No title

OPVK CZ.1.07/2.2.00/28.0184

Historie biochemie KBC/HIBC prof. Mgr. Marek Šebela, Ph.D. LS 2012/2013

Biochemie v USA a Kanadě

Maud Leonora Menten (*20. 3. 1879 – †26. 7. 1960) byla kanadskou vědkyní z oblastí lékařství, lékařské chemie a biochemie, která je známa pro svůj příspěvek k formulaci rovnice Michaelise-Mentenové. Narodila se v Port Lambdonu v Ontariu a studovala medicínu na univerzitě v Torontu (M.D. v r. 1911, byla mezi prvními ženami v Kanadě). Diplomovou práci zpracovala na univerzitě v Chicagu. V r. 1912 odešla za výzkumnou činností do Berlína, kde spolupracovala s Leonorem Michaelisem (Biochem. Zeitschrift 1913, 49:333–69). V r. 1916 získala v Chicagu Ph.D. s disertací věnovanou zásaditosti krve při chorobách. V l. 1923-1960 pracovala jako patolog na Pittsburské univerzitě, v l. 1951-1953 byla vědeckou pracovnicí na Lékařském výzkumném ústavu Britské Kolumbie.

http://www.flickr.com

Maminka byla vedoucí pošty. Během studií na univerzitě v Torontu pracovala M. Mentenová jako demonstrátorka ve fyziologické laboraři (získala magisterský titul z fyziologie v r. 1907). Získala roční stipendium na Rockefellerově ústavu pro lékařský výzkum (NYC), kde publikovala první práci o vlivu bromidu radia na tumory potkanů. Praktikovala v nemocnici pro ženy a děti v NY. Z její výzkumné práce je třeba dále zmínit objev spřažené reakce pro alkalickou fosfatasu s azobarvivem, která se používá v histochemii. Popsala toxiny z některých baktérií a byla mezi prvními, co separovali proteiny pomocí elektroforézy (1944). Pracovala na vlastnostech hemoglobinu, regulaci hladiny krevního cukru a funkci ledvin. Napsala zhruba 100 vědeckých prací. Měla vztah k umění (hudba, kreslení). Zabývala se horskou turistikou a astronomií. Kromě mateřského jazyka uměla také rusky, německy, francouzsky a italsky. Jezdila více než 30 let ve Fordu, model T. Celý život byla kanadskou občankou, i když pracovala v USA. V r. 1988 byla uvedena do Síně slávy kanadských lékařů.

James Batcheller Sumner (*19. 11. 1887 – †13. 8. 1955) Sumner byl prvním biochemikem, který krystaloval enzym (ureasu). Tento jeho výsledek byl přijat s nedůvěrou či dokonce s výsměchem nicméně přispěl ke konečnému pochopení toho faktu, že enzymy patří mezi proteiny. Narodil se v Cantonu u Bostonu, jeho předkové přišli do Ameriky z Anglie před pol. 17. stol. Jeho dědeček měl továrnu na zpracování bavlny a farmu. Už jako dítě proto mohl pozorovat parní a pletací stroje a zvířata na farmě. Na střední škole si oblíbil chemii a fyziku. Při lovecké výpravě ho postřelil společník do levé ruky, která musela být amputována nad loktem. Musel se přeučit na praváka, ovládal i s postižením sporty jako tenis, lyžování nebo jízda na kánoi .

Od r. 1906 studoval na Harvardu elektrické inženýrství, ale brzy to změnil za studium chemie, na škole publikoval jako spoluautor se svým profesorem práci o syntéze papaverinu. Po ukončení studia v r. 1910 šel pracovat do přádelny strýce. Po půl roce dostal nabídku učit jeden semestr chemii a fyziologii na Koleji Mt. Allison v Sackvillu, Nový Brunšvik (Kanada). Pak ještě krátce působil jako asistent na Worcesterské polytechnice. Následně odešel na Lékařskou fakultu Harvardu, kde dostudoval biochemii u Otto Folina (1867-1934), chemika pocházejícího ze Švédska, který se zabýval analytickými mikrometodami. Folin spolu s rumunským stážistou jménem Vintilă Ciocâlteu (1890-1940) vyvinuli činidlo pro stanovení fenolových látek (Folin-Ciocalteu Reagent, FCR). Absolvoval v r. 1913 a v r. 1914 získal doktorát, disertace se zabývala tvorbou močoviny v těle živočichů, spolupracoval s Cyrusem H. Fiskem, objevitelem kreatinfosfátu (1927). Poté nastoupil na Cornellovu univerzitu, kde působil na pobočce Lékařské fakulty v Ithace, NY. Byl docentem a později profesorem na Katedře fyziologie a biochemie. V r. 1938 přešel na zoologii na Přírodovědecké fakultě. V r. 1945 pak zakotvil na Fakultě zemědělství, Katedra biochemie a výživy. Bylz zde od. 1947 ředitelem Laboratoře chemie enzymů.

Otto Folin v laboratoři McLeanovy nemocnice v Bostonu (rok 1905).

V l. 1920-21 absolvoval postdoktorský pobyt na Lékařské fakultě Bruselské univerzity v Belgii. V l. 1929 byl u nobelisty Hanse von Eulera (1873-1964) na Stockholmské univerzitě a konečně v r. 1937 na univerzitě v Uppsale. Na Cornellu především učil biochemii s velkým úvazkem, ku pomoci měl pouze jediného asistenta, příležitostí k vědecké práci měl málo. Publikoval na téma bioanalytických metod, čímž se zabýval už na Harvardu. Šlo o stanovení amoniaku a močoviny např. ve svalu a moči. Byl fascinován problémem podstaty enzymů a rozhodl se získat čistý enzym. Zvolil ureasu z fazole Canavalia ensiformis odkud předtím krystaloval i dva globuliny. Cesta ke krystalické urease trvala 9 let, zkoušel mnoho metod a reagencií, nakonec využil relativně jednoduché procedury, získal koncentrát s malými krystaly. Po centrifugaci a rozpuštění ve vodě šlo naměřit vysokou aktivitu a test na obsah proteinů byl pozitivní. Výsledky byly publikovány v J. Biol. Chem. v r. 1926. Publikace byla přijata s nedůvěrou, zejména Richardem M. Wilstatterem (1872-1942) a jeho žáky v Německu, kteří předpokládali, že enzymy nejsou proteinové povahy, s tím, že krystaloval pouhý proteinový nosič enzymu. V následujících letech Sumner podpořil svoji převratnou práci dalšími publikovanými daty (10 prací).

V r. 1939 John Howard Northrop (1891-1987) z Rockefellerova ústavu v Princetonu, NJ, krystaloval pepsin a později s Mosesem Kunitzem (18881978) krystaloval trypsin a chymotrypsin. Ještě několik let ale trvalo, než se všeobecně akceptovalo, že enzymy jsou proteiny. V r. 1946 získali Sumner, Northrop a Wendell M. Stanley (19041971) Nobelovu cenu za chemii.

Sumner rovněž krystaloval katalasu, s Alexanderem Douncem (1909-1997), ten později jako první vyslovil hypotézu, že DNA by mohla být templátem pro tvorbu RNA a následně proteinů, předpověděl genetický kód (1952), objevil také skleněný homogenizátor pojmenovaný po něm, umožňující izolaci malých organel, jako jsou mitochondrie. Celkem Sumner získal půl tuctu krystalických enzymů. Provedl osobně většinu laboratorních experimentů. Při přípravě čtyřdílné knihy o enzymech, do které přispívalo 78 vědců a měla 2800 stran nejen posuzoval všechny příspěvky, ale i osobně ověřoval v laboratoři některé metodiky.

Frederick Grant Banting (*14. 11. 1891- †21. 2. 1941) F. Banting byl kanadský medicínský výzkumník, lékař a nositel Nobelovy ceny, který je považován za prvotního objevitele insulinu. Nobelovu cenu získal spolu se Skotem Johnem Jamesem Rickardem Macleodem (1876-1935) a podělil se o finanční odměnu se svým spolupracovníkem Charlesem Herbertem Bestem (18991978). Od kanadské vlády dostal za odměnu celoživotní rentu na výzkum. Banting se narodil na farmě v Ontariu (Alliston), byl nejmladší z pěti dětí. V místě navštěvoval veřejnou základní i střední školu. Chtěl vstoupit do armády, ale byl odmítnut kvůli slabému zraku. Na Torontské univerzitě proto začal se studiem bohoslovectví a posléze medicíny.

Zdroj: Wiki

V roce 1916 získal bakalářský titul a narukoval do Lékařského sboru Kanadské armády. Bojoval ve Velké válce ve Francii a byl v r. 1918 raněn v bitvě u Cambrai (Kamerijk). Za hrdinství získal Válečný kříž (1919). Po návratu do Kanady měl praxi v Londýně, Ontario. Po návratu do Toronta studoval ortopedii a pracoval v nemocnici. Učil na univerzitách v Londýně a Torontu a v r. 1922 získal titul doktor medicíny. O diabetes se zajímal mj. v souvislosti s jedním článkem o pankreatu. V té době již díky práci jiných vědců (Naunyn, Minkowski, Opie, Schafer) bylo známo, že pankreas (Langerhansovy ostrůvky) produkuje hormon, jehož nedostatek vyvolává symptomy diabetu. Název insulin pochází od Schafera. Pokusy izolovat insulin z rozdrceného pankreatu do té doby ztroskotaly na jeho rozkladu působením proteolýzy. Moses Barron uveřejnil článek o experimentálním podvázání vývodu pankreatu, který poslézle vedl k odumření buněk vylučujících trypsin, přičemž zůstaly nepoškozeny buňky Langerhansových ostrůvků. Banting diskutoval záležitost s Macleodem, profesorem fyziologie na Torontské univerzitě, který mu dal k dispozici laboratoř a asistenta Besta. Banting a Best pak spolu úspěšně získali insulin. Banting se v roce 1922 stal starším medicínským demonstrátorem na Torontské univerzitě a v následujícím roce získal pozici „Banting and Best Chair“ v medicínském výzkumu financovanou provincií Ontario.

Zdroj: Wiki

Stal se rovněž čestným poradcem v několika nemocnicích v Torontu, Pracoval dále jako vědec na Katedře medicínského výzkumu Bantinga a Besta. Věnoval se problematice silikózy, rakoviny, procesu utonutí a jeho obrácení. V souvislosti s dobou druhé světové války též pracoval na medicínské problematice v letectví (přechodná ztráta vědomí ve velkých výškách, synkopa - „blackout“) jako vedoucí výzkumné jednotky v tajném zařízení Kanadského královského letectva (RCAF). Zemřel v r. 1941 na následky zranění, které utrpěl při letecké havárii v Newfoundlandu při cestě do Anglie. Byl totiž spojovacím důstojníkem mezi britskými a severoamerickými lékařskými službami. V soukromém životě se věnoval malířství, maloval především kanadskou krajinu a zúčastnil se i vládou financovaných expedic do Arktidy (Velké Otročí jezero). Byl dvakrát ženatý, z prvního manželství měl syna. Byl členem mnoha vědeckých a lékařských společností doma i v Británii a USA, v r. 1934 se stal rytířem Řádu Britského impéria. V r. 1935 byl zvolen za člena Královské společnosti. V r. 1989 byl zapálen v Londýně (Ontario) Plamen naděje, na počest Bantinga a obětí diabetes, má hořet dokud nebude účinná léčba této nemoci. Je po něm pojmenováno několik škol a institucí.

Charles Herbert Best (*27. 2. 1899- †31. 3. 1978) C. H. Best byl americko-kanadský výzkumník v oboru medicíny, který je znám jako spoluobjevitel insulinu. Narodil se v Maine na kanadskoamerické hranici jako syn Kanaďanů. Jeho otec byl lékař. V r. 1916 odešel do Toronta kde studoval na univerzitě humanitní vědy. V r. 1918 vstoupil do kanadské armády, ale do války kvůli příměří nezasáhl. Po návratu z výcviku v Anglii se vzdělával na Torontské univerzitě v oborech fyziologie, biochemie a chemická patologie. Jako student pracoval experimentálně na souvislostech diabetu u profesora J. J. R. Macleoda, po promoci od května r. 1921 spolupracoval s F. G. Bantingem.

Biogr. Mems Fell. R. Soc.

Jeho zájem o studium diabetu plynul z tragické zkušenosti z vlastní rodiny, kdy jeho teta zemřela v diabetickém komatu. Sám Macleod kolem r. 1920 zcela nevěřil, že Langerhansovy ostrůvky produkují antidiabetický hormon. Nabízela se ještě možnost, že průchod krve pankreatem ovlivňuje její složení, k čemuž nenastává po odnětí pankreatu u experimentálních zvířat. Banting v r. 1920 navštívil Macleoda s návrhem na výzkum obsahu buněk Langerhansových ostrůvků po podvázání vývodu pankreatu a odumření hroznovitých pankreatických buněk. Macleod byl expert na metabolismus sacharidů, návrh přijal skepticky (nebyl nový!), ale protože odjížděl na následující léto do Evropy, rozhodl se umožnit Bantingovi provést experimenty.

Banting s Bestem podvázali vývod z pankreatu u laboratorních psů, ti pak byli ponecháni několik týdnů bez dalšího zásahu. Z podvázaných pankreatů byl pak připraven vodný extrakt a ten injekčně vpraven psům s odstraněným pankreatem, u kterých byla takto vyvolána silná cukrovka. Injekce způsobila podstatný pokles krevního cukru. Extrakty jiných orgánů např. sleziny byly bez účinku. Experiment byl několikrát opakován, opakování si vyžádal i Macleod po návratu z Evropy (září 1921). Výsledky byly poprvé uveřejněny na setkání Americké fyziologické společnosti na Yaleově univerzitě v prosinci 1921. Protože Banting a Best nebyli členy společnosti, byl jako hlavní autor uveden Macleod, což vyvolalo u Bantinga pocit křivdy.

První publikace autorů Banting a Best o insulinu byla v časopise Journal of Laboratory and Clinical Medicine (únor 1922). Další práce byla později v r. 1922 ve stejném časopise. Extrakt z pankreatu hovězího plodu umožnil při denní injekční aplikaci žít depankreatizovanému psu po dobu 70 dní. Bylo to kvůli několikanásobně vyššímu obsahu insulinu v extraktu a kvůli skutečnosti, že pankreas plodu do 5tého měsíce neobsahuje aktivní trypsin. Stabilní insulin byl posléze získáván okyseleným ředěným ethanolem. S jeho přečištěním pomáhal biochemik prof. James Bertram Collip (1892-1965) z Albertské univerzity v Edmontonu. Od r. 1922 byl insulinový extrakt testován u pacientů ve Všeobecné nemocnici v Torontu. Za velkou produkci insulinu byl později odpovědný Best (do r. 1941) jako ředitel Oddělení insulinu Conaughtových laboratoří na Torontské univerzitě. Banting, Best, Collip a Macleod se dále věnovali mechanismu působení insulinu. Přitom se zjistilo u laboratorních králíků, že injekční dávkování insulinu může vést ke křečím a smrti (v důsledku hypoglykemie). Vzešla potřeba biologicky standardizovat připravovaný insulin. Patenty na produkci insulinu byly podány v Kanadě, USA a Velké Británii. Na Torontské univerzitě vznikl dohlížecí Insulinový výbor. Licence na přípravu insulinu byla v r. 1922 poskytnuta společnosti Eli Lilly v Indianapolisu.

Působení insulinu (zdroj Wikipedia)

V r. 1923 byla Nobelova cena udělena jen Bantingovi a Macleodovi, Banting se o finanční prémii podělil s Bestem a Macleod s Collipem. V r. 1924 se Best oženil, v r. 1925 získal podporu pro vědecký pobyt v Evropě (Národní ústav pro medicínský výzkum v Londýně). Zde se podílel na studiu metabolismu glukosy o experimentálních zvířatech s odstraněnými játry, kde byla hladina glukosy v krvi udržována infuzí. Po přídavku insulinu do infúze klesala hladina krevní glukosy odbouráním a tvorbou glykogenu. V Londýně dále studoval histamin v plicní tkáni. V r. 1927 přijal profesuru na Torontské univerzitě (fyziologická hygiena). V r. 1928 získal na Londýnské univerzitě titul D.Sc. Po odchodu Macleoda do Aberdeenu (Skotsko) v r. 1929 se Best ve věku 30ti let stal v Torontu vedoucím Katedry fyziologie. Po Bantingově smrti v r. 1941 se stal ředitelem Katedry medicínského výzkumu Bantinga a Besta, tuto pozici držel do r. 1967, kdy odešel na odpočinek. Dalším z Bantingových výzkumů byla role cholinu v potravě laboratorních zvířat jako prevence proti hepatické cirhóze (tuk v játrech) vyvíjející se v důsledky chybějícího pankreatu. V r. 1937 vyvinul tým včetně Besta postup, jak získávat heparin z hovězích plic. Jeho válečný výzkum pro kanadské námořnictvo spočíval v problematice nočního vidění stimulovaném červeným světlem. Zabýval se i hyperglykemií vyvolanou glukagonem.

Robert „Jim“ Brainard Corey (*19. 4. 1897- †23. 4. 1971) Robert Corey byl dlouholetým spolupracovníkem Linuse Paulinga (19011994) na Caltechu, kde byly na konci 40. let a začátku 50. let 20. stol. Formulovány základní principy struktury proteinů: α-helix a β-skládaný list. Spolupráce byla založena na Paulingových představách a nápadech, které pak Corey ověřoval na základě výsledků difrakčních experimentů. Narodil se ve Springfieldu, MA, jeho rodiče pocházeli z rodu anglických přistěhovalců, kteří se dostali do Ameriky v polovině 17. století. Oba byli vzdělanými absolventy Cornellovy univerzity, otec byl strojním inženýrem.

Zdroj: NAS Biographical Memoirs

Corey absolvoval univerzitu v Pittsburghu, v r. 1919 se stal bakalářem v oboru chemie. Od mládí byl chatrného zdraví, neboť prodělal dětskou obrnu, měl částečně ochrnutou ruku a kulhal. To zřejmě přispělo k jeho povaze, byl velmi vážný a příliš nevyhledával společnost. Magisterské studium absolvoval na Cornellově univerzitě v Ithace, NY, kde studoval anorganickou chemii, spektroskopii a fyzikální chemii. Zde se spolužákem sestrojili skleněnou vakuovou aparaturu a charakterizovali různé hydridy germania, které v ní vytvořili.

V r. 1924 získal titul Ph.D. a pokračoval na Cornellu jako instruktor analytické chemie. Seznámil se s rentgenovým spektrometrem, který byl předtím používán Ralphem W. G. Wyckoffem (1897-1994), v té době už pracujícím na Rockefellerově ústavu pro medicínský výzkum (nyní Rockefellerová univerzita, NYC). V r. 1928 tam Corey odešel jako asistent v oboru biofyzika, v r. 1930 se tam stal výzkumným pracovníkem, oženil se. S Wyckoffem se zabýval použitím RTG difrakce pro studium jednoduchých organických molekul s C-C a C-N vazbami (např. thiomočovina), aby se nakonec dostali k analýze krystalických a vláknitých proteinů. Laboratoř ale byla v r. 1937 zrušena, Wyckoff odešel na NIH (Washington). Coreymu bylo nabídnuto roční stipendium pro pokračování jinde, provozní peníze a přesun přístrojů.

Corey napsal Paulingovi, který v té době začinal se strukturní chemií aplikovanou na biologické systémy. Pauling ho přijal na Caltech, ale s podmínkou, že nemůže být jeho pobyt delší než roční. Mezi přístroji, které si s sebou Corey vzal do Pasadeny byl mj. Weissenbergův fotoaparát pro krystalografii.

V Pasadeně zůstal po zbytek profesní dráhy, úspěšně postupoval v kariéře, v r. 1938 byl pouhým stipendistou, v r. 1946 se ale stal výzkumným pracovníkem a v r. 1949 profesorem strukturní chemie. Emeritním profesorem se stal v r. 1968, pak už kvůli zdraví ovšem nebyl příliš aktivní. Jeho povaha byla naprostým protikladem Paulinga, možná proto bylo tohle duo tak efektivní. Pro Coreyho byla typická pečlivost, pozornost k detailům. S Paulingem nikdy nebyli blízcí přátelé. Před válkou se Corey v Pasadeně věnoval určování krystalových struktur malých molekul : glycinu, D,L-alaninu a diketopiperazinu (cyklický anhydrid glycylglycinu). Byly to první krystalové struktury svého druhu. K výpočtům přitom tehdy mohl využít pouze logaritmické pravítko (300 intenzit pro alanin). V té době již byla k dispozici Pattersonova funkce pro řešení struktur, kterou Arthur Lindo Patterson (1902-1906) zavedl r. 1934.

Struktura diketopiperazinu jako první prokazovala, že peptidová vazba je planární. V době války se Pauling zabýval projektem studia stability a výbušnosti střelného prachu a Corey musel řešit četné administrativní záležitosti s Ministerstvem války. K vědecké práci se tak vrátil až po válce. Pauling k řešení biologických problémů chemickými postupy zahrnujícími termodynamiku, kvantovou mechaniku, elektronovou difrakci v plynné fázi a krystalografii povolal řadu studentů a postdoků. Do r. 1955 byly publikovány krystalové struktury šesti aminokyselin a tří dipeptidů. S teoretickou možností výskytu helikální proteinové struktury přišel Pauling na konci 40. let. Kombinovala se tak data z teoretických modelů a experimentální difrakčních dat. Struktura dnes známého α-helixu byla kompatibilní s daty ze syntetických polypeptidů poly-γ-methyl-L-glutamátu a poly-γ-fenyl-L-glutamátu. Následovaly publikace v časopisu PNAS popisující α-helix, další helix – méně kompaktní, paralelní a antiparalelní β-skládaný list včetně atomových souřadnic (1950-51). Tím byl zahájen věk molekulární biologie akcelerovaný krátce nato Watson-Crickovou DNA dvoušroubovicí. Rozsáhle se využívalo modelů struktur. Název CPK modely je odvozen ze jmen Corey, Pauling, Koltun.

V období 1950-55 studovali Pauling a Corey struktury řady vláknitých proteinů z vlasů, hedvábí, vlny, peří a další včetně kolagenu. K tomu chybně vyhodnotili strukturní data pro strukturu deoxyribonukleové kyseliny, kde uvažovali trojitou šroubovici. Při hustotě 1.62 nebyli schopni konstruovat model, kde by páry bazí byly uvnitř. Navrhli tak fosfáty uvnitř a spojení řetězců prostřednictvím –OH…..H vazeb. Pauling se začal věnovat antinukleárním aktivitám a veřejnému přednášení, proto se Corey stal de facto vedoucím laboratoře struktur. Na konci 50. let se Corey zaměřil na struktury krystalických proteinů, zejména lysozymu a dále nukleotidů a nukleosidů. Při tom Karst Hoogesteen objevil obrácené párování (Hoogsteenovo párování). Projekt struktury lysozymu s využitím komplexů s těžkými kovy Ta a Nb byl zklamáním, protože bylo sebráno velké množství dat, získána mapa elektronové hustoty, ale mezitím byla struktura publikována jinou laboratoří (D. C. Phillips, PNAS 57, 484-95, 1967).

Linus Carl Pauling (*28. 2. 1901- †19. 8. 1994) Pauling je považován za největšího chemika 20. století. Měl široký záběr působení: kvantová mechanika, krystalografie, mineralogie, strukturní chemie, imunologie, medicína, evoluce. Nejvíce je znám pro proniknutí do podstaty chemické vazby, objev sekundárních struktur proteinů (helix, skládaný list), objev podstaty srpkovité anémie. Byl jedním ze zakladatelů molekulární biologie. V roce 1954 získal Nobelovu cenu za chemii. V r. 1962 získal Nobelovu cenu míru, byl tak oceněn jeho odmítavý postoj k testování jaderných zbraní. Byl velkým propagátorem vitamínu C jako potravinového doplňku pro zlepšení zdraví a prevenci onemocnění.

Narodil se v Portlandu v Oregonu, po otci měl německé a po matce irské kořeny. Otec byl nějaký čas obchodním cestujícím, později si otevřel vlastní drogerii. Brzy se naučil číst, v devíti letech měl za sebou četbu Bible či Darwinovy evoluční teorie. Četl též Encyklopedii Britannicu. Ve škole byl schopný, získal zájem o chemii a od r. 1917 studoval na Oregonské zemědělské univerzitě chemické inženýrství. Již v 18ti letech se stal instruktorem na chemické katedře, četl odborné knihy a časopisy a začal se zajímat problematikou chemické vazby. V roce 1922 získal bakalářský titul a přednášel úvodní kurz chemie pro studentky domácnostní ekonomie, kde se seznámil s budoucí manželkou (Ava Helen Miller). V témže roce se dostal na Kalifornský technologický ústav (Caltech) v Pasadeně, kde zůstal více než 40 let. Důvodem bylo tříleté studium k získání doktorátu a nabídka stipendia od fyzikálního chemika Arthura Amose Noyese (1866-1936), jednoho ze zakladatelů, spojená s částečným úvazkem instruktora. Jeho disertace se zabývala rentgenovou difrakční analýzou. Spolu s R. G. Dickinsonem zjistil např. krystalovou strukturu molybdenitu MoS2. Doktorát získal s 12ti publikacemi mj. s Peterem Debyem (18841966) na téma zředěných roztoků iontů. Od r. 1926 působil díky stipendiu na Ústavu teoretické fyziky v Mnichově u Arnolda Sommerfelda (1868-1951).

V r. 1927 se vrátil na Caltech jako odborný asistent pro teoretickou chemii, aplikoval poznatky vlnové mechaniky na atomy s více elektrony. V r. 1929 se stal docentem a v r. 1931 řádným profesorem. Experimentální data se spolupracovníky získaval rentgenovou krystalografií, elektronovou difrakcí v plynné fázi, IR, UV a Ramanovou spektroskopií – pro stovky molekul byly získány meziatomové vzdálenosti a vazebné úhly. Na těchto podkladech povstaly výsledky jako Paulingovy iontové poloměry (velikosti iontů v krystal. mřížce) či Paulingova pravidla (5), která definují principy vzájemné interakce mezi kationty a anionty v reálných strukturách. V r. 1927 byla vyřešena Schrödingerova rovnice pro molekulový ion H2+ (Ø. Burrau), Pauling přišel v r. 1928 s koncepcí LCAO („linear combination of atomic orbitals“) – vlnová funkce H2+ jako lineární kombinace atomových funkcí dvou atomů v základním stavu, energie interakce má pak minimum. Tato koncepce byla základem i pro pozdější teorii molekulových orbitalů (MO; F. Hund, E. Hückel, R. S. Mulliken), i když ve své době Pauling dával přednost modelu valenční vazby (VB) – elektronové páry kovalentní vazeb jsou v lokalizovaných orbitalech, každý elektron z páru má opačný spin. Přišel rovněž s koncepcí hybridizovaných sp orbitalů pro vysvětlení čtyřvaznosti uhlíku. Dále přišel s koncepty rezonančních struktur a elektronegativity. Vše shrnul v knize „The Nature of the Chemical Bond“, vyšla poprvé r. 1939.

Na konci 40. let se Paulingův záměr přesouvá od chemických vazeb ke struktuře a funkci biologických molekul. Zde již dříve předpokládal velký význam vodíkových vazeb, svými myšlenkami předběhl prokázání DNA jako nositelky genetické informace a roli enzymů při snižování aktivační energie reakcí a zvyšování jejich rychlosti. Už v době hospodářské krize získal grant od Rockefellerovy nadace, věnoval se studiu hemoglobinu, měřením magnetické susceptibility prokázal kovalentní vazbu kyslíku na železo v hemu – žádné nepárové elektrony (Pauling a Coryell, 1936). S Alfredem E. Mirskym (1900-1974) popsal denaturaci proteinů jako proces, který za jemných podmínek může být vratný, jinak je nevratný. Spolu s Maxem Delbrückem (1906-1981) zmínili pojem komplementarita („complementariness“) jako podstatu biologických interakcí, což rozpracoval na příkladu interakce protilátky s antigenem. Pokud jde o protilátky, chybně se domníval, že mají stejné polypeptidové řetězce jako jiné globuliny a liší se pouze v jeho konfiguraci. Neuměl tehdy vysvětlit, jaký mechanismus by na základě struktury antigenu vedl ke změnám v pořadí aminokyselin. V r. 1941 se dietou vyléčil z Blightovy choroby (onemocnění ledvin), po vstupu USA do války se věnoval válečnému výzkumu, např. umělých protilátek či měření obsahu kyslíku v ponorkách.

V r. 1947 byl hostujícím profesorem v Anglii a přednášel v Oxfordu. Na základě krystalografické práce Roberta B. Coreyho (1897-1971) s aminokyselinami a malými peptidy dospěl k modelu sekundární struktury αhelixu proteinů (18 zbytků AK na 5 otoček helixu). V té době se objevila práce Bragga, Kendrewa a Perutze (1950) o více možných helikálních strukturách α-keratinu. Pauling spolu s Coreym a Bransonem publikovali práce o sekundárních strukturách proteinů v l. 1950 a 1951. V r. 1952 byl proveden experiment A. D. Hersheye a M. Chaseové, který ukázal, že DNA je nositelkou dědičné informace (fágová infekce vedla k inkorporaci fágové DNA, fágový protein se nedostal do bakteriální buňky). V r. 1953 publikoval Pauling s Coreym práci o struktuře DNA, kdy uvažovali sbalení protonovaných fosfátů (HPO4-) podél osy obalených pentosovými zbytky a s bázemi trčícími směrem ven. Ještě před publikací byla kopie textu zaslána do Cambridge tandemu Watson-Crick, kteří byli i takto stimulovaní k dokončení své struktury s párováním bazí. Paulingova myšlenka byla chybná, překvapivě v ní opustil svůj princip komplementarity. Důvodem byla nereprezentativní krystalografická data získaná z degradované DNA a při výpočtech zanedbal velký obsah vody v DNA vzorcích. Neměl prostě k dispozici data od Rosalind Franklinové (1920-1958) a publikování uspěchal.

Jako zakladatel molekulární biologie se Pauling uvádí pro pochopení příčiny srpkovité anémie na molekulové úrovni. Intuitivně předpokládal chybu v sekvenci hemoglobinu vedoucí k agregaci molekul. Potvrzení bylo umožněno příchodem elektroforézy (Pauling et al., 1949). Mnohem později pak bylo sekvenční analýzou ukázáno, že jde o důsledek záměny Glu za Val v β-řetězci na pozici 6. Dalším významným výsledkem v souvislosti s hemoglobinem bylo zjištění, že odlišnosti v sekvencích řetězců hemoglobinu u člověka, koně, gorily aj. mohou být využity jako „biologické hodiny“ pro sledování evoluce (Zuckerkandl a Pauling, 1962). Tak bylo odvozeno, že rozdíl mezi člověkem a gorilou se odvíjí od společného předka před 10 mil. lety, rozdíl mezi a- a ß-řetězcem je starý až 600 mil. let (dáno frekvencemi mutací). Pauling byl v 50. letech 20. stol. veřejně známou osobou. Pro svůj odpor k vývoji jaderných zbraní byl odstaven od vládních výzkumných peněz a bylo mu bráněno cestovat mimo USA (McCarthyho éra, válka v Koreji). V r. 1958 organizoval petici pro zákaz jaderných testů předanou generálnímu tajemníkovi OSN Hammarskjöldovi, další petice se objevila v r. 1961. Po zákazu testů ve vzduchu, vesmírném a podmořském prostoru v r. 1963 získal Pauling Nobelovu cenu míru za rok 1962.

V 60. letech měnil působiště: Kalifornská univerzita v San Diegu (1967-69), Stanfordova univerzita (1969-1972). Vzhledem k častému nachlazení na doporučení lékaře (Dr. Irwin Stone) začal užívat denně tři gramy kyseliny askorbové. Stal se pak popularizátorem tohoto postupu, což se nesetkalo s pochopením lékařské komunity. Spolupráce se skotským lékařem Ewanem Cameronem vedla k publikaci o použití vitamínu C jako terapeutika v konečné fázi rakoviny. S Arthurem B. Robinsonem založil Ústav pro ortomolekulární medicínu (1973), později byl přejmenován na Ústav přírodních věd a medicíny Linuse Paulinga. Ústav měl finanční těžkosti, partneři se rozešli se soudní dohrou. Nynější pohled na pozitivní terapeutický efekt vitamínu C zdůrazňuje jeho funkci antioxidantu. Kromě Nobelových cen získal Pauling řadu ocenění a čestných doktorátů: na Oregonské státní univerzitě, Brooklynském polytechnickém ústavu, Reedově univerzitě v Portlandu a univerzitách v Chicagu, Princetonu, Yaleově univ., Cambridgi, Londýně, Oxfordu, Paříži, Toulouse, Montepellieru, Lyonu, Lutychu, Berlíně (Humboldtova u.), Melbourne, Yorku (Toronto), Novém Brunšviku a Varšavě.

Dean Burk (*21. 3. 1904- †6. 10. 1988) Dean Burk byl americký biochemik a vědec v oblasti medicíny, spoluobjevitel biotinu. Pracoval mj. u Otto Heinricha Warburga (1883-1970) v berlínském Ústavu císaře Viléma a také v Národním ústavu pro výzkum rakoviny. V r. 1934 spolu s Hansem Lineweaverem (19072009) přispěl k enzymologii publikováním Lineweaver-Burkova grafu pro určení parametrů enzymové reakce. Narodil se v Kalifornii (Oakland), jeho otec Frederic byl zakladatelem učitelského ústavu, ze které se později stala Státní univerzita v St. Francisku. Od 15ti let studoval na Kalifornské univerzitě v Davisu, po roce pak přestoupil do Berkeley, kde získal titul bakaláře (entomologie, 1923) a Ph.D. (výživa rostlin a chemie, 1927).

Zdroj: Wiki

V l. 1927-1929 byl na stážích na Londýnské univerzitě, Ústavu císaře Viléma a Harvardově univerzitě. Od r. 1929 pracoval v Laboratoři výzkumu vázaného dusíku při Ministerstvu zemědělství (USDA). Ve 30. letech byl na stážích v Rusku (na Akademii u A. N. Bacha and V. I. Engelhardta). V r. 1939 přišel jako starší výzlumník na Národní ústav pro výzkum rakoviny. Zde pracoval více jak třicet let; když odcházel do důchodu (1974), byl vedoucím cytochemické laboratoře. V l. 1939-1941 učil biochemii na Lékařské fakultě Cornellovy univerzity. Od r. 1947 působil na Univerzitě George Washingtona. Práce o enzymové kinetice s Hansem Lineweaverem (1934) je nejcitovanějším příspěvkem v časopise Journal of the American Chemical Society. Mimo to publikovali spolu články o fixaci dusíku u Azotobacter. Burk byl spoluobjevitelem biotinu (vitamínu H či B7), stejně jako biochemik Vincent du Vigneaud (1901-1978), který v r. 1955 získal Nobelovu cenu za chemii (za izolaci, strukturní identifikaci a totální syntézu cyklického peptidu oxytocinu). Jako objevitel se uvádí Paul Gyorgy (1893-1976), americký nutricionista maďarského původu. Burk napsal několik článků s Otto Heinrichem Warburgem. V r. 1952 získal za studium fotosyntézy Hildebrandovu cenu. V r. 1965 byl oceněn Cenou Gerharda Domagka za vývoj postupů pro odlišení normální a rakovinové buňky. Na konci kariéry publikoval o alternativní léčbě rakoviny (laetril). Byl velkým odpůrcem fluoridace vody.

Aparatury pro studium fixace dusíku u baktérií; vlevo Burk, vpravo Lineweaver; zdroj: www.chemheritage.org

Hans Lineweaver (*25. 12. 1907- †10. 6. 2009) H. L. byl americký fyzikální chemik, který je znám pro svůj příspěvek k grafu Lineweavera a Burka pro určení parametrů enzymové reakce (1934). Narodil se v Západní Virginii jako syn reverenda. Navštěvoval presbyteriánskou Kolej Davise & Elkinse ve WV odkud přešel na Univerzitu George Washingtona. V r. 1930 zde získal bakaláře a v r. 1933 magistra (chemie). Ph.D. v oboru fyzikální chemie dostal na Univerzitě Johnse Hopkinse (Baltimore) v r. 1936.

Ještě jako student začal v r. 1929 pracovat jako pomocná vědecká síla v laboratoři při americkém Ministerstvu zemědělství (USDA).

San Francisco Chronicle

V r. 1930 se stal pomocným chemikem („associate chemist“). Jeho šéfem byl Dean Burk (1904-1988). Práci o dvojnsobně reciprokém grafu spolu s Burkem vyhotovil ještě jako doktorand. V časopise JACS byla posuzována šesti recenzenty, kteří doporučili odmítnutí, editor Arthur B. Lamb však rozhodl opačně! V r. 1939 přešel Lineweaver do nově zřízené Výzkumné laboratoře Západní oblasti (WRRL) USDA v Albany (CA) jako starší biochemik a vedoucí enzymové sekce biochemického oddělení. Během války spoluopracoval s armádou na problematice věnované drůbeži a sušeným vejcím. Od r. 1949 byl vedoucím Laboratoře drůbeže WRRL, na této pozici zůstal až do r. 1973, kdy odešel na odpočinek. Během své kariéry publikoval stovku prací věnovaných drůbežářské technologii, zpracování vajec a biochemii. Byl držitelem 6ti patentů, získal řau ocenění, byl členem vědeckých společností a národních poradních orgánů. Z jeho technologických úspěchu lze zmínit proces pasterizace vaječného bílku a zpracování odpadního peří na krmivo. Dožil se úctyhodných 101 let, měl syna a dceru a důchod trávil ve Walnnut Creeku v Kalifornii.

Publikace Lineweavera a Burka z r. 1934 se zabývá tvorbou komplexu enzym – substrát a úvadí několik možných variant jeho vzniku, včetně možností, kdy se na enzym současně váže více molekul substrátu nebo se také vážou inhibitory – kompetivní a nekompetitivní.

Zmiňuje se podobnost závislosti Michaelise-Mentenové a Langmuirovy adsorpční izotermy q = a.p/(b+p), kde q je množství naadsorbovaného plynu, p je tlak, a je maximální množství navázaného plynu a b je disociační konstanta. Pro případ E+S=ES doporučují autoři vynesení 1/v = KS/Vmax(S) + 1/Vmax oproti Hanesově vynesení (S)/v = (S)/Vmax + KS/Vmax kvůli lepšímu umístění hodnot při nižších koncentracích substrátu. Z vynesení lze pohodlně odečítat hodnotu KS a Vmax. Vysvětluje se rozdíl mezi kompetitivní a nekompeptitivní inhibicí (sklon závislosti a průsečíky na ose y).

David Ezra Green (*5. 8. 1910 – 1983) Green byl americký biochemik, který významně přispěl k vědomostem o enzymech z oblasti transportního řetězce elektronů a oxidační fosforylace. Narodil se v Brooklynu, NYC. Učil se na veřejných školách a v r. 1928 se zapsal na Newyorskou univerzitu. Původně chtěl být lékařem, ale po dvou letech přípravného studia přešel k biologii a absolvoval v r. 1931. Při letní praxi ve Woods Hole, MA, se inspirativně seznámil s Leonorem Michaelisem. Po získání magisterského titulu v r. 1932 odešel do Anglie, kde v Cambridge na katedře biochemie u F. G. Hopkinse potkal tehdejší osobnosti enzymologie např. Malcolma Dixona či Robina Hilla.

V Cambridge pokračoval ve studiu k získání titulu Ph.D., jeho školitelem byl Dixon. Jeho disertační práce měla název “The Application of OxidationReduction Potentials to Biological Systems.” Obhájil ji v r. 1934, ale již rok předtím publikoval výsledky v časopise Biochemical Journal. Za celých 8 let působení v Cambridge publikoval 32 prací. Po evakuaci Britů z Dunkirku se vrátil s rodinou do USA a stal se výzkumníkem na Katedře biochemie Lékařské fakulty Harvardovy univerzity. Laboratoř však byla špatně vybavena, scházel Warburgův přístroj pro měření respirace, centrifuga, všechny kofaktory bylo třeba izolovat z kvasinek či živočišných tkání. Izoloval však kvasinkový flavoproteinu a fosforylasu škrobu z brambor. V r. 1940 publikoval v Cambridge knihu o biologických oxidacích. V r. 1941 se stal odborným asistentem na katedře medicíny Kolumbijské lékařské a chirurgické fakulty v NYC. Zde pokračoval se svým studentem z Harvardu Paulem K. Stumpfem. I když byla válka, díky příspěvkům z různých neveřejných zdrojů mohl tým publikovat 20 článků z oblasti enzymové oxidace aminokyselin, transaminace a mechanismu oxidace pyruvátu (multienzymová reakce) a získal vybavení pro studium enzymů např. spektrofotometr a mixér. Byl aktivním členem diskusního Enzymového klubu na Kolumbijské univerzitě.

V r. 1948 přešel Green do Madisonu na Wisconsinskou univerzitu, Ústav výzkumu enzymů. Stumpf zakotvil na Katedře rostlinné výživy Kalifornské univerzity v Berkeley a stal se rostlinným biochemikem. Od příjezdu do Madisonu se Green věnoval oxidaci mastných kyselin, metaloflavoproteinům, syntéze mastných kyselin, mitochondriálnímu respiračnímu řetězci a oxidační fosforylaci. Díky projektům mohl v poválečné době podporovat až 10 postdoků. Pro pokračující výzkum oxidace MK byl zásadní objev, že k stabilnějším enzymovým preparátům vede cesta přes acetonový prášek nikoli jaterní homogenát. Játra, ledviny a srdce byly denně dováženy z jatek čerstvé v ledu. Pro měření celé dráhy oxidace MK vymyslel Green stanovení s tetrazoliovou solí a spřaženými enzymy. CoASH pro tuto analýzu byl izolován z baktérií a přečišťován precipitací s glutathionem, posléze získáván z továrny na kvasinkové extrakty. Díky tomu bylo možné připravovat různé acyl-CoA jako enzymové substráty a otázka celé dráhy byla vyřešena v průběhu 1 roku. Výsledky byly poprvé prezentovány na setkání Americké biochemické společnosti v Chicagu v r. 1953 (kontroverze s F. Lynenem). Butyryl-CoA-dehydrogenasa byla prvním charakterizovaným flavoproteinem s obsahem mědi. Povrzen tak byl výskyt kovových kofaktorů jiných než je hemové železo.

Studovány byly vlastnosti flavoproteinů, tvorba volných radikálů a přenos elektronu. Prokázala se interakce acyl-CoA-dehydrogenasy s ETF. To vedlo postupně k objevu Fe-S proteinů a jejich charakterizaci EPR spektroskopií. Na návrh Greena se tým Gibsona a Wakila na Ústavu pro výzkum enzymů zabýval biosyntézou MK, pracovali s extrakty holubích jater (konec 50. a začátek 60. let 20. stol.). Sledovali konverzi acetyl-CoA na dlouhořetězcové MK v přítomnosti esenciálních kofaktorů, přičemž prokázali potřebu ATP a NADPH v zatím neznámých biosyntetických krocích. Náhoda pomohla k objevu potřeby HCO3-. Omylem byl použit fosfátový pufr namísto běžně užívaného bikarbonát-fosfátového pufru, důsledkem byla ztráta aktivity enzymové směsi. Protože [14C]-HCO3- nebyl inkorporován přímo do MK, byl hledán intermediát a posléze nalezen malonyl-CoA a prokázána přítomnost acetyl-CoA-karboxylasy a koenzymu biotinu v určité frakci extraktu (R1g). Frakce R2g potom obsahovala synthasu MK. Tým z ústavu také potvrdil, že jako produkt celé dráhy vzniká volná MK, nikoli derivát CoASH. Mnohem větší výzvou však byla problematika přenosu elektronu a oxidační fosforylace. Mitochondrie byly pro tento účel získávány z hovězích a vepřových srdcí a jater.

Srovnání syntézy a odbourávání mastných kyselin

Klíčovou metodikou byla centrifugace. Zásadní objev spočíval v nalezení ubichinonu. R. A. Morton v Anglii v 50. letech získal ubichinon z nezmýdelnitelné frakce tkání jako je trávicí trakt či játra. Na ústavu u Greena byl nalezen ve vodě nerozpustný avšak lipofilní faktor s isoprenoidním řetězcem a nazván CoQ. To byl dosud neznámý článek spojující primární dehydrogenasy (flavoproteiny se železem) s cytochromy. Postupně byly izolovány komplexy I-IV (Hatefi, Ziegler) pomocí centrifugace a frakcionací (pH, soli, chaotropy). Z oddělených komplexů byl pak sestaven funkční dýchací řetězec. V 60. letech se snaha ubírala k vysvětlení oxidační fosforylace. Elektronovou mikroskopií byla sledována struktura mitochondrií v souvislosti s nízkou hladinou vápníku, fosfátu a MK vedoucí k zvýšené permeabilitě, indukci ATPasy, rozpojení oxidační fosforylace a ztrátě kontroly respirace. Byly pozorovány konformační změny a předpokládalo se, že proces uchovávání energie je s nimi spojen. S pomocí matematiky a teoretické chemie byly hledány modely k vysvětlení experimentů. Green však nevěřil chemiosmotické teorii a jeho jméno s ní není spojeno.

Oliver Howe Lowry (*18. 7. 1910 – †29. 6. 1996) Lowry byl americký biochemik známý pro vypracování metody stanovení koncentrace proteinů. Jeho otec byl učitelem a později se stal školským superintendantem. O. Lowry měl sestru a tři bratry, všichni získali vysokoškolské vzdělání. Po střední škole byl rok na brigádě na obchodní lodi a pracoval na statku v Nebrasce. Zapsal se na Severozápadní univerzitu, obor chemické inženýrství. Pobýval na stáži ve Freiburgu v Německu a po návratu studoval od r. 1931 na uviverzitě v Chicagu obor fyziologická chemie. Školitelem jeho diplomové práce na téma stanovení ketolátek v krvi byl Frederick Koch.

Foto: Annu. Rev. Biochem.

Současně s Ph.D. získal i titul M.D. Během studií se seznámil s Bairdem Hastingsem a pracoval s ním v Billingsově nemocnici. Hastings se posléze stal nástupcem Otto Folina jako vedoucí na Harvardu. Prvním Lowryho vědeckým tématem na Harvardu bylo měření Cl-, Na+, K+, Ca2+ a Mg2+, v množstvích tkáně v řádu mg, objektem analýzy byl např. srdeční sval v souvislosti s ischémií. Vypracoval tehdy metodiku pro analýzu kolagenu a elastinu. Ještě na Harvardu získal prostředky na studijní pobyt v Carlsberské laboratři v Kodani, kde pracoval s K. Linderstrømem-Langem. Zde se blíže seznámil s metodami analýzy v mikroměřítku, kterým se pak věnoval po celý život. Následovala etapa na Výzkumném ústavu veřejného zdraví v NYC, oddělení fyziologie a výživy, vzhledem ke vstupu USA do války byl zahájen důležitý nutriční výzkum s O. Besseym. V malém objemu krve (0.1 ml) se určoval obsah vitamínů, proteinů a alkalické fosfatasy, jejíž hladina je v souvislosti s nedostatkem vitamínu D. Dobrovolníci byli krmeni gramovými dávkami vit. C, zjistilo se, že skladovací kapacita těla jsou 4g, nadbytek je vylučován močí.

V r. 1946 publikoval metodu stanovení alkalické fosfatasy s pnitrofenylfosfátem, r. 1951 pak nejcitovanější práci všech dob – stanovení proteinů s Folinovým činidlem, i když princip vlastně nebyl originální.

Princip stanovení proteinů s Folinovým činidlem dle Lowryho:

www.labome.com

Byla vypracována metodika stanovení fosfátu za mírných podmínek, následovala konstrukce mikrocely pro spektrofotometr (30 µl) a vylepšení spektrofluorimetru přídavkem fotonásobiče. Od r. 1947 byl vedoucím katedry farmakologie na Washingtonské univerzitě v St. Louis. Zde se zabýval kvantitativní histochemií mozkové tkáně. Pro stanovení různých látek a enzymových aktivit se používaly lyofilizované řezy potkaních mozků skladované při -70 °C ve vakuu. Z těchto řezů byly dále vysekávány malé kousky a ty váženy na přesných vahách vlastní konstrukce s rameny z křemenných vláken. Maloobjemové kapalné vzorky (do 5 µl) byly ve formě kapiček v olejové fázi ve speciálních destičkách. Pro stanovení aktivity dehydrogenas či byl-li princip tvorby NADH/NADPH využíván ve spřažené reakci posloužila fluorescence. Oxidované formy NAD+ a NADP+ nefluoreskují, ale v alkalickém prostředí je možné tyto přeměnit na fluoreskující deriváty. Ve směsi s redukovanými koenzymy je před převedením nutné NADH i NADPH rozložit kyselinou. Pro stanovení velmi nízkých množství těchto koenzymů byly zavedeny enzymové amplifikační systémy (formálně „analogie“ PCR reakce):

Po uplynutí zvoleného času se zlikviduje koenzym použitý v nadbytku pro proběhnutí reakce. Následuje amplifikační reakce s vytvořenou formou koenzymu, výše je to redukovaná forma.

Po proběhnutí zvoleného času (amplifikace třeba v řádu 103 nebo 105) se reakce zastaví zahřátím a měří se produkt, např. 6-fosfoglukonát, a to v reakci, kdy opět vzniká redukovaná forma koenzymu jako v počátečním systému (nahoře).

Lowry takto sledoval glykolytické enzymy, porovnával aktivity u kontrol a ischemických potkanů se zvýšenou glykolýzou (6x).

Myší hlavičky byly zmrazovány v časové škále, byl prokázán pokles hladiny Fru-6-Pi a narůst Fru-1,6-bisPi včetně 3C metabolitů. Ukázalo se, že enzym PFK tvořící Fru-1,6-bisPi je regulačním místem glykolýzy. Pro měření PFK byl nejlepší fosfátový pufr, snižoval inhibici enzymu působením ATP (allosterický inhibitor). Při ischémii roste hladina enzymu PFK, kromě Fru-1,6-bisPi roste i hladina ADP, AMP, Pi a NH4+, citrát byl potvrzen jako další inhibitor PFK. V neuronech byl určován obsah ATP , fosfokreatinu a glukosy, detekční limit byl na úrovni 10-15 mol/l. Lowryho tým rovněž izoloval svalová vlákna a měřil v nich enzymové aktivity. Vlákna byla dlouhá 10-50 µm, což odpovídalo váze vzorků 10 až 20 ng.

Metabolity glykolýzy a TCA byly v mikroměřítku analyzovány např. ve myších i lidských vaječnících. Jako marker (index) intenzity glykolýzy posloužila 14C-2-deoxyglukosa, která je hexokinasou fosforylována spolu s glukosou, ovšem není dále přeměňována, což vede k jejímu hromadění (70. léta 20. stol.). Omezením metody původně byla nemožnost rozlišení 14C-DG od 14C-DG6P na autoradiofotografii, proto bylo třeba čekat 30-45 min na distribuci a spotřebování DG v mozku. Odděleným měřením DG a DG6P s NADP+ byl tento nedostatek překonán (80. léta 20. stol.).

Melvin Ellis Calvin (*6. 4. 1911 – †8. 1. 1997) Americký chemik Calvin získal spolu s kolegy Andrew Bensonem a Jamesem Basshamem v r. 1961 Nobelovu cenu za chemii za výzkum asimilace CO2 v rostlinách. Svou profesionální kariéru v délce téměř padesáti let strávil na Kalifornské univerzitě v Berkeley. Narodil se v Minnesotě rodičům, kteří byli židovskými imigranty z území carského Ruska. Rodina se přestěhovala do Detroitu, kde měl otec obchod s potravinami.

Zdroj: Wiki

Po střední škole studoval chemii, v r. 1931 získal titul bakaláře na Michiganské hornické a technické univerzitě (nyní MTU). V r. 1935 dostal Ph.D. titul v oboru Chemie na Minnesotské univerzitě. Na postdoktoranském pobytu v Manchesteru se začal zajímat o ftalokyaniny, chlorofyl, fotosyntézu a umělé fotosyntetizující membránové modely.

V r. 1937 se stal instruktorem na UCA v Berkeley. Pracoval u G. N. Lewise na Katedře chemie, zabýval se fotochemií barevných porfyrinů. V r. 1945 byl přesvědčen děkanem Wendellem Latimerem (Fakulta chemie a chemického inženýrství) a Enestem O. Lawrencem (1901-1958; ředitel Laboratoře radioisotopů, vynález cyklotronu), aby použil v biochemickém výzkumu fotosyntézy radioizotopy. Práci s radioizotopy se tam již předtím zabývali Sam Ruben (19131943) a Martin Kamen (1913-2002). V l. 1938-1942 spolu s E.O. Lawrencem studovali metabolické procesy fixace CO2 ve fotosyntéze s pomocí inkorporace izotopu 11C, byli ale neúspěšní kvůli absorpci produktů na proteiny. Ruben pomocí kyslíku 18O získaného z vody H218O prokázal, že kyslík uvolněný při fotosyntéze pochází z vody. V únoru r. 1940 spoluobjevili izotop 14C. Calvin vytvořil skupinu výborných chemiků s biologickými zájmy. S izotopem 14C ve formě uhličitanu barnatého, který v r. 1942 získal od Rubena, začal pracovat mladý Andrew Benson (*1917). Ruben zemřel na otravu fosgenem při nehodě během válečného výzkumu v r. 1943. Pro separaci produktů se používala extrakce s nemísitelnými rozpouštědly a papírová chromatografie.

Původní představa (James Franck, Farrington Daniels): CO2 je absorbován chlorofylem v proteinovém komplexu, vodík z vody se přenáší k jeho redukci , přičemž vzniká formaldehyd. Při polymeraci formaldehydu za vzniku cukrů se uvolňuje kyslík. K tomu je třeba světlo.

Benson izoloval produkty fixace 14CO2 ve tmě, s Edwinem McMillanem (1907-1991) krystalovali radioaktivní produkt, kyselinu jantarovou. Experimenty byly prováděny na řasách osvěcovaných v nepřítomnosti CO2 a pak přenášených do tmavých nádob s 14CO2. Pozorována tvorba radioaktivní sacharosy, ukázalo se, že musí být k dispozici redukovadlo a fosforylační činidlo. Snahou bylo získat produkt z co nejkratší expozice 14CO2, což bylo problematické vzhledem k malé specifické radioaktivitě izotopu. Po krátkých expozicích bylo využito chromatografie, nejdříve papírové, později ionexové, kterou zavedl Calvin. Ukázalo se, že produkt fixace se drží pevněji než fosfáty sacharidů a potvrzena byla kyselina 3fosfoglycerová (PGA), radioaktivita byla nalezena v –COOH skupině. Tehdy to byl již známý metabolit odbourání glukosy.

Ostatní cukry z dráhy byly identifikovány podle jejich chemických vlastností. 14C byl nalezen v obou hexosách v sacharose. K potvrzení sekvence reakcí bylo využito prvotního značení fruktosy. Identifikace akceptoru CO2 byla složitější. Na papírovém chromatogramu byly Bensonem nalezeny ketosy. Experimenty se prováděly ve spolupráci s Jamesem A. Basshamem (1922-2012). V jedné ketose bylo nalezeno 14% radioaktivity v karbonylu, z čehož usoudili, že jde o sedmiuhlíkatý cukr. V menším cukru se potvrdil pentosadifosfát (radioaktivita 32P a 14C ukázala na poměr dva atomy fosforu – pět atomů uhlíku). Až na počátku 50. let byl akceptor ztotožněn s ribulosabisfosfátem. Celá dráha byla objevena do r. 1958. Calvin se podílel na činnosti vědeckých společností v USA, byl prezidentem ACS a ASPP, i na mezinárodní úrovni. Spolupracoval s NASA: opatření k zamezení biologické kontaminace Měsíce lunárními sondami ze Země, ochrana před zavlečením patogenů z Měsíce, plány na hledání života ve vzorcích z Měsíce a planet. Byl poradcem prezidentů Nixona a Forda,

Konrad Emil Bloch (*21. 1. 1912 - †15. 10. 2000) K. E. Bloch byl americký biochemik. Spolu s Feodorem Lynenem získal v r. 1964 Nobelovu cenu za fyziologii a medicínu v r. 1964, oceněny byly jeho objevy v souvislosti s metabolismem cholesterolu, MK a příslušné regulace. Narodil se v Nise v pruském Slezsku (nyní na území Polska) ve středostavovské rodině, jeho otec řídil rodinnou továrnu. Střední školu ukončil v r. 1930 (pamětní deska v Nise). Studoval na Technické univerzitě v Mnichově, kde ho zaujala chemie díky přednašejícímu organické chemie Hansi Fischerovi (1881-1945).

Foto: Wikipedia

Na přednáškách Mnichovské chemické společnosti ho zaujalo např. vystoupení Heinricha Wielanda (1877-1957) objevitele barviv motýlích křídel – pteridinů.

Pamětní deska Konradu Blochovi ve slezské Nise (bývalá Brüderstraße)

V r. 1934 musel pro svůj židovský původ studium v Mnichově ukončit, H. Fischer mu však zajistil asistentské místo v Davosu ve Švýcarsku (Švýcarský ústav horského výzkumu). Pracoval na analýze lipidů u mykobaktérií, vyvrátil přítomnost cholesterolu. Při analýze fosfolipidů korespondenčně spolupracoval s R. J. Andersonem z Yaleovy univerzity. Připravil např. čistou fosfatidovou kyselinu. Jeho práce byly podkladem disertace, která byla bohužel v Basileji zamítnuta. V r. 1936 získal díky Andersonovi nabídku místo asistenta biologické chemie na Lékařské fakultě Yaleovy univerzity, avšak bez stipendia. Se dvěma doporučujícími dopisy se dostal na Kolumbijskou univerzitu, kde pracoval u Hanse Clarka a získal Ph.D. (1938). Ve spolupráci s Rudolfem Schoenheimmerem se dostal k biochemickým pokusům se značenými izotopy, kdy s pomocí 15N demonstroval přeměnu svalového kreatinu na kreatinin v moči. Zabýval se i biosyntézou kreatinu, konkrétně methylačním krokem při přeměně guanidinoctové kyseliny. Tehdy neúspěšně studoval původ hydroxylové skupiny v cholesterolu (pocházející z oxygenasové reakce) a po Schoenheimmerově smrti v r. 1941 se začal zabývat biosyntézou cholesterolu a mastných kyselin např. s využitím značeného acetátu.

Číslování cholesterolu a steroidů: 21 H3C

20

18 CH3 19 CH3 2 3

HO

1

A 4

10 5

11 9

B 6

12

C

13 14

8 7

17 D 16 15

22

23

24

25 27 CH3

CH3 26

Pomocí značeného cholesterolu připraveného pomocí katalyzované izotopové výměny prokázal v r. 1945 jeho roli jako prekurzoru při tvorbě. steroidního hormonu progesteronu. Dobrovolníkem pro klíčový experiment byla jeho žena. Biosyntézu cholesterolu pak s kolegy potvrdil v novém působišti v Chicagu pomocí mutantu baktérie Neurospora crassa zavislém na dodání vnějšího acetátu. Vedoucím katedry biochemie v Chicagu byl jeho spolužák Earl Evans (19101999). Na počátku 50. let 20. století byl velký zájem rozluštit proteosyntézu. Bloch se svými studenty sledoval tvorbu peptidových vazeb v glutathionu nebo biosyntézu aromatických aminokyselin. Velkým zájmem laboratoře bylo popsat původ všech 27 uhlíkových atomů cholesterolu, výzkum byl sdílený s laboratoří Cornfortha a Popjaka. Např. inspirováni pracemi britského nutricionisty H. J. Channona, který prokázal zvýšený cholesterol u potkanů krmených potravou s obsahem skvalenu ze žraločích jater. V r. 1952 Bloch uvažoval, že skvalen cyklizuje na na 30tiuhlíkatý lanosterol. Strukturu lanosterolu mezitím popsal tým L. Ruzicky z Curychu. Po identifikaci kyseliny mevalonové v r. 1956 byl na konci 50 let. 20. stol. Blochovým týmem a dalšími laboratořemi (mj. F. Lynen) potvrzen isopentenyldifosfát jako výchozí „biologická isoprenová jednotka“.

Značení uhlíkových atomů cholesterolu v návaznosti na značení acetylu:

H3C

C HO

C

C

C

CH3 C C

C C

C

C

C C

C

CH3 C C

C

C

C

C

CH3

C CH3

C C

C H3C

C

V r. 1954 přešel na Harvard, kde byl až do r. 1982 profesorem biochemie. V té době se začalo pro studium metabolických drah hojně používat mikroorganismů. Takto byla prokázána důležitost molekulového kyslíku pro tvorbu OH- skupiny v poloze 3 u cholesterolu (1956) a to s použitím 18O. Následovalo studium biosyntézy nenasycených mastných kyselin, pokusným materiálem byly kvasinkové mikrosomy. Prokázali, že přeměna stearové k. na olejovou vyžaduje kyslík. U anaerobů byl předpoklad jiného mechanismu, později se potvrdilo, že jde o dehydrataci hydroxykyselin. Enzym βhydroxydekanoylthioesterdehydrasa z E. coli zároveň fungoval jako isomerasa (přesun polohy dvojné vazby). Spolu s další laboratoří (Roy Vagelos) přispěli k objevu ACP proteinu důležitého pro biosyntézu MK. Kyselina 3-decenová připravená katalyticky z 3-decynové k. přispěla k objevu fenoménu reakčně závislé inhibice dehydrasy (konec 60. let 20. stol.). Enzym dehydrasa byl inhibována allenovým isomerem nečistoty v testovaném substrátu - nezreagované 3-decynové kyseliny (kovalentní modifikace histidinu). Izomeraci přitom sám katalyzoval. Kyselina 3-decynová inhibuje růst baktérií, což lze zvrátit přídavkem olejové kyseliny. Důležitost kyslíku pro biosyntézu cholesterolu a MK je zřejmě dána evolucí.

Christian Boehmer Anfinsen (*26. 3. 1916 – †14. 5. 1995) byl americký biochemik, který získal v r. 1972 Nobelovu cenu za chemii, spolu s Williamem Howardem Steinem a Stanfordem Moorem za práci věnovanou enzymu ribonuklease a vztahu mezi strukturou a aktivitou. Narodil se v Monessenu, Pensylvánie, do rodiny norských přistěhovalců. Jeho otec byl strojní inženýr. Ve 20. letech se rodina přestěhovala do Filadelfie, v r. 1939 získal magisterský titul v oboru organická chemie na Pennsylvánské univerzitě.

Foto: NIH (1969)

Následně využil stipendia Americko-Skandinávské nadace a pobýval do r. 1940 v Carlsberské laboratoři v Kodani, kde se věnoval analýze chemické struktury proteinů. V r. 1943 získal Ph.D. na lékařské fakultě (Harvard) v oboru biochemie, kde pak zůstal dalších 7 let (Kat. biologické chemie).

V l. 1947-48 byl na stáži u Hugo Theorella v Nobelově medicínském ústavu ve Švédsku. V r. 1950 se stal šéfem Laboratoře buněčné fyziologie a metabolismu v Národním ústavu srdce (NIH) v Bethesdě, Maryland. Díky stipendiu Rockefellerovy nadace mohl strávit další rok v Carlsberské laboratoři (1950) a Guggenheimova nadace mu umožnila pobyt v Rehovotu na Weizmannově vědeckém ústavu (1958-59). V l. 1962-63 se vrátil na Harvard jako profesor biologické chemie, následně byl ustanoven vedoucím Laboratoře chemické biologie na Národním ústavu artritidy a metabolických onemocnění při NIH (do r. 1981). Konečně pracoval jako profesor biologické chemie na Univerzitě J. Hopkinse (1982-1995). Byl editorem v časopisech Advances in Protein Chemistry a Journal of Biological Chemistry, působil v americké i dánské akademii věd. Zpočátku se zabýval studiem biosyntézy proteinů s využitím radioaktivního značení (14C). Předpokládalo se, že proteiny se tvoří buď najednou (AK nasednou na velký templát) nebo postupně v dílčích krocích. První varianta předpokládala rovnoměrné zabudování značené stavební AK, druhá nerovnoměrné. Pro ovalbumin bylo analýzou značení, např. pro Asp, po proteolýze zjištěna druhá varianta. Později bylo tímto způsobem značení prokázáno, že proteiny se syntetizují z N-konce.

Od pol. 50. let se Anfinsen soustředil na problematiku vztahu mezi strukturou a funkcí enzymů. Klíčovým enzymem výzkumu jeho týmu byla ribonukleasa ze slinivky. Spolu s kolegy (M. Sela, F.H. White) rozpoznali, že informace, která určuje terciární strukturu proteinu, se skrývá v primární struktuře, tedy v aminokyselinové sekvenci. Pro potvrzení předpokladu byly prováděny experimenty s reverzibilní denaturací proteinů. Prokázáno bylo, že mnohé proteiny se mohou spontánně poskládat („refolding“) do přirozené formy poté, co se redukčně rozštěpí jejich disulfidové vazby. Tyto výsledky vedly k všeobecnému přijetí „termodynamické hypotézy“ (Anfinsenovo dogma).

Objevil mikrosomální enzym, který katalyzuje vzájemnou přeměnu –SH skupin a disulfidů a tím in vitro urychluje skládání reverzibilně denaturovaných proteinů s disulfidovými vazbami. Rychlost takové renaturace byla dostatečná k tomu, aby pomohla skládat protein během biosyntézy. V posledních etapě vědeckého života se věnoval enzymologii extracelulární nukleasy ze Staphylococcus aureus. Jeho tým určil jeho aminokyselinovou sekvenci a biochemické vlastnosti enzymu včetně 3-D struktury.

Anfinsenův experiment

Arthur Kornberg (*3. 3. 1918 – †26. 10. 2007) byl americký biochemik, který v roce 1959 získal Nobelovu cenu za fyziologii a medicínu, a to za objev biosyntézy DNA, byla to cena sdílená, druhým laureátem byl Severo Ochoa.

Narodil se v New Yorku židovským rodičům, imigrantům z Haliče. Jeho otec pracoval jako technik šicích strojů, později měl obchod s železářstvím, hovořil šesti jazyky. A. Kornberg studoval na střední škole Abrahama Lincolna v Brooklynu, kterou ukončil v 15ti letech, o tři roky dříve než se předpokládalo.

Foto: National Library of Medicine

Nastoupil na prestižní Městskou univerzitu (City College) na Manhattanu. V r. 1937 získal bakalářský titul (chemie), v době Velké krize (the Great Depression) pak pro nedostatek míst pokračoval ve studiu medicíny na Rochesterské univerzitě, které ukončil v r. 1941.

Biochemie mu při studiu medicíny připadala nudná a nezajímavá zejména pro popisný charakter přednášky bez témat jako jsou energetický metabolismus a úloha makromolekul jako jsou např. enzymy. O budoucím zaměstnání ve výzkumu neuvažoval. První publikaci měl v r. 1942, kdy se věnoval popisu zvýšeného výskytu bilirubinu, kterým trpěl, i u ostatních studentů (Gilbertova choroba – dědičná, nižší aktivita UDP-glukuronyltransferasy). Po počáteční praxi nastoupil do armády jako lodní lékař, díky zmíněné publikaci získal místo v NIH, Laboratoř výživy (Nutrition Laboratory). Laboratoř založil Joseph Goldberger (1874-1929), později se přesunula na předměstí Washingtonu do Bethesdy, Maryland. Jeho práce v l. 1942-1945 spočívala v hledání příčiny krvácení a smrti potkanů krmených potravou obsahující sulfonamidy. Po objevu kyseliny listové se prokázalo, že likvidace střevních baktérií sulfonamidy vedla k deficitu vitamínu K. V r. 1943 se oženil, jeho žena Sylvy Kornberg byla biochemička a spolupracovala s ním později v laboratoři. Povzbuzen literaturou o enzymech, koenzymech a ATP (Warburg, Meyerhof, Cori, Kalckar, Lipmann) se začal zabývat enzymologií. V r. 1946 pracoval na Lékařské fakultě Newyorské univerzity u Severo Ochoy, kde se zabýval purifikací akonitasy ze srdečního svalu, spektrofotometrické stanovení aktivity využívalo spojení s isocitrátdehydrogenasou.

U Ochoy rovněž studoval jablečný enzym, byl i na stáži u Coriových na Washingtonské univerzitě, kde se zabýval vznikem pyrofosfátu a tvorbou ATP. Po návratu ze stáží se stal vedoucím oddělení enzymů a metabolismu na NIH (1947-1953). Ve své laboratoři poskytnuté ředitelem Sebrellem pokračoval v práci na enzymu štěpícím pyrofosfátovou vazbu NAD, na kterém už pracoval s Olovem Lindbergem v St. Louis. Po obtížích s izolací enzymu z králičích ledvin konečně získal nukleotidpyrofosfatasu z brambor. Následně prokázal umístění extra fosfátu v NADP a potvrdil, že nikotinamidribosafosfát je možné přeměnit reakcí s ATP na NAD za vzniku pyrofosfátu. Analogicky spoluobjevil tvorbu FAD z riboflavinfosfátu a ATP a posléze došel k závěrům, že přenos nukleotidylu z nukleosidtrifosfátu je důležitý pro biosyntézu koenzymů, přičemž je reakce posouvána hydrolýzou pyrofosfátu. V 50. letech se jeho zájem přesouvá k biosyntéze RNA z nukleotidů. Zabýval se tvorbou fosfodiesterové vazby ve fosfolipidech. V anaerobní baktérii Zymobacterium oroticum našel metabolity orotové kyseliny – dihydroorotovou k. a karbamoylaspartát. Později prokázal tvorbu fosforibosyldifosfátu (PRPP synthetasa), orotidin-5P a konečně UMP s použitím jaterního a kvasinkového extraktu, orotátu, ATP a ribosa-5P. Pochopil existenci de novo a recyklačních drah

Clin. Chem. 2004, 50:11 2117-24.

OBJEV DNA-POLYMERASY V l. 1953-1959 byl profesorem a vedoucím Katedry mikrobiologie na Washingtonské univerzitě v St. Louis. V Kornbergově laboratoři se od pol. 50. let 20 stol. používala pro studium enzymů baktérie E. coli. Studie probíhaly s 14C-značenými bázemi a nukleotidy. V té době S. Ochoa a M. Grunberg-Manago objevili polynukleotidfosforylasu. V l. 1956-1957 začal se spolupracovníky zkoumat biosyntézu DNA (inkorporace značeného dT, dTMP a dTTP), přelomové bylo pochopení skutečnosti, že molekula DNA je nutná pro DNA-polymerasu jako templát (díky znalosti pokusů Coriových s glykogenfosforylasou). Od r. 1959 vykonával Kornberg funkci profesora a výkonného vedoucího Katedry biochemie na Lékařské fakultě Stanfordovy univerzity v Kalifornii (Palo Alto). DNA-polymerasa (I) bylo purifikována a ukázalo se, že produkt její reakce odráží složení bazí v templátu (1961). Byla prokázána opačná polarita řetězců v dvojitém helixu. Když byla objevena ligasa (1967) bylo možné s DNA-polymerasou I připravit cirkulární jednořetězcovou fágovou DNA, která měla biologické vlastnosti – byla infekční. To byl převratný experiment pro vývoj molekulární biologie a genového inženýrství.

DNA-polymerasa I tvoří řetězec DNA ve směru 5’  3’. Brzy však tým zjistil, že volný 3’ konec je enzymem odbouráván v nepřítomnosti stavebních kamenů. Syntézou duplexové DNA s chybným párováním na 3’ konci potvrdila opravnou aktivitu („proofreading“), pravděpodobnost chyby 1:107, publikováno 1972. Později prokázali nukleasové působení enzymu i na 5’ k. V l. 1970-1972 byly pak objeveny DNA-polymerasy II a III (Kornbergův syn Tom), z nichž DNA-polymerasa III byla hledaným replikačním enzymem. Nedařilo se prokázat, že DNA-polymerasa I je schopná nastartovat syntézu nového řetězce sama o sobě, potřebovala k tomu povařený extrakt E. coli. V r. 1968 Okazaki zjistil, že replikace nezačíná na jednom místě chromozomu, ale opakovaně na více místech. Otázky průběhu replikace (zahájení – priming) se vyřešily díky fágové DNA (vláknitý fág M13). Primerem je krátký úsek RNA, který syntetizuje RNApolymerasa. Inhibicí RNA-polymerasy rifampicinem se replikace kruhové DNA z M13 zastavila. Problém vyvstal u fága φX174, kde replikace nebyla inhibována rifampicinem. Vodítko přišlo s nalezením enzymu primasy pro replikaci DNA fága G4. Od poloviny 70. let pak byly vysvětlovány komponenty tzv. primosomu při replikaci fága φX174, kde helikasa rozevírá replikační vidličku a umožňuje navázání DNA-polymerasy III-holoenzymu.

Annu. Rev. Biochem. 1989, 58: 1-13.

Při snaze získat bezbuněčný aparát pro iniciaci replikace chromozómu baktérie E. coli se využilo dvou triků: 1) přídavek PEG vedl k „zakoncentrování“ proteinů a DNA, 2) frakcionace síranem amonným pak umožnila získat požadované proteiny oddělením inhibitorů. Annu. Rev. Biochem. 1989, 58: 1-13.

Arthur Kornberg se rovněž zabýval bakteriálními sporami, zejména s ohledem na infekční nemoci (anthrax, botulismus, tetanus). Byl k tomu stimulován případem úmrtí matky v r. 1939 při operaci žlučníku (plynatá sněť, Clostridium perfringens).

Edwin Gerhard Krebs (*6. 6. 1918 – †21. 12. 2009) E. Krebs byl americký biochemik, nositel Nobelovy ceny za fyziologii a medicínu v r. 1992 (spolu s Edmondem H. Fischerem) pro objasnění reverzibilní fosforylace proteinů jako regulačního nástroje buněčných procesů. Pocházel z Iowy, byl potomkem německých imigrantů. Jeho otec byl presbyteriánským pastorem. V dětství rád četl knihy o občanské válce, základní školu a část střední školy navštěvoval v Greenville, Illinois. Po smrti otce se rodina přestěhovala do Urbany, kde je Illinoiská univerzita.

Zdroj: ASBMB

Oba jeho bratři tam studovali chemii. Od r. 1936 se zapsal na zmíněné univerzitě, kde zpočátku volil předměty s přípravou na další studium chemie či medicíny. Již na úrovni bakaláře pracoval experimentálně v organické laboratoři a byl spoluautorem publikací. Následně započal díky stipendiu se studiem medicíny na Lékařské fakultě Washingtonovy univerzity v St. Louis, kde se na seminářích seznámil s Coriovými, Ardou Greenovou a Sidney Collowickem.

Získal zde znalosti z teoretické i praktické medicíny, ale i z oblasti medicínského výzkumu. Školu ukončil v r. 1943 a byl pak na stáži v Barnesově nemocnici v St. Louis. Po válce sloužil v námořnictvu, byl lékařským důstojníkem na lodi. Po propuštění z armády v r. 1946 se chtěl stát internistou na univerzitě, nicméně se rozhodl studovat biochemii a byl postdokem u Coriových. Prováděl kontrolu čistoty krystalických preparátů glyceraldehyd-3-fosfáttedehydrogenasy a triosafosfátdehydrogenasy (TPD), porovnával vlastnosti svalové a kvasinkové TPD či sledoval vliv protaminu na aktivitu svalovou fosforylasu a a b.

Laboratoř byla kolorimetrem, pH elektroforézu.

tehdy metry,

vybavena spektrofotometrem Beckman, centrifugou a Tisseliovým aparátem pro

V r. 1948 získal místo odborného asistenta na Katedře biochemie nově zřízené Lékařské fakulty Washingtonské univerzity v Seattlu. Od r. 1950 zde byl prvním vedoucím katedry Hans Neurath (1909-2002). Prvním projektem byla práce na enzymu TPD a inhibici glykolýzy katalyzované enzymy kvasinkového extraktu protilátkami proti TPD. V r. 1953 přišel na katedru Edmond H. Fischer (nar. 1920). Spolupracovali poté na enzymologickém výzkumu glykogenfosforylasy, přičemž se zájem soustředil na konverzi enzymzu mezi formami a/b. Na základě náhodně zjistěného rozdílu ve staré a nové metodice přípravy fosforylasy (centrifugace svalového extraktu na rozdíl od dříve používané filtrace) vedla k objevu fosforylasakinasy, která s využitím ATP fosforylovala formu b na formu a. Zjistili též, že kinasa potřebuje ke své aktivitě Ca(II) ionty (byly z filtračního papíru) a aktivaci Ca(II)dependentní proteasou, kalpainem. Dále bylo zjištěno, že defosforylaci katalyzuje fosfatasa. Revezibilní fosforylace byla tímto prokázána jako mechanismus regulace funkce proteinů.

http://themedicalbiochemistrypage.org/glycogen.php

Ve stejné době pracoval Earl Wilbur Sutherland Jr. (1915-1974) na Washingtonově Univerzitě v St.Louis později na univerzitě Case Western Reserve v Clevelandu, Ohio, na zkoumání vlastností glykogenfosforylasy z jater. Spolu s ostatními objevil cAMP jako teplotně stabilní faktor, který slouží jako druhý posel pro adrenalin a glukagon při aktivaci glykogenfosforylasy. E. Krebs a E. Fischer ukázali stejné schéma v králičím svalu a potvrdili, že cAMP učinkuje ve smyslu fosforylační aktivace fosforylasakinasy. Trvalo několik let, než byl vysvětlen mechanismus zahrnující další enzym cAMP-dependentní proteinkinasu (PKA). Ukázalo se, že tento enzym fosforyluje i jiné proteiny, proto je jeho název obecný. Předpokládalo se sice nejdříve, že regulace prostřednictvím fosforylace proteinů je omezena na metabolismus glykogenu, práce z konce 60. let a počátku 70. let 20. století pak potvrdily obecnou platnost. V r. 1968 odešel E. Krebs na Kalifornskou univerzitu v Davisu, kde se stal vedoucím katedry biochemie na lékařské fakultě.

V pokračujícím výzkumu PKA bylo zjištěno, že působí i na lipasu, skládá se z katalytických (C) a regulačních (R) podjednotek, vlivem cAMP dochází k jejich disociaci. Vypracován byl mj. také protokol pro purifikaci glykogensynthasy. V r. 1976 se E. Krebs vrátil do Seattlu jako vedoucí tamní katedry farmakologie. Spolupráce s Kennethem Walshem a Koiti Titanim z Katedry biochemie Lékařské fakulty WU se týkala analýzy primární struktury PKA a dalších kinas. Vazebné studie využívaly afinitního značení . Na konci 70. let přišly z jiných laboratoří převratné objevy týkající se fosforylace a defosforylace proteinů, mj. že fosforylován může být nejenom serin či threonin, ale i tyrosin. Potvrzeny byly různé proteintyrosinkinasy (PTK). Takovou kinasou je i insulinový receptor. Předmětem zájmu se stalo také propojení tyrosinové fosforylace s fosforylací serinu a threoninu. Byla objevena MAPK kaskáda. Dalším studovaným enzymem byla kaseinkinasa 2 (CK2) fosforylující více než 100 substrátů. Bylo zjištěno, že glykogensynthasakinasa 3 může fosforylovat určitý substrát insulinového receptoru a tím z něj učinit inhibitor. Jiným předmětem výzkumu byla apoptóza a role fosforylací v jejím průběhu, např. proteolytická aktivace proteinkinas.

Paul Delos Boyer (*31.7. 1918) P. D. Boyer je americký biochemik a chemik, profesor na Kalifornské universitě v Los Angeles (UCLA). V r. 1997 získal Nobelovu cenu za chemii, což přišlo za výzkum ATP-synthasy, spolu s Angličanem Johnem Ernestem Walkerem. Dalším tehdy oceněným byl Dán Jens Christian Skou za objev Na+/K+-ATPasy. Narodil se v Utahu, v městě Provo, kde absolvoval i střední školu. Bakalářského vzdělání v oboru chemie dosáhl na mormonské Univerzitě Brighama Younga tamtéž (1939) a získal stipendium pro studium biochemie na Wisconsinské univerzitě v Madisonu. V té době se tam prováděl špičkový výzkum v oblasti výživy a metabolismu, byly objevovány a studovány např. vitamíny, jejich příprava a antagonisté. Pracoval u profesora Paula Phillipse.

Jedním z jeho prvních výsledků bylo zjištění, že enzym pyruvátkinasa je aktivován K+, bylo sledováno jako ovlivnění přenosu fosfátu z 3fosfoglycerátu do kreatinfosfátu (ATP byl objeven Lohmannem v r. 1927).

Poté co obdržel Ph.D., pobýval na Stanfordově univerzitě, kde v době války hledali možnost stabilizace sérového albuminu pro zahřívání za účelem likvidace patogenů. Toho bylo dosaženo přídavkem acetyltryptofanu. Svoji nezávislou kariéru začal na Minnesotské univerzitě, kde se zabýval především studiem enzymů (50. léta 20. stol.). Jedním z témat byla glyceraldehyd-3-fosfátdehydrogenasová reakce v glykolýze. S pomocí izotopu 18O prokázali zabudování kyslíku fosfátu do karboxylové skupiny fosfoglycerátu. Při studiu oxidační fosforylace inkubovali mitochondrie s fosfátem značeným 18O a 32P a neznačeným ATP. Pozorovali rychlou výměnu kyslíků Pi s vodou a fosforu s ATP. Reverzibilita pokračovala i při inhibici přenašečů elektronů. Předpokládala se existence energeticky bohaté sloučeniny. Díky stipendiu byl Boyer v r. 1955 na studijním pobytu u Hugo Theorella ve Švédsku. Zde např. rozpoznal změnu fluorescence NADH po navázání na dehydrogenasu. Ve Švédsku také započal experimenty vedoucí k poznání, že poslední můstkový kyslík v ATP tvořeném oxidační fosforylací nepochází z ADP, ale z fosfátu.

V následujícím období se využívalo 32P ke studiu intermediátů enzymových reakcí, např. glutaminsynthetasy. V r. 1961 se již zdálo, že objevili hledanou energeticky bohatou sloučeninu. Po expozici mitochondrií 32Pi a jejich solubilizaci byla radioaktivním fosforem značená nedialyzovatelná látka. Potvrdilo se, že jde o protein s histidinovou fosforylací. Od r. 1963 byl Boyer profesorem na Katedře chemie a biochemie na UCLA. Výzkum dále pokračoval nalezením modulátorů tvorby fosfohistidinového zbytku v daném proteinu, efektivní byl sukcinát a CoA. Fosforylovaný histidin byl nakonec vysvětlen jako intermediát sukcinylCoA-synthetasové reakce, nikoli oxidační fosforylace. Na UCLA přijal místo ředitele Ústavu molekulární biologie. Pokračující experimenty s 32P, ukázaly, že primárním akceptorem fosfátu při oxidační fosforylaci je ADP. Byly získány důkazy, že domnělý energeticky bohatý intermediát hraje také roli při transportu aminokyselin či určitých sacharidů do mitochondrií. Boyer tehdy stále odmítal Mitchellovu teorii protonmotivní síly, dle jeho slov, kvůli chybějícímu vysvětlení procesu, kterým migrace protonů může vést k tvorbě ATP. Na poč. 70. let dospěl Boyer k představě, že energie uložená v ATP může pocházet z konformační změny proteinu. K tomu svádělo pozorování, že výměna kyslíků ve fosfátu byla méně náchylná k působení rozpojovačů než celková oxidační fosforylace (ATP vázáno v aktivním místě enzymu a hydrolyzováno).

en.wikipedia.org

V té době skupina E.C. Slatera prokázala na izolované F1-ATPase a ATPsynthase vazebná místa pro ATP a ADP. Boyerův tým dokumentoval pevnou vazbu ATP (tvořeného z Pi v médiu) na myosinovou ATPasu. Při hydrolýze ATP myosinovou ATPasou byla prokázána výměna kyslíků mezi vázaným ATP a vodou. Kombinace myosinu a aktinu uvolňovala ATP jak bylo předpokládáno pro ATPasu. Koncept translokace protonů spojený s uveřejnil Peter D. Mitchell (19201992) v roce 1961.

Robert Bruce Merrifield (*15. 7. 1921 – †14. 5. 2006) Merrifield působil na Rockefellerově univerzitě, v r. 1984 získal Nobelovu cenu za chemii za vyvinutí metodiky pro chemickou syntézu na pevné fázi. Narodil se v Texasu (Fort Worth), jeho otec byl malířem pokojů a prodavačem nábytku. Kvůli hospodářské krizi se rodina často stěhovala. Navštěvoval celkem 11 různých středních škol, oblíbil si chemii, fyziku a astronomii, fotografoval. V r. 1939 nastoupil na Juniorskou kolej v Pasadeně, pozdějí na Kalifornskou univerzitu v LA (UCLA), kde v r. 1943 získal bakalářský titul. Jeho učitel biochemie Max Dunn byl odborníkem na aminokyseliny, u něj Merrifield pracoval v magisterském studiu.

zdroj: Wiki

Experimenty, které se prováděly, zahrnovaly především mikrobiologii, např. sledování látek esenciálních pro růst laktobacilů s cílem vyvinout metody kvantitativní analýzy látek, např. obsah prolinu v proteinech či obsah pyrimidinových bazí v DNA. V r. 1949 získal titul Ph.D., oženil se a přešel na Rockefellerův ústav pro medicínský výzkum, kde pracoval u D. W. Woolleyho na izolaci nového bakteriálního růstového faktoru nazvaného strepogenin, což zahrnovalo práci s proteinovými hydrolyzáty. Osvojil si například aminokyselinovou analýzu vyvinutou kolegy z univerzity Williamem Howardem Steinem (1911-1980) a Stanfordem Moorem (1913-1982), kteří spolu s Christianem B. Anfinsenem (1916-1995) získali v r. 1972 Nobelovu cenu za chemii. V té době Angličan Fred Sanger (1918-2013) opublikoval sekvenci insulinu, části inzulinu z B- řetězce byly na RU studovány pro strepogeninovou aktivitu. Určitý pentapeptid bylo třeba syntetizovat pro ověření výsledků. To se povedlo tehdy konvenčními technikami, což znamenalo jen minimální změny od dob Emila Fischera (1852-1919) – chránící skupiny, selektivní reakce, krystalizace. Tedy pomalý proces s velkými ztátami.Ve 30. letech se objevilo reduktivní odštěpení chránících skupin sodíkem v kapalném amoniaku. Vincent du Vigneaud (1901-1978) a kol. zavedli benzyloxykarbonylovou chránící skupinu (Z), což umožnilo syntetizovat nonapeptidy oxytocin a vasopresin.

Na konci 50. let uvažoval Merrifield o nové strategii, rychlé, kvantitativní a automatizovatelné, kde by se využilo chromatografické kolony s navázaným peptidem, kde by k elongaci docházelo přídavkem aktivované kyseliny. Předpokládal, že vše půjde vyvinout za několik měsíců, fáze proof-of-concept však trvala 3 roky. Původnějako pevné médium zkoušel celulosový prášek (uvažoval esterovou vazbu aminokyseliny), dále polyvinylalkohol, polyakrylamid a konečně dospěl k polystyrenu s příčnými vazbami prostřednictvím divinylbenzenu. Pokud jde o chránění aminoskupiny, Z skupina nebyla optimální kvůli nutnosti hydrolyzovat silnou kyselinou, což vede i k odštěpení části startovní aminokyseliny navázané na polymer ve formě benzylesteru, ale nebylo příliš na výběr. Po navázání AK na polystyren se skupina Z odštěpila, aminoskupinu bylo třeba deprotonovat alkalizací s terc. Aminem a následně se navazovala další Z-chráněná AK s využitím dicyklohexylkarbodiimidu (DCCI).

K rutinním syntézám pak byla vyvinuta aparatura se sintrovým filtrem a kohoutem pro promývání. K získání publikovatelných výsledků byl vybrán tetrapeptid. Další inovace přinesly blokování nezreagovaných aminoskupin acetylací, odštěpení peptidu proběhlo reakcí zmýdelnění.

Dočištění peptidu bylo provedeno iontoměničovou chromatografií. Celý postup byl publikován r. 1963 a vznikla syntéza peptidů na pevné fázi (SPPS). Na toto téma v průběhu kariéry nakonec Merrifield publikoval více než 300 prací. Po první publikaci následovala syntéza bradykininu s nově zavedenou chránicí skupinou Boc (t-butyloxykarbonyl). Postup byl s chráněním postranních řetězců vypracován tak, že byla rychlost 2 AK za den, celý bradykinin bylo možné získat za 8 pracovních dnů. S automatizací na zkonstruovaném aparátu se rychlost zvýšila na 6 AK za den, ve spolupráci s Johnem Stewartem, ten pak připravil řadu bradykininových analogů. Od r. 1965 pracoval Merrifield v týmu s mladými výzkumníky a studenty, byly připraveny další peptidy, angiotensin, insulin, oxytocin, antibiotika. S postdokem Berndem Guttem z Německa v r. 1969 syntetizoval enzym ribonukleasu A (124 AK). Tento historický úspěch znamenal 369 reakcí a 11 931 kroků bez nutnosti izolace intermediátů. Produkt svými vlastnostmi odpovídal přirozenému enzymu. Naví šlo o experimentální důkaz k Anfinsenovu tvrzení o tom, že primární struktura proteinu předurčuje jeho strukturu prostorovou.

Tento projekt však odhalil některé nedostatky , proto kolem r. 1970 proběhla reexaminace celého postupu, esterové vazby, chránicích skupin, účinnosti připojování i odštěpení. Ztráty činily 83%, což znamenalo průměrně 1,4% na krok. Polystyren byl nahrazen PAM pryskyřicí (oxymethylfenylacetamidomethyl) s řádově 100krát větší stabilitou v kyselém prostředí, k tomu byl překonán i problém s peptidy, které měly permanentně blokovanou aminoskupinu. Postup byl dále zdokonalen štěpením v mírně kyselém prostředí a možností syntézy stavebních bloků pro další spojování. Výtěžek optimalizovaného postupu se dostal až na 99,9%. Dalšími syntetizovanými látkami byly peptidy glukagon a jeho analoga, gastrin, antibiotikum cecropin A a analoga (tvoří iontové kanály v membránách) mellitin, thymosiny a fragmenty imunoglobulinů. V současné době se na pevné fázi peptidy syntetizují zcela běžně a automatizovaně, budují se takto i oligopeptidy a celé knihovny organických sloučenin. Kromě Nobelovy ceny a řady dalších cen získal Merrifield i patnáct čestných doktorátů.

Marshall Warren Nirenberg (*10.4. 1927 – †15.1. 2010) byl americký biochemik a genetik židovského původu. V roce 1968 získal Nobelovu cenu za fyziologii a medicínu spolu Har Gobindem Kharanou (chem. syntéza kodonů) a Robertem W. Holleym (struktura tRNA) jako ocenění práce na vyluštění genetického kódu a popisu fungování proteosyntézy. Narodil se v NYC. Jako chlapec prodělal revmatickou horečku, proto se s rodiči přestěhoval na Floridu (Orlando) kvůli klimatu. Na farmě získal zájem o biologii. Studoval zoologii na Floridské univerzitě v Gainesvillu (1952), v roce 1957 získal doktorát z biochemie na Michiganské universitě v Ann Arboru. Jako postdok-stipendista začal pracovat v Národních ústavech zdraví (NIH). Poté získal místo vědeckého pracovníka (1959) a věnoval se vztahu DNA, RNA a proteinů. V roce 1962 se stal vedoucím Oddělení biochemické genetiky na Národním ústavu pro onemocnění srdce, šéfem laboratoří zůstal až do své smrti. Oženil se v roce 1961 a pak podruhé v roce 2005.

Na konci 50. let 20. století se ukázalo, že DNA je nositelkou genetické informace (Avery-MacLeod-McCartyův experiment, experiment Hersheye a Chaseové, Watson-Crickova struktura, Meselson–Stahlův experiment). Nevědělo se však, jak se přenáší informace do proteinů a jaká je role RNA. Nirenberg na tom pracoval v týmu s Heinrichem J. Matthaei na NIH. Jejich klíčový experiment (Nirenberg-Matthaei experiment) ukázal, že poly(U) RNA (uracil je pouze v RNA) je v systému obsahujícím DNA, RNA, ribosomy a další buněčný aparát pro proteosyntézu po rozkladu DNA DNasou překládán do polyPhe proteinu. Tohle bylo ověřeno tak, že přidávali vždy jednu radioaktivní AK a 19 neradioaktivních, postupně se značení prostřídalo. Do vzniklého proteinu byl zabudován pouze radioaktivní fenylalanin (!). Nirenberg zveřejnil výsledky na Biochemickém kongresu v Moskvě v srpnu 1961. Během několika let jeho tým potvrdil, že AAA se překládá jako Lys a CCC jako Pro. Dalším průlomovým experimentem byla práce postdoktoranda v Nirenbergově laboratoři Phillipa Ledera, který objevil metodu (NirenbergLederův experiment) pro luštění genetického kódu. Enzymová syntéza krátkých RNA molekul, vlastně kodonů, to umožnila spolu s radioaktivně značenou aminoacyl-tRNA a částečně purifikovanými ribosomy. Tyto výsledky doplnil Gobind Khorana. Nirenberg se na konci kariéry věnoval neurovědě.

Období v l. 1961 a 1962 je často nazýváno „coding race", kvůli soutěži mezi laboratořemi – Nirenbergovou na NIH a Ochoovou na NYU. Protože tehdy mohl první vědec z NIH získat Nobelovu cenu, mnoho Nirenbergových kolegů odložilo svou vlastní práci a přispělo k řešení genetického kódu. Leder a Nirenberg v experimentu používali velmi krátké umělé RNA sekvence (tři nukleotidy) v bezbuněčném systému. Tyto krátké fragmenty byly dostatečně dlouhé, aby se ribosom mohl vázat s molekulou tRNA, která je komplementární k jednomu kodonu a přitom detekovatelná. Klíčovým krokem experimentu bylo, že byl vždy označen jeden typ aminokyseliny a směs se filtrovala. Speciální filtr dovolil průchod nenavázané tRNA, nikoli však ribosomům s vázaným tripletem. Byla pak sledována radioaktivita vzorku. Bylo-li radioaktivita ve vzorku, který neprošel přes filtr, znamenalo to navázání odpovídající aminokyseliny.

Smith, A. (2008) Nucleic acids to amino acids: DNA specifies protein. Nature Education 1(1)

•Crick, F. H., et al. General nature of the genetic code for proteins. Nature 192, 1227–1232 (1961) •Jones, D. S., Nishimura, S., & Khorana, H. G. Further syntheses, in vitro, of copolypeptides containing two amino acids in alternating sequence dependent upon DNA-like polymers containing two nucleotides in alternating sequence. Journal of Molecular Biology 16, 454–472 (1966) •Leder, P., et al. Cell-free peptide synthesis dependent upon synthetic oligodeoxynucleotides. Proceedings of the National Academy of Sciences 50, 1135–1143 (1963) •Nirenberg, M. W., Matthaei, J. H., & Jones, O. W. An intermediate in the biosynthesis of polyphenylalanine directed by synthetic template RNA. Proceedings of the National Academy of Sciences 48, 104–109 (1962) •Nirenberg, M. W., et al. Approximation of genetic code via cell-free protein synthesis directed by template RNA. Federation Proceedings 22, 55–61 (1963) •Nishimura, S., Jones, D. S., & Khorana, H. G. The in vitro synthesis of a co-polypeptide containing two amino acids in alternating sequence dependent upon a DNA-like polymer containing two nucleotides in alternating sequence. Journal of Molecular Biology 13, 302–324 (1965)

William Wallace „Mo“ Cleland (*6. 1. 1930 – †6. 3. 2013) Narodil se v Baltimoru, Maryland. Bakalářské studium absolvoval na Oberlinské koleji v r. 1950, magisterské a doktorské na Wisconsinské univerzitě v Madisonu, a to v l. 1953, resp. 1955. Postdoktorský pobyt vykonal na Chicagské univerzitě odkud se vrátil do Wisconsinu jako odborný asistent. V r. 1962 se stal docentem a v r. 1966 profesorem. Získal pak ještě profesury v l. 1978 a 1982.

Jeho hlavním oborem bylo zpočátku studium lipidů, zabýval se acylací glycerolfosfátu za vzniku fosfatidových kyselin a sledoval substrátovou specifičnost enzymu pro různé acyl-CoA. Substráty připravoval chemickou acylací CoASH, pro redukci koenzymu využíval dithiothreitol (Clelandovo činidlo) jako jistý analog lipoamidu.

zdroj: ASBMB

Pro výuku biochemie se snažil zdokonalit téma enzymové kinetiky. Kombinace řešení rovnic a experimentů vedla ke třem publikacím v časopisu Biochimica et Biophysica Acta, ve kterých navrhl nomenklaturu a teorii enzymových reakcí s více substráty nebo produkty. Cleland využil svoje poznatky ke studiu rozmanitých enzymů, např. glycerolkinasy, kde zjistil, že jde o uspořádaný mechanismus, kdy se nejdříve váže glycerol, pak ATP v komplexu s Mg2+, nejdříve se uvolňuje MgADP a nakonec glycerol-3-fosfát. Využil přitom inhibičních technik. Ke studiu enzymových mechanismů využíval kinetických isotopových efektů; ze stabilních izotopů např. deuteria, 13C, 15N a 18O, z radioaktivních izotopů 14C a 3H. Změnami pH se hledaly podmínky, při kterých chemická reakce limitovala rychlost, nebo se prováděla místně řízená mutageneze. Sledovalo se, jak obsah těžkého izotopu (stopové značení) ovlivňoval kcat nebo kcat /Km. Byl vášnivým filatelistou (prezident US filatelistické společnosti v r. 1992), měl rád operu a byl členem jachtařského klubu. Na téma známky publikoval ca. 300 článků.

Cleland zemřel v důsledku nehody, pádu na ledu.

Clelandovo schéma - náhodný sekvenční mechanismus (kreatinkinasa):

ATP Kreatin

Fosfokreatin ADP

Enzyme

Enzyme E (kreatin) (ATP) Kreatin ATP

E (fosfokreatin) (ADP) ADP Fosfokreatin

Clelandovo schéma uspořádaného sekvenčního mechanismu (laktátdehydrogenasa):

NADH Pyruvát

Enzyme E (NADH) (pyruvát)

Laktát NAD+

E (laktát) (NAD+)

Enzyme

Clelandovo schéma pingpongového mechanismu (aspartátaminotransferasa):

Aspartát

Enzyme E (aspartát)

Oxaloacetát

(E-NH3+ ) (oxaloacetát)

-Oxoglutarát

(E-NH3+ ) (oxaloacetát)

(E-NH+ ) 3 (-oxoglutarát)

Glutamát

Enzyme E (glutamát)

Bruce Michael Alberts (*1938) Alberts je americký biochemik, autor knihy Molecular Biology of the Cell a veřejný činitel v oblasti vědy a vzdělávání. Přispěl k objasnění role proteinových komplexů při replikaci DNA. Byl editorem časopisu Science a prezidentem Národní akademie věd (1993-2005). Otec byl strojním inženýrem a pracoval na patentovém úřadě. Studoval střední školu na předměstí Chicaga (Illinois), je absolventem Harvardovy univerzity (biochemické vědy), v roce 1965 zde získal doktorát. Během pregraduálního studia pracoval v chemické laboratoři a už tehdy byl spoluautorem vědeckých prací na téma nukleové kyseliny (PNAS, Nature, r. 1960).

Gitschier J (2012) Scientist Citizen: An Interview with Bruce Alberts. PLoS Genet 8(5): e1002743. doi:10.1371/journal.pgen.1002743

V průběhu Ph.D. studia se pokoušel o experimenty v sousvislosti s rozluštěním genetického kódu a replikace DNA. Předpokládalo se působení DNA polymerasy, nevědělo se ale, jak vše probíhá na dvouřetězcové DNA. Příliš mnoho pokusů bez výsledku nakonec vedlo k studiu příčných vazeb v DNA zjištěných u E. coli a potvrzených v DNA z telecího brzlíku. O DNA z E. coli se věřilo, že jde o lineární molekulu, na jejímž konci replikace začíná vlásenkou spojující oba řetězce. Ve studiu replikace DNA pokračoval během postdoktorandského pobytu v Ženevě u Richarda Epsteina. Ten již v roce 1963 publikoval článek o nutné přítomnosti alespoň sedmi proteinů (včetně DNA polymerasy) pro replikaci DNA fága T4. V Ženevě se snažil připravit kolonu s DNA pro izolaci proteinů vázajících se na DNA. Po experimentech s chemickým připojením přišel náhodou na to, že vysušením vzorku DNA s čistou celulosou dojde k pevnému navázání. Od r. 1966 pracoval Alberts jako asistent na Katedře biochemických věd Princetonské univerzity. E. coli byla infikována různými mutanty fága T4. Při použití mutanta genu 32 zmizel jeden z proteinů, co se běžně vázal na jednořetězcovou DNA. Protein byl izolován a zjistilo se, že katalyzuje denaturaci i renaturaci DNA za fyziologických podmínek (Nature, 1970).

V r. 1972 se stal docentem a v r. 1974 řádným profesorem na Princetonu. V r. 1975 se podařilo Albertsově týmu rekonstituovat replikační aparát bakteriofága T4 z purifikovaných proteinových komponent.

V r. 1976 přešel na Kalifornskou univezitu v San Franciscu, kde přijal místo profesora a zástupce vedoucího Katedry biochemie a biofyziky. Vedoucím se pak stal v r. 1985. V r. 1980 získal doživotní profesuru od Americké společnosti pro rakovinu. Na problematice replikačních proteinů pokračoval Albertsův tým i nadále až do 90. let 20. století. Popsali např. fungování DNA topoisomerasy, helikasy, histonacetylasy a jiných enzymů. Později se začal angažovat v oblasti vzdělávání a školství, působí v Národní akademii věd, rozmanitých vědeckých komisích a redakčních radách. Prezidentem Národní akademie věd byl v l. 1993-2005. V l. V r. 2010 byl vyslancem prezidenta Obamy pro vzdělávací misi v muslimských zemích.

Kary Banks Mullis (*28. 12. 1944) Mullis je americký biochemik, který je znám za vyvinutí PCR techniky a v roce 1993 byl laureátem Nobelovy ceny za chemii spolu s Michaelem Smithem (1932-2000), který přispěl k vývoji místně řízené mutageneze. PCR dnes patří k ústředním technikám v biochemii a molekulární biologii. Narodil se ve farmářské rodině v Severní Karolině. V městě Columbia v Jižní Karolině navštěvoval střední školu. Studoval pak v Atlantě na Technické univerzitě, kde získal bakalářský titul v oboru chemie. Ph.D. v oboru biochemie dosáhl na Kalifornské univerzitě v Berkeley (1972). Jako postdoktorand pracoval na univerzitách v Kansas City a San Francisku. Několik let pracoval v biotechnologické společnosti Cetus Corporation V Kalifornii, kde vyvinul proces polymerasové reakce.

Zdroj: nobelprize.org

Ve firmě Cetus se zabýval syntézou oligonukleotidů. Amplifikaci DNA s pomocí DNA-polymerasové reakce, dvou oligonukleotidových primerů a nukleosidtrifosfátů demonstroval v prosinci 1983. Na projektu vývoje PCR techniky pracovali i další zaměstnanci firmy Cetus jako Randall Saiki a Henry Erlich. Vývoj je tedy považován za týmovou záležitost. V r. 1986 Mulis z firmy Cetus odešel a pracoval jako vedoucí molekulární biologie ve firmě Xytronyx, Inc. v San Diegu. Dále se živil a živí jako konzultant a podnikatel. V počátečním uspořádáním experimentu se po každém cyklu musela přidávat nová DNA polymerasa. V r. 1986 začal Saiki používat termostabilní Taq polymerasu z Thermus aquaticus, což umožnilo automatizaci. Princip samotné PCR ale nebyl novátorský, byl popsán H. G. Khoranou a K. Kleppem v roce 1971 (Journal of Molecular Biology). Patent byl firmou Cetus prodán společnosti Roche Molecular Systems za 300 mil. USD, i když byl firmou DuPont zpochybněn. Mullis přiznal zkušenosti s používáním LSD a na setkání s Albertem Hofmannem při příležitosti jeho stých narozenin mu sdělil, že to bylo užívání LSD, které mu dovolilo vyvinout PCR k amplifikaci sekvencí DNA. Má zajímavé extrémní osobní názory, odmítá nemoc AIDS a globální oteplování.

Kleppe, K.; Ohtsuka, E.; Kleppe, R.; Molineux, I.; Khorana, H. G. (1971). Studies on polynucleotides *1, *2XCVI. Repair replication of short synthetic DNA's as catalyzed by DNA polymerases. Journal of Molecular Biology 56 (2): 341–361 K.B. Mullis, F. Faloona, S. Scharf, R. Saiki, G. Horn and H. Erlich, 1986, Specific enzymatic amplification of DNA in vitro: The polymerase chain reaction. Cold Spring Harbor Symposium in Quantitative Biology, 51:263-273. Saiki, R.; Gelfand, D.; Stoffel, S.; Scharf, S.; Higuchi, R.; Horn, G.; Mullis, K.; Erlich, H. (1988) Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase. Science 239 (4839): 487–491. K. Mullis, 1990, The unusual origin of the polymerase chain reaction. Scientific American, April 56-65.