No title

A mecA génkomplex vizsgálata methicillin rezisztens Staphylococcus aureus törzsekben DIPLOMAMUNKA Készítette: BOHNER KATALIN biológus MSc hallgató Témavezető: Dr. PUTNOKY PÉTER PTE TTK Biológiai Intézet Genetikai és Molekuláris Biológiai Tanszék

PÉCS, 2011.

RÖVIDÍTÉSEK AT – adenin-timin ATCC – American Type Culture Collection bp – bázispár CA-MRSA – community-associated methicillin rezisztens Staphylococcus aureus CLSI – Clinical and Laboratory Standards Institute DNS – dezoxiribonukleinsav EUCAST – European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing fw – forward G + C – guanin + citozin GC – guanin-citozin HA-MRSA – hospital acquired methicillin rezisztens Staphylococcus aureus L - Ladder MIC – minimal inhibitory concentration – minimális gátló koncentráció MRSA – methicillin rezisztens Staphylococcus aureus MSSA – methicillin szenzitív Staphylococcus aureus NCCLS – National Committee for Clinical Laboratory Standards PBP – penicillin binding protein PCR – polymerase chain reaction PRP – penicillinázrezisztens penicillinek SCCmec – Staphylococcal Cassette Chromosome mec

TARTALOMJEGYZÉK 1.1. A Staphylococcus genus ............................................................................................. 3 1.2. A Staphylococcus aureus jellemzése.......................................................................... 3 1.2.1. Morfológia, tenyésztés......................................................................................... 3 1.2.2. Előfordulás, klinikai jelentőség ........................................................................... 4 1.2.3. A Staphylococcus aureus törzsek által termelt toxinok....................................... 5 1.3. Methicillin rezisztens Staphylococcus aureus (MRSA) törzsek ................................ 6 1.3.1. MRSA törzsek felosztása .................................................................................... 6 1.3.2. A methicillin rezisztencia kialakulása ................................................................. 7 1.3.2.1. A penicillin-kötő proteinek (PBP) megváltozásán alapuló rezisztencia .......... 7 1.3.2.2. A sejtfalképzés alternatív útján alapuló („BYPASS”) rezisztencia.................. 9 1.3.3. A Staphylococcus kromoszómális kazetta (SCCmec) ....................................... 10 1.3.4. mecA gént hordozó törzsek rezisztencia mértékük szerinti csoportosítása ....... 12 2. CÉLKITŰZÉSEK............................................................................................................ 14 3. ANYAG ÉS MÓDSZER ................................................................................................. 15 3.1. A vizsgálati anyagok begyűjtése .............................................................................. 15 3.2. A minták előkészítése, feldolgozása......................................................................... 17 3.3. Baktériumtörzs azonosítása ...................................................................................... 17 3.4. Biokémiai tulajdonságok vizsgálata ......................................................................... 18 3.5. Antibiotikum érzékenységi vizsgálatok ................................................................... 18 3.5.1. Előkészítés, inokulum készítése ........................................................................ 18 3.5.2. Korongdiffúzióval végzett érzékenységi vizsgálatok........................................ 19 3.5.3. Minimális gátló koncentráció (MIC) meghatározása ........................................ 20 3.5.4. Rezisztenciamechanizmusok vizsgálata ............................................................ 20 3.6. A vizsgált törzsek genotípusos jellemzése ............................................................... 21 3.6.1. Bioinformatikai módszerek ............................................................................... 21 3.6.2. Polimeráz láncreakció (PCR, polimerase chain reaction) ................................. 23 3.6.3. DNS agaróz gélelektroforézis............................................................................ 24 3.6.4. Fragmentizolálás................................................................................................ 25 3.6.5. DNS szekvenálás ............................................................................................... 25 4. EREDMÉNYEK ÉS MEGVITATÁSUK ....................................................................... 26 4.1. Biokémiai tulajdonságok és antibiotikum érzékenység vizsgálata........................... 26 4.2. Minimális gátló koncentráció meghatározása oxacillin E-teszttel ........................... 29 4.3. A rezisztencia mértékét változtatni képes törzsek fenotípusos vizsgálata ............... 30 4.4. A mec gének kimutatására........................................................................................ 31 4.4.1. A minták előkészítése amplifikációhoz ............................................................. 32 4.4.2. Megfelelő primerek kiválasztása, tervezése ...................................................... 33 4.4.3. A mecA gén kimutatása ..................................................................................... 34 4.4.4. A mecR1 és a mecI szekvenciák kimutatása...................................................... 35 4.4.5. A mecA promóter régió felsokszorozása ........................................................... 39 4.5. A magasabb rezisztenciára váltás molekuláris hátterének vizsgálata ...................... 39 4.5.1. A feltételezett mutáns mec régiók izolálása és szekvenciájuk meghatározása.. 39 4.5.2. A mec promóter régiók szekvenciájának elemzése ........................................... 40 5. ÖSSZEFOGLALÁS ........................................................................................................ 42 6. IRODALMI HIVATKOZÁSOK..................................................................................... 43 7. KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS ......................................................................................... 46 8. FÜGGELÉK .................................................................................................................... 47

2

1. IRODALMI BEVEZETÉS 1.1. A Staphylococcus genus A Staphylococcusok az emberi szervezet leggyakoribb opportunista kórokozói közé tartoznak. Felosztásuk időről időre változik. A genusba jelenleg 33 fajt sorolnak (Barcs I. és mtsi. 1999). A besorolás elsődleges alapja a vérplazmát kicsapó koaguláz enzim termelése. A makro- és mikromorfológiai jellegzetességekkel szemben a korszerű taxonómia molekuláris biológiai vizsgálómódszerek eredményeinek számítógépes feldolgozásán alapul. A fajok elkülönítése a G + C arány (nukleinsavban lévő bázisok aránya),

a

peptidoglikán

szerkezete,

a

fermentáció

során

keletkezett

tejsav

forgatóképessége alapján történik, melyek azonosítása biokémiai próbákkal végezhető el. A Staphylococcusok megtalálhatók az ember, emlősállatok, madarak bőrén és nyálkahártyáin. A fajok általában szűk gazdaspektrumot mutatnak, és a gazda kitüntetett anatómiai területét népesítik be. Az élettelen természetben, vagy más fajba tartozó gazda testfelületein nem telepednek meg tartósan. A genus orvosi mikrobiológiai szempontból legjelentősebb tagja a koaguláz-pozitív Staphylococcus aureus (újabb nevén S. aureus ssp. aureus),

az

ember

és

különféle

háziállatok

kórokozója.

A

koaguláz-negatív

Staphylococcusok elsősorban szaprofiták, de olykor súlyos kórképeket is kialakíthatnak.

1.2. A Staphylococcus aureus jellemzése 1.2.1. Morfológia, tenyésztés Gömb alakú, 0,5-1μm átmérőjű baktériumok, amelyek mikroszkóposan jellegzetes, leginkább szőlőfürtre emlékeztető szabálytalan csoportokat képeznek (staphylos = szőlő), innen kapták a nevüket. Váladékokban, klinikai mintákban jobbára egyesével vagy párosával elhelyezkedő Gram-pozitív coccusok. A S. aureus jól tenyészik egyszerű táptalajokon. 16-18 órás inkubálás után ad típusos telepeket. Véres agaron (Columbia agar) közepes nagyságú, kerek, ép szélű fényes, enyhén domború, vagy lapos telepekben nő. A telepek általában aranysárga, ritkábban fehér pigmenteket termelnek (1. ábra), gyakran erős β-típusú hemolízist mutatnak (2. ábra). A pigmenttermelés szobahőmérsékleten történő tenyésztéssel fokozható, a hemolízis megjelenését hosszabb inkubálás segíti elő.

3

1. ábra: A bal oldali lemezfotón tipikus aranysárga pigmenteket termelő telepeket, a jobb oldalon pedig fehér pigmenteket termelő Staphylococcus aureus subsp. aureus telepek láthatók véres agaron felnövesztve

2. ábra: Két azonos lemezfotó látható véres agarra kioltott S. aureus subsp. aureus telepekről, ahol a jobb oldali lemez alulról megvilágítva jól szemlélteti a telepek körül kialakult hemolitikus udvart (β-hemolízis)

1.2.2. Előfordulás, klinikai jelentőség A S. aureus egy gyakori baktérium, amelyet az emberi test rezidens flórájának lakójaként a felnőtt lakosság 20-40%-a hordozza a bőrén és az orrában, az elülső orrkagyló alatt. Az emberi szervezetbe kerülve néha fertőzést okoz. Ezek jellemzően bőr-és sebfertőzéseket okoznak, de kiválthat tüdő-, műtéti-, véráram-, szív-, csont- és egyéb invazív fertőzéseket is. Kórházi járványok kórokozójaként a methicillin rezisztens S. aureus (MRSA) világszerte súlyos gondot jelent. Előfordulásának gyakorisága emelkedik, már területen szerzett infekciókban is megjelent. Kórházi környezetből kiirtani rendkívül nehéz. Az újonnan felvett, a tenyésztés eredményéig elkülönített betegek orrváladékának szűrését és a személyzet kézmintáinak rendszeres ellenőrzését magába foglaló aktív megelőzéssel csökkenthető a járványok kialakulásának a veszélye.

4

1.2.3. A Staphylococcus aureus törzsek által termelt toxinok A S. aureus okozta fertőzések létrejöttében a törzsek enzim- és toxin természetű virulencia faktorai játszanak szerepet. A kataláz a fagocitákban képződő, a baktériumokra toxikus hidrogén-peroxidot inaktiválja. A koaguláz a fibrinogént fibrinné alakítja, ezáltal a vérplazmát megalvasztja. A koaguláz pozitív fajok (S. aureus, S. intermedius, S. delphinii, S. schleiferi ssp. coagulans) közül csak a S. auereus-ra jellemző a „clumping faktor”, a törzsek 90-95%-ának sejtfelszínén található fehérje, mely a fibrinogént és a fibrin monomereket adszorbeálja, ezáltal a sejtek agglutinációját okozza (Koneman et al. 1997). A proteinA a S. aureus törzsek 90%-ában a peptidoglikánhoz kapcsolódva fordul elő, termelhetik egyéb koaguláz-pozitív fajok is. A proteinA aspecifikusan reagál az IgG Fc fragmentumával, az opszonizációt és a komplement aktiválást gátolja. A koaguláza fibrin/fibrinogén kötő fehérje révén elfedi a felszíni antigéneket megakadályozva a felismerésüket. A fibrinolizin feloldja a fibrin rögöket, elősegítve az infekció átterjedését a szomszédos szövetekbe. A hialuronidáz a sejtek közötti mukopoliszacharid matrixot hidrolizálva szolgálja a szöveti inváziót. A lipázok a bőrben és a bőr alatti kötőszövetekben segítik elő a terjedését. A foszfolipáz C érzékenyíti a szöveteket a bioaktív komplement komponensekkel és a komplement aktiválódás termékeivel szemben, a felnőttkori respirációs distressz és a disszeminált intravaszkuláris koaguláció (DIC) kialakulásában játszik szerepet. A hőstabil nukleáz a S. aureus-ra jellemző enzim, ezen kívül csak a S. intermedius, egyes S. hyicus és S. schleiferi törzsek termelik 24 óra alatt kimutatható mennyiségben (Koneman et al 1997). A membránt károsító citotoxinok (α-,β-,γ-δ-hemolizin, leukocidin) és az epidermolitikus (exfoliativ) toxinok a kórokozó invázióját, szöveti terjedését biztosítják, hemolitikus hatásúak, vagy a fehérvérsejtek károsításán keresztül csökkentik a szervezet védekező képességét. Enterotoxin-termelő törzsek ételmérgezést okoznak. Jelenleg 6 enterotoxint különítenek el (A, B, C, D, E). A korábban enterotoxin F-ként ismert protein a toxikus shock syndroma toxinja (TSST-1), kimutatása fontos kiegészítője a klinikai diagnózisnak (Arbuthnott et al. 1990). A S. aureus törzsek kis hányada poliszacharidokból álló tokot képez. Ezek a törzsek ellenállóbbak a szervezet védekező mechanizmusaival és az antibiotikumokkal szemben. A tokanyag 8 szerotípusa ismert, a tokos klinikai izolátumok 70-80%-ában az ötös és nyolcas szerotípus mutatható ki. Ez a két szerotípus egyéb virulencia faktorokkal, leggyakrabban a TSST-1 termelésével is összefügg (Arbuthnott et al. 1990). 5

1.3. Methicillin rezisztens Staphylococcus aureus (MRSA) törzsek A methicillin rezisztens S. aureus (MRSA) törzsek világszerte súlyos gondot jelentenek. A törzsek előfordulási gyakorisága országról-országra igen változó: ÉEurópában 1% alatt van, míg a dél- és nyugat európai országokban akár 40% fölött is lehet. Romániában és Nagy-Britanniában a S. aureus törzsek akár 50%-a is methicillin rezisztens (Tiemersma et al.2004). Magyarországon az első MRSA által okozott járványt 1993-ban igazolták, azóta több mint száz igazolt esetről tudunk, illetve magas a sporadikus esetek száma is (Böröcz és mtsai. 2002). A saját és más hazai mikrobiológiai laboratóriumok adatai is azt mutatják, hogy növekvő tendenciát mutat az MRSA által okozott fertőzések száma. Az European Antimicrobial Resistance Surveillance System (EARSS) kiadványai alapján 2001 és 2005 között az MRSA által okozott véráramfertőzések aránya 5%-ról közel 20 %-ra emelkedett (SSHAIP TEAM 2005). Hazánkban komoly erőfeszítésre lesz szükség, hogy legalább késleltessük a már számos európai országra jellemző magas MRSA incidencia kialakulását. 1.3.1. MRSA törzsek felosztása A

CA-MRSA

(community-acquired,

vagy

community-associated)

törzsek

közösségekben fordulnak elő. Ezek elsősorban bőr és lágyrész infekciókat okoznak, ritkán súlyos, nekrotizáló pneumóniát, oszteomielitiszt, nekrotizáló faszcitiszt és szepszist. Legjellemzőbb mikrobiológiai sajátosságaik, hogy többnyire csak β-laktám rezisztensek. Jellegzetes virulencia faktoruk a Panton-Valentin-leukocidin és az SCCmec IV. vagy V. típusát hordozzák. A HA-MRSA (hospital-acquired) törzsek kórházban szerzett törzsek. A kórházakban az MRSA a vérbe, vagy a szervezet más szöveteibe gyakran az ellátás/kezelés, különösen az invazív beavatkozás során (műtét, injekció, gépi lélegeztetés) jut be. Az MRSA ezután helyi bőrfertőzést, vagy életveszélyes fertőzéseket (tüdőgyulladás, véráramfertőzés, műtéti fertőzés) okozhat. A fertőzés kockázatának csökkentése érdekében megelőző intézkedésekre (kézmosás, szűrés, antibiotikum helyes alkalmazása) van szükség. Tehát egészséges ember hordozó lehet, gyenge immunrendszerű egyénnek átadva azt megbetegítheti. A HA-MRSA törzsek az SCCmec I., II. vagy III. típusát hordozzák. Ezek a törzsek mind fenotípusosan, mind genotípusosan eltérnek a CAMRSA törzsektől.

6

1.3.2. A methicillin rezisztencia kialakulása Az MRSA rövidítés jelentése: methicillin/oxacillin (penicillinszármazékok) rezisztens S. aureus. A penicillin terápia bevezetésekor a S. aureus törzsek nagy többsége érzékeny volt a penicillinre. Az évek során állandóan szaporodott a rezisztens törzsek száma. A törzsek egy része penicillináz (béta-laktamáz) enzimet termel plazmidok által kódolva, amely a penicillint elbontja. A penicillinterápia következtében az érzékeny törzsek kiszelektálódtak és ma már a fertőzéseket csaknem mindig penicillinázt termelő rezisztens törzsek okozzák. Az idők folyamán a törzsek

jelentős részénél kialakult

nemcsak a penicillin-, hanem a methicillin-, oxacillin-, tetraciklin- vagy kloramfenikol rezisztencia is. Ha ezek együttesen fordulnak elő, akkor polirezisztens törzsről beszélünk. Az első MRSA törzset 1961-ben izolálták Angliában (Barber, 1961). A sejtfalszintézist katalizáló transzpeptidáz és karboxipeptidáz enzimekhez kötődő penicillin és származékai a peptidoglikán szintézisének elakadását eredményezik. Ezeket az enzimeket ebből következően az angolszász irodalom PBP (penicillin binding protein, penicillin-kötő fehérje) néven emlegeti. A methicillin rezisztens S. aureus baktériumban a PBP megváltozott szerkezetű formája van jelen, amelyhez a hatóanyag molekulája nem képes kötődni: a baktérium valamennyi penicillin- és cefalosporin-származékkal szemben rezisztenssé válik. Tehát olyan génre tettek szert, amely a penicillin-kötő fehérjét kódolja, ezáltal egyes antibiotikumokkal szemben ellenálló.

1.3.2.1. A penicillin-kötő proteinek (PBP) megváltozásán alapuló rezisztencia A PBP-k a β-laktamáz enzimekkel evolúciós és funkcionális rokonságban levő peptidázok. A baktérium citoplazma membránjában helyezkednek el. Számuk a baktérium fajra jellemző, jelölésük: molekulasúlyuk alapján számmal, vagy számmal és hozzátartozó betűvel történik. Egy faj adott számozású PBP-je genetikailag és biokémiailag nem azonos egy másik faj ugyanolyan számot viselő proteinjével. A PBP-k nélkülözhetetlen enzimek a sejtfal peptidoglikán szintézisében (transzpeptidázok, transzglikolázok), és mint ilyenek, a β-laktám antibiotikumok célmolekulái. Mivel a β-laktám antibiotikumok a sejtfal prekurzorok struktúr analógjai, a baktériumok sejtfalában a peptidoglikánok közötti keresztkötések kialakulását gátolják.

7

A penicillin β-laktám része ahhoz a transzpeptidáz enzimhez kötődik, mely a baktérium peptidoglikán molekuláit kötné össze. Az enzim így nem tud megfelelően működni és a baktérium sejtfala osztódás során meggyengül (másképp fogalmazva az antibiotikum citolízist, sejtpusztulást eredményez, mikor a baktérium megpróbál osztódni). Ezen felül a felhalmozódott peptidoglikán prekurzorok a baktériumban aktiválják a sejtfal hidrolázok működését, amelyek tovább rombolják a baktérium meglevő peptidoglikánját (Scott Williams 2004). Az enzim-antibiotikum komplex stabilitása és ily módon való detektálhatósága miatt hívják az egyébként a sejtfalépítésben részt vevő enzimeket penicillinkötő fehérjéknek. A β-laktám antibiotikumoknak a PBP-khez, valamint a βlaktamáz enzimekhez való kötődésének kezdeti lépései alapvetően hasonlóak (3. ábra).

3. ábra: A sejtfalszintézis befejező stádiumában közreműködő enzimek közös tulajdonsága, hogy penicillint és más β-laktám antibiotikumokat kötnek meg. A penicillinszármazékok strukturális alapja a β-laktám gyűrű. A baktériumok által termelt béta-laktamáz enzimek a penicillin β-laktám gyűrűjét hasítják, ami hatástalanná teszi a molekulát

8

A fő különbség az, hogy a β-laktamáz enzimek antibiotikumokhoz való kötődése labilis, vagyis az enzim a folyamat végén „kiszabadul” a kötésből, regenerálódik, ennek következtében az antibiotikum lebomlik, a baktérium az adott β-laktám antibiotikummal szemben rezisztens lesz. A PBP-k antibiotikumhoz való kötődése viszont stabil és a folyamat végeredménye, hogy maga a PBP inaktiválódik. A sejtfalépítésben esszenciális PBP inaktiválódása esetén a baktérium sejt pusztulása következik be. A vad típusú PBP fehérjék génjeiben végbemehetnek olyan módosulások, amelyek az enzimnek egy-, vagy több β-laktám antibiotikumhoz való kötődését gyengítik. Ezen esetekben a PBP-k a sejtfalszintézis folyamatában zavartalanul részt tudnak venni, ezért a baktérium rezisztenssé válik az adott β-laktám antibiotikummal szemben. Ilyen típusú rezisztenciát gyakrabban észlelünk a Gram-pozitív, mint a Gram-negatív baktériumok esetében.

1.3.2.2. A sejtfalképzés alternatív útján alapuló („BYPASS”) rezisztencia Ez a rezisztencia mechanizmus áll a Staphylococcus methicillinnel szembeni klasszikus rezisztenciájának a hátterében. A methicillin érzékeny Staphylococcus négy különböző PBP-vel rendelkezik, amelyek közül a PBP 1, 2, és 3 a sejtfalképzésben nélkülözhetetlenek. A β-laktám antibiotikumok, így a methicillin és az oxacillin is, ezekhez a fehérjékhez kötődnek. A methicillin rezisztens staphylococcusok egy további, számon felüli enzimet, a PBP2a-t is termelik. Ez az enzim gyengén kötődik a β-laktám antibiotikumokhoz és képes egymagában, a PBP 1, 2, és 3 inaktivált állapota esetén is részt venni a peptidoglükán szintézisében. Az ily módon képződött sejtfal ép, habár a peptidoglükán kevesebb keresztkötést tartalmaz, mint a methicillin érzékeny egyedé. A PBP2a-t a baktérium kromoszómáján elhelyezkedő mecA gén kódolja. A mecA gén feltehetően horizontális géntranszfer révén jutott be a staphylococcusok génállományába, és igen elterjedt mind a S. aureus, mind a koaguláz-negatív Staphylococcus törzsekben. A mecA gén regulációjában számos kromoszómális gén vesz részt. A PBP2a expressziója lehet indukálható vagy konstitutív. A mecA gén homogén, vagy heterogén formában fejeződhet ki. Az utóbbi esetében a baktérium populáció nagy része érzékeny, vagy mérsékelten érzékeny a methicillin iránt és csak a populáció kis része (egy 10 4-108 sejtből) szerzett magas szintű methicillin rezisztenciát.

9

1.3.3. A Staphylococcus kromoszómális kazetta (SCCmec) A staphylococcusok methicillin rezisztenciájának kialakulásáért elsősorban felelős PBP 2’ transpeptidase termelését a mecA gén kódolja. A mecA gén egy nagy mozgékonyságú kromoszómális szakaszon, az SCCmec kazettán (staphylococcal cassette chromosome mec) helyezkedik el, az MRSA törzsek kromoszómáján (4. ábra).

4. ábra: Az SCCmec II. típusú kazetta felépítése A kazetta tartalmazza az IS431 inszerciós szekvenciát, valamint az általa közrezárt pUB110 DNS elemet, amelyen a tobramycin rezisztencia van kódolva. Továbbá magába foglalja a mecA génkomplex elemeit, a mecI, mecR1 és mecA géneket, amelyek a methicillin rezisztenciáért felelősek. A Tn554 transzpozonon kódolt a makrolid, a linkozamin, a streptograminB és spectinomycin rezisztencia. Tartalmazza továbbá a ccr (casette chromosome recombinase) génkomplexet és a kazetta végein orfX géneket. Ezekből az adatokból világossá válik, hogy miért ilyen ellenálló ez a baktérium több antibiotikummal szemben (multidrog rezisztencia).

A mecA génkomplex, amelynek 2 osztályát azonosították (class A és B), a methicillin rezisztenciát kódoló gént (mecA) és annak kifejeződését szabályozó géneket (mecI, mecR1) tartalmazza. A ccr gén komplex (típusai: type 1, 2, 3) az elem kivágódásáért és más S. aureus törzsek kromoszómájába történő beépülésért felelős. A mecA és a ccr gén komplex alapján az SCCmec elem különböző típusait írták le (5.ábra).

10

5. ábra: Az SCC elemek strukturális összehasonlítása. A kazetták minden típusa tartalmaz két génkomplexet: a ccr zöld, a mec pedig lila színnel jelölt. Az illusztráció elemzésével következtethetünk az egyes típusok rezisztencia tulajdonságaira. A HA-MRSA törzsek (HA = hospital acquired) az első három típus valamelyikét, a közösségben terjedő MRSA törzsek (CA-MRSA, community-acquired) pedig a IV-es típust hordozzák. Az SCCmec elemek adatai a DDBJ / EMBL / GenBank adatbázis alapján Accession n: AB033763 (type 1B SCCmec), D86934 (type 2A.1 SCCmec), AB127982 (type 2A.2), AB037671 (type 3A SCCmec), AB063172 (type 2B.1 SCCmec), AB063173 (type 2B.2 SCCmec), AB096217 (type 2B.3 SCCmec), és AB121219 (type 5C).

11

1.3.4. mecA gént hordozó törzsek rezisztencia mértékük szerinti csoportosítása Valamely antibiotikum bakteriosztatikus hatásának kvantitatív jellemzésére a minimális gátló koncentráció (minimum inhibitory concentration – MIC) értéket használjuk. A MIC az antibiotikumnak az a legkisebb mennyisége, amely 1 ml térfogatban gátolja egy bizonyos baktérium törzs szaporodását. A mecA gént hordozó törzsek négy osztályba sorolhatók a megjelenő rezisztencia mértéke szerint. A 4. osztályba a homogén, magasfokú methicillin rezisztenciával rendelkező S. aureusokat sorolják (MIC 400-1000 μg/ml). A másik három osztályba a heterorezisztenseket sorolják: 1. osztály: MIC 1,5-3 μg/ml a populáció nagy részében, és 10-7-10-8 frekvenciával jelennek meg 25 μg/ml vagy annál nagyobb MIC értékkel rendelkező sejtek. 2. osztály: MIC 6-12μg/ml a populáció nagy részében, és 10-6-10-4 frekvenciával jelennek meg 25μg/ml vagy annál nagyobb MIC értékkel rendelkező sejtek. 3. osztály: itt már magas rezisztencia szinttel rendelkezik a populáció nagy része (50-200μg/ml), és 10-3-10-2 frekvenciával jelennek meg magas szintű rezisztens sejtek (300-400μg/ml). Az 1. és 2. osztályba tartozó törzsek gyakran alacsony szintű rezisztensnek, vagy methicillin érzékenynek is mutatkoznak a hagyományos fenotípusos vizsgálatok során. A mecA gén pozitív törzsekben a methicillin rezisztencia mértékét csökkentő, befolyásoló tényezők közül, a PBP2a termelődését szabályozó gének (mecI, mecR1) már jól ismertek. Ezek a mecA-val közös operonon találhatók és molekuláris szerveződésük, struktúrájuk és funkciójuk nagyon hasonlít a blaZ (S. aureus penicillináza) repressziós regulációját szabályozó két génhez (blaI, blaR1). Az aktív állapotú BlaI fehérje az operátor régióhoz kapcsolódva represszálja a β-laktamáz, a BlaR1 fehérje, valamint a saját transzkripcióját (6. ábra), ezért ezek a fehérjék antibiotikum hiányában csak alacsony szinten termelődnek. A penicillin megjelenése, kötődése a BlaR1 transzmembrán fehérjéhez, annak autokatalitikus aktiválódását idézi elő. Ez direkt, vagy indirekt úton a BlaI fehérje inaktiválásához vezet, és a represszió alól felszabadult gének transzkripciója felerősödik.

12

6. ábra: A β-laktamáz (blaZ) gén szabályozása a. I. A BlaI fehérje hozzákötődik az operátor régióhoz, megkezdődik a BlaZ, BlaR1-BlaI transzkripciója . II. A penicillin kötődik a BlaR1 fehérjéhez és autokatalitikus aktiválást idéz elő. III-IV. BlaI fehérje direkt vagy indirekt (egy másik proteinnel BlaR2) inaktiválásához vezet, a gének (blaZ, blaR1, blaI) transzkripciója megkezdődik. V. a blaZ kódolja az extracelluláris enzimet, VI. a penicillin hidrolizálja a β-laktám gyűrűt VI. ezáltal ez inaktívvá válik b. a S. aureus methicillin rezisztencia mechanizmusa. A PBP2a szintézise hasonló, mint az előbb leírt β-laktamázé. A mecR1 inaktiválja a MecI fehérjét, lehetővé válik a PBP2a szintézise. (Lowy FD 2003. Science of Medicine) Ilyenformán a mecA repressziós szabályozása is hasonló. A mecI-ben, vagy a mecA promóterében történő különböző mutációk idézhetik elő a magasfokú methicillin rezisztencia kialakulását. A két rendszer képes egymás szabályozására (koreguláció) is, tehát

egy

mecA

pozitív,

mecI

mutáns,

penicillináz

termelő

törzs

mutathat

heterorezisztenciát is. A másik rezisztenciát befolyásoló tényező a sejtfal szintézishez szükséges egyéb fehérjék jelenléte, illetve hiánya. A fem („factors essential for methicillin”) faktorok az oligopeptid oldalláncok szintézisében játszanak szerepet. Bármelyik hiánya a rezisztencia mértékét jelentősen csökkenti a mecA pozitív törzsekben. 13

2. CÉLKITŰZÉSEK Munkámban az alábbi feladatokat tűztük ki célul: 1. Nozokomiális fertőzésekből származó különböző minták mikrobiológiai vizsgálata, - methicillin rezisztens S. aureus kimutatása a laboratóriumi diagnosztikában klasszikus bakteriológiai vizsgálatokkal, - az izolált törzsek multidrog rezisztencia vizsgálata különböző antibiotikum érzékenységi módszerekkel, - az egyes módszerek kiértékelése, a vizsgált törzsek rezisztencia mértéke szerinti osztályokba sorolása. 2. Célunk volt a mec gének meglétének megerősítése molekuláris genetikai vizsgálatokkal, - kromoszómán kódolt, az SCCmec kazettán található mecA génkomplex génjeinek kimutatása PCR technológiával. 3. Mutációk keresése a rezisztencia mértékét változtató törzsekben mecI génben és a mecA promóter régióban DNS-szekvencia meghatározással. 4. A mutációk elemzésével a másodlagos rezisztencia mechanizmusának vizsgálata, ezzel új információt szolgáltatva a heterogén expresszió folyamatának megértéséhez.

14

3. ANYAG ÉS MÓDSZER 3.1. A vizsgálati anyagok begyűjtése Az általam MRSA-nak azonosított mikroorganizmusok kórházban fekvő betegektől származnak, azaz kórházban cirkuláló (HA-MRSA) törzsek. A minták izolálási helyei: Bajai Szent Rókus Kórház (Bakteriológia), Kalocsai Kórház (Bakteriológia), PTE ÁOK Orvosi

Mikrobiológiai

és

Immunitástani

Intézet,

Bakteriológiai

Diagnosztikai

Laboratórium (dr. Mestyán Gyula). A vizsgált minták típusai: decubitus, garat, trachea, köpet, seb, vizelet, fisztula, orr, kanül, haemokultúra, bronchus, fül és genny. Összesen 62 izolátumot vizsgáltunk. A kalocsai illetve a pécsi intézetekből származó izolátumok klasszikus bakteriológiai módszerekkel vizsgált és bizonyítottan methicillin rezisztens S. aureus törzsekként kerültek hozzánk további molekuláris vizsgálatra. A kísérlet során pozitív kontrollként Staph. aureus ssp. aureus (HNCMB 112014) ATCC 33591, negatív kontrollként pedig Staph. aureus ssp. aureus (HNCMB 112011) ATCC 25923, törzseket alkalmaztunk, melyeket az Országos Epidemiológiai Központon keresztül (Orvosi Baktériumok Magyar Nemzeti Gyűjteménye (HNCMB) Bakteriológiai II. Osztály Termékellenőrzési Egység) szereztünk be. A vizsgált törzsek jegyzékét és tulajdonságait az 1. táblázat ismerteti. 1. táblázat: A vizsgált törzsek jegyzéke, tulajdonságai, mintavételi helye Minta száma

reziMinta típusa ns

Izolálási helye

145K

seb

Kalocsai Kórház

711K

köpet

Kalocsai Kórház

766K

köpet

Kalocsai Kórház

795K

torok

Kalocsai Kórház

927K

trachea

Kalocsai Kórház

967K

torok

Kalocsai Kórház

991K

torok

Kalocsai Kórház

1017K

köpet

Kalocsai Kórház

1265K

köpet

Kalocsai Kórház

1340K

köpet

Kalocsai Kórház

15

1. táblázat: (folytatás) Minta száma

reziMinta típusa ns

2902 B

torok

Bajai Szt. Rókus Kórház

3273 B

Seb

Bajai Szt. Rókus Kórház

3393 B

haemokultúra

Bajai Szt. Rókus Kórház

2801 B

vizelet

Bajai Szt. Rókus Kórház

2608 B

orr

Bajai Szt. Rókus Kórház

3612 B

hüvely

Bajai Szt. Rókus Kórház

3835 B

seb

Bajai Szt. Rókus Kórház

4469 B

haemokultúra

Bajai Szt. Rókus Kórház

7073 B

bronchus

Bajai Szt. Rókus Kórház

5377 B

vizelet

Bajai Szt. Rókus Kórház

5146 B

seb

Bajai Szt. Rókus Kórház

7254 B

fül

Bajai Szt. Rókus Kórház

6354 B

haemokultúra

Izolálási helye

Bajai Szt. Rókus Kórház

32959 P

vizelet

PTE ÁOK

41902 P

genny

PTE ÁOK

34799 P

seb

PTE ÁOK

41672 P

orr

PTE ÁOK

36107 P

seb

PTE ÁOK

6110 P

garat

PTE ÁOK

5650 P

garat

PTE ÁOK

6153 P

garat

PTE ÁOK

1444 P

köpet

PTE ÁOK

40756 P

seb

PTE ÁOK

32536 P

vizelet

PTE ÁOK

39303 P

kanül

PTE ÁOK

43101 P

ulcus

PTE ÁOK

6527 P

fistula

PTE ÁOK

6435 P

seb

PTE ÁOK

2554P

seb

PTE ÁOK

2048P

trachea

PTE ÁOK

532P

trachea

PTE ÁOK

16

1. táblázat: (folytatás) Minta száma

reziMinta típusa ns

Izolálási helye

2893 P

seb

PTE ÁOK

2492 P

vizelet

PTE ÁOK

5703 P

garat

PTE ÁOK

1031 P

decubitus

PTE ÁOK

5557 P

kanül

PTE ÁOK

6525 P

kanül

PTE ÁOK

ATCC33591

-

HNCMB1

ATCC 25923

-

HNCMB1

A törzsek vizsgálati eredményeit a Függelék 3., 4., 5. táblázatok ismertetik. 1 Orvosi Baktériumok Magyar Nemzeti Gyűjteménye (HNCMB)

3.2. A minták előkészítése, feldolgozása A minta típusának, származási helyének, a közölt klinikai tüneteknek és diagnózisnak ismeretében megtörtént a vizsgált baktérium törzsek species szintű azonosítása, a fajnak megfelelő biokémiai próbák elvégzése. A vizsgálati anyag laboratóriumba érkezését követően minél rövidebb idő alatt feldolgozásra került. Munkánk során dúsító táptalajként tripton-szója bouillont (TSB), szilárd táplemezként columbia agart (COS) és MRSA agarchromid táptalajt használtunk. Ezt követően inkubálás céljából megfelelő atmoszférát és hőmérsékletet biztosító termosztátba helyeztük a táptalajokra oltott anyagokat.

3.3. Baktériumtörzs azonosítása A feldolgozott vizsgálati anyagból 18-24 órás inkubálás után a S. aureus azonosítása columbia agaron történt. (Columbia agar: kazein és állati szövetek enzimatikus hidrolízisével nyert peptonokban gazdag, marhahús kivonatot és keményítőt tartalmaz, a táptalajt általában vérrel egészítik ki). Ezen a legjellegzetesebb a morfológia, 2-3 mm átmérőjű szabályos kerek, sima és fényes felszínű. Pigmenttermelése következtében a telep színe aranysárga, szürkésfehér, vagy porcelánfehér, a telepeket általában hemolitikus udvar vesz körül (β-hemolízis)(1., 2. ábra).

17

3.4. Biokémiai tulajdonságok vizsgálata Biokémiai tulajdonságok vizsgálatára szolgáló próbák S. aureus azonosításakor: 1. Kataláz-próbát végeztünk 30%-s hidrogén-peroxid (H2O2) oldattal, tárgylemez módszerrel. A S. aureus légzésének végtermékeként H2O2 keletkezik, a minta kataláz pozitivitást mutat. 2. Clumping-próba (kötött koaguláz). A S. aureus koaguláz enzimet termel, amely megalvasztja a vérplazmát. A koaguláz pozitív törzs olyan anyagot, clumping faktort hordoz sejtfelszínéhez kötötten, amely a tárgylemezen az alvadásban gátolt vérplazmában azonnal durva kicsapódást okoz (koaguláz-pozitív) (BioMerieux). 3. PBP2a gyorsteszt: methicillin rezisztens S. aureus kimutatására latex agglutinációs gyorstesztet alkalmaztunk, PBP2’(penicillin binding protein 2’) detektálása alapján. A bevont latexnél agglutináció látható (BioMerieux).

3.5. Antibiotikum érzékenységi vizsgálatok Az antibiotikum érzékenységi vizsgálatokat a Clinical and Laboratory Standards Institute/National Committee for Clinical Laboratory Standards (CLSI/NCCLS), valamint az European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing (EUCAST) aktuális évi, érvényben lévő nemzetközi ajánlásai alapján végeztük és interpretáltuk. A vizsgálatok kivitelezése az ajánlásoknak megfelelően kontroll törzsekkel, ellenőrzött táptalajokon, nemzetközi standardoknak megfelelő körülmények között történtek, korongdiffúziós módszerrel, valamint E-teszttel. A vizsgálat célja bakteriális infekcióban szenvedő betegek mintáiból kitenyészthető feltételezett kórokozók antibiotikumokra való érzékenységének, egyúttal az egyes antibiotikumokkal szemben szerzett másodlagos rezisztenciájának meghatározása, az adott baktériumra szokásosan hatékony szerek alkalmazásával.

3.5.1. Előkészítés, inokulum készítése A gátlóanyagot nem tartalmazó táptalajról 3-5 nagyobb, vagy ennél több kisebb izolált telepet kisfejű steril kaccsal megérintve, majd 3 ml steril fiziológiás NaCl oldatba helyezve 0,5 McFarland sűrűségű szuszpenziót készítettünk. A szuszpenzió sűrűségét kalibrált denzitométerrel (Densimat-BioMerieux)) állítottuk be. 18

Az elkészített szuszpenziót 15 percen belül a vizsgálandó speciesnek megfelelő táptalajra oltottuk (CLSI/NCCLS). Erre a gyártó által beállított kation koncentrációjú Mueller-Hinton táptalajt használtunk. Leoltás előtt a szuszpenziót rázógéppel homogenizáltuk. Ezt követően 100 μl szuszpenziót vittünk a táptalaj felszínére. A felvitt szuszpenziót steril vattapálcával egyenletesen elterítettük az agar felszínén. A leoltott lemezekre felhelyeztük az antibiotikum tartalmú korongokat és 15 perc elő-diffúziós idő után termosztátba kerültek. A CLSI által megadott inkubációs hőmérséklet a staphylococcusok esetén 33-35oC közé esik, mert a methicillin rezisztenciája jobban kifejeződik. A lemezeket normál légterű termosztátban inkubáltuk 16-18 órán keresztül. Az oxacillin érzékenység vizsgálatakor az inkubációs idő teljes 24 óráig tartott.

3.5.2. Korongdiffúzióval végzett érzékenységi vizsgálatok Korongokat steril eszköz segítségével enyhe nyomással, illetve diszpenzerrel juttattuk a leoltott táptalajok felszínére. 90mm átmérőjű Petri-csészén 5 korongot helyeztünk el. Adott species esetében a vizsgálandó antibiotikumok körét az aktuális, jelenleg a CLSI/NCCLS és az ezt figyelembevevő Mikrobiológiai Körlevél ajánlása alapján alkalmaztuk. A korongdiffúziós vizsgálatok során az alábbi antibiotikum korongok (Oxoid) kerültek felhasználásra: gentamicin 10μg, cefuroxim 30μg, sumetrolim 25μg, doxycyclin 30μg, amoxicillin/clavulansav 20/10μg, ciprofloxacin 5 μg, oxacillin 1μg, penicillin 10 units, erythromycin 15μg, clindamycin 2μg, vancomycin 5 μg, teicoplanin 30μg, cefoxitin 30μg, rifampicin 5μg. A kapott zónaátmérőt a kontroll törzsekkel végzett, standardizált körülmények között kapott eredményekhez hasonlítva érzékeny (E), mérsékelten érzékeny (M) és rezisztens (R) eredményt kaptunk. Az összegzéseknél a baktériumoknak az adott antibiotikumra való érzékenységének megadásakor két kategóriát használtunk: érzékeny és nem érzékeny (érzékeny és rezisztens). A kategóriák megállapítása a kapott gátlási zónák értékelése (CLSI M100-S15 M2 Disc diffusion 2A-D táblázataiban) a megadott értékhatárok alapján történt (2. táblázat). A vizsgálat eredményeit a Függelék 3. táblázata tartalmazza.

19

2. táblázat: Korongdiffúziós határértékek S. aureus-ra megállapítva Antibiotikum

rRezisztens

Mérsékelt

Érzékeny

Gentamycin 10μg

<12

13-14

>15

Cefuroxim 30μg

<14

15-17

>18

Sumetrolim 25μg

<10

11-15

>16

Doxycyclin 30μg

<12

13-15

>16

Amoxic./clav. 20/10μg

<19

-

>20

Ciprofloxacin 5 μg

<15

15-20

>21

Oxacillin 1μg

<10

-

>13

Penicillin 10 units

<28

-

>29

Erythromycin 15μg

<13

14-22

>23

Clindamycin 2μg

<14

15-20

>21

Vancomycin 5 μg

-

-

MIC

Teicoplanin 30μg

<10

11-13

>14

Cefoxitin 30μg

<21

-

>22

Rifampicin 5μg

<16

17-19

>20

3.5.3. Minimális gátló koncentráció (MIC) meghatározása MIC érték meghatározása E-teszttel – az oxacillin MIC értéket az antibiotikumot meghatározott koncentráció grádiensben tartalmazó csíkokkal, a gyártó előírásának megfelelően határoztuk meg (BioMerieux) (Függelék 4. táblázat). Az inkubációs idő letelte után kiértékeltük, „leolvastuk” az antibiotikum érzékenységi vizsgálat lemezeit, illetve megvizsgáltuk a kialakult gátlási zónák határait, alakját.

3.5.4. Rezisztenciamechanizmusok vizsgálata Klasszikus típusú rezisztencia azaz mec génnel rendelkező törzsek esetén, a baktériumok rezisztensek a penicillinázrezisztens penicillinekkel (PRP) szemben (methicillin, oxacillin) és a rezisztencia expressziójában vagy homogének, vagy heterogének.

20

Homogén expresszió esetében gyakorlatilag az összes sejt rezisztenciát mutat a hagyományos in vitro tesztek során. Heterorezisztens expresszió esetén az egyes sejtek érzékenynek, más sejtek pedig rezisztensnek mutatkoznak. Gyakran a vizsgált sejtpopulációban 104-108 sejt közül csak egy mutat rezisztenciát. A heterogén expresszió esetenként határeseti MIC értéket eredményez, például oxacillin esetében 4-8 μg/ml-es MIC értéket. A klasszikus rezisztenciával rendelkező izolátumok általában rezisztensek más szerekre, így az erythromycinre, a clindamycinre, a chloramphenicolra, a tetracyclinre, a trimethoprin-sulfamethoxazol kombinációra, a kinolokra és az aminoglikozidokra. A βlaktamáz fokozott termelése és a módosított PBP jelenléte által okozott rezisztencia is általában határeseti rezisztenciát eredményez. A β-laktamáz fokozott termelése, vagy a módosított PBP jelenléte miatt rezisztens izolátumoknál általában nincs többszörös rezisztencia. A baktériumpopuláción belül másodlagosan kialakuló rezisztens telepek megjelenése heterorezisztenciát igazol. A gátlási zónán belül növekedő telepet újra véres agarra szélesztettük, a rezisztenciavizsgálatot a szélesztett és az eredeti törzs színtenyészetéből újra elvégeztük (3.5.2; 3.5.3 fejezet). A tiszta tenyészet ismételt benövése után a gátlási zónán belüli telepekből 3-3 telepet izoláltunk. A tenyészetet véres agaron rezisztens sejtvonalra tisztítottuk. A tisztított törzseknél is elvégeztük a fenotípusos vizsgálatokat (MIC, PBP2a), és egyéb rezisztenciát megerősítő molekuláris vizsgálatot, vagyis a törzsek mec génjeit megvizsgáltuk. Az így kapott eredményeket összevetettük az eredeti törzs rezisztencia adataival (Függelék 5. táblázat). A magasfokú rezisztencia kialakulását különböző mutációk idézhetik elő. A mutációk felderítéséhez szükség volt az eredeti sejt és azok utódsejtjeinek egyéb molekuláris vizsgálatára.

3.6. A vizsgált törzsek genotípusos jellemzése

3.6.1. Bioinformatikai módszerek A Staphylococcus aureus (strain MRSA 252, AC: BX571856) genom szekvenciáját az NCBI (National Center for Biotechnology Information) nukleotidszekvencia adatbázisából (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/2861157), kerestük ki.

21

A teljes S. aureus genom szekvenciájából a mecA génkomplex szekvenciája a függelék 8. táblázatában került bemutatásra. Az SCCmec teljes szekvenciája ismert, ezért a primerek tervezéséhez a genom adatbázisokban (PrimerStat http://www.bioinformatics.org/sms2/pcr_primer_stats.html) található DNS szekvenciákat vettük alapul. A mecA génkomplex szekvenciájának ismeretében primerpárosokat terveztünk. Úgynevezett belső primereket a mecA, mecR1 és mecI régiókra, illetve további primereket mecA promóter és mecI mutációkhoz. A kísérlet során mindösszesen egy referencia primert használtunk (Staphylococcus aureus strain ATCC 33591 penicillin binding protein GenBank: AC: FJ810876.1 PCR primers, 6. táblázat) a struktúrgén régióra, amely 1459 bp hosszúságú szakasz megsokszorozását eredményezte.

6. táblázat: Az alkalmazott primerek tulajdonságai és a várható PCR termék mérete. Primer név

Primer szekvencia 5’- 3’

Tm

PCR termék méret

mecA fw CAAGATATGAAGTGGTAAATG 1 50oC 663 bp mecA rev CGTATTTTTTATTACCGTTCTC 1 _________________________________________________________________________ mecR1 fw ATAATCAGTTCATTGCTCACG 1 56oC 769 bp 1 mecR1 rev CACCATAACGTATATGTTCATG _________________________________________________________________________ mecA fw2 TCATAGCGTCATTATTCCAGG 2 58oC 1459 bp 2 mecA rev2 AATTTGTCTGCCAGTTTCTCCT mecA rev3 TTGAGGGTGGATAGCAGTAC 1 58oC 676 bp _________________________________________________________________________ mecI1R CTGGTGTTATTACAAGCATTATTG 1 58oC 588 bp 1 mecRI GCGAAGACAATGCGAATG mecI2R GACTTGATTGTTTCCTCTGTT 1 495 bp 1 o mecI3R TTCTCAATTATTCTATTTCATCTTG 50 C 425 bp _________________________________________________________________________ mecRA AATGGAATTAACGTGGAGAC 1 58oC 678 bp 1 mecAR CTGGAATAATGACGCTATGAT _________________________________________________________________________ 1

Általunk tervezett primerek, 2 Staphylococcus aureus strain ATCC 33591 penicillin binding protein GenBank: AC: FJ810876.1 PCR primers

22

A megfelelő primerek kiválasztása, megtervezése a sikeres PCR legfontosabb előfeltétele. A tervezésnél figyelembe vettük, hogy közel azonos olvadási hőmérséklettel rendelkezzenek, illetve ne képezzenek másodlagos szerkezetet, és stabilan kötődjenek a DNS régiókhoz (GC: AT arány). A vizsgálatokhoz alkalmazott primerek részletezését a 6. táblázat tartalmazza. Összesen 13 primerrel végeztünk elemzést (6. táblázat), és minden olyan reakciót, amelyekben a primerek nem, vagy nem elég meggyőzően működtek többször megismételtünk.

3.6.2. Polimeráz láncreakció (PCR, polimerase chain reaction) A S. aureus törzsek methicillin rezisztenciáját a mecA gén PCR amplifikációjával vizsgáltuk. A PCR reakciók összeállítását és az automatizált polimerizációt az 7. táblázat ismerteti. Továbbá tanulmányoztuk a mecR1 gén jelenlétét, illetve esetleges mutációk felderítésére a mecIR és mecRA szakaszokat is vizsgáltuk (12. ábra). A vizsgálatokhoz az előzőekben leírt specifikus primereket használtuk. A mecA génkomplex kimutatásánál a baktériumokat többféle módszerrel készítettük elő az amplifikáláshoz. i) A baktériumtörzsek egyéjszakás véres agar tenyészetéből 1-2 telepet elszuszpendáltunk 100 μl steril desztillált vízben (kolónia PCR). Szemre gyenge denzitású baktérium szuszpenziót képezve (kb.0,1-0,3 OD). ii) Egy másik eljárás során „részleges sejtfeltárást” végeztünk, úgy, hogy az előzőleg említett módon előkészített szuszpenziót egy percig mikrohullámú sütőben melegítettük. iii) A harmadik módszer egy erőteljesebb feltárási mód volt detergensekkel. A mecIR és mecRA gének kimutatásánál már kizárólagosan a feltárt sejtekkel („nyers lizátum”) dolgoztunk. A baktériumtörzsek véres agar tenyészetéből 1 közepes telepet 100 μl emésztő pufferben (20 mM TRIS, - pH: 7.5, 0,01% zselatin, 0,5% TritonX-100, 0,5% Tween 20) elszuszpendáltunk, majd 6 μl Proteináz K oldatot adtunk hozzá, és 56oC-on egy órát át, majd 95oC-on 10 percig inkubáltuk. 1 perc centrifugálás után (12000 rpm), majd a DNS tartalmú felülúszót -20oC-on tároltuk.

23

A PCR reakciók összeállítása az alábbiak szerint történt: 4x PCR mix törzsoldat Steril desztillált víz

6 μl 16 μl

Felső primer

1 μl

Alsó pimer

1 μl

Taq polimeráz

0,5 μl

_________________________ Végtérfogat

24 μl

Baktérium szuszpenzió + 1 μl

7. táblázat: Az automatizált polimerizáció a következő programbeállítás szerint történt mecA

mecR1

mecA2

mecA3

mecIR

mecRA

mecI3

1

95oC 2:00

95oC 2:00

94oC 2:00

94oC 2:00

94oC 2:00

94oC 2:00

94oC 2:00

2

95oC 0:30

95oC 0:30

94oC 0:30

94oC 0:30

94oC 0:30

94oC 0:30

94oC 0:30

3

56oC 0:30

56oC 0:30

58oC 0:30

58oC 0:30

58oC 0:30

58oC 0:30

50oC 0:30

4

72oC 0:40

72oC 0:40

72oC 1:30

72oC 0:40

72oC 0:40

72oC 0:40

72oC 0:30

5

33x go to step 2.

33x go to step 2.

33x go to step 2.

33x go to step 2.

33x go to step 2.

33x go to step 2.

33x go to step 2.

6

END

END

END

END

END

END

END

Az amplifikációt Little Genius BIOER, PTC-200 Peltier Thermal Cycler és S1000 Thermal Cycler készülékekkel végeztük.

3.6.3. DNS agaróz gélelektroforézis A DNS fragmentek elválasztását agaróz gélelektroforézis alkalmazásával végeztük. Az elválasztásra szánt fragmentek méretétől függően 1,5% és 2%-os agaróz gélt használtunk. A gélekhez etidium-bromid oldatot adtunk a kiöntés előtt, 0,1 μg/ml végkoncentrációban. A DNS molekulák elválasztása TBE pufferes közegben történt (89 mM Tris, 89 mM Bórsav, 2 mM EDTA).

24

A DNS mintákhoz (általában 8μl végkoncentrációban) 2 % ficoll-400, 50 mM EDTA (pH 8.0), 0.04 % brómfenolkék „STOP-oldatot” adtunk. Minden gélen 100 bp-os Ladder szolgált DNS méret standardként. A gélelektroforézist 60-125 V feszültségen végeztük. A DNS fragmentek jelenlétét UV fénnyel tettük láthatóvá. A gélképeket UVP BioDoc It készülékkel rögzítettük. A kísérlet során minden gélen az első oszlopban pozitív kontrollként S. aureus ATCC 33591 törzsazonosító kódszámú, a második oszlopban negatív kontrollként S. aureus ATCC 25923 törzsazonosító kódszámú törzseket alkalmaztunk.

3.6.4. Fragmentizolálás A PCR reakcióval előállított DNS fragmenteket gélelektroforézissel tisztítottuk. 2 órás, 40V feszültség melletti elválasztás után az izolálni kívánt fragmentum elé UV fény alatt a gélbe bemetszést ejtettünk és a résbe megfelelő méretű Whatman DE 81 papírt helyeztünk. Majd további 20 percig 40 V feszültség melletti elektroforézis után az izolálandó fragmentum a papírra kerül. A papírt eppendorf csőben 50 μl 1M nátrium-klorid oldattal mostuk le kétszer egymás után. A DNS kicsapása 10 μl 3M nátrium-acetát oldattal (pH:7,0) és 80 μl izo-propanol alkohollal történt. Inkubálás -20 oC-on over night. Második napon 5 perc centrifugálás (12000rpm) után mosás 70%-os etanollal, majd újabb 5 perces centrifugálás (12000rpm) után szárítás. A csapadékot 20 μl steril desztillált vízben oldottuk fel. Általában 5 μl mintát ellenőriztünk agaróz gélen.

3.6.5. DNS szekvenálás Az izolált PCR fragmenteket DNS-szekvencia meghatározás céljából az MTA Szegedi Biológiai Központ DNS Szekvenáló Laboratóriumába küldtük el. A szekvenálási vizsgálatokkal megbízható, összevethető eredményt kapunk a nukleotid sorrendre vonatkozóan. A reakcióhoz használt oligonukleotidokat a 6. táblázat foglalja össze. A szekvenálásra a heterogén expresszió jelenségét mutató törzsek közül 4 eredeti törzset és azok tisztított sejtvonalaiból 5 törzset választottuk ki a kapott rezisztencia értékek alapján.

25

4. EREDMÉNYEK ÉS MEGVITATÁSUK 4.1. Biokémiai tulajdonságok és antibiotikum érzékenység vizsgálata Munkánk során összesen 62 izolátumot vizsgáltunk, beleértve a rezisztens sejtvonalra tisztított törzseket, illetve a kontrollként alkalmazott pozitív és negatív törzsgyűjteményi törzseket is (a törzsek tulajdonságait az 1. táblázat ismerteti). Első lépésben a feldolgozott vizsgálati anyagokból megfelelő inkubálási idő (24 és 48 óra) után történt a S. aureus azonosítása columbia agaron. A telepek minden esetben S (smooth) típusú, szabályos, kerek szélű, általában domború, többségben szürkésfehér, kis számban porcelánfehér és aranysárga (1. ábra) pigmentet termeltek. 92%-ban a telepek körül kifejezett β-hemolitikus udvar (β-hemolízis) volt látható (2. ábra). A felnőtt telepeken biokémiai tulajdonságokon alapuló próbákat végeztünk, melyek a következők voltak: kataláz próba, Clumping- próba, PBP2a kimutatása (monoklonális antitesttel). Noha a pécsi és a kalocsai intézetekből átvett törzsek bizonyítottan methicillin rezisztens S. aureus törzsekként kerültek intézetünkbe, bizonyos fenotípusos vizsgálatokat el kellett végezni, illetve pontos adatok hiánya miatt szükséges volt megismételni. A próbák során minden mintánál jelen voltak a S. aureus-ra jellemző biokémiai tulajdonságok, azaz az összes minta kataláz pozitív volt, és endokoaguláz (clumping faktor) próbája során pozitív reakciót adott. A penicillinkötő proteinek (PBP) megváltozásán alapuló rezisztencia kimutatása során minden törzs (a negatív kontroll törzs: Staph. aureus ssp. aureus ATCC 25923 kivételével) pozitív eredményt adott. A kapott eredmények bizonyították, hogy az izolátumok mind methicillin rezisztens S. aureus törzsek. Az MRSA törzsek methicillin rezisztencia szerinti csoportosítása (klasszikus, „borderline” és preMRSA) és a rezisztencia mértékének meghatározása miatt második lépésben antibiotikum érzékenységi vizsgálatokat végeztünk. A meghatározásokat a CLSI/NCCLS és EUCAST aktuális évi és érvényben lévő nemzetközi ajánlásai alapján korongdiffúzióval és oxacillin E-teszttel végeztük, az eredményeket a szakma szabálya szerint (2. táblázat, Függelék 3. táblázat) értékeltük. A methicillin (oxacillin) rezisztencia kimutatásában rendhagyó módon igen nagy az egyetértés. A kiértékelésnél az érzékeny (E) és rezisztens (R) kategóriák szerint csoportosítottunk az EUCAST és CLSI ajánlásának megfelelően.

26

A mérsékelten érzékeny kategória megítélése már nem egységes (Goldstein 1994), ezért kiértékelésünk során csak érzékeny és rezisztens besorolást alkalmaztunk. Érzékenynek tekintettük a baktériumot, ha a szokásos adagolás mellett kialakuló koncentráció elegendő az in vivo antibakteriális hatás kialakításához. Rezisztensnek tekintettük a baktériumot, ha a szervezetben antibakteriális koncentráció nem alakítható ki. A korongdiffúziós vizsgálat (7. ábra) során az alábbi antibiotikum korongok kerültek felhelyezésre: gentamicin, cefuroxim, sumetrolim, doxycyclin, amoxicillin/clavulansav, oxacillin, penicillin, erythromycin, clindamycin, vancomycin, teicoplanin, cefoxitin és rifampicin. Az antibiotikum koncentrációt és a korongdiffúziós határértékeket a Függelék 3. táblázata ismerteti.

7. ábra: Korongdiffúziós vizsgálat eredményeként: erythromycin, clindamycin, penicillin, gentamycin, ciprofloxacin, cefuroxim, amoxicillin/clavulansav rezisztens fenotípus (6110P számú törzs) A kapott gátlási udvar kiértékelése után kiderült, hogy az összes törzs érzékeny a glikopeptidekre (vancomycin, teicoplanin), illetve a rifampicinre. Aminoglikozidokra (gentamicin) a vizsgált törzsekben 89%, szulfonamidokra (sumetrolim) és tetracyclinre (doxycyclin) 97% volt érzékeny. A törzsek kis részében (8%) bizonytalan érzékenység mutatkozott számos β-laktám antibiotikum, elsősorban a cefalosporinok iránt. A jelenségre a feltételezett magyarázat: i) a heterorezisztencia jelensége miatt az egyéb β-laktám antibiotikumokkal szembeni rezisztencia még nehezebben detektálható, mint a methicillinnel szembeni rezisztencia ii) az egyéb β-laktám antibiotikumoknak a PBP2a termelését indukáló hatása in vitro gyengébb, mint in vivo.

27

Mivel a jelenleg rendelkezésre álló β-laktám antibiotikumok kötődése igen eltérő mértékű a PBP2a enzimhez, ezért a mecA gén kódolta, klasszikus methicillin rezisztens staphylococcusokat minden β-laktám antibiotikummal szemben rezisztensnek kell tekinteni (CLSI és EUCAST kritériuma alapján). Tehát ezek alapján rezisztensnek tekintettük a vizsgált törzseket β-laktamáz gátlókkal összeállított aminopenicillinre (amoxicillin/clavulansav), penicillinre és a cefalosporinokra (cefuroxim). Az MRSA gyakran mutat rezisztenciát egyéb antibiotikum családokkal szemben, ez a mi esetünkben is bebizonyosodott. Rezisztenciát mutattunk ki a kinolokra (ciprofloxacin) 95%-ban, a makrolidokra (erythromycin) 89% és a lincozamidokra (clindamycin) 60%-ban. Az erythromycin rezisztens és clindamycin érzékeny törzsek között 11 törzsben indukálható fenotípust találtunk, ezért a CLSI ajánlása szerint a kapott pozitív D-teszt eredmény (8. ábra) miatt mind az erythromycinre, mind a clindamycinre rezisztensnek tekintettük ezeket a törzseket.

8. ábra Pozitív D-tesz (indukálható clindamycin rezisztencia, 532P számú törzs) Mivel a hagyományos penicillinszármazékokra ma már a legtöbb Staphylococcus penicillináztermelő rezisztenciát hozott létre, ezért szükségessé vált ezen staphylococcusok elleni penicillinek kifejlesztése. A methicillin (ma már nem használják) volt az első képviselő, ma ebbe a csoportba tartozik az oxacillin. Ezek a szerek az MRSA törzsek ellen szintén nem hatnak. A tesztet 1 μg tartalmú oxacillin koronggal végeztük Mueller-Hinton agaron 35oC-on pontosan 24 órán át. Újabb ismeretek alapján a cefoxitin tartalmú korongdiffúziós vizsgálat nagyobb segítséget nyújt a „klasszikus” MRSA törzsek elkülönítésében a hagyományosan használt 1 μg-os oxacillin korongnál, mert a cefoxitin jobban indukálja a PBP2a fehérjéért felelős mecA gén kifejeződését (Bouchillon 2004).

28

A vizsgált törzsekben 100%-ban fenotípusos oxacillin és cefoxitin rezisztencia volt kimutatható. A kapott eredmények alapján 62 törzsből 4 törzs két antibiotikum osztályra, 58 törzs pedig ennél több antibiotikum osztályra nem volt érzékeny (Függelék 3. táblázat). Ezen adatok alapján a kapott törzseket multidrog rezisztens törzseknek tekintettük.

4.2. Minimális gátló koncentráció meghatározása oxacillin E-teszttel . A zónaátmérő alapján kapott rezisztenciaeredmények miatt szükségessé vált a minimális gátló koncentráció meghatározása oxacillin E-teszttel (9. ábra). Minden 2 μg/ml feletti MIC értéket mutató oxacillin rezisztens S. aureus esetében PBP2a fehérjét kimutató gyorstesztet is végeztünk.

12μg/ml

9. ábra: Magasfokú rezisztencia (bal oldali fotó) MIC >256μg/ml (6110P) heterogén rezisztencia (jobb oldali fotó) MIC 12μg/ml (1265K) A megjelenő rezisztencia alapján 7 törzs rendelkezett homogén, magas fokú rezisztenciával (azaz gyakorlatilag az összes sejt rezisztenciát mutatott) (Függelék, 4. táblázat). 17 törzs stabil rezisztenciával és az összes többi heterorezisztenciával rendelkező törzs, amelyeket rezisztenciamértékük alapján a következő osztályokba soroltunk: az 1. osztályba (MIC 1,5-3μg/ml) 3 törzset, a 2. osztályba (MIC 6-12μg/ml) 5 törzset, a megmaradt törzseket pedig a 3. osztályba (50-200μg/ml) soroltuk. A kapott eredményeket a Függelék 4. táblázat mutatja be. Ismeretes a Staphylococcus methicillinnel szembeni mérsékelt rezisztenciájának az a ritka formája, amikor a methicillin iránti érzékenység elvesztésének a PBP1, 2 és 4-en bekövetkezett változás az oka. Fenotípusosan ez az ún. „borderline” (BORSA) methicillin rezisztenciában nyilvánul meg.

29

Az oxacillin MIC értékek 2-8 μg/ml között vannak. E- teszttel vizsgálva bizonytalan végpontok, 1 μg-os oxacillint tartalmazó korongot használva korongdiffúziós módszerrel a gátlási zóna 10-13mm között van, a gátlási zóna nem éles. Ennek a típusú methicillin rezisztenciának az elkülönítése azért fontos, mert szemben a klasszikus methicillin rezisztenciával nem jár együtt a β-laktám antibiotikumokkal szembeni keresztrezisztenciával. A vizsgálatok során összesen 5 törzset találtunk 2-8 μg/ml közötti MIC értékkel, ebből 3 törzsnél az oxacillin korong gátlási zónája 0mm, 1 törzs esetében pedig 11, 1 törzsnél pedig 15mm. Ezeknek a mintáknak a kiértékelése során a végpontok jól olvashatóak voltak, a gátlási zóna széle éles volt.

4.3. A rezisztencia mértékét változtatni képes törzsek fenotípusos vizsgálata Az oxacillin E-tesz kiértékelése során kiderült, hogy, a magasfokú rezisztenciát mutató törzsek mellett, 17 törzs stabil rezisztenciával rendelkezik, ugyancsak 17 törzsnél megfigyelhető volt, hogy a baktériumpopuláción belül másodlagosan kialakuló rezisztens telepek jelentek meg (10. ábra).

3μg/ml

10. ábra: Másodlagosan kialakult rezisztens telepek megjelenése baktériumpopuláción belül Hogy ellenőrizzük, nem kevert tenyészetről, hanem valóban a fokozottan rezisztens baktériumok spontán keletkezéséről (szegregálásáról) van szó, négy törzset (145K, 3393B, 41672P, 4469B) „tisztítottunk” nem szelektív (véres lemezen) táptalajon, azaz tovább oltottuk 1 telepre. Az így létrehozott vonalakkal a rezisztencia vizsgálatot megismételtük (E-teszt). Mindegyik esetben megmaradt a magasabb rezisztenciára „váltás” képessége, a gátlási zónán belül ismét megjelentek egyedi telepek. 30

A zónán belül megjelent telepeket is háromszor „tisztítottuk”, majd újra minimális gátló koncentrációt mértünk E-teszttel. A kiértékelés alapján kiderült, hogy olyan törzseket izoláltunk, amelyek bizonyítottan homogén, tehát tisztán magasfokú methicillin rezisztenciával rendelkező sejtvonalak (Függelék, 5. táblázat). A tenyészet nem volt vegyes, mert akkor tisztítás nélkül is el lehetett volna különíteni a telepeket. A baktérium fenotípusában a mecA gén, vagy homogén, vagy heterogén formában fejeződhet ki. A vizsgálat során kapott eredményeink alátámasztották azt a tényt, miszerint heterogén expresszió esetén a baktériumpopuláció nagy része érzékeny, vagy mérsékelten érzékeny a methicillin iránt, és csak a populáció kis része szerzett magas szintű rezisztenciát. Ismert, hogy a magasfokú rezisztencia kialakulását különböző mutációk idézik elő (REF). A genetikai oka az lehet a rezisztenciaváltásnak, hogy akár egy mutáció következtében is megszűnhet az alacsony rezisztenciát eredményező represszió. Feltételeztük, hogy a magasabb rezisztenciára történő váltást az általunk izolált törzsek esetében is a mecI represszor génben vagy a mecA operátor (promóter) régióban bekövetkezett mutáció idézte elő. Ennek bizonyítására néhány esetben szekvencia szintű vizsgálatokat végeztünk. A kapott eredmények az 4.5.1 fejezetben kerülnek ismertetésre.

4.4. A mec gének kimutatására A methicillin rezisztencia megállapítása rendkívül fontos. Az 1μg-os oxacillin korongot használó agardiffúzióval kapott eredmény megerősítésére, illetve a járványok pontos felderítéséhez szükség van a törzsek molekuláris technikákkal történő vizsgálatára. Munkánk során az SCCmec kazettán elhelyezkedő mec génkomplexet vizsgáltuk, ami tartalmazza a methicillin rezisztenciát kódoló mecA gént és a vele közös operonon lévő és kifejeződését szabályozó mecR1 és mecI gént (4. és 6. ábra). A gének kimutatása PCR technológiával történt.

31

4.4.1. A minták előkészítése amplifikációhoz Az amplifikációhoz a baktériumokat többféle módon készítettük elő (lásd 3.6.2. fejezet). A minta előkészítésekor célunk az volt, hogy a lehető legegyszerűbben nyerjünk olyan DNS mintákat, amelyeknél a gének kimutatása jól reprodukálható. i) Gyenge denzitású baktérium szuszpenzióval (úgynevezett kolónia PCR vizsgálattal) ii) Részleges sejtfeltárással mikrohullámú sütőben iii) sejtfeltárás detergensekkel, fehérje eltávolítás Proteináz K segítségével Az első módszer néhány kísérlet után megmutatta hátrányai. Egyrészt a tenyészet öregedésének elkerülése miatt a törzsek gyakori átoltására volt szükség. Ez sok manuális munkát igényelt. Másrészt a PCR reakciók elvégzése után a gélfotókon a DNS mintázat többszöri ismétlés után sem volt mindig reprodukálható (11. ábra).

1

2

3

4

5

6

L

7

8

9 10 11 12 13 14 15 16 17

11. ábra: A mecA szekvencia kimutatása baktérium szuszpenzióból L: 100 bp Ladder kontroll DNS. Az 1. helyen a pozitív kontroll (ATCC33591), a 2. helyen a negatív kontroll (ATCC 25923). Megfelelő mennyiségű DNS-fragmentet csak a 7. és 8. helyen láthatunk, az 1. helyen lévő pozitív kontroll sem adott megbízható eredményt. A részleges sejtfeltárással előkészített minták már könnyítették a munkánkat abból a szempontból, hogy a mintát a következő vizsgálatig a fagyasztóban tárolhattuk, tehát nem volt szükség a tenyészetek folyamatos átoltására. Ezzel viszonylag sok időt takarítottunk meg, azonban ez a módszer sem tűnt megbízhatónak, mert az amplifikáció során gyakran hasonló eredményeket kaptunk, mint az előbb leírt esetben. Feltételeztük, hogy a különböző MRSA törzsek, genetikai hátterüktől függően, többé-kevésbé ellenállnak a melegítéssel vagy mikrohullámokkal történő feltárásnak, ezért a Gram-negatív baktériumoknál bevált egyszerű módszerek (pl. kolónia PCR) nem megfelelőek.

32

Szükségessé vált egy gyors és olcsó, a sejtfeltárást megoldó módszer kipróbálása. A S. aureus törzseknél legtöbbször alkalmazott kromoszómális DNS tisztítási módszer (lizozim hozzáadásával) időigényes és költséges, ezért egy jóval egyszerűbb módszert próbáltunk ki harmadikként. Feltárás céljából egy telepet Triton X-100 és Tween-20 detergenseket tartalmazó pufferben szuszpendáltunk fel, és Proteináz K emésztést alkalmaztunk. Az így készült „nyers lizátum” egy részét mértük be a PCR reakcióhoz. Ezzel a módszerrel biztosan reprodukálható eredményeket kaptunk az előzőleg változó eredményt adó törzsek esetén is. Ennek bizonyítéka a gélfotókon látható (4.4. fejezet). További előny, hogy a „nyers lizátum”, eddigi tapasztalataink alapján, több hónapig is megbízhatóan használható.

4.4.2. Megfelelő primerek kiválasztása, tervezése Bár sok primert írtak már le a mec gének kimutatására, kezünkben a kipróbáltak nem működtek mindig megfelelően, illetve túl hosszú (1500 bp) vagy túl rövid (200-300 bp), és ezért nehezebben detektálható terméket eredményeztek. A primerek tervezésénél fontosnak tartottuk, hogy a termék 500-600 bp hosszú legyen, ami biztosítja, hogy két oldalról, egy-egy szekvenálási reakcióval, könnyen meghatározható a szekvenciája. Ezen kívül a primerek olvadáspontját viszonylag magasra (58oC körül) terveztük, hogy gyorsabb legyen a PCR kivitelezése és megakadályozzuk az esetleges dimer képződések és egyéb, nem kívánt zavaró kölcsönhatások kialakulását. A mec génkomplex szekvenciájának ismeretében primerpárosokat terveztünk a mecA, mecR1 és mecI régiókra, illetve további primereket az esetleges mecA promóter és mecI regulátorgén mutációk kimutatásához. Összesen 13 primerrel végeztünk elemzést (6. táblázat) és minden olyan reakciót, amelyekben a primerek nem, vagy nem elég meggyőzően működtek többször megismételtünk. A PCR reakciók körülményeit a 3.6.2. fejezet ismerteti. A vizsgálat elsősorban a methicillin rezisztencia kimutatására irányult, majd a későbbiekben az arra alkalmas törzseknél mutációt kerestünk DNS szekvenálással. Ehhez a PCR reakcióval előállított fragmenteket izolálással készítettük elő (3.6.4. fejezet). A vizsgálat alapja a methicillin rezisztenciát kódoló SCCmec génkazetta (4. ábra) amely az MRSA sejtjeiben nagy számban jelen van. Ezen a kromoszómán található kazetta határozza meg, hogy a törzs homogén, vagy heterogén. A tervezett primerek elhelyezkedését 12. ábra mutatja be.

33

mecA génkomplex p

mecI

mecR1

mecA

mecR mecI3R

mecA1

mecR1 mecI2R mecI1R

mecA3 mecRA mecA2

12. ábra: A mec gének és a kimutatott PCR termékek elhelyezkedése A PCR termékeket jelképező téglalapokban az elnevezések mutatják, hogy milyen szekvenciákat tartalmaznak, illetve milyen primereket használtunk a kimutatásukra. A mecI gén 3’ végére tervezett primerek kívül esnek a 3’ kódoló régión, illetve a mecI3R primer pont a kódoló régió végét fedi le. A mecRA primerekkel a mec promóter régió (p), a különböző hosszúságú mecA primerekkel a teljes kódoló szakasz vizsgálható.

4.4.3. A mecA gén kimutatása A PCR reakcióban kezdő lépésként PBP2a enzimet kódoló mecA gén jelenlétét vizsgáltuk. A gén kimutatása, a rezisztencia vizsgálatok előtt, vagy azokkal egy időben azt jelzi, hogy MRSA baktériummal lehet dolgunk. 62 törzset vizsgáltunk meg a gén jelenlétére. A mecA régió azonosítására 5 primert használtunk (6. táblázat). Első lépésként egy irodalomban leírt primerrel végeztük az amplifikációt. Ezt a primert egy 1459 bp hosszúságú belső mecA szekvencia felsokszorozására tervezték. Az annealing fázisban a hőmérsékletet először 58oC-ra, majd 50oC-ra állítottuk, de egyik esetben sem kaptunk specifikus eredményt. A végzett reakciók többszöri ismétlés ellenére is sikertelennek bizonyultak (kezdetben a vizsgálatot a sejtfeltárási módszerekkel kapcsolatos problémák is nehezítették). Ezért újabb, rövidebb szakaszok megsokszorozására terveztünk primereket a mecA gén belsejébe (12. ábra). Ezekkel már sikeresen ki tudtuk mutatni a mecA gén jelenlétét.

34

A legmegbízhatóbb eredmény a mecA fw2/mecA rev3 primerpárossal kaptuk (13. ábra). 1

2

L

3

4

5

6

7

8

9

10

11

13. ábra: A mecA gén detektálása (1) pozitív kontroll, ATCC33591; (2) negatív kontroll, ATCC 25923; (L) 100 bp Ladder kontroll DNS; Vizsgált törzsek: (3) 145K; (4) 711K; (5) 795K; (6) 927K; (7) 967K; (8) 991K; (9) 1017K; (10) 1265K; (11) 1340K . A (6) 927K mintánál ismétlés után pozitív reakciót kaptunk. (Feltehetően a reakció összeállításakor nem lett belemérve a DNS)

Mivel a fenotípusos vizsgálatok során kiderült, hogy minden törzs methicillin (oxacillin) rezisztenciát mutatott, ezért valószínű volt a struktúrgén megléte az összes izolátumban. Ennek megfelelően minden törzsben kimutattuk a mecA gén jelenlétét. A kontroll vizsgálathoz használt törzskönyvezett MRSA (Staph. aureus ssp. aureus ATCC 33591) törzs minden esetben pozitív, az MSSA (Staph. aureus ssp. aureus ATCC 25923) törzs pedig minden esetben negatív eredményt adott, tehát az általunk elvárt eredményt kaptuk.

4.4.4. A mecR1 és a mecI szekvenciák kimutatása A génkazetta regulátorgénjei közül először a mecR1 gén jelenlétét vizsgáltuk két primerrel egy 769bp hosszúságú szakasz kimutatásával. Mind a 62 törzsben pozitív eredményt kaptunk, azaz kivétel nélkül ki tudtuk mutatni bennük a mecR1 szekvenciát. A kontroll törzsek is az elvártnak megfelelően viselkedtek (14. ábra).

35

1

2

3

4

5

6

7

8

9

L 10 11 12 13

14. ábra: A mecR1 gén kimutatása (1) pozitív kontroll, ATCC33591; (2) negatív kontroll, ATCC 25923; (L) 100 bp Ladder kontroll DNS; Vizsgált törzsek: (3) 145K; (4) 766K; (5) 795K; (6) 927K; (7) 967K; (8) 991K; (9) 1017K; (10) 3273B; (11) 3393B; (12) 2801B;(13) 3612B; A methicillin rezisztencia kifejeződéséhez szükséges a mecR1 jelenléte. A mecR1 génről átíródó fehérje jelátalakító fehérje. A mecR1 regulátorgén lassú induktora a methicillin rezisztenciának, ezzel ellenszemben a mecI egy erős represszor. A mecI gén amplifikálásához először egy olyan primerpárt terveztünk, amelynek egyik tagja a mecI gén előtt, a mecR1 szekvencia végén helyezkedett el (mecRI), a másik primer a mecI gén után, a nem kódoló 3’ végen található (mecI1R termék, 12. ábra). Ezt a PCR terméket a pozitív kontrollon kívül még számos törzsben ki tudtuk mutatni, de közel sem az összesben (15. ábra, Függelék, 4. táblázat). A vizsgált izolátumokból összesen 20 törzs volt mecI1R pozitív. Ezek közül 11 törzsnek a MIC értéke 20-256 μg/ml volt, egy törzsnél nagyobb volt, mint 256μg/ml, nyolc törzs heterogén fenotípusú volt, a többi pedig alacsony rezisztenciaértékkel rendelkezett. Tehát egyáltalán nem mutattak egységes képet és nem volt alacsony a rezisztencia szintjük, mint ahogy az a MecI represszor jelenlétében várható lenne.

1

2

3

L

4 5

6 7 8 9 10

15. ábra: A mecI1R 588bp hosszú szekvencia kimutatása (1) pozitív kontroll, ATCC33591; (2) negatív kontroll, ATCC 25923; (L) 100 bp Ladder kontroll DNS; Vizsgált törzsek: (3) 145K; (4) 145KT1; (5) 145KT2; (6) 145KT3; (7) 3393B; (8) 3393BT1; (9) 3393BT2; (10) 3393BT3 36

A törzsek többségében a mecI1R terméket tehát nem tudtuk kimutatni, ezért a mecI gén után, a 3’ nem kódoló részben terveztünk egy újabb primert, közelebb a mecI végéhez (mecI2R) és egyet, amely lefedte a stop kodont (mecI3R). Ezek segítségével, a mecRI primerrel párban, további csoportokba tudtuk osztani az MRSA törzseket (12. ábra, Függelék 4. táblázat). Az eredményekből egyértelmű volt, hogy a vad típusú mecI szekvencia több törzsből hiányzik, hiszen a stop kodonhoz tervezett primerrel sem tudtunk terméket kimutatni (16. ábra).

1

1

2 L 3 4 5 6 7

1

2 L 3 4 5 6 7

2 L 3 4 5 6 7

16. ábra: A mecI2R (bal oldal) és a meI3R (jobb oldal) fragmentek kimutatása (1) pozitív kontroll, ATCC33591; (2) negatív kontroll, ATCC 25923; (L) 100 bp Ladder kontroll DNS; Vizsgált törzsek: BAL oldal (3) 145K; (4) VAK (5) 3393B; (6) 41672P; (7) 4469B; JOBB oldal (3) VAK; (4) 145K; (5) 7254B; (6) 5377B; (7) 7073B A mecI2R PCR fragment esetében a mecI végéhez tervezett primer, a mecI1R fragmenthez hasonlóan, szintén kívül esett a 3’ nem kódoló régión (12. ábra), de már rövidebb szakaszt sokszorozott fel, 495 bp hosszúságban. Mindösszesen öt olyan törzset találtunk, amelyben a mecI1R fragmentet nem, de a mecI2R terméket ki tudtuk mutatni. Azoknál a törzseknél, ahol a mecI1R vagy a mecI2R szekvencia jelenlétét ki tudtuk mutatni a mecI gén teljes egészében jelen van. Nagyobb deléciók biztosan nincsenek benne, de pontmutációk vagy kisebb deléciók meglétét nem lehet kizárni. Abban az öt törzsben, amelyben a mecI1R fragmentet nem, csak a mecI2R terméket tudtuk detektálni legalább a mecI1R primerhely deléciót szenvedett. A mecI3R szekvencia kimutatását azoknál a törzseknél láttuk szükségesnek, ahol sem a mecI1R sem a mecI2R fragmentre nézve pozitív eredményt nem kaptunk. A törzsek vizsgálata során az előzőleg mecI negatív izolátumoknál a pozitív kontroll törzs kivételével egy esetben sem kaptunk pozitív eredményt. A vizsgálatot megismételtük két-két mecI1R és mecI2R pozitív törzzsel is (16. ábra).

37

Az amplifikáció során kapott eredményből kiderült, hogy a pozitív kontroll törzsön kívül a mecI1R pozitív törzsek adtak még pozitív eredményt (16. ábra). Ennek okát egyelőre nem tudjuk. Ismert, hogy a mecI génben belső deléciók fordulhatnak elő, ez a PCR fragmentek méretbeli különbségeiből látható lett volna a gélfotókon. Az általunk vizsgált törzseknél a fragmentek mérete mindig akkora volt, mint amekkora a vad típusú szekvenciából keletkezhet. Azoknál a törzseknél, ahol nem volt kimutatható a mecI3R szekvencia sem, ott biztosan nincs meg a törzsben a teljes mecI gén. A mecI negatív törzsek rezisztencia tulajdonságok alapján a következőképpen csoportosíthatók: 1, heterogén expressziót mutató törzsek (21 törzs), MIC 3-64μg/ml között 2, stabil rezisztenciát mutató törzsek (9 törzs), MIC 12-128 μg/ml között 3, homogén expressziót mutató törzsek (4 törzs), MIC 256 μg/ml, >256 μg/ml A mecI gén hiányából arra következtethetünk, hogy a törzs magas rezisztenciával rendelkezik. Az általunk kapott eredmények nagy részben megfelelnek ennek a feltételezésnek. A mecA gént hordozó, de mecI negatív eredmények jól példázzák, hogy a törzsek képesek expresszálni a methicillin rezisztenciát a represszor hiányában. Az aktív állapotú MecI fehérje az operátor régióhoz kapcsolódva represszálja mecA és a mecR1I, transzkripciós egységek átírását, ezért ezek a fehérjék antibiotikum hiányában csak alacsony szinten termelődnek. A penicillin megjelenése, kötődése a MecR transzmembrán fehérjéhez és annak autokatalitikus aktiválását idézi elő. Ez direkt, vagy indirekt úton a MecI fehérje inaktiválódásához vezet, és a represszió alól felszabadult gének transzkripciója felerősödik. Tehát mecI génben, vagy a mecA promóterben történő különböző mutációk idézhetik elő a magasfokú rezisztencia kialakulását. Azok a mecA pozitív törzsek, amelyek alacsony MIC értéket adtak, illetve heterorezisztenciát mutattak a vizsgálat során, erősen heterorezisztens törzseknek tekinthetők. Egyes irodalmi adatok szerint a methicillin rezisztencia mértéke még nem teljesen ismert, összetett regulációs mechanizmusok változásának eredménye (Rohrer 2004).

38

4.4.5. A mecA promóter régió felsokszorozása A mecA promóter és operátor régió szekvenciájának ellenőrzésére terveztünk két primert, melyek közül az egyik a mecA, a másik a mecR gén elejére esik (6. táblázat, 12. ábra). A mecRA PCR-fragment kimutatása minden vizsgált MRSA törzsben sikeres volt (17. ábra). A magasabb rezisztenciára váltás egyik oka az operátor régióban bekövetkező mutáció lehet. Ennek kimutatására kívántuk a későbbiekben ezt a reakciót felhasználni.

1

2

L

3

4

5

6 7

8

9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19

17. ábra: A mecRA szekvencia detektálása (1) pozitív kontroll, ATCC33591; (2) negatív kontroll, ATCC 25923; (L) 100 bp Ladder kontroll DNS; Vizsgált törzsek: (3)145K; (4) 145KT1; (5) 145KT2; (6) 145KT3; (7) 3393B; (8) 3393BT1; (9) 3393BT2; (10) 3393BT3; (11) 41672P; (12) 41672PT1; (13) 41672PT2; (14) 41672PT3; (15) 41672PT4; (16) 4469B; (17) 4469BT1; (18)4469BT2; (19) 4469BT3

4.5. A magasabb rezisztenciára váltás molekuláris hátterének vizsgálata A 4.3. fejezetben leírtak szerint izoláltunk magasabb rezisztenciára váltott törzseket. Az irodalmi adatok alapján (Hiramatsu, 2001) feltételeztük, hogy ezekben mutáció keletkezett a mecA promóter-operátor régióban, vagy a mecI regulátorgénben. A kérdéses régiókat PCR reakció segítségével kívántuk izolálni a feltételezett mutánsokból és ezek után szerettük volna meghatározni pontos bázissorrendjüket.

4.5.1. A feltételezett mutáns mec régiók izolálása és szekvenciájuk meghatározása Négy váltani képes törzsből (145K, 3393B, 41672P, 4469B; Függelék, 5. táblázat), és az azokból származó, már homogén, magasabb oxacillin rezisztenciát mutató homogén izolátumokból (145KT1, 145KT2, 145KT3, 3393BT1, 3393BT2, 3393BT3, 41672PT1, 41672PT2, 41672PT3, 41672PT4, 4469BT1, 4469BT2, 4469BT3; Függelék, 5. táblázat) felsokszoroztuk a mecAR fragmenteket (4.4.2. fejezet 12. ábra), majd ezeket agaróz gélelektroforézis segítségével izoláltuk. 39

A fragmentek bázissorrendjét a PCR-reakcióban is alkalmazott mecRA primer segítségével határozták meg a MTA Szegedi Biológiai Központban. Időközben, az eredeti izolátumok jellemzése során kiderült (4.4.4. fejezet), hogy három váltani képes törzsben (3393B, 41672P, 4469B) nem mutatható ki a teljes mecI szekvencia, ezért ezeknél feltételezhetően hiányzik a funkcióképes MecI represszor. Tehát az eredeti alacsonyabb rezisztencia, és a váltás után kialakult magasabb rezisztencia oka nem lehet a vad típusú mecI gén jelenléte illetve megváltozása. A 145K törzs esetében sikerült mind az eredeti, mind a magasabb rezisztenciát mutató törzsből (145KT1) izolálni a mecIR DNS-szakaszt. Ezek szekvencia meghatározása folyamatban van.

4.5.2. A mec promóter régiók szekvenciájának elemzése A szakirodalomban közölt adatok szerint a magasabb rezisztenciára váltáskor mutáció következhet be a mecI régióban, illetve a mec promóter régióban (Kobayashi, 1998; 18. ábra).

18. ábra: Magasabb rezisztenciát eredményező mutációk a mec génekben (A) az első sorban egy referenciatörzs (S. aureus N315) mecI szekvencia részlete látható, melynél aláhúzással jelezték a mutáns törzsben (SH13) deletálódott szakaszt. A deléció következtében korai STOP kodon alakult ki (hármas csillaggal jelölt) (B) a mecA promóter-operátor régió nukleotid szekvenciája. A függőleges nyilak egy-egy bázis cseréjét jelzik az adott mutáns törzsben (M6, M7). A felső folyamatos vonalak a palindrom operátor szekvenciát jelölik. A mecA gén transzkripciójának irányát a vastag nyíl jelöli. A START kodon aláhúzással van jelölve. SD: Shine Dalgarno szekvencia. (Kobayashi, 1998). 40

Eredményeink szerint a magasabb rezisztenciára váltott törzsekben a mecA promóter-operátor régió szekvenciája nem változott, teljesen megegyezett a 18. ábrán látható vad típusú szekvenciával. Ez alól kivételt csak a 145K törzs és származéka képezett, ahol két báziscserét találtunk (19. ábra, Függelék 9; 10 táblázat). mecA catttgtaatatactacaaatgtagtcttatataaggaggatattgATGAAAAA SD 145K catttgtaatatactacaaatgtagtattatataaggaggaaattgATGAAAAA

wt

19. ábra: A 145K törzs mecA promóter régiója Sárga szín és nyilak jelölik az eltérő bázisokat; SD: Shine Dalgarno szekvencia; piros aláhúzott rész: mecA START kodon; nyíl mutatja a transzkripció irányát; wt: vad típusú szekvencia. Mivel az eltérések a váltás előtti állapotban is jelen voltak, ezért szerepük a rezisztencia-szint változásában kizárható. Az azonban lehetséges, hogy az alap rezisztencia mértékének alakításában egyiknek, vagy mindkettőnek szerepe lehet. A 145K törzs rendelkezik ugyanis a legmagasabb alap rezisztencia szinttel a vizsgált törzsek közül (Függelék, 5. táblázat). Mivel a 145K törzs tartalmazza a teljes mecI gént is, elképzelhető, hogy a váltást egy ebben a génben keletkezett mutáció okozta, ahogy azt már több példa bizonyítja (Kobayashi, 1998; 18. ábra). Ennek lehetőségét a jövőben meg fogjuk vizsgálni. Azokban a törzsekben, ahol a mecI szekvenciát nem tudtuk kimutatni, nem valószínű, hogy a csonka mecI génben bekövetkezett változás következménye a magasabb rezisztencia. Egyes irodalmi adatok (Petinaki et al., 2001) szerint a methicillin rezisztens törzsekben a mecI gén 40 %-ban törlődik, ennek ellenére a regulátorgén hiányában is van represszió. Ennek egy lehetséges magyarázata, hogy a S. aureus törzsek nagy részében megtalálhatók a rokon bla gének is, ahol a szabályozás nagyon hasonló mec génekéhez (1.3.4. fejezet, 6. ábra). Ha olyan törzsekben következik be a magasabb rezisztenciára váltás, amelynek nincs teljes mecI génjük, és nem történt mutáció a mecA promóter régióban, akkor ezeknél érdemes a blaI gén jelenlétét és esetleges változását vizsgálni. Mivel a kapott eredmények jó néhány megválaszolatlan kérdést hagynak maguk után, ezért indokoltnak látjuk a munka folytatását, a blaI és a mecI gének vizsgálatával, a heterogén expresszió szabályozási folyamatának megértésére. A további vizsgálatokat a már meglévő heterogén törzsekből kívánjuk elvégezni.

41

5. ÖSSZEFOGLALÁS A multirezisztens Staphylococcus aureus MRSA törzsek megjelenése az országban és az egész kontinensen súlyos probléma. A molekuláris biológiai eljárások e törzsek azonosítása, elemzése területén is nagy segítséget nyújtanak. Vizsgálatainkat kórházban cirkuláló MRSA törzseken végeztük. Célunk egyrészt a methicillin rezisztenciát eredményező, és az MRSA törzsekre jellemző mec gének gyors és megbízható kimutatására használható polimeráz láncreakció (PCR) alapú módszer kidolgozása volt, másrészt a kórházi izolátumok sokféleségének meghatározása biokémiai, mikrobiológiai és molekuláris biológiai módszerekkel.

Továbbá célunk volt a heterogén expresszió

hátterében álló lehetséges mutációk felderítése. Munkánk során 62 kórházi izolátumot jellemeztünk. Biokémiai és mikrobiológiai vizsgálatokkal megállapítottuk, hogy a törzsek methicillin rezisztens S. aureus-ok, majd homogén és heterogén fenotípus szerint is jellemeztük őket. Ezen kívül négy heterogén rezisztenciát mutató törzsből izoláltunk olyan vonalakat, melyek stabilan magasabb rezisztenciára váltottak, hogy a jelenség genetikai hátterét tanulmányozhassuk. A mec gének PCR segítségével történő kimutatásához sikerült egy megbízható és egyszerű módszert találnunk, majd a mecA, mecR1 és mecI génekre tervezett primerek segítségével a szekvenciák jelenlétét megvizsgálnunk az összes izolátumban. Csak a mecI szekvencia tekintetében találtunk eltérést. 34 törzsben a gén jelenlétét nem tudtuk detektálni. Eredményeinket összegezve megállapíthattuk, hogy a kórházi izolátumok, az irodalmi adatokkal egyezően, valóban nagy változatosságot mutatnak.

A 49 eredeti

izolátumot a mikrobiológiai, biokémiai és molekuláris biológiai eredmények alapján összesen hét nagy csoportba tudtuk besorolni. A magasabb rezisztenciára váltás genetikai okainak meghatározására a heterogén expressziót mutató eredeti törzsekben és a magasabb rezisztenciával rendelkező származékaikban eddig a mecA promóter-operátor régió szekvenciáját vizsgáltuk meg. Megállapítottuk, hogy a tanulmányozott esetekben nem ebben a régióban következett be mutáció. Mivel a legtöbb törzsben hiányzott a vad típusú mecI represszorgén, feltételezzük, hogy ezekben az esetekben más gén látja el a szabályozó funkciót. Egy lehetséges jelölt a blaI gén, melyről ismert, hogy szabályozhatja a mecA expreszióját is. A jövőben ezt a lehetőséget tervezzük vizsgálni.

42

6. IRODALMI HIVATKOZÁSOK Archer, G. L., Niemeyer, D. M., Thanassi, J. A. & Pucci, M. J. (1994). Dissemination among staphylococci of DNA sequences associated with methicillin resistance. Antimicrobial Agents and Chemotherapy 38, 447–54. Bouchillon S. K., Johnson B.M., Hoban D.J. et al.: Determining incidence of extended spectrum beta-lactamase producing Enterobacteriaceae, vancomycin resistant Enterococcus faecium and methicillin resistant Staphylococcus aureus in 38 centres from 17 countries: the PEARLS study 2001-2002. Int. J. Animicrob. Agents, 24, 119-124, 2004 Boyce, J. M., Medeiros, A. A., Papa, E. F. & O'Gara, C. J. (1990). Induction of betalactamase and methicillin resistance in unusual strains of methicillin-resistant Staphylococcus aureus. Journal of Antimicrobial Chemotherapy 25,73– 81. Chambers H. F.:

Penicillin-binding protein-mediated resistance in pneumococci and

staphylococci. J. Infect. Dis., 179 (Suppl 2), S353-S359, 1999 Cosgrove, SE, et al. Comparison of mortality associated with methicillin-resistant and methicillin-susceptible Staphylococcus aureus bacteremia: a meta-analysis. Clin. Infect. Dis. 2003. 36:53-59 Czirók Éva: Klinikai és Járványügyi Bakteriológia. 1999 Melánia Kiadó Franklin D. Lowy: Antimicrobial resistance: the example of Staphylococcus aureus J Clin Invest. 2003; 111(9):1265–1273. doi:10.1172/JCI18535. Gacs M, Tóth Á, Tirczka T, Végh Zs. (2005) Az OEK Bakteriológiai Surveillance 2004. első félévi adatainak elemzése: methicillin rezisztens Staphylococcus aureus. Mikrobiológiai Körlevél, 5: 1 sz Gacs Mária, Tóth Ákos, Tirczka Tamás, Füzi Miklós Antibiotikum érzékenységi vizsgálatok. Korongdiffúzió Mikrobiológiai Körlevél 2006. VI. évfolyam 1. szám Hiramatsu, K, Cui, L, Kuroda, M, Ito, T. The emergence and evolution of methicillinresistant Staphylococcus aureus. Trends Microbiol. 2001. 9:486-493. Hiramatsu, K. Molecular evolution of MRSA. Microbiol. Immunol. 1995. 39:531-543. Hiramatsu, K., K. Asada, E. Suzuki, K. Okonogi, and T. Yokota. 1992. Molecular cloning and nucleotide sequence determination of the regulator region of mecA gene in methicillin-resistant Staphylococcus auureus (MRSA). FEBS Lett. 298:133

43

Jevons, MP. “Celbenin”-resistant staphylococci. Br. Med. J. 1961. 1:124-125. Kobayashi, N., Taniguchi, K. & Urasawa, S. (1998). Analysis of diversity of mutations in the mecI gene and mecA promoter/operator region of methicillin-resistant Staphylococcus aureus and Staphylococcus epidermidis. Antimicrobial Agents and Chemotherapy 42, 717–20. Marreroa, Aniebrys, Goretti Mallorquí-Fernándeza, Tibisay Guevaraa, Raquel GarcíaCastellanosa and F. Xavier Gomis-Rüth, : Unbound and Acylated Structures of the MecR1 Extracellular Antibiotic-sensor Domain Provide Insights into the Signaltransduction System that Triggers Methicillin Resistance, Institut de Biologia Molecular de Barcelona, C.I.D.–C.S.I.C. C/Jordi Girona, 18–26, 2006 Murray R.P.: Manual of Clinical Microbiology. 6. kiadás. ASM Press, Washington, D.C. 1995 Nagy E, Tóth Á, Visontai I.: Az EUCAST antibiotikum érzékenységi vizsgálatokra vonatkozó ajánlásai és az antibiotikum rezisztencia vizsgálatok jövője Európában Mikrobiológiai Körlevél 10: 2-7 (2010) National Committee for Clinical Laboratory Standards: Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing; Tenth Informational Supplement (Aerobic Dilution). M100-S10 (M7), NCCLS, Wayne PA, January 2000 Nkwelang, G. JFTK Akoachere. Staphylococcus aureus isolates from clinikal andenvironmental samples in a semi-rural area of Cameroon: phenotypic characterization of Cameroon: phenotypic characterization of isolates (2009) Olsson-Liljequist B., LarssonP., Waldner M., Miöner H. : Antimicrobial susceptibility testing in Sweden. III. Mothodology for susceptibility testing. Scand. J. Infect. Dis., Suppl.105, 13-23, 1997 Parker, MT, Hewitt, JH. Methicillin resistance in Staphylococcus aureus. Lancet. 1970. 1:800-804. Petinaki E., A. Arvaniti, G. Dimitracopoulos and I. Spiliopoulou: Detection of mecA, mecR1 and mecI genes among clinical isolates of methicillin-resistant staphylococci by combined polymerase chain reactions. Antimicrobial Agents and ChemotherapyAccepted November 20, 2000 Rohrer,

S.,

B.

Berger-Maechi.

2003.

What

makes

resistance

to

methicillin

heterogeneous? Journal of Medical Microbiology 52: 605-607 Suzuki, E K Kuwahara-Arai, J F Richardson and K Hiramatsu: Distribution of mec regulator genes in methicillin-resistant Staphylococcus clinical strains. Department 44

of Bacteriology, Juntendo University, Tokyo, Japan. Antimicrob Agents Chemother. 1993 June; 37(6): 1219-1226 Timothi M. A. Weller. The distribution of mecA, mecR1 and mecI and sequence analysis of mecI and the mec promoter region in staphylococci expressing resistance to methicillin J. Antimicrob. Chemother. (1999) 43(1): 15-22 doi:10.1093/jac/43.1.15 Tóth Á, Gacs M (2009). Az MRSA Referens Laboratórium ajánlása: A methicillin rezisztens

Staphylococcus

aureus

glikopeptid

érzékenységének

vizsgálata.

Mikrobiológiai Körlevél, 9: 1. sz Tóth Á, Gacs M. (2005) A makrolid rezisztens Staphylococcus aureus clindamycin rezisztenciája. Mikrobiológiai Körlevél, 5: 1 sz. van Saen, H.K.F., Damjanovic, V., Murray, A.E. et al.: How to classify infections in intensive care units- the carrier state, a criterion whose time has come? J. Hosp. Infect. 1996, 33, 1-12. Veréb I., Sóki J., Deák J., Nagy E.: Staphylococcus mecA gén kimutatása PCR módszerrel klinikai isolátumokból Infektológia és klinikai mikrobiológia 5: 22-29 (1998)

45

7. KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS Hálás köszönetemet szeretném kifejezni témavezetőmnek, Dr. Putnoky Péternek, aki fáradtságot nem ismerve nyújtott segítséget a kísérlet pontos, biztonságos kimenetelében, tapasztalatai átadásában, és az adatok elemzésében, továbbá elméleti és gyakorlati útmutatást adott diplomamunkám elkészítéséhez. Köszönettel tartozom Kuczmog Anett és Galambos Anikó PhD hallgatóknak és Garai Krisztinának, akik sok gyakorlati segítséget adtak kísérleteim elvégzése során. Továbbá köszönettel tartozom a Bajai Szent Rókus Kórház Bakteriológiai Részleg asszisztenseinek, a Kalocsai Kórház Bakteriológiai Részleg asszisztenseinek, valamint dr. Mestyán Gyulának a PTE ÁOK Orvosi Mikrobiológiai és Immunitástani Intézet, Bakteriológiai Diagnosztikai Laboratórium klinikai főorvosának, akik a kísérletekhez szükséges vizsgálati izolátumokat és a hozzá tartozó dokumentációt rendelkezésemre bocsátották.

46

8. FÜGGELÉK

Gentamicin

Cefuroxim

Sumetrolim

Doxycyclin

Amoxi/clavul

Ciprofloxacin

Oxacillin

Penicillin

Erythromycin

Clindamycin

Vancomycin

Teicoplanin

Cefoxitin

Rifampicin

3. táblázat: A vizsgált törzsek korongdiffúziós eredményei A kiértékelésben érzékeny (E) és rezisztens (R) kategóriákat használtunk (piros betű)

145 K

E

R

E

E

R

R

R

R

R

R

E

E

R

E

711 K

E

R

E

E

R

R

R

R

R

R

E

E

R

E

766 K

E

R

E

E

R

R

R

R

R

R

E

E

R

E

795 K

E

R

E

E

R

R

R

R

R

R

E

E

R

E

927 K

R

R

E

E

R

R

R

R

R

R

E

E

R

E

967 K

E

R

E

E

R

R

R

R

R

R

E

E

R

E

991 K

E

R

E

E

R

R

R

R

R

R

E

E

R

E

1017 K

E

R

E

E

R

R

R

R

R

R

E

E

R

E

1265 K

E

R

E

E

R

R

R

R

R

R

E

E

R

E

1340 K

E

R

E

E

R

R

R

R

R

R

E

E

R

E

2902 B

E

R

E

E

R

R

R

R

R

R

E

E

R

E

3273 B

E

R

E

E

R

R

R

R

R

R

E

E

R

E

3393 B*

E

R

E

E

R

R

R

R

R

R

E

E

R

E

2801 B

E

R

E

E

R

R

R

R

R

R

E

E

R

E

2608 B*

E

R

E

E

R

R

R

R

R

R

E

E

R

E

3612 B

E

R

R

R

R

E

R

R

E

E

E

E

R

E

3835 B

E

R

E

E

R

R

R

R

R

R

E

E

R

E

4469 B

E

R

E

E

R

R

R

R

R

R

E

E

R

E

7073 B*

E

R

E

E

R

R

R

R

R

R

E

E

R

E

5377 B

E

R

E

E

R

R

R

R

R

R

E

E

R

E

5146 B

E

R

E

E

R

E

E

R

R

R

E

E

R

E

7254 B

E

R

E

E

R

R

R

R

R

E

E

E

R

E

6354 B

E

R

E

E

R

E

R

R

E

E

E

E

R

E

TÖRZS

47

Gentamicin

Cefuroxim

Sumetrolim

Doxycyclin

Amoxi/clavul

Ciprofloxacin

Oxacillin

Penicillin

Erythromycin

Clindamycin

Vancomycin

Teicoplanin

Cefoxitin

Rifampicin

3. táblázat folytatása

32959 P

E

R

E

E

R

R

R

R

E

E

E

E

R

E

41902 P*

E

R

E

E

R

R

R

R

R

R

E

E

R

E

34799 P

R

R

E

R

R

R

R

R

R

R

E

E

R

E

41672 P*

E

R

E

E

R

R

R

R

R

R

E

E

R

E

36107 P*

E

R

E

E

R

R

R

R

R

R

E

E

R

E

6110 P

R

R

E

E

R

R

R

R

R

R

E

E

R

E

5650 P

E

R

E

E

R

R

R

R

E

E

E

E

R

E

6153 P

E

R

E

E

R

R

R

R

R

E

E

E

R

E

1444 P

E

R

E

E

R

R

R

R

R

E

E

E

R

E

40756 P*

E

R

E

E

R

R

R

R

R

R

E

E

R

E

32536 P

E

R

E

E

R

R

R

R

R

R

E

E

R

E

39303 P*

E

R

E

E

R

R

R

R

R

R

E

E

R

E

43101 P

R

R

E

E

R

R

R

R

R

R

E

E

R

E

6527 P

E

R

E

E

R

R

R

R

E

E

E

E

R

E

6435 P

E

R

E

E

R

R

R

R

R

R

E

E

R

E

2554 P

R

R

R

E

R

R

R

R

R

R

E

E

R

E

2048 P*

E

R

E

E

R

R

R

R

R

R

E

E

R

E

532 P*

E

R

E

E

R

R

R

R

R

R

E

E

R

E

2893 P

R

R

E

E

R

R

R

R

R

R

E

E

R

E

2492 P*

E

R

E

E

R

R

R

R

R

R

E

E

R

E

5703 P

E

R

E

E

R

R

R

R

E

E

E

E

R

E

1031 P

E

R

E

E

R

R

R

R

E

E

E

E

R

E

5557 P

R

R

E

E

R

R

R

R

R

R

E

E

R

E

6525 P

E

R

E

E

R

R

R

R

R

R

E

E

R

E

TÖRZS

* indukálható Clindamycin rezisztencia

48

4. táblázat: A vizsgált törzsek fenotípusos (E-teszt, PBP2a) és molekuláris (mec szekvenciák) vizsgálatainak eredménye. nt: nem tesztelt TÖRZS

Cefoxitin 30 μg (mm)

Oxacillin 1μg (mm)

Oxacillin MIC μg/ml

145 K 711 K 766 K 795 K 927 K 967 K 991 K 1017 K 1265 K 1340 K 2902 B 3273 B 3393 B* 2801 B 2608 B* 3612 B 3835 B 4469 B 7073 B* 5377 B 5146 B 7254 B 6354 B

14 13 14 17 0 11 16 16 15 17 15 16 15 13 16 15 11 14 14 13 19 14 18

0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 11 0 0 0 0 0 15 0 0

64 32 >256 32 >256 >256 96 48 12 128 3 32 48 3 6 32 64 32 16 32 3 256 64

stabil reziszt.

heteroreziszt.

+ + +

+ + + + + +

+ + + +

+

+ + + +

+

+

PBP2a

mecA szekvencia

mecR szekvencia

mecRA szekvencia

mecIR szekvencia

mecIR2 szekvencia

mecI3 szekvencia

+ + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + +

+ + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + +

+ + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + +

+ + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + +

+ + + + + + + -

+ + -

+ nt. nt. nt. nt. nt. -. nt. nt. + 49

4. táblázat: folytatása, * indukálható Clindamycin rezisztencia nt: nem tesztelt TÖRZS

32959 P 41902 P* 34799 P 41672 P* 36107 P* 6110 P 5650 P 6153 P 1444 P 40756 P* 32536 P 39303 P* 43101 P 6527 P 6435 P 2554 P 2048 P* 532 P* 2893 P 2492 P* 5703 P 1031 P 5557 P 6525 P

Cefoxitin 30 μg (mm)

19 17 13 19 18 0 17 15 18

7 10 15 16 17 19 0 16 14 0 17 12 14 16 18

Oxacillin 1μg (mm)

Oxacillin MIC μg/ml

0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 14 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

32 32 256 16 12 >256 256 8 96

256 256 12 256 32 128 >256 32 256 >256 16 48 24 >256 24

stabil reziszt.

heteroreziszt.

+ + +

+

+

+

+ + + +

+ + + +

PBP2a

mecA szekvencia

MecR1 szekvencia

mecRA szekvencia

mecIR szekvencia

mecIR2 szekvencia

mecI3 szekvencia

+ + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + +

+ + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + +

+ + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + +

+ + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + +

+ + + + + + + + + -

-

nt. nt. nt. nt. nt. nt. nt. nt. nt. nt. nt. -

+ + -

50

5. táblázat: Heterogén fenotípusú törzsek MIC értékei

Törzs

Eredeti MIC μg/ml

T 1 MIC μg/ml

T 2 MIC μg/ml

T 3 MIC μg/ml

T 4 MIC μg/ml

145 K

64

256

256

256

-

3393 B*

48

256

256

256

-

41672 P*

16

256

256

256

256

4469B

32

256

256

256

-

A vizsgált törzsek oxacillin E-tesztjeinek eredménye. A gátlási zónán belül felnövő, magasabb rezisztenciájú telepeket T1-T4 számozással jelöltük. A 145K, 3393B és 4469 törzsek lemezeiről 3-3, a 41672P lemezről pedig 4 telepet tisztítottunk tovább a szekvencia elemzésekhez. * indukálható Clindamycin rezisztencia

51

8. táblázat: A S. aureus ssp. aureus AC.002952 mec génkomplex szekvenciája

.

TACGCGAAATATTATGATGGTTATAAATTTCCCTTAGCACTCTTTTTTCATTATCATTTATATTTTATTTTCCATaattgcctaccccata agttattttgaatttagtttatagtttatcatgtatttttataccaactattttaacataaattaaattaaaccttagaacaacttaaaac ctcacttaggttatcatcttcgttcttttattttttttattatttcaataaaTTACGTATTTCCAATATGACGATTTTTTATGCAAAGTCG TTGTATGTTTTTCAAATTTTTGACATTTATGCAATCTAAATAGCCAATTAGGGAATTTTTAACATTTTTTATTTGTTTGATATTATACTTA ATGTATCTTAAATAGAAAGAGGGTATGCATATGGATTTCACTGGTGTTATTACAAGCATTATTGATTTAATCAAgacttgcattcaggctt tcggttaattttttcaactaaaaaacagaggaaatattcaacgacttgattgtttcctctgttttctatgtattgttgtaaacacaacaat tttattttttattcaatatatttctcaaTTATTCTATTTCATCTTGTGATAGATCTTCTTTTTCTACAAAGTTTAAGACAAGTGAATTGAA ACCGCCTTTGTATACTTTATTGATAAAGTTTTTAGATGTTTTATATTTTATATCACTTTCTTCTACAAGAGAGTAATATTGAAAAATTTTA TTGTCTTTTTTACGATCTATAAATCCCTTTTTATACAATCTCGTTATAAGTGTACGAATGGTTTTTGGACTCCAGTCCTTTTGCATTTGTA TTTCTTCTATTATATTATTCGCACTTGCATATTTTTTCATCCAAATGATATTCATAACTTCCCATTCTGCAGATGATATTTCATACGTTTT ATTATCCATTATATTAACTCCATTTCTTTTAAAATACGCTCAGAAATTTGTTGTGCTTTTTCGCCATTCGCATTGTCTTCGCCTTTTAAAT GTGTAGCAAAATAATACGTATTATCTTTCGTTTCAACATAACCTACGAACCATCCATTTGCTTCTTTGTGATTCACGATTCCTGTTCCAGT TTTACCTACATATTTATAAGTATCTTTTTGTTTCAAAGTCATACTATTTTCAACTTTTTCAATAGCCTTATTATCAAAATGCATGTTATGT TGTTTCATATTTTTCAACAAATTAACCTGTTCTATTGCAGAAATTTTTAATGAAGATTCATTCCAATAATTTTCATTCCCTGATATTTCTT CATTACCATATTCAATTAGATCTAAATAAGATTTAACCTCATCTTGTCTTAAATGTTTGTTTAAATTTTCGTAATACCAATTTACTGAATA TTTCATTGAAGAATTTAAATTTTGATCTTGGTTCCATTCTTTAAATGGATATTGATGTTTATCCCATTGTTGTTCAGTATGATTTAATGAG AGTAAATTTTGGTCGAATGCCATTAACGCTAAATAAATTTTGTAAGTAGAATTAGGTGAATATCGTTGTTTACTTTCTGGTTCATTATAAA TAGAATAAGCTTGCTCCCGTTCATTATAAAGCACAAAACTTCCATCAAATCCTTTGAAATACGGAGCTAGTTGATTTAATTTTTTATATGA TACATTTGTTTCATATTTGTCTTGTTGAACATGTGCAGATAGTAACGGTGCTTGTATTAAAAGCGATATACTACATACAATATACGCAACA ATACGCTTGTTTCGATTAGGTTTAGGCATTGAATCATAAAGTGCAATATACTTAACACGTTCTTTAATATTTGAATTAAAACCTAGTAAAT ATTGTGCTGCCACATTATTTATGTGCTGAGATTTTAAAATAGAGCATTTTAATATCGATTCACCATAACGTATATGTTCATGGCGATTCAA AATTTTTAAAACGTTTCTATCACATACTTTTTCACAGTCATTGTCCATCATTGTTTTACTTATATATAGTGCAGGATTAAACCAGAATATC ATTTTAAAAACAACATAAAGCTGGTTGAATATTAAGTCATGACTTTTCACATGTGATAGTTCATGTAGAATAATATATTCAATTTCTTTGT CATTCATGGTTTCGACTACGACAGTTGGTAGTACAATTTGGGATTTCACTAAACCAAATACCATCGGATTATCAATGTTTGAACTATAACT AATTGTTATATGCTTTTTGTAGAACTGCATCTTACTTTGACATACTTTAAGTCGTTCATTAAGATATGACGATTCCAATGACGAACTTTTA ATAACATCAATTTGTCGGAATGCCTTAATCATATAAAATAAGCACAACAAACTACCAAATACCCATATCAAAAGAATCATATACGTTATAT TTGAGGTCTCAAACTGATTAACATTAATTGCTAAGTCTTTCGTAACAGATGATTGTTGACCATCTAACATATGACTAACCGAAGAAGTCGT GTCAGATACATTTCGATTCATCATATCTTTTGAAAATGTAAAATTCGATATTTTGTAAAATGGTATTAATGGAATTAACGTGGAGACGAGC ACTAATAACCAAATCTTATGTGACATAATATTTTGAGTATATTTTATATAGAGCATTCTCACTAAAAAAATTACACATATCGTGAGCAATG AACTGATTATACTTAACATTAAAAAAGATGATAACACcttctacacctccatatcacaaaaattataacattattttgacataaatactac atttgtaatatactacaaatgtagtcttatataaggaggatattgATGAAAAAGATAAAAATTGTTCCACTTATTTTAATAGTTGTAGTTG TCGGGTTTGGTATATATTTTTATGCTTCAAAAGATAAAGAAATTAATAATACTATTGATGCAATTGAAGATAAAAATTTCAAACAAGTTTA TAAAGATAGCAGTTATATTTCTAAAAGCGATAATGGTGAAGTAGAAATGACTGAACGTCCGATAAAAATATATAATAGTTTAGGCGTTAAA GATATAAACATTCAGGATCGTAAAATAAAAAAAGTATCTAAAAATAAAAAACGAGTAGATGCTCAATATAAAATTAAAACAAACTACGGTA ACATTGATCGCAACGTTCAATTTAATTTTGTTAAAGAAGATGGTATGTGGAAGTTAGATTGGGATCATAGCGTCATTATTCCAGGAATGCA GAAAGACCAAAGCATACATATTGAAAATTTAAAATCAGAACGTGGTAAAATTTTAGACCGAAACAATGTGGAATTGGCCAATACAGGAACA GCATATGAGATAGGCATCGTTCCAAAGAATGTATCTAAAAAAGATTATAAAGCAATCGCTAAAGAACTAAGTATTTCTGAAGACTATATCA AACAACAAATGGATCAAAATTGGGTACAAGATGATACCTTCGTTCCACTTAAAACCGTTAAAAAAATGGATGAATATTTAAGTGATTTCGC AAAAAAATTTCATCTTACAACTAATGAAACAGAAAGTCGTAACTATCCTCTAGGAAAAGCGACTTCACATCTATTAGGTTATGTTGGTCCC ATTAACTCTGAAGAATTAAAACAAAAAGAATATAAAGGCTATAAAGATGATGCAGTTATTGGTAAAAAGGGACTCGAAAAACTTTACGATA AAAAGCTCCAACATGAAGATGGCTATCGTGTCACAATCGTTGACGATAATAGCAATACAATCGCACATACATTAATAGAGAAAAAGAAAAA AGATGGCAAAGATATTCAACTAACTATTGATGCTAAAGTTCAAAAGAGTATTTATAACAACATGAAAAATGATTATGGCTCAGGTACTGCT ATCCACCCTCAAACAGGTGAATTATTAGCACTTGTAAGCACACCTTCATATGACGTCTATCCATTTATGTATGGCATGAGTAACGAAGAAT ATAATAAATTAACCGAAGATAAAAAAGAACCTCTGCTCAACAAGTTCCAGATTACAACTTCACCAGGTTCAACTCAAAAAATATTAACAGC AATGATTGGGTTAAATAACAAAACATTAGACGATAAAACAAGTTATAAAATCGATGGTAAAGGTTGGCAAAAAGATAAATCTTGGGGTGGT TACAACGTTACAAGATATGAAGTGGTAAATGGTAATATCGACTTAAAACAAGCAATAGAATCATCAGATAACATTTTCTTTGCTAGAGTAG CACTCGAATTAGGCAGTAAGAAATTTGAAAAAGGCATGAAAAAACTAGGTGTTGGTGAAGATATACCAAGTGATTATCCATTTTATAATGC TCAAATTTCAAACAAAAATTTAGATAATGAAATATTATTAGCTGATTCAGGTTACGGACAAGGTGAAATACTGATTAACCCAGTACAGATC CTTTCAATCTATAGCGCATTAGAAAATAATGGCAATATTAACGCACCTCACTTATTAAAAGACACGAAAAACAAAGTTTGGAAGAAAAATA TTATTTCCAAAGAAAATATCAATCTATTAACTGATGGTATGCAACAAGTCGTAAATAAAACACATAAAGAAGATATTTATAGATCTTATGC AAACTTAATTGGCAAATCCGGTACTGCAGAACTCAAAATGAAACAAGGAGAAACTGGCAGACAAATTGGGTGGTTTATATCATATGATAAA GATAATCCAAACATGATGATGGCTATTAATGTTAAAGATGTACAAGATAAAGGAATGGCTAGCTACAATGCCAAAATCTCAGGTAAAGTGT ATGATGAGCTATATGAGAACGGTAATAAAAAATACGATATAGATGAATAAcaaaacagtgaagcaatccgtaacgatggttgcttcactgt tttaTTATGAATTATTAATAAGTGCTGTTACTTCTCCCTTAAATACAATTTCTTCATTTTCATTGTATGTTGAAAGTGACACTGTAACGAG TCCATTTTCTTTTTTTATGGATTTCTTATTTGTAATTTCAGCGATAACGTACAATGTATTACCTGGGTATACAGGTTTAATAAATTTAACG TTATTCATTTGTGTTCCTGCTACAACTTCTTCTCCGTATTTACCTTCTTCTACCCATAATTTAAATGATATTGAAAGTGTATGCATGCCAG ATGCAATGATACCTTTAAATCTACTTTGTTCTGCTTTTTCTTTATCTATATGCATATATTGAGGATCAAAAGTTGTTGCAAATTGGATAAT TTCTTCTTCTGTAATATGAAGGCTTTTTGTTTTGAATGTTTCTCCTACTATAAAATCATCGTATTTCATatatgtctctctttcttattca aattaattttttagtatgtaacatgttaaaggtaagtctaccgtcactgaaacgtaagactcacctctaactt .

A színes betűk a mec géneket jelzik, kis betűvel a nem kódoló, nagy betűvel a kódoló régiót jelöltük. Kódoló régiók: mecA bordó, mecR kék, mecI aláhúzott (ez utóbbi két gén fordított irányba áll). Az eltérő színű téglalapok a különböző primerek elhelyezkedését jelölik. A primerek elnevezése és szekvenciája a 6. táblázatban található.

52

9. táblázat: A 145K törzs mecRA szekvenciájának kromatogrammja. A bázisokat jelentő csúcsok jól olvashatóak. A felső sorban található szekvencia mindenütt megegyezik a görbékkel. Sárga színnel a vad típustól eltérő bázisokat jelöltük.

53

10. táblázat: A mecA promóter régiók szekvenciák illesztése

.

BK5 mecRA BK2 BK1

----------------------------------------TATGTGACATAATATTTTGA AATGGAATTAACGTGGAGACGAGCACTAATAACCAAATCTTATGTGACATAATATTTTGA ----------------------------------------TATGTGACATAATATTTTGA ------------------------------------------TG-GACATAATATTTTGA ** ***************

20 60 20 17

BK5 mecRA BK2 BK1

GTATATTTTATATAGAGCATTCTCACTAAAAAAATTACACATATCGTGAGCAATGAACTG GTATATTTTATATAGAGCATTCTCACTAAAAAAATTACACATATCGTGAGCAATGAACTG GTATATTTTATATAGAGCATTCTCACTAAAAAAATTACACATATCGTGAGCAATGAACTG GTATATTTTATATAGAGCATTCTCACTAAAAAAATTACACATATCGTGAGCAATGAACTG ************************************************************

80 120 80 77

BK5 mecRA BK2 BK1

ATTATACTTAACATTAAAAAAGATGATAACACCTTCTACACCTCCATATCACAAAAATTA ATTATACTTAACATTAAAAAAGATGATAACACcttctacacctccatatcacaaaaatta ATTATACTTAACATTAAAAAAGATGATAACACCTTCTACACCTCCATATCACAAAAATTA ATTATACTTAACATTAAAAAAGATGATAACACCTTCTACACCTCCATATCACAAAAATTA ************************************************************

140 180 140 137

BK5 mecRA BK2 BK1

TAACATTATTTTGACATAAATACTACATTTGTAATATACTACAAATGTAGTCTTATATAA taacattattttgacataaatactacatttgtaatatactacaaatgtagtcttatataa TAACATTATTTTGACATAAATACTACATTTGTAATATACTACAAATGTAGTATTATATAA TAACATTATTTTGACATAAATACTACATTTGTAATATACTACAAATGTAGTATTATATAA ***************************************************.********

200 240 200 197

BK5 mecRA BK2 BK1

GGAGGATATTGATGAAAAAGATAAAAATTGTTCCACTTATTTTAATAGTTGTAGTTGTCG ggaggatattgATGAAAAAGATAAAAATTGTTCCACTTATTTTAATAGTTGTAGTTGTCG GGAGGAAATTGATGAAAAAGATAAAAATTGTTCCACTTATTTTAATAGTTGTAGTTGTCG GGAGGAAATTGATGAAAAAGATAAAAATTGTTCCACTTATTTTAATAGTTGTAGTTGTCG ******:*****************************************************

260 300 260 257

BK5 mecRA BK2 BK1

GGTTTGGTATATATTTTTATGCTTCAAAAGATAAAGAAATTAATAATACTATTGATGCAA GGTTTGGTATATATTTTTATGCTTCAAAAGATAAAGAAATTAATAATACTATTGATGCAA GGTTTGGTATATATTTTTATGCTTCAAAAGATAAAGAAATTAATAATACTATTGATGCAA GGTTTGGTATATATTTTTATGCTTCAAAAGATAAAGAAATTAATAATACTATTGATGCAA ************************************************************

320 360 320 317

BK5 mecRA BK2 BK1

TTGAAGATAAAAATTTCAAACAAGTTTATAAAGATAGCAGTTATATTTCTAAAAGCGATA TTGAAGATAAAAATTTCAAACAAGTTTATAAAGATAGCAGTTATATTTCTAAAAGCGATA TTGAAGATAAAAATTTCAAACAAGTTTATAAAGATAGCAGTTATATTTCTAAAAGCGATA TTGAAGATAAAAATTTCAAACAAGTTTATAAAGATAGCAGTTATATTTCTAAAAGCGATA ************************************************************

380 420 380 377

BK5 mecRA BK2 BK1

ATGGTGAAGTAGAAATGACTGAACGTCCGATAAAAATATATAATAGTTTAGGCGTTAAAG ATGGTGAAGTAGAAATGACTGAACGTCCGATAAAAATATATAATAGTTTAGGCGTTAAAG ATGGTGAAGTAGAAATGACTGAACGTCCGATAAAAATATATAATAGTTTAGGCGTTAAAG ATGGTGAAGTAGAAATGACTGAACGTCCGATAAAAATATATAATAGTTTAGGCGTTAAAG ************************************************************

440 480 440 437

BK5 mecRA BK2 BK1

ATATAAACATTCAGGATCGTAAAATAAAAAAAGTATCTAAAAATAAAAAACGAGTAGATG ATATAAACATTCAGGATCGTAAAATAAAAAAAGTATCTAAAAATAAAAAACGAGTAGATG ATATAAACATTCAGGATCGTAAAATAAAAAAAGTATCTAAAAATAAAAAACGAGTAGATG ATATAAACATTCAGGATCGTAAAATAAAAAAAGTATCTAAAAATAAAAAACGAGTAGATG ************************************************************

500 540 500 497

BK5 mecRA BK2 BK1

CTCAATATAAAATTAAAACAAACTACGGTAACATTGATCGCAACGTTCAATTTAATTTTG CTCAATATAAAATTAAAACAAACTACGGTAACATTGATCGCAACGTTCAATTTAATTTTG CTCAATATAAAATTAAAACAAACTACGGTAACATTGATCGCAACGTTCAATTTAATTTTG CTCAATATAAAATTAAAACAAACTACGGTAACATTGATCGCAACGTTCAATTTAATTTTG ************************************************************

560 600 560 557

BK5 mecRA BK2 BK1

TTAAAGAAGATGGTATGTGGAAGTTAGATTGGGATCATAGCGTCATTATTCCAGA 615 TTAAAGAAGATGGTATGTGGAAGTTAGATTGGGATCATAGCGTCATTATTCCAG- 654 TTAAAGAAGATGGTATGTGGAAGTTAGATTGGGATCATAGCGTCATTATTCCAGA 615 TTAAAGAAGATGGTATGTGGAAGTTAGATTGGGATCATAGCGTCATTATTCCAGA 612 ****************************************************** __________________________________________________________________________________________.

A BK1 (145K) és BK2 (145KT1) szekvenciája megegyezik és eltér a BK5 (3393B) szekvenciától 2 bázisban. A BK5 (3393B) szekvencia viszont tökéletesen azonos az adatbázisból kiszedett Staphylococcus aureus subsp. aureus MRSA252 AC NC_002952) szekvenciával.

54