PCR diagnostika lymeské borreliózy. Mgr. D. Berenová, J. Hořejší, Ing. A. Lukavská, RNDr. P. Kodym, CSc. Národní referenční laboratoř pro lymeskou borreliózu Centrum epidemiologie a mikrobiologie Státní zdravotní ústav Praha 2O12
Dlouhý P, Honegr K, Krbková L, Pícha D, Roháčová H, Šruncová V. Lymeská borrelióza: Doporučený postup v diagnostice, léčbě a prevenci. Vydán: květen 2011
PCR detekuje ve vyšetřovaném materiálu borreliovou DNA – nejvyšší záchyt bývá v synoviální tekutině případně v bioptickém vzorku z kůže, vyšetření likvoru bývá často negativní. Vyšetřování moče či krve je nevhodné. Metoda je považována pouze za doplňkovou - není standardizována a dostupné komerční sety jsou určeny pouze pro výzkumné účely. K přímému průkazu původců LB v klinickém materiálu by bylo možné použít elektronové mikroskopie s identifikací spirochét v tkáňové biopsii či tělních tekutinách; jde o metodu vyhrazenou spíše k výzkumným účelům.
Přehled PCR metod •
16S rRNA –
v současnosti používáme endpoint kit Borrelia s.l. od firmy Sacace Biotechnologies (Dynex), dle námi provedených testů má záchyt na všech 5 patogenních borrelií v Evropě (Borrelia burgdorferi sensu stricto, B. garinii, B. afzeli, B. valaisiana, B. lusitaniae)
•
ospA –
nested využíváme pro potřeby genotypizace, sekvenace
(Motter et al. 1994, Detection of Borrelia burgdoferi sensu lato in lesional skin of patients with erythema migrans and acrodermatis chronica atrophicans by OspAOspAspecific PCR. J Clin Microbiol.) •
Artus Borrelia LC PCR kit (Qiagen) kvantifikace BBSL, výzkumné účely
•
RT RT--PCR flagelín – nízka senzitivita
–
kit pro Real Time PCR,
Vhodný materiál Krev – nesrážlivá (EDTA, Citrát) Likvor Biopsie – kůže, sval, myokard, synovie Borreliová DNA obsahuje asi 29% GG-C párů, což znamená, že její DNA není stabilní a podléhá rychlé degradaci, proto pro všechen uvedený materiál platí co nejrychlejší transport do vyšetřující laboratoře (nejpozději do 24 hod. nebo zamrazit, krev -zamrazit plasmu, biopsie zamrazit ve sterilním fyziologickém roztoku) Méně vhodné materiály Moč, Biopsie ve formalinu, parafinu Nevhodný materiál - Krev srážlivá (afinita borrelií k aktivovaným destičkám)
Specifita PCR 16S rRNA (Sacace) Druh
původ kmenu
Sacace, 16S rRNA
1.
Treponema palidum
szu
-
2.
Chlamydia trachomatis
szu
-
3.
Chlamydia pneumoniae
szu
-
4.
Escherichia coli
szu
-
5.
Staphylococcus aureus
szu
-
7.
Anaplasma phagocytophylum
szu
-
8.
Leptospira interrogans
Instand
-
9.
Borrelia garinii
Instand
+
10.
Borrelia valeisiana
Instand
+
11.
Borrelia lusitaniae
Instand
+
12.
Borrelia afzelii
szu
+
13.
Borrelia burgdorferi s.s.
szu
+
Citlivost PCR 16S rRNA (Sacace) 500 kopií / mL.
Přehled vyšetřených materiálů a jejich pozitivity Celkem
Pozitivní
Krev
1124
81
% pozitivních 7,2
Likvor
1168
103
8,8
Výpotek
85
7
8,2
Myokard
39
7
17,9
Procento pozitivních vzorků krve / likvoru podle měsíce odběru v r. 20112011-2012
Krev Likvor
Březen
Únor
Leden
Prosinec
Listopad
Říjen
Září
Srpen
Červenec
Červen
Květen
Duben
Březen
18 16 14 12 10 8 6 4 2 0
Procento pozitivních vzorků krve / likvoru podle základní diagnózy ( A=borrelióza, D=novotvary nemoci krve, G=nemoci nervové soustavy, M=nemoci pohybové soustavy, R=abnormality)
12 10 8 6
Krev 1
Likvor
4 2 0 A
D
G
M
R
Kvantifikace BBSL v biopsiích myokardu (Artus Borrelia LC PCR kit (Qiagen)) Kvalitativní PCR krve
Kvantitativní PCR biopsií myokardů (kopie/mg)
Druh borélie (NCBI kod)
16S rRNA+ OspA+
16S rRNA+
3800
B.garinii (HQ173807)
2
16S rRNA+
Negative
353
B.afzelii (JF262958)
3
16S rRNA+ OspA+
16S rRNA+ OspA+
1,7
4
16S rRNA+ OspA+
Negative
5,9
B.garinii (JF772231)
5
16S rRNA+
Negative
2,6
B.garinii (EF364112)
6
OspA+
OspA+
38,1
Negative
7
16S rRNA+
16S rRNA+ OspA+
120
B.afzelii (HQ173808)
8
16S rRNA+
Negative
233
9
OspA+
Negative
neg.
Negative
10
OspA+
16S rRNA+
5,9
B.garinii (JF262957)
11
OspA+
Negative
412,8
Č.
Kvalitativ. PCR biopsií myokardů
1
B.burgdorferi sensu stricto (HQ173806)
B.burgdorferi sensu stricto (JN008941)
B.burgdorferi sensu stricto (JF772232)
Kvantitativní PCR biopsií myokardů - průměrná kvantita 79 kopií/mg.
Detekce BBSL v biopsiích myokardu 41 biopsií myokardů z IKEMu za 2 roky 10/41 (24%) biopsií LB pozitivních B.burgdorferi s.s. 30% B.afzelii 20% B.garinii 40% Kubánek M, Šramko M, Berenová D, Hulínska D, Hrbáčková H, Malušková J, Lodererová A, Málek I, Kautzner J. Detection of Borrelie burgdorferi sensu lato in endomyocardial biopsy specimens in individuals with recent – onset dilated cardiomyopathy. Eur J Heart Fail 2012
Závěr •
DNA borélií nestabilní → důraz na dodržování podmínek preanalytické fáze
•
Význam PCR LB u vyšetřeni biopsií – (myokard 17,9% pozitivních)
•
PCR v diagnostice LB doplňková metoda vedle serologie, význam ve včasných fázích, před tvorbou protilátek
•
Význam PCR – genotypizace
•
Interpretace výsledků: Pozitivní výsledek PCR – potvrzení BBSL ve vzorku, doporučení zopakovat PCR a provést serologické testy za 22-3 týdny. Negativní výsledek PCR LB nevylučuje.
Děkuji za pozornost
