07.05.2014
Tömegspektrometria /MS/
FIZIKA-BIOFIZIKA 2 2014. 04. 28. Huber Tamás PTE ÁOK Biofizikai Intézet
A tömegspektrometria rövid története: • Goldstein 1886: gázfázisú ionok felfedezése (anódsugár). • Thomson 1912: az első tömegspektrométer. • Aston, Dempster 1919-től: izotópok pontos tömege, tömegspektrum kifejezés. • 1942: első kereskedelmi készülék. • Cameron, Eggers 1948-52: time-of-flight (TOF) analizátor • Paul 1955: quadrupol analizátor. • McLafferty 1974: HPLC és MS összekapcsolása • Karas et al. 1987: MALDI (matrix assisted laser desoption ionisation) • Fenn 1988: elektrospray szervetlen MS 1900-1950 szerves MS 1950-től
1
07.05.2014
A tömegspektrometria Definíció: térben és időben szétválasztott részecskék egymás utáni elektromos detektálása. Alapelvek: Ionok képzése bármely alkalmas anyagból. Ionok szétválasztása töltésegységre eső tömegük szerint. Ionok minőségi és mennyiségi detektálása az m/z – gyakoriság függvény szerint. Az ionintenzitás- fajlagos tömeg közötti függvénykapcsolat a tömegspektrum.
Miért jó az MS? Nagy érzékenység kvalitatív kimutathatósági tartomány: 10-12 - 10-16 g kvantitatív kimutathatósági tartomány: 10-10 - 10-14 g Széles tömegtartomány 1-106 relatív tömegegység Specifitása, reprodukálhatóság, alacsony mintaigény ~μg - ~pg Bármilyen halmazállapotú, érzékenységű, szerkezetű anyag vizsgálható.
2
07.05.2014
Milyen információkat kaphatunk az MS-el? • • • •
MW meghatározás, minőségi azonosítás. Szerkezetvizsgálat (pontos tömeg = elemösszetétel) Izotóparány GC, LC, stb. kombinációk összetett mátrixok elemzésére • Proteomika • Molekulák termodinamikai tanulmányozása: ionizációs energia, aktivációs entalpia és entrópia stb.
LC/LC-MS/MS-Tandem LC, Tandem MS
3
07.05.2014
Az MS elvi felépítése Vákuum rendszer
Mintabevitel
Ion forrás
Analizátor
Detektor
Adatfeldolgozás, vezérlés
A minta folyékony biológiai minták fehérjék peptidek oligoszaharidok DNS szérum vér vizelet agy-, gerincvelői folyadék kismolekulák szilárd szöveti minták gyógyszerek … a mintából ionokat kell készíteni
4
07.05.2014
Mintabeviteli megoldások 1. Direkt mintabevitel (zsilipelés) • gázok • folyadékok • szilárd minták bevitele
2. Indirekt (elválasztás utáni) mintabevitel • GC-MS • LC-MS • CE-MS
Vákuumrendszerek: Analitikai készülékek: kétfokozatú Szerkezetvizsgálók: három fokozatú: 1. fokozat: elővákuum-rotációs szivattyú (102kPa-0.1-1kPa-ig) 2. fokozat: turbomolekuláris szivattyú diffúziós szivattyú (0.1-1 kPa-ról 10-6-10-7kPa-ig) 3. fokozat: ion getter pumpa (IGP)(10-8-kPa-ig)
5
07.05.2014
Az ionforrások feladata: • Ionok előállítása • ionok gyorsítása • koherens ionnyaláb biztosítása Az ionizáció történhet gáz, folyadék és szilárd fázisban.
Ionizálás Hő (+töltéscsere elektrolitban) Elektromos mező Foton Elektronütközés (EI) Atomok, ionok ütközése. Elsősorban a minta anyagi minősége, stabilitása, oldószere határozza meg. Befolyásolja az érzékenységet, kinyerhető szerkezeti információkat.
6
07.05.2014
Elektron ionizáció Közvetlen ionizáció. Ütközés fűtött katódból kilépő elektron-nyalábbal (5075eV). Könnyen gázfázisba vihető anyagok meghatározására alkalmas 1000 Da-ig, magas hőmérséklet. Intenzív, stabil, jól reprodukálható. Anyagok szűk körére alkalmas, jelentős fragmentáció (in source decay, ISD)
Az elektron ütközéses ionizáció elve
gyorsító elektród
izzó katód
elektron nyaláb
(+) ionnyaláb
+ + U + rep minta (M)
M+e
ionoptika
M+ + 2e
Analizátor
repeller
- U = 1-100kV
anód
7
07.05.2014
Lágy ionizációs technikák • Kémiai ionizáció (chemical ionisation, CI) •
Gyors atom/ion bombázás (fast atom/ion bombardment, FAB/FIB)
•
Plazmadeszorpció (plasma desorption, PD)
•
Térdeszorpció erős elektromos térrel (field desorption, FD)
Kémiai ionizáció Közvetett ionizáció. Kombinált EI/CI forrás. Ion-molekula ütközések a reagens ionok és a minta molekulái között. Reagens gázok: metán, i-bután, ammónia. Gyenge fragmentáció, főleg molekulatömeg információ.
8
07.05.2014
CI ionforrás M + CH5+ izzó katód
[M+H]++CH4
Analizátor
gyorsító elektród
repeller CH5+ + + +
Reagens gáz: CH4, NH3, propán, PB CH4 + e
anód
CH4+ + 2e
CH4 + CH4+
minta (M)
CH5++CH3
Elektrospray/ionspray ionizáció (ESI, ISI) Porlasztásos technika Fém kapilláris, 2-5 kV, szemben erős ellentétes töltés Külső csövön vezetett porlasztógáz (N2) Fűtött N2 ellenáram – oldószer párologtatás Nem illékony, poláros szerves vegyületek
9
07.05.2014
ESI Pressure = 1 atm Inner tube diam. = 100 um
Partial vacuum
Sample Inlet Nozzle (Lower Voltage)
MH+
N2 Sample in solution N2 gas
++ + + ++
++ + + ++ ++ + + ++
+ ++
+ ++
+ ++
+
+
+ ++ + ++
+ ++
+ + +
+
+
+ +
MH22+
+
MH33+ High voltage applied to metal sheath (~4 kV)
• • • •
Charged droplets
a minta porlasztása /spray/ elektromos erőtér + vákuumba apró cseppek az oldószer gyorsan párolog a vákuumban a csepp mérete csökken, a töltéssűrűség megnövekszik a cseppben az elektrosztatikus taszítóerő a cseppet egyre kisebb cseppecskékre bontja
10
07.05.2014
MALDI (Matrix Assisted Laser Desorption Ionization) Szerves mátrix (mustársav, -ciano-4-OH-fahéjsav, 2,5-dihidroxi-benzoesav). Minta a mátrixszal fémfelületre szárítva. Lézerimpulzusok. Mátrix az elnyelt energia révén ionizálja és elpárologtatja a mintát. Gyors, kíméletes, érzékeny, keverék mintákhoz is jó – makromolekulák vizsgálata
MALDI [Mátrix + M]
lézer
[Mátrix] + M
[Mátrix] + M+
Nitrogén lézer
Mátrix + M
D
ionizáció – deszorpció • • • •
a mátrix és a minta (M) elnyeli a lézer energiáját a mátrix+minta leválik a fémfelszínről a vákuumba gázfázisú molekulák jönnek létre a minta részecskéit a mátrix ionizálja gázfázisú protontranszfer során
11
07.05.2014
Analizátorok Feladatuk: Az ionforrásból érkező nagy sebességű ionok szétválasztása fajlagos tömegük szerint. • Mágneses analizátorok (180, 90, 60°-os eltérítésű) • kvadrupól analizátorok (felső tömeghatár: 100 kDa) • Ioncsapda (olcsó, érzékeny, de mennyiségi meghatározásra nem alkalmas) • Repülési idő (TOF) készülék (felső tömeghatár: 300 kDa) • Orbitrap • FT-ICR • kettős fókuszálású • Tandem analizátorok: MS/MS, MSn
Kvadrupól analizátor
• • •
a kvadrupól elektromos erőterében a részecske pályája függ a tömegétől és töltésétől egy adott DC és AC erőtér esetén csak az annak megfelelő tömeg/töltés aránnyal rendelkező részecskék tudnak áthaladni a kvadrupólon és elérni a detektort a DC és AC erőtér változatásával szekvenciálisan különböző tömeg/töltés aránnyal rendelkező részecskék detektálhatóak
12
07.05.2014
TOF (time of flight) analizátor Detektorhoz való megérkezés ideje függ a tömegtől és a töltéstől (gyorsítófeszültség). Hosszú tér- és ütközésmentes útszakasz kell. Lineáris és reflektron mód. Olcsó, jó felbontóképesség, széles tömegtartomány. MALDI + TOF fehérjeanalitika
TOF analizátor
á á
= 1 = 2
é ( )=
á
1 = 2 =
á
á ( ) ő( )
=
á
2
13
07.05.2014
Detektorok Feladatuk: 10-9 - 10-15 A ionáram érzékelése. Ionsokszorozó, fotosokszorozó.
A detektorok jellemzése: • érzékenység • ionáram változás követésének sebessége • erősítési tényező • elektromos zajszint (ún. sötétáram) • stabilitás (élettartam)
MS felbontás Felbontóképesség:
R m / m R<104 kisfelbontású R>104 nagyfelbontású
10 % szabály: két egyenlő intenzitású csúcs között a völgy legfeljebb a csúcsmagasság 10 %-a.
14
07.05.2014
Tömeg/töltés spektrum
Relatív intenzitás
Szén-dioxid m/z
Az n-Dekán tömegspektruma
C10H22
15
07.05.2014
Összetevők azonosítása
sztearinsav- metilészter
A tömegspektrometria orvosi alkalmazásai I. •
Mintabevitel: folyékony állapotú biológiai minta, megfelelően elkészített szérum, vércsepp, vizelet, liquor, szövetminta extraktum. • Egy vizsgálatból gyorsan, akár 30 féle anyagcsere betegségre adható diagnosztikai vélemény • Fehérje (enzim) szint diagnosztika: szekvenciaeltérés azonosítása poszttranszlációs modifikációk azonosítása konformáció eltérések vizsgálata kvantitatív fehérje expressziós profil vizsgálata
16
07.05.2014
közép-láncú acyl-CoA dehydrogenase hiány (MCAD)
marker metabolit: C6, C8, C10:1-karnitin
propionsav acidaemia (PA)
marker metabolit: C3-karnitin
A tömegspektrometria orvosi alkalmazásai II. Metabolit szint diagnosztika: veleszületett anyagcsere-betegségek • karnitin-észter profil meghatározás: primér/szekunder karnitinhiány, • zsírsavoxidációs zavarok, aciduriák • aminosav profil meghatározás: aminoacidopathiák • guanidinovegyületek: kreatinszintézis zavarok • epesavmetabolitok: epesavszintézis zavarok • homocystein: hiperhomocysteinaemiák • purinok, pirimidinek • galaktosaemia • szteroidszintézis, koleszterinszintézis zavarok • hormonszintézis zavarok (trijódtironin, katekolaminok) • szénhidrát-anyagcsere zavarai
17
07.05.2014
Detektált molekula marker metabolit
Betegség rövid-láncú acyl-CoA dehydrogenase hiány (SCAD)
C4-karnitin
közép-láncú acyl-CoA dehydrogenase hiány (MCAD)
C6, C8, C10:1-karnitin
hosszú-láncú hydroxi-acylCoA dehyrogenase hiány (LCHAD)
C14OH, C16OH, C18OHkarnitin
nagyon hosszú-láncú acylCoA dehydrogenase hiány (VLCAD)
C14:1, C16:1-karnitin
carnitin-palmytoil transferase hiány (CPT-I, II)
Emelkedett C0/C16+C18 karnitin arány
Betegség
Detektált molekula marker metabolit
fenilketonuria
fenilalanin/tirozin
jávorfaszörp betegség (MSUD)
leucin, izoleucin
tyrosinaemia I, II
tirozin
citrullinaemia I (ASS)
citrullin
arginosuccinic aciduria (ASL) argininaenemia
arginin
glutársav aciduria I (GA-I)
glutarinkarnitin
isovaleriánsav acidaemia (IVA)
C5-karnitin
metilmalonsav acidaemia (MMA)
C3-karnitin, metilmalonil karnitin
propionsav acidaemia (PA)
C3-karnitin
Köszönöm a figyelmet!
18
