Samenvatting
De kleurverandering van bladeren is een van de opvallendste kenmerken van de herfst voordat ze afsterven en afvallen. Tijdens de herfst worden de bouwstoffen die aanwezig zijn in het blad gerecycled en opgeslagen om na afloop van de winter gebruikt te worden om nieuwe bladeren te laten uitlopen. Ons woord herfst is afgeleid van het oud Germaanse woord ‘harbista’, dat via het Hoogduitse ‘herbist’ en het Middelhoogduitse ‘herbest’ uiteindelijk het Middelnederlandse ‘hervest’ werd. Het Engelse woord harvest wat oogsten betekent heeft echter niet meer de betekenis van jaargetijde behouden zoals in Nederland. De herfst is het jaargetijde van het oogsten en dat doen zowel mensen als planten. Het afsterven van bladeren is niet passief. Voordat ze afsterven, halen veel planten de voedingsstoffen terug uit hun bladeren. Ze worden opgeslagen in de wortels en de stengel voor het volgende voorjaar of worden gebruikt voor de aanmaak van zaden en vruchten. Tijdens mijn onderzoek heb ik gewerkt met de modelplant Arabidopsis thaliana, oftewel een onkruid dat vrijwel overal in Nederland is te vinden en ook wel zandraket wordt genoemd. De zandraket wordt gekenmerkt door een korte levenscyclus wat het mogelijk maakt om tijdens een promotieonderzoek een bepaalde eigenschap te volgen in opeenvolgende generaties. Sinds de ontdekking van de structuur van het DNA zijn wetenschappers in staat om eigenschappen van een organisme te herleiden tot een gen. Tegenwoordig is de volledige erfelijke informatie die is opgeslagen in het DNA van de zandraket bekend en weten we dat het voor ongeveer 32000 genen codeert. Een aantal studies heeft aangetoond dat ruim tweeduizend genen betrokken zijn bij het afsterven van bladeren. Dit toont aan dat bladafsterving een genetisch gecontroleerd proces is en dus een belangrijk onderdeel vormt van de levenscyclus van de plant. De bladeren van de zandraket sterven af zodra ze een bepaalde leeftijd hebben bereikt, daarnaast kan de plant er voor zorgen dat een blad afsterft zodra deze stress krijgt. Dus een deel van de plant kan worden opgeofferd voor het behoud van de rest. Een belangrijk plantenhormoon dat het afsterven van
157
bladeren bevordert is ethyleen. Daarnaast zorgt ethyleen voor het rijp worden van bananen en appels maar heeft ook als effect dat snijbloemen snel verwelken. Daarom mogen vruchten en bloemen nooit samen vervoerd worden. Naast ethyleen is er een ander plantenhormoon, cytokinine wat juist een anti-verouderings effect op bladeren heeft en ervoor zorgt dat ze langer groen blijven. Mijn onderzoek is voornamelijk gericht op veranderingen in bladeren die optreden tijdens het verouderen. Deze wijzigingen kunnen een signaal zijn voor de plant om een blad te laten afsterven. Omdat het afsterven van de bladeren van de zandraket wordt gereguleerd door de leeftijd van het blad vormt het een uitstekend testsysteem. De studie die hier beschreven is heeft als doel genen te identificeren die betrokken zijn bij het verouderingsproces van de bladeren. Daarnaast is het effect van het plantenhormoon ethyleen onderzocht op de ontwikkeling van de zandraket. Naast het genetisch onderzoek is er ook bepaald hoe het metabolisme van de bladeren verandert tijdens het ouder worden. De combinatie van de onderzoeksresultaten heeft nieuwe inzichten opgeleverd over de regulatie van de bladveroudering. Resultaten van het onderzoek kunnen worden toegepast om uiteindelijk de opbrengst van gewassen te verbeteren. Hormonen zijn universeel betrokken bij de ontwikkeling, groei en metabolische processen van alle organismen. Plantenhormonen kunnen zowel bladafsterving stimuleren als voorkomen. Het plantenhormoon ethyleen is betrokken bij vele aspecten van de ontwikkeling van de plant waarvan het aanzetten van bladafsterving een aspect is. Voor het identificeren van genen die van invloed zijn op de bladveroudering is er gebruik gemaakt van een mutant analyse. Door zaden van de zandraket chemisch te behandelen kunnen er mutaties optreden in het DNA. Het veranderen van een genetische eigenschap op deze manier kan gevolgen hebben voor de bladveroudering. Met behulp van een ethyleen behandeling is het mogelijk om mutanten te selecteren die verschillen in hun bladveroudering ten opzichte van de controle planten. Op deze manier zijn er ruim 100 onafhankelijke mutanten geïsoleerd. De grote vraag die overblijft is dan, welke van de 32000 genen zijn er veranderd in deze mutanten? Naast het toepassen van ethyleen voor het identificeren van genen die mogelijk betrokken zijn bij de bladveroudering is het effect van ethyleen ook onderzocht tijdens de ontwikkeling van controle planten.
158
In hoofdstuk 1 en 2 van dit proefschrift wordt de relatie tussen de leeftijd van een blad en het effect van ethyleen op de inductie van bladafsterving uitgebreid beschreven. Ethyleen kan alleen bladafsterving induceren wanneer het blad een bepaalde leeftijd heeft bereikt, dus jonge bladeren zijn ongevoelig voor het hormoon. Het onderzoek toonde aan dat het effect van ethyleen op bladveroudering afhankelijk is van de tijdsduur van blootstelling aan het hormoon. Een langere ethyleen behandeling resulteert in sterkere verouderingssymptomen, echter een extra lange behandeling vermindert de effecten van ethyleen op veroudering. Dus het effect van ethyleen op de inductie van bladveroudering hangt af van de leeftijd van een blad en de lengte van de behandeling. Naast dit effect van ethyleen op de controle planten zijn er ook acht mutanten getest. De mutanten worden old (onset of leaf death) genoemd. De behandeling van de mutanten met ethyleen toont aan dat een enkele genetische eigenschap een rol kan spelen bij de regulatie van de bladveroudering. Drie van de acht mutanten die beschreven zijn in hoofdstuk 2 zijn gekozen voor een gedetailleerde studie om nieuwe genetische componenten te identificeren die betrokken zijn bij bladveroudering. Twee mutanten, old13 en old9 vertonen alleen vervroegde bladveroudering tijdens een behandeling met ethyleen. Omdat het effect van ethyleen leeftijdsafhankelijk is verwachten wij door het bestuderen van deze mutanten het mechanisme van de interactie tussen leeftijd en ethyleen beter te begrijpen. Tot nog toe zijn er geen specifieke bladverouderingsgenen gevonden en hebben de bekende mutanten vaak een veelvoud aan extra defecten. Vanuit het perspectief van evolutie is het ook minder aannemelijk dat er specifiek genen zijn die alleen tijdens de laatste ontwikkelingsfase van een blad een rol spelen. De old13 mutant wordt beschreven in hoofdstuk 3 van dit proefschrift en is betrokken bij verscheidene processen in de plant. Wanneer een blad wordt aangevallen door een pathogeen dan kan er een lokale celdood optreden waardoor de invasie kan worden verhinderd. De old13 mutant vertoont deze eigenschap tijdens de ethyleen behandeling. Ondanks dat de mutant een normale ontwikkeling vertoont is hij overgevoelig voor droogte stress. Dit heeft waarschijnlijk te maken met het feit dat de interne concentratie van anionen (chloride, nitraat en sulfaat) sterk verhoogd is. Belangrijke signaalmoleculen tijdens zowel pathogeen detectie, droogte stress en bladafsterving zijn zuurstof radicalen. Tijdens de groei van de mutant is er een 159
constante verhoogde aanwezigheid van deze signaalmoleculen. Samenvattend kan het old13 gen product worden gekarakteriseerd als een belangrijke modulator tussen omgevingsstress en het aanschakelen van het blad afstervingsproces. In hoofdstuk 4 wordt de old9 mutant beschreven. De resultaten van het onderzoek naar de mutant resulteerden in 2 nieuwe inzichten. Ten eerste is er bepaald welke genen actief zijn in de mutant ten opzichte van de controle planten. Dit heeft aangetoond dat een grote groep genen die kunnen reageren op het hormoon cytokinine zich anders gedragen dan in de controle planten. Dit is opmerkelijk omdat cytokinine is gerelateerd aan het voorkomen van veroudering. Echter, een experiment waarin controle planten worden behandeld met cytokinine tijdens verschillende fasen van ontwikkeling toont aan dat het anti-verouderingshormoon ook veroudering kan veroorzaken. Wanneer planten op jonge leeftijd een behandeling krijgen met cytokinine dan resulteert dit in een verhoogde bladafsterving tijdens de ethyleen behandeling. Een ander interessant resultaat is dat een eiwit dat een onderdeel vormt van de celwand betrokken is bij de vervroegde bladafsterving in de old9 mutant. In de mutant is het gen dat voor de aanmaak van dit eiwit codeert sterk actief, echter wanneer dit gen wordt geblokkeerd vermindert de reactie van de mutant op de ethyleen behandeling. De rol van celwand eiwitten in de regulatie van de bladveroudering is een nieuw inzicht dat om verder onderzoek vraagt. In het laatste hoofdstuk van dit proefschrift wordt de old5 mutant gepresenteerd. De mutant toont vervroegde veroudering tijdens normale groei omstandigheden en heeft een enkele weken kortere levenscyclus. De mutant wordt veroorzaakt door een mutatie in een gen dat betrokken is bij de productie van het energiemolecuul NAD waarvan vitamine B3 een onderdeel is. NAD is belangrijk voor vrijwel alle metabole processen in de cel. Recent onderzoek in muizen, gist en mensencellen toont aan dat NAD direct is gekoppeld aan veroudering. Het onderzoek geeft aan dat de ontwikkeling en groei van cellen wordt aangepast aan de hand van de aanwezige hoeveelheid NAD. De old5 mutant vertoont vervroegde veroudering die waarschijnlijk wordt veroorzaakt door vergelijkbare mechanismen die betrekking hebben op veroudering in dieren. Het was eerder geopperd dat planten en dieren een zelfde verouderingsstrategie zouden kunnen hebben, echter dit is de eerste studie die dat inderdaad ook aantoont. De verandering in NAD niveaus in de mutant gaan gepaard 160
met een verhoogd cel metabolisme. Metabolisme afhankelijk van zuurstof gaat altijd hand in hand met oxidatieve stress. Oxidatieve stress ontstaat voornamelijk in de mitochondriën waar de verbranding plaatsvindt en wordt gezien als de belangrijkste oorzaak van veroudering in dieren. Deze studie toont aan dat de mitochondriën in planten wel degelijk een rol spelen bij veroudering in tegenstelling tot de algemeen aanvaarde opvatting dat de bladgroenkorrels de belangrijkste bron van oxidatieve stress zijn. Gezien de parallel tussen dieren- en plantenveroudering toont dit onderzoek aan dat het blad als een uitstekend model kan dienen voor het onderzoek naar veroudering. Door het toepassen van een nieuwe techniek waarbij de concentratie van honderden verschillende verbindingen in de cel tegelijk kan worden bepaald hebben we nieuwe factoren geïdentificeerd die wellicht de leeftijd van een blad bepalen. Verscheidene aminozuren vertonen een sterke ophoping vlak voor de start van de bladafsterving. Deze componenten kunnen dienen als kenmerken voor oude bladeren en dus nuttig zijn voor het bepalen van de ontwikkelingsfase van een blad. Daarnaast kan de combinatie van informatie van het metabolisme met die van de genexpressie worden gebruikt om nieuwe mechanismen te ontdekken die betrokken zijn bij de bladveroudering. Ongeveer 10 jaar geleden werd bladveroudering beschreven als een te complex biologisch proces om volledig te kunnen begrijpen. Echter de ontwikkeling van nieuwe moleculair biologische technieken heeft een ware revolutie te weeg gebracht in het onderzoek. Dit heeft geleid tot een continue toename van publicaties over genen die betrokken zijn bij bladveroudering. De groei in het aantal studies aan bladveroudering zal zeker leiden tot nieuwe inzichten in het proces. Daarom zullen de komende jaren opwindend en inspirerend zijn wanneer de processen die ten grondslag liggen aan bladveroudering worden onthuld.
161
162
