Mycotoxines - screening
Dr A. Callebaut CODA-CERVA-VAR NRL Mycotoxines Leuvensesteenweg 17 3080 Tervuren 7/6/2010
tox subst nat
1
Mycotoxines
Inleiding Meest voorkomende mycotoxines Analysemethodes Screeningsmethodes Sneltesten
7/6/2010
tox subst nat
2
1
Mycotoxines
Inleiding Meest voorkomende mycotoxines Analysemethodes Screeningsmethodes Sneltesten
7/6/2010
tox subst nat
3
Inleiding
Mycotoxines zijn toxische (natuurlijke) secundaire metabolieten geproduceerd door schimmels Toxines van paddenstoelen zijn geen mycotoxines Mycotoxines veroorzaken intoxicaties door opname via voeding/voeder Mycotoxines kunnen geproduceerd worden in het gewas op het veld (voor de oogst) of tijdens de stockage van producten (na de oogst) Vele mycotoxines zijn cytotoxisch, carcinogeen, mutageen, immunosuppressief Er is niet altijd een verband tussen de aanwezigheid van de schimmel en contaminatie met mycotoxines
7/6/2010
tox subst nat
4
2
Inleiding
Chemisch : zeer heterogeen (300-400 mycotoxines) Mycotoxines kunnen ziektes en dood induceren bij gewervelde dieren en mensen Historisch : turkey X disease (1960): ongeveer 100000 kalkoenen sterven door pindanotenmeel gecontamineerd met aflatoxines Ergot alkaloïden : moederkoren, SintAntoniusvuur (middeleeuwen, heksen ?)
7/6/2010
tox subst nat
5
Inleiding
Acute effecten : turkey X disease, ergotisme, stachybotryotoxicose Chronische effecten : (sluipend gif) grootste deel van effecten van mycotoxines zijn te wijten aan chronische blootstelling (langdurig, lage concentraties) wat kan leiden tot kanker, immunosuppressie, nierschade, enz..
7/6/2010
tox subst nat
6
3
Inleiding
Mycotoxicose : blootstelling aan mycotoxines via voeding, inademen, of dermaal veroorzaakt de effecten = vergiftiging op een natuurlijke manier
Mycotoxicose : interactie met infecties, voedingsstatus, alcohol misbruik, enz ..
Mycoses : schimmel groeit in/op dierlijke/menselijke gast
7/6/2010
tox subst nat
7
Mycotoxines
Inleiding Meest voorkomende mycotoxines Analysemethodes Screeningsmethodes Sneltesten
7/6/2010
tox subst nat
8
4
Aflatoxines
B1, B2, G1, G2 en M1 (fluorescerend onder UV)
Turkey disease
B1 : voornaamste afla; krachtigste natuurlijk carcinogeen (Groep 1). M1 is een metaboliet gevonden in melk. Aflatoxicoses : dood, kanker, immuunsuppressie, enz Lever aantasting (leverkanker, verhoogd risico indien hepatitis B). Longkanker
Geproduceerd door vnl Aspergillus sp In vijgen, noten, olie-zaden, granen, enz..
Kan zowel op het veld als tijdens de opslag van grondstoffen geproduceerd worden Vnl problemen in warme en vochtige gebieden, maar niet uitsluitend
7/6/2010
tox subst nat
9
Fumonisines
Geproduceerd door Fusarium sp B 1 , B2 , B3 Interfereren met sfingolipiden metabolisme : leucoencephalomalacia bij paarden, konijnen Pulmonair edema bij varkens; toxisch voor lever en carcinogeen bij ratten Esophagale kanker bij de mens (Zuid-Afrika, China, Italië). Neural tube defecten Vooral in maïs, sorghum In groep 2B : waarschijnlijk carcinogeen hydrofiel
7/6/2010
tox subst nat
10
5
Ochratoxine A
Graangewassen, bonen, noten, specerijen, droge vruchten, koffie, bier, en wijn wordt teruggevonden in vlees, melk Nephrotoxisch (varkens) en mogelijk kanker bij mensen. Gevogelte ook gevoelig Hepatotoxisch, genotoxisch, cytotoxisch, teratogeen en immunotoxisch bij dieren Vooral geproduceerd door Aspergillus soorten
7/6/2010
tox subst nat
11
Trichothecenen
Familie van meer dan 60 sesquiterpeen metabolieten Verschillende schimmels, Fusarium
Macrocyclische en niet-macrocyclische
7/6/2010
tox subst nat
12
6
Trichothecenen
Niet-macrocyclische : type A (HT2, T2, DAS, ..) en type B (DON, NIV, enz..) DON : algemeen in graangewassen en dus in food en feed
Bij dieren: hoge dosis :braken, nausea, diarrhee; lagere dosis : gewichtsverlies en weigeren van voeder (varkens)
T2 en DAS : meest toxisch
T2 : alimentary toxic aleukia : bloedingen, braken, huidontsteking (USSR)
7/6/2010
tox subst nat
13
Trichothecenen
Macrocyclische : Stachybotritis sp Satratoxines, roridine, verrucarine Stachybotryotoxicose : dodelijke paardenziekte (beschimmeld hooi en sto) Ook in vochtige huizen (longbloeding bij kinderen)
7/6/2010
tox subst nat
14
7
Zearalenone
Fusarium Niet echt toxisch, wel myco-estrogeen Vooral varkens gevoelig : abortus, problemen bij bevruchting. Ook bij koeien en schapen
7/6/2010
tox subst nat
15
Ergot alkaloïden
In sclerotia van Claviceps purpurea
Ergotism : gangreen, centraal zenuwstelsel
Courant in middeleeuwen in Europa
Verwant aan LSD
Ergotamine geneesmiddel (migraine)
Blijft een veterinair probleem : koeien, schapen, varkens en kippen gevoelig (gangreen, abortus, convulsies, lactatieproblemen, hypergevoeligheid en ataxia)
Vnl in rogge
7/6/2010
tox subst nat
16
8
Andere
Enniatines, beauvericine (Fusarium) Roquefortine, cyclopiazonic acid (kaas, Penicillium) Penitrems, lolitrems : neurologische problemen (tremors) bij dieren (Penicillium) Citrinin (yellow rice disease, Penicillium, Aspergillus) Alternaria toxines (o.a. op groenten) Patuline (appels, appelsap, Penicillium,Aspergillus) Sterigmatocystin (kaas, Aspergillus)
7/6/2010
tox subst nat
17
Gemaskeerde mycotoxines
DON-glucoside, ZEA-glucoside, ZEA-sulfate, …
Fumonisines : zeer complex, talrijke onbekende chemische vormen
Niet gedetecteerd met de referentiemethoden
Kunnen in aanzienlijke hoeveelheden voorkomen
Veranderingen tijdens processing
7/6/2010
tox subst nat
18
9
Gemaskeerde mycotoxines
De plant detoxifieert het mycotoxine
Niet opgenomen in de wetgeving
Worden ze opgenomen en omgezet in natieve mycotoxines ? Of eerst gehydrolyseerd en dan opgenomen?
Metabolisatie in dier/mens
Speciale categorie : mycotoxines niet extraheerbaar, bindingen met celwanden ?
7/6/2010
tox subst nat
19
Mycotoxines
EU reglementering
EC 657/2002
EC 1881/2006
EC 1126/2007
Grondstoffen, maar ook afgewerkte producten zoals verbruikt
Speciale normen voor babyvoeding en voeding voor kinderen
7/6/2010
tox subst nat
20
10
Mycotoxines
Wettelijk gereglementeerde mycotoxines in voeding (EU)
Aflatoxines (0.025 – 8 µg/kg) Ochratoxine A (0.5 – 10 µg/kg) Fusarium toxines : • DON (200 – 1750 µg/kg) • FUM’s (200 – 4000 µg/kg) • ZEA (20 – 400 µg/kg) • T2 & HT2 : nog geen maxima
7/6/2010
tox subst nat
21
Mycotoxines
Aanbevelingen voor maximum gehalten in voeders (EU)
Aflatoxines (5 – 200 µg/kg) Ochratoxine A (50 – 250 µg/kg) Fusarium toxines • DON (0.9 – 12 mg/kg) • FUM’s (5 – 60 mg/kg) • ZEA (0.1 – 3 mg/kg)
7/6/2010
tox subst nat
22
11
Mycotoxines
Inleiding Meest voorkomende mycotoxines Analysemethodes Screeningsmethodes Sneltesten
7/6/2010
tox subst nat
23
Mycotoxines : analyse
Referentiemethodes : fysicochemische methoden
Instrumenteel : LC-UV, LC-Fluo, LC-MS/MS, .. bevestigingsmethode Meestal robuust, betrouwbaar Tijdrovend, meestal duur
Screeningsmethodes : biochemische methoden
7/6/2010
Meeste gebaseerd op immunotechnieken Vermijden van zwaar gecontamineerde partij grondstoffen Snel, goedkoper, ter plaatse
tox subst nat
24
12
Mycotoxines
Inleiding Meest voorkomende mycotoxines Analysemethodes Screeningsmethodes Sneltesten
7/6/2010
tox subst nat
25
Screeningsmethodes
2002/657/EU :
7/6/2010
Methoden gebruikt om de aanwezigheid van een substantie of een klasse van substanties aan te tonen op een bepaald niveau (wettelijke limiet, actielimiet). Deze methoden worden vooral gebruikt om uit een groot aantal stalen de potentiële niet-conforme stalen te selecteren.
tox subst nat
26
13
Screeningsmethodes
Validatie moet aantonen dat de screening range laag genoeg is om een staal met de contaminant op niveau van wettelijke limiet als positief te detecteren
Alleen analytische technieken voor dewelke op een traceerbare en gedocumenteerde manier kan aangetoond worden dat ze gevalideerd zijn en voor dewelke de kans op een fout resultaat < 5 % is op het niveau waarop gemeten wordt, kunnen gebruikt worden
In geval van een niet conform resultaat, moet dit bevestigd worden met een bevestigingsmethode
7/6/2010
tox subst nat
27
Screeningsmethodes - detectie
Biologische methoden
Biochemische methoden
Celculturen, bacterieën, .. Voor groepen, vb oestrogeen effect
Selectief voor familie of molecule-specifiek Meestal interactie antilichaam of eiwit (receptor) en een antigen
Fysicochemische methoden
7/6/2010
Molecule specifiek Verschillende moleculen kunnen samen bepaald worden
tox subst nat
28
14
Screeningsmethodes - kwantificatie
Kwalitatieve methoden
Semi-kwantitatieve test
Boven of onder een “cut-off” waarde (immunotest) Piek of niet (chromatografische test)
Numeriek resultaat niet betrouwbaar, eerder range Oriëntatie voor bevestingsmethode
Kwantitatieve methodes
Moeten voldoen aan dezelfde vereisten als bevestigingsmethoden (accuraatheid, range, precisie Identificatiepunten niet nodig
7/6/2010
tox subst nat
29
Screeningsmethodes
Prestatiekenmerken
2002/657/EC : • Kwalitatief : CCβ, gevoeligheid, specificiteit, toepasbaarheid, robuustheid, stabiliteit • Kwantitatief : idem + precisie
Guideline for initial validation and transfer of screening methods (CRL Fougères 08/07/2009)
7/6/2010
tox subst nat
30
15
Mycotoxines
Inleiding Meest voorkomende mycotoxines Analysemethodes Screeningsmethodes Sneltesten
7/6/2010
tox subst nat
31
Mycotoxines : sneltesten
In het algemeen gebaseerd op antilichamen Kwalitatief, semi-kwantitatief en kwantitatief Verschillende technologieën Verschillende detectiesystemen
Keuze afhankelijk van : Kost Complexiteit Gewenste betrouwbaarheid
Voornaamste toepassing in bedrijven in kader van food safety management system
7/6/2010
tox subst nat
32
16
Mycotoxines sneltesten
ELISA : standaard tool, matrix afhankelijk Fluorescentie-immunoassays : sneller, geen enzymes Membraan gebaseerde testen : Test strips (lateral-flow devices) : 5-10 min Flow-through Dip stick : 30 min -3 uur
7/6/2010
tox subst nat
33
Mycotoxines : sneltesten
Verificatie van de performantie van de kits :
GIPSA : fabrikant kan kit aanbieden, performantiecertificaat na administratieve en experimentele check AOAC International : validatie Geen vermelding : beste kit, voor officiële controle
Harmonisatie
7/6/2010
Rapid Alert System Food and Feed data Aflatoxine controle aan grenzen : 436 partijen (peanuts en noten) afgekeurd in periode januari – augustus 2008 Iedere partij moet in principe vergezeld zijn van een officieel attest van een erkend lab dat aan de performantiecriteria kan beantwoorden EU gefinancierd project (www.moniqa.org) : strategie voor harmonisatie en validatie van sneltesten
tox subst nat
34
17
Mycotoxines : sneltesten
Lateral flow devices : Kwalitatief met cut-off waarde Kwantitatief met een strip-lezer Problemen met gevoeligheid en selectiviteit (specificiteit antilichamen, matrix) Simultane detectie van ZEA en DON Colloid-goud gebaseerde strips voor : • DON • Afla B1 • FUM B1 • OTA • T2
7/6/2010
tox subst nat
35
Mycotoxines : sneltesten
7/6/2010
tox subst nat
36
18
Mycotoxines : sneltesten
7/6/2010
tox subst nat
37
Mycotoxines : sneltesten
De Saeger et al. (2002) : Membraan-gebaseerd flow-through enzyme immunoassay OTA en T2 in granen : vals negatief : 4%, vals positief 2 %
Zheng et al (2005) : ELISA based assay Totaal aflatoxines in maïs, maïsproducten en andere granen : kit was bevredigend (GIPSA criteria) voor 11 van 13 matrices
7/6/2010
tox subst nat
38
19
Mycotoxines : sneltesten
Salmon and Mathews (2007):
7/6/2010
DON sneltest kits for 20 naturlijk gecontamineerde tarwestalen Vergelijking met gehalte bepaald door GC-MS 1 staal : alle kits gaven een onderschatting 18 stalen : significante verschillen tussen GCMS en sneltesten Lateral flow systemen : overschatting van DON
tox subst nat
39
Mycotoxines : sneltesten
Vals positieven : Kruisreactie met vb. gemaskeerde mycotoxines
Vals negatieven : Matrix-mycotoxine interactie waardoor mycotoxine niet beschikbaar wordt voor het antilichaam
7/6/2010
tox subst nat
40
20
Sneltesten : test strips kits
Commercieel beschikbaar :
AFLA’s : kwalitatief en kwantitatief DON : semi-kwantitatief en kwantitatief FUM’s : kwalitatief en kwantitatief OTA : kwantitatief ZEA : kwantitatief
7/6/2010
tox subst nat
41
Analytical performances of 5 commercial fast kits for the determination of deoxynivalenol in cereals TANGNI Emmanuel et al. CODA - CERVA
Chemical Safety of Food chain
Unit Toxins and Natural Components - NRL
21
Sneltesten – DON in graangewassen
CODA-CERVA : administratieve en experimentele evaluatie van voornaamste DON-kits in België (2008) Administratief : inventaris, contacten met leveranciers, validatiedossiers beschikbaar gesteld door leveranciers, opstellen vragenlijst, administratieve evaluatie, verslag Experimenteel : + checks in het CODA-CERVA van kruisreacties, gevoeligheid aan temperatuur en incubatieduur, matrix interferenties Rapporten op www.var.fgov.be en op www.favv.be
7/6/2010
tox subst nat
43
Inventory of DON testing kits USA: Germany : Austria : Italy: The Netherlands: 14
Charm, Neogen, Strategic Diagnostica Aokin, R-Biopharm Romerlabs Tecnalab EuroProxima
14
Number of Kis
12 10 8 5
6 4 2 2 0 Quantitative
Semi-quantitative
Qualitative
Type of kits
7/6/2010
tox subst nat
44
22
Inventory: DON Kit providers (I) Manufacturers
Kits
Range of quantitation
Remarks
10 - 1400 ppb
Quantitative
Wheat, barley: 1 ppm
Qualitative P/N
Wheat: 0.5 ppm 0.1 6 ppm
Quantitative
DEOXYNIVALENOL EIA (5121DON1p) DON Tube Test
0.015 – 1.0 ppm
Quantitative
Cut-off 0.5 ppm
Qualitative
®
Cut-off 1 ppm
Qualitative
Cut-off < 0.5 ppm
(semi quantitative) Multi cut-off
1- AOKIN
AokinmycontrolDON
2- CHARM
ROSA Qualitative for DON
ROSA Quantitative for DON 3-EURODIAGNOSTICA
4- NEOGEN
Agri-Screen for DON (8310) ®
Reveal For DON SQ (8315) ®
(for use with the Reveal AccuScan™ III Reader)
>0.5 <1.0 ppm > 1.0 <2.0 ppm
®
Veratox For DON 5/5 (8333) ®
Veratox for DON 5/5 (Europe only) (8331) NE ® Veratox For DON High Sensitivity (HS) (8332)
7/6/2010
> 2.0 ppm 0.5 – 5 ppm
Quantitative
0.25-2.0 ppm
Quantitative
25 -250 ppb
Quantitative
tox subst nat
45
Inventory: DON Kit providers (II) 5- STRATEGIC DIAGNOSTICA
MycoChek DON Test Kit
6- R-BIOPHARM
Ridascreen FAST DON (R5901, R5902) Ridascreen® FAST DON SC (R5905) ® Ridascreen DON
®
(R5906)
0.5 – 3 ppm
Quantitative
0.2 – 6 ppm
Quantitative
0.074 – 6 ppm 18.5 – 100 ppb
Quantitative Quantitative
(cereals, malt and feed) 3.7 – 100 ppb (beer and wort) Cut-off1= 1250 ppb
®
RIDA Quick DON (R5904) ® RIDA QUICK SCAN DON (strip) RAPID SCREENING CARDS 7- ROMERLABS
AgraStrip® DON ® AgraQuant DON ® AccuTox Kit
8-TECNALAB
I'screen DON "GLOD
7/6/2010
Cut-off2 = 500 ppb 0.5 – 10 ppm
0.5 -5 ppm 0.25 - 5 ppm Cut-off 0.5 ppm
Semi-quantitative
Quantitative Qualitative Quantitative Quantitative Qualitative Quantitative.
tox subst nat
46
23
Partnership AFSCA-FAVV
Guidance
(Food agency)
Kit users (Agro-food sector)
CODA – CERVA (NRL for mycotoxins)
Evaluation work
Kit providers (Manufacturers, Distributors)
7/6/2010
Users’ expert committee (Public & private Labs, Universities, …)
tox subst nat
47
Administrative evaluation Quantitative kits
Qualitative kits
Detection lim it Range and linearity Sensitivity and specificity
Detection limit Cut-off lim it False positive and negative rates
Measurement Uncertainty
Unreliability region
Accuracy: trueness, precision
Sensitivity and specificity
Selectivity: interferences Ruggedness or robustness
Selectivity: interferences Ruggedness or robustness
Checking provided information against • AOAC requirements (http://www.aoac.org) • USDA/GIPSA/FGIS directives (http://www.gipsa.org) • EC regulation No 401/2006/EC
Other parameters • Amount of materials and solvent needed • Cost & time requirement (per sample) 7/6/2010
tox subst nat
48
24
Administrative & experimental evaluations Concerned kits Microwell Plate AGRAQUANT® DON EIA
Provider Romerlabs EuroProxima
®
Veratox for DON 5/5 Lateral Flow Device ROSA LF-DONQ FIA device MycontrolDON
Neogen Charm Aokin
Test procedure and reagents contained or recommended by test kits providers were used 7/6/2010
tox subst nat
49
AGRAQUANT (administrative Evaluation) Parameter
Cumulative rate
Calibration curves (number of standards according AOAC requirements)
5
Compliance (with EU Acceptable limits without dilution)
15
Number of target commodities
5
LOD requirements (GIPSA requirement)
5
Recovery percents (EU requirements)
Precision (relative standard deviation, EU requirement)
Max rate*
Result
Rating
5
4
3
1.00 µg/g
5
OK
5
1.25 µg/g
5
OK
5
1.75 µg/g
5
OK
5
OK
5
OK
5
OK
5
OK
5
OK
2
OK
2
Requirements
5 (not zero)
Main cereals (>3)
5
0.25 µg/g 5
5
5
60 - 110% (for 0.1 – 0.5 µg/g) 70 -120 % (for >5.0 µg/g)
5
RSDr <= 20% 5
Accuracy (GIPSA requirements)
Confirmation (Cross validation)
Cross reactivity of antibody used
25% for 0.5 µg/g
2
20% for 1.0 µg/g
2
15% for 2.0 µg/g
2
OK
2
10% for 5.0 µg/g Concordance
2
OK
2
5
98%
5
Mean discrepancy
5
447 ppb (74%)
3
< 0.23 µg/g
3
5
>100%
0
5
0%
5
8
15
Questionable concentration range (> EU limits) 10
3ACDON (<10%) NIV (<10%)
Time requirement (GIPSA requirements)
5
30 min 30
Cost /unit of kit
6 euros
Shelf life (2 - 6°C)
5
Overall 'ease to use' Scientific support for providers
5
> 6 months
7/6/2010
Score (%) : Max rate was fixed by evaluator
*
8 months
5
Yes 5
Total Score Max rate
5
5 72
83
83
tox subst nat
87%
50
25
AGRAQUANT (Experimental Evaluation)
Parameter class
Cross-reactivity (in %)
Effect of incubation time
Max rate for class
60
15
Matrix effect 30
Overall "ease to use" Technical support from providers
15
Max rate
Measured effect
Rating
NIV
10
0
10
3AC-DON
10
770
0
DOM-1
10
35
D3G
Parameter
7
10
52
7
FUSX
5
0.7
4.5
15Ac-DON
5
1.6
4.5
DAS
2
0
2
T2
2
0
2
HT2
2
2.1
1
VCL
2
0
2
ZEA
2
18°C
10
0 130-161%
2 5
21°C
10
91-116%
10
25°C
10
108-156%
5
multiplying time by 0.5 and/or 1.5 (at 21°C)
15
109-135%
7,5
Wheat
10
1,4
Winter barley
10
13
10
Oat
10
6.5
10
CODA users
5
15
10
12
5
4 115.5
Total Score Max rate
155
Total score (%) 7/6/2010
155
tox subst nat
75%
51
Overall ADM & EXP evaluations
VERATOX
ROSADON
AGRAQUANT 100% 90% 80% 70% 60% 50% 40% 30% 20% 10% 0%
ADM: ROSA > VERATOX > AGRAQUANT > MYCONTROL > DON EIA EXP: ROSA > VERATOX > AGRAQUANT > MYCONTROL > DON EIA
DON EIA
Administrative Expérimentale
MYCONTROLDON
• Overall scoring must be taken with caution Higher or lower values may be obtained according to the specific conditions related to specific matrix, temperature and conditions of use • More attention has to be paid to the experimental assessment checking the quality of the data provided for the administrative evaluation is not always easy 7/6/2010
tox subst nat
52
26
Characteristic standard curves of DON EIA (Eurodiagnostica) towards mycotoxins 1,0
DON
Relative absorbance (B/Bo)
0,8
DOM-1
FUS X NIV
0,6
0,4
3ACDON D3G
0,2
0,0 0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Mycotoxin concentrations (ng/ml)
DON
NIV
3ACDON
15ACDON
DOM1
FUSX
T2
HT2
VCL
ZEA
7/6/2010
D3G
tox subst nat
DAS
53
CR values determined by two methods
Data obtained via VERATOX Method1
Method 2
Ratio (Method2 / Method1)
IC50% (µg/kg)
CR %
Slope
CR %
624.4 ± 56.1
100.4 ± 9.0
1.019 ± 0.031
101.9 ± 3.1
1.01
1566.7 ± 146.8
40.0 ± 3.8
0.128 ± 0.005
12.8 ± 0.5
0.32
DOM-1
296.1 ± 22.5
211.5 ± 16.5
2.322 ± 0.202
232.2 ± 20.2
1.10
D3G
398.7 ± 3.9
156.6 ± 1.5
0.681 ± 0.062
68.1 ± 6.2
0.43
DON 3ACDON
• Cross reactivity values can easily vary according to the methods used for computation • The observed differences between these two methods are not unexpected (AOKIN, Personal communication) 7/6/2010
tox subst nat
54
27
Temperature & incubation duration sensitivities Tested kits Agraquant
Parameter (*)
Effect of temperature
Effect of incubation time
Veratox
18°C
130-161%
70-81%
21°C
91-116%
95-101%
25°C
108-156%
79-100%
multiplying time by 0.5 and/or 1.5 (at 21°C)
109-135%
85-103%
RosaDON Incubation is made in an oven provided with the system
Incubation time can not be changed with this system
DON-EIA 94-123% 97-111% 100-115%
43 - 67%
Mycocontrol Incubation is made in an oven provided with the system
Incubation time can not be changed with this system
GIPSA maximum Accuracy criteria
• Avoid the low (down to 18°C) & high (from 25°C) room temperatures •Incubation durations of 5, 15 & 60 min were recommended for VERATOX, AGRAQUANT & DON EIA, respectively 7/6/2010
tox subst nat
55
Matrix interferences (%CCR) Matrices
Tested kits Agraquant
Veratox RosaDON DON-EIA Mycocontrol
Wheat Winter barley
1.4 13
0.7 23
6 33
28 19
-14 20
Oat
6.5
15
17
10
24
Typically, significant effect due to matrices should be above 10% (Lee et al. 2004) and satisfactory ranges for DON may stand up to ± 30% (AOKIN, personal communication)
7/6/2010
tox subst nat
56
28
Conclusions & perspectives For KIT Users Cross reactivity of antibody is an important parameter in the experimental evaluation • High cross reactivity exists for 3-AcDON, DOM-1 and D3G for antibodies used in all tested kits (with various ranking orders) •NIV and Fus X cross react in antibody used in DON EIA (EuroProxima) • Low or absence of cross reactivity were diversely observed against 15AcDON, DAS, T2-toxin, HT2-toxin, VCL and ZEA within the range of the tested concentrations. Note CR does not allow appropriate checking the compliance with the legal norms. Nevertheless, it may allow giving an idea about the whole amount of the target compound together with other detectable analogues.
7/6/2010
tox subst nat
57
Conclusions & Perspectives For KIT Users It is important to check room temperature (labs) when starting an ELISA test • If T < 20°C, use an incubator or avoid performing the test • If T> 25°C, use an air conditioning system or avoid performing the test
Incubation Strict respect of the incubation timing & devices (Aokin & Charm) as it is recommended by manufacturers
Matrix interferences Matrix effects could influence significantly the results Each laboratory must perform its own validation within its specific laboratory conditions as well as its own control chart
7/6/2010
tox subst nat
58
29
Conclusions & Perspectives FOR KIT Manufacturers or certifying boards CR data obtained in this work are somewhat different from the declared values by the manufacturers Need Re-evaluation of CR
Standardize the choice of mycotoxins to be tested in CR experiments according to the nature of the target analyte
As for DON kits: 3-AcDON, NIV, D3G, DOM-1 and FUS X should be included
Strict control of produced batches by the manufacturer or certifying body
7/6/2010
tox subst nat
59
Thanks to my colleagues
7/6/2010
Dr Dr Dr Dr Dr
E Tangni B Huybrechts Ph Debongnie J-C Motte L Pussemier
tox subst nat
60
30
