embrió irányába, így elsősorban a keltetés közepén és végén okoznak nagyarányú embriópusztulást és növelik az elhalt és befulladt tojások arányát (Harry 1957, North 1978, in Bogenfürst 1986). Ezek lehetnek Micrococcus sp., Enterobacteriaceae, Streptococcus sp., Staphylococcus sp., Bacillus sp., Pseudomonas sp., Coli baktériumok, Proteus sp., bél- és talajspórás bacillusok, különféle penészgombák (Pfennig 1974, Schopen 1974, Pataky és Ernhaft 1976, Bruce és Johnson 1978, in Bogenfürst 1986).
2.2. A madarak korai embrionális fejlődésének sajátosságai
Vizsgálataimban az inkubáció első 6 napján elhalt embriók feno- és kariotípusának meghatározása után kiszűrtem azokat a szülőket, melyek utódai között nagy számban fordultak elő embrionális és/vagy kromoszómális rendellenességet mutatók. A madárembriológiai ismeretekre azért van szükség az általam végzett kísérletekben, mert az elhalt, illetve rendellenes fejlődésű embriók vizsgálatakor meg kell állapítanom az embrionális elhalás idejét, fenotípusát, valamint az embrió fejlettségi stádiumát.
4
Irodalmi áttekintés 2.2.1. A megtermékenyítéstől a hypoblast kialakulásáig
A madarak petesejtje sokszikű, a szikanyag nem vesz részt az osztódásban.
A
barázdálódás típusa segmentatio partialis discoidalis, mitózisok kizárólag a csírakorong területén találhatók (Bakonyi 1995). Az osztódások következtében a csírapajzs átmérője egyre nagyobb lesz, a sejtek között előbb radiális, majd később cirkuláris lefutású barázdák alakulnak ki, ekkor van az embrió morula stádiumban. A lerakott megtermékenyített tojásban a csírakorong morula-blasztula állapotban van, kb. 60.000 sejtből áll, ebből csak megközelítőleg 500 vesz részt közvetlenül az embrió kialakításában (Spratt és Haas 1960). A csírapajzs egy-két sejtsornyi vastagságú állományában a sejtek között üreg nincsen, a sejtes lemez közvetlenül a sziken fekszik. Eyal-Giladi és Kochav (1976) vizsgálta elsőként, hogy milyen morfológiai változások zajlanak a madár (tyúk) embrionális fejlődése során az első barázdálódástól a primitív csík kialakulásáig. Az első barázádlódás az előző tojás megtojása utántól számított 5 és fél óra múlva következik be. A barázdálódások során egyre több és kisebb sejt jön létre. Ezzel egyidejűleg a vakuólumok száma és mérete is csökken. 10-11. órás uterinális korra a sejtek nagyon kicsik, egyenletes vastagságú epitheliális felületet alkotnak. Ezt már blasztodermának nevezzük. A második szakaszba négy stádium tartozik, a 12-20 órás uterinális korig, vagyis a frissen tojt tojásig bezárólag. Ennek során határozottan elkülönül az area opaca az area pellucidától. A harmadik szakaszba szintén négy stádium tartozik, amelyből az utolsó megegyezik a Hamburger - Hamilton (1952) által leírt második stádiummal. A hypoblast jól definiálhatóan kialakul, melynek posteriorális részéből egy sejthíd jön létre a hypoblast és az area opaca között. Láthatóvá válik a primitív csík kialakulása ezen a posteriorális sejthídon, a hypoblast kezdeti posteriorális széléig.
2.2.2. Az embriogenezis időszaka: az inkubáció első három napja
A további osztódások során a csírakorong alatt a szikállomány megemésztődése és felszívódása következtében egy keskeny rés alakul ki, ez a blasztocöl (szubgerminális üreg). A felette elhelyezkedő sejtes lemezt nevezzük blasztodermának.
5
Irodalmi áttekintés A gasztruláció során alakulnak ki a csíralemezek. A blasztodermából sejtek válnak ki, melyek a szik felé elmozdulva a blasztodermával párhuzamos állású lemezzé formálódnak, ez az endoderma. A mezoderma képződését egy intenzív sejtosztódás és vándorlás előzi meg, melynek következtében az area pellucida caudális részén kialakul az őslemez. Ez fokozatosan megnyúlik és elkeskenyedik, végül csík alakú lesz. Ennek a képletnek a neve primitív csík, melynek közepén a primitív barázda húzódik. Az osztódó sejtek itt találkoznak, összetorlódnak és a mélybe fordulnak, így jön létre a mezoderma. Ezeket a sejtmozgásokat Nicolet (1971) figyelte meg jelölt timidin segítségével. Az embriogenezis során a primitív csík a keltetés 18-19. órájában éri el maximális hosszát (1,8 mm), majd a keltetés második napján eltűnik, csak a Hensen-csomó környéke látható még, mint farokbimbó. A keltetés 18-22 órája között a mezoderma állománya ősszelvényekké (somiták) sűrűsödik (Hamburger és Hamilton (1951) által megállapított 4-5. stádium). Ezek képezik majd a vázrendszer, törzsizomzat és a bőr kötőszövetes rétegeinek telepét. Az őscsigolyáktól laterálisan fekvő mezodermarészből jön létre a húgyivarszervek (gononephroton) telepe. A mezodermában ekkor jelennek meg az első kis vérszigetek. A 24. óra az embrió fejlődésében a neuruláció időszaka, a Hamburger és Hamilton (1951) által megállapított 7. stádium. A chorda dorsalis mellett kétoldalt látható a 3-4 pár somita. A somiták számával a korai embriók fejlettsége pontosan jellemezhető. A chorda dorsalis feletti velőlemez területén már folyik a velőcső kialakulása, de a velőlemez csővé még nem záródott. A velőlemez elülső részénél kialakul a fej kezdeménye. Ebben a stádiumban kezd kialakulni az embrió körül a testredő, mely elkülöníti az embriót az őt körülvevő extraembrionális területektől. Az endoderma behúzódásából létrejön az előbél, mely az elülső bélkapun át közlekedik a primitív bélüreggel. A 24-33. óra eseményei, a Hamburger és Hamilton (1951) által megállapított 8., 9. és 10. stádium, a keringési rendszer kialakulása. Az area vasculosa a vérszigetek között kialakuló összeköttetések miatt hálózatos lesz, kezdetét veszi a szikkeringés kialakulása. Ennek az érhálózatnak az a feladata, hogy az endoderma sejtek által a szikből felvett és megemésztett tápanyagokat az embrióba szállítsa. Kialakul a két nagy szikvéna és a szívcső, amely kialakulása után pulzálásával fenntartja a szikkeringést. Ebben a stádiumban az embrió 8 pár somitával rendelkezik. Kialakul a három agyhólyag (elő,- közép- és utóagy) is. Az előagyból kiinduló két oldalsó kitűrődés a szemtelep (Waddington 1952). 6
Irodalmi áttekintés A 33-38. órában az embrió eléri a Hamburger és Hamilton (1951) által megállapított 11. stádiumot. A somiták száma 10-12 körül van. A szívcső pitvarból és kamrából áll. Kialakul az első aortaív, a leszálló aorta, az elülső, a hátulsó és a közös cardinális vénák is. A központi idegrendszerben
a
szemhólyagok
megnagyobbodnak,
lefűződnek,
és
kialakulnak
a
hallóhólyagok. Az embrió fejlődésének a 38-50.-óráig tartó szakasza a Hamburger és Hamilton (1951) által megállapított 12. és 13. stádium. Ennek a periódusnak a szikkeringés megindulása a legfontosabb eseménye. Kialakulnak az embrió érrendszerének főbb pályái, ezzel lehetővé válik az embrió intenzív táplálkozása. Fokozódik az embrió lefűződése, a farok kialakulása és a bélcső tagolódásának folyamata. E periódus másik fontos eseménye a magzatburkok kialakulása. A laterális testredőknél felemelkedő, majd egymás felé növő extraembrionális ektodermából és somatopleurából álló amnion redők a fej felett összeérnek, majd összenőnek, és e folyamat eredményeként kezd kialakulni a belső magzatburok (amnion) és a külső magzatburok (serosa). Az 51-60. óra legfontosabb eseményei (Hamburger és Hamilton, 1951; 14., 15. és 16. stádium) a következők: az embrió a sziken már teljesen jobbra fordulva található, somitáinak száma 29-30 pár körül van. A szív nagyméretű, erősen kiugró szerv. A garat területén jól kivehetők a kopoltyúívek és a zsigerív artériák. Az elemi szájöböl, a későbbi szájüreg kezdeménye,
egyre
mélyülő
ektodermális
betűrődésként
indul
fejlődésnek.
A
szemkezdeményben megjelenik a lencsetelep, a gononephrotonban pedig a mesonephros is fejlődésnek indul. Differenciálódnak a somiták, kialakul a dermatom, a sclerotom és a myotom. Az embrió fejlődésének a 61-72. óráig tartó szakasza a Hamburger és Hamilton (1951) által megállapított 17., 18. és 19. stádium. A fej igen nagy és erősen hajlott, az agyhólyagok gyorsan fejlődnek, a szemek igen nagyok. A hát területén a somiták kirajzolják a gerincoszlopot. A törzsből megindul a végtagbimbók kinövése. A végtagbimbók ektodermális hámmal borított mesenchyma sűrűsödések. A hátulsó végtagbimbókkal egy magasságban kialakul a magzati húgytömlő (allantois), amely a csirkeembrió kiválasztott anyagcsere végtermékeit a kikelésig raktározza. Az allantoisban kialakul egy érhálózat, mely létrehozza az allantoiskeringést. Az allantoiskeringés később óriási fejlődésen megy át és az embrió legfontosabb légzőszerve lesz. Ez az időszak az embrionális fejlődés befejezését jelenti.
7
Irodalmi áttekintés A további napok az embrionális növekedés időszaka. Ennek főbb lépéseit a 2/2. táblázatban foglaltam össze különféle baromfifajokban.
2/2. táblázat: Négy baromfifaj embriófejlődésének ismertetőjegyei napokban kifejezve (Kiss István, 1977 nyomán)
Ismertetőjegyek A csírakorong körte alakú, megjelenik az őscsík, majd tovább differenciálódva: a somiták, a velőbarázda és az előagy. Megkezdődik a fej elkülönülése, az agyvelő részekre való differenciálódása: nagyagy, középés nyúltagy, somiták száma 10 fölé emelkedik, a fejen kétoldalt megjelenik a szem-hólyag. Vérszigetek megjelenése, szikvénák és artériák kialakulása, szikvérkeringés megindulása. Az embrió C betűre emlékeztető alakot vesz fel, jobboldalt a testen kívül dobog a szív, a szemserleg és a lencse differenciálódása, megjelenik a hallóhólyag, a 3. aortaív és a somiták száma eléri a 30-at. A szempigmentáció kezdete. A végtagbimbók megjelenése. A száj képződése, felső csőrkáva megjelenése. Az alsó csőrkáva megjelenése. Tollképletek megjelenése a gerincvonalon. Az allantois záródása. Az embrió testét pelyhek fedik. A szemhéj zárt. A sziktömlő behúzódásának kezdete. A sziktömlő teljesen behúzódott. 8
tyúk
lúd kacsa embrió életkora napokban
pulyka
1
1
1
1
2
2
2
2
2
2
2
2
3
3
3
3
3 3-4
5 5
4 5
5 5
7
8
7
7
10
12
11
9
9
12
11
9
10-11 14 15 19 20
14 18 23 24 28
13 15 18 23 27
13 17 17 23 27
Irodalmi áttekintés 2.2.3. Az embrionális fejlődés faji sajátosságai
Annak ellenére, hogy a korai embrionális elhalás általában magas a baromfifajokban (Coleman 1983, Krueger 1990), ennek biológiai alapjai még nem teljesen tisztázottak. Baromfiban az első barázdálódás 6-8 órával a fertilizáció után történik (Perry 1987). Annak köszönhetően, hogy a megtermékenyített petesejteknek az embriók fejlődésének kezdetén az oviductus elülső részéből történő eltávolítása az állat kiirtása nélkül nem lehetséges, a korai embrionális rendellenességek tanulmányozása főként a megtojás utáni időszakra korlátozódik (Foulkes 1990). Így tehát, az embriófejlődés leírása többnyire az őscsík megjelenésétől (csirkében ez az első 6-8 óra inkubáció) kezdődik, ez a jele a gasztruláció megindulásának. Hamburger és Hamilton (1951) megalkották a normál embrionális fejlődés állomásainak szám szerinti leírását a megtojás után kezdődően csirke embriókra, amely jelenleg a legszélesebb körben használt rendszer. 46 embrionális fázist írtak le, amely három fő szakaszra osztható: 1. Az őscsík megjelenésétől és megnyúlásától a feji redő megjelenéséig (2-6. fázis). 2. A szomiták megjelenésétől és megsokszorozódásuktól az embrió görbült formájának kialakulásáig (7-14. fázis). 3. Az embrionális szervek és extra-embrionális struktúrák kialakulása (15-46 fázis). Hamburger és Hamilton (1951) az oviductusban lezajló embrionális fejlődés egészét és az inkubáció (postovipozició) első óráját az őscsík megjelenéséig bezárólag nevezte első fázisnak. Eyal-Giladi és Kochav (1976) elsőként írta le az oviductusban történő embrionális fejlődést, a megtermékenyüléstől a megtojásig, házityúkban. Később, Gupta és Bakst (1993) és Bakst et al. (1997) állapították meg a normál embrionális fejlődés szakaszait pulykaembrióban, ugyancsak az oviductusban. Általánosságban elmondható, hogy a korai embrionális fejlődésnek ez a szakasza csirkében és pulykában három fő részre osztható: 1. A barázdálódás szakasza (az oviductusban), amelyet intenzív sejtosztódás jellemez (IIV. fázis Eyal-Giladi és Kochav, I.-VI. fázis Gubta és Bakst). 2. Az area pellucida kialakulása (az oviductusban), amely tartalmazza a blastodisc elvékonyodó centrális zónáját (a sejtvesztés következményeként) (VII.-IX. fázis EyalGiladi és Kochav, VII-VIII. fázis Gubta és Bakst). 3. A hypoblast kialakulása (az inkubáció első 6 órája csirkében), amely a sejtek beáramlását eredményezi az embrió ventrális felszínéről, valamint a sejtek marginális
9
Irodalmi áttekintés részéből történő elvándorlását (X-XIV. fázis Eyal-Giladi és Kochav, IX-XI. fázis Gubta és Bakst). Dupuy et al. (2002) az oviductusban történő embrionális fejlődést írták le pekingi kacsában. Az első barázdálódás a legtöbb kacsaembriónál az előző tojás megtojásától számított harmadik órában válik láthatóvá, a héjhártyák kialakulását megelőzően. Az első barázda a magnumban figyelhető meg, amely fürjben az isthmusban, csirkében és pulykában pedig az uterusban található. Kacsában, amikor a tojás belép az uterusba, az embrió már jónéhány, egymáshoz közel álló sejtet tartalmaz a középső részen. Úgy tűnik, hogy az area pellucida és a hypoblast kialakulása a kacsa-, a csirke- és a pulykaembrióban hasonló. Mindemellett úgy tűnik, hogy az area pellucida kialakulása az embrió ventrális sejtjeiből történő sejtvándorlással befejeződik. Ez a jelenség az embrió farokrészétől indul (kivéve a legkülső zónát, amelyből később az area opaca fog kialakulni és progresszíven megindul az elülső vég fele). Napjainkban is több kutatás irányul az apoptozis szerepének vizsgálatára az area pellucida kialakulása esetében (Bloom et al. 1998, Muscarella et al. 1998). A hypoblast kialakulásának első jelei nem figyelhetők meg olyan jól a kacsa esetében, mint a tyúknál, vagy a pulykánál. A legtöbb kacsaembrióban több sejt származtatható az epiblastból, feltételezhetően azért, hogy beépüljenek a hypoblastba. Ezek egyenletesen eloszlanak az area pellucida ventralis felületén. Ilyen sejtek nincsenek a marginális területeken. Ebben a szakaszban a kacsaembriók még csaknem teljesen szimmetrikusak. Lúdban
az
oviductusban
történő
embrionális
fejlődést
nem
vizsgálták
ilyen
részletességgel, mivel ebben a fajban az ovuláció időpontja nehezen meghatározható. Az inkubáció első 72 órájában az embriófejlődés hasonló az említett fajokban, csak az időbeni megjelenés különböző.
2.3. Az embriológia és a kromoszómavizsgálatok kapcsolata
Az egyedfejlődés (ontogenezis), ezen belül az embrionális fejlődés genetikailag szabályozott. A megtermékenyített petesejt génkészletében, azaz kromoszómáiban tárolt információ hozza létre az új szervezetet. Az egyedfejlődés tehát a zigóta genetikai programjának valóra váltása. Nyilvánvaló, hogy a hibátlan embrionális fejlődéshez hibátlan génkészletre van szükség, különben a fejlődés zavart szenved. A hiba súlyosságától függően abnormális fejlődés, illetve az embrió pusztulása következik be. 10
Irodalmi áttekintés Citogenetikai vizsgálatokkal a genetikai rendellenességek kromoszómális szintű része feltárható,
és
segítségükkel
az
öröklődő
rendellenességek
egy
részének
kialakulása
állományszinten elkerülhető. Ezért az állattenyésztésben (sertés, szarvasmarha, ló, baromfifélék) az 1970-es évek óta alkalmazzák a kromoszóma-rendellenességeket hordozó tenyészállatok szűrővizsgálatát. A baromfi kromoszómák vizsgálata a huszadik század elején kezdődött, párhuzamosan az emlősökével. Az első áttekintő tanulmányok ezen a területen Makino (1951), Brant (1952) és Romanoff (1960) nevéhez fűződnek. A hat "nagy" kromoszóma (makrokromoszóma) számával és morfológiai leírásával a kariotípusban minden kutató egyetértett, valamint azzal is, hogy ezek közül az egyik duplán fordul elő a hímekben, míg a nőivarban nem, azonban a "kis" kromoszómák
(mikrokromoszómák)
nehezen
meghatározhatóvá
tették
a
teljes
kromoszómaszámot. Több szerző azt feltételezte, hogy a kromoszómák száma sejtenként különböző lehet. A mikrokromoszómák természetéről és funkciójáról a hatvanas évek végéig viták folytak. Figyelemre méltó volt ebben az időszakban Yamashina (1944) cikke, aki házityúkban a kromoszómák számát minden sejtben állandónak találta. 16 makrokromoszómát írt le a hímnemben, 15-öt a nőnemben, valamint 62 mikrokromoszómát mindkét nemben. A 2n kromoszómaszámot tehát 78 - nak határozta meg a hímnemben, míg 77- nek a nőnemben. Az ivari kromoszómákat ZZ-nek és Z0-nak feltételezte. A technikai feltételek javulásával Newcomer és Brant (1954), valamint Newcomer (1957) úgy találták, hogy a mikrokromoszómák kromoszóma szerűek, de funkcionálisan különböznek a szabályos kromoszómáktól és valószínűleg nem hordoznak géneket. Christidis (1989) megfogalmazása szerint a 2 µm körüli mérettartományba tartozók a mikro- míg a 4-8 µm tartományba esők a makrokromoszómák. Az egzakt meghatározást az teszi nehézzé, hogy a kromoszómák hossza függ a preparálás módjától és minőségétől, ámbár egymáshoz viszonyított arányuk állandó. A kromoszómák számát illetően jellemző, hogy a legtöbb madárfajban 7-8 pár makro- és 30-32 pár mikrokromoszóma található, tehát a diploid szám (2n) 74-80 kromoszóma. A W kromoszóma mérete és morfológiája fajfüggő (Christidis 1986). Schoffner 1965-ben készült cikkében, amelyben az addig megjelent irodalmat tekintette át, úgy vélte, hogy a baromfi kariotipizálásnak nincs olyan alapvető kérdése, amelyre ne lenne már meg a kielégítő válasz. Mindemellett azért az elkövetkező években sok új, hasznos információ gyűlt össze. A 2/3. táblázat mutatja nyolc baromfifaj jelenleg elfogadott diploid kromoszómaszámát és ivari kromoszómáik jellemzőit. 11
Irodalmi áttekintés 2/3. tábázat: Nyolc baromfifaj jelenleg elfogadott diploid kromoszómaszáma, valamint ivari kromoszómáik méretsorrendben elfoglalt helye és leírása (Szalay, 1989 nyomán) Faj 2N Z W Hivatkozás Owen (1965) házityúk 5 8-9 Pollock, (Gallus 78 metacentrikus metacentrikus Fechheimer (1976) domesticus) Bloom (1969) kacsa 4 7-8 Muravská, (Anas 80 szubtelocentrikus szubtelocentrikus Baumgartner platyrhynchos (1983) f. domestica) Hammar (1966) lúd 4 7-8 Hidas, Szalay (Anser anser f. 80 szubmetacentrikus metacentrikus (1987) domestica) Talluri, Vegni (1965) japán fürj 5 8-9 Fábián, Nagy (Coturnix 78 metacentrikus szubtelocentrikus (1973) coturnix Baumgartner, japonica) Koncenková (1984) Stenius et al. pulyka 4 6-7 (1963) (Meleagris 80 metacentrikus szubmetacentrikus Krishan, Shoffner gallopavo) (1966) fehér kínai 4 6-7 hattyúlúd 80 Bhatnagar (1968) szubmetacentrikus szubmetacentrikus (Cygnopsis cygnoides) Stock, Bunch gyöngytyúk 5 9-10 (1982) (Numida 80 metacentrikus telocentrikus Kozikova (1984) meleagris) Makino (1951) pézsmakacsa 4 7-8 Migliore et al. (Cairina 80 akrocentrikus akrocentrikus (1986) moschata)
2.3.1. A madarak genomjának speciális tulajdonságai
A házityúk sejtmagjának DNS tartalma megközelítőleg 3 pg, hozzávetőlegesen a fele az emberének és az egérének (Atkin et al. 1965, Bachmann et al. 1972). A különbség leginkább abból adódik, hogy a genom lényegesen kisebb arányban vesz részt a repetitív szekvenciák kialakításában, és kevesebb nagy heterokromatikus régiója van. Ez alól kivételt képez a W 12
Irodalmi áttekintés kromoszóma, amely szinte teljes egészében heterokromatikus és egy nagy terminális C sáv található a Z kromoszóma hosszú karján (Pollock és Fechheimer 1981). (A C sáv olyan kromoszómafestési módszer, amivel a heterokromatikus, repetitív szekvenciák válnak láthatóvá főként a centromerek közelében.) Csaknem az összes mikrokromoszóma megjelölhető kis C sávokkal. Hat, aránylag nagy kromoszóma, amely a teljes kariotípus összhosszúságának 65 %-át teszi ki, határozottan megkülönböztethető alakú a metafázisban és könnyen azonosítható. A következő három vagy négy szintén, jó minőségű preparátum esetén. A maradék, amelyeket mikrokromoszómáknak nevezünk, csökkenő méretű elemeket foglal magába, amelyeknek többsége akrocentrikus és amelyeket rendkívül nehéz pontosan megszámolni és azonosítani. A legkisebb mindössze 1 µm, amely éppen a határán van annak, hogy még fénymikroszkóppal vizsgálható legyen. A hímivar homogametikus, ZZ, a nőivar heterogametikus, ZW. A Z kromoszóma egyike azon makrokromoszómáknak, amely könnyen azonosítható, metacentrikus, a méret szerinti sorban az ötödik házityúk esetében. A W kromoszóma kis, szubmetacentrikus alkotó, a hetes és nyolcas atuszómákhoz hasonló méretű, késői replikációjú és szinte teljes egészében heterokromatikus (Owen 1965, Schmid 1962). A házityúkban nincs dóziskompenzáció, amely kiegyenlítené a nagy ivari kromoszómák számbeli különbségét a két ivarban (Cock 1964). Ezek szerint a két Z kromoszóma egyidejűleg replikálódik a hímivarban és nincs szex-kromatin, amely az inaktív ivari kromoszómát jelzi az interfázisos sejtmagban. A házilúd genomjáról rendkívül kevés adat áll rendelkezésre. Az első publikáció a házilúd kromoszómaszámáról 1966-ban született. Hammar (1966) 80-nak határozta meg a diploid kromoszómaszámot. Bakai et al. 1986-ban a rajnai libákban szintén 80-nak találták a kromoszómák számát, a Z kromoszómát pedig az ötödik legnagyobbnak írták le. Hidas és Szalay 1987-ben szintén 80 kromoszómát írt le magyar ludak csontvelőjéből készült szövettenyészetből preparálva, ahol a Z kromoszóma a negyedik, a W kromoszóma a 7-8. makrokromoszómának felelt meg.
13
Irodalmi áttekintés 2.3.2. Kromoszóma-rendellenességek előfordulása különböző baromfifajok embrióiban, és ezek hatása a korai embrióelhalásra A baromfitenyésztésben az elmúlt évtizedekben komoly előrehaladás történt az embriológiai és citogenetikai ismeretek együttes gyakorlati alkalmazása terén. A korai embriók kromoszómavizsgálatának témakörében a 60-as évek végén kezdődtek kutatások, főként csirkében (Bloom és Buss 1966, Fechheimer et al. 1970, Duber et al. 1973). A fenotípusosan abnormális embriókban különféle, elsősorban számbeli rendellenességeket találtak, így haploid, poliploid és aneuploid típusokat (Bloom 1969, Mong et al. 1974). Baromfiban, természetes körülmények között a kromoszóma szerkezeti eltérés nem jellemző (Fechheimer 1990). Kimutatták, hogy összefüggés lehet az embriómortalitás és a kromoszóma-rendellenességek között a különféle baromfifajokban. A kromoszómális rendellenességek szignifikáns csökkenése volt megfigyelhető a tojók korának előrehaladtával, ugyanabban a tojóciklusban vizsgálva kacsa és lúd esetében (Bloom 1970). Az anyai kor hatásáról ugyanígy számoltak be korábban tyúkban Mong et al. (1974), De Boer et al. (1984), később Saefudin et al. (2002) és kacsában Vagt et al. (1988). Jaap és Fechheimer (1974) úgy vélték, hogy a nőivarban bekövetkező hormonális változások lehetnek felelősek a csirkeembriókban létrejövő kromoszómális rendellenességekért, amikor a tojók megkezdik a tojástermelő ciklusukat. Deeming és Van Middelkoop (1999) ROSS és COBB broiler tojó vonalakat vizsgált. A korai embrionális rendellenességek aránya 4% körül alakult mindkét esetben és 35, valamint 55 hetes tojókra nézve ez arány nem változott. További vizsgálatok szükségesek víziszárnyasokban annak kiderítésére, hogy a tojástermelési ciklus elején emelkedik - e a kromoszómális rendellenességek aránya. A lámpázáskor kiemelt tojásokban található elhalt embriók, valamint differenciálatlan, embriót nem tartalmazó szövetek kromoszómavizsgálatából kiderül, hogy azok mutatnak-e valamilyen eltérést a kromoszómák számát, esetleg alakját illetően. A tyúk esetében számos irodalmi adat utal arra, hogy a korai embriófejlődés során jelentős veszteséget (1-12%) okozhatnak a kromoszóma-rendellenességek (Fechheimer 1981, Szalay et al. 1988). Ezek az elsősorban számbeli eltérések, mint például a triploidia, haploidia, poliploidia, amelyek a meiózis vagy a termékenyülés során, illetve az embriófejlődés kezdetén lépnek fel és többnyire letálisak (Mong et al. 1974, Fechheimer és Jaap 1980, Fechheimer 1981). Ez az arány a tömegtermelésben jelentős veszteséget jelent, ezért indokolt a kromoszómarendellenességeket előidéző tényezők vizsgálata. A házityúk esetében kimutatták a kromoszómarendellenességek arányának eltérését különböző fajtákban, családokban, illetve egyedekben 14
Irodalmi áttekintés (Reddy és Siegel 1977, Wolowodiuk et al. 1985, Thorne et al. 1987, Thorne és Sheldon 1991). Bebizonyosodott például, hogy az anyaállat genotípusa igen fontos tényező a haploid és a haploid/euploid genotípusú embriók keletkezésében (Bloom 1972, 1978, Snyder et al. 1975). Duber és munkatársai (1973) megfigyelték, hogy a hústípusú fajtákban magasabb a kromoszómarendellenességek aránya (4,9%), mint a tojótípusú állományokban (2,8%). Fechheimer (1977) szintén hasonló eredményre jutott, 10,2% a broilerekben, 1,4% leghornban, 4,6% a hús - tojó keresztezés után. A rendellenességek gyakorisága más fajokban nyert adatok alapján változni látszik a tojóciklus folyamán is (Vagt et al. 1988). Miller et al. (1971) 12,7% (36/282) kromoszóma aberrációt találtak hús típusú állomány embrióiban. Bloom (1972) különféle fajták 4182 embrióját vizsgálta. Kromoszómaszámbeli eltérést 2,5% (103) -ban talált, de ez a különböző fajtákban 0,4-8,9%-ot jelentett. Csak a fenotípusosan abnormális embriókra vetítve, azokban 2,3 - 23,7% volt kromoszómálisan is rendellenesek aránya. Lodge et al. (1973) leghorn állományban kevesebbet (1,4%) találtak (5/347). A kromoszóma-rendellenességek egyes családokban felhalmozódhatnak (Hidas et al. 1996, Liptói és Hidas 1998). Az aneuploidia (monoszómia, triszómia) viszonylag ritkán szerepel az embrionális elhalások okai között. Hidas et al. (1999) rekurrens triszómiát írtak le két tojó esetében, amelyek nemcsak az aneuploidiát mutatták ismételten, hanem az érintett kromoszóma is minden alkalommal ugyanaz volt. Ezen rendellenesség kialakulásának háttere még nem teljesen tisztázott. Lehetséges, hogy a tojóban, a meiózisban történik hiba (Fechheimer 1981). Japán fürjek testsúly alapján történő divergens szelekciója után a korai embrionális kromoszóma-rendellenességek aránya 5,3% volt a nagyobb súlyúak között, a szelektálatlan kontrollban pedig 1,34% (Jaszczak et al. 1985). Hasonlóképpen Wolowodiuk et al. (1985) szerint, ahol a nagyobb súlyú madarak embrióiban 8,9%, a szelektálatlan kontrollban 5,6%, míg a kisebb súlyú csoportban 4,1% volt. Vagt et al. (1988) pekingi kacsa embrióiban ugyancsak magasabb arányban találtak rendellenességet a nagyobb súlyú vonalakban (8,24%), mint az alacsonyabb súlyúakban (5,62%). A következő számbeli eltéréseket figyelték meg: haploidia, haploid/euploid, diploid/triploid kimérizmusok. A tojástermelés kezdetén (az első 6 hét) magasabb volt a rendellenességek aránya, mint később. Házilúdban viszonylag kevés adattal rendelkezünk az embrionális kromoszómarendellenességek előfordulásával kapcsolatban. Baromfiban természetes körülmények között rendkívül kevés szerkezeti eltérést találtak. Zartman és Smith (1975) számol be arról, hogy 15
Irodalmi áttekintés sikerült indukálniuk 1-Z transzlokációt tyúkban. Ezért különösen érdekes Szalay 1989-ben végzett azon vizsgálata, amelyikben a babati rajnai libaállományban több pericentrikus inverziót talált. Egyébként a rendellenességek aránya landesi-ben 1,33% (1/75), rajnaiban 3,37% (3/89 volt). Más állományokra ez egyáltalán nem jellemző. Liptói és Hidas (1998) szürke landesi vonalban haploid, triploid, poliploid, haploid/diploid, diploid/triploid, poliploid/diploid kariotípusokat találtak. Szürke landesi és fehér magyar vonalak összehasonlításakor, a kromoszóma-rendellenességek aránya, az elhalt embriókra vetítve, 16% volt mindkét esetben, bár a tojáskiesés, az előbbiben nagyobb volt (Liptói és Hidas 1997). Klein és Saar (1992) egy húshasznosítású és egy tojástermelésre szelektált vonalat vizsgált. Eredményül azt kapták, hogy a korán elhalt embriókban a kromoszóma-rendellenességek aránya 18,0% volt a nagy testsúlyra szelektáltakban, míg a másikban 20,1%. Ez mind mértékét, mind tendenciáját tekintve eltér az eddig közölt irodalmak adataitól. Mindezek a kutatási eredmények alátámasztják a citogenetikai vizsgálatok fontosságát a modern baromfitenyésztésben.
2.4. Korai embrionális rendellenességek fenotípus szerinti csoportosítása
A korai rendellenes fejlődésű embriókat, valamint az embrionális szöveteket több kategóriába sorolják, tyúkban az inkubáció 4-5., lúdban a 6-7. napján megállapítva. Az osztályok jelölésére angol rövidítésük használatos. Ezek a következők (Abbot és Yee 1975, Szalay et al. 1989): - ND (no development): a csírakorong nem indult fejlődésnek. Abban osztódás nem található, így metafázisok sem. - PD (positive development): A tojás fertilis, azonban a differenciálódás az inkubáció alatt megáll, mielőtt az embrió kialakulhatott volna. A membrán csak ekto- és endodermális szöveteket tartalmaz. - BWE (blastoderm without embryo): Embrió ebben az esetben sem található, viszont itt már mezodermális szövetek is létrejönnek. Így például vérerek láthatók a tojásban. - D (dead embryo): Az embrió mérete, fejlettsége alapján megállapítható, hogy az inkubáció melyik napján halt el.
16
Irodalmi áttekintés - AE (abnormal embryo): Ha az élő embrió valamilyen morfológiai rendellenességet mutat (pl. nincs szeme), vagy mérete kicsi (lassú fejlődésű). - NE (normal embryo): Korának megfelelő fejlettségű és küllemű embrió. Elsőként Abbot és Yee (1975) számoltak be a PD - positive development és a BWE - blastoderm without embryo előfordulásáról, mint két szokatlan korai embrionális rendellenességről. Előbbi esetben az ektoderma és az endoderma alakult ki, míg utóbbi esetben a mezoderma is megjelent, amely a vérszigetek jelenlétét magyarázza. A kategóriák meghatározása azért fontos, mivel ezekben nem található minden esetben kromoszóma-rendellenesség, mégis genetikai defektusra utalhatnak, illetve megkönnyítik a mutációk
felismerését
is.
A
korai
embrionális
rendellenességek
egyes
családokban
felhalmozódhatnak különféle lúdvonalakban (Liptói et al. 1999, Liptói és Hidas 2000). Bednarczyk és Rosinski (1999) fehér olasz ludak vizsgálata során a korai embrionális rendellenességek arányát 6,2 - 8% között határozták meg a húsra szelektált vonalakban és 3,7%nak találták a tojástermelésre szelektáltakban. Korábban szintén fehér olasz fajtában a WD-1, tojásra szelektált vonalban a korai embrionális rendellenességek aránya 6,0 - 6,3% volt, míg a WD-3 vonalban, amely húshasznú, 7,6-7,7% (Rosinski és Bednarczyk 1997). Brah et al. (1991) két fehér leghorn vonalat vizsgáltak. A korai embrionális rendellenességek aránya 3% és 6% körül alakult vonalanként. Khan et al. (1981) szintén fehér leghorn vonalakban a korai embrionális elhalás arányát 5,83 és 14,06% között határozták meg. Egyes esetekben nagyon korai embrionális elhalás (ovipozíció előtti) figyelhető meg kacsában (Hu et al. 1997). Ez szabad szemmel nem, csak sztereomikroszkóppal látható, a csírakorong preparálása után. Azt, hogy az embrionális fejlődés melyik fázisában történt az elhalás, az Eyal-Giladi és Kochav (1975) által kidolgozott etalonhoz viszonyítják. Az inkubáció 24-48. órájában bekövetkező PD fenotípusú elhalás esetében csak organizálatlan szövetrétegek láthatók a tojás feltörése után, ami rendkívüli hasonlóságot mutat a partenogenetikus, elhalt embriókkal pulykában (Cassar et al. 1998). Utóbbi azonban csak hímnemű lehet. A hasonlóság miatt felmerült az a kérdés, hogy a PD embriók nem partenogenetikusak-e? A szövetek DNS vizsgálata során W specifikus próbát alkalmazva azonban, a PD minták között nőivart is sikerült kimutatni. Ennek alapján tehát elmondható, hogy a PD embriók fertilizációs hiba, vagy sikeres fertilizációt követő korai embrionális elhalás során jönnek létre, nem csak partenogenetikus módon.
17
Irodalmi áttekintés PD és BWE kategóriák fordultak elő a legnagyobb számban a kacsában és a libában is, hasonlóan a tyúkhoz (Szalay et al. 1999). A különböző baromfifajok között a hústípusú házityúk vonalakban lehet a legnagyobb arányban kromoszóma-rendellenességeket kimutatni, ami a testtömegre és a növekedési erélyre hosszú ideig, intenzív módon folytatott szelekcióval magyarázható, ezáltal rendkívül megnövelve a rendellenes embriók arányát (Reddy és Siegel 1977). Feltételezhető, hogy lúdban és kacsában a sokkal rövidebb történetre visszatekintő intenzív szelekció miatt mutatnak a kromoszóma-rendellenességek alacsonyabb, de nem elhanyagolható arányt ezek embrióiban (Szalay et al. 1999).
2.5. Korai embrióelhalást okozó mutációk különféle baromfifajokban
Baromfiban három ivarhoz kötött recesszív rendellenességet írtak le (Sherdian 1964, Somes és Smyth 1967, Bernier és Arscott 1972), több autoszómális recesszív (Dunn 1923, Savage és Harper 1985, Savage et al. 1988) és egy autoszómális domináns gént (Landauer és Dunn 1930), amelyek az inkubáció első 120 órájában nyilvánulnak meg. A legkorábban leírt, korai embrionális elhalást okozó gén, a creeper (Cr) (Landauer és Dunn 1930, Landauer 1932), amely egy nem teljesen domináns autoszómális génváltozat és a hosszú csontok megrövidülésével jár. Homozigóta állapotban már az inkubálás első napjaiban letális. Sheridan (1979) számolt be a ladykiller (lk) génről, amely a hímivarú állatokban detektálható és a nőivarú embriók elhalását okozza az inkubáció első hetében. Somes és Smyth (1967) egy hasonló gént írtak le, (prenatal lethal –pn- gene), amely a lassú tollasodást meghatározó génhez (k) és a törpeség (dw) génjéhez található közel, ivarhoz kötött és szintén korai embrionális elhalást okoz, amely az inkubáció 3-4. napján a legmagasabb. Az lk és pn gének egymáshoz nagyon hasonlóak, így lehetséges, hogy csak génváltozatokról van szó. Az irodalomban számos, fenotípusosan vagy citológiailag detektálható örökletes rendellenességet mutattak ki, amelyek a korai embriófejlődés során veszteségeket okozhatnak. Savage et al. (1988) beszámoltak egy autoszómális recesszív letalitást okozó génről (blr), amelyet csirkeembriókban vizsgáltak. Ez a keltetés harmadik napja előtt jár embrióelhalással és jellegzetessége, hogy az embrió körül vérgyűrű látható, az érrendszer helyén pedig vérpettyek. Véleményük szerint ennek kiváltó tényezője egy génmutáció lehet. A blr gén gyakoriságát leghorn és new hampshire populációkban 0,08% és 0,14% között találták. Kromoszóma 18
Irodalmi áttekintés vizsgálatokat nem végeztek. Szintén gyűrűs elhalást mutatott ki Savage és Harper (1985) pulykában. 48 óra inkubáció után fehér gyűrűt lehetett szabad szemmel is megfigyelni a sárgája felületén, amely amorf sejtekből állt az area opacaban, az area pellucida pedig vagy tartalmazott sejteket, vagy nem. Ez a rendellenesség autoszómális recesszív tulajdonságként öröklődik és homozigóta állapotban nyilvánul meg. Thomas et al. (1992) 1-3 mm széles gyűrűt írtak le pulykában, amely vérszigeteket tartalmaz, a sinus terminalis pedig szabálytalan embrionális eritrocitákat. Az idő előrehaladtával a gyűrű ármérője növekszik. Egy másik letális mutáció a blasztoderma-degeneráció (bld), melynek kialakulásáért szintén egy autoszómális recesszív gént tartanak felelősnek (fehér leghornban). Az embrióelhalás az inkubáció harmadik napja előtt következik be, a Hamburger-Hamilton (1952) által meghatározott 8-9. fázisban manifesztálódik, az agy differenciálódása, a somiták kialakulása és a szív fejlődése szenved zavart. Autoszómális recesszív tulajdonságként öröklődik (Savage et al. 1992). Delany et al. (1994) az rRNS gén kópiaszámában találtak változást egy házityúk állományban, ami következtében korai embrióelhalás lépett fel. Ez a rendellenesség legegyszerűbben citológiai preparátumokon azonosítható, ugyanis a kópiaszám nagy mértékű csökkenése a sejtmagvacskák (nukleolusz) sejtmagon belüli kisebb méretéből ismerhető fel. A rendellenességet heterozigóta formában hordozó egyedek ezt a tulajdonságot átörökítik, homozigóta formában letális.
2.6. A rendellenes kariotípusok eredete a madárembriókban
A madárembriókban előforduló kromoszóma-rendellenességek eredetének áttekintését két olyan alapfogalom bemutatásával kezdem, amelyek az ugyanabban az egyedben található különböző kariotípusú sejtek leírásakor használatosak. Az egyik a mozaicizmus, amely egyetlen zigótából későbbi genommutációk révén alakul ki. A másik a kimérizmus, amely több zigóta összeolvadásából jön létre. Ez azt is jelenti, hogy a sejtek genomjának az eredete a mozaicizmus esetében ugyanaz, míg a kimérizmus esetében különböző (Szabad 1988, Szalay 1989, Kovács és Hidas 2004). A genetikailag különböző vonalakban a heteroploidok sokféle típusa található meg. Így az euploidok, amelyek esetében a teljes kromoszóma-készlet száma tér el a normál 2n diploidtól, tehát a haploidok (1n), illetve a poliploidok (tri- (3n), tetra- (4n), hexa- (6n) ploidok), valamint az 19
Irodalmi áttekintés aneupoidok, ahol az egyes kormoszómapárok számbeli eltérése figyelhető meg (triszómia 2n+1, monoszómia 2n-1, autoszómális és gonoszómális heteroszómiák pl. ZZW, ZZZ). Rendkívül ritkán struktúrális rendellenességek (pericentrikus inverzió) fordulhatnak elő (Szalay 1989, Kovács és Hidas 2004). A
kromoszómális
rendellenességek
eredete
markerkromoszómák
alkalmazásával
vizsgálható (Zartman és Smith 1975). Több szerző szerint a heteroploidok jelentős része anyai eredetű (Miller et al. 1971, Bloom 1972, Duber et al. 1973, Snyder et al. 1975), így a triploidok a diploid petesejtekből keletkezhettek. Fechheimer (1981) szerint a haploidia és a kimérák haploid sejtvonalai a spermasejtek mitotikus osztódásának hibáira vezethetők vissza. A diploid/triploid kimérák létrejöttére Fechheimer et al. (1983) négy lehetőséget sorolnak fel a kétmagvas oocytákban. Ezek szerint a hiba történhet: a megtermékenyítésben, az egyik magban a meiózis Iben, az egyik magban a meiózis II-ben, illetve mindkét magban a meiózis II-ben. Poliploid sejtek létrejöhetnek a mitózisban bekövetkező hiba során (endomitózis), amikor az épen maradó sejtmaghártyán belül a kromoszómaszám megtöbbszöröződik (Imreh 1986).
2.7. Kromoszóma-rendellenességek előfordulása a baromfifajok kifejlett egyedeinél
Házityúkban a kifejlett madarak között találtak triploid állatokat. Ezek fenotípusosan normálisak voltak, de nem fertilisek. Azonban a diploid-triploid mozaikos nőnemű (2AZW/3AZZW), valamint hímnemű egyedek (2AZZ/3AZZW) normál és hibás ivarsejteket egyaránt termeltek és fertilisek voltak, míg a 2AZW/3AZZZ garnitúrával rendelkező nőnemű egyedek nem. A haploid-diploid egyedek (1AZ/2AZW, 1AZ/2AZZ) mindkét ivarban fertilisek. Haploid-diploid-triploid tyúk Z/ZW/ZZW nem termékeny. Aneuploidiát tartalmazó állatot nem találtak (Thorne et al. 1987, Bonamino és Fechheimer 1993, Donner et al. 1969, Snyder et al. 1975).
20
Anyag és módszer 3. ANYAG ÉS MÓDSZER
Munkám során négy kísérletet állítottam be a korai embrionális elhalások és a kromoszóma-rendellenességek előfordulásának, valamint öröklődésének vizsgálatára (3/1. ábra a 24. oldalon). Időközben indokolttá vált a megtojás előtti, még a tojócsőben történő embrionális elhalások vizsgálati módszerének fejlesztése, amelyhez egy ötödik kísérletre volt szükség. Vizsgálataimat Artiguèresben (INRA - Station Expérimentale des Palmipèdes à Foie Gras, Benquet, Franciaország) végeztem.
3.1. A vizsgálatban résztvevő fajták bemutatása 3.1.1. Fehér lengyel (4-es vonal)(1. kép):
A 80-as évek elején, egy közös lengyel-francia kutatási program keretében a Koluda Wielka Kutatóállomásról (Lengyelország) Artiguèresbe behozott húshasznosítású fajta. Azóta tiszta vonalban tartják. A fertilitás növelése érdekében keresztezésekhez, illetve összehasonlító kísérletekhez használják (Poujardieu et al. 1994). A telepi adatok 1998-ban: Az átlagos tojástermelés 44,9 db, a fertilitás 63,1%, a tömés utáni átlagos májtömeg 321-402 g.
1. kép: Fehér lengyel tojó 21
Anyag és módszer
3.1.2. Szürke landesi (7-es vonal) (2. kép):
Több landesi vonalból Artiguèresben kialakított szintetikus vonal, amelyet tojástermelésre és májhasznosításra hoztak létre. Landesi ludak tojástermelési eredménye a reprodukciós ciklus során átlagosan 50 db az első évben, 60 db a másodikban. A tömést 20 hetes korban kezdik, ami átlagosan 18 napig tart. A máj átlagos súlya 750 g körül alakul (Rouvier et al. 1982a, 1982b). A telepi eredmények 1998-ban a következőképpen alakultak: Átlagos tojástermelés 43,1 db, átlagos fertilitás 52,3%, a tömés utáni átlagos májtömeg 773-854 g.
2. kép: Szürke landesi tojó
22
Anyag és módszer
3.1.3. Fehér lengyel (4-es vonal) és szürke landesi (7-es vonal) keresztezése (9-es vonal) (3.kép):
Ezt a vonalalt Artiguèresben alakították ki. Az első évben a 7-es vonalat keresztezték a 4es vonallal, valamint a 4-es vonalat a 7-el. Az így létrejött 47-es és 74-es vonalakat keresztezték ezután, illetve a 74-est a 47-el. Ezután a fehér szín szerint szelektált állatok tenyésztésével hozták létre a 9-es vonalat. Az állatok színe alapvetően fehér, kevés szürke területtel a háton, a nyakon és a szárnyvégeken. A vonal májhasznú. Az átlagos tojástermelés 65,5 db, az átlagos fertilitás 45,2%, az átlagos hízott máj tömege 590-650 g az 1998-as telepi adatok szerint. Ehhez azonban hozzá kell tenni, hogy a tojók februártól szeptember végéig tojnak, viszont a gunarak hamarabb leállnak. Áthidalásként azt a megoldást választották, hogy májusban a gunarakat lecserélik, így próbálják növelni a fertilitást.
3. kép: Tojó a 9-es vonalból
23
Anyag és módszer 3/1. ábra: A négy kísérlet menetének áttekinése Állományvizsgálat a három vonalban a kromoszóma-rendellenességek és az embrionális elhalás arányának meghatározására. Mindhárom vonalban voltak olyan családok, egyedek, amelyek magas arányban mutatták ezeket a rendellenességeket.
Első kísérlet:
Kiválogattam azokat az egyedeket, amelyek az embrionális elhalást és kromoszóma-rendellenességeket a populációs átlagtól szignifikánsan magasabb arányban mutatták. A továbbiakban ezeket az egyedeket hordozónak feltételeztem és cP-vel jelöltem.
Második és harmadik kísérlet:
Negyedik kísérlet:
24
A hordozónak feltételezett egyedek utódaiból is kiválasztottam egy csoportot a további vizsgálatokhoz. Ezeket F1-el jelöltem.
A rendellenességek ismétlődésének és öröklődésének követésére célzott párosításokat alakítottam ki a hordozónak minősített egyedekből, ezek utódaiból és utódaival, valamint nem hordozó egyedekkel.
Teszteltem a hordozónak minősített egyedek utódait, valamint az ezekből a párosításokból származó utódokat, amelyeket F2-nek neveztem.
Anyag és módszer 3.2. Első kísérlet
A 4-es vonalban öt tojó és egy gúnár, a 7-es és 9-es vonalban négy tojó és egy gúnár került fülkénként elhelyezésre, kültérben, természetes fényben. A fülkék 12 m2 alapterületűek voltak, fürdési lehetőséggel kiegészítve. A tojásokat csapófészkes módszerrel gyűjtöttem, jelöltem rajtuk a vonal, a fülke, valamint a tojó azonosítóját. Az adatokat Palmi szoftver segítségével rendszereztem (Batut 1997). 1997-ben, a vizsgálat első évében a 4-es és 9-es vonal tojói az első tojóciklusukban, míg a 7-es vonal tojói a második tojóciklusukban voltak. A 4-es vonalban 25, a 7-es vonalban 33, a 9-es vonalban 24 fülkébe osztották az állatokat. A tojásokat naponta két alkalommal gyűjtötték és maximum egy hétig tárolták inkubáció előtt. A mintákat a tojóciklus elején (februárban), a közepén (áprilisban) és a végén (júniusban) gyűjtöttem. Az inkubáció 5. napján történt lámpázás után azokat a tojásokat nyitottam fel, amelyekben nem látszott normális embrionális fejlődés. A 4-es vonalban 913 tojást törtem fel 95 tojótól, a 7-esben 822 tojást 131 tojótól, a 9-esben 1112 tojást 94 tojótól. Azokat a tojókat, amelyek nem produkáltak egyetlen termékeny tojást sem, kizártam az analízisből, így a 4-es vonalban 70, a 7esben 119, a 9-esben 89 tojót értékeltem (összes inkubált tojásaik száma rendre 964, 2578 és 2047 volt). Kiválasztottam azokat az állatokat, amelyek magas arányban mutatták az embrionális elhalást (az elhalt embriók aránya magasabb volt, mint 12% a termékeny tojásokra vetítve), hogy a következő évben teszteljem az ismétlődhetőségét és az örökölhetőségét a vizsgált tulajdonságoknak. A továbbiakban ezeket az egyedeket hordozónak feltételeztem és cP rövidítéssel jelöltem.
3.3. Második kísérlet
1998-ban különféle párosításokat alakítottam ki a hordozónak feltételezett, 7-es vonalból kiválasztott egyedekből (cP) és azok utódaiból (F1). A cP állatok a harmadik tojóciklusukban, míg az F1 állatok az első tojóciklusukban voltak. A c jelzést a hordozó egyedek, az r jelzést a rokon, az nr jelzést a nem rokon egyedek jelölésére használtam. Egy gúnár és négy tojó került minden fülkébe, kültérben, természetes megvilágításban. A február közepétől májusig termelt tojásokat vizsgáltam. Természetes párosítást és csapófészket 25
Anyag és módszer használtam a kísérlet folyamán. Annak a 30 tojónak a teljesítményét vizsgáltam (36 közül), amelyiknek legalább egy termékeny tojása volt. 465 tojást törtem fel (752 összes inkubáltból). A párosítási típusok a következők voltak: - eredeti párok (cPxcP), - apák a saját lányaikkal (cPxrF1) - cP gunarak nem rokon egyéves tojókkal (cPxnrF1), - F1 gunarak a saját testvéreikkel (F1xrF1) - F1 gunarak nem rokon egyéves tojókkal (F1xnrF1). Az F1 gunarak nem voltak egymás rokonai.
A 4-es vonalban az állatokat azonos párosításban, valamint azonos tartásban helyeztem el, mint az előző évben (cPxcP). Ezek az egyedek a második tojóciklusban voltak.
3.4. Harmadik kísérlet
1999-ben az előző két kísérlet alkalmával már vizsgált tojókból és gunarakból alakítottam ki újabb párosításokat, függetlenül attól, hogy a 4-es, vagy a 7-es vonalból származtak. A február közepétől májusig termelt tojásokat vizsgáltam. A cél az volt, hogy a hordozónak minősített gunarak és tojók nem hordozókkal párosítva ismét hordozóknak bizonyulnak-e, vagy esetleg csak a hím-, illetve csak a nőnem felelős az embrionális rendellenességek kialakításáért. A rokontenyésztés elkerülése mellett a következő párosításokat alkalmaztam: - hordozó gunarak és tojók (cPxcP), amely megegyezett az előző kísérletek egyedeivel és beállításával, tehát ezek eredetileg a 7-es vonalból származtak és a negyedik tojóciklusukban voltak; - hordozó gunarak nem rokon, azonos korú nem hordozó (nc) tojókkal (cPxncP), ahol a cP egyedek a 7-es vonalból származtak és a negyedik tojóciklusban voltak, az ncP egyedek a 4-es vonalból származtak és a harmadik tojóciklusukban voltak; - hordozó gunarak nem rokon, utódnemzedékből származó tojókkal (cPxcF1), ahol a cP egyedek a 7-es vonalból származtak és a negyedik tojóciklusban voltak, a cF1 egyedek szintén a 7-es vonalból valók és a második tojóciklusban voltak;
26
Anyag és módszer - szülői nemzedékből származó nem hordozó gunarak nem rokon, utódnemzedékből származó hordozónak feltételezett tojókkal (ncPxcF1), ahol az ncP egyedek a 4-es vonalból származnak és a harmadik tojóciklusban voltak, a cF1 egyedek a 7-es vonalból valók és a második tojóciklusban. Az előzőekhez haslonlóan egy gúnár és négy tojó volt elhelyezve kültéri fülkénként, természetes párosítással.
Annak a hipotézisnek az igazolására vagy elvetésére, hogy a hordozó szülők utódai nagyobb arányú embrionális rendellenességet produkálnak alacsony fertilitás mellett, egy kisebb kísérleti állományt állítottam be (6 gúnárt és 19 tojót) mesterséges termékenyítéssel a következő párosítási sémával: -utódnemzedékből származó hordozó gunarakat hordozó, szülői nemzedékből való tojókkal (cF1xcP); -utódnemzedékből származó hordozó tojókat és gunarakat egymással (cF1xcF1); -szülői nemzedékből származó hordozó gunarakat utódnemzedékből származó hordozó tojókkal (cPxcF1). A cP egyedek a 4-es vonalból származtak és a harmadik tojóciklusukban voltak, míg a cF1 egyedek szintén a 4-es vonalból valók a második tojóciklusban. A hím és nőivarú állatok egy légtérben, 60x80 cm-es egyedi ketrecekben kerültek elhelyezésre, természetes megvilágítás mellett. Gunaranként három tojót termékenyítettek, egy gúnár kivételével, amelyik ondójával négyet, hetente két alkalommal. A gunarakat két hétig tréningezték az ondóvételre a vizsgálatok megkezdése előtt. A sperma minőségi paraméterei közül az ondósejtek motilitását és az ondó mennyiségét ellenőriztem és minősítettem a gunarak erekcióját.
3.5. Negyedik kísérlet
2000-ben annak a hipotézisnek a bizonyítására vagy elvetésére, hogy a hordozó gunaraktól származó hímivarú utódok magas terméketlenségének az oka valójában nagyon korai (megtojás előtti, még a tojócsőben történő) embrionális elhalás, 9 gunarat és 19 tojót teszteltem mesterséges termékenyítés alkalmazásával, a rokontenyésztés elkerülése mellett. A február 27
Anyag és módszer közepétől májusig termelt tojásokat vizsgáltam. A hím és nőivarú állatok egy légtérben, 60x80 cm-es egyedi ketrecekben kerültek elhelyezésre, természetes megvilágítás mellett és heti két alkalommal voltak inszeminálva. Négy gunarat már az előző évben is vizsgáltam ugyanazokkal a tojókkal párosítva (cF1xcF1). Öt gúnár és kilenc tojó a harmadik kísérlet azon párosításaiból származó utód, ahol az embrionális mortalitás magas volt (F2xF2). Egy, kettő, illetve három tojó tartozott minden gúnárhoz. A sperma és erekció minősítése a harmadik kísérletben leírtakkal azonos volt.
3.6. Embriók vizsgálata
Azokat a tojásokat törtem fel, amelyek az 5. napon végzett lámpázás során nem mutattak normális embrionális fejlődést. A terméketlennek tűnő tojások tartalmazhatnak olyan embrionális szöveteket, amelyeket nem lehetséges a lámpázáskor kimutatni, csak feltörés után válnak láthatóvá. A korán elhalt embriók illetve embrionális szövetek éles ollóval történő kimetszése után a mintákat 0,9%-os NaCl oldatba helyeztem a fenotípus meghatározásának idejére, amelyet sztereomikroszkóp (Olympus) segítségével végeztem. A következő fenotípusos kategóriákat alkalmaztam (Abbot és Yee 1975 és Szalay 1989 nyomán): •pozitív fejlődésmenet (positive development - pd): A membránfelületek csak ekto- és endodermális szöveteket tartalmaznak. Vérszigetek nem alakultak ki. • embrió nélküli blasztoderma (blastoderm without embryo - bwe): Ektodermális, endodermális és mezodermális szöveteket lehet megfigyelni. A vérszigetek kialakultak. • elhalt embrió (dead embryo - d1-5): Az inkubáció első öt napja során különböző fejlődési stádiumban elhalt embriók. • abnormális embrió (abnormal embryo - ae): Élő embriók, amelyek rendellenesen fejlődtek, vagy lassú növekedést mutattak. A nagyon korai (megtojás előtt, még a tojócsőben történt) embrióelhalásokat Eyal-Giladi és Kochav (1976) szerint határoztam meg, szintén sztereomikroszkóp segítségével (Olympus).
28
Anyag és módszer Az első kísérlet során, ahol állományvizsgálat történt, kissé eltérő módszert alkalmaztam. A tojásokon hegyes csipesz segítségével kis nyílást vágtam a légkamra fölött. Ezen keresztül injektáltam be 1-2 csepp 0,1%-os kolhicint (C9754 Sigma-Aldrich Chemical Company), majd egy órán keresztül 37 °C-on inkubáltam a tojásokat a mitózisok mennyiségének növelése érdekében a kromoszómavizsgálatokhoz. Ezután történt meg az embriók fenotípusának a meghatározása. A többi kísérletben a korábban ismertetettek szerint jártam el.
3.7. Kromoszómavizsgálat
A minimálisan 16-18 órán keresztül 37,5 °C-on inkubált embriók már tartalmaznak megfelelő számú osztódó sejtet, amelyből kromoszómák mutathatók ki (Sharma és Sharma 1973, Schwarzacher és Wolf 1974, Verma és Balm 1989). Azonban 4-6 napos korban lehet a legjobb eredményeket kapni (Bloom 1978). Ekkorra a légkamra mérete megnövekszik, az embrió pedig közelítőleg ebbe az irányba fordul. Az embriók fenotípusának meghatározása után a mintákat 0,56%-os hipotóniás KCl oldatba helyeztem és 1-2 csepp 0,1%-os kolhicinnel injektáltam a mitózisok arányának növelésére, majd 37,5 °C-on inkubáltam 20 percen keresztül. Végül fixálás következett ecetsav:abszolút etanol - 1:3 arányú keverékének néhányszori cseréjével. Az oldatokat vízlégszivattyú segítségével távolítottam el. A fixált mintákból egy kis részt kimetszettem és 50%-os ecetsavval szuszpendáltam automata pipetta segítségével. 30 mikroliter szuszpenziót közelítőleg 40 °C-ra melegített tárgylemezre helyeztem. A csepp szélének száradása után a maradék mintát a pipetta segítségével mindig továbbvittem, így lemezenként nyolc kört kaptam. A lemezeket a minták egy napos légszárítása után 8 percig friss 2,4%-os Giemsa (G3032 Sigma-Aldrich Chemical Company) foszfát pufferes oldatával festettem, amelyet a következők szerint készítettem:
A oldat: 12,5 g Na2HPO4 x 12H2O, 500 ml-re feltöltve desztillált vízzel B oldat: 4,76 g KH2PO4, 500 ml-re feltöltve desztillált vízzel Munkaoldat: 20 ml A, 20 ml B, 1ml Giemsa oldat, pH = 7,0
Lemezenként legalább 10 osztódást értékeltem 1000x nagyítással Zeiss mikroszkóp segítségével. 29
Anyag és módszer 3.8. Tojáskezelés, inkubáció
A kísérletekhez felhasznált tojásokat naponta háromszor gyűjtötték. Tisztítás után 20 percre UV besugárzásnak tették ki azokat, majd az egyhetes tárolás alatt 15 °C hőmérsékleten, fémtálcákon helyezték el. „Bretagne” típusú keltetőgépben, 37,5 °C-on 80% páratartalom mellett 5 napig inkubálták. A gépek fertőtlenítésére formalint használtak Fumigantmeriel, Désogerme 3A és Virkon márkanevű gomba, baktérium és vírusellenes fertőtlenítőszerekkel kombinálva. A tojásokat az inkubáció ötödik napján, UV lámpával világították át. A normálistól eltérő embrionális fejlődést mutató, vagy üres tojásokat műanyag tojástálcán átszállítottam a kb. 100 méterre lévő laboratóriumba, ahol a feltörésükig 37,5 °C -os termosztátba kerültek.
3.9. Ondóvétel, ondóminősítés, inszeminálás technikája
A spermavétel a gunarak hátának masszázsával kezdődött, az erekció kiváltása után egy kalibrált üvegcsőbe történt. Az ondó koncentrációjának megállapítására spektrofotométert használtam. A higított sperma (50 µl sperma / 2500 ml fiziológiás oldat) optikai denzitás értékét a táblázati értékkel hasonlítottam össze. A motilitást a következő, Artiguèresben használatos skála alapján határoztam meg:
0123456-
nincs motilitás gyenge motilitás javuló motilitás javuló motilitás néhány “előrehaladóval” jó motilitás néhány “előrehaladóval” jó motilitás sok “előrehaladóval” kiváló motilitás sok “előrehaladóval”
A spermamintát a vételt követően azonnal 36 °C-os tárgylemezre helyeztem és 200x nagyítással mikroszkóppal vizsgáltam. A gunarak erekcióját “nagyon jó”, “jó” és “rossz” minősítéssel jellemeztem. Mesterséges termékenyítés során az ondó higítás nélkül, az adott gúnárhoz tartozó tojók között egyenlő arányban elosztva került felhasználásra. Az ondó a tojócsőbe vezetett mutatóujj mellett felvezetett csövön keresztül jutott a tojóba. 30
Anyag és módszer 3.10. Definíciók
Az összes tojás, a termékeny tojások, az elhalt és rendellenes embriók, a kromoszómarendellenességek az elhalt embriókban minden egyes tojó esetében egyedileg feljegyzésre kerültek. A következő fogalmakat határoztam meg: TE: A termékenység mértéke az összes tojás százalékában, ahol a termékeny tojások számát az inkubáció 5. napján történő lámpázáskor határoztam meg, beleértve azokat a korán elhalt embriókat is, amelyek a tojások felbontása után váltak láthatóvá. EM: A korai embrionális elhalás mértéke a termékeny tojások százalékában, ahol az elhalt és rendellenes embriók számát az inkubáció 5. napján történő lámpázás során kiesett tojások feltörése után határoztam meg. KR: A kromoszómális rendellenességek mértéke az elhalt embriókban, százalékban.
3.11. Statisztikai analízis
A termékenység, korai embrionális elhalás és a kromoszómális rendellenességek arányai mint binomiális minták arányai szerepeltek az analízisben. A vonalak vagy a párosítási típusok között a TE-ben, az EM-ben és a KR-ben levő szignifikáns különbségek vizsgálatára klasszikus chi négyzet teszt kontingencia táblázatot alkalmaztam, ahol a kérdés az volt, hogy az arányokban történő változás a vonalaknak, vagy a párosítási típusoknak köszönhető-e (Snedecor és Cochran 1980). Chi négyzet tesztet használtam a gunarak és a gunarakon belül a tojók EM-re gyakorolt hatásásának a kimutatására, a következő biológiai modell alkalmazásával: A termékeny tojásokat embriónak tekintjük, amelyek hím, vagy nőivarú utódok, élők vagy elhaltak. Például, ha az i-dik gúnár elhalt embrióinak a mértéke pi = ai/ni, ahol ai és ni-ai az elhalt és élő embrió utódok teljes létszáma gunaranként, az a cél, hogy megvizsgáljuk, vajon a pi valódi értéke változik-e a gunarakon belül. Ez a hipotézis tesztelhető a χ2=Σ ni (pi -p)2/p(1-p) képlettel, ahol Σ az összege az összes gúnárnak és p az átlagértéke az összes gúnár utódai arányának. Egyszerűen belátható, hogy χ2= [Σ ai2/ni - (Σai)2/Σni]/ p(1-p), a szabadságfok pedig a gunarak száma mínusz 1. Érdekes sajátossága ennek a modellnek, hogy a Chi négyzet összefüggésben van a vizsgált embriók tulajdonságainak (élő, vagy elhalt) az öröklődhetőségével (Robertson és Lerner 1949). 31
Anyag és módszer Ugyanezt a módszert használtam a tojók apai és anyai (az apákon belül) EM-re gyakorolt hatásának a vizsgálatára. Az arányok statisztikai pontossága miatt az elemzésből kizártam azokat a tojókat, amelyeknek ötnél kevesebb termékeny tojásuk volt. Ez a típusú analízis a kromoszómális rendellenességekre nem volt alkalmazható azok kis számú előfordulása miatt. Az EM-t magasabb arányban mutató szelektált tojóknak a TE, EM és KR értékeit a tpróba segítségével hasonlítottam össze a populációs átlaggal (Snedecor és Cochran, 1980). A binomiális eloszlást normál eloszlással közelítve, a t úgy tekinthető, mint eltérés a centrális redukált normál eloszlástól, ahol az átlag 0, a szórás 1. Az EM ismétlődhetőségi koefficiensét a szelektált állatokban a második és a harmadik tojóciklus között a következő modell szerint számítottam: Ykm=µ + αk + ekm , ahol Ykm az m-dik mérése a k-dik egyed teljesítményének, µ a közös átlag, αk a hatása a k-dik egyednek, ahol a várható érték 0 és a variancia Var α, ekm a környezeti hatása az m-dik mérésnek, ahol a várható érték 0 és a variancia Var e. Az ismétlődhetőség az osztályokon belüli összefüggés: Var α/ (Var α+ Var e). A két tojóciklus teljesítménye között az ismétlődhetőség a lineáris korrelációs koefficiens segítségével is mérhető. Mivel az állatok szelektáltak voltak, az ismétlődhetőség alábecsült.
3.12. Ötödik kísérlet - Propídium jodidos festés
A feltört tojásokban szabad szemmel terméketlennek tűnő csírakorongokat kimetszettem. Ehhez először a fehérjét a tenyeremben leválasztottam a sárgájáról. A tojássárgáját egy kis edényben annyi fiziológiás NaCl oldatba helyeztem, hogy éppen ellepje. A csírakorongot egy hegyes és éles olló segítségével körbevágtam, egy műanyag lapátkával 0,9%-os NaCl oldatba helyeztem, kis petricsészébe. Bonctűvel sztereomikroszkóp (Olympus) alatt a csírakorong sejtjeit leválasztottam a szikhártyáról. Összhasonlítottam az Eyal-Giladi és Kochav (1976) által leírt I-VI embrionális fázisokkal. Ezután a sejteket tárgylemezre helyeztem, és propídium jodiddal (PI) (P4170, Sigma-Aldrich Chemical Company) festettem, amely egy nukleinsav-specifikus fluoreszcens festék és az elhalt sejteket mutatja ki. A törzsoldatot 1 mg PI és 4 ml 0,4 SSC felhasználásával készítettem. A festéshez ebből 100 µl-t kivéve 5 ml desztillált vízzel higítottam és 5 µl-t használtam fel ebből az oldatból mintánként. A termékenység meghatározásához fluoreszcens mikroszkópot alkalmaztam (Leica, 500x nagyítás). 32
Anyag és módszer A propídium jodidos festési módszer tesztelésére a következő kísérleteket állítottam be: Első lépésben 132 inkubálatlan, vadas és fehér színű magyar kacsa tojást törtem fel, amelyek Gödöllőről, a Kisállattenyésztési és Takarmányozási Kutatóintézet állományából származtak. A feltört tojásokban szemre biztosan termékenynek látszó csírakorongok közül 50 darabot, valamint az összes szemre bizonytalannak látszót és a biztosan terméketlennek tűnőket festettem meg. Ezt követően 160 inkubált, lámpázáskor „terméketlennek” minősített tojás csírakorongját festettem meg. Ehhez a pézsmaréce és kacsa (Cairina moschata és Anas platyrhynchos) keresztezéséből származó tojásokat használtam fel, amelyek Sásdról, a Búzakalász MgTsz keltetőjéből származtak, az inkubáció 7. napján végzett lámpázás után. A festést és a vizsgálatot a fent leírtak szerint végeztem el.
33
Eredmények 4. EREDMÉNYEK
4.1. Első kísérlet
Csak azoknak a tojóknak az adatait használtam fel az értékelésénél, amelyek legalább egy termékeny tojást tojtak, mivel a cél az embrionális elhalás és a kromoszómális rendellenességek meghatározása volt, amely csak ebben az esetben mutatkozhat meg. A három vonal erősen különbözött a termékenység és az embrionális elhalás aránya tekintetében, de nem különbözött a kromoszóma-rendellenességek aránya esetében (4/1. táblázat). A termékenység a 7-es vonalban volt a legmagasabb (78,3%) és alacsonyabb a 4-es (56,4%), valamint a 9-es vonalban (57,3%). Az embrionális elhalás átlagos előfordulása mérsékelt volt. A legmagasabb a 4-es vonalban (9,4%), a legalacsonyabb a 7-es vonalban (5,2%), és a kettő közötti a 9-es vonalban (7,3%). A kimutatott kromoszómális rendellenességek előfordulása mindhárom vonalban alacsony volt, átlagosan az elhalt embriókra vetítve a 4-es vonalban 8,0%, a 7-es vonalban 14,8%, a 9-es vonalban 13,1%. Az összes kromoszómális rendellenesség
számbeli
eltérést
mutatott:
haploid,
triploid,
mozaikos
vagy
kiméra
haploid/diploid, diploid/triploid, diploid/poliploid kariotípusokat találtam (4/1., 4/2., 4/3. kép). A 4/1. ábra mutatja a különféle abnormális kariotípusok eloszlását a három vonalban. A diploid/poliploid vegyes kariotípus volt a leggyakoribb.
4/1. táblázat: A termékenység % (TE) a korai embrionális elhalás % (EM) és a kromoszóma-rendellenességek az elhalt embriók százalékában % (KR) átlagértékei és szórásai a 4-es, 7-es és 9-es vonalban Összes Tojók Tojóciklus inkubált Vonal létszáma tojás 4 70 1. 964 7 119 2. 2578 9 89 1. 2047
TE x ±s
EM x ±s
KR x ±s
56,4 ± 1,6 78,3 ± 1,8 57,3 ± 1,1
9,4 ± 1,2 5,2 ± 0,5 7,3 ± 0,7
8,0 ± 3,8 14,8 ± 3,5 13,1 ± 3,6
χ2 teszt: A három vonal közötti különbségek erősen szignifikánsak voltak a TE és EM tekintetében, de nem mutattak szignifikáns különbséget a KR-ra nézve.
35
Eredmények 4/1. ábra: A különféle rendellenes kariotípusok megoszlása a három vonalban
60
százalék
50 40
4-es vonal
30
7-es vonal
20
9-es vonal
10 0 haploid
haploid/diploid
triploid
diploid/triploid
diploid/poliploid
kariotípus
A 4/2. táblázat mutatja a korai embrionális rendellenességek különbségein végzett szignifikancia tesztek szintjeit a családok között és a tojók között a családon belül. A különbségek szignifikancia szintjei szintén láthatók a tojók apái között, illetve a tojók anyái között (a nagyszülői családon belül). Ez egyetlen kivétellel minden esetben szignifikáns volt. A kivételt a 4-es vonalban vizsgált tojók apái esetében számított érték jelentette. A 4/2. és 4/3. ábra az átlagos embrionális elhalási arányok eloszlását mutatja a gunarak és tojók szerint, melyben nagy variabilitás figyelhető meg.
4/2. táblázat: A szabadságfokok száma (D.F.) és a χ2 teszt legnagyobb értékének valószínűsége (p) a gunaraknak, a tojóknak a családon belül, a tojók apjának és anyjának (a nagyszülői családon belül) a korai embrióelhalásra gyakorolt hatásukra nézve a három vonalban 4-es vonal 7-es vonal 9-es vonal D.F. p D.F. p D.F. p gúnár 24 p<0,001 32 p<0,005 23 p<0,05 tojó 25 p<0,05 73 p<0,05 49 p<0,05 tojó apja 9 p>0,05 38 p<0,05 28 p<0,05 tojó anyja 42 p<0,01 81 p<0,05 46 p<0,05 36
Eredmények
4/2. ábra: A korai embrionális rendellenességek eloszlása a családok között a gunarakra vetítve a három vonalban
gunarak megoszlása (%)
30 25 20 4-es vonal
15
7-es vonal 9-es vonal
10 5 0 0-2
2-4
4-6
6-8
8-10
10-12 12-14 14-16 16-18
18-20 20-28
EM tartományok embrióveszteségi kategóriák gyakorisága (%)
4/3. ábra: A korai embrionális rendellenességek arányainak eloszlása a családokon belül azokra a tojókra vetítve, amelyek több mint 5 termékeny tojást tojtak, a három vonalban 50 tojók megoszlása (%)
45 40 35 30
4-es vonal 7-es vonal 9-es vonal
25 20 15 10 5 0 0-2
2-4
4-6
6-8
8-10 10-12 12-14 14-16 16-18 18-20 20-30 30-40 40-
EM tartományok embrióveszteségi kategóriák gyakorisága (%)
37
Eredmények
Az első kísérletben mindhárom vonalban voltak olyan tojók, amelyekben az embrionális elhalások aránya a termékeny tojásokra vetítve a populációs átlag felett volt (4/3. táblázat). A 4es vonalban az összes korai embrionális elhalás 23,4%-át három tojó adta. A 7-es vonalban két tojó mutatott 30%-ot meghaladó embrionális elhalást (5 rendellenes embrió, 31,25% a termékeny tojásainak és 3 rendellenes embrió, 37,5%). A 9-es vonalban két tojó produkált kiemelkedően magas embrionális mortalitást, az egyik 3 elhalt embrióval (37,5%), a másik 5 elhalttal (38,46%).
38
Eredmények 4/3. táblázat: Szelektált tojók termékenysége % (TE), korán elhalt embriói % (EM), kromoszóma-rendellenességei % (KR) és az elhalás fenotípusai TE 4-es vonal 1. tojó 2. tojó 3. tojó 4. tojó 5. tojó 6. tojó 7-es vonal 1. tojó 2. tojó
94,44 45,45 66,67 50,00 54,55 90,00
EM
KR
Fenotípus
17,65 BWE, BWE, D2, PD 40,00 25,00 BWE, BWE, BWE, BWE 28,57 BWE, BWE, D3, D5, PD 25,00 12,50 BWE, BWE, BWE 16,67 BWE, BWE, BWE 22,22 BWE, BWE, D2, AE
72,00 22,22 40,00 37,50 25,00
3. tojó
84,21 31,25
4. tojó 5. tojó 6. tojó 7. tojó 8. tojó 9. tojó 10. tojó
42,31 48,28 80,00 80,00 90,91 92,00 94,44
-
27,27 14,29 7,14 7,14 15,00 5,00 15,00 13,04 17,65 5,88
9-es vonal 1. tojó 54,55 22,22 11,11 2. tojó 47,06 37,50 37,50
D3, D4, PD, PD BWE, BWE, PD BWE, BWE, BWE, AE, AE PD, PD, PD D4, PD BWE, AE, BWE, BWE, BWE BWE, AE, AE, PD, AE, AE BWE, BWE, PD
BWE, BWE, D2, AE PD, BWE, BWE BWE, BWE, BWE, BWE, 3. tojó 56,52 38,46 7,69 BWE 4. tojó 65,63 14,29 PD, AE, AE 5. tojó 30,77 25,00 12,50 D5, D5, PD 6. tojó 65,71 13,04 PD, PD, PD 7. tojó 66,67 16,67 8,33 AE, AE BWE: embrió nélküli blasztoderma PD: differenciálatlan embrionális szövet D1-5: elhalás az inkubáció 1-5. napja között AE: élő, de nem normál fejlődésű embrió
39
Eredmények A 4/4. táblázat mutatja a termékenység, az embrionális elhalások és a kromoszómális rendellenességek átlagát és szórását a szelektált tojókra vetítve a három vonalban.
4/4. táblázat: A termékenység % (TE) a korai embrionális elhalás % (EM) és a kromoszóma-rendellenességek az elhalt embriók százalékában % (KR) átlagértékei és szórásai a vizsgálatok során használt szelektált tojókban
Vonal
Tojók létszáma
4 7 9
6 10 7
Összes inkubált tojás 100 244 184
TE x ±s
EM x ±s
KR x ±s
74,0 ± 4,3 71,7 ± 2,8 55,9 ± 3,6
22,9 ± 4,8 17,7 ± 2,8 22,3 ± 4,1
11,7 ± 7,8 25,8 ± 7,8 34,7 ± 9,9
A 4/5. táblázat mutatja a szelektált tojók (4/4. táblázat) és a kiinduló populációk (4/1. táblázat) átlagos teljesítményének összehasonlításával kapott t-értékeket, a termékenységre, az embrionális elhalására és a kromoszómális rendellenességekre vonatkozóan a három vonalban: az embrionális elhalás szignifikánsan magasabb volt minden szelektált csoportban, mint a kiinduló populációkban, a termékenység szignifikánsan magasabb volt a 4-es vonalból szelektált tojókban, és legalacsonyabb a 7-es vonalból szelektált tojókban. A kromoszómális rendellenesség nem mutatott szignifikáns különbséget a populációs átlaghoz képest a 4-es és 7-es vonalban.
4/5. táblázat: A t-próba értékei, a szelektált tojók átlagos termékenységének (TE) %, korai embrionális elhalásának (EM) %, kromoszóma-rendellenességeinek az elhalt embriók százalékában (KR) % és a populációs átlagnak az összehasonlításakor Vonal 4 7 9
TE t értéke 4,00 -2,28 -0,36
EM t értéke 2,76 4,33 3,66
KR t értéke 0,48 1,39 2,18
40
Eredmények
A 4/4. ábra mutatja az embrionális elhalások fenotípusainak a megoszlását a három vonalban. Az embrionális rendellenességek négy fenotípusa közül a BWE volt a leggyakoribb mindhárom vonalban. Különbségek főként a rendellenes fejlődésű élő embriók (AE) arányában mutatkoztak.
4/4. ábra: Az embrionális elhalások különféle fenotípusainak eloszlása a három vonalban
60
százalék
50 40 4-es vonal 7-es vonal 9-es vonal
30 20 10 0 BWE
D1-5
PD
AE
EM fenotípus
A kromoszómális rendellenességek aránya a PD fenotípusban volt a legnagyobb, melytől alig maradt el a BWE kategória (4/5. ábra). Mindkét esetben a haploid kariotípus volt a leggyakoribb (több, mint 10%, illetve közel 6%) (4/6. ábra). A rendellenesen fejlődő élő embriókban (AE) a triploid és poliploid rendellenesség bizonyult a leggyakoribbnak. A 4/6. ábrán a haploid/diploid kariotípust a haploidokkal, a diploid/triploid kariotípust a triploidokkal, a diploid/poliploid-ot a poliploidokkal összevontan ábrázoltam.
41
Eredmények
4/5. ábra: Kromoszóma-rendellenességek aránya a különféle fenotípusú embrionális elhalásokban a 18 16
a
14 százalék
12
b
b
10 8 6 4 2 0 BWE
D1-5
PD
AE
EM fenotípus
p<0,01
4/6. ábra: Különféle rendellenes kariotípusok aránya a különféle fenotípusú embrionális elhalásokban 12
10
8 százalék
haploid triploid 6
tetraploid poliploid endomitózis
4
2
0 BWE
D1-5
PD
AE
EM fenotípus
42
Eredmények
4/1. kép: Diploid kariotípus
4/2. kép: Haploid kariotípus
4/3. kép: Poliploid kariotípus
43
Eredmények
4.2. Második kísérlet
Az 4/6. táblázat mutatja a termékenység, az embrionális elhalás és a kromoszómális rendellenességek átlagértékét és szórását 4-es vonalból szelektált hat párban, a második tojóciklusukban, 1998-ban. Az embrionális elhalás magas értéke megismétlődött (12,65%), de ez nem volt igaz a kromoszómális rendellenességek magas értékeire (vö. 4/4. táblázat).
4/6. táblázat: A termékenység % (TE) a korai embrionális elhalás % (EM) és a kromoszóma-rendellenességek az elhalt embriók százalékában % (KR) átlagértékei és szórásai a feltételezetten hordozó szülőkre vetítve a 4-es vonalban, a második tojóciklusban Párosítási típus Összes (tojók száma) inkubált tojás cP x cP (6)
107
TE x ±s
EM x ±s
KR x ±s
81,3 ± 3,8
12,7 ± 3,6
5 ± 4,9
A 4/7. táblázat mutatja azoknak az állatoknak és utódaiknak a termékenységére, a korai embrionális elhalásaira és a kromoszómális rendellenességeire számított átlagértékeit és szórásait, amelyeket a 7-es vonalból szelektáltam és öt párosítási típusba osztottam. A termékenység alacsonyabb volt a nem rokon, feltételezhetően hordozó szülőktől származó tojók és gunarak párosításában (F1xnrF1) és a rokonok (F1xrF1) párosításában egyaránt, egyéves ludak esetén. A feltételezhetően hordozó szülők és utódok ismét magasabb embrionális elhalás értékeket mutattak, mint a populációs átlag. Az embrionális mortalitás magas aránya volt megfigyelhető a rokon egyedek párosításakor is, de feltételezhetően az alacsony mintaszám miatt ez nem szignifikáns. A kromoszómális rendellenességek átlagértéke az öt párosítási típusban 9,5% volt. A kromoszómális rendellenességek öröklődése nem volt kimutatható. A kromoszómális rendellenességek néhány pár esetében fordultak elő, de ezek ismétlődése nem volt megfigyelhető (4/6., 4/7. táblázat).
44
Eredmények
4/7. táblázat: A termékenység % (TE) a korai embrionális elhalás % (EM) és a kromoszóma-rendellenességek az elhalt embriók százalékában % (KR) átlagértékei és szórásai a 7-es vonalból szelektált állatokban, a második kísérletben TE x ±s
EM x ±s
KR x ±s
90
21,1 ± 4,3
36,8 ± 11,1a
0
88
18,2 ± 4,1
37,5 ± 12,1ac
33,3 ± 19,2
236
49,2 ± 3,3
12,9 ± 3,1b
6,7 ± 6,4
262
56,9 ± 3,1
19,5 ± 3,2ab
10,3 ± 5,7
83
68,7 ± 5,1
10,5 ± 4,1b
0
Párosítási típus Összes (tojók száma) inkubált tojás F1 x nrF1 (4) F1 x rF1 (4) cP x cP (10) cP x rF1 (13) cP x nrF1 (3) p<0,01
A korai embrionális elhalás ismétlődhetőségi koefficiense 0,54 volt a 7-es vonalban 8 párra számítva (az átlagos tojásmennyiség tojónként 24 volt az első évben és 25 a másodikban) és 0,47 a 4-es vonalban 6 párra számítva (az átlagos tojásmennyiség tojónként 17 volt az első évben és 21 a másodikban). Az embrionális elhalás szülő-utód regresszió alapján 10 párra számított örökölhetőségi értéke 0,7 volt, de ez az érték nem bizonyult szignifikánsnak. A 4/7. ábra mutatja a 7-es vonal 2. és 3. tojóciklusa között számított regressziót, az embrionális rendellenességek százalékban megadott értékeinek arcsin négyzetgyök x transzformációja után (Snedecor és Cochran 1980). A 3. tojóciklusban várható embrionális rendellenesség értékeket, amelyeket a 2. tojóciklus alapján számított, hasonlítja össze a 3. tojóciklusban valóban bekövetkezett embrionális rendellenességek arányával. Ebből is látható, hogy a párok ismétlik az embrionális rendellenességek magas arányát, a szórás azonban nagy.
45
Eredmények 4/7. ábra: A 7-es vonal 2. és 3. tojóciklusa között számított regresszió az embrionális elhalások százalékos adatainak arcsin négyzetgyök x transzformációja után
2. tojóciklus Line Fit Plot 20
3. tojóciklus
18 16 14
3. tojóciklus
12 10
becsült 3. Predicted 3. tojóciklus tojóciklus
8 6 4 2 0 0
5
10
15
20
2. tojóciklus
A három vonalban a kromoszóma-rendellenességek aránya a D1-5 fenotípusban volt a legnagyobb, több mint 14% (4/8. ábra). A haploid kariotípus volt jellemző a BWE, PD és D1-5 fenotípusokban. A rendellenes fejlődésű (AE) embriókban csak triploidokat találtam (4/9. ábra). A 7-es vonalban a PD fenotípus volt a leggyakoribb, míg a 4-esben a D1-5 és PD aránya hasonlóan alakult (4/10. ábra). 4/8. ábra: Kromoszóma-rendellenességek aránya a különféle fenotípusú embrionális elhalásokban a három vonal átlagában 16 14
százalék
12 10 8 6 4 2 0 BWE
D1-5
PD
AE
EM fenotípus
46
Eredmények
4/9. ábra: Rendellenes kariotípusok aránya a különféle fenotípusú embrionális elhalásokban a három vonal átlagában 12 10
százalék
8
haploid triploid tetraploid
6
poliploid endomitózis
4 2 0 BWE
D1-5
PD
AE
EM fenotípus
4/10. ábra: Különféle fenotípusú embrionális elhalások aránya az összes elhalt embrió között a 4-es és a 7-es vonalban 45 40 35
százalék
30 25
4-es vonal 7-es vonal
20 15 10 5 0 BWE
D1-5
PD EM fenotípusa
47
AE
Eredmények 4.3. Harmadik kísérlet
A korai embrionális elhalások aránya minden olyan párosítási típusban magas volt (több, mint 12%), amelyben hordozónak feltételezett tojókat és gunarakat párosítottam. Abban az esetben, amikor nem hordozó gunarakat hordozó tojókkal állítottam párba (ncPxcF1), az embrionális rendellenességek aránya mindössze 7,46% volt, amely szignifikánsan kevesebb a többi párosításban kapott EM értéknél, kivéve a cPxcP (hordozó gúnár x hordozó tojó) típust. Abban a párosításban, amelyben a gúnár feltételezhetően hordozó volt, míg a tojó nem (cPxncP), az EM értéke nem különbözött szignifikánsan azoktól, ahol a tojót is hordozónak feltételeztem (cPxcP, cF1xcP, cF1xcF1, cPxcF1)(4/8. táblázat).
4/8. táblázat: A termékenység % (TE) és a korai embrionális elhalás % (EM) átlagértékei és szórásai a harmadik kísérletben, természetes pároztatás alkalmazásával TE EM Párosítás típusa Összes (tojók száma) inkubált tojás x ±s x ±s cP x cP 80 72,50 ± 4,8 13,78 ± 4,5a (3) cP x ncP 118 51,69 ± 4,6 26,23 ± 5,6b (6) cF1 x cP 43 55,81 ± 7,6 20,83 ± 8,3abc (2) cF1 x cF1 53 43,40 ± 6,8 34,78 ± 9,9bc (2) cP x cF1 72 65,28 ± 5,6 25,53 ± 6,3bc (4) ncP x cF1 252 79,76 ± 2,5 7,46 ± 1,8ad (12) p<0,01
A 4/9. táblázat mutatja a termékenység és az embrionális elhalás alakulását a különféle párosításokban mesterséges termékenyítés alkalmazása mellett. A hordozó szülőktől származó szintén hordozónak feltételezett gunarak és tojók (cF1xcF1) párosításának embrionális mortalitás értéke szignifikánsan különbözött a többi párosítástól, kivéve, ahol hordozó szülőktől származó hordozó gunarat párosítottam a szülői nemzedékből származó, de nem rokon tojóval (cF1xcP). Azok a párosítások, amelyekben a tojó hordozó szülőktől származó hordozó (cF1) volt, a termékenység szignifikánsan alacsonyabbnak bizonyult a többitől. 48
Eredmények
4/9. táblázat: A termékenység % (TE) és a korai embrionális elhalás (EM) % átlagértékei és szórásai a harmadik kísérletben, mesterséges termékenyítés alkalmazásával TE EM Párosítás típusa Összes (tojók száma) inkubált tojás x ±s x ±s cP x cP 40 55,00 ± 7,9ab 31,82 ± 9,9b (2) cP x cF1 73 49,32 ± 5,9a 22,22 ± 6,9b (4) cF1 x cP 95 63,16 ± 4,9b 16,67 ± 4,8ab (4) cF1 x cF1 202 48,51 ± 3,5a 9,18 ± 2,8a (9) p<0,01
A különféle típusú embrionális rendellenességek közül a PD bizonyult a legmagasabb arányúnak mind a mesterséges termékenyítés, mind a természetes párosítás során (4/11. és 4/12. ábra). A BWE fenotípus egyáltalán nem volt kimutatható. Mesterséges termékenyítés során a gunarak erekciója a „nagyon jó” kategóriába tartozott, a motilitás 1 és 3 között volt és átlagosan 0,3 ml spermát adtak ejakulátumonként (4/10. táblázat).
4/10.
táblázat: A mesterséges termékenyítésben szereplő spermamennyisége, valamint a motilitás és erekció minősítése gúnár száma (n) 7
49
átlagos motilitás 2,3
sperma mennyisége /ejackulátum (ml) 0,3
gunarak
erekció nagyon jó
átlagos
Eredmények
4/11. ábra: Különböző fenotípusú embrionális elhalások aránya az összes elhalt embrió között, mesterséges termékenyítés alkalmazása során
c
60
százalék
50 40
b
30
a
20 10 0 BWE
D1-5
PD
AE
EM fenotípus
p<0,01
százalék
4/12. ábra: Különböző fenotípusú embrionális elhalások aránya az összes elhalt embrió között, természetes párosítás során 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0
c
b BWE
D1-5
a PD
AE
EM fenotípus
p<0,01
50
Eredmények 4.4. Negyedik kísérlet
A 4/11. táblázat mutatja a termékenység és az embrionális elhalás értékeit 2000-ben, mesterséges termékenyítés alkalmazásával kétféle párosítási típus vizsgálatakor. A termékenység és az embrionális mortalitás értékek tojónként számított átlagok. Az EM mindkét esetben magas volt. A két párosítás EM és TE értékei között nem lehetett szignifikáns különbséget kimutatni. A harmadik kísérlet cF1xcF1 párosításában szereplő állatok azonosak voltak a negyedik kísérlet egyedeivel. Az előző évhez képest az EM szignifikánsan magasabb volt, míg a TE nem különbözött jelentősen. Az előző kísérlet hordozó szülőitől származó tojók és gunarak párosítása (F2xF2) is szignifikánsan különbözött az EM tekintetétben az előző év cF1xcF1 párosításához képest.
4/11. táblázat: A termékenység % (TE) és a korai embrionális elhalás % (EM) átlagértékei és szórásai a negyedik kísérletben, mesterséges termékenyítés alkalmazásával Párosítás típusa (tojók száma) cF1 x cF1 (10) F2 x F2 (9)
Összes inkubált tojás
TE x ±s
EM x ±s
300
50,00 ± 2,9
13,33 ± 2,8
258
57,36 ± 3,1
12,16 ± 2,7
Az embrionális rendellenességek fenotípusa tekintetében a PD és D1-5 kategóriák szignifikánsan magasabb arányban voltak jelen. A tojócsőben történő elhalás vizsgálata ebben a kísérletben vált indokolttá. Az ilyen típusú, nagyon korai embrionális elhalás aránya 10% volt a cF1xcF1 párosításban, míg 11,2% az F2xF2 párosításban. Élő, rendellenes embrió (AE) nem volt kimutatható egyik esetben sem (4/13. és 4/14. ábra).
51
Eredmények
százalék
4/13. ábra: Különféle típusú embrionális mortalitások aránya az összes embrionális rendellenesség között a cF1xcF1 párosításban 50 45 40 35 30 25 20 15 10 5 0
b b
a a nagyon korai elhalás
BWE
D1-5
PD
AE
EM fenotípus p<0,01
százalék
4/14. ábra: Különféle típusú embrionális mortalitások aránya az összes embrionális rendellenesség között az F2xF2 párosításban 50 45 40 35 30 25 20 15 10 5 0
b b
a
a
nagyon korai elhalás
BWE
D1-5
PD
AE
EM fenotípus p<0,01
52
Eredmények A 4/15. ábra mutatja a kétféle párosítási típusban szereplő gunarak ondójának átlagos koncentrációját inszeminációnként. A hároméves gunarak (cF1xcF1) kevesebb, míg az egyéves gunarak (F2xF2) több spermát adtak. A sperma termékenyítőképessége az előbbi esetben jobbnak bizonyult, mint a fiatal állatoknál, bár a tojók termékenységében egyes gunaranként is nagy szórás mutatkozott (4/17. és 4/18. ábra). Az átlagos motilitás 2,4 volt (1 és 4 között mozgott), míg az erekció mindig „nagyon jó” kategóriába tartozott (4/12. táblázat).
4/15. ábra: A cF1xcF1 és az F2xF2 párosításban szereplő gunarak átlagos spermium koncentrációja (millió ondósejt / ejakuláció) az inszeminációk napján 200
millió ondósejt / ejakulátum
180 160 140 120 cF1 átlag
100
F2 átlag
80 60 40 20
,2 7
,3 0 IV ,1 0 IV ,1 3 IV ,1 7 IV ,2 5 IV ,2 7 V, 15
III
III
,2 3 III
,2 0 III
III ,6
III ,2
4
7
4
8 II, 2
II, 2
II, 1
II, 1
II, 1
1
0
inszemináció dátuma
4/12. táblázat: Az átlagos motilitás és az erekció minősítése a cF1xcF1, valamint az F2xF2 párosítási típusban cF1 x cF1 átlagos motilitás erekció átlagos motilitás erekció 53
2,5 nagyon jó F2 x F2 2,2 nagyon jó
Eredmények 4/16. ábra: Az átlagos termékenység alakulása tojónként (%) a tojóciklus egésze alatt inszeminált átlagos spermiumkoncentráció függvényében a cF1xcF1 párosítási típus esetén 90 termékenység (%)
80 70 60 50 40 30 20 10 0 0
20
40
60
80
100
ondósejt (millió)
termékenység (%)
4/17. ábra: Az átlagos termékenység alakulása tojónként (%) a tojóciklus egésze alatt inszeminált átlagos spermiumkoncentráció függvényében az F2xF2 párosítási típus esetén 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 0
50
100
150
ondósejt (millió)
A sperma minőségi mutatói közötti egyedi, illetve generációs különbségek nem hatottak sem a termékenységre, sem az embrionális mortalitás arányára.
54
Eredmények 4.5. Ötödik kísérlet Mivel az igen korai embrionális elhalások vizsgálata során a festetlen csírakorongok sztereomikroszkópos vizsgálattal történő megítélése sokszor bizonytalan, ezért célszerűnek látszott a csírakorongok festését is elvégezni. A terméketlen csírakorongon nagy vakuólumok láthatók, ami a termékenyre nem jellemző (4/4. kép). Amennyiben a csírakorong termékeny volt, a propídium jodid hatására a sejtmagok fényesen világítottak (4/5. kép). A 132 inkubálatlan kacsatojás 72%-a volt termékeny. A fennmaradó 28%-nak 1/3-a terméketlen volt, míg 2/3-a szemre bizonytalan. A propídium jodidos festéssel a bizonytalan tojások 41%-a bizonyult termékenynek (9/22). 50 db szemre termékenynek látszó csírakorong festéssel is kivétel nélkül termékenynek bizonyult. Az a 160 csírakorong, amely az inkubáció 7. napján végzett lámpázás során, valamint feltörés után szemre is terméketlennek látszott, festéssel 25%-ban termékenynek bizonyult.
A
B 4/4. kép: Termékeny (A) és terméketlen (B) csírakorong sztereomikroszkópos képe (80x)
4/5. kép: Termékeny csírakorong képe propídium-jodidos festés után (500x) 55
Eredmények 4.6. Megfigyelt tipikus megjelenésű elhalási formák
Vizsgálataim során két, jól meghatározható, tipikus megjelenésű, visszatérő elhalási formát találtam. Az egyik egy vérgyűrűs mutáció, amely az inkubáció 2-3. napján okoz embrionális elhalást és Savage et al. (1988) recesszív letális tulajdonságként határozták meg, elsőként pulykában (4/6. kép). A másik egy körülbelül 5 mm átmérőjű, degenerált blasztoderma, amelyet fehér gyűrű, azon belül pedig vérgyűrű vesz körül (4/7. kép). Egy, az inkubáció 2-3. napján elhalt embriót lehetett belőle kipreparálni, amely csak sztereomikroszkóp segítségével volt lehetséges. Az embrió szemlencséje már kialakult, az agya nem differenciálódott az erre az időszakra jellemző mértékben, 27 pár somitát lehetett megkülönböztetni (4/8. kép). Csak egyetlen tojó produkálta ezt a rendellenességet, amely a termékeny tojások több mint 25%-ban (14/4) okozott veszteséget.
4/6. kép: Vérgyűrűs elhalás az inkubáció harmadik napján (2,5x)
56
Eredmények
4/7. kép: Degenerált, kb. 0,5 cm átmérőjű blasztoderma, amelyen fehér gyűrű és vérgyűrű is látható (2x)
4/8. kép: Degenerált blasztodermából kipreparált embrió (80x)
57
Eredmények 4.7. Az embrionális elhalás fenotípusai
Az Abbot és Yee (1975), valamint Szalay (1988) által leírt és alkalmazott kategóriák az embrió fenotípusának leírására jól használhatók, de a gyakorlati munka során gyakran lehet találkozni az egyes kategóriákon belül jellemző változatokkal.
4.7.1. Embrió nélküli blasztoderma (BWE - blastoderm without embryo) változatai 1. Blasztoderma átmérője közelítőleg 3 cm • Vérgyűrű - egyik oldalon egybefüggő vércsík, másik oldalon nincs vér, vagy vérpettyes (4/13., 4/16. kép). • A blasztoderma középső részén az area pellucida teljesen áttetsző, nem tartalmaz embriót. Körülötte egyenletesen vérpettyes (4/9. kép). • Mint az előző, de az area pellucida közepén megfigyelhető az embrionális burok, embrió nélkül, esetleg egy szív, szintén embrió nélkül (4/11., 4/12. kép). • Nem található áttetsző rész, az egész felület egybefüggő, egyenletesen vérpettyes, vagy véreres (4/14., 4/17. kép). 2. Blasztoderma átmérője 0,5-1 cm • Vérgyűrű, a felületen áttetsző rész nem figyelhető meg. • Vérgyűrű, a felület közepén áttetsző rész figyelhető meg (4/15. kép). • A blasztoderma középső részén az area pellucida teljesen áttetsző, nem tartalmaz embriót. Körülötte egyenletesen vérpettyes (4/10. kép).
4/9. kép: Embrió nélküli blasztoderma, ahol jól megkülönböztethető az „üres” area pellucida és az area opaca (40x) 58
Eredmények
4/10. kép: Embrió nélküli blasztoderma (2,5x)
4/11. kép: Embrió nélküli blasztoderma, amelyben szövetburjánzás figyelhető meg, de differenciálódott embrionális szervek nem (40x)
59
Eredmények
4/12. kép: Embrió nélküli blasztoderma, amelyben szövetburjánzás figyelhető meg, de differenciálódott embrionális szervek nem (80x)
4/13. kép: Embrió nélküli blasztoderma, amely vérszigeteket tartalmaz. Az area opaca és area pellucida egyneműnek látszik (2x)
60
Eredmények
4/14. kép: Embrió nélküli blasztoderma, amely vérszigeteket tartalmaz. Az area opaca területén is opálos, átlátszatlan rész figyelhető meg (2,5x)
4/15. kép: Embrió nélküli blasztoderma, amely kb. 0,5 cm átmérőjű. Vérszigeteket tartalmaz, megkülönböztethető benne az area pellucida és az area opaca (4x)
61
Eredmények
4/16. kép: Embrió nélküli blasztoderma, amely körül vérgyűrű látható (2x)
(Fotó: Dr. Hidas András) 4/17. kép: Hálószerűen vérerekkel átszőtt, embriót nem tartalmazó blasztoderma (1x)
62
Eredmények 4.7.2. Differenciálatlan embrionális szövet (PD - positive development) változatai A csírakorong közepétől csillag alagban haladva fehér szövet indul növekedésnek, élesen elhatárolható fehéres lepelt képezve a sárgáján. Vér nem található benne. Mérete szerint lehet: • egy normál fejlődésmenetű blasztoderma átmérőjének megfelelő (~ 3 cm) (4/18., 4/19. kép) • megközelítőleg 1 cm átmérőjű (kis PD) • boríthatja csaknem a sárgája teljes felületét (nagy PD) (4/20. kép).
4/18. kép: Differenciálatlan embrionális szövet csillag alakban (1,3x)
4/19. kép: A differenciálatlan embrionális szövet 1-2 réteg vastagságú sejtsorokból áll (80x) 63
Eredmények
4/20. kép: Differenciálatlan embrionális szövet, amely a sárgája nagy részét borítja (40x)
4.7.3. Rendellenes fejlődésű embrió (AE - abnormal embryo) változatai Élő embrió, amely méretében, fejlettségi fokában elmarad a normál embriótól. • • •
Az embrió ugyanabban az embrionális fázisban van, mint a normál fejlődésmenetű, de méretében kisebb (4/21. kép). Az embrió fejlődésmenete normális, de lassúbb, mint a normál embriónak, nincs ugyanabban az embrionális fázisban (4/23. kép). Az embrió torz. Hiányozhat a szem, torz szív, fej, agykezdemény hiánya, stb. (4/22. kép)
64
Eredmények
4/21. kép: Lassú fejlődésű embrió (2x)
4/22. kép: Torz, élő embrió. Szem nem alakult ki, a szív a testen kívül dobog, az agy differenciálatlan (80x)
65
Eredmények
4/23. kép: Lassú fejlődésű embrió (80x)
4.7.4. Embrionális elhalások az inkubáció 1-5. napján (D1-5 - embryonic death on the 15thday of the incubation)
Az embrióelhalás időpontját úgy lehet megállapítani, hogy a normál fejlődésmenetű embrióhoz hasonlítom az elhalt embriót, valamint megvizsgálom, hogy mely szervek fejlődtek ki az adott időpontra. A szomiták száma is segít a meghatározásban. Hibaként jelentkezhet, hogyha lassú fejlődésű embrió halt el, mivel ezt korábbi elhalásként lehet meghatározni, mint az valójában történt. • • • •
Blasztoderma szélén vérgyűrű található (4/31. kép). Nem található vérgyűrű (4/24., 4/25., 4/26. kép). Egyik oldalon vércsík, másik oldalon pontozottan határolt (4/32, 4/33. kép). Az embrió körül egyenletesen vérpettyes (4/27, 4/28., 4/29., 4/30. kép).
66
Eredmények
4/24. kép: Emrióelhalás az inkubáció első napján (2x)
4/25. kép: Az inkubáció 33. órájában elhalt embrió (40x)
67
Eredmények
4/26. kép: Az inkubáció 33. órájában elhalt embrió. Megjelent a szemtelep, az agyvelő, 8 pár szomita. Látható a gerinchúr és még az őscsík (80x)
4/27. kép: Az inkubáció második napján elhalt embrió. A blasztoderma átmérője kicsi, kb. 2cm (1x)
68
Eredmények
4/28. kép: Az inkubáció 3. napján elhalt, torz embrió (80x)
4/29. kép: Az inkubáció 3. napján elhalt embrió, a blasztodermán vérszigetekkel (2,5x)
69
Eredmények
4/30. kép: Az inkubáció 3-4. napján elhalt embrió, a blasztodermán vérszigetekkel (2x)
4/31. kép: Az inkubáció 4. napján elhalt embrió, vérgyűrűvel (3x)
70
Eredmények
4/32. kép: Az inkubáció 4. napján elhalt, torz embrió (80x)
4/33. kép: Az inkubáció 4. napján elhalt embrió (3x)
71
Eredmények 4.7.5. Ikrek
Blasztoderma középső részén 2, 3 esetleg 4 embrió található. Az elhalás általában az inkubáció 2. vagy 3. napján következik be. Az embriók lehetnek egyforma méretűek és fejlettségűek, vagy egyik lehet torz (két farok, deformált fej), valamint lehetséges teljes testfelületükön összenőtt ikrek kialakulása is.
4/34. kép: Az inkubáció 2-3. napján elhalt ikrek (2x)
4/35. kép: Az inkubáció 2-3. napján elhalt ikrek (80x) 72
Eredmények
4/36. kép: Hármasikrek (80x)
4/37. kép: Teljes testfelületükön összenőtt ikrek (80x)
73
Eredmények
4/38. kép: Az inkubáció 3-4. napján elhalt ikrek (4x)
74
Eredmények 4.8. Új tudományos eredmények 1. Megállapítottam, hogy a korai embrionális elhalás aránya a termékeny tojások százalékában szignifikánsan különbözött egymástól a húshasznosítású (9,4%), a szaporaságra szelektált (5,2%) és a kettő keresztezéséből kialakított májhasznosítású (7,3%) lúdvonalakban. 2. Megállapítottam, hogy a kromoszóma-rendellenességek aránya az elhalt embriókban a húshasznosítású lúdvonalban 8,0%, a szaporaságra szelektáltban 14,8% és a kettő keresztezéséből
kialakított
májhasznosítású
vonalban
13,1%
volt.
Az
összes
kromoszómális rendellenesség számbeli eltérést mutatott: haploid, triploid, valamint vegyes (mozaikos vagy kiméra) haploid/diploid, diploid/triploid, diploid/poliploid kariotípusokat találtam. 3. Minden vonalban találtam olyan családokat, egyedeket, amelyek a populációs átlaghoz képest szignifikánsan magasabb arányban produkáltak elhalt embriókat. A nagyobb arányú embrionális elhalás kialakulása ismétlődik az erre hajlamos egyedeknél a következő szaporodási ciklusokban is, ami arra utal, hogy a magas embrionális elhalás örökletesen továbbvihető a lúdállományban. 4. A gunarak és tojók egyaránt felelősek a korai embrionális elhalás kialakításáért, bár a gunarak szerepe jelentősebbnek látszik. 5. Elsőként alkalmaztam propídium jodidos festést az inkubált tojások szabad szemmel terméketlennek látszó csírakorongjainál az igen korai, még az oviductusban történő embrionális elhalások meghatározására. 6. Elsőként adtam átfogó, színes illusztrációs áttekintést lúdban a korai embrionális elhalások és rendellenességek fenotípusairól. Jelentősen továbbfejlesztettem az Abbot és Yee (1975) által kidolgozott és Szalay (1989) által módosított rendszert, az eddigi 4 fő típus mellett mintegy 18 változatot írtam le. Ilyen jellegű munka még nem jelent meg a szakirodalomban. 7. Elsőként írtam le a blasztoderma gyűrűs degenerációját lúdban, amely az embrió elhalásához vezet az inkubáció második – harmadik napján. 75
Következtetések és javaslatok 5. KÖVETKEZTETÉSEK ÉS JAVASLATOK
5.1. Eredmények értékelése és következtetések
5.1.1. Első kísérlet
Három vonal teljes populációra kiterjedő vizsgálatát végeztem el a pedigré keltetés során, 2848 tojás feltörésével és értékelésével. A kísérlet célja az volt, hogy megbecsüljem a korai embrionális és kromoszómális rendellenességek előfordulását és megvizsgáljam ezek genetikai hátterét lúdban. Ezért az elemzésekben azoknak a tojóknak az adatait használtam fel, amelyek legalább egy termékeny tojást tojtak. Ismeretes, hogy a háremszerű pároztatási rendszerekben, mint például a pedigré tartás, általában a termékenység alacsonyabb, mint a szabad, természetes párzás során lehetséges, valamint, hogy a két - három éves ludak magasabb fertilitásúak, mint az elsőéves madarak (Rosinski és Bednarczyk 1997). A 7-es vonal mutatta a legmagasabb fertilitást és a legalacsonyabb mortalitást, a 4-es vonal mutatta a legmagasabb embrionális mortalitási arányt (csaknem kétszerese a 7-es vonalban tapasztaltnak). A három vonal nem mutatott különbséget a kromoszómális rendellenességek tekintetében, amely 8,0-14,8% volt az elhalt embriókra és igen alacsony, 0,76-0,95% a termékeny tojásokra vetítve. A korai embrionális rendellenességek aránya (5,2-9,4%) közepesnek mondható. Ezek az adatok hasonlóak a Rosinski és Bednarczyk (1997) által találtakhoz, két szelektált fehér olasz vonalban. Az eredményeik azt mutatták, hogy a WD-1 vonalban (tojásra szelektált) az EM aránya, amelyet az inkubáció 6. napjáig néztek, alacsonyabb volt (6,0-6,3%), mint a WD-3 vonalban (7,6-7,7%), amelyet húsra szelektáltak. A 7-es vonalat két, szaporaságra és májtermelésre szelektált szürke landesi vonalból alakították ki (Rouvier et al. 1990). Ez magyarázhatja a magasabb szaporodási képességet a hústermelésre szelektált 4-es vonalhoz képest (Larzul et al. 2000). Csirkében kimutatták, hogy az embrionális elhalások hátterében gyakran genetikai rendellenességek állnak (Savage et al. 1988, 1992, Somes és Smyth 1967, Zartman és Smith 1975). A rendellenes embrionális fejlődés okozója kromoszómális rendellenesség is lehet (Abbot és Yee 1975, Thorne et al. 1985). Az általam kapott eredmények alapján ez nem áll fenn jelentős mértékben a vizsgált állományok esetében. A házityúkkal ellentétben, itt csak az embrióelhalások 77
Következtetések és javaslatok kis része volt kromoszómális rendellenességekre visszavezethető. Az összes elhalt embrió 12,77%-ában (30/235) volt kromoszóma-rendellenesség kimutatható. Mindhárom vonalban a diploid/poliploid kariotípus volt a leggyakoribb. Ezt a rendellenességet haldokló, öregedő szövetekben is kimutatták (Imreh 1986). Mivel a tojásokat 5 nap inkubáció elteltével törtem fel, elképzelhető, hogy ez a kariotípus már az embrióelhalás után jelent meg. Lehetséges, hogy ez a kromoszóma-rendellenesség nem minden esetben az elhalás okaként alakult ki, hanem az elhalás következményeként is létrejöhetett. A minták egy része nem volt értékelhető, technikai problémák, valamint rossz minőségű osztódások miatt. A kromoszóma-rendellenességek előfordulásáról csak kevés adat áll rendelkezére lúdban. Szalay (1989) 3,37% rendellenes kariotípust írt le rajnai lúdvonalakban. Szürke landesi és magyar fehér lúd esetében a kromoszóma-rendellenességek aránya 16% volt az elhalt embriókban (Liptói és Hidas 1997). Klein és Saar (1992) 18% kromoszóma-rendellenességet írt le hús típusú lúdembriókban. Ismeretes, hogy az embrionális elhalás környezeti tényezőktől is függ, úgy mint a tojás fertőzöttség, a tárolás és az inkubáció körülményei (Fasenko et al. 1992, Fasenko et al. 2001, Kuurman et al. 2002, Bakst és Akuffo 1999, Bakst 1996, Bogenfürst 1989). Ugyanolyan környezeti feltételek között vizsgálva az összes tojást, feltételezhető, hogy az embrionális mortalitás családok közötti különbsége egyéb genetikai, de nem kromoszómális szintű defektus hatása. Vizsgálataimban néhány teljes- és féltestvér család nagyobb arányban mutatta az embrionális elhalást, mint a többi. Például, a 7-es vonalban a fél- és teljestestvér családok összehasonlításában a legmagasabb EM érték 20,69%, illetve 24% volt, ami az elhalások halmozódását mutatta ebben a rokoni körben. Mindhárom vonalban egyedi szinten is, néhány tojó kimagasló EM értéket mutatott. A 4-es vonalban az összes embrionális elhalás 23,4%-át három tojó produkálta. A 7-es vonalban két tojó mutatott nagyon magas embriómortalitást (5, illetve 3 elhalt embrió, 31,25%-os és 37,5% EM). A 9-es vonalban két tojó mutatott kiemelkedő EM-t, az egyik 37,5%-t, míg a másik 38,46%-t. A gunarak és tojók hatásának vizsgálata az EMre azt mutatta, hogy mindkettő örökítheti az embriómortalitást. Ezt magyarázhatja a gunarak és tojók közötti variabilitás (4/2. és 4/3. ábra).
78
Következtetések és javaslatok 5.1.2. Második kísérlet
A kísérlet célja az volt, hogy megvizsgáljam, ismételik-e a hordozónak minősített egyedek a magas embrionális elhalás és kromoszómális rendellenesség értékeket, illetve az utódaik is kialakítják-e ezeket a tulajdonságokat. Azok a tojók és gunarak, amelyeket hordozónak minősítettem a fokozott embrionális elhalásra való hajlamra nézve, ismételten párosítva újból mutatták a magas EM értékeket. Az EM szülő-utód regresszió alapján számított örökölhetőségi értéke rendkívül nagy volt (0,7), de nem szignifikáns. Tíz párra lehetett meghatározni és ismétlésére a későbbiekben nem volt mód. Nagyobb egyedszám és ismétlés esetén elképzelhető, hogy szignifikáns értéket kapok. A nagy érték talán annak köszönhető, hogy ez már rendellenességre, magas embriómortalitásra szelektált állományban vizsgáltam, így az ott jelenlevő nagy negatív hatású gének okozzák. Egy átlagos populáció esetén, ahol ezek ritkán fordulnak elő, az EM öröklődési értéke is lényegesen alacsonyabb. Thorne et al. (1985) kimutatták, hogy a KR szignifikánsan magasabb arányban található a PD (50%) kategóriában az elhalt embriók között és a BWE-ben (30%) ausztrál házityúk vonalakban. Szalay (1989) szerint is hasonló a tendencia. Hu et al. (1997) azt találták, hogy a D4 és D5 kategóriák a leggyakoribbak kacsában. Vizsgálataim szerint lúdban a kromoszómális rendellenességek aránya hasonlóan alakult, a D1-5 fenotípusban volt a legmagasabb. A kromoszómális rendellenességek ismétlődése nem volt megfigyelhető. A lányokat saját apjukkal párosítva, szintén magas EM-t mutattak (13 tojó és 253 tojás alapján). Úgy tűnik, hogy a hordozó apák nőnemű utódai hordozhatják az embriómortalitás kialakítására való hajlamot. Ez az eredmény nem valószínű, hogy a közeli rokontenyésztés következménye, mivel ez más baromfifajokhoz viszonyítva kevesebb kockázattal jár lúdban. A szoros rokontenyésztés megfelelő szelekció mellett három évig nem okoz a termelési eredményekben és az életképességben leromlást (Bogenfürst 1992). Beltenyésztés során a korai embrionális rendellenességek aránya nem mutatott szignifikáns különbséget a normál szelekcióval tenyésztett állatokhoz képest pulykában, de a késői embrionális rendellenességek száma emelkedett, valamint a keltethetőség is csökkent (Shook et al. 1971). A beltenyésztés és korai embrionális elhalás kapcsolatáról hasonlóan számoltak be Hagger et al. (1986). A szoros rokontenyésztést azért alkalmaztam ebben az esetben, hogy a rendellenességek, amennyiben genetikai alapjuk lehet, erőteljesebben manifesztálódjanak, megkönnyítve ezzel az értékelést. 79
Következtetések és javaslatok Egyéves tojók és egyéves gunarak párosításakor a TE alacsony (19,66% !), az EM magas (37,14%) értéket mutatott. Ez azt jelentheti, hogy a feltételezetten magas embrionális mortalitást hordozó (12%<) apák hímivarú utódai hordozói lehetnek az embriómortalitás kialakításának, alacsony fertilitással párosulva.
5.1.3. Harmadik kísérlet
A kísérlet célja egyrészt az volt, hogy megvizsgáljam, vajon a tojók és gunarak egyforma mértékben felelősek-e a magas arányú embrionális mortalitás kialakításáért, másrészt a hordozó szülők hímivarú utódainak tesztelését végeztem, nagyobb egyedszám alkalmazásával, annak megállapítására, hogy ismétlik-e az alacsony fertilitás és magas embrionális mortalitás arányokat. Természetes pároztatás alkalmazásával a hordozónak minősített párok továbbra is magas arányban mutatták az embrionális mortalitást (13,79 - 25,53%). Azokban az esetekben, amikor a hordozó gunarakat párosítottam nem hordozó tojókkal, az EM magas volt (26,23%). Nem hordozó gunarakat hordozónak minősített tojókkal párosítva az EM alacsony volt, 7,46%, amely hasonló a kiinduló populáció normálisnak mondható EM arányához. Ez az eredmény arra enged következtetni, hogy az EM kialakításában a hímnemnek nagyobb a szerepe, mint a nőivarnak. A termékenység vizsgálata mesterséges termékenyítés alkalmazásával válik objektívvé, mivel ezzel a módszerrel kizárható, hogy a gunarak „rangsorolják” a tojókat, ami természetes pároztatás során, hárem rendszerű tartásban gyakran előfordul (Rouvier 1991). Behr és Hartman (1992) nem találtak különbséget az elhalt embriók arányát illetően a mesterséges termékenyítés és természetes pároztatás között, amely 10% alatt alakult mindkét esetben lúdban. A vizsgálat során az ejakulációnkénti átlagos spermamennyiség 0,3 ml körül alakult, amely megegyezik a más szerzők által közölt adatokkal (Chelmonska és Lukaszewicz 1995). A hordozó szülők utódait ismételten párosítva (tehát ezek az egyedek a második tojóciklusukban voltak) a TE alacsony volt (48,51%) de az EM is alacsony értéket mutatott (9,18%). Ez az előző kísérlethez képest meglepő eredmény azt a kérdést vetette fel, hogy a nagyszámú terméketlen tojás egy része talán olyan nagyon korán elhalt embriót tartalmaz, amely még a megtojás előtt halt el. Ezek szabad szemmel a tojások feltörése esetén sem válnak láthatóvá, úgy néznek ki, mintha a csírakorongok terméketlenek lennének. Ezért vált szükségessé a nagyon korai embrionális elhalás meghatározása, amely a következő kísérletben meg is történt. Sztereomikroszkóppal egy részük 80
Következtetések és javaslatok kimutatható az Eyal-Giladi és Kochav (1975) által kidolgozott etalonhoz viszonyítva. Az oviductusban történő, nagyon korai embrionális elhalásról számolt be Dupuy (1996) pekingi kacsában és Hu et al. (1997) mulard kacsában.
5.1.4. Negyedik kísérlet
A kísérlet célja az volt, hogy teszteljem a hordozó szülőktől származó utódok teljesítményét az EM-re és a TE-re vonatkoztatva mesterséges termékenyítés alkalmazásával. Az előző évben már vizsgált cF1xcF1 párosításban a termékenység alacsony, az embrionális elhalás magas volt és ez utóbbi szignifikánsan több lett, mint előző évben. Az előző kísérletekben magas EM-t mutató szülők utódaiból létrehozott párosításban (F2xF2) az eredmények hasonlóan alakultak. A nagyon korai embrionális elhalás aránya 10% körül alakult az összes elhaltra viszonyítva mindkét esetben. Az „üres”, valóban terméketlen tojásokra vetítve azonban csak 1,4%, illetve 1,9% az arányuk. Ez azt jelenti, hogy az alacsony termékenységnek nem ez lehetett az oka. Lehetséges, hogy a valóban terméketlen tojások nagy száma miatt az EM nem tudott kifejezésre jutni. Minden tojó átlagosan több, mint 20 millió ondósejtet kapott inszeminációnként, amely elegendő a megtermékenyüléshez (Sellier és Rousselot-Pailley 1995, Barna et al. 2000). Érdekes megfigyelés, hogy néhány párosításban nagy különbségek mutatkoztak a tojók termékenységét illetően a mesterséges termékenyítés alkalmazása során. Például az egyik gúnár két tojóval párosítva 40%, illetve 90%-os termékenységet produkált, míg egy másik gúnár három tojóval párosítva 5%, 45% és 50%-os termékenységet mutatott. A tojók minden esetben jól tojtak. Lehetséges, hogy a termékenység különbsége a tojók és a gunarak között meglévő fiziológiai „kompatibilitás - inkompatiblitás” -ból adódik, illetve a tojók spermiumtárolási kapacitásában meglévő egyedi különbségek is okozhatják (Birkhead és Moller 1992, Bakst et al. 1994).
81
Következtetések és javaslatok 5.1.5. Ötödik kísérlet
A kísérlet célja egy olyan módszer kidolgozása volt, amely megkönnyíti a nagyon korán, még az oviduktusban elhalt embriók felismerését. Sajnos a Franciaországban végzett kísérletek során ennek kipróbálására nem volt lehetőség. A teszteléshez kacsatojásokat használtam. A frissen tojt, termékeny tojás könnyen felismerhető (Kosin 1945). Az inkubáció első napján azonban a csírakorong jellegzetes formája eltűnik. A tojások vizsgálatát a gyakorlatban az inkubáció 4-7. napja között történő lámpázáskor lehet elvégezni. A szemre terméketlen csírakorongok esetleges termékenységének megállapítása sztereomikroszkóp használatával is bizonytalan. Propídium jodidos festés alkalmazásával a termékeny tojások (nagyon korán elhalt embriók) minden esetben jól azonosíthatók. A valódi fertilitás tanulmányozása fontos kérdés a természetes vagy a mesterséges termékenyítés hatékonyságának és más technológiai paraméterek ellenőrzésének terén. Az ovulált petesejtet körülvevő külső és belső szikhártya között található spermiumok (OPVL spermiumok) számolásával kombinálva, a gunarak, gácsérok termékenyítő-képességének becslésére is használható (Liptói et al. 2004).
5.1.6. A kísérletek eredményeinek szintézise
Mind az öt, különböző időben végzett, mégis összefüggő kísérlet azt a célt szolgálta, hogy az embrionális elhalás és a kromoszóma-rendellenességek előfordulása, vonalak közti megoszlása, esetleges ismétlődhetősége és örökölhetősége követhető legyen. A lúd ebben a tekintetben kevéssé vizsgált faj. Különös nehézséget okoz speciális szexuális viselkedése, alacsony termékenysége, szezonalitása, a többi baromfifajhoz képest kevesebb tojása az adott tojástermelési ciklusban (Rouvier 1990, Bogenfürst 1992). A populációs átlag 5,2% volt az embrionális elhalás tekintetében a 7-es vonalban, míg az innen szelektált egyedekben 17,7% a második tojóciklusban, a vizsgálat első évében. Kimutatható volt a tojók, a gunarak, valamint a tojó apjának és anyjának hatása az embrionális mortalitás kialakítására, ami genetikai hatásra utal. A feltételezhetően hordozó állatok ugyanabban a párosításban tartva a következő két évben átlagosan 13% körüli embriómortalitást mutattak. Mesterséges termékenyítést alkalmazva a negyedik tojóciklusban 31,8% ez az arány. A 82
Következtetések és javaslatok feltételezhetően hordozó apák saját lányaikkal párosítva minden esetben magas korai embrionális elhalást mutattak. Ebből úgy tűnt, hogy a hordozónak minősített apák nőivarú utódai szintén hordozzák a magas embrionális elhalás kialakítására való hajlamot. Abban az esetben, amikor hordozó szülőktől származó hímivarú utódokat párosítottunk a testvéreikkel, illetve szintén első tojóciklusban levő nem rokon tojókkal, a termékenység minden esetben rendkívül alacsony volt, magas embrionális elhalással párosulva. Felmerült a kérdés, hogy mindkét ivar egyforma mértékben felelős-e az embrionális mortalitás kialakításában. A hordozónak minősített (cP) gunarakat nem hordozó (ncP) tojókkal párosítva az embrionális elhalás 26,23%-nak bizonyult, míg a nem hordozó (ncP) gunarakat utódgenerációba tartozó, hordozó (cF1) tojókkal párosítva az embrionális mortalitás aránya 7,46% volt, amely szinte azonos mértékű a vizsgálat első évében talált populációs átlaggal. Ebből úgy tűnik, hogy a gunarak felelőssége nagyobb a magas korai embrionális elhalás kialakításában. A hordozó szülőktől származó hím ivarú utódok alacsony termékenysége nem párosult a nagyon korai embrionális elhalások nagyobb gyakoriságával.
A korai embrionális elhalás fenotípusainak részletes ismerete és leírása megkönnyíti a rendellenességek, valamint az esetleges mutációk felismerését. Az általam elkészített kategorizálás segítséget adhat az egyedek valódi termékenységének a megállapításában és az esetleges terheltség kiszűrésében. Az első lámpázás után feltört tojásokban az elhalt embrió vagy embrionális szövet képe esetenként eltérő lehet attól, amit közvetlenül az elhalást követően láthatnánk. Például egy, az inkubáció első-második napján elhalt embrió blasztodermája az ötödik napon lehet ugyanolyan méretű, mint egy ötnapos embrióé, annak ellenére, hogy az embrió szervezete nem differenciálódik tovább. A kategorizálás további fejlesztésének iránya lehet, hogy az egyes fenotípusos kategóriák kialakulásának fiziológiai alapjait keressük. Lehetséges, hogy egyes típusok inkább technológiai hibák, míg mások inkább genetikai terheltség miatt jelentkeznek. Az eredmények alapján úgy tűnik, hogy az állatok életkorának előrehaladtával a PD (pozitív fejlődésmenet) aránya növekszik az állományban, a D1-5 (az inkubáció első 5 napján bekövetkező embrióelhalás) csökken. Ez a keltetői gyakorlatban azt jelenti, hogy megnő az „üres” kategóriába kerülő tojások aránya a lámpázás során és csökken az elhalt embriókat tartalmazó „véresek” mennyisége, mivel a PD fenotípus egésze, a BWE (embrió nélküli blasztoderma) és az inkubáció 1-2. napján elhalt embriók egy része ezzel a módszerrel nem válik láthatóvá. Így az egyes tojókra, illetve családokra jellemző embrióelhalás valódi 83
Következtetések és javaslatok mértéke nem derül ki pontosan. Ez hozzájárulhat ahhoz, hogy a rendellenességek kialakítására való hajlam fennmaradjon, tovább öröklődjön az állományban. Az irodalomban számos gyűrűs elhalásról, illetve a blasztoderma rendellenes fejlődéséről számolnak be különféle baromfifajokban (Savage et al. 1988, Savage és Harper 1985, Thomas et al. 1992, Savage et al. 1992). Ezek az inkubáció első néhány napján okoznak embrionális elhalást. Lúdban ilyen típusú rendellenességről még nem áll rendelkezésünkre adat. Az általam leírt, fehér és véres gyűrűvel határolt, közelítőleg 0,5 cm átmérőjű degenerált blasztoderma, amely az inkubáció második-harmadik napján elhalt embriót tartalmaz, az első ilyen eredmény. Egyetlen tojó produkálta, termékeny tojásainak több mint 25%-ában. Előző évben másik gúnárral párosítva, ez a tojó egyátalán nem produkált ilyen rendellenességet. Ez azt jelentheti, hogy recesszív gén okozhatja ezt a tipikus megjelenésű, visszatérő elhalási formát. Ennek igazolására azonban még további vizsgálatok szükségesek. Brah et al. (1991) két fehér leghorn vonalat vizsgáltak. A korai embrionális elhalást öröklődőnek találták, de úgy vélték, hogy a korai és késői embrionális rendellenességeket együttesen kell vizsgálni, mindkettő figyelembevételével a családok szelekciójánál. Jelen vizsgálatok alapján úgy tűnik, hogy a gunarak és tojók egyaránt felelősek a korai embrionális rendellenességek kialakításáért az utódaikban, bár a gunarak szerepe ebben erőteljesebbnek látszik. Ez azt jelenti, hogy a szülők vizsgálatával (egyaránt a hím- és nőnem) és kiszűrve azokat a tojókat és gunarakat, melyek magasabb arányban produkálnak elhalt embriókat, javulhat a keltethetőség a lúdvonalakban.
84
Következtetések és javaslatok
5.2. Javaslatok
•
Lúd törzsállományok kialakításánál javaslom azoknak a tojóknak és gunaraknak a kizárását a tenyésztésből, amelyek a korai embrionális elhalást a termékeny tojásokra vetítve a populációs átlagnál szignifikánsan magasabb arányban mutatják, mivel valószínűsíthető ezek genetikai eredete és öröklődése.
•
Meglévő lúd törzsállományokban, amennyiben technológiai, állategészségügyi problémák nem állnak fenn és az első lámpázás során a „véres” tojások aránya tartósan 10% felett van az adott vonalban, javaslom az állomány ellenőrzését és azoknak a gunaraknak és tojóknak a kizárását a tenyésztésből, amelyek a korai embrionális elhalást magas arányban mutatják.
•
A lámpázás során „üresnek” minősített tojások vizsgálata is indokolt, mivel a PD elhalás egésze, a BWE elhalás egy része, valamint esetenként az inkubáció 1-2. napján történt elhalások egyébként rejtve maradhatnak
•
Baromfisperma
mélyhűtési
kísérleteknél
a
felolvasztott
spermával
történő
termékenyítés után a „valódi” termékenység ellenőrzésére, illetve a gyakorlatban a termékenyítés hatékonyságának ellenőrzésére javaslom a csírakorongok propídium jodidos festésének alkalmazását.
85
Összefoglalás
6. ÖSSZEFOGLALÁS
A korai embrionális elhalás és a kromoszóma-rendellenességek előfordulásának vizsgálatát, valamint azok ismétlődésének, öröklődésének, genetikai hátterének tanulmányozását tűztem ki célomul lúdvonalakban. Ennek érdekében négy tojóciklus során négy kísérletet állítottam be az INRA Víziszárnyas Kutatóállomásán, Artiguerèsben (INRA - Station Expérimentale des Palmipèdes à Foie Gras, Benquet, Franciaország). Kiindulásként három vonal, a fehér lengyel (4-es vonal), a szürke landesi (7-es vonal), és a belőlük kialakított szintetikus vonal (9-es vonal) populációanalízisét végeztem el. A pedigré keltetés során azt a 2847 tojást törtem fel, amelyek az inkubáció ötödik napján végzett lámpázás során nem mutattak normális embrionális fejlődést. A mintákat a tojóciklus elején (február), közepén (április) és végén (június) gyűjtöttem. Az elhalt embriókat fenotípusuk szerint osztályokba soroltam és meghatároztam a kariotípusukat is. Az embrionális elhalás átlagos aránya a termékeny tojásokra vetítve (EM) 9,45%, 5,21% és 7,29% volt a 4-es, a 7-es és a 9-es vonalban. Azoknak az embrióknak az aránya az elhalt embriókra vetítve, amelyek kromoszómarendellenességet mutattak (KR) 8,0% volt a 4-es vonalban, 14,8% a 7-esben és 13,1% a 9-esben. Szignifikáns volt a gunarak hatása a családok között, valamint a tojók (családon belül) hatása az embrionális elhalásra, amely a genetikai hatás meglétét mutatja. A tojók apjának és anyjának (nagyszülői családon belül) hatása is szignifikáns volt az embrionális elhalásra, amely szintén genetikai hatás jelenlétére utal. Szelektáltam azokat az állatokat, amelyek magas embrionális elhalást és kromoszómálisan rendellenes embriókat produkáltak és ezeket hordozónak feltételeztem. A szelektált csoportokban az átlagos EM 17,71-22,97% volt és az átlagos KR 11,76-34,78% a három vonalban. A második kísérlet célja az volt, hogy megvizsgáljam, ismétlik-e a hordozónak minősített egyedek a magas embrionális elhalás és kromoszóma-rendellenesség értékeket, illetve az utódaik is kialakítják-e ezeket a tulajdonságokat. A kromoszómális rendellenességeket az állatok nem ismételték, ellenben a magas EM ismétlődött. Az embrionális mortalitás ismétlődhetőségi koefficiens 0,54 volt. A lányokat saját apjukkal párosítva, szintén magas EM-t mutattak (13 tojó és 253 tojás alapján). Úgy tűnik, hogy a hordozó apák nőnemű utódai hordozhatják az embriómortalitás kialakítására való hajlamot. Hordozó szülőktől származó tojók és gunarak párosításakor a TE alacsony (19,66% !), az EM magas (37,14%) értéket mutatott. Ez azt 87
Összefoglalás
jelentheti, hogy a feltételezetten hordozó, magas embrionális mortalitású (12%<) apák hímnemű utódai hordozói lehetnek az embriómortalitás kialakításának, amely alacsony fertilitással párosul. A harmadik kísérlet célja egyrészt az volt, hogy megvizsgáljam, a tojók és gunarak egyforma mértékben felelősek-e a magas arányú embrionális mortalitás kialakításáért, másrészt a hordozó apák hímivarú utódainak tesztelése, nagyobb egyedszám alkalmazásával, annak megállapítására, hogy ismétlik-e az alacsony fertilitás és magas embionális mortalitás arányokat. Természetes pároztatás alkalmazásával a hordozónak minősített párok továbbra is magas arányban mutatták az embrionális mortalitást (13,79 - 25,53%). Azokban az esetekben, amikor a hordozó gunarakat párosítottam nem hordozó tojókkal, az EM magas volt (26,23%). Nem hordozó gunarakat hordozónak minősített tojókkal párosítva az EM alacsony volt, 7,46%, amely hasonló a kiinduló populáció normálisnak mondható EM arányához. Ez az eredmény arra enged következtetni, hogy az EM kialakításában a hímnemnek nagyobb a szerepe, mint a nőivarnak. A hordozó szülők utódait ismételten párosítva (tehát ezek az egyedek a második tojóciklusukban voltak) a TE alacsony volt (48,51%) de az EM is alacsony értéket mutatott (9,18%). Ez az előző kísérlethez képest meglepő eredmény azt a kérdést vetette fel, hogy a nagyszámú terméketlen tojás egy része talán olyan nagyon korán elhalt embriót tartalmaz, amely még a megtojás előtt halt el. A negyedik kísérlet célja az volt, hogy teszteljem a hordozó szülőktől származó utódok teljesítményét az EM-re és a TE-re vonatkoztatva mesterséges termékenyítés alkalmazásával, ezzel kizárva a természetes pároztatás során a gunarak tojó-preferenciáját. Az előző évben már vizsgált, hordozónak minősített, utódgenerációba tartozó gunarak és tojók párosításában a termékenység alacsony, az embrionális elhalás magas volt és ez utóbbi szignifikánsan magasabb az előző évinél is. Az előző kísérletekben magas EM-t mutató szülők utódaiból létrehozott párosításban (F2xF2) az eredmények hasonlóan alakultak. A nagyon korai embrionális elhalás aránya 10% körül alakult az összes elhaltra viszonyítva mindkét esetben. Az „üres”, valóban terméketlen tojásokra vetítve azonban csak 1,4%, illetve 1,9% az arányuk. Ez azt jelenti, hogy a magas látszólagos terméketlenségnek nem ez lehetett az oka. Szükségessé vált egy olyan módszer kidolgozása, amely megkönnyíti a nagyon korán, még az oviductusban elhalt embriók felismerését. Erre egy ötödik kísérletet állítottam be. Sajnos a Franciaországban végzett kísérletek során ennek kipróbálására nem volt lehetőség. A teszteléshez kacsatojásokat használtam a gödöllői Kisállattenyésztési és Takarmányozási 88
Összefoglalás
Kutatóintézetből és Sásdról, a Búzakalász MgTsz-ből. A vizuálisan terméketlennek tűnő csírakorongok esetleges termékenységének megállapítása sztereomikroszkóp használata mellett is sokszor bizonytalan. Propídium jodidos festés alkalmazásával a termékeny tojások (nagyon korán elhalt embriók) minden esetben jól azonosíthatók. A valódi fertilitás tanulmányozása fontos kérdés a mesterséges termékenyítés hatékonyságának és más technológiai paraméterek ellenőrzésének terén. A korai embrionális elhalás fenotípusainak ismerete megkönnyíti a rendellenességek, valamint az esetleges mutációk felismerését. Ez segítséget adhat az egyedek valódi termékenységének a megállapításában és az esetleges terheltség kiszűrésében. Az eredmények alapján úgy tűnik, hogy az állatok életkorának előrehaladtával a PD (pozitív fejlődésmenet) aránya növekszik az állományban, a D1-5 (az inkubáció első 5 napján elhalt embriók) csökken. Ez a keltetői gyakorlatban azt jelenti, hogy megnő az „üres” kategóriába kerülő tojások aránya a lámpázás során és csökken az elhalt embriókat tartalmazó „véresek” mennyisége, mivel a PD fenotípus egésze, a BWE (embrió nélküli blasztoderma) és az inkubáció 1-2. napján elhalt embriók egy része ezzel a módszerrel nem válik láthatóvá. Így az egyes tojókra, illetve családokra jellemző embrióelhalás valódi mértéke nem derül ki pontosan. Ez hozzájárulhat ahhoz, hogy a rendellenességek kialakítására való hajlam fennmaradjon, tovább öröklődjön az állományban. Lúdban az inkubáció első néhány napján fenotípusosan megjelenő mutációt még nem írtak le. Az általam talált, fehér és véres gyűrűvel határolt, közelítőleg 0,5 cm átmérőjű degenerált blasztoderma, amely az inkubáció második-harmadik napján elhalt embriót tartalmaz, az első ilyen, erre utaló jellegzetes elváltozás. Egyetlen tojó produkálta, termékeny tojásainak több mint 25%-ában. Előző évben másik gúnárral párosítva, ez a tojó egyáltalán nem produkált ilyen rendellenességet. Ez azt jelentheti, hogy egy recesszív gén okozhatja ezt az esetleges mutációt. Ennek igazolására azonban még további kísérletek szükségesek. Jelen vizsgálatok alapján úgy tűnik, hogy a gunarak és tojók egyaránt felelősek a korai embrionális rendellenességek kialakításáért az utódaikban, bár a gunarak szerepe ebben erőteljesebbnek látszik. Ez azt jelenti, hogy a szülők vizsgálatával (egyaránt a hím- és nőnem) és kiszűrve azokat a tojókat és gunarakat, melyek magasabb arányban produkálnak elhalt embriókat, javulhat a keltethetőség a lúdvonalakban.
89
Summary
7. SUMMARY
Early embryonic mortality and chromosome abnormalities as well as the genetic determination of the recurrence and heritability were studied in three goose lines: Grey Landes (line 7), White Polish (line 4) and their synthetic line (line 9). Experiments were carried out during four laying cycles in Artiguères, INRA - Station Expérimentale des Palmipèdes à Foie Gras, Benquet, France. Eggs laid at the beginning (February), in the middle (April) and at the end (June) of the laying season were set. At candling at 5th day of incubation, the eggs with no normal embryonic development were opened and examined (2847 eggs). Dead embryos were classified phenotypically and karyotyped. The mean ratio of embryonic mortality (EM) among fertile eggs was 9.45%, 5.21% and 7.29% in lines 4, 7 and 9, respectively. The mean ratio of embryos with chromosomal abnormalities (KR) among the dead embryos was 8.00%, 14.85% and 13.09% in lines 4, 7 and 9, respectively. Gander effect and layer within gander effect were significant on embryo mortality, suggesting genetic effects. Father and mother of the layer effects were also significant, showing family effects. Animals producing dead embryos and embryos with chromosome abnormalities in high proportion were selected. In the selected groups EM was 17.71% to 22.97% and KR was 11.76% to 34.78% for all three lines. The second experiment was designed to investigate the repeatability of high embryonic mortality and chromosomal abnormality in these groups and to determine whether their progeny would present these malformations as well. The recurrence of KR was not observed in the following reproductive season the next year. However, the high EM was recurrent in these animals (repeatability coefficient of 0.54). The progeny of the selected ganders and layers also showed high EM. It seems that the female progeny of the carrier ganders may carry the ability to produce high embryonic mortality. When the offspring layers and ganders of carrier parents were mated, fertility was low (19.66%!) and EM was high (37.14%). It might explain that the progeny of the presumed carrier ganders with high embryonic mortality (more than 12%) could carry an ability to produce high embryonic mortality and low fertility. The objective of the third experiment was to examine whether ganders and layers equally contribute the high embryonic mortality ratio, as well as to test more ganders from carrier parents for repeatability of high embryonic mortality and low fertility. The presumed carrier animals showed high embryonic mortality again (13.79% to 25.53%). Carrier ganders paired with non91
Summary
carrier layers produced high EM (26.23%). Non-carrier ganders paired with presumed carrier layers gave low EM, 7.46%, which was very similar to the average of the original population. It may mean that the contribution of males in the formation of EM is larger. When the offspring of the carrier parents were paired again (in their second laying cycle) fertility was low (48.51%) but EM showed a low value also (9.18%). Following the previous experiment, this surprising result suggested that embryonic death mainly occurred before oviposition. The aim of the fourth experiment was to test the production of the progeny of carrier parents for EM and fertility after artificial insemination. This technique eliminates the layerpreference factor in ganders. In the pairing of presumed carrier ganders and layers from the offspring generation (cF1xcF1), which was examined in the previous year, fertility was low and embryonic mortality was significantly higher than in the previous year. When the progeny of the parents with high embryonic mortality in the previous year (F2xF2) were paired, the results were similar. The ratio of very early embryonic mortality in all eggs with dead embryos was around 10% in both cases but in the “clear”, really unfertile eggs this ratio was only 1.4% and 1.9%. It means that embryonic death, which occurred before oviposition was not the reason of the high apparent infertility. A new method was required that could help in the determination of the very early embryonic death (in the oviduct). That was the objective of a fifth experiment. Unfortunately, it was impossible to include this particular experiment in the previous experiments in France. Duck eggs from the Institute for Small Animal Research and Búzakalász Agricultural Company, Sásd were used. Determination of the fertility of eggs appearing to be infertile by visual inspection is uncertain even when a dissecting microscope is used. Using propidium iodide dye the fertile eggs (very early dead embryo) are well distinguishable in any case. The investigation of the true fertility is important for monitoring of the effect of artificial insemination and of other technological parameters. Detailed description the phenotypes of the early embryonic death lets the determination of abnormalities and mutations easier. It may help in the identification of the true fertility of individuals and in the selection of the economically desirable characteristics. According to these results it seems that, when the animals age, the ratio of PD (positive development) increases in the population, while the D1-5 (embryonic death on the first 5 days of incubation) decreases. It means that, at the hatchery level, that the quantity of “clear” eggs will increase and the number of 92
Summary
“bloody” eggs, which contain dead embryos will decrease at candling, because all eggs with PD, some eggs with BWE (blastoderm without embryo) and all eggs with dead embryos on the first 2 days of incubation will appear “clear” with candling. In this case, the true rate of the embryonic mortality, which is a characteristic of each layer and family will not be measured accurately. It may cause that the ability for the formation of abnormalities can persist and inherited in the population. In goose, there are no published references about any phenotypically visible mutations over the first few days of the incubation. Our finding was the first, characteristic malformation, which may refer to expression of a mutation in these early stages. It was a degenerated blastoderm with a diameter of about 0.5 cm surrounded by white and bloody rings, which contained a dead embryo on the 2nd or 3rd day of incubation. Only one layer showed this abnormality in more than 25% of her fertile eggs. In the previous year, that layer did not produce this abnormality when it was paired with another gander. It may mean that this presumed mutation could be caused by a recessive gene being present in the gander as well. Further studies would be necessary to confirm this hypothesis. According to these results it seems that both ganders and layers are involved in the formation of abnormalities in their progeny. However, the role of the ganders seems to be predominant. It means that the examination of each parent pair and culling of the layers and ganders, which produce dead embryos, could improve hatchability in goose lines.
93
Irodalomjegyzék 8. IRODALOMJEGYZÉK
Abbot, U.K., Yee, G.W. (1975): Avian Genetics. In Handbook of Genetics. V.4. R.C.King, Ed. Plenum Publ. Corp. NY. 151-200. Atkin, N.B., Mattison, G., Becak, W., Ohno, S. (1965): The comparative DNA content of 19 species of placental mammals, reptiles, and birds. Chromosoma 71: 1-10. Bachmann, K., Harrington, B.A., Craig, J.P. (1972): Genome size in birds. Chromosoma 37: 405416. Bakai, A.V., Perchikhin, Y.A., Nguyen, H.K. (1986): Opredelenije kariotipusa domasnej ptici. Sbornik Nauchnykh Trudov, Moskovskaja Veterinaria Akademia 147: 17-20. Bakonyi, G. (1995): Állattan. Mezőgazda Kiadó. p. 43-56. Bakst, M.R. (1996): Impact of egg storage on early embryonic development in turkeys. Turkeys, December: 17-19. Bakst, M.R. Akuffo, V. (1999): Impact of egg storage on embryo development. Proc. of Int. Congress on Bird Reproduction, Tours: 125-131. Bakst, M.R., Gupta, S.K., Akuffo, V. (1997): Comparative development of the turkey and chicken embryo from cleveage through hypoblast formation. Poult. Sci. 76: 83-90. Bakst, M.R., Wishart, G., Brillard, J.P. (1994): Oviducal sperm selection, transport and storage in poultry. Poultry Sci. Rev. 5:117-143. Balzak, W.F., Fechheimer, N.S. (1979): Gonosome-autosome translocation in fowl: Chromosome complements of gametes and viability of embryos derived from singly and doubly heterozygous cockerels. J. Hered. 70, 407-412. Barna, J., K. Do thi Dong Xuan, Szalay, I. (2000): Preliminary study on the in vivo sperm transport in goose. Proceeding of 14th International Congress on Animal Reproduction, Stockholm. Vol:1, pp:114. Batut, M.C. (1997): Logiciel de Gestion des Palmipèdes, Station d’Amélioration Génétique des Animaux, INRA, France Baumgartner, J., Koncenková, Z. (1984): Karyological study of Japanese quail (Coturnix cot. japonica). Hydinárstvo, 21: 37-45. Beaumont, C., Millet, N., Le Bihan-Duval, E., Kipi, A., Dupuy, V. (1997): Genetic parameters of survival to the different stages of embryonic death in laying hens. Poultry Sci. 76:1193-1196. Bednarczyk, M., Rosinski, A. (1999): Comparison of egg hatchability and In Vitro Survival of goose embryos of various origins. Poultry Sci. 78:579. 95
Irodalomjegyzék Behr, K.P., Hartmann, U. (1992): Artificial insemination of geese under field conditions. Proc. of 9th Int. Symp. on Waterfowl. Pisa, Italy, 112-114. Bernier, P.E., Arscott, G.H. (1972): Fifteen years of observations on the dwarf gene in domestic fowl. Ann. Genet. Sel. Anim. 4:183-215. Bhatnagar, M.K. (1968): Mitotic chromosomes of white Chinese geese. J Hered. 59(3):191-5. Bitgood, J.J., Shoffner, R.N. (1990): Cytology and Cytogenetics. In: “Poultry Breeding and Genetics”, p. 401-427, Editor R. D.Crawford, Elsevier, Amsterdam, Netherlands. Birkhead , T.R., Moller, A.P. (1992): Sperm competition in birds- Evolutionary Causes and Consequences. Academic Press, New York, 1992. Bloom, S.E. (1969): Chromosome abnormalities in early chicken (Gallus domesticus) embryos. Chromosoma (Berl.) 28:357-369. Bloom, S.E. (1970): Haploid chicken embryos: Evidence for diploid and triploid cell populations. J. Hered. 61:147-150. Bloom, S.E. (1972): Chromosome abnormalities in the chicken (Gallus domesticus) embryos: Types, frequencies and phenotypic effects. Chromosoma (Berl.) 37:309-326. Bloom, S.E. (1978): Chick embryos for detecting environmental mutagens. Chem. Mutagens 5:203232. Bloom, S.E., Buss, E.G. (1966): Triploid-diploid mosaic chicken embryo. Science 153:759-760. Bloom, S.E., Muscarella, D.E., Lee, M.Y., Rachlinski, M. (1998): Cell death in the avian blastoderm: resistance to stress-induced apoptosis and expression of anti-apoptotic genes. Cell Death Differ. 5(6): 529-538. Bogenfürst F. (1986): A keltethetőség javításával összefüggő tényezők vizsgálata különös tekintettel a lúd fajra. Kandidátusi értekezés. Kaposvár. Bogenfürst, (1989): Long term storage with periodical warming. Proc. of 8th Int. Symp. of Waterfowl. Budapest, 148-150. Bogenfürst, F. (1992): Lúdtenyésztők kézikönyve. Új Nap Lap- és Könyvkiadó, Budapest. Bogenfürst, F., Ballay, E. (1990): Effect of fusarium mycotoxins on reproduction of geese. Proc. of VIII. European Poultry Conference, Barcelona. 718-720. Bonamino, G.,A., Fechheimer, N.S. (1993): The gonadal histology of triploid chicken (Gallus domesticus) embryos. Genet. Sel. Evol. 25:205-210.
96
Irodalomjegyzék Brah, G.S., Sandhu, J.S., Chaudhary, M.L. (1991): Hetitability estimates of components of incubation mortality in White Leghorns. Br. Poult. Sci. 32:871. Brant, J.W.A. (1952): A review of literature on chromosome studies of the fowl. Poultry Sci. 31: 409-417. Bruce J., Johnson, A.L. (1978): The bacterial flora of unhatchable eggs. Br. Poult. Sci. 19(45): 681689. Byerly, T.C. (1931): Time of occurence and probable causes of mortality in chick embryos. Proc. 4th World’s Poultry Congress, London: 178-186. Cassar, G., Mohammed, M., John, T.M., Gazdzinski, P., Etches, R.J. (1998): Differentiating between parthenogenetic and "positive development" embryos in turkeys by molecular sexing. Poultry Sci. 77:1463. Chelmonska, B., Lukaszewicz, E. (1995): Current state and future of artificial insemination in waterfowl. Proc.10th European Symp. on Waterfowl, Halle: 225-241. Christidis, L. (1986): Chromosomal evolution within the Estrildidae (Aves) I. The Poephilae. Genetica 71:81-97. Christidis, L. (1989): Karyotypic Analyses in Birds, in Halnan, R.E.: Cytogenetics of Animals (1989). C.A.B. International. Page 125-149. Cock, A.G. (1964): Dosage compensation and sex chromatin in nonmammals. Genet. Res. 5: 354365. Coleman, M.A. (1983): Extra 25 chicks per hen with ”embryo watch”. Boiler Industry, May: 32-34. De Boer, L.E.M., De Groen, T.A.G., Frankenhuis, M.T., Zonneveld, A.J., Sallevelt, J., Belterman, R.H.R. (1984): Triploidy in Gallus domesticus embryos, hatchlings and adult intersex chickens. Genetica 65, 83-87. Deeming, D.C., Van Middelkoop, J.H. (1999): Effect of strain and flock age on fertility and early embryonic mortality of broiler breeder eggs. Brit. Poultry Sci. 40:22. Delany, M.E., Muscarella, D.E., Bloom, S.E. (1994): Effects of rRNA gene copy number and nucleolar variation on early development: inhibition of gastrulation in rDNA-deficient chick embryos. J. Hered. 85:211-217. Dobos-Kovács, M., Czifra, Gy., Varga, Zs. (1985): A lúd phallusgyulladása. Magyar Állatorvosok Lapja. 40(1) 49-57. Do thi Dong, X., Péczely, P. (1989): A sötéttermes tartásmód és a takarmányozás változtatásának hatása a gunarak szaporodásbiológiai jellemzőire. Állatteny. és Tak. 27(6) 635-641.
97
Irodalomjegyzék Donner, L., Chyle, P., Sainerova, H. (1969): Malformation syndrome in Gallus domesticus associated with triploidy. J. Hered. 57:548-549. Duber, M.M., Mong, S.J., Fechheimer, N.S., Jaap, R.G. (1973): Chromosome abnormalities in embryos from divergent lines and their crosses. Poultry Sci. 52:2023-2024. (Abstract). Dunn, L.C. (1923): A lethal gene in fowls. Am.Nat. 57:345-349. Dupuy, V. (1996): Etude du dévéloppement embryonnaire entre le premier clivage et la 72éme heure d’incubation dans 2 souches de canard Pekin: classification et mesures quantitatives sur une série d’embryons normaux. Mémoire D.E.A. ENSA de Rennes. Dupuy, V., Neressian, B., Bakst, M.R. (2002): Embryonic development from first cleveage through seventy-two hours incubation in two strains of Pekin duck (Anas platyrhynchos) Poultry Sci. 81:860-868. Eyal-Giladi, H., Kochav, S. (1976): From cleavage to primitive streak formation: a complementary normal table and a new look at the first stages of the development of the chick. Developmental Biology 19:321-337. Fábián, Gy., Nagy, M. (1973): Newer data to the recognition of karyotype of the Japanese quail (Coturnix coturnix japonica). Aquila 80-81: 33-40. Fasenko, G.M., Robinson, F.E., Hardin, R.T. (1992): Research note: Variability in preincubation embryonic development in domestic fowl. Poultry Sci. 71: 2129-2132. Fasenko, G.M., Christensen, V.L., Wineland, M.J., Petitte, J.N. (2001): Examining the effects of prestorage incubation of turkey breeder eggs on embryonic development and hatchability of eggs stored for four to forteen days. Poultry Sci. 80: 132-138. Fechheimer, N.S. (1977): Frequency and source of chromosome abnormalities in chicken embryos. Ann. Genet. Sel. Anim. 9:541. (Abstract) Fechheimer, N.S. (1980): Origins of heteroploidy in chicken embryos. Poultry Sci. 60:1365-1371.
Fechheimer, N.S. (1981): Origins of heteroploidy in chicken embryos. Poultry Sci. 60:1365-1371. Fechheimer, N.S. (1990): Chromosomes of chickens. in Advances in Vetenary Science and Comparative Medicine. Domestic Animal Cytogenetics Ed. McFeely R.A. 34:169-207. Fechheimer, N.S., Isakova, G.K., Belyaev, D.K. (1983): Mechanisms involved in the spontaneous occurrence of diploid-triploid chimerism in the mink (Mustela vision) and chicken (Gallus domesticus). Cytogenet. Cell Genet. 35:238-243. Fechheimer, N.S., Jaap, R.G. (1980): Origins of euploid chimerism in embryos of Gallus domesticus. Genetica 52/53:69-72.
98
Irodalomjegyzék Fechheimer, N.S., Lodge, J.R., Miller, R.C. (1970): Sex proportion of domestic chicken at 16 hours of incubation. J. Reprod. Fert. 23: 365-367. Foulkes, A.G. (1990): The unincubated avian blastoderm; its characterization and an investigation of developmental quiscence. Ph.D. Dissertation. Dep. of Biology, Fac. of Science, Univ. of Southampton, UK. Gupta, S.K., Bakst, M.R. (1993): Turkey embryo staging from cleavage through hypoblast formation. J. Morphol. 217: 313-325. Hagger, C., Steiger-Stafl, D., Marguerat, C. (1986): Embryonic mortality in chicken eggs as influenced by egg weight and inbreeding. Poultry Sci. 65:812-814. Hamburger, V., Hamilton, H.L. (1951): A series of normal stages in the development of the chick embryo. J. of Morphology 8, 49-92. Hammar, B. (1966): The karyotypes of nine birds. Hereditas 55: 367-385. Harry, E.G. (1957): Effect on embryonic and chick mortality of yolk contamination with bacteria from the hen. Vet. Record 69: 1433-1439. Hidas, A., Szalay, I. (1987): Chromosomes studies in the domestic goose (Anser anser domesticus). Proc. 1st Nat. Conf. of Hungarian Genetics, Budapest. p.119. Hidas, A., Szalay, I., Liptói, K., Várkonyi, E. (1996): Cytogenetic analysis of early dead embryos in chicken breeding stocks. Arch. Zootec. 45. 221-224. Hidas, A., Várkonyi, E., Liptói, K., Sayahzadeh, H., Lennert, L., Szalay, I. (1999): Recurrent trisomies in chicken embryos. 13th European Colloquium on Cytogenetics of Domestic Animals, Budapest, Hungary, 2-5 June, 1998. In: Állattenyésztés és Takarmányozás, 1999. 48. (1) 80-82. Hu, Y.H., Rouvier, R., Poivey, J.P., Brun, J.M., Sellier, N. (1997): Fertility and early embryonic viability in the intergeneric cross-breeding between muscovy drake and common duck females. Proceedings of 11th European Symp. on Waterfowl, Nantes, France. 382-391. Imreh, S.I. (1986): A kromoszóma. Kriterion Könyvkiadó, Bukarest. p. 25-32. Jaap, R.G., Fechheimer, N.S. (1974): Normal and abnormal avian chromosomes. Proc. XV World Poult. Cong., New Orleans, 313-315. Jassim, E.W., Grossman, M., Koops, W.J., Luykx, R.A.J. (1996): Multiphasic Analysis of Embryonic Mortality in Chickens. Poultry Sci. 75:464-471. Jaszczak, K., Sadowska, G., Pawluczuk, B. (1985): Chromosomal abnormalities in quails selected for a high and low body weight. Genet. Pol. 25:417-425. Khan, A.G., Prasad, J. (1981): Incubation mortality of developing chick embryos having divesified genetic origin. Indian J.Poultry Sci. 16:280. 99
Irodalomjegyzék Kisné, D.T.D.X. (1988): A landesi ludak ondó- és spermiumtermelésének alakulása életkortól és származástól függően. Baromfiteny. és Feldolg. 2:65-74. Kisné, D.T.D.X., Péczely, P. (1989): A sötéttermes tartásmód és a takarmányozás változtatásának hatása a gunarak szaporodásbiológiai jellemzőire. Állatteny. és Tak. 37(6): 535-546. Kiss, I. (1977): Baromfikeltetés. Mezőgazdasági Kiadó, Budapest. Klein, S., Saar, W. (1992): Differences in egg phenotype in short term incubated goose eggs and their relationship to chromosome aberrations. 10th European Colloq. Cytogen. Domest. Anim. Utrecht Univ. Netherlands, Proc. 116-121. Klosowska, D., Bielinska, K., Klosowski, B. (1979): Studies on the morphological and histological development of gander gonads. Rocz. Nauk. Zool. 6:15-28. Kosin, I.I. (1945): The accuracy of the macroscopic method in identifying fertile unincubated germ discs. Poultry Sci. 24:281-295. Kovács, A., Hidas, A. (2004): Citogenetika. In: Szabó, F.: Általános állattenyésztéstan. Mezőgazda Kiadó. 2004. Kozikova, L.V. (1984): Opredelnije polovoj hromoszomi u ceszarok. Citologia i Genetika 18: 231232. Krishan, A., Shoffner, R.N. (1966): Sex chromosomes in the domestic fowl (Gallus domesticus), turkey (Meleagris gallopavo), and the Chinese pheasant (Phasianus colchicus). Cytogenetics 5: 5363. Krueger, K.K. (1990): Fertility in female turkeys: How manage it? Page 205-212 in Control of Fertility in Domestic Birds. No. 54. Les Colloques de l’INRA, Nouzilly, France. Kurbatov, A.D., Tsarenko, R.G., Popov, I.I. (1976): Improving of AI in geese. 8th Int. Congr. on Animal Repr. and AI. Krakkow, Poland. 4:1009-1012. Kuurman, W.W., Bailey, B.A., Koops, W.J., Grossman, M. (2002): Influence of storage days on the distribution for time of embryonic mortality during incubation. Poultry Sci. 81: 1-8. Landauer, W. (1932): Studies on the creeper fowl. III. The early development and lethal expression of homozygous creeper embryos. J. Genet. 25:367-394. Landauer, W. (1951): The hatchability of chicken eggs as influenced by environment and heredity. Bulletin 262, revised. Storrs Agricult. Exp. Station, Univ. Connecticut, Storrs, CT. Landauer, W., Dunn, N.C. (1930): Studies on the creeper fowl: 1. Genetics. J. Genet. 23:37-53. Larzul, C., Rouvier, R., Rousselot-Pailley, D., Guy, G. (2000): Estimation of genetic parameters for growth, carcass and overfeeding traits in a white geese strain. Genetics Selection Evolution 32:415427. 100
Irodalomjegyzék Liptói, K., Hidas, A. (1997): Investigation of chromosomal abnormalities in goose breeding stocks. Int. Symp. Current Problems in Avian Reproduction. Wroclaw (Poland) Proceedings 205-206. Liptói, K., Hidas, A. (1998): Investigation of early dead embryos in goose populations. Cytogenet. Cell Genet. 81:138. (Abstr.) Liptói, K. Hidas, A. (2000): Inheritance of Early Embryonic Abnormalities in Goose Breeding Stocks. XXI World's Poultry Congress in Montreal, Canada, August 20-24, 2000, Proceedings: W14.06. Liptói, K., Hidas, A., Szalay, I. (1999): Investigation of chromosomal and embryonic abnormalities in early dead embryos. 13th European Colloquium on Cytogenetics of Domestic Animals, Budapest, Hungary, 2-5 June, 1998. In: Állattenyésztés és Takarmányozás, 1999. 48. (1) 82-85. Liptói, K., Varga, Á., Hidas, A., Barna, J. (2004): Determination of the rate of true fertility in duck breeds by the combination of two in vitro methods. Acta Vet. Hung. 52(2): 227-233. Lodge, J.R., Fechheimer, N.S., Miller, R.C. (1973): Deletion, monosomy and multiple monosomytrisomy in chicken embryos. Poultry Sci. 52:397-399. Lukaszewicz, E. (2001): DMF effects on frozen gander semen. British Poultry Sci. 42:308-314. Makino, S. (1951): An atlas of the chromosome numbers in animals. 2nd Ed. The Iowa State College Press, Ames. Migliore, L., Tesoro, M., Romboli, I. (1986): Chromosome complement and C-banding pattern in the muscovy duck (Cairina moschata domestica L.). Proc. 7th European Poult. Conf., Paris, Vol. 1., 99-103. Miller, R.C., Fechheimer, N.S., Jaap, R.G. (1971): Chromosome abnormalities in 16-18 hour chick embryos. Cytogenetics 10:121-136. Mong, S.J., Snyder, M.D., Fechheimer, N.S., Jaap, R.G. (1974): The origin of triploidy in chick (Gallus domesticus) embryos. Can. J. Genet. Cytol. 16:317-322. Muravská, J., Baumgartner, J. (1983): Karyological study of the domestic duck (Anas platyrhynchos domestica). Proc. 5th Int. Symp. Actual Problems of Avian Genetics, Piestany, 185-187. Muscarella, D.E., Rachlinski, M.K., Bloom, S.E. (1998): Expression of cell death regulatory genes and limited apoptosis induction in avian blastodermal cells. Mol. Reprod. Dev. 51(2): 130-142. Newcomer, E.H. (1957): The mitotic chromosomes of the domestic chicken. J. Hered. 48: 227-234. Newcomer, E.H., Brant, J.W.A. (1954): Spermatogenesis in the domestic fowl. J. Hered. 45: 79-87.
101
Irodalomjegyzék Nickolova, M., Guerzilov, V. (2000): Sperm characteristics of Landes and Benkovsky White Ganders during the first and the second reproductive years. International Conference, Taiwan, pp:181-187. Nicolet, G. (1971): Avian gastrulation. Adv. Morphogen. 9: 231-262. North, M.O. (1978): Commercial chicken production manual. 2ed. AVI Publication Co. Inc. Westport. Connecticut. Owen, J.J.T. (1965): Karyotype studies on Gallus domesticus. Chromosoma (Berl.) 16: 601-608. Pataky, M., Ernhaft, J. (1976): Lúdtojások higiéniai és biológiai vizsgálatai, különös tekintettel a kelési százalék növelhetőségére. Az Agrártudományi Egyetem Közleményei, Gödöllő, 45-66. Péczely, P. (1987): A madarak szaporodásbiológiája. Budapest. Mezőgazdasági Kiadó. 205 p. Perry, M.M. (1987): Nuclear events from fertilization to the early cleavage stages in the domestic fowl (Gallus domesticus). J. Anat. 150: 99-109. Pfennig, I. (1974): Versuche zur Penetration von Enterobacteriaceen durch die Schale des Hühnereiers bei Zimmertemperatur. Dissertation. Bonn. Rheinischen Friedrich-Wilhems Universitat. Pollock, D.L., Fechheimer, N.S. (1976): The chromosome number of Gallus domesticus. Br. Poultry Sci. 17: 39-42. Pollock, D.L., Fechheimer, N.S. (1981): Variable C-banding pattern and a prospered C-band karyotype in Gallus domesticus. Genetica (The Hague) 54: 273-279. Poujardieu, B., Rouvier, R., Rousselot-Pailley, D., Guy, G., Rosinski, A., Wesyk, S. (1994): Croissance et aptitude au gavage d'oies de 3 genotipes. Ann. Zootech. 43,197-211. Reddy, P.R.K., Siegel, P.B. (1977): Chromosomal abnormalities in chickens selected for high and low body weight. J. Hered. 68:253-256. Robertson, A., Lerner, I. M. (1949): The heritability of all or none traits: viability of poultry. Genetics 34:395-411. Rol’nik, V.V. (1970): Bird Embryology. Keter Press, Jerusalem, Israel. Romanoff, A.L. (1949): Critical periods and causes of death in avian embryonic development. The Auk 66: 264-270. Romanoff, A.L. (1960): The avian embryo: Structural and functional development. MacMillan, New York. Rosiński, A., Bednarczyk, M. (1997): Influence of genotype on goose egg hatchability. Arch. Geflügelk. 61 (1), 33-39. 102
Irodalomjegyzék Rouvier, R., Poujardieu, B., Chrysostome, C., Rousselot-Pailley D. (1990): Expérimentation en selection de deux souches d’oies landaises (Anser anser): performances de reproduction. in: Les colloques de l’INRA, no 54, Control of fertility in domestic birds, Tours (France), July 2-4 1990; INRA Ed; Paris,1990. Rouvier, R., Rousselot-Pailley, D. (1987): Genetique et selection de l’oie. in: Bennejean, G.: Manuel technique d’aviculture. Original du texte. Rouvier, R., Vrillon, A., Rousselot-Pailley, D., Larrue, P. (1982a): Etude de quelques facteurs de variation du poids a deux mois et des performances de prégavage et de gavage d’oies Landaises. Ann. Génét. Sél. Anim. 14(3): 381-398. Rouvier, R., Vrillon, A., Rousselot-Pailley, D., Larrue, P. (1982b): Note: Efficacité théorique d’un indice de sélection sur collatéraux pour le foie gras de l’oie Landaise. Ann. Génét. Sél. Anim. 14(2): 245-252. Saefudin, W., Saar, M, Schmutz, M., Preisinger, R., Schüler, L. (2002): The influence of the age of hen on early embryonic mortality, frequency and types of chromosomal aberrations in laying hens. Proc. of 11th European Poultry Conference, September 6 Savage, T.F., DeFrank, M.P., Brean S.E. (1988): Blood ring: An early embryonic lethal condition in chicken. J.Hered. 79(2): 124-128. Savage, T.F., Harper, J.A. (1985): Ring lethal: an early embryonic failure in Medium White turkeys. J. Hered. 76:474-476. Savage, T.F., Mirosh, L.W., Jones, J.L, Schneiderman, E.T. (1992): Blastoderm degeneration, an early embryonic failure in dwarf single comb white leghorn chikens. J. Hered. 83:249-254. Schmid, W. (1962): DNA replication patterns of the heterochromosomes in Gallus domesticus. Cytogenetics 1: 344-352. Schoffner, R.N. (1965): Current knowledge about the chromosomes in the domestic fowl. World’s Poultry Sci. J. 21:157-165. Schopen, G.E. (1974): Versuche zur Penetration von Enterobacteriaceen durch die Schale des Hühnereiers bei 37 °C. Dissertation. Bonn. Rheinischen Friedrich-Wilhems Universitat. Schwarzacher, H.G., Wolf, U. (1974): Methods in Human Cytogenetics. Springer-Verlag, New York. Sellier, N., Rousselot-Pailley, D. (1995): L'insemination artificielle chez l'oie grise des Landes: bilan et perspectives. INRA Prod.Anim. 8(2): 127-133. Sharma, A.K., Sharma, A. (1973): Chromosome Techniques- Theory and Practice. 2nd. ed. Butterworth, London.
103
Irodalomjegyzék Sheridan, A.K. (1964): A sex-linked mutation causing low hatchability in broiler chicken. In: Proc. of Australian Poultry Sci. Convention, Surfers Paradise, 87-90. Sheridan, A.K. (1979): Further studies with a sex-linked lethal gene in the fowl. Br. Poultry Sci. 20:571-573. Shook, J.G., Stephenson, A.B., Biellier, H.V. (1971): Heritability estimates of differences in arbitrary embryonic mortality traits in turkeys. Poultry Sci. 50 (5):1255. Snedecor, G.W; Cochran, W.G (1980): Statistical Methods, Seventh Edition, The Iowa State University Press, Ames, Iowa, U.S.A. Snyder, N.D., Fechheimer, N.S., Jaap, R.G. (1975): Incidence and origin of heteroploidy, especially haploidy in chick embryos from intraline and interline matings. Cytogenet. Cell Genet. 14:63-75. Somes, R.G., Smyth, J.R. (1967): Prenatal, a sex-linked lethal mutation of the fowl. J. Hered. 58:25-29. Spratt, N.T., Haas, H. (1960): Integrative mechanisms in the development of early chick blastoderm. I. Regulative potentiality of separated parts. J. Exp. Zool. 145, 97-137. Stenius, C., Chrisitian, L.C., Ohno, S. (1963): Comparative cytological study of Phasianus colchicus, Meleagris gallopavo and Gallus domesticus. Chromosoma (Berl.) 13: 515-520. Stock, A.D., Bunch, T.D. (1982): The evolutionary implications of chromosome banding pattern homologies in the bird order Galliformes. Cytogenet. Cell Genet. 34: 136-148. Szabad, J. (1988): Mozaikok és kimérák. Tudomány 4:59-62. Szalay, I., Hidas, A., Vas, E. (1988): Rendellenes kariotípusú embriók vizsgálata pecsenyecsirke nagyszülő állományban. Baromfitenyésztés és feldolgozás 35:149-155. Szalay, I. (1989): Cytogenetic aspects of early embryonic development in meat type poultry. PhD Thesis, Hungarian Academy of Sciences, Budapest Szalay, I., Hidas, A., Liptói, K., Do thi Dong, X., Barna, J. (1999): Effect of choromosome aberrations on early embryonic mortality in goose and duck. Proc. 1st World waterfowl Conference, Thichung, Taiwan, ROC 1-4 Dec. 1999. Talluri, M.V., Vegni, L. (1965): Fine resolution of the karyogram of the quail Coturnix coturnix japonica. Chromosoma (Berl.) 17: 264-272. Telloni, R.V., Jaap, R.G., Fechheimer, N.S. (1976): Cytogenetic and phenotypic effects of chromosome rearrangement involving the Z-chromosome and microchromosome. Poultry Sci. 56:193-201. Thomas, F., Savage, T.F., Mirosh, L.W. (1992): Inheritance of Blood Ring, an Early Embryonic Failure in the Turkey, Poultry Sci. 71:585-589. 104
Irodalomjegyzék Thorne, M.H., Collins, R.K., Sheldon, B.L. (1985): A cytogenetic survey of early embryonic mortality in Australian layer and meat chickens. Proc. 6th Australian Poultry and Stockfeed Conv., Melbourne, 287-292. Thorne, M.H., Collins, R.K., Sheldon, B.L. (1987): Live haploid-diploid and other unusual mosaic chickens (Gallus domesticus). Cytogenet. Cell Genet. 45:21-25. Thorne, M.H., Sheldon, B.L. (1991): Cytological evidence of maternal meiotic errors in a line of chickens with a high incidence of triploidy. Cytogenet. Cell Genet. 57, 206-210. Vagt, A., Saar, W., Pingel, H., Schneider, K.H. (1988): Vergelich zur Haufigkeit cromosomaler Aberrationen Während der frühembryonalen Entwicklung bei Pekingenten (Anas platyrhynchos f. dom.) einer leichten und schweren Linie. Wiss. Z. Karl-Marx-Univ. Leipzig, Math-Naturwiss. R. 37:276-281. Varga, Á., Barna, J., Almási, A. (2003): Sperm analysis and sexual characteristics of frizzled Hungarian ganders. Preliminary study. Állattenyésztés és Takarmányozás 2:167-172. Verma, R.S., Balm, A. (1989): Human Chromosomes. Manual of Basic Techniques. Pergamon, New York. Waddington, C.H. (1952): The Epigenics of Birds. Cambridge Univ. Press. Wolowodiuk, V.D., Fechheimer, N.S., Nestor, K.E., Bacon, W.L. (1985): Chromosome abnormalities in embryos from lines of Japanese quail divergently selected for body weight. Genet. Sel. Evol. 17:183-190. Yamashina, Y. (1944): Karyotype studies in birds. I. Comparative morphology of chrmosomes in seventeen races of domestic fowl. Cytologia 13: 270-296. Zartman, D.L., Smith, A.L. (1975): The effect of five different chromosome mutations on embryonic survival studied in chicken. Genetics 80:87-88.
105
Saját publikációk 10. SAJÁT PUBLIKÁCIÓK
Lektorált, impakt faktorral rendelkező folyóiratban megjelent közlemények: Liptói, K., Varga, Á., Hidas, A., Barna, J. (2004): Determination of the rate of true fertility in duck breeds by the combination of two in vitro methods. Acta Vet. Hung. 52(2): 227-233. Liptói, K., Hidas, A., Rouvier, R. (2005): Investigations of chromosome abnormalities and early embryonic mortality in goose lines. Acta Biol. Hung. 56(1) in press. Liptói, K., Hidas, A. (1998): Investigation of early dead embryos in goose populations. Abstract. Cytogenet. Cell Genet. 81:138.
Lektorált folyóiratban megjelent közlemények: Magyar nyelven: Liptói, K., Hidas, A. (2003): Korai embrionális rendellenességek genetikai hátterének vizsgálati lehetőségei madarakban. Állattenyésztés és Takarmányozás 52. 1. 17-23. Liptói, K., Hidas, A. (2002): Korai embrionális rendellenességek öröklődésének vizsgálata a lúd fajban. A Baromfi. 2002. V.(1) 74-79. Angol nyelven: Liptói, K., Hidas, A., Szalay, I. (1999): Investigation of chromosomal and embryonic abnormalities in early dead embryos. Állattenyésztés és Takarmányozás, 48. (1) 82-85. Hidas, A., Várkonyi, E., Liptói, K., Sayahzadeh, H., Lennert, L., Szalay, I. (1999): Recurrent trisomies in chicken embryos. Állattenyésztés és Takarmányozás, 48. (1) 80-82. Hidas, A., Szalay, I., Liptói, K., Várkonyi, E. (1996): Cytogenetic analysis of early dead embryos in chicken breeding stocks. Arch. Zootec. 45. 221-224.
Nemzetközi konferencián tartott előadás: Liptói, K., Hidas, A. (2000): Inheritance of Early Embryonic Abnormalities in Goose Breeding Stocks. XXI World's Poultry Congress in Montreal, Canada, August 20-24, 2000, Workshop of waterfowl breeding. Liptói, K. (1997): Cytogenetic studies on early embryonic mortality on a goose breeding stocks. 2d Hungarian Egyptian Poultry Conference, 1997, 16-17 September, Gödöllő.
107
Saját publikációk Nemzetközi konferencián bemutatott poszter: Liptói, K., Hidas, A. (1997): Investigation of chromosomal abnormalities in early dead goose embryos. Proc. of Int. Symp. Current Problems in Avian Reproduction. 1997. 24-26. Apr. Wroclaw (Poland) 205-206. Hidas, A., Várkonyi, E., Liptói, K., Sayahzadeh, H., Lennert, L., Szalay, I. (1999): Recurrent trisomies in chicken embryos. 13th European Colloquium on Cytogenetics of Domestic Animals, 2-5 June, 1998. In: Állattenyésztés és Takarmányozás, 1999. 48. (1) 80-82. Liptói, K., Hidas, A., Szalay, I. (1999): Investigation of chromosomal and embryonic abnormalities in early dead embryos. 13th European Colloquium on Cytogenetics of Domestic Animals, 2-5 June, 1998. In: Állattenyésztés és Takarmányozás, 1999. 48. (1) 82-85. Szalay, I., Hidas, A., Liptói, K., Do thi Dong, X., Barna J. (1999): Effect of choromosome aberrations on early embryonic mortality in goose and duck. Proc. 1st World waterfowl Conference, Thichung, Taiwan, ROC 1-4 Dec. 1999. Liptói, K., Hidas, A. (2000): Inheritance of Early Embryonic Abnormalities in Goose Breeding Stocks. XXI World's Poultry Congress in Montreal, Canada, August 20-24, 2000, Proceedings: W14.06.
Hazai konferencián bemutatott poszter: Liptói, K., Hidas, A. (2003): Kromoszómális és embrionális rendellenességek vizsgálata lúd törzsállományokban. V. Magyar Genetikai Kongresszus, 2003. április 13-15. Siófok, Összefoglalók p119.
Nemzetközi konferencia proceeding: Liptói, K., Hidas, A. (1997): Investigation of chromosomal abnormalities in early dead goose embryos. Proc. of Int. Symp. Current Problems in Avian Reproduction. 1997. 24-26. Apr. Wroclaw (Poland) 205-206. Szalay, I., Hidas A., Liptói K., Do thi Dong, X., Barna J. (1999): Effect of choromosome aberrations on early embryonic mortality in goose and duck. Proc. 1st World waterfowl Conference, Thichung, Taiwan, ROC 1-4 Dec. 1999. Liptói, K., Hidas, A. (2000): Inheritance of Early Embryonic Abnormalities in Goose Breeding Stocks. XXI World's Poultry Congress in Montreal, Canada, August 20-24, 2000, Proceedings: W14.06.
Hazai konferencia proceeding: Liptói, K., Hidas, A. (2003): Kromoszómális és embrionális rendellenességek vizsgálata lúd törzsállományokban. V. Magyar Genetikai Kongresszus, 2003. április 13-15. Siófok, Összefoglalók p119.
108
Köszönetnyilvánítás 10. KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS
Köszönetet szeretnék mondani témavezetőmnek, Dr. Hidas Andrásnak, aki lehetőséget és segítséget adott elképzeléseim megvalósításához és mindig arra biztatott, hogy a képességeim szerinti maximumot nyújtsam. Munkahelyi vezetőmként megtanulhattam tőle azokat a módszereket, amelyek nélkül ez a dolgozat nem születhetett volna meg. Köszönöm Dr. Szalay Istvánnak, hogy a KÁTKI igazgatójaként munkámban mindennel támogatott. Kérdéseimmel, problémáimmal bármikor bátran fordulhattam hozzá, mindig számíthattam a segítségére és Daniel Rousselot-Pailley úrnak, hogy Artiguères igazgatójaként elképzeléseimet elfogadta és munkámat négy éven keresztül szponzorálta, átvállalva az állattartással és a kísérleteimmel járó összes költséget. Köszönöm Dr. Roger Rouvier-nek, hogy a statisztikai feldolgozás ellenőrzése mellett megtanított az eredmények kritikus értékelésére és korrekt bemutatására. Köszönöm Dr. Kisné Dr. Do thi Dong Xuannak és Nadine Sellier-nek, hogy az 1997-98as Balaton projektben számomra részvételt biztosítottak, így megkezdhettem a disszertációm témájául szolgáló munkát Franciaországban, valamint szakmai kapcsolatokra tehettem szert. Külön köszönöm Dr. Kisné Xuannak francia nyelvű írásaim, pályázataim nyelvi hiányosságainak türelmes javításáért. Köszönöm Dr. Barna Juditnak, hogy annyi sok írásomat lektorálta, építő kritikáival és megjegyzéseivel, javaslataival segített, valamint a propídium jodidos festési kísérlethez nyújtott támogatását, amelyet Dr. Varga Ákos PhD hallgató kollegámnak is köszönök. Köszönöm Lipcsei Józsefné asszisztensi közreműködését, amely nélkül a minták feldolgozása nem sikerülthetett volna. Köszönöm Lennert Lászlónénak és Dr. Gihan Shaaban-nak a statisztikai analízisek elvégzésében nyújtott segítségét. Köszönöm Lionel Million-nak és Michel Lague-nek a keltetőben, a laborban és a mesterséges termékenyítésnél végzett fáradhatatlan asszisztensi munkájukat és Monique Ruinautnak az adatszolgáltatást. Köszönöm Dr. Papp Miklósnak és Vincent Dupuy-nek cikkeim stilisztikai és nyelvi lektorálását. Végezetül köszönöm családomnak, hogy mindvégig nyugodt hátteret és sok-sok bíztatást adott.
109
