Analisis stomata Analisis stomata dilakukan dengan cara mengambil sampel daun nilam yang diambil dari masing-masing nomor somaklon yang dikategorikan peka dan toleran. Daun yang diambil adalah daun ketiga dari pucuk Analisis stomata dilakukan dengan prosedur : Daun dipotong dengan ukuran 1 x 1 cm, lalu direbus pada larutan HNO 3 pekat dengan perbandingan (3:1) hingga daun terkelupas. Potongan daun tersebut selanjutnya ditempatkan pada Petri disk. Bagian daun (epidermis) yang sudah terpisah dengan jaringan lainnya diambil, selanjutnya dicuci dengan air bersih diatas obyek gelas. Preparat ditetesi dengan larutan Safranin 2 % secukupnya dan dibilas dengan air bersih, selanjutnya ditetesi dengan gliserin 50% kemudian ditutup dengan cover glas. Pengamatan stomata meliputi struktur yaitu panjang, dan lebar stomata serta kerapatan stomata. Setiap sampel diamati sebanyak enam kali ulangan dengan sudut pandang yang berbeda. Kerapatan stomata dihitung berdasarkan rumus : jumlah stomata Kerapatan stomata = (Σ stomata/per mm2) satuan luas bidang pandang Hasil dan Pembahasan Evaluasi populasi somaklon hasil iradiasi sinar gamma dan seleksi in vitro berdasarkan karakter morfologi dan agronomi Cekaman kekeringan menyebabkan penurunan berbagai karakter kuantitatif populasi somaklon nilam (Tabel 25). Cekaman kekeringan nyata menurunkan tinggi tanaman populasi somaklon dan tanaman induk sebesar 17.9 – 32.4 % . Populasi somaklon TT05, TT10 dan TT15 mengalami persentase penurunan tinggi tanaman lebih rendah dari tanaman induk, sedangkan populasi somaklon TT15, TT20 mengalami penurunan persentase tinggi tanaman relatif lebih tinggi dari tanaman induk. Persentase penurunan tingggi tanaman tertinggi dialami oleh populasi somaklon TT15 sebesar 32.4 %. Berdasarkan analisis tinggi tanaman pada semua individu somaklon terhadap tinggi tanaman, terdapat beberapa nomor somaklon mampu merespon cekaman kekeringan yang lebih baik dibandingkan dengan tanaman induk, hal ini dapat dilihat dari penurunan persentase tinggi tanaman yang lebih rendah dari tanaman induk (Gambar 25). Cekaman kekeringan menyebabkan menurunnya jumlah cabang populasi somaklon dan tanaman induk sebesar 34.1 – 52.6 % . Penurunan jumlah cabang tertinggi terjadi pada somaklon TT20 sebesar 52.6 %, dan lebih tinggi dari tanaman induk, sedangkan populasi somaklon lainnya penurunannya relatif sama dengan tanaman induk. Cekaman kekeringan menyebabkan berkurangnya jumlah daun sebesar 37.4 – 52.2 %, persentase penurunan jumlah daun tertinggi dialami oleh populasi somaklon TT20 sebesar 52.2 %, sedangkan populasi somaklon lainnya mengalami penurunan lebih rendah dari tanaman induk. Beberapa individu somaklon menunjukkan penurunan jumlah cabang dan jumlah daun yang lebih rendah dari tanaman induk (Gambar 26 dan 27). Penurunan jumlah daun akibat cekaman kekeringan otomatis mengurangi bobot daun segar sebagai salah satu karakter utama tanaman nilam Persentase penurunan bobot daun segar akibat cekaman kekeringan mencapai 41.3 - 54.8 %. Populasi somaklon TT00, TT05 dan TT10 mengalami penurunan persentase bobot daun segar lebih rendah dari tanaman induk, sebaliknya populasi somaklon TT15 dan TT20 persentase penurunan bobot daun segar relatif sama dengan tanaman induk. Beberapa nomor somaklon memperlihatkan respon yang lebih baik dari tanaman induk yang diperlihatkan dari persentase penurunan bobot daun segar lebih rendah dari tanaman induk (Gambar 28) Menurunnya jumlah daun dan jumlah cabang akibat cekaman kekeringan mengurangi bobot terna kering. Bobot terna kering merupakan karakter utama tanaman nilam, karena dari bobot terna kering tersebut dihasilkan minyak melalui proses penyulingan. Populasi somaklon hasil seleksi in vitro menggunakan PEG dengan dosis iradiasi 5 dan 10 Gy (somaklon TT05 dan TT10) serta
somaklon hasil seleksi in vitro tanpa iradiasi sinar gamma (TT00) memberikan tingkat responsi yang lebih baik dibandingkan dengan tanaman induk (TT-in). Sedangkan somaklon hasil seleksi in vitro dan iradiasi sinar gamma 15 Gy dan 20 Gy memberikan pengaruh yang relatif sama dengan tanaman induk dalam merespon cekaman kekeringan dengan persentase penurunan bobot terna kering berturut-turut 44.1, 44.5 dan 48.2 %. Berdasarkan analisis bobot terna kering pada semua nomor somaklon, beberapa nomor somaklon memperlihatkan respon yang lebih baik dari tanaman induk (Gambar 29). Salah satu pengaruh buruk dari cekaman kekeringan adalah tertekannya pertumbuhan akar. Cekaman kekeringan menyebabkan penurunan bobot kering akar populasi somaklon hasil seleksi in vitro dan iradiasi sinar gamma. Populasi somaklon TT00, TT05 dan TT10 mempunyai kemampuan yang lebih baik dalam merespon cekaman kekeringan dibandingkan dengan tanaman induk dan populasi somaklon lainnya. Hal ini dapat dilihat dari persentase penurunan bobot kering akar yang lebih rendah yakni berturut-turut 44.9 %, 36.8 dan 40.0 %, sedangkan somaklon TT15, TT20 dan tanaman induk masingmasing 52.0 %, 58.7 dan 56.7 %. Berbeda dengan pengamatan karakter kuantitatif lainnya, kadar minyak sebagai produk akhir dari tanaman nilam justru mengalami peningkatan akibat cekaman kekeringan. Berdasarkan analisis statistika tidak terjadi interaksi antara somaklon dan cekaman kekeringan. Peningkatan kadar minyak hanya terjadi pada faktor tunggal yaitu antara rata-rata kadar minyak dari tanaman yang ditumbuhkan pada kondisi cekaman kekeringan dengan kondisi normal (tanpa cekaman kekeringan). Namun demikian populasi somaklon hasil seleksi in vitro tanpa iradiasi sinar gamma (TT00) dan iradiasi sinar gamma dengan dosis 5, 10 dan 15 Gy (TT05, TT10 dan TT15) mengalami peningkatan kadar minyak lebih tinggi dibandingkan dengan tanaman induk. Berdasarkan analisis persentase penurunan komponen karakter kuantitatif akibat cekaman kekeringan menunjukkan bahwa seleksi in vitro dan iradiasi sinar gamma dapat memberikan respon yang berbeda terhadap cekaman kekeringan. Secara umum, cekaman kekeringan menekan pertumbuhan dan hasil tanaman nilam. Somaklon hasil seleksi in vitro tanpa iradiasi sinar gamma (populasi somaklon TT00) dan somaklon hasil seleksi in vitro dan dosis iradiasi sinar gamma 5 Gy dan 10 Gy (populasi somaklon TT05 dan TT10) dapat mengurangi pengaruh buruk dari cekaman kekeringan dibandingkan dengan tanaman induk dan populasi somaklon hasil seleksi in vitro dan iradiasi sinar gamma 15 dan 20 Gy (populasi somaklon TT15 dan TT20). Perbedaan somaklon dalam merespon cekaman kekeringan disebabkan oleh perbedaan dalam morfologi dan mekanisme fisiologi tanaman. Seleksi in virto yang dikombinasikan dengan iradiasi sinar gamma dapat merubah susunan genetik tanaman nilam sehingga mempengaruhi ekspresinya dalam merespon cekaman kekeringan. Menurut Nepomuceno et al. (1998), adanya sifat toleransi terhadap cekaman kekeringan pada suatu genotype tertentu tidak sederhana karena melibatkan banyak gen (poligenik). Selanjutnya oleh Okogbenin et al. (2003) dan Bohner dan Jansen (1996) serta Ingram dan Bartels (1996) menyebutkan bahwa, perbedaan ekspresi dari gen spesifik antara tanaman yang toleran dan peka terhadap cekaman kekeringan mengindikasikan bahwa sifat toleransi dikendalikan secara genetik melalui suatu mekanisme biokimia dan fisiologi, dan hal tersebut mempengaruhi pertumbuhan tanaman. Hal ini yang menyebabkan para pemulia lambat mendapatkan suatu sifat tanaman yang toleran melalui program pemuliaan tanaman secara konvensional atau melalui persilangan. Sebaliknya penggunaan iradiasi sinar gamma dan variasi somaklonal yang diikuti dengan seleksi in vitro, sifat toleransi
terhadap cekaman kekeringan dapat diperoleh dengan waktu yang relatif lebih singkat. Proses pertumbuhan tanaman memerlukan ketersediaan air dalam jumlah yang cukup. Air diperlukan untuk pereaksi biokimia yang terlibat dalam proses fotosintesis dan proses hidrolisis (Levitt 1981; Fitter dan Hay 1994), sehingga terhambatnya pertumbuhan akar akibat cekaman kekeringan menyebabkan terganggunya absorbsi dan translokasi air dan mineral, transpirasi, fotosintesis serta translokasi fotosintat (Savin dan Nikolas 1996). Cekaman kekeringan menyebabkan perubahan potensial air, potensial osmotik dan potensial turgor sel (Moinuddin dan Chopra 2004). Translokasi dan akumulasi fotosintat yang terbatas menyebabkan berkurangnya karbohidrat pada jaringan tanaman. Keadan seperti ini akan menghambat pertumbuhan dan perkembangan tanaman. Toleransi tanaman terhadap cekaman kekeringan dicirikan oleh sistem perakaran, meliputi panjang akar, jumlah akar dan ketahanan akar (Passioura 1994). Hasil penelitian ini menujukkan bahwa persentase penurunan bobot akar akibat cekaman kekeringan pada somaklon TT00, TT05 dan TT10 lebih rendah dibandingkan dengan populasi somaklon TT15, TT20 dan tanaman induk.
Akumulasi prolin dan gula total hubungannnya dengan tingkat toleransi tanaman terhadap cekaman kekeringan Perlakuan cekaman kekeringan menyebabkan peningkatan kandungan prolin populasi somaklon generasi MV 2 (Tabel 29). Populasi somaklon yang dikategorikan agak toleran nyata meningkatkan kandungan prolin saat terjadi cekaman kekeringan, sedangkan populasi somaklon yang peka tidak nyata peningkatannya. Populasi somaklon TT00, TT05 dan TT10 sebagai populasi yang agak toleran mengalami peningkatan prolin masing-masing sebesar 62.9 %, 50.1 % dan 50.8 %, sedangkan populasi somaklon TT15, TT20 dan tanaman kontrol (TTin) yang dikategorikan sebagai populasi somaklon yang peka hanya mengalami peningkatan masing-masing sebesar 16.9 %, 33.7% dan 22.7 %. Hal yang sama juga terjadi pada masing-masing nomor somaklon, yaitu umumnya nomor somaklon yang dikategorikan toleran kekeringan berdasarkan uji sensitivitas mengakumulasikan prolin lebih tinggi dibandingkan dengan nomor somaklon yang peka (Tabel 30). Nomor somaklon dengan kriteria toleran mengalami peningkatan prolin 72.8 % sedangkan nomor somaklon agak toleran dan peka masing-masing 52.5 dan 29.9 %. Hal ini berarti bahwa rata-rata peningkatan prolin nomor somaklon yang toleran 146 % lebih tinggi dari rata-rata peningkatan prolin nomor somaklon yang peka (Gambar 31). Hasil penelitian ini sesuai hasil penelitian sebelumnya yang menyatakan bahwa prolin meningkat sejalan dengan meningkatnya cekaman kekeringan (Bandurska 2000; Rodriguez et al. 1997; Yang dan Kao 1999). Akumulasi prolin sebagai upaya tanaman mempertahankan potensial air agar tetap rendah pada jaringan sehingga tidak mengalami plasmolisis (Heuer 1999; Dib et al. 1998). Akumulasi prolin merupakan salah satu senyawa organik dalam sel-sel yang berperan sebagai tindakan penyesuaian osmotik ( ” osmotic adjusment ” ) dan berfungsi untuk membantu sel-sel tanaman untuk menahan defisit air melalui pemeliharaan tekanan turgor sehingga tanaman terhindar dari kematian (Rodriguez et al. 1997; Gibon 2000). Semakin lama tanaman bertahan hidup dalam kondisi cekaman kekeringan, semakin menekan pertumbuhan tanaman, namun demikian tanaman yang tergolong toleran terhadap cekaman kekeringan akan semakin banyak mengakumulasi senyawa prolin. Hasil penelitian ini membuktikan bahwa umumnya nomor somaklon yang dikategorikan toleran cekaman kekeringan dapat meningkatkan senyawa prolin lebih tinggi dari nomor somaklon peka. Besarnya akumulasi prolin dalam kondisi cekaman kekeringan tergantung dari lamanya tanaman mengalami cekaman kekeringan, perbedaan genotipe tanaman dan jaringan tanaman yang dianalisis kandungan prolinnya (Verlues dan Sharp 1999; Ridwan dan Sudarsono 2004). Nayyar dan Walia (2004) melaporkan bahwa gamdum genotipe C306 dapat mengakumulasikan prolin 300 % pada kondisi cekaman kekeringan, lebih tinggi dari genotipe HD2329 yang hanya 250 %. Berdasarkan analisis kandungan gula total yang diambil dari beberapa sampel daun nomor somaklon yang dikategorikan toleran dan peka menunjukkan bahwa tidak terdapat pengaruh yang nyata baik pada faktor tunggal populasi somaklon dan faktor cekaman kekeringan, maupun pada interaksinya. Namun demikian secara umum menunjukkan bahwa, pada somaklon yang dikategorikan agak toleran (moderat) cenderung mengalami peningkatan gula total lebih tinggi dari populasi somaklon yang peka (Tabel 29). Hal yang sama juga ditunjukkan oleh kandungan gula total pada nomor somaklon, nomor somaklon yang dikategorikan toleran umumnya mengalami peningkatan gula total relatif lebih tinggi dibandingkan dengan somaklon yang peka (Tabel 31). Hal tersebut mengindikasikan bahwa tanaman nilam dalam kondisi cekaman kekeringan mampu mempertahankan
kandungan gula total minimal sama dengan kondisi tanpa cekaman. Dengan demikian akumulasi gula total dalam kondisi cekaman kekeringan juga merupakan suatu mekanisme fisiologis agar dapat terhindar dari pengaruh dehidrasi sel sehingga tanaman tidak terlalu mengalami pengaruh buruk akibat kekurangan air. Sehubungan kandungan gula total sebagai senyawa osmotikum. Johson et al. (1996) menemukan hubungan yang jelas antara besarnya potensial air dengan kandungan gula total pada akar dan hipokotil tanaman mopane, semakin rendah potensial air semakin meningkat akumulasi gula total. Kandungan gula total meningkat secara drastis 300 % dari potensial air -0,03 Mpa menjadi -2,00 Mpa. Sebaliknya Pelah et al. (1997) melaporkan tidak terdapat hubungan yang jelas antara kandungan gula total dengan cekaman kekeringan tanaman populus.
somaklon TT00, TT05 dan TT10 mempunyai struktur dan kerapatan stomata lebih rendah dibandingkan dengan tanaman induk (Gambar 32). Stomata merupakan bagian anatomi daun yang berbentuk lubang yang mempunyai hubungan dengan atmosfir dan mempunyai cara kerja yang spesifik. Kehilangan air dari transpirasi melalaui stomata dapat mencapai 90 % (Passiora 1994). Stomata berfungsi sebagai pintu masuknya CO 2 ke dalam daun untuk berlangsungnya fotosintesis dan menguapkan air (transpirasi). Stomata membuka pada siang hari sehingga proses fotosintesis dapat berlangsung (Salisbury dan Ross 1992). Dengan demikian ukuran dan kerapatan stomata yang lebih rendah dapat mencegah transpirasi yang lebih besar, sehingga kehilangan air yang berlebihan dapat ditekan. Semakin banyak stomata pada daun atau semakin tinggi kerapatan stomata berarti semakin banyak ruang pada daun yang dapat melepaskan air ke atmosfir. Hasil penelitian ini menunjukkan bahwa nomor somaklon yang toleran umumnya mempunyai struktur dan kerapatan stomata yang lebih rendah dibandingkan dengan nomor somaklon yang peka (Gambar 33). Kondisi seperti ini memberikan indikasi bahwa somaklon yang dikategorikan toleran, mampu mengurangi kehilangan air yang berlebihan dari proses penguapan sehingga dapat mengurangi dampak buruk dari pengaruh cekaman kekeringan dibandingkan dengan somaklon yang peka. Adanya perbedaan dalam struktur dan kerapatan stomata pada umumnya diikuti oleh perubahan aktifitas fisiologi tanaman (Dickson 2000).
