No title

adva színreakció jön létre, a szín arányos a megkötött antitestek mennyiségével. Az abszorbanciát fotométerrel mérjük.

Hantavírus (Puumala) IgG/IgM-ELISA Enzimes immunvizsgálat az IgG és az IgM Puumala szerotipusú antitestek meghatározására.

4. Szükséges anyagok és reagensek, amelyeket a teszt nem tartalmaz

Kódszám: Tartalom: Tárolás:

Desztillált víz Osztott mérıhenger Kémcsövek a minták hígításához Precíziós pipetták: 5 µl, 20 µl, 50 µl, 200 µl és 1000 µl Többcsatornás vagy osztó pipetták: 100 µl és 200 µl Pipettahegyek a fenti pipettákhoz ELISA fotométer, 450 nm-es szőrıvel Kesztyők Stopper

PR59156 96 teszt +2-8ºC

Használati Utasítás /Instruction Sheet/ 1. Hantavírus klinikai tünetei A járványos veseelégtelenséget (Nephropathia epidemica, NE), a Puumala vírus (Hantavírusok) okozza. A lappangási idı 10-20 nap, a betegség influenzaszerő tünetekkel kezdıdik. További klinikai tünetek a hasi és ágyéki fájdalmak és a folyamatosan csökkenı vesemőködés. Jellemzı laboratóriumi paraméter a trombocita-szám csökkenés és a leukocitózis. A Hantaan típus által okozott hemorrhágiás lázzal és vesetünetekkel (HFRS) összehasonlítva a járványos veseelégtelenség ( NE) közepesen súlyos megbetegedés.

2. A teszt alkalmazása A Hantavírus (Puumala) IgG/IgM-ELISA teszt alkalmas a specifikus IgG és IgM antitestek meghatározására járványos veseelégtelenség (NE) gyanúja esetén. A Hantaan vírus és más szerotipusok által okozott fertızés csak korlátozottan mutatható ki (lásd: Az eredmények értékelése, Diagnosztikai hatékonyság részben).

3. A teszt mőködési elve A mikrotiter lemez a Puumala vírus rekombináló nucleocapsid-proteinjével van bevonva. Az IgM antitestek meghatározásához a vizsgálat elıtt a beteg szérumát reumafaktor IgG abszorbenssel inkubáljuk, hogy kiküszöböljük az IgG antitestek, vagy a reumafaktor nem specifikus reakcióját. Az inkubálás alatt a Puumala rekombináló antigén specifikus antitestjei a szilárd fázishoz kötıdnek. Mosás után a specifikus IgG és IgM antitesteket peroxidázzal kapcsolt anti-humán IgG és IgM antitesttel mutatjuk ki. Az oldathoz szubsztrátot Megrendelhetı: VITANI KFT. Egészségügyi Szaküzlet 1147 Budapest Telepes u. 17. Telefon: 467-0767, Fax/Üzenet: 467-0769 E-mail: [email protected]

2009.10.02.

5. Anyagok és reagensek A készlet tartalma (PR59156) MTP, 96 lyukas mikrotiter lemez Puumala rekombináló antigén bevonattal (CG 18-20), szilikagéllel alumínium fólia csomagolásban. Szükség szerint sorok vagy egyedi lyukak törhetık le a lemezrıl. Használatra kész. PG, pozitív IgG kontroll humán szérum, stabilizáló és tartósítószerekkel; 1 kémcsı, 1,5 ml (zöld fedı). Használatra kész. RG, referencia IgG kontroll humán szérum, stabilizáló és tartósítószerekkel; 1 kémcsı, 1,5 ml (vörös fedı). Használatra kész. PM, pozitív IgM kontroll humán szérum, stabilizáló és tartósítószerekkel; 1 kémcsı, 1,5 ml (sárga fedı). Használatra kész. RM, referencia IgM kontroll humán szérum, stabilizáló és tartósítószerekkel; 1 kémcsı, 1,5 ml (kék fedı). Használatra kész. NEG, negatív kontroll humán szérum, stabilizáló és tartósítószerekkel; 1 kémcsı, 1,5 ml (színtelen fedı). Használatra kész. SB 20x, minta puffer (20x), PBS pH 7,4 felület aktív anyagot és 0,01% thimerosalt tartalmaz, vörös színő, 1 palack 10 ml. Használat elıtt hígítani kell. WASH 20x, mosó puffer (20x), PBS pH 7,4; felületaktív anyagot és 0,01% thimerosalt tartalmaz, 1 palack, 10 ml. Használat elıtt hígítani kell. CG 20x, anti IgG-peroxidáz konjugátum (20x), 1 Gyártó:PROGEN Biotechnik GmbH, Germany 69123 Heindelberg Maaβstraβe 30 Telefon:+49(0)6221/8278 0 www.progen.de

1/5 oldal

kémcsı, 750 µl (fekete fedı). Használat elıtt hígítani kell! CM 20x, anti IgM-peroxidáz konjugátum (20x), 1

pipettákat használjunk! Ne használjunk mágneses keverıt! Kerüljük az oldatok érintkezését fémekkel!

kémcsı 750 µl (fehér fedı). Használat elıtt hígítani kell!

Minta szérum hígítása: 1 + 200

S 20x, szubsztrát (20x), tetrametil-benzidin (TMB) metil-pirrolidonban, 1 palack 750 µl. Használat elıtt hígítani kell!

IgG: mérjünk 5 µl szérumot 1000 µl használatra kész minta pufferhez.

STOP, befejezı oldat , 0,5 M kénsav, 1 palack, 15 ml. Használatra kész.

IgM: hígítás IgG leírás szerint. Mérjünk 15 µl ABS oldatot 250 µl hígított szérumhoz, inkubáljuk 30 percig szobahımérsékleten (20-26ºC).

ABS, reumafaktor IgG abszorbens (20x); antihumán IgG stabilizáló és tartósító szerekkel, 1 kémcsı, 750 µl (narancs fedı). Használatra kész. Öntapadó fólia az ELISA teszt csíkokhoz; 1 db.

6. Elıkészítés 6.1 Minta és mintatárolás A Hantavírus (Puumala) IgG/IgM-ELISA teszthez humán szérumot használunk. A mintákat 2-8°C hımérsékleten 6 hétig, a hígítatlan mintákat – 20ºC hımérsékleten több hónapig tárolhatjuk. Kerüljük el az ismételt lefagyasztást, kiolvasztást [9]. 6.2. Reagensek elıkészítése Hagyjuk a készletet szobahımérsékleten (20-26ºC) melegedni. A tömény puffer oldatok kristályokat tartalmazhatnak, amelyek 37ºC-on gyorsan feloldódnak. A puffer oldatokat hagyjuk szobahımérsékletre (20-26ºC) hőlni a vizsgálat megkezdése elıtt. A hígításokat a szükséges mennyiségben, közvetlenül a felhasználás elıtt végezzük! Használatra kész minta puffer: 1 + 19 Példa 8 lyuk esetén: mérjünk 1 ml SB 20x puffert 19 ml desztillált vízhez. Használatra kész mosó puffer: 1 + 19 Példa 8 lyuk esetén: mérjünk 1 ml WASH 20x puffert 19 ml desztillált vízhez. Használatra kész konjugátum: 1 + 19 Példa 8 lyuk esetén: mérjünk 50 µl CG 20x, illetve CM 20x oldatot 950 µl használatra kész mosó pufferhez. Használatra kész szubsztrát: 1 + 19 Példa 8 lyuk esetén: mérjünk 50 µl S 20x oldatot 950 µl desztillált vízhez. Tiszta edényeket és Megrendelhetı: VITANI KFT. Egészségügyi Szaküzlet 1147 Budapest Telepes u. 17. Telefon: 467-0767, Fax/Üzenet: 467-0769 E-mail: [email protected]

2009.10.02.

7

Tárolás, eltarthatóság

Tároljuk a készletet és összetevıit + 2-8ºC hımérsékleten. A bontatlan reagensek stabilak és felhasználhatóak a jelzett lejárati idıig. Eltarthatóság felbontás után: Felbontás után valamennyi komponens stabil 3 hónapig 2-8ºC hımérsékleten tárolva. A felhasználatlan tesztcsíkokat helyezzük vissza a fólia csomagolásba. Eltarthatóság hígítás után: A hígított minta puffer és mosó puffer oldat stabil 1 hétig 2-8ºC hımérsékleten tárolva. A hígított szubsztrát és konjugát oldatot a vizsgálat végén megsemmisítjük.

8

Kivitelezés

Minta inkubálása: pipettázzunk 100 µl hígítatlan negatív, pozitív és referencia oldatot majd hígított (és ABS-el kezelt) vizsgálandó mintát egy-egy lyukba. Fedjük le az öntapadó fóliával. Inkubáljuk 45 percig 37ºC-on. Mosás: öntsük ki a folyadékot a lyukakból, majd mérjünk be 200 µl hígított mosó puffert. Ürítsük ki a lyukakat és ismételjük meg háromszor a mosást. A maradék vizet itassuk fel szőrıpapírral. Konjugátum inkubáció: pipettázzunk 100 µl hígított konjugátumot (IgG vagy IgM) a lyukakba. Fedjük le az öntapadó fóliával. Inkubáljuk 45 percig 37ºC-on. Mosás: ürítsük ki a lyukakat és mossuk az elıbbiek szerint (4x200 µl lyukanként). Szubsztrát reakció: pipettázzunk 100 µl hígított szubsztrát oldatot a lyukakba. Inkubáljuk 10 percig szobahımérsékleten (20-26ºC). Befejezés: mérjünk 100 µl STOP reagenst a Gyártó:PROGEN Biotechnik GmbH, Germany 69123 Heindelberg Maaβstraβe 30 Telefon:+49(0)6221/8278 0 www.progen.de

2/5 oldal

lyukakba. Mérjük a kialakult színt 20 percen belül 450 nm hullámhossznál (referencia hullámhossz: 650 nm).

9

Megjegyzések

Laboratóriumi használatra. Pontosság és hatásfok a következı kritikus faktorok függvénye: Hemolitikus, lipémiás, ikteruszos vagy mikrobiálisan szennyezett minta hibás eredményt okozhat.

Termék: vegyi anyagokat a helyi szabályozásnak megfelelıen kell elhelyezni. Biológiai anyagokat a szérum minták és a fertızött hulladék megsemmisítésére alkalmazott gyakorlatnak megfelelıen kell kezelni. Csomagolás: a csomagoló anyagokat a helyi szabályozásnak megfelelıen kell elhelyezni. Szennyezett csomagolás esetén az eljárás ugyan az, mint a termék esetén. Más elıírás hiányában a nem szennyezett csomagolás háztartási hulladékba kerülhet, vagy újrahasznosítható. Eljárás szállítási sérülés esetén

Az inkubálást az elıírt 37ºC-on illetve szobahımérsékleten kell végezni. Tartsuk meg a pipettázás sorrendjét! Végezzünk párhuzamos meghatározást!

Ha a készlet jelentısen sérült, kérjük vegye fel a kapcsolatot a gyártóval, vagy a helyi képviselıjével. A sérült készletet ne használja fel a vizsgálatokhoz. Tárolja a készletet és részeit, amíg a reklamációt intézik.

Az inkubációs idı eltérés ± 10%-nál nagyobb nem lehet. Az inkubációs idı az utolsó pipettázással kezdıdik.

10 Minıségellenırzés

A minták bemérésének ideje nem haladhat meg 60 másodpercet egy ELISA tesztcsík esetén.

A következı arányok és abszorbancia értékek a teszt minıségellenırzı paramétereit jelenítik meg. A kiszámolt arányok sikeresen végrehajtott vizsgálat esetén (abszorbancia 450 nm, A):

A konjugátum, a szubsztrát és STOP bemérésének ideje nem haladhat meg 10 másodpercet egy ELISA tesztcsík esetén. Biztonsági megjegyzések: A STOP oldat (kénsav) és a szubsztrát komponensei (metil-pirrolidon) irritálhatják a bırt. Ha a savas oldat vagy a szubsztrát szembe kerül, azonnal bı vízzel öblítsük ki és forduljunk orvoshoz. A teszthez felhasznált humán plazma Humán Immunodeficiency Vírus, Hepatitis B és C ellenırzı vizsgálata negatív (ismételten nem aktiválható). Ennek ellenére minden humán vérszármazékot potenciálisan fertızı anyagként kell kezelni. Tartsuk be a fertızı anyagok kezelésére vonatkozó általános szabályokat! Több reagens tartalmaz tartósítószert (pl.: thimerosal). Ne nyeljük le! Kerüljük az érintkezést a bırrel és a nyálkahártyákkal! A biztonsági adatlap igény szerint rendelkezésre áll.

> 0,8

A pozitív IgG kontroll vagy A pozitív IgM kontroll PG = A pozitív IgG kontroll RG A referencia IgG kontroll NEG = A negatív IgG kontroll RG A referencia IgG kontroll PM = A pozitív IgG kontroll RM A referencia IgM kontroll NEG = A negatív IgM kontroll RG A referencia IgM kontroll

> 1,8 < 0,5 >2 < 0,5

Amennyiben ezek a kritériumok nem teljesülnek a vizsgálat nem értékelhetı és meg kell ismételni.

11 Az eredmények számítása, értékelése Az eredmények kiszámításához képezzük a minta és a referencia kontroll abszorbanciájának hányadosát: Aminta ------------------------------ =

Q

Areferencia kontroll és értékeljük a következı szerint: a)IgG antitest vizsgálatával:

Hulladék elhelyezés: Megrendelhetı: VITANI KFT. Egészségügyi Szaküzlet 1147 Budapest Telepes u. 17. Telefon: 467-0767, Fax/Üzenet: 467-0769 E-mail: [email protected]

2009.10.02.

Gyártó:PROGEN Biotechnik GmbH, Germany 69123 Heindelberg Maaβstraβe 30 Telefon:+49(0)6221/8278 0 www.progen.de

3/5 oldal

Q<1 1≤Q≤1,5

Q>1,5

Negatív:A mintában Puumala vírus IgG antitest nem mutatható ki. Egyértelmő értékelés nem lehetséges. A betegség lefolyását 10 nap múlva ismételten vizsgálni kell. Hantavírus fertızés gyanúja esetén javasolt a szérumminta IgM antitest és/vagy Hantaan szerotipus antitest vizsgálata is. Pozitív:A mintában Puumala vírus specifikus IgG antitest kimutatható.

b) IgM antitest vizsgálatával: Q<1 1≤Q≤2

Q>2

Negatív:A mintában Puumala vírus IgM antitest nem mutatható ki. Egyértelmő értékelés nem lehetséges. A betegség lefolyását 10 nap múlva ismételten vizsgálni kell. Hantavírus fertızés gyanúja esetén javasolt a szérumminta Hantaan szerotipus antitest vizsgálata is. Pozitív:A mintában Puumala vírus specifikus IgM antitest kimutatható.

12 A teszt értékelése

Seoul IFT n=47

PUU-IFT n=25

HTN-IFT n=56

95 %

88%

100%

68%

99%

62%

IFT ELISA Hantaan IgM ELISA Cutoff 0.600 Puumala IgM ELISA Cutoff 0.600

A szenzitivitás és a specificitás meghatározásához 194 egészséges véradó szérumát és 122 IgG pozitív szérumot (25 IgM szérum indirekt immunofluoreszcenciás vizsgálattal Puumala vírus pozitív volt) használtak fel. Puumala vírusra a szenzitivitás 100 % és a specificitás 99 %-os volt. 1

a)IgG

Diagnosztikai hatékonyság= specificitás/2 + szenzitivitás/2

13 Irodalom

Összehasonlították a Hantavírus (Puumala) IgGELISA, valamint a Hantavírus (Hantaan) IgGELISA, a Hantavírus Hantaan Antitest IF teszt, a Hantavírus Puumala Antitest IF és a Hantavírus Seoul Antitest IF párhuzamos tesztjeinek eredményeit és a következı diagnosztikai hatékonyságot1 találták: Seoul IFT n=38

PUU-IFT n=29

HTN-IFT n=56

95 %

88%

99%

75%

98%

84%

1.

2.

IFT ELISA Hantaan IgG ELISA Cutoff 0.600 Puumala IgG ELISA Cutoff 0.600

A szenzitivitás és a specificitás meghatározásához 194 egészséges véradó szérumát és 123 IgG pozitív szérumot (29 IgG szérum indirekt immunofluoreszcenciás vizsgálattal Puumala vírus pozitív volt) használtak fel. A szenzitivitás 99 %, a specificitás 97 % volt Puumala vírusra. b) IgM Megrendelhetı: VITANI KFT. Egészségügyi Szaküzlet 1147 Budapest Telepes u. 17. Telefon: 467-0767, Fax/Üzenet: 467-0769 E-mail: [email protected]

2009.10.02.

Összehasonlították a Hantavírus (Puumala) IgMELISA, valamint a Hantavírus (Hantaan) IgMELISA, a Hantavírus Hantaan Antitest IF teszt, a Hantavírus Puumala Antitest IF és a Hantavírus Seoul Antitest IF párhuzamos tesztjeinek eredményeit és a következı diagnosztikai hatékonyságot1 találták:

3.

4.

5.

Niklasson B., et al, Hemorrhagic fever with renal syndrome:Evaluation of ELSA for detection of Puumala virus-specific IgG and IgM. Res.Virol. (1990) 141 Settergren P., Juto P., Trollfors B., Wadell G. and Norrby S.R. Clinical characteristics of Nephropathia epidemica in Sweden: Prospective study of 74 cases.Reviews of Infectious Disease Vol. 11 (1989) Grcveska K., Polenakovic M., Oncevski A., Zografski Dj. And Gligic A. Different pathohistological presentations of acute renal involvement in Puumala virus infection: report of two cases. Clinical Nephrology (1990) 34: 197-201 Gött P., Zöller L., Yang S., Stohwasser R., Bautz E.K.F., Darai G..Antigenicity of Hantavirus nucleocapsid proteins expressed in E. coli. Virus Res. (1991) 19: 1-16 Zöller L., Yang S., Gött P., Bautz E.K.F., Darai G.. Use of recombinant nucleocapsid proteins of the Puumala and Nephropathia epidemica serotypes of Hantaviruses as immunodiagnostic antigens. J.Med.Virol.(1993) 39:200-207 Gyártó:PROGEN Biotechnik GmbH, Germany 69123 Heindelberg Maaβstraβe 30 Telefon:+49(0)6221/8278 0 www.progen.de

4/5 oldal

6.

Zöller L., Yang S., Gött P., Bautz E.K.F., Darai G..A novel µ-capture ELISA based on recombinant proteins allows sensitive and specific diagnosis of hemorrhagic fever with renal syndrome. J.Clin.Microbiol. (1993) 31: 1194-1199 7. gött, P., Zöller, L., Darai, G.? Bautz, E.K.F.: A major antigenic domain of hantaviruses is located ont he aminoproximal site of the viral nucleocapsid protein.Virus Genes, 14: (1): 3140 (1997) 8. Clement J, Heyman P, McKenna P., Colson P, and Avsic-Zupanc T. The Hantaviruses in Europe:from the Bedside to the Bench.Emergimg infectious Disease Vol. 3.No. 2 (April-June 1997) http://www.cdc.gov/ncidod/EID/vol3no2/ clement.htm 9. Togni,G.u.a.:Präanalytik.Schweiz.Med.Forum.6 113-120(2002)

Megrendelhetı: VITANI KFT. Egészségügyi Szaküzlet 1147 Budapest Telepes u. 17. Telefon: 467-0767, Fax/Üzenet: 467-0769 E-mail: [email protected]

2009.10.02.

Gyártó:PROGEN Biotechnik GmbH, Germany 69123 Heindelberg Maaβstraβe 30 Telefon:+49(0)6221/8278 0 www.progen.de

5/5 oldal