kod; IZOLACE
k doplnění
materiátu
klinického
pathogenních
kyse1iny
desoxyribonukIeové
Tzo].ace
u lymeské
vyšetření
]-aboratorních
z
bore]-Íí
bore1iózy ústav
zdravotní
Státní (stav
k
Praha
NRL LB
Praha,
t7.LL.L997)
1.O.Úvod pathogenní
Všechny znesnadňuje
jejich
je
náročná
důvodu
i
průkazu
je
DNA
izolace
DNA a dostatečná
fj-kace"
Pomocí
k
metod
také
DNA borelií.
ních
tě1
izolace
s oh}edem
pathogenních DNA i
reakcj-
(pcn)
pro
v
obsahu
přítomnosti
přítomných
ve
V posledních materiálů.V pat.hogenních
vyzkoušet
bore1iové
přítonrnost
jiné
pěti
bylo
v mnoŽství i
buňkách
boreliových
DNA izolované
by1o
letech
borelií.
řetězovou
DNA.Cílem
DNA borelií
metody
různé
z ostatních
buněk
vzorcích.
vyŠetřovaných
19B případech
bakteriáI-
poJ-ymerázovou
úspěŠnou
DNA v cca
nadbytku
dvou
nutné
identifikaci
prokázat
reprodukovate}ně odpovídajícího
pro
podroínek
skladby
prokázat
].ze
organismů
zvláŠtnosti by1o
dnes
pouŽívaných
a dalších
borel1í
způsobu identi-
specifické
genetiky
na
materÍálu.
nejvhodnějŠího
volba následné
moleku]ární
izoface
vyŠetřovaném
ve
citlivost
virů,bakterií
identifikaci
pozitivnr
i
úspěŠná
přítornnost
identifikace.Na
upozornÍ
|-ét:oŽ
materiálu.Z
klinickém
v
druhová
;ejích
ku1tivovate]-né,což
obtíŽně
kyse1iny(DNA)
desoxyribonuk].eové Podmínkou
průkaz
přímý
bore1ií
pathogenních
jsou
borelie
se
podařiIo
Pozitivní
krve, z
ku1tivačního
media, z
hrudního,koleního
a rameního výpotku,
vyŠetřeno
přítomnost
prokázat izolace
k1inických
1807
Se
podařila
mozkomíšního
m}če, z tkání
DNA z
moku, z
mozku a kůŽe.
2Při
pathogenních Ixodes
ricinus.Vyšetřovaný
České
republiky,
gariniÍ
Borrelia
k druhu
afze]-ii
(24).Cíleně
nejsou
uvedeny
Tabulka K1inický
izo1áty
Slovenské
japonica
7 (aI%) genospeciés
6.)
ke genospeciés
z druhově
izolátů
k
a menŠí část
Mezi
Borrefia
určených
genospecl-és BorreLia vs776.
a
bylo
repub1iky.
a směsnou infekci
]-16)
neby1y hJ-edány
stricto,Borre]'ia
z uzemí
(tabulka
část
garinii(
Borre7ia
patři1a
sensu
větší
7ato,
původem především
by1o 58 přiřazeno
izolátů
sensu
k].íŠtat
cizinců
podezření afzelÍi.
a Borrelia
Z L9B pozítivních burgrorferi
je
DNA
a v homogenátu
z uzemí
Ze souboru
cizinců.
dvou z nich
pozitivních,u
byl
materíáI
sedm materiálů
V souboru by1o L7 .
domácího psa
v krvi
borellí
prokázat
podaří1o
se
vzorků
nehumánních
zpracování
uvedenými
Borre]-ia burgrdorferi výsledky
z klÍŠtat.
1. materiáL
vyšetřený
v roce
L996 na LB PCR
materiá1
počet celkem
počet vZ
pozitivní počet celku pozitivníchvZz
krev
586
7O,L
56
6 !7O
mok
278
26 tr
22
2 t62
2L
2,6
7
o,84
placenta
1
0,1
0
0
srdce
3
0,3
0
0
svalovina
1
0,1
0
0
synovíum
3
0,3
1
o,T2
3
0r3
2
o tzo
1
0r1
1
o t12
89
LO ,6e"
punktát
mozková moč
celkem
z kolena
tkáň
837
100,02
Tabulka
2. materiáI
Klinický
vyŠetřený
v roce
LB PCR
1997 na
nateriá1
počet celkem
počet vZ
pozitivní počet pozitÍvníchv8zceIku
krev
69r
7r t2
ó9
mozkomíŠnímok
224
23 tr
5
o,5
L9
2,0
Á
o,4
9,2
punktát
z kolena
punktát
z ramena
1 a
or1
I
0'1
punktát
hrudní
I
0'1
1
0'1
L7
1'8
0
0
Ó
0r8
Ó
0'8
5
0r5
1
ulr
1
0r1
U
0
serum kultivační
medium
moč tkáň
synovium
tkáň
- Iyrnf .uzlina
I
or1
0
0
tkáň
- kůŽe
a z
o,2
0
0
celkem
970
100,02
109
TT 129"
4.
3.
Tabulka
uvedené
N e j č a s t ě j Š í diagnozy LB V roce
PCR na
u zaslaného
vyŠetření
]-997
po
Diagnoza
pro
materiálu
ve
všech
vzorcích
69.2
549
M 01.2
čet v pozitivních
z
vzorcích
56 ,6
62
56,9
30
?1
11
10r1
A 87.9
ZY
3r0
2
1'8
A 84.9
L4
A 84.1
10
1r0
0
0ro
M 54.1
Ó
or8
O
0'0
A
jiných
0'0
130 dalŠích
3I ,2
34,O
910
celkem
1003
r09
100%
4.
Tabulka
j.zolované
Tdentifikace
DNA pod1e
pozítiv
rok Celkem
8e
I99
6/.
1_99
7/..rae
celkem p o z n . z/ : z/ :
198
genospecéS
izo
ní
Bor. af zel-ii
v
L996-I997
Ietech
1ace druh neurčen
Bor.garinii
počet
počet
9o
počet
%
ZL
23,6
10
rLt2
2,8
106
97 t'2
0
1-16
58,62
58
24
12,Lz
5B
9o 65 ,2
o
29,3""
I z o l a c e s e t y QIAGEN Izolace DNA Sety Boehringer Mannheim (553 vyšetření) Iýzou (4L] vyŠetření) a alkalickou
5. Tabulka
5.
Izolace
DNA pro
vyŠetření
pouŽité
metodiky
]-996-1997
PcR-LB
pod1e
celkem
krev
mok
8
5
2
L
o
o
metodapočetpozítivní přípravy
.
DNA
vyŠetření
punktát
moč
tkáň
Alka1ická Iyza )1
41'7
High Pure PCR TemPlate Kit Preparalion Boehrínger Mannheim (2)
553
101
93
3
5
o
0
QTAamP xit tissuá (3) Qiagen
837
89
56
22
7
3
1
1807
198
r54
27
13
3
1
celketn
6.
6.
Tabulka VyŠetření
cizinci
jméno zkratka
čísIo prot..
PCR-LB
L996_I997
územní lokalizace
měsíc rok
materiáI
výsledek PrimerY
pozitivní
1 .. T 2 | T 3 v ť I. .
USA
l,-96
mozek
Pc*,bb-, 99-,cc-,
2 .252
Německo
6-96
krev
bb- '
3.324
Italie
I -YO
krev
bb- '
4.374
Rusko
8-96
serum
bb-,
5.448
Asie
9-96
mok
!{K+,
+
6.453
Rusko
9-96
mok
bb+,
+
SLovensko
9-96
krev
WK+,
+
8.443-2
Slovensko
9-96
mok
!vK+-,
9 .443-3
Slovensko
2-96
krev
bb- '
LL.443-4
Slovensko
2-96
mok
bb- '
L2.2I
Slovensko
r-97
krev
BG-,VS-,
13 .44
Afrika
2-97
krev
BG+ , VS+ ,
L4 .69
Bulharsko
2-97
mok
BG-,VS-,
L5.70
Bulharsko
z-Y
I
krev
BG+ / VS+ ,
+
L6.Lze
Slovensko
3-97
krev
BG+, OSPA- ,
+
17 .L255
Slovensko
ro-91
krev
BG-,VS-
'7 l . a J J
A 'r'1 -1
všech
LT
celkem
T.n-
pozitivních
7 (4Lz)
po
Pátrání
7.
vyšetření
2.o Strategie
bore1ií
DNA
vyŠetření potvrzující,
by být
při
přítomnosti
masové vyšetření,'
první
pro
nevhodná
a
ínhibitorů
onemocnění.
Iinie''
značnou nároČnost,
kontaminace ' fa1eŠné negativity nutnosti
zavedení
dalšího
a
kontrol
opatření,
náročných
pathogeneze.
během
a tkáních
k prognoze
zvýšení moŽnosti
cenu ,
přítomnosti
můŽe přispět
je
diagnoz
suspektních
vysokou
jako
boreLiÍ
DNA
genospeciés
určení
ke sledování
vhodná
nálezů
kvantifikace
Případná Tzolace
je
ve výpotcích
agens
bakteriálního
jiných
nálezech
}ymeskou boreIiozu(LB).
vždy provést
třeba
borelie.Izolace
izolované
u
je
DNA
pro
být
souběŽným ku]-tivačním vyšetřením.
doplněno
Po identifikaci
po pozitivních
svědčících
mě1o
by
materiálu
kIinickén
následující
vyšetření
laboratorních MěIo
v
řady
zpracování
nezbytných, amplifikačního
produktu. Naprotí
je
tomu
případech
závaŽných
akutních
provést
případech
ojedinělých
který
materiálu,
z materiá1u,
Týká se to
zmraŽené krve,
smíchaného Lze
též
s
určení ďoby
vzniku
účinnosti
léčby atd.
NejvětŠí
naděje
fixovaných), speciáIních
onemocnění. vyŠetření je
k
Lze
úspěŠný průkaz
metod pro
a
izo1aci
v
v
iuéŽ v indikovaných
hemolytického,vyschIého,
í zahřátého na 10o c aj.
vyšetření
výpotcích
něko]"ika hodin
z extrémně malého mnoŽství
při
sporech
onemocnění z archivovaných
na
provést
případů
pro jiné vyŠetření nevhodný.
jiŽ
materiáIu
dalším materiálem
doporučit
DNA běhero
boreliové
identifikaci
specifickou
omezeném počtu
možné v
plné
o určení dj-agnoz, vzorků'
je v tkáních
DNA borelií krvi.Zďá
preparátů,
S€,
Že při
DNA a PCR bude nejčastějŠí
(j-
vyuŽití izolace
8.
jsou
z moče. Dosud Při
v jedné
obsahu
mnoŽství
tekutin.
těIních
sta.tě:
Sor'rkrrrr Izolace Výběrové Ideá1ní
DNA použít
jako
vyšetření
pro
pro
Lérn1z
boreiií
ambulantních
vzorku.
boreIie.
: ohledem na
s
materiálu
cirkulaci
pracoviŠt
V
materiáIem
cíIové DNA při
prostředí
vyšetřovaném materíáIu.
s
a
obsahuj ícím DNA borelií.
uchovávání
a koncentraci cílového
koncentrace
se]ektivníí
klinických
specializovaných
prostředí
části
d)NemoŽnost templátu
plazmu.
v organismu pacienta.
b)Kontaminace
c)ztráta
onemocnění.
1 buňku v 2oO mikrolitrech
prokáŽe
načasovaný odběr
a)Nevhodně
potvrzující.
nejzávaŽnější
genospecÍés
specificky
Prok>
vyšetření
rnýpotky a citrátovou
tkáně,
Extrémní citlivost, Urěí
je
i v objemu 200-1ooo mikrolitrů(uI)
buněk 1ze prokázat
bakteriá1ních
DNA' coŽ odpovídá
Toto mínimální
buňkách borelií.
až dvou
DNA
a ampJ-ifikace
izolace
15-6o fg boreIiové
přítomnost
moŽné prokázat
mozkomíšního moku.
DNA z
ízolací
doporučeného postupu
dodrŽení
DNA
problérny s
nadbztkem
DNA
z
vzorků. bore1iového
buněk přítomných
ve
3. O.Schéma vyšetření aseptický
3 . 1 . odbě]._lBalcliéLr-
plasma,
krev
pJ-ná
jsou
EDTA a heparin
je
antikoagulans
nejlepší
podmínek
PCR, Zd 1istých
inhibitory
citrát.
se obtíŽně odstraňují.
fyziologÍckérn
(formol
vané fixací
i
tkáň
ve
konzervo-
aj. )
cca
Alternativně
konzervace
75oo rpm) .
( 1o ninut
2 ml materiálu
centrifugací
okamŽÍtákoncentrace
laboratoři.
v
vzorku
3.2.koncentrace
Ize dodávat
Tyto materiá1y
roztoku.
stavu,
natívním
v
dodávat
mok
a mozkomíšní
Punktát
Ize
nejdé1e jeden týden).Konzervovat
_2o až -7oCI
vzorku(při
po koncentraci
plasmu'
1en odděLenou
koncentrátmoku,punktátuatkáňvefyz.rozLoku. z
:.:.izalegg_DNA pro
setů
protokolu
tkání,pod1e Izolace
g | e n o m o v éa
izolaci
moků a moče a]-kalickou
Setem pro
ptasmidové
pro izolacj-
DNA
zpracování
pro
moku komerčním moče pouŽít
z moče.(5) nukleových kyselin set pro izolaci standardní metodou DNA izolované 3 . 4 . amplif ikace PCR se
zařazenou
přítornnosti obecných
při
inhibitorů
primerů
(Tzolovanou
vnitřní
kontrolou
DNA
Lze
uchovávat
DNA BorreLia v ředěném
_2o C S omezeným počtem rozÍarazení vzorku
v dest.vodě
rychle
hyďrolyzuje)
speciální
nebo rnu]-tilokáIní
průběhu reakce
pcR v kaŽdém vzorku.
k identifikaci
zpracování
DNA.(4)
bakteriá].ní
Lýzou(1),nebc
DNA z krve.Při
izo]aci
komečních
punktátů,pomocí
a
tkání
plasmy,
k vyloučení
Ampl-ifikace
s pouŽitín
burgdorferi
sensu
tris
pufru
í několik
}et'
]-ato.
10.
(nahraŽuje
ternplátu
obsahu cílového
kontro]-ou bez
.negatirmí
Pro PCR)
dest.voda
kontrolou
,Jou_rli]rnÍ
podle
bore}ie
doplnit:
amp1ifíkace
serií
3. 5.kontroly
DNA (3-4
obsahu1ící
mixu)pathogenní
ng,/roul
primeru
druhu pouŽitého
mixu ředěnou
DNA
uvedených druhů s obsahem 150 a 3oO fg v t mikrolitru,/1O
u1
obsahujícÍ
reakce
citlivosti
.kontro1ou
v
mixu .izolační druhu
Í ŠarŽe setu
izolované
vzorky
10 a 1oo bore}ií
ředěnou
prod
pouŽítím vel1kostního
3.7.fotQdokumentace
borelií
mezi s obsahem
týden
pro
a přístrojů
moIekulárního
a intenzity
agarózovém
markru.
obarvení
při
9e1u
- hodnotit vzorky
výhradně
Srovnání
se
arnp1ifikovat
s
snímku
pouŽitím
primerů pro určení genospeciés
4c zaŤazenými
na černobíIý
červeném filtru
aŽ na pozitivním
s
ethidium
vodě při
v desti}ované
gelu
benduv UV světle.
v UV světle
DNA.
izolaci v
amplifÍkace
kontaminace
vyloučení
při
mezí izolace
zařadit
film.
panchromatický
specífických
pathogenních
procesu.KaŽdý
Po důkladném vyprání
odeČtení polohy kontrolami.
.pozítirrní
zařadit
změně
v 10 uI PBS na zkoumaný vzorek.
reagencií
3.6.erektroforéza
3.8.Hodnocení
součástí,
destí].ované vody
2ao uL sterilní pouŽívaných
kulturu
DNA' nebo při
přípravy
změně rnetodiky
a jednotlívých
kontaminace
.kontrolou
bromldem.
Pří
kontroIou.
bore] ií
druhově
11
.negativní
vzorky
kde byla
kontroIa:
změřit
mnoŽství
není
výsledky
o
obecného i
jediné
tak
přesné
bendů je
v'ýsledku
třeba
restrikčními
produkt
třeba
dáte
při
ale
kontrol,
produktu,
lokalizaci
je
v souladu primeru. jak
opakovat
-
amPlifikaci
odpovídajícírn
jsou
specifického
druhově
kontroIe
neodpovídaiící
pacienta.
produktu'
pokud
ana}yzovat,
vzorek
po pouŽití
izolaci, .při
dáte
třeba
nebo
kontrol,
1oka1izací
shody s odpovída]ící
bezvýhradné
od stejného
zařazených
odpovídaj ícím v'ýsIedku
.při
znovu
odpovídající,
DNA
nový vzorek
izolovat
neměřitelné,
a
10krát)
aŽ
polovinu
mnoŽství
Je-1i
arnplif ikovat.
.při
na
nadbytku,
Pří
ÍzoIované DNA ve vzorku.
ředit(větŠinou
přísluŠně
anplifikační
téŽ negativní
při
případně
zpracovat
pochybnosti vzníku
vÍce
hybridizací,sekvenováním,
aj.
enzymy
. 9 . Citlivost v porovnání
srovnatelnými elektronovou
metod.u
průkaz LB(přírný průkaz da}Šími metodami pro je třeba zvýšit diagnóza), j a s n á k I i n i c k á mikroskoPií,
pouŽitím metody nested
cítlivost
borelií
koncentrace
(7) mikrokoncentratory
protilátkou
přípaďně
PcR,(6)
( liposony
materíáIu
z
zařadit
srovnate}nými
dalšími
metodami
elektronovou
mikroskoPií,
jasná
vyŠetření
pomocí sťejných
striktních
účinnějŠí S
(8) ). v porovnanl-
kontaninaci
Se
pro
se
průkaz LB(přírný průkaz
klinická kontrol.
diagnóza),pátrat
po
Srovnávat
výsledky
vzorků s renomovanou laboratoří.
1,2
.při
koIísarných
.rnýsledcích
spolehlivost
pouŽívané techniky,
Sor-r-Lrrrr
sta.tě:
Sterilní
odběr.
Uchování
vzorku
okamŽitá
izolace
okamŽitá
PcR
nebo
negati\mí,pozitivní,
s
PcR
.rrnitřním
PcR
cítIivosti
kontrola
a
izolace. zpracování
a kontrolní
Periodické
nukleázami
restrikčními
b)Přítomnost
polymerázy,
hybridizací,
aj.
a starý
inhibitorů
materiá]-.
v izolované
c)Špatný nebo nevhodně vybraný mix
arnpIifikátu
:
L érnaz
a)Špatně odebraný
d)Špatný
nested
fragmentem.
citlivosti
P r o]c
konzervace.
DNA.
multi1o}<ální
kontrolním Kontrola
postupu,
změny, ingÍredience.
nebo jeho
v chIadu
standardnost
di-agnóza),prověřit
klinická
mikroskoPií,jasná
elektronovou
průkaz
LB(přímý
průkaz
pro
ntetodami
ďa]-šírni
se srovnatelnýrni
v porovnání
pro
PCR
DNA nebo nadbytek
primer,
jeho
koncentrace.
(poŠkozené nukleotidy,nizká
nízký obsah íontů
DNA.
aktivita
M9 ++, nevhodná dest.voda
PCR . uvedeny jen nejčastějŠí příčiny).
pro
