SAMENVATTING
141
Samenvatting
Aminozuren zijn bouwstenen voor de synthese van eiwitten die nodig zijn voor de groei van een organisme. De synthese van aminozuren kost energie dat wordt gewonnen uit de voedingstoffen die door het organisme worden verbruikt. Om geen energie te verspillen door het onnodig aanmaken van aminozuren, wordt er via reguleringsmechanismen voor gezorgd dat er precies genoeg aminozuren worden gemaakt. Van de 20 verschillende aminozuren zijn de aromatische aminozuren fenylalanine, tyrosine en tryptofaan het meest kostbaar om te maken. Dieren (en ook mensen) zijn niet in staat om de aromatische aminozuren zelf te maken en moeten deze dan ook via het voedsel opnemen. De meeste planten, schimmels, gisten en bacteriën kunnen deze aminozuren wel maken. De synthese van de aromatische aminozuren wordt in het algemeen goed gereguleerd in deze organismen zodat zo efficient mogelijk met de beschikbare hoeveelheid energie wordt omgegaan. De regulatie bestaat voornamelijk uit remming van het eerste enzym en de enzymen op elk vertakkingspunt in de route door de aromatische aminozuren zelf (terugkoppelingsremming). Actinomyceten zijn veelzijdige bodembacteriën die in staat zijn om vele soorten antibiotica te produceren. Veel eigenschappen van actinomyceten zijn nog onbekend en verder onderzoek wordt van groot belang geacht voor het maken van meer en nieuwe varianten van bekende antibiotica maar ook voor de isolatie van geheel nieuwe typen antibiotica. Daarnaast is kennis omtrent de aanvoerroutes van de bouwstenen van antibiotica belangrijk. Een interessante groep van antibiotica wordt gemaakt uit aromatische aminozuren of uit tussenprodukten van hun biosynthese. De kennis die wordt verkregen door de bestudering van de regulatie van aromatische aminozuur biosynthese in actinomyceten is dan ook belangrijk om een efficiënte produktie van deze groep antibiotica te bewerkstelligen. Aromatische aminozuren worden gemaakt door het achtereenvolgens uitvoeren van verschillende chemische reacties. Deze reacties worden in het organisme uitgevoerd door enzymen, de biologische katalysatoren. De eerste 7 enzymatische stappen, de shikimaat route, zijn voor de drie aromatische aminozuren identiek. Het eerste enzym, 3-deoxy-D-arabino-heptulosonaat 7-fosfaat synthase (DS) maakt uit fosfoenolpyruvaat en erythrose-4-fosfaat het produkt 3-deoxy-D-arabino-heptulosonaat 7-fosfaat. Aan het eind van de shikimaat route wordt het eindprodukt chorismaat verdeeld over de enzymen anthranilaat synthase (tryptofaan route) en chorismaat mutase (fenylalanine en tyrosine route). Het produkt van de chorismaat mutase, prefenaat, wordt verdeeld over prefenaat dehydratase (fenylalanine route) en prefenaat aminotransferase (tyrosine route). De eigenschappen van een aantal enzymen die noodzakelijk zijn in de biosynthese van fenylalanine en tyrosine zijn bestudeerd in de actinomyceet Amycolatopsis methanolica. Er is gekozen voor de bestudering van DS, chorismaat mutase, prefenaat dehydratase en prefenaat aminotransferase, enzymen die de verdeling over de verschillende routes bepalen. In A. methanolica is gevonden dat DSI een interactie
142
Samenvatting
aangaat met chorismaat mutase (complex vorming). Deze interactie is noodzakelijk voor een goede werking van de chorismaat mutase maar niet voor die van DSI. De andere bestudeerde enzymen functioneren zelfstandig. De procedures voor het isoleren van mutanten van A. methanolica die geen fenylalanine, tyrosine en/of tryptofaan konden maken werden geoptimaliseerd. De cellen van A. methanolica zijn met elkaar verbonden in lange, vertakte ketens. Hierdoor is het bijna onmogelijk om auxotrofe mutanten te isoleren. Door de ketens kort te behandelen met ultrageluid konden individuele cellen worden verkregen waarna beschadigingen in het erfelijk materiaal (DNA) geïntroduceerd werden met behulp van bestraling met ultraviolet licht. Aldus konden op eenvoudig wijze vele mutanten geïsoleerd worden. In deze mutanten waren één of meerdere activiteiten van bepaalde enzymen uit de biosynthese van aromatische aminozuren niet meer aanwezig. Mutanten die DS, shikimaat dehydrogenase, shikimaat kinase of prefenaat aminotransferase activiteit verloren hadden werden niet geïsoleerd, hetgeen een duidelijke aanwijzing was dat er meerdere vormen van deze enzymen aanwezig waren. Dit vermoeden werd bevestigd met behulp van enzymzuiveringen. In A. methanolica wordt DSI activiteit geremd door zowel fenylalanine, tyrosine als tryptofaan. Tevens remt tryptofaan ook de anthranilaat synthase activiteit zodat er geen chorismaat wordt omgezet in tryptofaan als dit al voldoende aanwezig is. Chorismaat mutase activiteit wordt geremd door zowel fenylalanine als tyrosine. De route vanaf prefenaat naar tyrosine wordt alleen indirect gecontroleerd door tyrosine. Tyrosine stimuleert de prefenaat dehydratase activiteit zodat meer fenylalanine gemaakt wordt, waardoor er minder prefenaat beschikbaar is voor tyrosine synthese. Fenylalanine remt zijn eigen synthese door remming van de prefenaat dehydratase activiteit. In de situatie waarin te weinig fenylalanine in de cel aanwezig is om optimaal te kunnen functioneren wordt er een tweede DS (DSII) gemaakt en extra veel van chorismaat mutase. De DSII activiteit wordt niet geremd door fenylalanine maar alleen door tyrosine en in mindere mate door tryptofaan. Een grote hoeveelheid van chorismaat mutase kan geen interactie aangaan met DSI omdat van dit enzym juist niet extra veel gemaakt wordt. Deze vrije vorm van chorismaat mutase heeft een lage specifieke activiteit maar wordt niet geremd door fenylalanine en tyrosine. Remming van prefenaat dehydratase door fenylalanine wordt veroorzaakt door een lagere affiniteit voor prefenaat en een lagere maximale snelheid van prefenaat dehydratase. De stimulatie door tyrosine wordt veroorzaakt door een hogere affiniteit voor prefenaat en een hogere maximale snelheid van prefenaat dehydratase. Door veranderingen in het erfelijk materiaal van prefenaat dehydratase werden twee typen mutanten geïsoleerd. In beide mutanten is prefenaat dehydratase niet meer gevoelig voor remming door fenylalanine. In één mutant is tegelijkertijd de stimulatie door tyrosine en de remming door fenylalanine verloren.
143
Samenvatting
In A. methanolica zijn meerdere aromatische aminotransferasen aanwezig. In de route naar fenylalanine kunnen twee enzymen, aro ATI en aro ATII, fenylalanine maken uit fenylpyruvaat; in de route naar tyrosine zijn drie enzymen, Ppa ATI-III, aanwezig die arogenaat, de precursor voor tyrosine, maken uit prefenaat. Het enzym aro ATII is voor het grootste gedeelte verantwoordelijk voor de vorming van fenylalanine. Aro ATII is daarnaast ook noodzakelijk voor de groei op en de afbraak van tyrosine en heeft daardoor een dubbele functie. Aro ATI en Ppa ATI komen overeen met de aminotransferase die ook de vertakte aminozuren maakt. De activiteit van Ppa ATII is een nevenactiviteit van het enzym aspartaat aminotransferase. Ppa ATIII kan alleen prefenaat omzetten in arogenaat en is waarschijnlijk het belangrijkste enzym voor de vorming van arogenaat uit prefenaat. A. methanolica is naast veel andere koolstofbronnen ook in staat om te groeien op quinaat (1,3,4,5-tetrahydroxy-cyclohexaancarbonzuur). Het katabolisme (afbraak) van quinaat verloopt via 3-dehydroquinaat en 3-dehydroshikimaat. Deze twee intermediairen maken ook deel uit van de shikimaat route. Normaal gesproken verlopen katabole routes gescheiden van biosynthetische routes. Indien er dezelfde intermediairen gevormd worden in zowel katabole als biosynthetische routes zijn hiervoor meestal verschillende enzymen verantwoordelijk. In A. methanolica is het enzym dat 3-dehydroquinaat omzet in 3-dehydroshikimaat, 3-dehydroquinaat dehydratase, zowel betrokken bij het katabolisme van quinaat als bij de biosynthese van aromatische aminozuren. Het enzym vertoonde grote overeenkomsten met het katabole type II, zoals die voorkomt in schimmels die groeien op quinaat, maar niet met het biosynthetische type I. Mutanten die geen 3-dehydroquinaat dehydratase activiteit bezaten konden niet meer groeien op quinaat en konden ook geen aromatisch aminozuren meer maken, een duidelijk bewijs dat één 3-dehydroquinaat dehydratase aanwezig is met een dubbele functie. De twee startprodukten voor de synthese van aromatische aminozuren, fosfoenolpyruvaat en erythrose-4-fosfaat, worden gemaakt uit glucose via respectievelijk de glycolyse en de pentosefosfaat-weg. Erythrose-4-fosfaat speelt ook een rol in het metabolisme van methanol. De regulatie van glucose en methanol metabolisme werd bestudeerd vanwege de interactie met de biosynthese van de aromatische aminozuren. Het metabolisme van glucose verloopt volgens de klassieke Embden-Meyerhoff route Opmerkelijk was dat het enzym fosfofruktokinase (PPi-PFK) pyrofosfaat gebruikt als fosfaat donor bij de omzetting van fructose-6-fosfaat in fructose-1,6-bisfosfaat, in tegenstelling tot het meer gebruikelijke ATP als fosfaat donor. De PPi-PFK activiteit werd ook aangetoond in naaste verwanten van A. methanolica. De glycolyse in A. methanolica wordt niet of nauwelijks gereguleerd door remming of stimulatie van PPi-PFK en pyruvaat kinase door intermediairen uit de glycolyse en citroenzuur-cyclus maar lijkt meer gereguleerd te worden aan de hand van de energiestatus van de cel.
144
Samenvatting
De groei op een simpel molekuul als methanol vereist dat dit wordt omgezet in grote, meer ingewikkelde molekulen. De fixatie van methanol verloopt via de ribulose-5-fosfaat (RuMP) cyclus. De oxydatie van methanol in formaldehyde kon lange tijd niet worden aangetoond in A. methanolica. Met behulp van een tetrazolium zout, een kunstmatige elektronen acceptor, werd een methode ontwikkeld om de methanol dehydrogenase activiteit reproduceerbaar te kunnen meten. Dit nieuwe type methanol dehydrogenase kon ook worden aangetoond in andere actinomyceten die op methanol en/of ethanol konden groeien. De activiteit van transketolase en ribulose-5-fosfaat epimerase, twee andere enzymen uit de RuMP cyclus, zijn sterk verhoogd door de aanwezigheid van methanol. De hogere transketolase activiteit is het gevolg van synthese van een extra enzym.
145
