Zvyšování konkurenceschopnosti studentů oboru botanika a učitelství biologie CZ.1.07/2.2.00/15.0316
Molekulární markery PCR, RAPD, RFLP, AFLP, mikrosatelity, sekvenace
Genetické markery
Genetické markery jsou definovány jako morfologické, anatomické, fyziologické nebo biochemicko-genetické vlastnosti organismů těsně korelující s jinými, mnohdy složitějšími, vlastnostmi.
Rozdělení genetických markerů morfologicko-anatomické
biochemicko-fyziologické markery
zásobní a stavební proteiny
biochemicko-genetické
izoenzymy
nukleové kyseliny
Základní rozdělení DNA markerů délkového polymorfismu fragmentů vzniklých restrikčním štěpením (RFLP)
DNA
amplifikace fragmentů DNA v in vitro podmínkách (PCR) detekce variability na základě různých typů propojení metod RFLP a PCR (AFLP) polymorfismu repetetivních sekvencí mini- a mikrosatelitů stanovení sekvencí neboli pořadí nukleotidových párů v molekule DNA
Oblasti využití genetických markerů humánní medicína
veterinární medicína
detekce letálně působících genů detekce napadení člověka například viry určení paternity
detekce napadení zvířat například viry detekce letálně působících genů
kriminalistika
jednoznačná identifikace osob selekce s využitím markerů
šlechtění a plemenářství
identifikace odrůdové pravosti a čistoty určení paternity
evoluční biologie paleontologie historie
fytopatologie
Selekce s využitím markerů Selekce s využitím markerů neboli MAS (Marker Assisted Selection) je aktuální trend ve šlechtění rostlin i zvířat. MAS je založeno na tom, že šlechtitel selektuje potomstvo na základě genetické analýzy s využitím různých typů markerů. Tímto způsobem eliminuje chybu selekce u znaků, které jsou modifikovány vnějším prostředím.
Použití metody MAS výrazně urychluje a zefektivňuje šlechtění. Řada genetických markerů vykazuje kodominanci a umožňují tak odlišit homozygoty od heterozygotů.
U kvantitativních znaků jsou pomocí MAS identifikovány takzvané kandidátní geny, které vykazují majoritní efekt na úroveň kvantitativního znaku. DNA markers can be used to determine whether a seedling carries an allele of interest. Here, the marker for the red-flesh allele is detected as an additional DNA band on an agarose gel. Breeders use information like this to decide which seedlings to grow and which to discard.
http://www.biotechlearn.org.nz/
Biochemicko-genetické markery - detekce variability organismů přímo na úrovni jejich genetické informace. - starší typy markerů (proteiny, izoenzymy) detekovaly variabilitu produktů transkripce a translace.
- současnost: detekce variabilitu nositelů genetické informace – DNA a RNA.
- zpravidla je variabilita detekována a vyhodnocována na základě elektroforetické separace různě velkých molekul obvykle na gelovém nosiči.
Markery založené na polymorfismu DNA Základní vlastnosti DNA markerů:
• jsou aplikovatelné u všech organismů, kde je zvládnutá technika izolace DNA • nejsou závislé na podmínkách prostředí • jejich počet je téměř neomezený • často lze DNA markery lze použít na minimálním množství DNA = nedestruktivní metody (části listů, semena)
• pomocí DNA markerů lze charakterizovat i velmi raná ontogenetická stádia organismů
Proteinové markery Jsou známy vztahy mezi přítomností určité bílkoviny, lokalizací jejího genu a dalšími vlastnostmi rostliny.
Pomocí těchto markerů je možné predikovat například kvalitu složení obilky, odolnosti k některým chorobám nebo stanovit odrůdovou pravost – vypracovány certifikované metodiky
U skotu je obdobným způsobem provedeno hodnocení proteinů mléka. Příklad využití proteinových markerů při studiu linií pýru (Agropyron elongatum) (potenciální zdroj genů tolerance pšenice vůči salinitě a suchu). Přítomnost specifických bandů u linií s vlastnostmi, které by mohly ovlivňovat vlastnosti těsta.
Isozymy = allozymy U většiny enzymů existují takzvané izoformy neboli izoenzymy. Izoenzymy katalyzují stejnou biochemickou reakci, t.j. reagují s jedním substrátem a vytváří shodný produkt. Izoformy jednoho enzymu se vzájemně odlišují například velikostí molekuly.
Levné, rychlé, dostupné …… ?
•Omezená hodnota informací •Exprese závislá na prostředí •Jen čerstvý materiál
Isozymy = allozymy
Isozymy = allozymy
RFLP RFLP - Restriction Fragment Lenght Polymorphism Polymorfismus v délce restrikčních fragmentů
gDNA naštěpíme restriktázou fragmenty rozdělíme elektroforeticky z gelu je přesajeme na membránu membránu hybridizujeme se sondou navázanou sondu detekujeme
•
U malých genomů nebo malých fragmentů DNA s malým počtem vznikajících fragmentů metoda využívá pouhé elektroforetické separace různě dlouhých fragmentů
•
U větších genomů technika využívá DNA-DNA hybridizace na principu Southern blottingu.
Co jsou to restrikční fragmenty?
Restrikční fragmenty jsou úseky molekul DNA, které vznikají enzymatickou aktivitou restrikčních endonukleáz, které rozpoznávají specifické sekvence, kde „přestřihnou“ molekulu DNA.
Postup RFLP Rozpoznávací místo restriktázy EcoRI - 6bp dlouhou sekvencE (GAATTC)
ATCGTCCAGAATTCATGCCCTTCGCCCTTCCGTCCAGAATTCGCCCTTC
Sonda -Ze všech naštípaných fragmentů vybírám pouze určitou část DNA, kterou studujeme (gen)
Postup RFLP Rozpoznávací místo restriktázy EcoRI - 6bp dlouhou sekvencE (GAATTC)
ATCGTCCAGAATTCATGCCCTTCGCCCTTCCGTCCAGAATTCGCCCTTC
Postup RFLP Standartní (popř. dominantní) alela po naštěpení ATCGTCCAGAATTCATGCCCTTCGCCCTTCCGTCCAGAATTCGCCCTTC
ATCGTCCAG AATTCATGCCCTTCGCCCTTCCGTCCAG AATTCGCCCTTC
Postup RFLP Standartní (popř. dominantní) alela po naštěpení ATCGTCCAGAATTCATGCCCTTCGCCCTTCCGTCCAGAATTCGCCCTTC
ATCGTCCAG AATTCATGCCCTTCGCCCTTCCGTCCAG AATTCGCCCTTC Sonda
Postup RFLP Mutovaná (popř. recesivní) alela ATCGTCCAGAATTCATGCCCTTCGCCCTTCCGTCCAGACTTCGCCCTTC ztráta restrikčního místa (nezabrání vazbě sondy)
Postup RFLP Mutovaná (popř. recesivní) alela po naštěpení ATCGTCCAGAATTCATGCCCTTCGCCCTTCCGTCCAGACTTCGCCCTTC
AATTCATGCCCTTCGCCCTTCCGTCCAGACTTCGCCCTTC ATCGTCCAG
ztráta restrikčního místa (nezabrání vazbě sondy)
Postup RFLP Standartní alela
Mutovaná alela
ATCGTCCAGAATTCATGCCCTTCGCCCTTCCGTCCAGAATTCGCCCTTC
ATCGTCCAGAATTCATGCCCTTCGCCCTTCCGTCCAGAATTCGCCCTTC
Štěpení a elfo AATTCATGCCCTTCGCCCTTCCGTCCAGAATTCGCCCTTC AATTCATGCCCTTCGCCCTTCCGTCCAG
AATTCGCCCTTC ATCGTCCAG
ATCGTCCAG
Po provedení elektroforézy, přesátí a hybridizace (Southern blotting) AATTCATGCCCTTCGCCCTTCCGTCCAGAATTCGCCCTTC AATTCATGCCCTTCGCCCTTCCGTCCAG
AATTCGCCCTTC ATCGTCCAG
ATCGTCCAG
RFLP Sondou se rozumí úsek jednořetězcové DNA, který má sekvenci jako detekovaný gen. Sonda je obvykle označena radioizotopem fosforu, který ji umožňuje detekovat.
classes.midlandstech.edu
Genetická interpretace RFLP markerů RFLP markery představují kodominantní typ markerů. Umožňují vzájemně odlišit dominantní homozygoty, heterozygoty a recesivní homozygoty. Uplatňují se například: 1. Pro vyhledávání v genomových knihovnách 2. Pro detekce konkrétních genů 3. Pro detekce bodových mutací 4. Pro tvorbu RFLP map, ….
Segregace RFLP markeru Letální recesivní alela vznikla mutací a liší se od dominantní alely ztrátou restrikčního místa.
• Případ Colin Pitchfork (1983 a 1986) • Dvě slečny znásilněny a zavražděny v hrabství Leicestershire v Anglii • Mentálně zaostalý mladík Richard Buckland, který nahlásil nález druhého těla, se přiznal k zavraždění této dívky • Na základě RFLP vyloučen • 5 000 místních mužů bylo požádáno o vzorek krve nebo bukální stěr • Pekař exhibicionista Colin Pitchfork za sebe k odběru poslal (za 200 liber) kamaráda Iana Kellyho, který se tím pochlubil v hospodě • První omilostnění a první obvinění pomocí DNA důkazů.
Nevýhody RFLP • Požadavek velkého množství intaktní DNA (50 ng odpovídá ~ 10 000 buněk) • Metoda málo robustní (interpretační potíže)
Replikace „in vivo“
www.genetika-biologie.cz
Amplifikace fragmentů DNA v in vitro podmínkách Tato metoda detekce genů je označována jako polymerázová řetězová reakce PCR (Polymerase Chain Reaction). Je založena na zmnožení hledaného úseku DNA. Který je ohraničen známými sekvencemi – takzvanými primery. Metoda je tvořena opakováním těchto kroků: • denaturace analyzované templátové DNA
• nasedání dvojice primerů – annealing • prodlužováním fragmentů DNA. Zmnožení fragmentu DNA je prováděno v termocykleru. tnrtb.wordpress.com
http://www.karymullis.com/
PCR – replikace „in vitro“ PCR – Polymerase Chain Reaction Polymerázová řetězová reakce • 1955 - objev DNA polymerázy a první pokusy s umělou syntézou většího množství DNA (amplifikace DNA) • 1983 – Karry Mullis pracoval na projektu geneticky podmíněných chorob člověka v kalifornské firmě Cetus Corporation. Hledal novou metodu analýzy mutací DNA. Modifikoval Sangerovu metodu sekvenace DNA – přidal zpětný primer pro syntézu krátkých úseků DNA. Uvědomil si, že opakováním amplifikace DNA pomocí DNA polymerázy může vést k řetězovému množení specifického segmentu genomu - PCR. „Pomocí PCR můžete z jedné molekuly DNA vytvořit 100 biliónů kopií za jedno odpoledne. Potřebujete jenom zkumavku, několik jednoduchých reagencií a zdroj tepla“ • 1984 – rozpracování metody s matematikem Fredem Faloonou, patentování (Mullis et al. 1986; Mullis a Faloona 1987) • • 1993 – Nobelova cena za chemii • V devadesátých letech Cetus Corp. prodává patenty „PCR a Taq“ firmě Hoffman–La Roche za 330 miliónů $
Polymerázová řetězová reakce
denaturace
„annealing“
prodlužování cit.vfu.cz
Zvyšování počtu kopií fragmentu DNA při PCR
PCR – replikace „in vitro“
DNA
PCR – Polymerase Chain Reaction
• další rozvoj metody s použitím termostabilní polymerázy z termofilní bakterie Thermus aquaticus = zkratka Taq Pol" nebo "Taq")
Jak lze zjistit výsledek amplifikace
www.austincc.edu
Výsledek amplifikace se stanovuje gelovou elektroforézou.
Elektroforeogram amplifikovaných fragmentů DNA, které umožní identifikovat odrůdy brambor.
PCR – hlavní faktory ovlivňující průběh reakce Koncentrace dNTPs - stock solution 100mM - ředění na 20 a 200mol (pro každý dNTP) – vyšší specifičnost a nižší frekvence
zařazení nesprávného nukleotidu
Koncentrace MgCl2 - optimum je 1,5-2mM, - nad 6mM klesá aktivita Taq Polymerázy
- nízká koncentrace – nízké výtěžky PCR - příliš vysoké koncentrace – rozmazané proužky na gelu nebo zmnožení nespecifických produktů
Teplota annealingu – nasednutí primerů - vyšší teplota = vyšší specifičnost ke komplementární sekvenci = primer nasedá na komplementární místo s vyšší přesností = přesnější výsledek PCR
- nižší teplota – vhodné pro studie, kdy se používají primery odvozené od příbuzných druhů; nebezpečí vzniku nespecifických produktů (jiné úseky DNA, než které jsme chtěli získat) - zvýšení specifičnosti např. tzv. Touch down PCR – v prvních cyklech vyšší teplota = specifické produkty, ale v s nižším výtěžkem = v dalších cyklech vyšší teplota annealingu = zvýší se výtěžek PCR - Koncentrace templátové DNA – příliš vysoká konc. DNA může bránit PCR, zároveň se naředí inhibitory PCR ve směsi (např. chemikálie použité při izolaci)
PCR – hlavní faktory ovlivňující průběh reakce Volba polymerázy – odlišné výsledky PCR od Taq P. od různých firem - např. pro sekvenace – „proofreading polymerase“ – nižší procento vložení chybného nukleotidu
Aditiva - pro zvýšení efektivity PCR, stabilizaci enzymu - v pufru dodávaném s polymerázou: - detergenty (TRITON X-100, TWEEN, NP-40) zpravidla 2 ze tří uvedených - dimetylsulfoxin nebo glycerol – lepší průběh denaturace a chlazení - BSA (bovinní sérový albumin) nebo želatina
- Finální koncentrace aditiv se pohybuje mezi 0,1 a 1,0% celkové reakční směsi, avšak konkrétní koncentrace je většinou nutno empiricky vyzkoušet. Kontaminace – nebezpečí zejména u málo koncentrovaných nebo problematických templátů - sterilní špičky, vysoce čistá voda pro PCR, pufry, PCR zkumavky, rukavice (nikdy nesterilizovat dNTPs, primery, polymerázu ) - příprava PCR směsí ve flow boxu v oddělené místnosti od prostor, kde se pracuje s produkty - při přecházení z místností měnit rukavice…..
Optimalizace reakčních podmínek PCR Změny v protokolu vedoucí k odstranění nežádoucích nespecificit a ke zvýšení množství PCR produktu. - počet cyklů - annealingová teplota - koncentrace Mg2+, polymerázy, templátové DNA - aditiv (např. DMSO, formamid) -
Příklad optimalizace PCR Podmínky podle literatury 1
1
1 1 2
1
1 B
PCR po optimalizaci 1
1
1
1 2
2
1
1
Marker 1 - produkt 240bp
Ta = 62°C, 30 cyklů 20uM primery
Ta = 67°C, 25 cyklů 10uM primery
1
1
1
1 1 2
1
1 B
1
1
1 2
2
1
Marker 2 - produkt 460bp
Ta = 66°C, 30 cyklů 20uM primery
Ta = 66°C, 25 cyklů 10uM primery
1
RAPD - Random Amplified Polymorphic DNA Variabilita délek náhodně amplifikované DNA
RAPD Random Amplified Polymorphic DNA Variabilita délek náhodně amplifikované DNA • PCR s jedním primerem • Primer dosedne na různých místech a v různých směrech amplifikuje DNA fragmenty
Identifikace např. kmenů bakterií
popř. ověřování homogenity linií
RAPD
Výhody - Velmi levné - Rychlé a snadné = není třeba znát sekvenci primeru, stačí velmi málo DNA, poměrně dost fragmentů…
Nevýhody převažují: - Omezena hodnota informace (dominantní marker) - Nereproducibilní DNES TREND NEUŽÍVAT RAPD MARKERY
AFLP - Amplified Fragment Length Polymorphism Polymorfismus délky amplifikovaných fragmentů
AFLP Princip • • •
metoda založená na restrikci DNA dvěma enzymy selektivní namnožení jen některých proužků vizualizace proužků na gelu
Postup – relativně složitý (4 fáze) 1. RESTRIKCE • specifické rozštěpení DNA restrikčními endonukleázami MseI - rozpoznává 4bp dlouhou sekvenci (TTAA) EcoRI - rozpoznává 6bp dlouhou sekvenci (GAATTC) (Variabilita je dána mutací v restrikčním místě insercí - delecí mezi restrikčními místy)
• získáme množství fragmentů s „lepivými konci“ = „sticky ends“
AFLP – 2. ligace
• pomocí T4 ligázy k fragmentům přidány adaptory = oligonukleotid, jeho sekvenci známe • známe sekvence konců všech fragmentů … můžeme je amplifikovat PCR
AFLP – 3. preselektivní amplifikace klasická PCR s primery komplementárními k sekvenci adaptorů, navíc 1 nukleotid směrem dovnitř amplifikovaného úseku = selekce jen ca. 1/4 fragmentů (fragmenty komplementární k primerům + fragmenty EcoRI- MseI)
AFLP – 3. preselektivní amplifikace
restrikce + ligace
AFLP – 3. preselektivní amplifikace
restrikce + ligace
preamplifikace
AFLP – 4. selektivní amplifikace -fragmentů je stále mnoho pro objektivní vyhodnocení -další redukce jejich počtu použitím primerů se 3mi selektivní nukelotidy (s přesahem "dovnitř" amplifikovaných fragmentů)
- tento krok se provádí opakovaně s různými primerovými kombinacemi (primery se liší zařazenými nukleotidy na koncích -redukce na 1/256 všech fragmentů (1/16 x 1/16)
AFLP – 5. vyhodnocení
-primery jsou fluorescenčně značeny sekvenátor
- Primery bez značení PAGE elektroforéza
AFLP realizace AFLP –- realizace 1: Restrikce - příprava restrikčního mixu (EcoI, MseI, buffer, voda) - přidat k DNA - inkubovat 2 hod při 37°C 2: Ligace - příprava ligačního mixu (LIGAZA, BUFF, ADAPTORY, VODA) - přidat k roztoku z předchozího kroku - inkubovat 2,5 hod při 37°C 3: Preamplifikace - klasická PCR - ligační roztok jako matrice Kroky 1-3 se provedou pouze 1x, dál pracujeme s preamplifikátem 4: Amplifikace - klasická PCR - matrice = preamplifikát - měníme kombinace primerů = detekujeme jiné fragmenty
MIKROSATELITY
MIKROSATELITY krátké tandemové repetice, STR (short tandem repeats) repetice jednoduchých sekvencí, SSR (simple sequence repeats) •krátké, tandemově se opakující jednoduché sekvenční motivy zpravidla o délce 2-6bp •prokaryota a eukaryota •kódující i nekódující oblasti •Vysoká mutační rychlost (u savců 10-3 až 10-4/lokus/generaci) hlavní zdroj vysoké proměnlivosti - sklouznutí nukleotidového řetězce během replikace (replication slippage) …. …GTTCTGTCATATATATATATAT…………CGTACTT… …GTTCTGTCATATATATATATATATATATCGTACTT… •Alely se liší svou délkou…… •Snadná separace pomocí elektroforézy
MIKROSATELITY – Dokonalé = perfect repeats (jeden nepřerušený motiv): • • • • • •
Jednonukleotidové: …AAAAAAAAAAAAAAAAAA… Dinukleotidové: …CACACACACACACACACACA… = (CA)n Trinukleotidové: …CGTCGTCGTCGTCGTCGTCGT… = (CGT)n Tetranukleotidové: …CAGACAGACAGACAGACAGA… =(CAGA)n Pentanukleotidové: …AAATTAAATTAAATTAAATT… =(AAATT)n Hexanukleotidové: … CTTTAACTTTAACTTTAACTTTAA… =(CTTTAA)n – Pr: …(AG)32…; …(TAT)25…; …(CAA)7… Cicer
– Nedokonalé = imperfect repeats (motiv je přerusen jedním nebo několika bazemi): • …(TC)6A(TC)13…; …(AG)12GG(AG)3… Cicer
– Složené = compound: (směs dokonalých nebo nedokonalých vzorů několika motivů) • …(AT)6(GT)42AT(GT)5(GT)10… • …(AT)14(AG)8… • …(GAA)21…(TA)23
• Nejčastější motivy: mono a dinukleotidové; 3, 4 a 5ti méně
MIKROSATELITY
…GTTCTGTCATATATATATATCGTACTT… celková DNA PCR – specifický pár primerů
ELFO separace
MIKROSATELITY Výhody - vysoká variabilita -
velká početnost a rozmístění po celém genomu
-
jednoduchost analýzy (mikrosatelity lze poměrně snadno studovat pomocí PCR)
-
robustní a reproducibilní markery
-
KODOMINANTNÍ MARKER, IDENTIFIKACE ALEL Nevýhody - Musíme znát sekvence primerů -
Pokud neznáme, tak testovat SSR z příbuzných druhů Optimalicace PCR Popřípadě vyvíjet nové: EST-SSR
MIKROSATELITY - využití jaderné mikrosatelity (SSRs) • nejlepší marker pro zhodnocení variability na populační úrovni • jsou potřeba druhově specifické primery, tj. metoda použitelná pouze v případě, že pro studovaný druh byly primery již publikovány
chloroplastové mikrosatelity (cpDNA SSRs) • vhodné pro hodnocení variability na úrovni příbuzných druhů, někdy i na vnitrodruhové úrovni • dostupné jsou univerzální primery
Obecně: • •
Forenzní genetika: kriminalistika, identifikace jedinců, příbuzenské vztahy analýza rodičovství (parentage analysis) • určení rodičů semen (semenáčků) v populacích
• •
identifikace klonů populačně-genetické studie • genový tok, migrace • historie populací
MIKROSATELITY - využití
MIKROSATELITY - využití
SEKVENOVÁNÍ DNA
SEKVENOVÁNÍ DNA - princip
• zjištění pořadí nukleotidů v řetězci DNA …ATATATAGGCAAGGAATCTCTATTATTAAATCATT… • Zjištění rozdílů mezi jedincemi, geny • Základní informace pro konstrukci primerů • využití informace ke zjištění průběhu a rychlosti evoluce • zjištění podobnosti a příbuznosti taxonů
SEKVENOVÁNÍ DNA - princip
• 1) Předstupeň: PCR s použitím dvojice primerů • namnožení studovaného úseku DNA
• 2) sekvenační reakce • použití pouze jednoho primeru • kromě dNTP jsou ve směsi přítomny i ddNTP • produkce fragmentů lišících se přesně o 1 bázi
• Elektroforetická separace fragmentů na gelu • automatický sekvenátor
SEKVENOVÁNÍ DNA
Aplikace - Aplikační možnosti: 1. evoluce genů (vznik alel, lokusů,redukce polymorfismu v důsledku selekce atd.) 2. vnitrodruhové (populační) studie (geografická proměnlivost, tok genů, hybridizace, fylogeografie (př. mitochondriální geny, Y chromozom)
3. mezidruhové studie (studium speciace, biogeografie) -
volba správné sekvence
4. Detekce SNP = identifikace jedinců, taxonů, populací – sekvenace pomáhá nalézt drobné populačně- i taxonově-specifické rozdíly
Výhoda - Možnost srovnání sekvenčních dat o vašem organismu s údaji v internetových databázích
Př: http://www.ebi.ac.uk/embl/
SEKVENOVÁNÍ DNA 1977: dvě metody zjištění pořadí nukleotidů v DNA
Maxamova-Gilbertova (chemická) metoda je založena na bázově-specifické chemické modifikaci a následném štěpení fragmentů DNA - dnes se neužívá Krátká sekvenceDNA (ds nebo ss) * na 5' konci radioaktivně označena 32P. * vzorek se rozdělí na pět částí a) Přídavek chemikálí – modifikují vždy jeden nebo dva typy nukleotidů: 1. dimethylsulfát: G 2. kys. mravenčí: A+G 3. hydrazin: C + T 4. 1,5M NaCl: C b) Přídavkem piperidinu: štěpení DNA v místě modifikace c) Elfo separace Výsledek ELFO: sekvence DNA: 5´-GTCTGCA-3´ (čte se zespodu)
- narazila na technické problémy s vývojem standartních molekulárních kitů - technicky příliš komplexní a příliš mnoho toxických látek
SEKVENOVÁNÍ DNA Sangerova metoda terminace řetězce Sangerova metoda • založena na terminaci replikace nového řetězce
podle matrice zkoumané sekvence dideoxynukleozidtrifosfátem (ddNTP) • na 3’-uhlíku deoxyribózy chybí OH-skupina a proto k nim DNA polymeráza nemůže navázat další nukleotid •pokud během replikace dojde k náhodné inkorporaci dideoxynukelotidu (ddA, ddC, ddG, ddT), replikace se zde zastaví
SEKVENOVÁNÍ DNA Sangerova metoda založená na terminace řetězce Sangerova (enzymatická) metoda •Vzorek DNA se rozdělí do čtyř zkumavek a do každé se přidá specifický primer, směs všech čtyř standartních nukleotidů a DNA polymeráza
•Do každého ze vzorků je přidán vždy jen jeden značený dideoxynukleotid - v určitém poměru s deoxinukleotidy •Př: • ddA + dA, dG, dC, dT • ddT + dA, dG, dC, dT…. •Po ukončení amplifikace separace pomocí denaturující PAGE v dlouhém (sekvenačním) gelu + detekce autoradiograficky
• výsledné pořadí nukleotidů se odečte
SEKVENOVÁNÍ DNA - zefektivnění Sangerovy metody vývoj kapilárních sekvenátorů •
Syntéza DNA je v principu totožná s asymetrickou PCR (tj. s jedním primerem) v normálním termocykleru, s extenzí řetězce Taq polymerázou.
•
k detekci produktů jsou užívány fluorescenčně značené ddNTP = každý dideoxynukleotid má jinou značku – tzv. „Dye-terminator sequencing“ •
Př. ABI PRISM® Big Dye™ Terminator v 3.1. Ready Reaction Cycle Sequencing Kit
• Polymerizační reakce probíhá v jednom vzorku •
během PCR dochází k produkci fragmentů lišících se o jednu bázi
•
detekce produktů probíhá během elektroforetické migrace v kapiláře pomocí laserového detektoru
•
sekvence je zaznamenána přímo do paměti počítače
•
500 – 700 bp/run
SEKVENOVÁNÍ DNA - zefektivnění Sangerovy metody vývoj kapilárních sekvenátorů
Vzorek s fluorescenčně značenými fragmenty po PCR
SEKVENOVÁNÍ DNA
SEKVENOVÁNÍ DNA - zefektivnění metody vývoj kapilárních sekvenátorů Kapiláry - vnitřní průměr 50μm - naplněny gelem s nízkou viskozitou, který nahradil polyakrylamid (dříve kapiláry nešlo opakovaně používat) - kratší časy analýz - plně automatizované systémy
Automatické sekvenátory
Nature Reviews Microbiology 7, 287-296
NGS = Next Generation Sequencing
Celogenomové sekvenování -
paralelně probíhající sekvenační reakce
-
produkují tisíce – miliony sekvencí v jednom běhu
-
čtení kratších úseků (30-300bp)
-
Obecný postup 1.
Izolace DNA
2. Příprava DNA knihovny – PCR, klonování 3. Vlastní sekvenace 4. Vyhodnocení surových dat 5. Sestavení konsenzuální sekvence
Nature Reviews Microbiology 7, 287-296
454 - Pyrosekvenace - první nová sekvenační metoda (1998) - princip: detekce aktivity DNA-polymerázy během syntézy DNA
- Výhody: - délka čtených úseků 700bp - rychlost – sekv. cyklus 10 hodin - sekvenace PCR produktů - Nevýhody - překryvy homopolymerních oblastí - cena
454 sekvenování Ligace adaptorů - B adaptor má biotinovou značku pro přichycení na streptavidinem obalenou magnetickou kuličku
úseky 300 bp - čteno 400 tisíc fragmentů najednou Fragmentace DNA - 300-800bp
Pico-titer plate (sekvenační čip - obsahuje 1,6 mil jamek širokých 44μm - průměr DNA kuličky je 26 μm -přídavek menších kuliček dvou typů – jeden obsahuje chemikálie pro pyrosekvenaci, druhý typ fixuje kuličky s DNA
Emulzní PCR - DNA kuličky do roztoku oleje a vody - Protřepání = vznik mikroreaktoru okolo kuličky
Sekvenační reakce - Na destičku se cyklicky nanáší roztok polymerázy a vždy jednoho nukleotidu… viz. pyrosekvenace
Záznam a zpracování dat
Pyrosekvenování
1. začlenění nukleotidu (konkrétní typ, ne směs) 2. uvolnění pyrofosfátu (PPi) 3. Vznik ATP •
Enzym ATP sulfuryláza katalyzuje vznik ATP reakcí PPi s adenosinfosfosulfátem (APS)
4. Emise záření: •
enzym luciferáza spotřebuje vzniklý ATP na oxidaci luciferinu – záblesk
5. Detekce záblesku 6. Enzym apyráza odstraní nespotřebované nukleotidy a ATP
7. Promytí systému 8. Změna typu nukleotidu ve směsi – krok č 1.
pico-titer plate from Roche's FLX
Roche 454 sequencing
Illumina Genome Analyzer -metoda sekvenace syntézou (SBS-sequencing by synthesis) - r. 2006; úseky 35-50bp - 1) Příprava knihovny - fragmentace - na konce dva adaptéry - ELFO: vyříznou se fragmenty 150-200bp - přečištění - 2) Amplifikace fragmentů (bridge amplification) - na sklíčku jsou oligonukleotidy komplementární k oběma adaptorům - jednovláknové fragmenty se navážou na sklíčko – vytvoří „můstek“ - dosyntetizování komplementárního vlákna - denaturace – dva identické fragmenty navázané na sklíčko blízko sebe - opakování = vznik tisíců kopií těsně vedle sebe v tzv. „clusterech“
Illumina Genome Analyzer - 3) sekvenační reakce - v každém cyklu NARÁZ všechny nukleotidy - mají fluorescenční značku a modifikovaný 3´konec (brání zařazení více nukleotidů v jednom kroku) - zařazení nukleotidu provázené emisí světla, charakteristického pro daný nukleotid - detekce - odstranění fluoresc. značky a odblokování 3´konce - opakování postupu - x cyklů - zpracování dat
Illumina sequencing
SOLiD sequencing
Sekvenace pomocí LIGACE krátkých oligo sond, které jsou fluorescenčně značeny + cena + vysoká přesnost metody (99,95%) + malé množství vzorku - čtené úseky: 100 bp - náročnost zpracování dat a rychlost analýzy (týden)
SOLiD sequencing
1. Příprava DNA knihovny •
Štěpení templátové DNA na kratší fragmenty
•
Připojení adaptorů P1 a P2
•
emPCR – amplifikace fragmentů na magn. kuličkách
•
modifikace 5´konce – připojení na sekvenační destičku
2. Vlastní sekvenace
SOLiD sequencing - Sekvenační reakce •
Navázání univ. primeru, ligace sondy
•
Připojení univ. primeru k adaptoru P1
•
Přidání oktamerních sond s fluoro. značkami
4 barvy, 16 kombinací koncových nukleotidů na 1. a 2. pozici Pokud je sonda na 1. a 2. pozici komplementární k 1. a 2. pozici templátu – prodloužení řetězce DNA ligázou
2. Emise a detekce fluoresc. signálu 3. Odštěpení fluoresc. značky (štěpení sondy mezi 5. a 6. nukeotidem) 4. Opakování kroků 1. – 3. x-krát po konec sekvence 5. Reset primeru – odštěpení nově nasynt. Vlákna 6. Napojení nového univ. primeru k adaptoru P1 - primer je o jeden nukleotid kratší 7. Opakování kroku 1.-6. s primery (n-2) až (n-6) 8. Vyhodnocení dat – dešifrování barevného kódu
8. Vyhodnocení dat – dešifrování barevného kódu - každá báze je určena na základě dvou nezávislých sekvenačních cyklů
SOLiD sequencing
Odvozené metody využívající NGS sekvenace při hledání SNP polymorfismů
RRL sequencing
Trends in Genetics April 2013, Vol. 29, No. 4
RAD-Taq sequencing - restrikce: DNA je naštípána restriktázami, - ligace: na vzniklé fragmenty je navázán adaptor, - vysokokapacitní NGS sekvenování (tagged fragment amplification) - analýza dat ……. - Hledání SNP – a) anotace k referenčnímu genomu b) pooling vzorků a hledání SNP lokusů (putative RADtaq locus) - Kombinace snížení komplexnosti genomu restrikčním štěpením s NGS sekvenováním.
That´s all folks!
