No title

Investice do rozvoje vzdělávání

Inovace studia molekulární a buněčné biologie reg. č. CZ.1.07/2.2.00/07.0354

Tento projekt je spolufinancován Evropským sociálním fondem a státním rozpočtem České republiky.


Genomika (KBB/GENOM)



Fyzické mapování Fyzické kontigové mapy Ing. Hana Šimková, CSc.


Cíl přednášky


- seznámení s konstrukcí fyzických kontigových map a jejich ukotvováním

Klíčová slova - fyzické mapování, fingerprinting, kontig, ukotvování fyzických map, integrace genetických a fyzických map


KONSTRUKCE FYZICKÝCH KONTIGOVÝCH MAP


Kontig – řetězec po sobě jdoucích fragmentů DNA vytvářejících spojitou sekvenci Kontigová fyzická mapa se skládá z překrývajících se klonů z knihoven dlouhých inzertů Konstrukce fyzické kontigové mapy: sestavování kontigů ověřování správnosti kontigů pomocí genetických a cytogenetických markerů integrace genetických a fyzických map


1) Sestavování kontigů - z překrývajících se klonů z knihoven dlouhých inzertů. Překryvy je možno zjišťovat na základě - analýzy restrikčních spekter (fingerprintů) Investice do rozvoje vzdělávání

- vyhledávání společně se vyskytujících markerů (STS, genetické markery)


Uspořádání klonů na základě srovnání restrikčních spekter (fingerprinting)


Fingerprint = unikátní spektrum restrikčních fragmentů získaných na základě štěpení 1 nebo více restriktázami a frakcionace takto vzniklých fragmentů. Klony odvozené z jednoho místa genomu sdílejí určitou část restrikčního spektra. Různé varianty fingerprintingu: a) štěpení 1 restrikční endonukleázou (RE) s 6-bp restrikčním místem (cca 20-45 proužků na klon) - elektroforéza na agaróze, barvení ethidium bromidem - vizualizace téměř všech fragmentů  jednoznačnější stanovení přesahů – spolehlivější, je možné zjistit velikost BAC klonu, nejlevnější  omezená automatizace, nižší informační hodnota Alternativní způsob vytváření fingerprintů - optickým mapováním.

Gibson a Muse, 2004



b) štěpení více RE + koncové značení - radioaktivně - fluorescenčně Analýza na polyakrylamidovém gelu - vertikální elektroforéza - sekvenátor

Kombinace 2 enzymů, radioaktivní značení


Automatizovaný postup fyzického mapování BAC klonů - izolace DNA z BAC klonů - štěpení 1 až 4 vzácněji štěpícími RE (s 6-bp místem) zanechávajícími kohezní konce - štěpení 1 často štěpící RE (s 4-bp místem) zanechávající tupé konce

5’ 3’

GGCC

T C TAGA

CCGG

CCGG

AGAT CT

GGCC

3’ 5’

XbaI + HaeIII


- koncové značení fluorescenčně značenými ddNTP (1 až 4 různé barvičky) – jen u kohezních konců

*

5‘

TC

3‘

AGATC

CTAGA

*CT

3‘ 5‘

Fragmenty 35-600 bp – získáme celkově až stovky fragmentů, viditelných (tj. nesoucích fluorescenční barvičku aspoň na 1 konci) do 50 pro 1 enzym. Optimum – 50-250 proužků pro všechny enzymy dohromady. - frakcionace – sekvenátor – použití vnitřního standardu v každé kapiláře - vyhodnocení – program FPC (FingerPrintedContigs) - porovná fingerprinty - poskládá klony do kontigů - navrhne nejkratší cestu pro sekvenování (minimum tiling path - MTP) Tento projekt je spolufinancován Evropským sociálním fondem a státním rozpočtem České republiky.

Využití kitu SNaPshot pro barevné značení


BamHI

EcoRI

EcoRI

HaeIII

HaeIII

Výstup ze sekvenátoru

(adapted from Luo et al., Genomics, 2003)


Luo et al. 2003

Čtyřbarevné značení – oddělení barev

BamHI


EcoRI

XbaI

XhoI

Velikostní standard (Liz) Tento projekt je spolufinancován Evropským sociálním fondem a státním rozpočtem České republiky.

HICF (high information content fingerprinting) fingerprinting s vysokým informačním obsahem


Izolace DNA z BAC klonů

Štěpení 5 restrikčními endonukleázami Sestavování kontigů (Genoprofiler, FPC)

Fluorescenční značení (SNaPshot kit) (Luo et al, 2003, Genomics)

Kapilární elektroforéza (ABI3730)


Konstrukce fyzické mapy


Výběr metody pro daný genom tak, aby byl dosažen a) optimální počet analyzovaných proužků - méně proužků – nižší informační hodnota, větší relativní chyba - příliš mnoho proužků – více falešně pozitivních překryvů b) dostatečná vzdálenost mezi proužky Sulston cutoff score (Sulstonova prahové hodnota) vyjadřuje pravděpodobnost, že proužky společné pro 2 fingerprintované klony jsou výsledkem náhody. Pokud je hodnota nižší než tento uživatelem nastavený práh, klony jsou prohlášeny za překrývající se. Udává se jako e-n.

Meyers et al. 2004

Větší genomy vyžadují mnohem nižší hodnotu Sulstonova skóre (vyšší n). Tento projekt je spolufinancován Evropským sociálním fondem a státním rozpočtem České republiky.

Závislost mezi Sulston cutoff score a rozsahem překryvu BAC klonů křivka pro BAC klon o velikosti cca 125 kb

1e- 45


1e-75

50- 60%

70-80%

% překryvu klonů Paux et al. 2008 Tento projekt je spolufinancován Evropským sociálním fondem a státním rozpočtem České republiky.

Sestavení fyzické mapy chromozómu 3B pšenice s použitím programu FPC

[e-70] [e-65]


Počet kontigů

[e-60] [e-75]

[e-55] [e-50] [e-45] [e-25]

Počáteční sestavení (automaticky s vysokou přísností)

Následné automatické sestavení s klesající přísností (merging, DQing…)

Manuální upravování sestavy (merging, splitting, killing…) Paux et al. 2008


Vyhledávání překryvů na základě společných markerů


Obvykle slouží k doplnění fingerprintingu, propojení dosud nespojených kontigů. Lze použít i samostatně, ale velmi pracné, vyžaduje vysokou hustotu markerů. STS markery (sequence-tagged site – místo se sekvenční adresou) – krátká sekvence, kterou lze amplifikovat pomocí PCR a kterou lze lokalizovat na jediném místě v genomu a) odvozeny z náhodných sekvencí (nemusí být polymorfní) b) odvozeny z genetických markerů (např. ISBP, mikrosatelitů, RFLP) c) odvozeny z ESTů (expressed sequence tag – místo s expresní adresou)


2) Ověřování správnosti kontigů - integrací genetických a fyzických map – markery ve vazbě by


měly kolokalizovat na dlouhých kontizích - sekvence z obou konců dlouhých kontigů použít k odvození genetických markerů – ty by měly kosegregovat Tyto koncové sekvence (BAC end sequences = BES) také mohou posloužit ke spojení dvou kontigů: - odvození sondy z konce kontigu - skríning knihovny - vytipování BACu – získání jeho koncové sekvence – může být na dalším kontigu


Ukotvování kontigů pomocí FISH - pro kontigy, které nelze ukotvit

Dvoubarevná FISH

- pro kontrolu orientace kontigů - pro zjištění velikosti mezer mezi kontigy

172A10 + 173K08

140C18 + 173K08


VIRTUÁLNÍ DVOU KONTIGŮ Na základěSPOJENÍ dvoubarevné FISH jsou oba kontigy v těsné blízkosti nebo se překrývají

PŘEKRYV ?

FISH

172A10 (5 kb)

140C18 (8 kb)

173K08 (3 kb)

Podle FISH jsou oba kontigy lokalizovány na distálním konci 3B Tento projekt je spolufinancován Evropským sociálním fondem a státním rozpočtem České republiky.

Zjištění vzájemné pozice dvou BAC klonů pomocí FISH na natažených chromozómech


mitotické chromozómy

natažené chromozómy

mezera cca 30 kb


3) Integrace genetických a fyzických map Genetická mapa Xbcd907 Xcdo460


Xtam61 XksuH7 Xpsr689 Xabg471

Xbcd1418 Xfbb378

Xcfa2226 Xcfa2191 Xcfd143 Xgwm493 Xbarc147 Xbarc133 Xbarc75 Xbarc102 Xgwm389 Xgwm533-1 Xgwm533-2 Xwmc43 Xgwm264 Xgwm566 Xgwm72 Xcfd4 Xcnl3 Xgwm285 Xgwm131 Xgwm77 Xgwm108 Xgpw1146 Xgwm112 Xgwm376 Xbarc164 Xgwm284

Xbcd131

Deleční mapa

3BS-8

3BS-9 XksuH7 Xpsr689 3BS-1

C

3BL-2 Xcfa2170

Xfba360 Xbg131 Xtam63

Xgwm299 Xbarc77 Xbarc84 Xgwm114 Xpsp2151 Xgwm547 Xgwm247 Xgwm181 Xgwm340

Xmwg11

Paux et al. 2008

Fyzická mapa Xgwm493 Xbarc87 Xbarc147 Xbarc102 Xbarc75 Xgwm389 Xgwm533 Xbarc68 Xbarc156 Xbarc73 Xgwm264 Xgwm144 Xcfd79 Xgwm566 Xgwm72 Xgwm285 Xgwm77 Xbarc139 Xgpw1146 Xgwm376 Xgwm131 Xgwm108 Xbarc77 Xbarc1077 Xgwm112 Xgwm114 Xbarc203 Xbarc1044

3BL-10

Xcfa2191 Xcfa2226 Xcfd143 Xbarc133

Xwmc43

Xcfd4

Xgwm284 Xbarc164 Xcnl3

Xpsp3081

Xbarc164 3BL-7

Xpsr170 XksuG62

Xcfa2170 Xgwm547 Xgwm181 Xbarc84

Xgwm299 Xpsp2151 Xgwm247 Xgwm340 Xfwm4


?

A) Přímé ukotvování (forward contig anchoring)


Přímé ukotvování: - z genetických map do kontigů pomocí geneticky zamapovaných markerů (SSR, EST, RFLP, DArT, SNP…) Provádí se skríning knihovny genetickými markery - je možné i s větším počtem sond – poolovací strategie (strategie směsných vzorků): a) PCR skríning – pooly z knihovny – miskové+řádkové+sloupcové (=3D), ale i 5D, 6D pooly. b) skríning hybridizací – na membránách o vysoké hustotě

Paux et al., Science, 2008) Tento projekt je spolufinancován Evropským sociálním fondem a státním rozpočtem České republiky.

a) Vytváření třídimenzionálních směsných vzorků (poolů)


48 PCR reakcí umožní proskrínovat 8 misek po 384 jamkách, tedy najít 1 pozitivní klon mezi 3072.

CNRGV Toulouse Tento projekt je spolufinancován Evropským sociálním fondem a státním rozpočtem České republiky.

b) Hybridizace na membránách o vysoké hustotě Nanášecí schéma 5x5, každý klon 2x


Nylonová membrána s nanesenými klony

CNRGV Toulouse

Detail

Po hybridizaci s radioaktivně značnou sondou Tento projekt je spolufinancován Evropským sociálním fondem a státním rozpočtem České republiky.

Skríning hybridizací – na membránách o vysoké hustotě - sonda z 1 markeru (např. EST) - směsné sondy z několika typů markerů - sondy z překrývajících se oligonukleotidů (overgos) odvozeny z kusu známé unikátní sekvence – 2 částečně se překrývající oligonukleotidy 22-24 bp

konce doplněny radioaktivně značenými oligonukleotidy


8 bp 22-24 bp

 vysoká specificita hybridizace (odvozeno z jednokopiových sekvencí), silné signály, lze snadno odmýt – hybridizační membránu je možno použít víckrát  poměrně vysoké náklady na syntézu overgos


B) Reverzní ukotvování (reverse contig anchoring)


Reverzní ukotvování (chromosome landing): - ukotvování kontigů BAC klonů na genetickou mapu (přes genetický marker obsažený v kontigu) – využívá markerů odvozených ze sekvencí BAC klonů nebo konců BAC klonů (BES) – SSR, ISBP, SNP, …, které se geneticky zamapují za použití mapovací populace

Paux et al., Science, 2008) Tento projekt je spolufinancován Evropským sociálním fondem a státním rozpočtem České republiky.

No title

Recommend Documents