KLASICKÉ A MOLEKULÁRNÍ METODY V KLINICKÉ A ONKOLOGICKÉ CYTOGENETICE. Zuzana Zemanová CENTRUM NÁDOROVÉ CYTOGENETIKY Ústav klinické biochemie a laboratorní diagnostiky VFN a 1. LF UK PRAHA
CYTOGENETIKA velmi úzce specializovaná vědecká disciplína zabývá se studiem struktury, funkce a evoluce chromosomů a jejich chováním v průběhu dělení zárodečných i somatických buněk sleduje změny a nepravidelnosti těchto procesů, které vedou ke vzniku početních a strukturních odchylek chromosomů v buněčných jádrech
Základní mezníky v rozvoji lidské cytogenetiky: Stanovení přesného počtu lidských chromosomů - 1956 První popsaný syndrom spojený s trisomií chromosomu 21 - 1959 První popsaná specifická chromosomová aberace nádorového onemocnění (CML, Ph-chromosom) - 1960
u
Pruhovací techniky barvení chromosomů - 1968 až 1970 Molekulární cytogenetika a rozvoj metody fluorescenční in situ hybridizace (FISH) - 1988
Cytogenetické vyšetření: Klinická cytogenetika → stanovení karyotypu nemocných s vrozenými vývojovými vadami, geneticky podmíněnými syndromy apod. Prenetální diagnostika → určení chromosomové výbavy plodů
In vitro fertilizace → vyšetření oocytů, spermií, blastomer a blastocyst Nádorová cytogenetika → zpřesnění diagnózy prognózy některých nádorových onemocnění
a
určení
Laboratoře hygienické služby - testování mutagenních účinků chemických látek na lidský organismus na úrovni chromosomů; radiační cytogenetika.
VYŠETŘOVANÉ TKÁNĚ: •lymfocyty periferní krve •buňky plodové vody •buňky choriových klků •buňky placenty •periferní krev plodu •kožní fibroblasty •buňky vyšetřovaných orgánů •buňky kostní dřeně •buňky solidních nádorů
analýza chromosomů - ve světelném mikroskopu - mitosa - buněčné dělení - stadium metafáze
Somatická buňka: Diploidní sada chromosomů:
22 párů autosomů 2 pohlavní chromosomy muž 46,XY žena 46,XX
Chromosomové aberace: odchylky v počtu nebo struktuře chromosomů (vrozené x získané)
Chromosomové aberace: heterochromosomové x autosomové I. Vrozené (konstituční) odchylky jsou základem při vzniku chromosomálně podmíněných klinických syndromů (např. Downův syndrom); obvykle jsou přítomny ve všech buňkách těla. II. Získané odchylky chromosomů nalézáme v nádorových buňkách; mají klonální charakter (postihují jen určité buněčné klony).
CHROMOSOMOVÉ ABERACE I. NUMERICKÉ ODCHYLKY - aneuploidie • zmnožení jednotlivých chromosomů - např. trisomie apod. (n+1)
• ztráta jednotlivých chromosomů - monosomie
(n-1)
CHROMOSOMOVÉ ABERACE I. NUMERICKÉ ODCHYLKY - euploidie = početní změny, které postihují celou chromosomovou sadu (triploidie, tetraploidie apod.)
CHROMOSOMOVÉ ABERACE II. STRUKTURNÍ PŘESTAVBY
translokace
reciproká
inserce
nereciproká
delece
inverse
KLINICKÁ CYTOGENETIKA stanovení karyotypu vývojovými vadami
nemocných
s
vrozenými
stanovení karyotypu nemocných s genetickýmy podmíněnými syndromy poruchy fertility určení chromosomové výbavy plodů prenatální diagnostika
NÁDOROVÁ CYTOGENETIKA • Zabývá se studiem získaných chromosomových změn v buňkách benigních a maligních tumorů. • V současné době byly u většiny lidských neoplasií prokázány buňky se strukturními či početními změnami karyotypu. • Většinu studovaných lidských neoplasií představují hemoblastozy. • Teprve v posledních letech se objevují i výsledky vyšetření buněk solidních nádorů u větších souborů nemocných.
CHROMOSOMOVÉ ABERACE V NÁDOROVÝCH BUŇKÁCH: I. NÁHODNÉ • postihují náhodně kterýkoliv chromosom nádorové buňky • objevují se náhodně u různých nemocných s různými diagnosami II. NENÁHODNÉ - SPECIFICKÉ • • •
vyskytují se u určitých konkrétních typů nádorů mohou se podílet na vzniku a vývoji nádoru slouží jako nezávislý diagnostický a prognostický ukazetel
CHROMOSOMOVÉ ABERACE: I.
ZTRÁTA GENETICKÉHO MATERIÁLU
monosomie, delece
II.
ZMNOŽENÍ GENETICKÉHO MATERIÁLU
trisomie, tetrasomie atd. duplifikace, amplifikace triploidie, tetraploidie atd.
III. PŘEMÍSTĚNÍ GENETICKÉHO MATERIÁLU translokace (reciproké, nereciproké) inverse, inserce atd.
Konvenční cytogenetická analýza v onkohematologii: V dnešní době je nezbytnou součástí vyšetření nemocných s hemoblastozami. Potvrzení diagnózy Stanovení prognózy Monitorování úspěšnosti léčby
potvrzení remise včasný záchyt relapsu
Monitorování úspěšnosti transplantace buněk kostní dřeně (dárci opačného pohlaví, markery, chromosomové polymorfismy)
METODY: KONVENČNÍ CYTOGENETICKÁ ANALÝZA: kultivace buněk a zpracování buněčných kultur (např. lymfocyty periferní krve 72h, buňky kostní dřeně 24h atd.)
barvení chromosomů - do r.1969 Giemsovo barvivo nebo orcein od r.1970 pruhování chromosomů - různé techniky (nejčastěji tzv. G-pruhy; dále R-pruhy, C-pruhy atd.)
vyhodnocení chromosomových aberací aberací podle ISCN nomenklatury (1995), standardizované zápisy MOLEKULÁRNĚ CYTOGENETICKÉ METODY (FISH)
1
Ph
Pruhování chromosomů:
→ závisí na spiralizaci a stupni kondenzace chromosomů profáze - až 2000 pruhů, prometafáze - 850 pruhů, metafáze - 400 až 450 pruhů na haploidní sadu (1 pruh = 5 až 10 Mb DNA)
International Standardization and Cytogenetic Nomenclature ISCN
p
q
6
krev, kostní dřeň
medium
kolchicin
hypotonie
fixace
preparace
inkubace při 37°C
barvení
Postup při kultivaci a přípravě preparátů k cytogenetickému vyšetření
POČÍTAČOVÁ ANALÝZA OBRAZU - IKAROS
46,XX,t(9;22)(q34;q11)
Adenokarcinom pankreatu 38,X,-Y,del(2)(q33q35),der(6)r(6)(p25q21)ins(6;?)(q13;?),add(8)(p11),der(9)t(9;17)(p11;q11),der(10)t(10;17)(p11;q11),13,der(14;22)(q10;q10),-15,-17,-18,der(19;21)(q10;q10)del(19)(q13),-21/37,idem,-der(6)r(6)ins(6;?)/37-39,idem,del(1) (q11)/35-38,idem,add(7)(q32)/38,idem,del(7)(q32)/38,idem,dup(11)(q13q23)/38-39,idem,der(X)t(X;7)(p22;p11),der(6) t(6;19)(p21;q13),-7,der(7)t(6;7)(p21;q36),-der(14;22),+r1,+mar1/38-39,idem,der(7)del(7)(q32)ins(7;7)(q32;q11q22) ins(7;7)(q22;q11q32)ins(7;7)(q32;q32q22)t(7;?)(q22;?)t(?;19)(?;q11)/37-38,idem,-der(6)r(6)ins(6;?),der(7)/39-40,idem, i(5)(p10),-der(10)t(10;17),+i(10)(q10),+der(16)t(5;16)(q22;q13),+add(17)(p11),-20/38,idem,-der(10)t(10;17),+der(17;20) (q10;q10),+der(18)t(10;18)(q11;q11),-20/38,idem,-der(10)t(10;17),-der(14;22),+der(14;22)add(22)(q13),+der(17;20), +der(18)t(10;18),-20/40,idem,-der(6)r(6)ins(6;?),+ins(6;?)(q13;?),-der(10)t(10;17),+i(10)(q10),+12,+add(17)(p13),-20, der(22)t(20;22)(q11;p11),+mar2/40,idem,-der(6)r(6)ins(6;?),+ins(6;?),-der(10)t(10;17),+i(10)(q10),+12,+der(17) r(17;?) (p13q25;?),-20,der(22)t(20;22),+mar2/39-40,idem,inv(4)(p11q27),-der(6)r(6)ins(6;?),+ins(6;?), der(10)t(10;17),+i(10) (q10),+12,+der(17)r(17;?),-20,der(22)t(20;22),+mar2/39,idem,der(3)r(3;?),-der(6)r(6)ins(6;?),+ins(6;?),-der(10)t(10;17), +i(10)(q10),+der(17;20),-20,+mar2/76-77,idemx2/73-75,idemx2,der(X)t(X;7)x2,der(6)t(6;19)x2,-7,-7,der(7)t(6;7)x2,der(14;22)x2,+r1x2/73-76,idemx2,der(7)x2/73-74,idemx2,der(7)x2,-der(6)r(6)ins(6;?)/78-80,idemx2,-der(6)r(6)ins (6;?)x2,+ins(6;?)x2,-der(10)t(10;17)x2,+i(10)(q10)x2,+12,+12,+add(17)(p13)x2,-20,-20,der(22)t(20;22)x2,+mar2x2/7980,idemx2,-der(6)r(6)ins(6;?)x2,+ins(6;?)x2,-der(10)t(10;17)x2,+i(10)(q10)x2,+12,+12,+der(17)r(17;?)x2,-20,-20,der(22) t(20;22)x2,+mar2x2/66-74,idemx2,-1,del(4)(q21),-der(6)r(6)ins(6;?),-der(10)t(10;17)x2,+i(10)(q10),-der(14;22),+add (17)(p11)x2/72-74,idemx2,-1,del(4),-der(6)r(6)ins(6;?),-der(10)t(10;17)x2,+i(10)(q10),-der(14;22)x2, +i(14)(q10)/7374,idemx2,-1,del(4),-der(6)r(6)ins(6;?),-der(10)t(10;17)x2,+i(10)(q10),-der(14;22),+i(17)(q10)/72-73,idemx2,-1,-der(6) r(6)ins(6;?),-der(10)t(10;17)x2,+der(10)t(10;19)(p11;q11),-der(14;22)/69-73,idemx2,-1,-der(6)r(6)ins(6;?),-der(10) t(10;17)x2,+der(10)t(10;19),-der(14;22),t(16;17)(q24;q21)/72-73,idemx2,-1,-der(6)r(6)ins(6;?),-der(10)t(10;17)x2, +der(10)t(10;19),-der(14;22),+mar3,+mar4/72-73,idemx2,-1,-der(6)r(6)ins(6;?),-der(10)t(10;17)x2,+der(10)t(10;19),der(14;22)x2,+i(14)(q10)/150-300,idemx4-8/150-200,idemx4-5,del(4),-der(10)t(10;17)x4-5,+i(10)(q10)x2-3,-der(14;22) x4-5,+i(14)(q10)x2-3/160-400,idemx4-10,der(7) del(7)(q32)ins(7;7)(q32;q11q22)ins(7;7)(q22;q11q32)ins(7;7)(q32;q32 q22)t(7;?)(q22;?)t(?;19)(?;q11) x4-10/158-300,idemx4-8,-der(6)r(6)ins(6;?)x4-8,+ins(6;?)x4-8,-der(10) t(10;17)x4-8, +i(10)(q10) -x4-8,+12,+12,+12,+12,+12,+12,+add(17)(p13)x2-4,+der(17)r(17;?)x2-4,-20,der(22)t(20;22)x4-8,+mar2x48/150-400,idemx4-10,-der(10)t(10;17)x4-10,+der(10)t(10;19)x2-5,-der(14;22)x2-5,+t(16;17)x2-5,+mar3x2-5,+mar4x2-5
Gorunova et al., Genes Chromosomes Cancer 26:312-321, 1999
VÝHODY KONVENČNÍ CYTOGENETICKÉ ANALÝZY: Umožňuje během jednoho experimentu analyzovat celý genom Přispěla k identifikaci většiny genů zahrnutých ve specifických přestavbách
LIMITY KONVENČNÍ CYTOGENETICKÉ ANALÝZY: Technické faktory (rozložení mitose, kvalita pruhování)
chromosomů
v
Nízký mitotický index Kryptické buněčné klony (patologické buňky se v kultivaci často nedělí) Kryptické translokace a inserce, subtilní přestavby Komplexní přestavby
Metody molekulární cytogenetiky: Radioaktivní in situ hybridizace (ISH) – od roku 1969 Fluorescenční in situ hybridizace (FISH) – 1986 jednobarevná / dvoubarevná Mnohobarevná FISH (Nederlof et al.) - 1989 Komparativní genomová hybridizace (CGH) - 1992 „24 barevná FISH (mFISH, SKY ) - 1996 Mnohobarevné pruhování s vysokou resoluční schopností (mBAND) - 1998 MICROCHIPS, MICROARRAYS - 1998
FLUORESCENČNÍ IN SITU HYBRIDIZACE (FISH) • velmi citlivá molekulárně-cytogenetická metoda • umožňuje hodnotit karyotyp a detekovat numerické a strukturní chromosomové odchylky v buňkách v mitose i v nedělících se interfásních jádrech • doplňuje a upřesňuje výsledky získané konvenční cytogenetickou analýzou
FLUORESCENČNÍ IN SITU HYBRIDIZACE (FISH)
METAFÁZE
INTERFÁZE
FLUORESCENČNÍ IN SITU HYBRIDIZACE (FISH)
Cytogenetický preparát
Dvouřetězcová značená DNA
Denaturace buněčné DNA fixované na cytogenetickém preparátu
Denaturace DNA sondy
Hybridizace DNA sondy ke komplementárním úsekům cílové DNA fixované na cytogenetickém preparátu
Analýza fluorescenčních signálů ve fluorescenčním mikroskopu
MOŽNOSTI APLIKACE FISH Různé biologické materiály: • histologické řezy • tkáňové preparáty (různě zpracované kultivované i nekultivované buňky) • izolovaná buněčná jádra • chromosomové preparáty
FISH V ONKOCYTOGENETICE Diagnostika leukemií a preleukemií: • • • •
detekce početních a strukturních odchylek určení původu marker chromosomů monitorování účinků terapie detekce residuálních leukemických buněk po terapii • určení původu buněk po transplantaci kostní dřeně Diagnostika solidních nádorů
DNA sondy pro FISH
Centromerické sondy
Telomerické sondy
Malovací sondy pro celé chromosomy (wcp) nebo jejich části (pcp)
Lokus specifické sondy
Mnohobarevné malovací sondy
Sondy pro specifické chromosomové struktury: α-satelitní DNA - centromery Stanovení numerických odchylek, ověření původu centromer markerchromosomů, určení původu buněk po TKD od dárců opačného pohlaví metafáze x interfáze
CENTRUM CENTRUM NÁDOROVÉ NÁ CYTOGENETIKY É CYTOGENETIKY ÚKBLD,VFN VFNAa1.LF 1.LFUK UK Praha NÁDOROVÉ DOROV
UroVysion – Abbott Vysis
TELOMERICKÉ / SUBTELOMERICKÉ SONDY
TELOMERICKÉ SONDY
SUBTELOMERICKÉ SONDY
Sondy pro jedinečné genové sekvence: tzv. lokus-specifické sondy Mapování polohy genů na chromosomech, detekce strukturních přestaveb
metafáze x interfáze
Lokus-specifické sondy detekce strukturních přestaveb translokací inzercí amplifikací delecí inverzí
TRANSLOKACE
Ph-chromosom
ASS locus ABL locus
LSI BCR/ABL ES Dual Color Translocation Probe
CENTRUM NÁDOROVÉ CYTOGENETIKY ÚKBLD, VFN a 1.LF UK Praha
MLL - 11q23
TRANSLOKACE
DELECE
DELECE
DELECE
INVERZE
AMPLIFIKACE
Sondy pro mnohočetné chromosomové sekvence (tzv. malovací sondy): obsahují sekvence z celých chromosomů nebo jejich částí (parciální sondy) Určování strukturních přestaveb (translokace a delece většího rozsahu), identifikace původu marker-chromosomů pouze metafáze
CENTRUM NÁDOROVÉ CYTOGENETIKY ÚKBLD, VFN a 1.LF UK Praha
VÝHODY FISH: Relativně rychlý proces Detekce specifických aberací Vysoká specifita a citlivost Interfázická FISH Detekce delecí spojených se vznikem fúzních genů Automatické systémy pro fluorescenčního mikroskopu
analýzu
obrazu
z
LIMITY KLASICKÉ JEDNOBAREVNÉ A DVOUBAREVNÉ FISH: Umožňuje sledovat jen omezený počet cílových sekvencí fixovaných na preparátu Neposkytuje informace o celém genomu Závisí na dostupnosti DNA sond Umožnňuje detekci specifických aberací
pouze
omezeného
počtu
VÍCEBAREVNÁ FISH
Princip kombinatoriálního značení:
mnohobarevná FISH (mFISH): simultánní použití nejméně tří různých fluorochromů ke specifickému značení DNA sond (kromě DAPI) První úspěšný mFISH experiment:
Nederlof P.M., Robinson D., Abuknesha R., Wiegant J., Hopman A.H., Tanke H.J., Raap A.K.: Three-color fluorescence in situ hybridization for the simultaneous detection of multiple nucleic acid sequences. Cytometry 10: 20-27, 1989. Amino methyl coumarin acetic acid – AMCA Tetramethylrhodamine isothiocyanate – TRITC Fluoresceine isithiocyanate - FITC
Princip kombinatoriálního značení:
mFISH CENTRUM NÁ NÁDOROVÉ DOROVÉ CYTOGENETIKY, III. INTERNÍ INTERNÍ KLINIKA VFN A 1.LF UK
Kombinatoriální značení: smícháním n fluorochromů získáme 2n-1 různých barevných kombinací
FLUOROCHROMY PRO mFISH:
• DIETHYLAMINOKUMARIN (DEAC, NEN Life Science Products)
• SPECTRUM ORANGE (VYSIS) • TEXAS RED (Molecular Probes) • ALEXA 488 (Molecular Probes) • CY 5 (Amersham Life Sciences) • DAPI (4,6 diamidino 2-phenylindol)
color Y
X
47,XY,+X,t(1;5),t(3;6),t(9;22)
45,X,-X,t(3;11),del(5)(q13q33),der(10)t(X;10),del(10)(q),der(17)t(X;10;17)
CEN mFISH
Tel mFISH
Figures by Dr. L. Kearney, Oxford/ London, UK
LSI mFISH
mBAND
Labeling scheme of chromosome 5:
mBAND
CENTRUM NÁDOROVÉ CYTOGENETIKY ÚKBLD, VFN a 1.LF UK Praha
inv(11)(p11.2q13.3)
dup p15 MLL p15 MLL der(4)t(4;11)
4
11
18
der(18)t(11;18)
der(11)t(4;11)
KOMPARATIVNÍ GENOMOVÁ HYBRIDIZACE (CGH) Kohybridizace na cytogenetický preparát s normálními chromosomy Celková genomová DNA z normálních buněk
Celková genomová DNA z testovaných buněk
Detekce a vizualizace
Buňky s normálním karyotypem
Buňky s amplifikací nebo polysomií
Buňky s delecí nebo monosomií
MICROCHIPS
Array CGH
VÝHODY MOLEKULÁRNĚCYTOGENETICKÝCH METOD: • Umožňují hodnocení i velmi nekvalitních mitos, které jsou jinak pro cytogenetickou analýzu nevhodné. • Poskytují informace i z nedělících se nebo terminálně diferencovaných buněk. • Výrazně zkracují dobu nutnou k získání a interpretaci výsledků. Metody FISH tak významně přispívají ke zpřesnění cytogenetického nálezu a ke zlepšení a zrychlení diagnostiky a případně léčby nemocných s různými typy geneticky podmíněných onemocnění.
