Vysokoúčinná kapalinová chromatografie Stacionární fáze/sorbenty
Příprava předmětu byla podpořena projektem OPPA č. CZ.2.17/3.1.00/33253
2.3. Sorbenty pro HPLC Historie - současnost: Plně porézní materiály (Totally porous beads) – silikagel, alumina ~ 20-40 µm: malá účinnost vzhledem k pomalému přenosu hmoty ve stagnantní mobilní fázi Pelikulární sorbenty (Pellicular packings, porous layer beads) – pevné neprostupné jádro ~ 20-40 µm – sklo, ocel, na povrchu porézní tenká vrstva – silikagel, alumina, měnič iontů apod.: nebotná, vyšší účinnost – snížený vliv přenosu hmoty ve stagnantní fázi, ale nízká kapacita sorbentu Mikroporézní sorbenty (Microparticular, microporous particles) – malé plně porézní sférické částice, silikagel, alumina ~3-10 µm, vysoká účinnost, snížení negativních vlivů stagnantní mobilní fáze a odporu proti přenosu hmoty v mobilní fázi, velký povrch ~100-500 m2g-1, velikost porů ~ 6-10 nm
Současné trendy ve vývoji sorbentů
Totally porous sub-2 µm particles
Superficially porous particles (Povrchově porézní částice)
5 µm, 0.25 um, 300 Å
suitable for separation of macromolecules
http://www.phenomenex.com
/
Hybridní sorbenty
XTerra™ Particle Technology O RSi(OR’)3
R Si
+ Si(OR’)4
O
O O
Si
SiO2(RSiO1.5)n O
O Unger et al J. Chromatogr. 125 (1976), 115 (“bulk modification”)
Perfusion sorbents (developed for the separation of macromolecules) F. Regnier, Nature, 350 (1991) 634 • Designed for Bio-applications, polymeric backbone • In "classical" chromatography, sample molecules are carried to binding sites on the particle surface by convective flow through the column. However, transport of sample molecules to binding surfaces inside the particle occurs by diffusion - a slow process, especially for large molecules such as proteins and peptides • For capacity and resolution to be maximized, interaction with as many of the binding sites as possible must take place. However, as flow rate past the particles increases, there is less time for molecules to diffuse the necessary distance to reach interior binding sites; resolution and capacity both suffer. As a result, conventional media has always required trade-offs between speed, resolution, and capacity • Diffusion into the stagnant mobile phase pools of the long internal pores is the rate-limiting factor with conventional media. This slow diffusion process leads to peak broadening and loss of capacity if flow rates are increased
• POROS Flow-through Particles Overcome Mass Transport Barriers • In contrast to conventional chromatography media, POROS Perfusion Chromatography particles are engineered to have two discreet classes of pores. Large "throughpores" allow convection flow to occur through the particles themselves quickly carrying sample molecules to short "diffusive" pores inside • POROS Perfusion Chromatography media is manufactured by inter-adhering microspheres into particle clusters. The process is carefully controlled to create throughpores of 6000-8000 Å and diffusive pores of 800-1500 Å. • By reducing the distance over which diffusion needs to occur, the time required for sample molecules to interact with interior binding sites is also reduced. Diffusion is no longer limiting and flow rates can be dramatically increased - without compromising resolution or capacity. Separations can be achieved at 1,000 to 5,000 cm/hr compared to 50 to 360 cm/hr for conventional media
Advantages of Perfusion Chromatography Technology: • Develop Better Separations Methods in a Shorter Time Frame • Improve Recovery of Biologically Active Product • Reduce Time-consuming Sample Prep You can replace many sample preparation steps with high speed Perfusion Chromatography technology. For instance, dialysis of large volumes of material can be replaced by high flow rate processing of the dilute sample. Elution in a small volume of new buffer accomplishes both buffer exchange and concentration. Similarly, ultrafiltration and other concentration techniques that can lead to product loss through extra handling can potentially be replaced. • Monitor Process-Scale in Real-Time
• Create Novel Assays for More Efficient Analysis Perfusion Chromatography technology is not limited to standard modes of separation. Both enzymes and affinity ligands can be immobilized on POROS media. By combining rapid on-column protein digestions with rapid on-column immunoassays and chromatographic separations, you can create entirely new assays with unlimited potential
PerSeptive Biosystems Inc.
Monolitická média
Historický úvod
Původ slova monolit
- µονολιτηοσ
Webster’s College Dictionary defines the noun monolith as (i) (ii) (iii)
a large block of stone, something, such a column, made from one large block, and something suggestive of a large block of stone.
the adjective monolithic is explained as (i) constituting a monolith, (ii) massive, solid, and uniform, and (iii) constituting or acting as a single, often rigid, uniform whole.
Nevýhody “klasických” makroporézních sorbentů -poměrně pomalá difúze (zejména makromolekulárních) analytů do stagnantní mobilní fáze => malá separační účinnost, nutnost pracovat při poměrně nízkých průtocích -velký intersticiální prostor mezi částicemi sorbentu
=> Možná řešení - částice malých rozměrů - pelikulární a neporézní částice - perfúzní částice -monolitické stacionární fáze – přirozený výsledek vývoje sorbentů
Hydrogely
Ústav makromolekulární chemie v Praze =>polymerní monolit na bázi HEMA-co-EDMA pro užití v SEC - snaha nahradit zesítěné polysacharidové sorbenty - poměrně velký tlakový spád a malá účinnost M.Kubín, P.Špaček, R.Chromeček; Coll. Czechosl. Chem. Commun. 32 (1967) 3881.
uvedený koncept byl úspěšně oživen o mnoho let později pro CEC: A.Vegvari, A.Foldesi, C.Hetenyi, O.Kocnegarova, M.G.Schmid, V.Kudirakaite, S.Hjertén; Electrophoresis, 21 (2000) 3116.
Novější vývoj 1. Stlačitelné monolity 2. Rigidní monolity (a) válcového tvaru (b) monolitické disky (c) monolitické trubice s radiálním tokem 3. Anorganické monolity
1. Stlačitelné monolity
Prof. Hjertén - University of Uppsala - experimenty s měkkými deformovatelnými částicemi sorbentů již v 60. tých letech =>podobné zkušenosti jako Kubín a spol., tj. nízká průtoková rychlost - koncem 80. tých let experimenty s částicemi neporézní agarózy, za vyšších průtoků došlo k deformaci částic, ale přitom byla průtoková rychlost dostatečná a separace se zlepšila S.Hjertén, Y.Konguan, J.L.Liao, Macromol. Chem. Macromol. Symp., 17 (1988) 349.
- kombinace výše uvedených znalostí a zkušeností s vysoce zesítěnými polyakrylamidovými gely => úplně nový koncept, publikace v roce 1989 chemická podstata stlačitelného monolitu: N,N’-methylenbisakrylamid a akrylová kyselina při separaci stlačení na ~17% původního objemu velmi pěkná separace bílkovin v iontově-výměnném uspořádání
1.alcohol dehydrogenase, 2.horse skeletal muscle myoglobin, 3.whale myoglobin, 4.ribonuclease A, 5.cytochrom c
3 x 0.6 cm, lineární gradient NaCl
S.Hjertén, J.L. Liao, R.Zhang, J. Chomatogr., 473 (1989) 273.
- následně další zdokonalení lože => komercializace monolitů tohoto typu UNO® BioRad Laboratories (Hercules, CA)
- další zdokonalení technologie pro potřeby aplikací v CEC (polovina 90. tých let) S.Hjertén, D.Eaker, K.Elenbring, C.Ericson, K.Kubo, J.L.Liao, C.M.Zeng, P.A.Linstrom, C.Lindh,A.Palm, T.Srichiayo, L.Valcheva, R.Zhang, Jpn. J. Electrophor., 39 (1995) 105.
Bio-Rad, Hercules, California, USA UNO Q and S Ion Exchange Columns
2. Rigidní polymerní monolity Válcového tvaru
- vývoj na Cornell University, počátek 90. tých let - poly(glycidyl-methakrylát-co-ethylen-dimetakrylát) - poly(styrene-co-divinylbenzene) - narozdíl od disků příprava přímo ve vhodné trubici/koloně - první monolit tohoto typu byl využit pro úspěšné dělení bílkovin v iontově-výměnném modu - monolity uvedeného druhu byly komercializovány firmou ISCO Inc., dnes součást DIONEX, s označením Swift®
F.Svec, J.M.J. Fréchet, Anal. Chem., 54 (1992) 820.
Příprava
rigidních monolitů na bázi organických polymerů
Polymerizační směs
Promývací roztok
1) Utěsnění
1) Připojení k čerpadlu
2) Teplota
2) Promytí
Forma
Termostatovaná lázeň
Čerpadlo
Typické vlastnosti monolitu
- příprava přímo v koloně - přítomnost mesopórů i makropórů, jejichž velikost je “laditelná” vhodnou volbou podmínek při přípravě - možnost velmi rychlých separací při relativně malém tlaku na koloně - vysoká chemická odolnost - poměrně vysoká tepelná odolnost - možnost přípravy stacionárních fází pro různé chromatografické mody cestou funkcionálních monomerů nebo modifikací reaktivních monolitů
Velmi rychlá separace polystyrenových standardů
A
B
A: Monolitická kolona 50x8 mm, poly(styren-co-divinylbenzen), B: Konvenční porézní sorbent na bázi poly(styren-co-divinylbenzenu), 50x8 mm, průtok 20ml/min, gradient THF v metanolu, (a) trvání gradientu 30s, (b) trvání gradientu 12s analyty: polystyren Mr 9200, 34000, 980000.
Rozpouštěcí/srážecí chromatografie PS standardů na monolitu versus SEC na klasickém sorbentu
Separace oligonukleotidů na monolitické koloně na bázi modifikovaného poly(glycidyl-methakrylátu-co-ethylen-dimethakrylátu)
a
kolona 50x8 mm, průtok 4 ml/min analyty: (a) pd(A)12-18, (b) pd(T)12-24, gradient NaCl
Speciální aplikace monolitu - on/off ventil - kontrolovaný průtok - speciální mód hydrofobně-interakční chromatografie
NIPAAm: N-isopropylacrylamide MBAAm: methylenebisacrylamide
Teplotou řízená hydrofobně-interakční chromatografie (HIC)
(1) Carbonic anhydrase, (2) soybean trypsin inhibitor Grafted monolith 10x10 mm, isocratic elution, flow 1ml/min E.C.Peters, F.Svec, J.M.J. Fréchet, Adv. Mater., 9 (1997) 630.
Monolitické disky
prof. Belenkii a spol., Ústav makromolekulární chemie, Sankt-Petěrburg studium gradientové separace bílkovin v 80. tých letech + Ústav makromolekulární chemie v Praze příprava tenkých polymerních vrstev na bázi glycidyl-methakrylátu-co-ethylen-dimethakrylátu =>spolupráce od r. 1987 => monolitické disky pro dělení proteinů Ale: při snaze o publikování velké problémy, nakonec publikace přijata až v roce 1990 (podobné zkušenosti i prof. Hjertén) T.B.Tennikova, F.Svec, B.G.Belenkii, J. Liquid Chromatogr., 13 (1990) 273.
•hned velký ohlas, více než 300 žádostí o reprint •potenciál monolitických disků byl paradoxně dříve rozpoznán průmyslovou sférou, •dnes výroba firmou BIA (Lublaň, Slovinsko), CIM® Disks
Monolitické trubice s radiálním tokem •snadná disipace tepla při přípravě •možná syntéza velkých monolitů s vysokou separační kapacitou A.Podgornik, M.Barut, A.Štancar, D.Josic, T.Koloini, Anal. Chem., 72 (2000) 5693.
A.Podgornik,, M.Barut, A.Štancar, Anal.Chem. 72 (2000) 5693.
3. Anorganické monolitické materiály •první silikagelový monolit byl připraven prof. Nakanashi a Soga, Kyoto University,1991 K.Nakanashi, N. Soga, J. Am. Ceram. Soc., 74 (1991) 2518.
•prof. Tanaka, Kyoto Institute of Chemistry •povrchová modifikace C18 •zatěsnění monolitu do teflonové trubice •radiální komprese •separace polypeptidů •velmi úspěšná komercializace, Chromolith®, Merck (Německo) N.Tanaka, N.Ishizuka, K.Hosoya, K.Kimata, H.Minakuchi, K.Nakanashi, N.Soga, Kuromatogurafi, 14 (1993) 50. H.Minakuchi, K.Nakanashi, N.Soga, N.Ishizuka, N.Tanaka, Anal. Chem., 68 (1996) 3498.
- příprava: tetramethoxisilan/tetraethoxysilan, hydrolytická polymerizace ve vodném roztoku kyseliny octové v přítomnosti PEG
- výhody: jen mesopóry a makropóry nastavitelných rozměrů
- nevýhody: objemová kontrakce, omezené rozměry, obtížné zatěsnění do pláště
UPLC/UHPLC M. Gilar
