i
Riesky Beksono yang selalu mendukung dan menyayangi saya sehingga saya dapat menyelesaikan penelitian ini. 6. Suryani, S.Si yang sangat membantu saya dengan mengarahkan dan menyemangati saya dalam melakukan penelitian ini sehingga penelitian ini bisa selesai pada waktunya. 7. Lisna, S.Far yang mengajarkan saya dalam menjalankan penelitian ini. 8. Nilam Fajarwati selaku kakak tingkat yang membantu saya dalam penelitian ini. 9. Bimo Dwi Pramesta, Muhammad Fahreza Kautsar, Dimas Bagus Pamungkas, Andhika Pangestu, Muhammad Arif Rahman, Nurul Khafidz, dan Lintang Suryaning Bumi selaku teman satu kontrakan GPL F45 yang selalu mendukung, membantu dan menyemangati saya dalam melakukan penelitian ini. 10. Muflikha Mayazi, Rahman Mukti Aji, Nurrohimah Fuad, Nurhabiba Edriana, dan Faizal Rachman selaku kelompok riset yang selalu memberikan semangat dalam menyelesaikan penelitian ini. 11. Nadisha Refira, Tiara Putri Methas, Ulfa Rosliana Putri, Aditya Bagus Wicaksono, Niken Nurul Paramesti, yang selalu menyemangati dan mambantu saya dalam melakukan penelitian ini. 12. Teman – teman SCORP CIMSA UIN. 13. Seluruh mahasiswa PSPD 2011 serta teman – teman yang tidak bisa saya sebutkan namanya satu persatu Saya menyadari laporan penelitian ini masih jauh dari sempurna. Maka, penulis menerima adanya kritik dan saran yang berguna untuk penelitian ini. Demikian laporan penelitian ini saya tulis, semoga bermanfaat bagi masyarakat dan para pembaca pada umumnya. Ciputat,
September 2014
Penulis
vi
ABSTRAK Hanindyo Riezky. Program Studi Pendidikan Dokter. Uji aktivitas antioksidan ekstrak biji kopi robusta (Coffea canephora) dengan metode DPPH. Radikal bebas adalah molekul yang dapat menyebabkan berbagai kerusakan molekular pada tubuh, sehingga dapat menimbulkan berbagai macam penyakit. Oleh karena itu banyak dilakukan penelitian mengenai radikal bebas dan antioksidan. Biji kopi robusta (Coffea canephora) diduga memiliki aktivitas antioksidan yang kuat sehingga mampu meredam aktivitas radikal bebas pada tubuh. Tujuan penelitian ini adalah untuk mengetahui aktivitas antioksidan dari ekstrak biji kopi robusta dengan metode DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl). Cara maserasi dengan pelarut etanol dan air digunakan untuk membuat ekstrak. Konsentrasi yang digunakan pada uji aktivitas antioksidan ekstrak biji kopi robusta dimulai dari 50 ppm, 100 ppm, dan 200 ppm. Ekstrak biji kopi robusta dicampurkan dengan DPPH. Vitamin C dipilih sebagai kontrol positif. Spektrofotometer digunakan untuk pengukuran absorbansi dengan panjang gelombang 516 nm. Hasil penelitian ini menunjukan perubahan warna secara kualitatif pada ekstrak biji kopi dan vitamin C. Nilai IC 50 ekstrak biji kopi robusta senilai 140,24 ppm dan termasuk aktivitas antioksidan sedang berdasarkan klasifikasi Blois. Kata Kunci : antioksidan, ekstrak biji kopi robusta (Coffea canephora), DPPH ABSTRACT Hanindyo Riezky. Medical Student Study Program. Antioxidant Activity Assay of Robusta Coffee Beans (Coffea canephora)Extract by DPPH Method. Free radicals can cause molecular damage to the body. The damage would cause various disease, so that many recent studies focused on antioxidant. Robusta coffee beans (Coffea canephora) is thought to have strong antioxidant activity that can reduce free radical activity in the body. The aim of this study is to know the antioxidant activity of extracts of Robusta coffee beans with DPPH (1,1-diphenyl2-picrylhydrazyl). The extract was made by maceration with ethanol and water. The concentration used in the test of antioxdant activity of robusta coffee beans extract is strarting from 50 ppm, 100 ppm, 150 ppm, 200 ppm. Robusta coffee beans extract was added with DPPH. Spectrophotometer UV – Vis used to measure in maximum wave length 516 nm. Result of this study show color changed qualitatively both on coffee and vitamin C. IC 50 value of robusta coffee beans is 140,24 ppm and classified as medium antioxidant according to Blois classification. Keywords : Antioxidant, Coffee Robusta Beans (Coffea canephora) Extract, DPPH
vii
DAFTAR ISI
Halaman LEMBAR JUDUL...................................................................................................i LEMBAR PERNYATAAN KEASLIAN KARYA ................................................ ii LEMBAR PERSETUJUAN PEMBIMBING ........................................................ iii LEMBAR PENGESAHAN ................................................................................... iv KATA PENGANTAR ............................................................................................ v ABSTRAK ............................................................................................................ vii ABSTRACT .......................................................................................................... vii DAFTAR ISI ........................................................................................................ viii DAFTAR TABEL .................................................................................................. xi DAFTAR GAMBAR ............................................................................................ xii BAB 1...................................................................................................................... 1 PENDAHULUAN................................................................................................... 1 1.1.
Latar Belakang.......................................................................................... 1
1.2.
Rumusan Masalah .................................................................................... 2
1.3.
Tujuan Penelitian ...................................................................................... 3
1.3.1.
Tujuan Umum ................................................................................... 3
1.3.2.
Tujuan khusus ................................................................................... 3
1.4.
Manfaat penelitian .................................................................................... 3
1.4.1.
Untuk Institusi ................................................................................... 3
1.4.2.
Untuk Mahasiswa .............................................................................. 3
1.4.3.
Untuk Masyarakat ............................................................................. 3
BAB 2...................................................................................................................... 4 TINJAUAN PUSTAKA.......................................................................................... 4 2.1.
Kopi .......................................................................................................... 4
2.2.
Simplisia ................................................................................................... 6
2.3.
Ekstrak dan Ekstraksi ............................................................................... 6
2.3.1.
Ekstrak............................................................................................... 6
2.3.2.
Ekstraksi ............................................................................................ 6
viii
2.4.
Antioksidan............................................................................................... 7
2.4.1.
Vitamin C .......................................................................................... 8
2.5.
Radikal Bebas ........................................................................................... 9
2.6.
Uji Aktivitas Antioksidan ....................................................................... 11
2.6.1.
Metode DPPH ................................................................................. 11
2.6.2.
Metode ABTS ................................................................................. 12
2.6.3.
Metode Deoksiribosa ...................................................................... 12
2.7.
Spektrofotometer UV – VIS ................................................................... 12
2.8.
Kerangka Teori ....................................................................................... 13
2.9.
Kerangka Konsep ................................................................................... 14
2.10.
Definisi Operasional ........................................................................... 15
BAB 3.................................................................................................................... 16 METODE PENELITIAN ...................................................................................... 16 3.1.
Desain Penelitian .................................................................................... 16
3.2.
Waktu dan Tempat penelitian ................................................................. 16
3.3.
Sampel .................................................................................................... 16
3.4.
Alat dan Bahan Penelitian ...................................................................... 16
3.4.1.
Alat Penelitian ................................................................................. 16
3.4.2.
Bahan Penelitian.............................................................................. 16
3.5.
Cara Kerja Penelitian.............................................................................. 17
3.5.1.
Penyiapan Sampel ........................................................................... 17
3.5.2.
Pembuatan ekstrak biji kopi ............................................................ 17
3.5.3.
Pembuatan Larutan.......................................................................... 17
3.6.
Pengukuran Absorbansi .......................................................................... 18
3.7.
Manajemen Analis Data Antioksidan ..................................................... 19
BAB 4.................................................................................................................... 20 HASIL DAN PEMBAHASAN ............................................................................. 20 4.1.
Hasil Ekstraksi Biji Kopi Robusta .......................................................... 20
4.2.
Absorbansi dan Persen Penghambatan ................................................... 20
4.3.
Penetapan Nilai IC50 ............................................................................... 23
BAB 5.................................................................................................................... 26 SIMPULAN DAN SARAN .................................................................................. 26
ix
5.1.
Simpulan ................................................................................................. 26
5.2.
Saran ....................................................................................................... 26
DAFTAR PUSTAKA ........................................................................................... 27 LAMPIRAN .......................................................................................................... 30
x
DAFTAR TABEL Halaman Tabel 3.1
Pembuatan larutan seri ekstrak biji kopi ................................. 18
Tabel 3.2
Pembuatan larutan seri vitamin C ........................................... 18
Tabel 3.3
Klasifikasi aktivitas antioksidan .............................................. 19
Tabel 4.1
Nilai absorbansi dan % penghambatan ekstrak biji kopi robusta ...................................................................................... 22
Tabel 4.2
Nilai absorbansi dan % penghambatan vitamin C ................... 22
Tabel 4.3
Nilai IC50 .................................................................................. 24
xi
DAFTAR GAMBAR Halaman Gambar 2.1
Tanaman kopi robusta .............................................................. 4
Gambar 2.2
Biji kopi robusta ....................................................................... 4
Gambar 2.3
Tanaman kopi arabika .............................................................. 5
Gambar 2.4
Biji kopi arabika ....................................................................... 5
Gambar 2.5
Radikal DPPH dan bentuk stabilnya ........................................ 11
Gambar 4.1
Larutan seri ekstrak konsentrasi 50 ppm, 100 ppm, 150 ppm, 200 ppm ..................................... 20
Gambar 4.2
Larutan seri vitamin C 1 ppm, 2 ppm, 3 ppm, 4 ppm .............. 21
Gambar 4.3
Persamaan regresi linear ekstrak biji kopi robusta ................... 23
Gambar 4.4
Persamaan regresi linear vitamin C.......................................... 23
Gambar 6.1
Hasil determinasi ...................................................................... 30
Gambar 6.2
Larutan hasil maserasi .............................................................. 31
Gambar 6.3
Proses evaporasi ....................................................................... 31
Gambar 6.4
Ekstrak biji kopi robusta .......................................................... 31
Gambar 6.5
Penimbangan ekstrak................................................................ 31
xii
BAB 1 PENDAHULUAN 1.1.Latar Belakang Kopi merupakan tanaman yang banyak ditemukan pada beberapa negara di belahan dunia dan telah dikonsumsi sebagai minuman. Negara maju dan negara berkembang, tidak ingin ketinggalan untuk mengkonsumsi kopi. Kopi yang paling sering beredar dipasaran berasal dari biji kopi robusta (Coffea canephora) dan biji kopi arabika (Coffea arabica).1 Kopi robusta memliki ketahanan yang lebih tinggi dibanding kopi arabika. Kopi robusta lebih tahan terhadap hama dan penyakit dibandingkan kopi arabika. Selain itu kopi robusta dapat tumbuh di iklim apapun, tidak seperti kopi arabika yang sangat tergantung iklim dan cuaca. 2 Begitu banyak orang yang mengkonsumsi kopi tetapi juga tidak sedikit orang yang menghindari kopi karena hanya mengetahui efek negatif kopi. Beberapa laporan
penelitian menyebutkan efek negatif dari kopi tersebut namun pada
penelitian lainnya menunjukan bahwa kopi memiliki efek yang cukup baik bagi kesehatan. Kopi diteliti memiliki efek antimikroba seperti mengambat pertumbuhan bakteri Escherchia coli.3 Kandungan kafein dalam kopi diduga berperan dalam sistem saraf simpatik dan berperan dalam peningkatan tekanan darah dan terjadinya hipertensi pada beberapa orang. 4 Penelitian epidemiologis sebelumnya menyebutkan bahwa kopi memiliki beberapa manfaat untuk kesehatan yaitu dapat mencegah penyakit kronik.5 Salah satu zat dari kopi yang bermanfaat bagi kesehatan yaitu kandungan antioksidan kopi yang cukup tinggi. 6 Antioksidan merupakan pertahanan pertama tubuh kita terhadap kerusakan sel yang disebabkan oleh radikal bebas dan sangat penting untuk menjaga kesehatan tubuh agar optimum. Antioksidan mampu menginaktivasi atau menstabilisasi radikal bebas sebelum radikal bebas menyerang sel. Antioksidan sangat penting dalam menjaga sel dan kesehatan sistemik. Secara keseluruhan radikal bebas terlibat dalam patogenesis kebanyakan penyakit, namun pembentukan radikal bebas (dalam tubuh kita) dapat dikontrol oleh antioksidan dalam tubuh kita. Ketika kadar antioksidan dalam tubuh kita tidak terlalu banyak kerusakan yang
1
2
ditimbulkan oleh radikal bebas dapat berakumulasi dan menimbulkan dampak yang cukup serius terhadap kesehatan. Antioksidan dapat ditemukan dalam berbagai zat seperti vitamin C, vitamin E atau beberapa sumber makanan contohnya kopi.7 Beberapa penelitian menyebutkan kopi memiliki kandungan polifenol yang tinggi yang memainkan peran penting dalam kandungan antioksidan pada kopi. Zat seperti polifenol dan juga melanoid pada kopi ternyata memilik efek antioksidan yang tinggi. Zat polifenol tersebut terkandung dalam kopi seperti pada biji kopi robusta dan biji kopi arabika.8
Polifenol diteliti memiliki efek
antioksdian yang baik untuk kesehatan yaitu sebagai pencegahan terhadap penyakit kardiovaskular, kanker, dan osteoporosis serta diduga berperan dalam pencegahan penyakit neuro degeneratif dan diabetes mellitus. 6 Kandungan polifenol pada kopi juga diteliti berbeda beda bergantung pada wilayah dimana kopi ditanam. Kandungan asam klorogenik pada kopi yang berasal dari Meksiko dan India lebih tinggi dibanding yang terdapat di Cina.9 Berdasarkan uraian di atas telah jelas bahwa kopi selain memiliki beberapa efek negatif terhadap kesehatan akibat kandungan kafeinnya, ternyata kopi juga memiliki efek yang baik terhadap kesahatan terutama karena kandungan antioksidannya.6 Beberapa penelitian diluar negeri menyatakan bahwa biji kopi memiliki kandungan antioksidan didalamnya, namun di Indonesia belum ada penelitian yang menjelaskan mengenai kandungan antioksidan pada kopi robusta yang ditanam di indonesia. Oleh karena itu penulis ingin membuktikan apakah biji kopi robusta memiliki kandungan antioksidan atau tidak.
1.2.Rumusan Masalah Apakah biji kopi robusta memiliki kandungan antioksidan ?
3
1.3.Tujuan Penelitian 1.3.1. Tujuan Umum
Untuk mengetahui kadar antioksidan pada ekstrak biji kopi robusta dengan metode DPPH dengan berbagai konsentrasi larutan uji
1.3.2. Tujuan khusus
Untuk mengetahui apakah kopi robusta tergolong menjadi antioksidan kuat, sedang atau lemah.
1.4.Manfaat penelitian 1.4.1. Untuk Institusi
Memberi informasi mengenai kandungan antioksidan biji kopi robusta sehingga dapat bermanfaat untuk penelitian selanjutnya
1.4.2. Untuk Mahasiswa
Untuk meningkatkan kemampuan penggunaan alat didalam laboratorium
Menambah pengetahuan peneliti mengenai kandungan antioksidan pada kopi
1.4.3. Untuk Masyarakat
Memberikan informasi kepada masyarakat bahwa kopi mengandung antioksidan
Mengetahui kandungan antioksidan kopi robusta yang biasa dikonsumsi masyarakat
5
6
2.2.
Simplisia
Simplisia terbagi menjadi 2 yaitu simplisia hewani dan simplisia nabati. Simplisia merupakan bahan dari alam baik dari tumbuhan ataupun hewan yang mengandung bahan aktif yang belum mengalami pemrosesan sama sekali kecuali dikeringkan.11 2.3. Ekstrak dan Ekstraksi 2.3.1. Ekstrak Ekstrak merupakan sediaan pekat yang berasal dari simplisia. Simplisia mengandung senyawa aktif dan pelarut yang diuapkan hingga tersisa senyawa yang dibutuhkan. Simplisia dapat berasal dari simplisia hewani dan simplisia nabati.11 2.3.2. Ekstraksi Ekstraksi merupakan pemisahan bagian bagian tanaman atau bahan bahan lain dari bagian inaktif dengan menggunakan pelarut selektif sesuai dengan prosedurnya. Ekstraksi dapat berupa dari solid menjadi liquid, liquid menjadi liquid dan juga ekstraksi asam basa. Pelarut yang biasanya digunakan dapat berupa metanol, etanol, dll.11 Beberapa metode uang biasa digunakan untuk ekstraksi adalah
Maserasi Maserasi merupakan teknik perendaman dimana zat yang sudah diperhalus (dalam partikel yang lebih kecil) direndam menggunakan pelarut seperti metanol dengan beberapa kali diaduk atau dikocok pada suhu ruangan, dengan metode ini tidak semua bahan aktif terekstraksi.11
Perkolasi Prosedur ini paling sering digunakan untuk bahan ekstrak yang berupa cairan. Dengan metode ini bahan yang ingin diekstraksi direndam dalam pelarut hingga seluruh bahan aktifnya tertarik. Salah satu ciri khas dari
7
metode ini adalah pelarut yang digunakan selalu baru. Metode ini biasanya dilakukan pada suhu kamar.11
Infusi Dilakukan dengan cara memaserasi material menggunakan air dingin atau air panas dalam waktu yang singkat.11
Digesti Bentuk dari maserasi dengan pemanasan selama proses ekstraksi.11
Dekoktasi Metode ini menggunakan cara perebusan material menggunakan air pada volume tertentu dan waktu yang telah ditetapkan selanjutnya didinginkan dan disaring.11
2.4.
Antioksidan Antioksidan merupakan senyawa dalam tubuh kita yang berperan sebagai
pertahanan pertama tubuh terhadap radikal bebas, dan sangat penting untuk menjaga kondisi optimum dalam tubuh kita. Kebutuhan terhadap antioksidan menjadi sangat penting seiring dengan meningkatnya kadar radikal bebas oleh karena rokok, polusi, stres dll.7 Radikal bebas mampu menyerang sel pada tubuh, menyebabkan sel - sel tersebut kehilangan struktur dan fungsinya. Kerusakan sel akibat radikal bebas merupakan kontributor yang cukup besar terhadap penuaan dan atau penyakit degeneratif seperti penyakit kardiovaskular, katarak, penurunan sistem imun dan kanker. Untungnya pembentukan radikal bebas dalam tubuh kita dikontrol oleh antioksidan. Antioksidan mampu untuk menstabilkan atau menginaktivasi radikal bebas sebelum radikal bebas menyerang sel. Beberapa contoh antioksidan alami adalah vitamin E (tokoferol) yang larut dalam lemak serta vitamin C yang larut air.12
8
Antioksidan secara umum terbagi menjadi dua : 1. Antioksidan enzimatis Contohnya superoksida dismutase, katalase dan glutation peroksidase.
Superoksida dismutase berkerja dengan cara mengkonversi anion superoksida menjadi hidrogen peroksida dan O2, sering juga disebut pertahanan primer terhadap stress oksidatif karena superoksida adalah inisiator kuat reaksi berantai.
Hidrogen peroksida sekali terbentuk harus direduksi menjadi air untuk mencegah terbentuknya radikal hidroksil. Salah satu enzim yang mampu mengurangi pembentukan hidrogen peroksida adalah katalase.
Glutation merupakan salah satu zat yang berperan penting dalam perlindungan akibat kerusakan oksidatif. 12
2. Antioksidan Non Enzimatis
Antioksidan non enzimatis merubah radikal bebas menjadi bentuk yang non radikal dan tidak toksik melalui cara non enzimatik, antioksidan non enzimatik menetralkan radikal bebas dengan menyumbangkan satu atom hidrogen kepada radikal bebas tersebut sehingga mengurangi radikal bebas dan mereka ikut teroksidasi bersama reaksi. Antioksidan non enzimatis dapat diperoleh secara endogen maupun dalam asupan makanan sehari hari. Asupan makanan sehari hari seperti vitamin E, vitamin C, karotenoid, dan flavonoid dan endogen berupa urat dan melatonin.12
2.4.1. Vitamin C Meskipun vitamin C atau asam askorbat merupakan koenzim oksidasi – reduksi yang berfungsi dalam sintesis kolagen dan reaksi lainnya, vitamin C juga berperan dalam pertahanan terhadap radikal bebas. Pengurangan askorbat dapat meregenerasi bentuk tereduksi dari vitamin E melalui donasi elektron pada reaksi redoks. Vitamin C merupakan zat larut air dan bersirkulasi tanpa terikat pada darah dan cairan ekstraseluler, dan memiliki akses ke vitamin E melalui membran dan partikel lipoprotein.12,
9
2.5.
Radikal Bebas Radikal bebas didefinisikan sebagai suatu molekul yang mengandung satu
atau lebih elektron yang tidak berpasangan yang menempati molekul orbitalnya sendiri.13 Radikal bebas dan ROS lainnya merupakan derivat dari proses esensial metabolit normal pada tubuh manusia atau dari eksternal seperi paparan sinar X, ozon, merokok, polusi udara, dan zat kimia industri.7 Pembentukan radikal bebas pada sel terus menerus terjadi sebagai konsekuensi kedua reaksi enzimatik ataupun non enzimatik. Reaksi enzimatik yang menyebabkan sumber terbentuknya radikal bebas mencakup reaksi respiratori, fagositosis, sintesis prostaglandin dan sistem sitokrom P450. Radikal bebas juga dapat terbentuk melalui reaksi non - enzimatik oksigen dengan komponen organik.13 Beberapa sumber radikal bebas internal:
Fagosit
Xantin oksidase
Reaksi yang melibatkan besi dan metal lainnya
Jalur arakidonat
Peroksisom
Inflamasi
Iskemik
Beberapa sumber radikal bebas eksternal
Merokok
Polusi lingkungan
Radiasi
Sinar UV
Beberapa obat, pestisida dan anestesi
Ozon
10
Beberapa contoh pembentukan radikal bebas
Pembentukan radikal bebas enzimatik xantinoksdase
urat + O2- + 2H+
Xanthine + O2 + H2O NADPH + 2O2
NADPH oksidase
NADP+ + 2O2- +H+
Pembentukan radikal bebas non enzimatik Fe2+ + H2O2 Fe3+ + OH- + OH Fe2+ + O2 Fe3+ + O2Radikal bebas dapat menyebabkan berbagai kerusakan molekular pada
tubuh seperti pada lemak, protein, karbohidrat dan DNA. 14 Penyakit yang dapat ditimbulkan pun dapat bermacam macam seperti :
Penyakit kardiovaskular Penyakit kardiovaskular dapat disebabkan oleh karena kerusakan pada endotel, yang dapat menyebabkan terjadinya hipertensi. 14
Penyakit Neurodegeneratif Jaringan saraf termasuk otak sangat rentan terpapar oleh radikal bebas, diakibatkan karena tingginya kadar asam lemak tak jenuh.14
Keganasan DNA merupakan target utama dari radikal bebas. Kerusakan ini dapat menyebabkan terjadinya mutasi pada DNA tersebut sehingga memicu keganasan pada sel somatik.
Radikal bebas tidak hanya memberikan efek negatif pada tubuh, jumlah sedikit dari radikal bebas dalam tubuh dapat berfungsi sebagai : 1. Fosforilasi oksidatif 2. Apoptosis sel 3. Membunuh mikroorganisme.14
11
12
Keuntungan metode ini adalah DPPH dapat direaksikan dengan bahan apapun dan dapat mendeteksi kadar antioksidan yang lemah sedikitpun. Konsentrasi awal DPPH yang diberikan harus memberikan hasil kurang dari 1 (50 - 100 μM). Molekul DPPH mudah terdegradasi sehingga harus dikerjakan dengan cepat dan hati – hati. 15 2.6.2. Metode ABTS ABTS
atau
2,2’-azinobis
(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic
acid)
merupakan metode lain yang dapat digunakan untuk mengukur kadar antioksidan. ABTS dan pottasium persulfat akan dicampur diruang gelap dengan temperatur ruangan selama 16 jam sebelum digunakan, nantinya akan menghasilkan radikal ABTS. Nantinya zat yang akan diuji direaksikan dengan radikal ABTS dan hasilnya akan diukur menggunakan spektrofotometer dan dibaca setelah 6 menit. 17 2.6.3. Metode Deoksiribosa Deoksiribosa akan teroksidasi ketika terpapar radikal hidroksil yang dihasilkan oleh reagen fenton. Hasilnya dapat dideteksi dengan pemanasan menggunakan 2 - thiobarbituric acid (TBA) dalam kondisi asam agar muncul warna merah muda chromogen dan absorbansinya diukur pada panjang gelombang 532 nm.18 2.7.
Spektrofotometer UV – VIS Spektrofotometer UV – Vis merupakan alat analisa kuantitatif dan
semikualitatif yang sering digunakan. Bekerja dengan transisi molekul elektron dari cahaya yang diserap pada ultraviolet dan pada sinar yang tampak pada spektrum elektromagnetik. Panjang gelombang yang diukur menggunakan spektorfotometer diukur dalam satuan nanometer (nm). Pengukuran absorbansi oleh spektrofotometer berdasarkan hukum Lambert – Beer dimana absorbansi tergantung oleh cahaya yang melewati substansi, produk koefisien absorbansi dari substansi dan juga jarak cahaya melalui material.19
13
2.8.
Kerangka Teori Antioksidan
Enzimatis
Non enzimatis
Endogen
Eksogen
Ekstrak Biji Kopi
Kandungan melanoid dan polifenol Bersifat antioksidan
Metode ABTS
Metode DPPH
Metode Deoksiribosa
DPPH
Terdapat elektron bebas DPPH+ + antioksidan DPPH2
Aktivitas antioksidan semakin banyak terhadap DPPH
Perubahan warna dari violet menjadi kuning
14
2.9.
Kerangka Konsep
Ekstrak Biji kopi
mengandung antioksidan
Metode DPPH
Spektrofotometer
analisis
15
2.10.
Definisi Operasional
NO
Variabel
Definisi
Cara Ukur
Alat Ukur
Skala Ukur
Hasil ukur
1
Konsentr
Konsentrasi
Rumus
-
numerik
50 ppm
asi
larutan
V1 x M1=
100 ppm
ekstrak
diuji dalam ppm
V2 x M2
150 ppm
yang
biji kopi 2
200 ppm
Absorba
Nilai absorbansi
Diukur
nsi
tiap sampel
mengguna
sampel
spektrofotometer
numerik
Nm
-
Kategorik
Klasifikasi
ordinal
Blois:
kan spektrofoto meter
3
IC50
Kemampuan
Mengguna
substrat
atau
kan
ekstrak
untuk
persamaan
IC50 < 50
menghambat
regresi
μg/ml
reaksi
linier
sangat kuat
atau
biologi biokimia
sebesar 50%
=
IC50 50-100 μg/ml = kuat IC50
101-
150 μg/ml= sedang IC50 151-200 μg/ml
=
lemah IC50> 200 μg/ml = tidak aktif
BAB 3 METODE PENELITIAN
3.1. Desain Penelitian Penelitian ini merupakan penelitian observasional untuk mengetahui kadar antioksidan biji kopi dengan menggunakan metode DPPH.
3.2. Waktu dan Tempat penelitian Penelitian di laksanakan di Laboratorium Biologi Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan Uin Syarif Hidayatullah Jakarta. Penelitian dimulai dari bulan Januari hingga Agustus 2014.
3.3. Sampel Biji kopi robusta ini dideterminasi oleh Pusat Penelitian Biologi Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia (LIPI) Bogor. Determinasi dilakukan untuk menentukan apakah spesies yang digunakan sesuai dengan bahan yang dibutuhkan dalam penelitian ini. Hasil determinasi menunjukan bahwa sampel yang diuji benar yaitu biji kopi robusta. Biji kopi robusta kemudian dibuat larutan ekstraknya dalam berbagai konsentrasi.
3.4. Alat dan Bahan Penelitian 3.4.1. Alat Penelitian Timbangan analitik; tabung reaksi; tabung Erlenmeyer; cawan; gelas ukur; labu ukur 10 ml; kaca arloji; batang pengaduk; botol gelap; gelas beaker; mikropipet; tip; alumunium foil; kuvet; spektrofotometer UV-Vis Hitachi 2,2 solution 17; kertas saring; evaporator; shaker waterbath; termometer; dan hotplate with magnetic stirer.20
3.4.2. Bahan Penelitian Biji kopi robusta, etanol, metanol, DPPH, vitamin C, dan air aquades
16
17
3.5. Cara Kerja Penelitian 3.5.1. Penyiapan Sampel Biji kopi robusta yang didapatkan di pasar dan sudah dideterminasi untuk selanjutnya disiapkan untuk diekstraksi.
3.5.2. Pembuatan ekstrak biji kopi Pembuatan ekstrak biji kopi dilakukan oleh peneliti di laboratorium biologi. Biji kopi pertama digiling lalu disimpan dalam lemari pendingin sampai dilakukannya analisis. Sampel kopi selanjutnya diekstrak dengan menggunakan pelarut etanol dan juga air, rasio perbadingan antara etanol dan air adalah 600 ml : 400 ml. Kopi sebanyak 20 gram dilarutkan dengan 1 liter (L) etanol dan air, dengan perbandingan yang telah disebutkan diatas, setelah itu larutan dihomogenkan menggunakan hot plate with magnetic stirer selama 3 jam dengan suhu 60° C setelahnya lakukan penyaringan dengan kertas saring. Setelah disaring lakukan evaporasi menggunakan evaporator.20
3.5.3. Pembuatan Larutan a) Pembuatan Larutan DPPH
Timbang 0,0007 gram DPPH
Larutkan dalam metanol sebanyak 14 ml
Kocok larutan hingga homogen lalu masukan ke dalam botol gelap
Ukur
absorbansi
dengan
menggunakan
spektrofomotometer
mendapatkan panjang gelombang maksimum. 20
b) Pembuatan Larutan kontrol negatif
2500 μl metanol dicampur dengan 500 μl larutan DPPH
Kocok larutan hingga homogen.
agar
18
c) Pembuatan Larutan uji 1. Larutan Induk (1000 ppm) 10 g ekstrak biji kopi dilarutkan kedalam 10 ml etanol = 1000 ppm 2. Larutan Seri Tabel 3.1 Pembuatan larutan seri ekstrak biji kopi Konsentrasi (ppm) 50 ppm 100 ppm 150 ppm 200 ppm
Larutan Induk Biji Kopi (μl) 600 μl 450 μl 300 μl 150 μl
Etanol (μl)
DPPH (μl)
1900 μl 2050 μl 2200 μl 2350 μl
500 μl 500 μl 500 μl 500 μl
a. Pembuatan Larutan Kontrol Positif Vitamin C (Nabavi sf 2011) 1.
Larutan Induk (100 ppm) 1 mg Vitamin C murni dilarutkan dalam 10 ml etanol
2
Larutan seri (2,4,6,8 ppm) Tabel 3.2 Pembuatan larutan seri vitamin C Konsentrasi (ppm) 2 ppm 4 ppm 6 ppm 8 ppm
Larutan Induk Biji Kopi (μl) 60 μl 120 μl 180 μl 240 μl
Etanol (μl)
DPPH (μl)
2440 μl 2380 μl 2320 μl 2260 μl
500 μl 500 μl 500 μl 500 μl
3.6. Pengukuran Absorbansi Seluruh larutan kontrol, larutan ekstrak biji kopi dan larutan standar positif (vitamin C) dikocok menggunakan shaker waterbath dan diinkubasi pada suhu 37oC selama 30 menit dalam keadaan gelap (ditutup alumunium foil). Hal ini dilakukan karena radikal DPPH mudah didegradasi oleh cahaya.2 Ketika DPPH bereaksi dengan komponen, terjadi perubahan warna dan akan terbaca pada spektrofotometer dengan panjang gelombang 516 nm. Selanjutnya ketika hasilnya sudah didapat dicari persen hambat masing masing larutan dengan menggunakan rumus16 :
19
x 100%
% penghambatan =
Setelah didapatkan % aktivitas hambatan dicari nilai IC 50 melalui persamaan regresi linier y = a + bx
3.7. Analis Data Antioksidan Data antioksidan pada radikal DPPH (% penghambatan) ekstrak biji kopi dianalisis dan dihitung nilai IC50 nya. Semakin kecil nilai IC50 maka aktivitas antioksidan semakin kuat. Penelitian ini menghitung dan menganalisis nilai IC50 dengan mengunakan persamaan
regresi linear.16 Data % hambatan dan
konsentrasi larutan digunakan untuk mencari nilai IC 50 dengan persamaan regresi linear y = a + bx, dimana y adalah % hambat (senilai 50) dan x adalah nilai IC50.21 Dibawah ini tabel mengenai klasifikasi aktivitas antioksidan menurut Blois: Tabel 3.3 Klasifikasi aktivitas antioksidan16,22: No.
Nilai IC50
1.
< 50 ppm
Sangat kuat
2.
50-100 ppm
Kuat
3.
100-150 ppm
Sedang
4.
151-200 ppm
Lemah
Antioksidan
21
22
Setelah dilihat secara kualitatif, seluruh larutan diukur absorbansinya menggunakan spektrofotometer dengan panjang gelombang 516 nm. Panjang gelombang 516 merupakan panjang gelombang maksimum dari DPPH, bertujuan untuk mendapatkan nilai absorbansi maksimum pada larutan yang akan diuji. Setelah didapatkan absorbansi dicari persentase penghambatan masing - masing konsentrasi. Tabel 4.1 Nilai absorbansi dan persentase penghambatan ekstrak biji kopi NO 1 2 3 4
Konsentrasi (ppm) 50 ppm 100 ppm 150 ppm 200 ppm
Rata – rata nilai absorbansi 0,294 0,198 0,152 0,0843
% Penghambatan 8,97 % 38,69 % 52,94 % 73,90/%
*Larutan kontrol = 0,323 nm Tabel 4.2 Nilai absorbansi dan persentase penghambatan vitamin C NO 1 2 3 4
Konsentrasi (ppm) 2 ppm 4 ppm 6 ppm 8 ppm
Rata – rata nilai absorbansi 0,1923 0,166 0,113 0,073
% Penghambatan 40,46% 48,60% 65,01% 77,39%
*Larutan kontrol = 0,323 nm Berdasarkan tabel 4.1 dan 4.2 menunjukan bahwa semakin besar konsentrasi semakin kecil absorbansinya karena semakin tinggi konsentrasi larutan maka aktivitas antioksidan semakin tinggi. Ditandai dengan warna larutan DPPH yang semakin pucat dan semakin besarnya nilai % penghambatan. Setelah mendapatkan hasil persentase penghambatan, dibuat grafik anatara konsentrasi larutan (x) dan % penghambatan (y), sehingga diapatkan persamaaan regresi linear. Grafik dibawah menunjukan persamaan regresi linear ekstrak biji kopi dan vitamin C.
23
% penghambatan
80
y = 0,4181x - 8,635 R² = 0,9804
60 40 20 0 0
50
100
150
200
250
konsentrasi (ppm)
Gambar 4.3 Persamaan regresi linear ekstrak biji kopi
% penghambatan
100 y = 6,36x + 26,065 R² = 0,9853
80 60
40 20 0
0
2
4
6
8
10
konsentrasi (ppm)
Gambar 4.4 Persamaan regresi linear vitamin C
4.3. Penetapan Nilai IC50 Nilai IC50 didapatkan melalui persamaan regresi linear dengan menggunakan microsoft excel agar didapatkan persamaan regresi linear. Nilai IC50 yang semakin kecil menunjukan aktivitas antioksidan yang lebih besar. 16
24
Setelah dilakukan perhitungan, nilai IC50 dari biji kopi robusta dan vitamin C didapatkan data sebagai berikut : Tabel 4.3 Nilai IC50 NO 1 2
Bahan Ekstrak Biji Kopi Robusta Vitamin C
Nilai IC50 140,24 ppm 3,76 ppm
Pada tabel 4.3 menunjukan biji kopi robusta memiliki nilai IC 50 sebesar 140,24 ppm. Berdasarkan klasifikasi Blois maka aktivitas antioksidan dari biji kopi robusta tergolong dalam kategori antioksidan sedang. Hasil ini berbeda dengan penelitian Antonio Zuoro dkk yang menjelaskan bahwa aktivitas antioksidan biji kopi robusta dengan pelarut etanol dan air didapatkan nilai EC 50 sebesar 0,86 – 7,53% dan tergolong ke dalam antioksidan sangat kuat. 20 Lama penyimpanan dari biji kopi robusta juga mempengaruhi kandungan antioksidan yang terkandung dalam biji kopi robusta. Kadar polifenol dalam kopi akan semakin tinggi pada kopi yang disimpan dalam waktu singkat dibandingkan kopi yang disimpan dalam waktu yang lama. 23 Biji kopi robusta memiliki kandungan antioksidan karena kandungan polifenolnya. Polifenol merupakan mikronutrien yang terdapat pada beberapa asupan makanan, dan flavonoid merupakan salah satu metabolit sekunder dari senyawa polifenol dan cenderung larut dalam pelarut polar.24,25 Polifenol bersifat antioksidan sehingga dapat meredam radikal bebas. 6 Tabel diatas juga menunjukan nilai IC50 dari vitamin C sebesar 3,76 ppm yang menunjukan bahwa vitamin C tergolong sebagai antioksidan yang sangat kuat. Miguel dkk dalam penelitiannya menjelaskan bahwa aktivitas antioksidan biji kopi arabika dengan metode ABTS dengan pelarut metanol dan air tergolong sebagai antioksidan kuat.26 Metode ABTS merupakan metode yang hampir mirip dengan metode DPPH. keduanya menggunakan radikal bebas, namun radikal ABTS harus dibuat dengan cara mencampurkan ABTS dengan kalium persulfat terlebih dahulu sebelum direaksikan dengan zat yang telah diekstraksi.17 Penelitian lain juga menyebutkan bahwa kadar antioksidan biji kopi robusta lebih tinggi dibandingkan biji kopi arabika. Namun ketika dilakukan
25
pemanggangan, kadar aktivitas antioksidan biji kopi arabika akan lebih tinggi dibandingkan dengan biji kopi robusta.27 Uji aktivitas antioksidan pada biji kopi arabika dan biji kopi robusta yang masih hijau dengan metode DPPH, menunjukan kadar antioksidan yang lebih tinggi dibandingkan dengan biji kopi arabika dan biji kopi robusta yang telah melalui proses pemanggangan.28
BAB 5 SIMPULAN DAN SARAN 5.1.Simpulan Berdasarkan hasil penelitian yang telah dilakukan, pada berbagai konsentrasi larutan uji ekstrak biji kopi robusta didapatkan aktivitas antioksidan dengan nilai IC50 sebesar 140,24 ppm dan tergolong sebagai antioksidan sedang
menurut
Kriteria Blois. 5.2.Saran 1. Perlu dilakukan penelitian untuk mengetahui senyawa apa pada biji kopi robusta yang bersifat antioksidan. 2. Perlu dilakukan penelitian lebih lanjut terhadap kandungan lain dari biji kopi robusta seperti kafein. 3. Perlu dilakukan penelitian lebih lanjut mengenai manfaat biji kopi robusta sebagai antibakterial. 4. Perlu dilakukan penelitian lebih lanjut apakah biji kopi robusta dapat dijadikan obat.
26
27
DAFTAR PUSTAKA 1. Wang, Kan. Agrobacterium protocols. Edisi 2. Totowa New Jersey : Humana press inc 2006 2. Farah, A., Donangelo, C. M. Phenolic compounds in coffee. Braz. J. Plant Physiol 2006; 18, 23–36. 3. Fardiaz, srikandi. Antimicrobial activity of coffee (Coffea robusta) extract. ASEAN Food Journal 1995 4. Robertson D, Frolich JC, Carr RK, et al. Effects of caffeine on plasma renin activity, catecholamines and blood pressure. N Engl J Med 1978 ; 298:181– 186 5. Jane V. Higdon, Balz frei. Coffee and health: A review of recent human research. Taylor and Francis Group, LLC 2006; 101–123. 6. Claudia Anesini, Graciela E. Ferraro , Rosana Fillip. Total polyphenol content and antioxidant capacity of commercially available tea (Camellia sinensis) in argentina. Jurnal of Agricurtural and Food Chemistry 2008; 9225 – 9229. 7. Percival, Marks. Clinical nutrition insight. Advanced Nutrition Publications, Inc 1996. 8. Camerrer bettina, Lothar W. Kroh. Antioxidant activity of coffee brews. Springer-Verlag. 2006; 496 – 474. 9. Mullen, W. Nemzer, B. Stalmach, A. Ali, S. Combet, E. Polyphenolic and hydroxycinnamate contents of whole coffee fruits from China, India, and Mexico. J. Agric. Food Chem 61 2013; 5298–5309 10. Aak. Budidaya tanaman kopi. Jogjakarta : Kanisius. 1988 11. Sukhdev Swami Handa, Suman Preet Singh Khanuja, Gennaro Longo, Dev Dutt Rakesh. Extraction technologies for medicinal and aromatic plants. International centre for science and high technology 2008 12. Marks. Marks' essential medical biochemistry, 2nd Edition. Lippincott Williams & Wilkins 2007 13. Yun Zhong et al. Free radicals, antioxidants, and nutrition. Elsevier Science Inc 2002;18:872–879
28
14. Devasagayam et al. Free radicals and antioxidants in human health: Current status and future prospects. Jounal of the Association of Physician of India; 2004 15. Kadare, Sagar B. Genesis and development of DPPH method of antioxidant assay. Journal of Food Science and Technology August 2011;48(4): 412–422. 16. Molyneux P. The use of the stable free radical diphenylpicrylydrazyl (DPPH) for estimating antioxidant activity. Jurnal Science Technology Mar-Apr 2004; 26(2): 212-8 17. Thaipong, Kriengsak et al. Comparison of ABTS, DPPH, FRAP, and ORAC assays for estimating antioxidant activity from guava fruit extracts. Journal of Food Composition and Analysis 19 2006; 669–675. 18. Cheng zhiyong, Yuanzong Li. Antioxidant activity of selected phenols estimated by ABTS and FRAP methods. Analytica Chimica Acta 2003; 129 – 137. 19. Rouessac
Francis,
Rouessac
Annick.
Chemical
analysis
modern
instrumentation methods and techniques second edition. John Willey and Sons France 2007 20. Antonio Zuorro, Lavecchia Roberto. Influence of extraction conditions on the recovery of phenolic antioxidants from spent coffee grounds. American Journal of Applied Sciences 10 2013; (5): 478-486, 21. Reddy LJ, Jalli RD, Jose B, Gopu S. Evaluation of antibacterial & antioxidant activities of the leaf essential oil & leaf extract of citrus aurantifolia. Asian Journal of Biochemical and Pharmaceutical Research May 2012;2:346-53 22. Blois, MS. Antioxidant determinations by the use of a stable free radical, nature. 1958;1199-200 23. Votavová, L. Changes of antioxidant capacity of robusta coffee during roasting. Prague : Journal Food Science 2009 24. Nabavi SF, Nabavi SN, Ebrahimzadeh MA, Asgarirad H. The antioxidant activity of wild medlar (Mespilus germanical) fruits, stem bark and leaf. African Journal of Biotechnology 10 January 2011;Vol.10(2): 283-9. 25. Claudine, Manach. Polyphenols : food sources and bioavailability. American Society for Clinical Nutrition. 2004
29
26. Arellano-González, Miguel Angel. Antioxidant activity of fermented and nonfermented coffee (Coffea arabica) pulp extracts. Mexico : Department of Biotechnology, Metropolitan Autonomous University. 2011 27. Yashin, Alexander, et al. Antioxidant and antiradical activity of coffee. Moscow. 2013. 28. Hernández, et al. Phenolic characterization, melanoidins, and antioxidant activity of some commercial coffees from Coffea arabica and Coffea canephora. Sociedad Química de México. 2012
30
31
32
Lampiran 3 Riwayat Penulis
IDENTITAS Nama
: Hanindyo Riezky Beksono
Jenis Kelamin
: Laki – Laki
Tempat, Tanggal Lahir
: Surabaya, 03 Maret 1994
Agama
: Islam
Alamat
: Kota Wisata Monaco W.1/36 RT01 RW15 Kab. Bogor
Email
:
[email protected]
RIWAYAT PENDIDIKAN 1997 – 1999
: TK Tadika Puri Surabaya
1999 – 2005
: SDN Kertajaya XII Surabaya
2005 – 2008
: SMPN 147 Cibubur Jakarta Timur
2008 – 2011
: SMAN 39 Cijantung Jakarta Timur
2011 – Sekarang
: Program Studi Pendidikan Dokter FKIK UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
