http://www.natur.cuni.cz/~zdenap/members/zdenateaching.htm
ŽIVOTNÍ CYKLUS Alternativní programy EB: Meiosa, sporulace, párování diferenciace apoptosa
X
BUNĚČNÝ CYKLUS EB: Mitosa PB: Buněčné dělení
PB: Sporulace diferenciace “apoptosa-like” VNĚJŠÍ PROSTŘEDÍ ⇒ Konstantní ⇒ Externí signály Cyklická reprodukce buňky zdroje živin Zachování kontinuity jaderné další buňky (DNA) i mimojaderné informace teplota atd. Interní signály Změna v dalším vývoji buňky: - alternativní programy - dráhy signální transdukce ROZHODOVÁNÍ: EB: G1 fáze “START” mitosa X alt. program PB ? Před iniciací replikace B.dělení X alt. program
METODY STUDIA BUŇEČNÝCH A ŽIVOTNÍCH CYKLU “KLASICKÉ METODY” 1. SYNCHRONISOVANÉ KULTURY selekční a indukční metody a) SELEKČNÍ - velikost buněk (filtrace) - hustota (gradienty) - stáří
filtr
b) INDUKČNÍ - složení média (limitace fosfátů, vitaminů etc.) - teplota - tma/světlo (řasy) - chemické látky
2. MATEMATICKÉ METODY Generační doba
τ
Relativní stáří buňky:
a = t / τ , t je doba od posledního dělení
3. MIKROSKOPICKÉ TECHNIKY / BARVENI
4. GENETICKÉ METODY: Mutanty buněčného cyklu + molekulárně biologické (genové manipulace) + cytologické Replikace Cytoskelet B.stěna Organely atd….
X
X
Morfologie - TERMINÁLNÍ FENOTYP Problém = LETHALITA ⇒ termosensitivní (ts) a chladosensitivní (cs) mutanty (termolabilní protein; reversibilní x ireversibilní) Analysy ts (cs) mutant: - terminální fenotyp - komplementace mutace - knihovna divokého kmene (centromerové vektory)
⇒ isolace genu Analysy genů: - sekvenční/restrikční/počitačová - funkce genu v buňkách: amplifikace, modifikace genu (lokalisace), suprese jiných mutací, lokalisace v buňkách za různých podmínek (imunofluorescence etc.) MUTACE: Zrušení funkce X Změna funkce (např. jiný komplex)
“MODERNÍ METODY” 1. NOVÉ TECHNIKY BARVENÍ / MIKROSKOPIE - GFP (Green fluorescent protein) - varianty barevné, optimalisace pro organismy možnost sledování chování proteinů in vivo (kvasinky - genomové GFP fuse)
2. TECHNIKY “GENOMIKY” A “PROTEOMIKY” - sekvenování genomů a) Technika mikroarrays b) Technika 2d elektroforesy / MALDI analysa etc - proteomika c) DATABASE SGD http://www.yeastgenome.org/ Stanford Genomic Resources http://genome-www.stanford.edu/ Published Datasets Stanford PROTEOME, YPD, https://www.incyte.com/tools/proteome/databases.jsp d) PROJEKTY PŔÍPRAVY KMENU - EUROSCARF, deleční mutanty, kmeny - TRIPLES database - GFP-tag kmeny - lacZ - tag kmeny
http://www.rz.uni-frankfurt.de/FB/fb16/mikro/euroscarf/ http://ygac.med.yale.edu/triples/triples.htm
BUNĚČNÝ CYKLUS PROKARYOT : E. COLI Replikace DNA Růstové pochody (složky biomasy, povrchové struktury)
Specifika (x EB): E.coli Generační doba = závisí na kultivačních podmínkách (E.coli: minimální gen. doba = 20 min = 1/2 doby replikace)
Interval před zahájením replikace DNA (pouze je-li gen doba > 60min) Fáze B Gen doba < 60min ⇒
Replikace DNA Fáze C = 40 min (analogie S-fáze)
PŘEKRYVNÉ CYKLY
Interval mezi terminací replikace a dělením buňky Fáze D = 20 min (analogie G2+M fází)
Gen doba < 60min ⇒
PŘEKRYVNÉ CYKLY
Inic. Termin. Dělení
τ = 60 min
τ = 50 min
τ = 40 min
τ = 30 min
C
D
BUNĚČNÝ CYKLUS E.COLI Exponenciální balancovaný růst: Dělení: • stejná velikost buněk (pouze při balancovaném růstu x variabilní gen.doba) • iniciace replikace ve stejném věku buňky • tvorba septa v centru • tvorba septa závislá na terminaci replikace • pravidelná distribuce nukleoidů do dceř. buněk Interní signály • Chemické (regulační proteiny; ionty - např. Ca2+- myosin-like molekuly; cAMP, cGMP etc…) • Mechanické - stérické zábrany (např. při septaci) • Redundantní regulace
I. REPLIKACE 1963 (Jacob, Brenner, Cuzin) - role membrány - iniciační místa na membráně - separace nukleoidů
INICIACE REPLIKACE
I.
1 x za buněčný cyklus
DnaA protein “iniciátor replikace” (koncentrace v b.cyklu stabilní, konzerv.) oriC sekvence - 4 vazebná místa pro DnaA protein, vazba cca 20-40ti monomerů DnaA
ROLE MEMBRÁNY: DnaA - ATP = aktivní 1. DnaA = neaktivní DnaA - ADP = neaktivní Poměrně stabilní
DnaA - ATP
⇒
“otevření” oriC pro replikační aparát
MONOMERY - vazba na oriC ATP DnaA
DnaA - ADP
ADP FOSFOLIPIDY = hlavně fosfolipidy s nenasycenými mastnými kyselinami
2. DnaA + fosfolipidy = neaktivní komplex (agregát) - nadprodukce DnaA - isolována směs: aktivní monomery neaktivní agregát DnaA+fosfolip. ⇓ Aktivace fosfolipasami (DnaK) Membrána udržuje část DnaA v neaktivnim stavu (neváže oriC)
II.
INTERAKCE oriC S MEMBRÁNOU
oriC sekvence: 11 kopii GATC Methylace Dam methyltransferasou (dam) Po iniciaci replikace - methylován jen rodičovský řetězec HEMIMETHYLOVANÁ DNA - blok reiniciace replikace - ? “posun” vazby na vnější membránu (? Represorový protein) τ = 25-30 min ⇒ hemimethyl. DNA cca 8-10 min MODEL 1) Iniciace replikace na vnitřní membráně. - role fosfolipidů - vhodné množství monomeru DnaA-ATP INICIACE - inaktivace nenavázaného DnaA-ATP - agregace BLOK REINICIACE 2) Hemimethyl. oriC DNA - posun z vnitřní membrány na inhibitor na vnější membráně, dokud není DnaA-ATP inaktivován X dam- kmeny
SEGREGACE NUKLEOIDU - terminace replikace (FtsA exprese - ? signál pro buněčné dělení) - separace nukleoidů - posun 1/4 a 3/4 - septace 1963 Jacob - model - růst membrány X - Inhibice syntézy proteinů - nukleoidy zůstanou centrálně obnovení syntézy proteinů - posun nukleoidů bez viditelného růstu membrány inhibitory tvorby septa neovlivní umístění Růst membrány ⇒ nemá vliv na “odtažení” nukleoidů
MODEL
Filamenta - ? Vazba na stěnu (membránu)
FtsZ protein = prokaryotický homolog tubulinu MukB protein = ? Motorový protein - mutanty mukB - nukleoid zůstává v centru - in vitro vazba s mikrotubuly - interakce s FtsZ proteinem - vazba k DNA C-koncovou doménou - homologie s kinesinem a myosinem - Komplex s MukE a MukF
SEPTACE
“ENZOSKELETON” - membrána - DNA - “cytoskelet” - ? Regulace Ca2+, proteinfosforylace) - role i při adaptaci na různé prostředí
mukB - změny hydrodynamických vlastností nukleoidů – rozbalení bakteriálního chromosomu MukB - ovlivňuje superhelicitu nukleoidu - ? Síla nutná pro kondenzaci a oddělení dceřiných nukleoidů kondensované MukB - udržuje nukleoidy stacionárních domény chromatinu buněk v kondensovaném stavu dekondensované domény chromatinu
Replication machinery
SeqA vazba na hemimethylovanou DNA vedle replikační mašinerie a replikační vidličky, SeqA udržuje replikující se nukleoid v rozbaleném stavu -po remethylaci SeqA disociuje a MukB obnoví kondensovaný stav
Oddělování nukleoidů probíhá paralelně s replikací - replikované domény se rovnou posunují na správné místo Replikace a oddělení nukleoidů v PB jsou paralelní procesy (X EB)
BAKTERIÁLNÍ CYTOSKELET
Bakteriální actin-like cytoskeletální proteiny - homologní k aktinu MreB a MreB homology - role v řadě buněčných funkcí (e.g. Regulace buněčného tvaru, segregace chromosomu, buněčná polarita..) - Proteiny uspořádány do helikálních filamentárních struktur - na vnitřní straně membrány MreB
X není jasné, zda MreB hraje nějakou roli v cytokinesi E.coli
Caulobacter crescentus
Filamenta B. subtilis – dynamické struktury, změny v průběhu b.cyklu - MreB protein Thermotoga maritima self-assembly in vitro - dlouhá filamenta - MreB využívá in vitro buď ATP nebo GTP pro tvorbu filament, filamenta pevnější než aktinová (podobnější intermediálním filamentům - poskytuje buňkám „pevnost“) Možné role: 1 - regulace tvaru tyčovitých bakterií prostřednictvím organizace biosyntetických enzymů mureinu do helikální struktury podél dlouhé osy buňky - „vzorec“ syntézy mureinu, který je zodpovědný za tyčovitý tvar buňky Murein (peptidoglykan) = primární determinanta tvaru bakteriální buňky, tvoří exoskeleton vně plasmatické membrány
2. participace na určení buněčné polarity - ? Lokalisace specifických proteinů do jednoho nebo obou pólů buňky Např. C.crescentus - diferenciační cyklus - řada proteinů specificky cílena do jednoho nebo obou pólů (např. membránové histidine kinasy). MreB je pro lokalisaci nezbytný. Není-li přítomen, proteiny difusně rozloženy uvnitř buňky. Dále - polární lokalisace proteinů participujících na chemotaxi, pohybu, virulenci …. ? Mechanismus ? 3. Segregace chromosomů - poškozená není-li MreB – nukleoidy nesprávně distribuované v cytoplasmě, buňky bez nukleoidů nebo nukleoidy poškozeny septem -Mechanismus pohybu nukleoidu není znám, ? Interakce (přímá nebo nepřímá) oriC oblasti s MreB cytoskeletem – pohyb podél helikální MreB struktury ?
MamK aktinový homolog - subcelulární organizace membrán magnetosomů = další role pro aktin-like cytoskelet = umístění organel v bakteriální buňce Magnetosomy - na membránu vázané organely Magnetospirillum magneticum obsahující krystaly železa. Membrány magnetosomů = invaginace cytoplasmatické membrány - podél dlouhé osy buňky. - ohraničeny filamentárními MamK strukturami (MamK-GFP), Vazba MamJ - ΔmamK - nejsou filamenta ani uspořádané řetízky magnetosomů.
Magnetosomy - role při orientaci bakterií podle magnetického pole, magnetotaktické bakterie - ? Role při nalezení optimálního prostředí pro existenci – rozhraní mezi kyslíkovým a anoxickým prostředím v půdě (mikroaerofilní bakerie)
FtsA aktinový homolog FtsA - komponenta mašinérie buněčného dělení - interakce s C-koncem FtsZ - Lokalizuje do FtsZ ringu - esenciální protein FtsA - in vitro tvoří polymerní strukturu - Váže ATP Funkce?
ParM a AlfA proteiny - Role při segregaci plasmidů (low copy number) - Kódované plasmidy – E.coli ParRMC (parR a parM geny), parS lokus s repeticemi kam se váže ParR Par - E.coli
AlfA – B.subtilis, segregace plasmidů, tvoří vlákno mezi póly b.
Bakteriální tubulin-like cytoskeletální proteiny - homologní k tubulinu 2 typy = FtsZ a BtubA/BtubB proteiny (Prosthecobacter dejongeii), GTPasy FtsZ protein - vytváří transientní dynamickou helikální strukturu podél dlouhé osy buňky a tzv. Z-ring uprostřed buňky
Bacillus subtilis - FtsZ konservativní, pravděpodobně u všech prokaryot - GTP-vazebný protein, GTPasová aktivita - in vitro - polymerace do uspořádané struktury - dynamické vlastnosti, růst z nukleačního místa Dynamická lokalizace v průběhu cyklu ⇒ Assembly ve středu buňky, zůstává alespon polovinu BC než nastává invaginace ⇒ Během septace: Z-ring shluknutí na konci invaginace ⇒ half-life méně než minuta, prodloužení u FTsZ mutants s redukovanou GTPasovou aktivitou ⇒ Assembly FtsZ - vytvoří se aktivní místo pro GTP hydrolysu mezi asociovanými monomery, k hydrolyse docházi asi hned po assembly
Lokalisace (FtsZ-GFP)
Interaguje s mnoha proteiny
Bakteriální homology intermediálních filament Crescentin - homolog intermediálních filament EB - cca 25 % identita a 40 % similarita s IF EB. - zodpovědný za „prohnutý“ tvar Caulobacter crescentus - creS mutanty = změna tvaru na „tyčovitý“
Filamenta crescentinu
CfpA a Scc proteiny - u Spirochet – cytoplasmatická filamenta- průměr 5-7 nm (EB IF = 8-10) -4-6 filament pod membránou, podél dlouhé osy buňky (helikální), vazba na membránu prostřednictvím proteinů
AglZ protein u Myxococcus xanthus - hraje roli v sociální motilitě, interaguje s malými GTPasami - tvoří filamenta in vitro
Další bakteriální cytoskeletární proteiny, které nemají homology v EB MinD/ParA třída bakteriálních cytoskeletárních proteinů MinD skupina: umístění bakteriálních míst dělení ParA skupina: oddělování DNA MinD skupina: tvoří dynamickou helikální strukturu pod cytoplasmatickou membránou
In vitro tvorba svazků MinD filament bundles v přítomnosti MinE, ATP, a phospholipidových vesiklů.
ParA skupina: „plasmid partitioning proteins“ kódované plasmidy - zodpovědné za distribuci nízkokopiových plasmidů do dceřiných buněk In vivo - ParA proteiny tvoří helikální filamenta – osciují podél nukleoidů (podobné „min“) In vitro tvorba svazků ParF filament v přítomnosti ParG a ATP.
BUNĚČNÉ DĚLENÍ - TVORBA SEPTA Polar annuli (PA)
Periseptal annuli (PSA)
Elektronová mikroskopie 1983
Vnitřní membrána Vnější membrána Peptidoglykan PSA - vnitřní membrána těsně spojena s peptidoglykanem a vnější membránou - definuje oblast membrány, kde vznikne septum Fluorescenčně značené proteiny - do periplasmatického prostoru - oblasti PSA resp. PA - není volná komunikace se zbytkem periplasmatic. prostoru
⇒ Komponenty pro tvorbu septa nedifundují, jsou lokalisovány
CYKLUS SEPTACE:
ts MUTANTY = fts (filamenting ts phenotype) - filamenta blok v buněčném dělení (x mutace ovlivnující i jiné fce např sekrece, replikace etc) Předp. fenotyp = filamenta bez PSA (původní PSA dorozdělená)
I. Tvorba nových PSA
Nebyly identifikovány: ? tvorba PSA nezbytná pro růst b. (např. signál pro inkorporaci nového materiálu) = letálni Předp. fenotyp = filamenta s nekomplet.
II. Změna lokalisace nových PSA, náhodně rozmístěná PSA ftsZ84 = nematurovaná PSA náhodně + maturace PSA Zastavení v 1/4 resp. 3/4 délky
podél filamenta
Předp. fenotyp = filamenta s PSA různá stádia tvorby septa III. Morfogenese septa ftsA = kompletní PSA ve správných posicích, po přenesení do permisivní teploty - dokončení sept Septum - invaginace všech - začátek invaginace tří vrstev ftsQ - ddto envA, cha Změny permeability k antibiotikům
IV. Modifikace PA PA odvozen od původního PSA = obsahuje elementy pro buněčné dělení
MINICELL MODEL:
FINÁLNÍ FENOTYP určen poměrem množství min produktů
Mutanty “min” - fenotyp = heterogenní délka buněk v populaci - 1 dělení / buněčný cyklus X 3 možná místa dělení Delece “min” lokusu = MINICELL FENOTYP 3 geny: minC minD minE Analysa min mutant + kmenů nadprodukujících min geny: FENOTYP - nadbytek minC + minD ⇒ inhibice dělení ⇒ filamenta - nadbytek minE ⇒ dělení ve všech místech ⇒ minicell - delece minC, D, E ⇒ dělení ve všech místech ⇒ minicell - delece minE ⇒ inhibice dělení ⇒ filamenta 1. Wild type
CD E
2. ΔminE nebo nadbytek minCD
3. ΔminCD nebo nadbytek minE
CD
MinC+MinD = inhibitory buněčného dělení ve všech místech MinE = určuje specificitu minCD inhibitoru
E
CD E
E
Min proteiny ⇒ vytváří dynamické struktury ⇒ oscilace mezi 2 polovinami buňky MinC a MinD mají stejný pattern i periodicitu oscilace ⇒ asi oscilují v komplexu (potvrzená interakce MinC a MinD)
MinE
MinD-ADP
MinD-ATP
MinD-ATP ⇒ vazba na fosfolipidy
MinE stimuluje ATP hydrolysu jen když je MinD-ATP vázán na membránu ⇒ ATP a MinE regulují vazbu MinD na membránu
Cyklus oscilace cca 50s
Regulace assembly FtsZ uprostřed buňky: MinC je antagonista Z-ring assembly tato funkce stimulovana MinD ⇒ ?MinD přivede MinC k membráně (MinC v nepřítomnosti MinD v cytoplasmě)
Proč assembly iniciuje na pólu ?
FtsZ gen - overexprese - minicell fenotyp X nejsou prodloužené buňky - zvýšení frekvence buněčného dělení za buněčný cyklus = dělení v centru zůstává + dělení i na pólech - nadřazeno inhibici min lokusem (nadprodukce minCD částečně suprimuje) - lokalisace PSA
INHIBITORY BUNĚČNÉHO DĚLENÍ MinC, MinD SfiA, SfiC: normálně reprimovány dereprese po SOS indukci - reversibilní blok septace (čas pro opravy a rekombinace)
Regulace dělení v závislosti na živinách – Bacillus subtilis komponenta b.stěny lipoteichoic acid
hodně glukosy vysoká úroveň aktivity glucolipid UDP-glucose biosynthesis pathway
UgtP glucosyltransferasa
Blok FtsZ assembly
glucose 1-phosphate phosphoglucomutasa
glucose 6-phosphate
hodně živin
Lokalizace UgtP v závislosti na živinách překryvné cykly
UgtP-GFP
wt
porucha UgtP dráhy
? Udržuje konstantní poměr FtsZ rings vzhledem k buněčné délce a zajišťuje, že buňka dostatečně naroste a dokončí segregaci chromosomů před cytokinesí
