volba separace pro následnou MS kvantifikaci proteinů
Jan Havliš Jan Havliš Masarykova univerzita y Přírodovědecká fakulta, Brno
Ústav experimentální biologie : Ústav experimentální biologie : Oddělení funkční Oddělení funkční genomiky genomiky a proteomiky :: a proteomiky :: Centrální laboratoř :::
obsah obsah přednášky přednášky
kvantifikace proteinů/peptidů pomocí MS : kvalitní MS data
separace proteinů/peptidů i ů/ idů : jaká separace? :: úroveň :: technika 2
hmotnostně spektrometrické stanovení proteinů/peptidů nepřímé stanovení pomocí izotopového značení : potřebujeme ř b j stanovit i poměr ě intenzit/ploch i i / l h signálu i ál obou b verzíí peptidu id (lehká/těžká značka) :: AQUA – syntetické značené peptidy :: 18O – jednoduchá vnitřní značka :: iTRAQ – multibarická ltib i ká vnější ější značka čk
přímé ří é stanovení t í bez b izotopového i t éh značení č í : potřebujeme stanovit poměr intenzit/ploch signálu dvou stavů téhož peptidu : p potřebujeme j spočítat p identifikované peptidy p p yp příslušející j jjednomu p proteinu
3
nejčastější kvantifikace proteinů : tryptické peptidy pro pars pro toto kvantifikaci proteinu :: izotopolog jako vnitřní standard
důležité vlastnosti kvantifikačních peptidů : C‐koncový arginin : žádné reaktivní AK : žádná neúplná štěpení : intenzivní a reprodukovatelný signál v MS
stafylokokální enterotoxin H (cca 29 kDa), kDa), RPLC RPLC‐‐ESI ESI‐‐IT MS ř hl d kandidátských k didá ký h tryptických i ký h peptidů idů pro vnitřní i ř í standard d d přehled : většina nepoužitelných – neúplné štěpení, slabý MS signál
4
hledáme jehlu v kupce sena : složitá směs peptidů :: hledání hl dá í dvou d peptidů tidů lišících liší í h se v m/z / :: hledání jednoho peptidu (přímá kvantifikace)
prekvantitativní separace : citlivost i li – de d facto f prekoncentrace k : selektivita – izolace ze složité směsi proteinů
směs p proteinů : dělíme nejprve proteiny :: potom trypticky štěpíme a pak dělíme tryptické peptidy : dělíme až směs tryptických peptidů
5
separace proteinů/peptidů pro MS stanovení peptidů/proteinů pro MS stanovení peptidů/proteinů nepřímé stanovení : potřebujeme stanovit poměr signálů dvou izotopologů téhož peptidu
přímé stanovení : potřebujeme stanovit poměr signálů dvou stavů téhož peptidu : potřebujeme spočítat identifikované peptidy příslušející jednomu proteinu nutnost oddělení informace o ploše či intenzitě signálu peptidu od ostatních : izotopový vzor!
separace : oddělení individuí – optimální, ale náročné
frakcionace : oddělení skupin individuí – vhodné a relativné snadné
6
separační vlastnosti aminokyselin/peptidů multifunkční struktura aminokyselin/peptidů : C‐konec konec;; kyselý kladný náboj/polární : N‐konec konec;; zásaditý záporný náboj/polární : boční řetězec – široký rozsah vlastností
alifatické
velmi malé
malé
faktory ovlivňující separaci H : pH : polarita prostředí : iontová síla : kompatibilita s MS
kapalinová chromatografie elektromigrační metody hmotnostní spektrometrie
nepolární aromatické
nabité
polární
kladně nabité
7
kapacita separace (peak capacity) capacity) schopnost separovat : počet dobře rozlišených (R ≥ 1.5) píků (n) po dobu separace (tR0 až tRmax) : význam pro následné MS – efektivnější měření spekter (střída analyzátoru) :: optimálně má každý peptid své „okno“ (odhledě od efektů při ionizaci) 78 píků
w – šířka píku při základně j – počet píku v separaci (za čas tRmax) 64 píků
maximalizace kapacity separace : delší čas separace (v jednom rozměru) : spojováním více rozměrů či technik (hyphenation hyphenation))
8
hmotnostní spektrometrie separace v analyzátoru hmotnostního spektrometru : speciální způsob separace : vyžaduje konkrétní typy analyzátorů :: iontový selektor (SIM, SRM, MRM) ::: kvadrupól (Q, QqQ), QqQ), past (IT, FTICR, OT)
zásadní nedostatky : nehomogenní účinnost ionizace (potlačování ionizace) : kapacita pasti (nedostačuje komplexitě vzorku) : „ko ko‐‐eluce eluce“ – selekce iontů s podobným m/z
9
kapalinová chromatografie iontově‐‐výměnná chromatografie iontově využití první rozměr 2D‐LC LC‐‐MS : odsolení v druhém rozměru
malý specifický náboj molekuly : na rozdíl od anorganických iontů : C a N‐konce a pět nabitých AK :: tři kladně, dvě záporně
SCX při pH ≈ 3
chromatografie na obrácené fázi peptidy : převážně slabě polární až nepolární iontově iontově‐‐párovací mód (TFA, FA, AFA)
využití druhý rozměr 2D‐LC LC‐‐MS : vysoké rozlišení, na monolitu rychlé : kompatibilní rozpouštědlově s MS IP‐‐RPLC při pH ≈ 3 nebo pH ≈ 10 IP
10
chromatografie s hydrofilními interakcemi organická MF
využití první rozměr 2D‐LC LC‐‐MS : polární separace s vysokým obsahem organiky
analyt
voda
SF
částice nosiče SF
molekulová vylučovací chromatografie využití první rozměr 2D‐LC LC‐‐MS : nepříliš vhodná pro LC LC‐‐MS – složení MF
afinitní chromatografie : chirální hi ál í separace – cyklodextriny cyklodextriny, kl d t i , makrocyklická k kli ká antibiotika tibi tik : IMAC/MOAC – fosfopeptidy
11
vícerozměrná kapalinová chromatografie kompatibilita : ro rozpouštědlová pouštědlová : průtoková
: přímá (in in‐‐line line)) – přímý vstup do 2D z 1D :: smyčky (průtočné, vypařovací), záchytové kolony p (off off‐ ff‐line line)) – dávkování sesbíraných ý frakcí : nepřímá SCX
komplementarita rozměrů (orthogonality orthogonality))
příklady praktického využití : IP‐ IP‐RP RP(b) (b)––IP IP‐‐RP RP(a (a))–MS : SCX– SCX–RP RP––MS : HILIC HILIC––IP IP‐‐RP RP––MS
[s] [ ]
RPLC [min]
12
tryptická směs fosforylázy B IP RPLC C18 IP‐RPLC C18 pH = 2.6
pH = 3.25
retenční čas [min]
retenční čas [min]
IP‐RPLC C18 pH = 10.0
retenční čas [min]
SEC
retenční čas [min]
HILIC
retenční čas [min]
IP‐RPLC PFP IP‐RPLC PFP
SCX
retenční čas [min]
13
elektromigrace gelová elektroforéza kvalitní, ale omezená separace (MW, pI) pI) : extrémy pI a MW
využití : nepřímé spojení GE GE‐‐MS : přímé spojení :: kolonová k l á GE (CEGE) problémy se zpracováním gelu
kapilární zónová elektroforéza adsorpce na stěny separačního kanálu : řešení CGE (fyz fyz.. i chem chem.. gely) malá kapacita, kapacita nástřik cca 20 nl
využití první rozměr spojených technik : nutný kapalinový spoj před MS : nebo záchytová kolona
14
izoelektrická fokusace mimo gel (LP‐‐IEF (LP IEF;; liquid li id phase h IEF) : peptidově/proteinově specifické : spíše frakcionace než separace
napětí separační cely
elektroda
gelový proužek s amfolyty pH gradient
( yy ) : artefaktyy v MS (amfolyty?) cely prostorově pokrývají různá pI
využití : nepřímé spojení s MS proteiny s různým pI skončí v různých celách
kapilární elektrochromatografie : vysoká kapacita separace a vyšší rozlišení (oproti RP) ětší nástřik á třik (oproti ( ti CZE) : větší : technicky náročné (kolony)
15
spojené separační techniky (hyphenated techniques techniques)) kompatibilita : principiální i i iál í : rozpouštědlová
: zvláštní rozhraní :: např. např. kapalinový spoj
komplementarita rozměrů (orthogonality orthogonality)) SEC
CZE
LP‐IEF LP‐ IEF––SCX SCX––RPLC RPLC––MS :: frakcionace (20 frakcí) :: frakcionace (7 frakcí z každé LP LP‐‐IEF frakce) :: separace (každé SCX frakce)
16
predikce separačních vlastností na základě sekvence ákl dě k k komplexnost l vzorku, k nízká í ká množství ž í proteinu, i i i ionizace najdeme náš peptid? retenční/migrační čas (tR/tm) : závisí na chemickém složení; složení; AK sekvenci známe‐li sekvenci, odhadneme retenční čas známe‐ : větší pravděpodobnost nalezení kvantifikačního peptidu
jak tR/tm odhadneme? : numerické modelování (hard modelling modelling)) : poloaproximační modelování (semi semi‐‐hard modelling) modelling) :: SSRCalc, SSRCalc, LCMSWARP, ScoreRidge, ScoreRidge, SVR : aproximační modelování (soft modelling modelling)) :: umělé neuronové sítě (ANN)
17
molekulové deskriptory : délka peptidu, peptidu počet AK : molekulová hmotnost (MW) : hydrofobicita (HydroMCalc HydroMCalc)) : hydrofobní moment (µH (µH;; HyperChem) HyperChem) : logaritmus teoreticky vypočítaného rozdělovacího koeficientu n‐oktanol oktanol/voda /voda (logP logP;; Molinspiration Molinspiration)) : van der Waalsův objem (VvdW VvdW)) : objem molekuly dostupný rozpouštědlu (VSA)
optimální p deskriptory p y a ANN ((chyba y p předpovědi p 12 %) : struktura sítě 27 27‐‐3‐1 : aminokyselinové složení : délka peptidu : logP : hydrofobicita : zadání 1. AK z N‐ a C‐ konce (rozdělení do 7 skupin)
18
nějaký jednoznačný závěr? spíše ne… ne… : unikátnost jednotlivých směsí proteinů/peptidů :: unikátnost separačních řešení – nic obecného : rady, kterými neprohloupíme :: jednodušší směsi (desítky proteinů) ::: separujme až tryptické peptidy :: složité směsi (desítky až tisíce proteinů) ::: proteinová frakcionace původní směsi (IP (IP‐‐RPLC, RPLC SEC, SEC HILIC) a pak separace tryptických peptidů frakce (IP‐ (IP‐RPLC) ::: 1D tryptických peptidů původní směsi (HILIC, IP IP‐‐RPLC RPLC(b) (b),, SCX) a pak komplementární 2D (IP (IP‐‐RPLC RPLC(a) (a))) :: přednost mezi MS mají analyzátory QqQ QqQ,, FTICR a OT s ESI
19
20
děkuji za pozornost děkuji za pozornost finanční podpora GA ČR MŠMT
GA203//09 GA203 09//0148 MSM0021622413 MSM 0021622413, MSM 0021622413, MSM0021622415 0021622415
21
