OPVK CZ.1.07/2.2.00/28.0184 1
Kapitoly z bioorganické chemie OCH/KBCH RNDr. Lucie Brulíková, Ph.D. (RNDr. Milan Urban, Ph.D.) LS 2014/2015
[email protected]
2
1. Úvod
3
Cíle předmětu Přednáška podává přehled molekulárně-bioologických a chemických principů moderního vývoje léčiv, cíleně působících proti nádorovým onemocněním, leukémii a virovým chorobám.
http://www.novinky.cz/zena/zdravi/313516-cesti-vedci-objevilidalsi-gen-jenz-muze-za-metastazy-nadoru.html
http://www.ordinace.cz/clanek/mechanismus-ucinkunove-generace-antivirotik/
4
Sylabus předmětu 1. Úvod – Vymezení základních pojmů, souvislostí, přehled nejdůležitějších virových a nádorových onemocnění, antimetabolity a jejich použití v léčbě. Buněčný cyklus, regulace buněčného cyklu, mikrotubuly. Chemoterapie nádorových onemocnění. Centrální dogma a genová regulace, replikace, transkripce, translace, stručný náhled do genové regulace. 16. 2. 2015 2. Úvod – Principy stavby virů, jejich taxonomie, klasifikace virů. Životní cyklus virů, rozmnožování jednotlivých typů virů, jednotlivé fáze životního cyklu virů, cesty infekce organizmu viry, některé pojmy související s viry. Viry a nádorová onemocnění. Vakcíny, typy vakcín. Viry způsobující závažná onemocnění a epidemie u lidí. Terapie onemocnění člověka způsobených viry. Virové infekce, které v minulosti způsobily závažné epidemie. 23. 2. 2015 3. Struktura a funkce nukleových kyselin – RNA, DNA, Interakce malých molekul s nukleovými kyselinami, reakce s nukleofily, reakce s elektrofily, malé molekuly s reverzibilní vazbou na dvoušroubovici DNA. 2. 3. 2015
5
Sylabus předmětu 4. Biosyntéza a metabolismus nukleových kyselin - biosyntéza nukleosidů de novo. Katabolismus nukleových kyselin a nukleosidů. Poruchy metabolizmu purinů. Přehled základních enzymů biosyntézy a katabolizmu nukleových kyselin a jejich složek, které mohou být cíleny terapeutiky. Inhibitory biosyntézy prekurzorů bází a anabolismu nukleosidů. Enzymy katabolismu nukleových kyselin. 9. 3. 2015 5. Chemie nukleosidů, nukleotidů a oligonukleotidů – syntéza nukleosidů, tvorba glykosidické vazby, syntéza a transformace nukleobází, modifikace cukerné složky. Syntéza nukleotidů. Syntéza oligonukleotidů. 16. 3. 2015 6. Inhibitory jednotlivých stupňů rozmnožování virů – látky ovlivňující adsorpci virionu na buněčnou membránu. Látky interagující s povrchovou strukturou virionu. Inhibitory syntézy virových nukleových kyselin (analoga substrátu, analoga produktu, inhibitory herpesvirové helikázy-primázy, inhibitory RNA-dependentní-RNA polymerázy, inhibitory DNA-dependentní RNApolymerázy). Inhibitory HBV. Inhibitory HCV. Inhibitory serinové HCMV proteázy. Inhibitory cysteinové rhinovirové proteázy. 23. 3. 2015 6
Sylabus předmětu 7. Inhibitory jednotlivých stupňů rozmnožování virů – Inhibitory viru HIV (inhibitory průniku do buňky, nukleosidové inhibitory reverzní transkriptázy (NRTIs), nukleotidové inhibitory reverzní transkriptázy (NtRTIs), nenukleosidové inhibitory reverzní transkriptázy (NNRTIs), inhibitory HIV integrázy a transkripce virové RNA, inhibitory HIV proteázy. Současná antiretrovirová terapie pacientů s HIV infekcí. 30. 3. 2015 8. Acyklické nukleosidy a nukleotidy – acyklické nukleosidy, acyklické nukleosidfosfonáty, nové cyklické fosfonáty. 13. 4. 2015 9. Protinádorová a antileukemická chemoterapie – Alkylační léčiva. Mechanizmus účinku DNA alkylačních cytostatik. Skupiny alkylačních léčiv. Ptkomplexy. Cytostatika založená na selektivním účinku v hypoxických buňkách. 20. 4. 2015
10. Protinádorová a antileukemická chemoterapie – Inhibitory topoisomeras, specifické inhibitory topoizomerázy I, inhibitory topoisomerasy II. Inhibitory angiogeneze. Inhibitory thymidin fosforylázy. Látky s radiomimetickým účinkem. Telomeráza a její inhibitory. 27. 4. 2015 7
Sylabus předmětu 11. Protinádorová a antileukemická chemoterapie – Antimitotické látky interagující s tubulinem. Inhibitory proteinkináz. Inhibitory prenylace proteinů. Inhibice nežádoucích účinků androgenů a estrogenů. 4. 5. 2015
12. Opakování. 11. 5. 2015
8
Historie výuky předmětu na PřF UP Prof. RNDr. Antonín Holý, DrSc., Dr.h.c. (1.9.1936 – 16.7.2013)
1976 – DuviragelTM
antiherpetikum
1996 – VistideTM virový zánět oční sítnice 2001 – VireadTM
HIV, 2008 – hepatitida B
2002 – HepseraTM virová hepatitida typu B
9
1. Vymezení základních pojmů, souvislostí Chemoterapie
podávání léků (drugs) pacientům s cílem zastavit onemocnění či zmírnit jeho průběh, omezit doprovodné jevy
léčba onkologických, virových, parazitárních onemocnění
v onkologii – protinádorová chemoterapie - podávání léků s cytostatickým účinkem
bakteriálních,
plísňových,
10
1. Vymezení základních pojmů, souvislostí Lékové skupiny 2002
Antiinfektiva
Cytostatika
Respirační
Gastrointest. Dermatologika Respirační Revmatologie Endokrinologie Kardiologie CNS
Cytostatika Antiinfektiva
Endokrinologie CNS
Kardiologika 11
1. Vymezení základních pojmů, souvislostí Vývoj nového léku trvá asi 15 let Objev účinku
Nový lék
6.5 roku
Preklinická fáze zkoušek
1.5 roku
2 roky
Fáze I Fáze II
3.5 roku
1.5 roku
Fáze III Schvalová ní
Klinické zkoušky
Fáze IV (postmarketing testy)
A STOJÍ DNES ~ 800 MILIONŮ DOLARŮ V SOUČASNÉ DOBĚ SE PROJEVUJÍ SNAHY PO ZJEDNODUŠENÍ, ZKRÁCENÍ A ZLEVNĚNÍ TOHOTO PROCESU MAJÍ-LI VŠAK ZŮSTAT ZACHOVÁNA KRITERIA BEZPEČNOSTI PACIENTA, JE SMYSL TAKOVÝCH SNAH PONĚKUD SPORNÝ. 12
1. Vymezení základních pojmů, souvislostí World health organization (WHO) - The world health reports
90% všech úmrtí ve věkové skupině < 44 let bylo v roce 1998 způsobeno šesti infekčními chorobami: AIDS MALÁRIE TBC SPALNIČKY PRŮJMOVÁ ONEMOCNĚNÍ PNEUMONIE Čtyři z nich mají zcela nebo převážně virový původ. (WHO Health Report 1999)
13
1. Vymezení základních pojmů, souvislostí World health organization (WHO) - The world health reports Stav epidemie HIV v roce 2006: 39,5 miliónů lidí je infikováno virem HIV 4,3 miliónu lidí bylo nově infikováno virem HIV jen v 2006 2,9 miliónu lidí zemřelo na AIDS v roce 2006
Stav epidemie HIV v roce 2011: průměrně 34 miliónů lidí je infikováno virem HIV (31.4 - 35.9) na konci roku 2011 2,5 miliónu lidí bylo nově infikováno virem HIV v roce 2011 (o 20% méně než v roce 2001) 1,7 miliónu lidí zemřelo na AIDS v roce 2011
14
1. Vymezení základních pojmů, souvislostí
15
2. Přehled nejdůležitějších virových a nádorových onemocnění
1. Virová onemocnění 2. Rakovinná onemocnění
16
2. Přehled nejdůležitějších virových a nádorových onemocnění Virová onemocnění
„Virus is a piece of nucleic acid surrounded by bad news“ (Peter Medawar, nositel Nobelovy ceny 1960 za medicínu a fyziologii)
Vakcíny sice předcházejí vzniku epidemií, ale nezabraňují vzniku jednotlivých případů onemocnění. Ty musí řešit farmakoterapie. Proto je třeba vyvíjet léky účinné i
proti těm virovým infekcím, pro které je dostupná vakcína. 17
2. Přehled nejdůležitějších virových a nádorových onemocnění Virová onemocnění - závažná virová onemocnění vyvolávají:
• Chřipkové viry (influenzaviry) • Rotaviry – patogeny vyvolávající gastroeneritidu u kojenců • Varicella zoster virus – plané neštovice • Lidské cytomegaloviry (HCMV) – kolitida, zánět oční sítnice, pneumonie • Enteroviry – napadají CNS • Rhinoviry (rýmové viry) • Virus lidské žloutenky typu A („infekční žloutenky“) – nedostatečná hygiena • Virus lidské žloutenky typu B (HBV) – specificky lidský virus • Virus lidské žloutenky typu C (HCV) – chronické onemocnění
18
2. Přehled nejdůležitějších virových a nádorových onemocnění Virová onemocnění - závažná virová onemocnění vyvolávají:
• Virus varioly • Virus neštovic opic (monkeypoxvirus) – příbuzný variole, mortalita však „jen“ 1-2% • Viry vyvolávající hemoragické horečky (Lassa, Ebola, argentinská hemoragická horečka, bolivijská hemoragická horečka, krymská hemoragická horečka a další) • Hantaviry – virus Sin Nombre – plicní pneumonie • Retroviry HIV – původci onemocnění AIDS
19
Terapie onemocnění člověka způsobených RNA viry Vakcina dostupná
Účinná chemoterapie dostupná ve vývoji
Žádná terapie
Polioviry - obrna Rýma - rhinoviry Enterovirové průjmy Hepatitis A Hepatitis C Zarděnky Žlutá zimnice Dengue Klíšťová encefalitida Vzteklina Exotické viry (Lassa,Sandfly,West Nile…) Ebola Hemoragické horečky Příušnice Spalničky Subakutní sklerotizující panencefalitida Respirační syncitiální virus - pneumonie Chřipka Parainfluenza AIDS – HIV-1, HIV-2
Terapie onemocnění člověka způsobených DNA viry Vakcina dostupná
Účinná chemoterapie dostupná ve vývoji
Žádná terapie
Hepatitis B Papillomaviry Progresivní leukoencefalopatie Adenovirové pneumonie, konjunktivitidy Herpes simplex typ 1 a 2 Varicella zoster Cytomegalovirové infekce Mononukleosa, Burkittův lymfom Variola Monkeypox Molluscum contagiosum
20
Pandemie a epidemie virových chorob ve 20. století pandemie 1918 pandemie 1957 pandemie 1968 USA
“španělská chř.” “Asia” “Hong-Kong” 20-40 mil. ročně
Enteroviry Kaliciviry Hepatitis C Rotaviry HSV-1 HSV-2 Horečka Lassa
USA USA Francie 1998 Irsko 1998 Francie Francie
5-10 mil. ročně 600 tisíc ročně 1,8% obyvatel. 1700 ročně 65% seroprev. 15% seroprev. 1000 ročně
Hantaviry – Sin Nombre, Muerto Canyon Ebola Epidem. polyartritida
Čína USA 1993 Zair Fidži 1979 Texas 1964 Kalifornie 1952 Venezuela 1964 Čína 1960 Kuba 1981 S.&J.Amerika 1986 Nigerie 1969 Nigerie 1986 New York 1999 Čína Indie
Chřipka
WEE VEE Dengue Západonilská encefalitida Japonská encefalitida
100 tisíc ročně 42 případů 50 tisíc ročně 0.052% obyv. 0.25% obyv. 32 tisíc 700 tisíc 344 tisíc 88 tisíc 100 tisíc 10 tisíc ? 10 tisíc ročně 10 tisíc ročně
20 mil. úmrtí 100 tisíc úmrtí 100 tisíc úmrtí 10 tisíc úmrtí roč. 3000 úmrtí
smrtnost 2060% smrtnost 5-10% smrtnost 70% smrtnost 90% smrtnost 3-4% smrtnost 3-4% smrtnost 0.6% smrtnost 0.05%
smrtnost 56% 5 úmrtí smrtnost 70% (při léčení 11%)
21
2. Přehled nejdůležitějších virových a nádorových onemocnění Virová onemocnění Variola (virus pravých neštovic) - 700 n.l. – Indie, Čína, Japonsko, Evropa - 1520 – Mexiko - 1524 – Peru - 1555 – Brazílie - 1617 – Severní Amerika - 1713 – Jižní Afrika - 1789 – Austrálie První „vakcinace“ : - 1798 – Jenner, Anglie 1967-1977 - eradikace
An English doctor, Edward Jenner, carries out the first vaccination against smallpox in 1796 by inoculating a boy with cowpox virus.
(World health report 2007) 22
2. Přehled nejdůležitějších virových a nádorových onemocnění Virová onemocnění – ptačí chřipka
(World health report 2007)
23
2. Přehled nejdůležitějších virových a nádorových onemocnění Virová onemocnění – HIV/AIDS
24
2. Přehled nejdůležitějších virových a nádorových onemocnění Virová onemocnění – HIV/AIDS Nakažených může být desetkrát tolik, než vykazují statistiky. Mnoho lidí totiž nechodí na testy. V roce 2007 přišlo na testy hodně lidí, kteří už byli v pokročilém stadiu nemoci AIDS. Podle OSN se na světě virem HIV denně nakazí 6800 lidí a 5700 lidí na AIDS každý den zemře. Nejvíce doléhá nemoc na Afriku, kde žije 22,5 milionu lidí s virem HIV. V Asii je nakaženo 4,9 milionu lidí a za poslední sledovaný rok se tam virem HIV nakazilo 440.000 lidí. Celkový počet lidí infikovaných virem HIV po celém světě OSN odhaduje na 33 miliónů, vloni hovořily odhady o 40 miliónech. (World health report 2007) 25
2. Přehled nejdůležitějších virových a nádorových onemocnění Rakovinná onemocnění – vymezení pojmů
Nádor = Tumor = Neoplazma – maligní nebo benigní hmota tkáně, která nemá fyziologickou funkci, vzniká z buněk existující tkáně a nevyvolává zánětlivou reakci, někdy lokálně expanduje invazí nebo metastázami Karcinom – maligní tumor epiteliálního původu Sarkom – maligní neoplazma vznikající v mesodermální tkáni (kosti, chrupavky, pojivová tkáň, příčně pruhované svaly) Osteosarkom – sarkom odvozený od kostní tkáně Chondrosarkom – sarkom odvozený od pojivové tkáně Hemoblastom – maligní tumor odvozený z embryonálních ganglií Embryonální karcinom – maligní nádor varlat nebo vaječníků Adenokarcinom – maligní nádor odvozený od žlázové tkáně Metastáza – sekundární růst maligního tumoru – obecně přenos nádorové tkáně na jiné místo těla 26
2. Přehled nejdůležitějších virových a nádorových onemocnění Rakovinná onemocnění – vymezení pojmů Lymfom – maligní tumor lymfatické tkáně Myelom – primární tumor kostní dřeně obvykle zahrnující několik různých kostí (mnohočetný myelom) Leukemie – akutní nebo chronické onemocnění krvetvorných orgánů, charakterizované vzrůstem počtu bílých krvinek, tj.: lymfocytů, lymfoblastů, myeloblastů, monocytů, promyelocytů, keratinocytů, T-buněk (retrovirální leukemie) Myelodysplastický syndrom (preleukemie) – onemocnění krvetvorby, které postihuje kmenové buňky, funkční poruchy všech krvetvorných řad, hlavně u starších lidí Myeloproliferační syndrom (primární proliferace kmenových buněk) – porucha kmenových buněk v kostní dřeni, nadměrná tvorba buněk krevních řad vede k polycytémii – nadprodukci červených krvinek; esenciální trombocytémii – nadprodukci krevních destiček; primární myelofibróze – nadprodukci krevních destiček a vaziva v kostní dřeni; 27 chronické myeloidní leukémii – nadprodukci bílých krvninek (granulocytů)
2. Přehled nejdůležitějších virových a nádorových onemocnění Rakovinná onemocnění – vymezení pojmů Akutní leukémie se projevuje rychlým vzrůstem nezralých krevních buněk; kostní dřeň není schopná produkovat normální buňky; je nutná okamžitá léčba (jinak rozšíření do krve, ostatních orgánů, CNS) častěji u dětí Chronická leukémie se projevuje zvýšenou tvorbou defektních krevních buněk; většinou trvá měsíce až roky, než se projeví; většinou se neléčí okamžitě – monitorování a snaha o efektivní léčbu „v pravý čas“ Lymfoblastická leukémie je leukémie buněk kostní dřeně, ze kterých vznikají lymfocyty, léčí se chemoterapií Myeloidní leukémie je leukémie buněk kostní dřeně, ze kterých vznikají červené krvinky (erytrocyty) a některé typy bílých krvinek (leukocytů) a destiček (trombocytů), léčba transplantací kostní dřeně
28
3. Antimetabolity a jejich použití v léčbě Chemicky obměněné přirozené metabolity (analoga metabolitů), které ovlivňují metabolické procesy, probíhající v buňce. Jejich působení je vždy spojeno s ovlivněním průběhu enzymové reakce nebo jejího produktu. Jejich účinek je založen na principu podobnosti struktury modifikované látky k látce přirozené, na jejím rozpoznání enzymem. Výsledkem může být : • Pevná vazba s enzymem a jeho inaktivace • Inhibice enzymem katalyzované reakce • Vznik modifikovaného produktu neschopného další metabolické přeměny • Vznik modifikovaného produktu inhibujícího průběh této nebo další reakce • Vznik modifikovaného produktu jiných fyzikálně-chemických parametrů nebo molekulárně biologických vlastností • Terminace růstu polymerního řetězce (proteiny, nukleové kyseliny) 29
3. Antimetabolity a jejich použití v léčbě Antimetabolity jsou vždy spojeny s pochody v buňce (jejich kompartmentech) a mohou ovlivňovat základní životní procesy buňky či životní cyklus jejích parazitů. Na principu antimetabolitů jsou založena: • cytostatika • protivirové preparáty • antiprotozoální preparáty Na stejných principech působí také preparáty regulující průběh některých metabolických onemocnění, vyvolaných hyperfunkcí nebo dysfunkcí enzymů. Antimetabolity mohou působit přímo nebo až po předchozí aktivaci na aktivní antimetabolity. Jejich účinek v buňce je podmíněn postupně: • transportem přes buněčnou membránu • aktivací • působením na cílový enzym 30
3. Antimetabolity a jejich použití v léčbě Jejich relativní účinek v buňce je charakterizován tzv. chemoterapeutickým indexem nebo indexem selektivity účinku (poměr toxické externí koncentrace k účinné externí koncentraci na buňku). Ideální situace nastává, je-li kterýkoli z těchto tří kroků specifický pro transformovanou nebo infikovanou buňku: specifický transport pouze do těchto buněk aktivace pouze v infikovaných nebo transformovaných buňkách interakce pouze nebo převážně s enzymy transformované buňky nebo enzymy buněčného parazita zábrana procesů klíčových pro buněčného parazita, ale málo podstatných pro buňku. Ke zlepšení farmakologických parametrů či zvýšení selektivity účinku se používají profarmaka, t.j. deriváty antimetabolitů, které se lépe transportují nebo jen omezeně degradují, a poskytují antimetabolit teprve působením specifických enzymů v buňce. 31
3. Antimetabolity a jejich použití v léčbě Možné zásahy: Syntéza a funkce prekurzorů Syntéza a maturace nukleových kyselin Syntéza a maturace proteinů, … Zásahy na DNA: ALKYLACE, TOPOISOMERASY, MENŠÍ A VĚTŠÍ ŽLÁBEK, ŠTĚPENÍ, RADIOMIMETIKA Buněčná mitosa: PROTEINKINASY, TUBULIN, VŘETÉNKO Zásahy na membráně Fyzikálně-chemické zásahy: FOTOSENSIBILIZACE, HYPOTHERMIE Ovlivnění angiogenese Ovlivnění receptorů Ostatní antibiotické účinky 32
3. Antimetabolity a jejich použití v léčbě Příklady antimetabolitů
NH2
COOH PAB
NH2
NH2
SO3H
OH COOH
kyselina sulfanilová
PAS
33
3. Antimetabolity a jejich použití v léčbě Příklady antimetabolitů
O N H
OH N
N H2N
N
COOH
N
NH2
H2N
N N
N
COOH N H
NH2 N
H2N
N
COOH
R=H aminopterin R = CH3 methotrexat
COOH
edetrexat
N R O
N
kyselina listová
N H O
N
COOH
COOH N H
N
34
3. Antimetabolity a jejich použití v léčbě Příklady antimetabolitů NH2 4
3 N
O 2 N 1 R
NH2 5 6
N O
O
N R
O
N R
N
O
O
N R
O
N N R
O Br
N R
N R
O
N R
O
O
O
I
HN
N R
HN
HN
N R O
F
HN N R
O
N R
O CH3
HN
O
F
N
O
HN
O
O
N
NH2
N
O
HN O
N N R
NH2
NH2
HN O
N R 35
3. Antimetabolity a jejich použití v léčbě Příklady antimetabolitů
1N
NH2 6 5
N
NH2
7
2 N 4 N9 3 R
H2N
N R
N
O N N
N
N
N R
N
H2N
N
N R
H2N
N
N R
HN H2N
N
HN
N R
N
N R
N
S
O
OH
HN
N
HN
N R
N R
Se
S N
N
N N
O HN
N
N
8
NH2
NH2
N N R
N
HN H2N
N
N R
36
4. Buněčný cyklus 1. Regulace buněčného cyklu 2. Mikrotubuly
37
4. Buněčný cyklus Buněčný cyklus je definován obdobím od vzniku buňky (která vznikla dělením mateřské buňky) až do stadia, kdy dojde opět k rozdělení na dvě buňky dceřiné (cytokineze) 2 stadia: M-fáze (mitotická fáze) Interfáze – G1, S a G2-fáze Některé buňky přechází po mitóze do klidové fáze, takzvané G0. Odtud mohou po různě dlouhé době opět vstoupit do buněčného cyklu – aktivace – nebo v klidovém stavu zůstat. G1-fáze – postmitotická fáze, 1. přípravná - buňka zvětšuje svůj objem, vytváří se zásoba nukleotidů a syntetizují se enzymy pro budoucí replikaci jaderné DNA - leží zde hlavní kontrolní uzel cyklu S-fáze – syntetická fáze - replikace jaderné DNA, současná syntéza histonů, aby se mohly tvořit nové nukleosomy a chromatinové vlákno 38
4. Buněčný cyklus G2-fáze - 2. přípravná - závislá na dokončení replikace DNA v S fázi -Jedná se o 2. generační fázi (premitotickou), při níž dochází ke zvýšené syntéze a aktivaci proteinů (ke kondenzaci chromozomů, ke tvorbě mitotického aparátu a destrukci jaderného obalu), končí zahájením mitózy Mitóza - jaderné dělení, poslední etapa buněčného cyklu - chromozomy reduplikované do konce S fáze jsou ohraničeny, sesterské chromatidy odděleny a přemístěny k protilehlým pólům buňky (vlastní mitóza) - dceřiné buňky obdrží 2 kompletní sady chromosomů a shodnou výbavu cytoplazmatických organel
39
4. Buněčný cyklus
..\Videa\Cell Division and the Cell Cycle.mp4 ..\Videa\Mitosis.mp4
40
4. Buněčný cyklus - základní stadia mitotického dělení u živočišných buněk Profáze - počáteční stádium mitózy, dochází ke kondenzaci chromatinu, zaniká jadérko – místo, kde během interfáze dochází k mohutné transkripci ribozomální RNA, vzniká dělící vřeténko. Každý chromozom se nyní skládá ze dvou identických molekul DNA (chromatid) spojených v místě centromery. Prometafáze - zaniká jaderná membrána a kondenzované chromozomy se nyní nacházejí v cytoplazmě, zápětí přicházejí chromozomy do kontaktu s mikrotubuly dělícího vřeténka, na něž se svými kinetochory připojí. Za pomoci molekulárních motorů začínají chromozomy postupovat směrem k ekvatoriální rovině buňky Metafáze – chromosomy se přesunují ke středu vřeténka do tzv. ekvatoriální roviny. Pohyb chromozomů po mikrotubulech dělícího vřeténka je zprotředkován kinetochory, proteinovými komplexy nacházejícími se v oblasti centromery každého z chromozomů. 41
4. Buněčný cyklus - základní stadia mitotického dělení u živočišných buněk Anafáze – sesterské chromatidy se od sebe oddělí po mikrotubulech dělícího vřeténka k opačným pólům, zároveň se od sebe tyto póly (zpravidla tvořené centrozomy) vzdalují, jak se vůči sobě posouvají polární mikrotubuly z opačných pólů vřeténka Telofáze – chromatidy se přesunou k opačným pólům vřeténka, kde dekondenzují, výsledkem je vznik dvou dceřiných buněčných jader a oddělení cytoplazmy, dochází k obnově jadérka, chromatinu a jaderného obalu. V ekvatoriální rovině se zatím tvoří konstrikční rýha pro rozdělení cytoplasmy a organel.
42
4. Buněčný cyklus - základní stadia mitotického dělení u živočišných buněk Cytokineze - dochází k postupnému zaškrcení rýhy mezi 2 dceřinými buňkami, proběhne rekonstrukce buněčného jádra a cytoplazmy obou buněk do interfázové podoby, je rekonstruován i jaderný obal a napojení jeho zevní membrány na ER, chromosomy jsou ve svých euchromatinových úsecích rozvolněny a využity k transkripci, jadérko je obnoveno a tím jsou zahájeny procesy G1 fáze
43
4. Buněčný cyklus - základní stadia mitotického dělení u živočišných buněk
44
4. Buněčný cyklus Regulace buněčného cyklu Existují dva typy molekul, které hrají zásadní roli při regulaci buněčného cyklu - cykliny a cyklin dependentní kinázy (CDK) tyto kinázy jsou v buňce přítomné neustále, ale jsou neaktivní v přítomnosti cyklinů se aktivují a začnou fosforylovat (a tím aktivovat nebo deaktivovat) cílové proteiny, které buňku navedou do další fáze buněčného cyklu aktivací různých CDK se ovlivní různé proteiny tak, jak buňka postupuje fázemi buněčného cyklu jedná se o kaskádovitý děj - po obdržení extracelulárního promitotického signálu se aktivuje G1 cyklin-CDK a připraví buňku na přechod do S fáze. Zahájí syntézu transkripčních faktorů, které jsou nutné pro expresi S cyklinů a enzymů potřebných pro replikaci DNA. Také způsobí degradaci molekul, které inhibují přechod buňky do S fáze
45
4. Buněčný cyklus Regulace buněčného cyklu aktivní S cyklin-CDK fosforylují proteiny prereplikačních komplexů a tím je jednak aktivují a jednak zabrání vzniku nových prereplikačních komplexů důvodem je, aby jich bylo správné množství a celý genetický materiál byl zkopírován právě jednou aktivací dalších cyklin-CDK a proteinů dojde k přechodu do G2 fáze během S a G2 fáze se syntetizují neaktivní mitotické cyklin-CDK, ty se aktivují na přechodu do M fáze
46
4. Buněčný cyklus Regulace buněčného cyklu Kontrolní uzly Během buněčného cyklu existuje několik kontrolních bodů, kdy buňka zjišťuje připravenost na další fázi buněčného cyklu a pokud zjistí, že připravena není, pak přechod zablokuje, případně zahájí apoptózu. Prvním kontrolním uzlem je přechod G1/S. Pokud jsou vnější podmínky nepříznivé pro děleni a nebo existuje poškození buňky, zablokuje se přechod z G1 do S fáze. Druhým kontrolním uzlem je přechod G2/M. Zde se buněčný cyklus zastaví v případě poškození DNA. Buňky zůstanou v G2 fázi, dokud není DNA plně replikovaná, případně pokud je jinak poškozená. Třetím kontrolním uzlem je přechod M/G1. Buněčný cyklus se zastaví při přechodu z metafáze do anafáze, pokud nejsou chromozómy dokonale připojené k dělícímu vřeténku.
47
4. Buněčný cyklus Regulace buněčného cyklu Narušení cyklu buněčného dělení nádorových buněk nebo transformovaných buněk hemopoetického systému je cílem antineoplastické chemoterapie.
48
4. Buněčný cyklus - tubulin a mikrotubuly Mikrotubuly
jsou jedny z vláken cytoskeletu, která slouží především k transportu různých struktur a látek uvnitř buňky umožňují pohyb chromosomů při buněčné mitóze dlouhé rovné válcovité struktury o průměru 180-250 Å mikrotubuly jsou rozloženy po celé buňce a jsou víceméně zodpovědné za rozmístění organel po rozvolnění jaderné membrány v prometafázi vnikají mikrotubuly do prostoru jádra a prostřednictvím motorických proteinů (kinesin a dynein) vážou chromosomy, které pak transportují do ekvatoriální roviny vřeténka a k jeho pólům
49
4. Buněčný cyklus - tubulin a mikrotubuly Mikrotubuly Mikrotubuly mají dvě vazebná místa pro GTP nebo GDP a na tom, zda v těchto místech je GDP nebo GTP, závisí jejich stabilita. V případě, že je tam navázáno GTP, jsou stabilnější a proces depolymerizace je pomalejší než proces polymerizace, mikrotubuly tedy rostou. V případě, že je tam navázán GDP, depolymerizace převáží a mikrotubuly se zkracují. Samotná polymerizace tubulinu do mikrotubulů probíhá na úkor štěpení GTP. podél osy jsou rozloženy subjednotky proteinu – tubulinu uměle můžeme způsobit jejich rozpad alkaloidem kolchicinem (z ocúnu) a stabilizovat jejich polymeraci můžeme alkaloidem taxolem (který se získává z tisu) oba tyto alkaloidy inhibují mitózu! 50
4. Buněčný cyklus - tubulin a mikrotubuly Tubulin kyselý protein s GTPasovou aktivitou uspořádán do dimerových jednotek složených z α-tubulinu a βtubulinu každá molekula alfa i beta-tubulinu obsahuje vazebné místo pro GTP, jehož štěpením se uvolňuje energie - vazba je silně ovlivněna Ca2+ a Mg2+ v jejich blízkosti jsou vazebná místa charakterizovaná vazbou kolchicinu nebo vinca alkaloidů polymerizace tubulinu probíhá na úkor štěpení GTP --- GDP při nedostatku GTP se váže jen vzniklý GDP, vazba je výrazně slabší, proto dochází k depolymerizaci – dynamická nestabilita dimery tubulinů spolu tvoří dlouhé řetězce, v nichž na sebe navazují vždy alfa-tubulin na beta-tubulin nikdy se dimery na sebe nemohou navázat souhlasnými typy tubulinů jeden řetězec se nazývá protofilament 51
4. Buněčný cyklus - tubulin a mikrotubuly
52
4. Buněčný cyklus - tubulin a mikrotubuly
53
4. Buněčný cyklus - tubulin a mikrotubuly Schematické znázornění struktury mikrotubulu
Tubulinové dimery jsou seřazeny do 13 protofilament, která jsou vzájemně posunuta o 9 nm a vytváří tak levotočivou šroubovici. Nahoře je tzv. plus-konec mikrotubulu, na němž polymerace tubulinu probíhá rychleji (vystavuje βpodjednotku tubulinu s E-vazebným místem pro nukleotid) K polymeraci (přidávání) a disociaci (odebírání) dimerů bude docházet jen na koncích mikrotubulu. Ten konec mikrotubulu, který je zakončen betatubulinem, má schopnost růstu a proto se nazývá plus konec. Naopak mínus konec bude zakončen alfa-tubulinem a bude tam docházet k disociaci. Mikrotubulus má průměr 25 nm.
54
4. Buněčný cyklus - tubulin a mikrotubuly Dynamická nestabilita
Polymerace a disociace neprobíhá najednou, ale samostatně závisí to na existenci tzv. GTP čepičky, která je posazená na plusovém konci mikrotubulu jedná se o připojené beta-tubuliny, které na sobě mají navázané GTP později, až odroste tato nově navázaná část blíže ke středu mikrotubulu, tak se GTP rozštěpí na GDP a tento beta-tubulin s GDP, již nebude patřit do GTP čepičky GTP způsobuje to, že mikrotubul roste rovně, GDP má tendenci se ohýbat když nastane situace, že se přestanou polymerovat beta-tubuliny s GTP do GTP čepičky, dojde k disociaci mikrotubulu na mínusovém konci
55
4. Buněčný cyklus - tubulin a mikrotubuly V rámci mitózy fungují mikrotubuly následujícím způsobem: po rozvolnění jaderné membrány mikrotubuly narostou od pólů buňky k jednotlivým chromozómům, připojí se k jejich centrálním částem pomocí motorových proteinů a transportují je do rovníkové oblasti buňky ke každé kopii chromozómu je připojen mikrotubul z opačné strany buňky mikrotubuly připojené k centromerám se začnou zkracovat, motorové proteiny po nich posouvají chromatidy každou k jinému pólu buňky v každé polovině dělící se buňky tak zůstane jeden kompletní set chromozomů.
56
4. Buněčný cyklus - tubulin a mikrotubuly Mitotické vřeténko při metafázi: Při metafázi se chromozómy seřadí v rovníkové oblasti dělícího vřeténka. Z centrozomů, které jsou umístěné na pólech vřeténka, vyrostou mikrotubuly směrem k chromozómům a obě sesterské chromatidy každého chromozómu se připojí k těmto mikrotubulům (zelené) prostřednictvím svých kinetochorů. Kromě těchto mikrotubulů jsou v dělícím vřeténku přítomné dva další typy mikrotubulů – polární mikrotubuly (červené), které vybíhají z obou centrozomů a v ekvatoriální oblasti se překrývají a astrální mikrotubuly (modré), které rostou z centrozomů směrem k okraji buňky. Všechny tři typy mikrotubulů mají (-) konec u centrozomů a (+) konec směrem od centrozomů.
57
4. Buněčný cyklus - tubulin a mikrotubuly Mitotické vřeténko při metafázi:
58
4. Buněčný cyklus - tubulin a mikrotubuly Mitotické vřeténko při anafázi: Při anafázi se oddělí sesterské chromatidy a pohybují se směrem k pólům buňky. Děje se tak prostřednicvím mikrotubulů připojených ke kinetochorům. Tyto mikrotubuly se zkracují na svých (+) koncích a současně motorové proteiny připojené ke kinetochorům posouvají chromatidy podél zkracujícího se vlákna směrem k (-) konci, sesterské chromatidy tak zůstávají připojeny ke zkracujícím se mikrotubulům.
59
4. Buněčný cyklus - tubulin a mikrotubuly Mitotické vřeténko při anafázi:
60
4. Buněčný cyklus - tubulin a mikrotubuly v blízkosti vazebných míst pro GTP jsou vazebná místa charakterizovaná vazbou kolchicinu nebo vinca alkaloidů charakteristika je náhodná , v systému přirozené polymerizace tubulinu nehraje žádnou roli všechny látky, které se mohou vázat do těchto center, však silně narušují tvorbu komplexu s GTP a bráni tak polymerizaci tubulinu proto dochází k jeho spontánní depolymerizaci, zastavuje se pohyb motorických proteinů, zprotředkovaný mikrotubuly (včetně pohybu chromosomů), a tím se zastaví i buněčná mitóza látky narušující polymerizaci tubulinu mají proto obecně antineoplastický účinek a mnohé z nich se používají v terapii nádorů a malignit hemopoietického systému
61
5. Chemoterapie nádorových onemocnění Chemoterapie nádorových onemocnění může být rozdělována do následujících typů: •Primární – základní metoda léčby •Adjuvantní – doplňuje primární metodu léčby, většinou se podává po operaci nebo po radioterapii s cílem podpořit účinek •Neoadjuvantní – tato chemoterapie bývá podávána před operací nebo radioterapií s cílem zlepšit operabilitu a usnadnit vlastní výkon nebo také na: •Kurativní - podání chemoterapie s cílem vyléčit. Někdy též radikální. Běžné jsou vysoké dávky a tedy i vyšší nežádoucí účinky. •Paliativní – udržovací či doplňková podávána pro zlepšení stavu pacienta po operačním výkonu s cílem zamezit opětnému růstu nádoru nebo dokonce dosáhnout různě dlouhé remise.
62
5. Chemoterapie nádorových onemocnění Typy nádorů v souvislosti s chemoterapií dělíme na: •chemosenzitivní – nádor je citlivý na chemoterapii •chemokurabilní – nádor je citlivý na chemoterapii a navíc je podání cytostatik pro pacienta přínosné •chemorezistentní – nádor není citlivý na chemoterapii
63
5. Chemoterapie nádorových onemocnění Chemoterapeutika dělíme do několika základních skupin, které jsou popsány níže spolu s významnými zástupci z každé skupiny: •Alkylační cytostatika - dusíkatá analoga yperitu (Chlorambucil, Chlormethine, Cyklofosfamide, Ifosfamide, Melphalan), Busulfan, Dacarbazine, Mechlorethamine, Procarbazine, Temozolomide, ThioTEPA, Uramustine •Antimetabolity - deriváty kyseliny listové (Aminopterin, Methotrexate, Pemetrexed, Raltitrexed), purinová analoga (Cladribine, Clofarabine, Fludarabine, Mercaptopurine, Thioguanine), pyrimidinová analoga (Capecitabine, Catarabine, Fluorouracil, Gemcitabine) •Rostlinné alkaloidy - Taxol (Docetaxel, Paclitaxel), vinca alkaloidy (Vinblastine, Vincristine, Vindesine, Vinorelbine) •Cytotoxická/protinádorová antibiotika - anthracykliny (Daunorubicin, Doxorubicin, Epirubicin, Idarubicin, Mitoxandrone, Valrubicin), 64 Bleomycin, Hydroxyurea, Mitomycin
5. Chemoterapie nádorových onemocnění •Inhibitory topoizomeráz - Topotecan, Irinotecan, podophyllotoxiny (Etoposide, Teniposide) •Monoklonální protilátky - Alemtuzumab, Bevacizumab, Cetuximab, Gemtuzumab, Panitumumab, Rituximab, Tositumomab, Trastuzumab •Photosenzitizéry – Aminolevulová kysleina, Methyl aminolevulinát, Porfimer sodium, Verteporfin •Inhibitory kináz - Dasatinib, Erlotinib, Gefitinib, Imatinib, Lapatinib, Milotinib, Sorafenib, Sumitimib, Vandetamib •Ostatní - Alitretinoin, Altretamine, Amsacrine, Anagrelide, Arsenic trioxide, Asparaginase, Bexarotene, Bortezomib, Denileukin diftitox, Wstramustine, Hydrxycarbamide, Pentostatin, Masoprocol, Mitotane, Pegaspargase, Tretinoin 65
5. Chemoterapie nádorových onemocnění 1948
Metotrexát
Farber
1967
Carmustine
1953
Mitomycin C
Yamamoto
1969
Fludarabin
1954
6-merkaptopurin Hitchings, Elion
1969
Doxorubicin
1954
Actinomycin
Yamamoto
1971
Mithramycin A
1957
5-fluorouracil
Heidelberger
1972
Streptozotocin
1958
cyklofosfamide
Arnold
1972
Lomustine
1958
Busulfane
1976
Ftorafur
1960
Cytarabin
1978
Misonidazol
1961
Vinkristin, Vinblastin
1980
Doxyfluridin
1963
Hydroxyurea
1981
Mitaxanthron
Cheng
1963
Nitrosomočoviny Montgomery
1985
Karboplatin
Smith
1963
Daunorubicin
Dimarco
1986
Topotecan (Camptothecin)
1965
Cisplatina
Rosenberg
1988
Gemcitabin
1966
Bleomycin
Ume Zawa
1992
Taxol
Svoboda
Dimarco
Hiller
Ukeda 66
6. Centrální dogma a genová regulace
1. Replikace 2.Transkripce 3.Translace 4.Stručný náhled do genové regulace
..\Videa\YouTube - From DNA to Protein.flv
67
6. Centrální dogma a genová regulace
68
6. Centrální dogma a genová regulace Replikace Proces, kterým se kopíruje genetická informace z mateřské DNA do nové, dceřiné molekuly. Jednotlivé řetězce v dvoušroubovici DNA jsou vzájemně komplementární, vytváří kanonické páry bází A-T, G-C. Při replikaci se vlákna od sebe oddělí a ke každému vláknu dosyntetizují polymerázy vlákno nové, opět komplementární. Přesnost při přenosu informací způsobuje to, že dceřiné organizmy fungují podobně nebo stejně jako organizmus mateřský. Nepřesnosti při replikaci pak vedou k mutacím. Replikace je součástí buněčného cyklu, na základě vnějšího nebo vnitřního signálu buňka spustí proces, během něhož kromě mnoha dalších věcí začne replikovat DNA.
69
6. Centrální dogma a genová regulace Replikace V určitém místě vznikne replikační vidlička - DNA helikáza (často spojená s primázou) zruší Watson-Crickovy vodíkové vazby a rozvolní vlákna DNA od sebe. V určitém úseku tak vzniknou dva úseky jednovláknové DNA a vzhledem k tomu, že jsou antiparalelní a DNA polymerázy umí pracovat jen v jednom směru (syntéza probíhá ve směru 5´-3´ tedy templát musí být orientován opačně, 3´-5´), probíhá replikace každého z nich odlišně. Jedno vlákno se nazývá vedoucí (leading) a druhé opožďující se (lagging). Na vedoucím vlákně probíhá syntéza nové DNA kontinuálně. Na opožďujícím se vlákně musí replikační mašinérie počkat, až je rozpletený dostatečně dlouhý úsek (obvykle několik set bází dlouhý), a pak začne syntéza RNA primeru, který poskytne požadovaný 3‘ konec, a následně vlastní DNA, která proběhne až k původnímu místu vzniku vidličky. Tomuto vzniklému úseku se říká Okazakiho fragment.
70
6. Centrální dogma a genová regulace Replikace Mezitím probíhá dále rozplétání dvoušroubovice a syntéza na vedoucím vlákně. Až se odhalí další dostatečně dlouhý úsek opožďujícího se vlákna, zopakuje se celá syntéza RNA primeru a DNA. Tímto způsobem vznikne proti vedoucímu vláknu nové vlákno DNA a proti opožďujícímu se vláknu řada krátkých vláken DNA, každé začínající RNA primerem. V tento okamžik přistoupí znovu DNA polymeráza (pol u eukaryot), která odstraní primery a nahradí je DNA. Nakonec enzym ligáza přerušené úseky DNA spojí do jednoho vlákna. Vznik RNA primeru pomocí primáz je nezbytný, protože DNA dependentní DNA polymerázy neumí syntetizovat oligonukleotidový řetězec de novo, umí pouze prodlužovat již existující vlákno. 71
6. Centrální dogma a genová regulace Replikace Pro replikaci jsou potřebné tyto enzymy a proteiny: Helikáza - odděluje komplementární vlákna DNA, zdrojem energie je ATP. DNA vazebný protein - protein, který se váže na jednoduché vlákno DNA po oddělení helikázou, aby zabránil opětovnému spojení do dvoušroubovice. RNA primáza - začne de novo syntetizovat RNA vlákno komplementární k DNA vláknu. Poté, co je RNA primer cca 7-14 nukleotidů dlouhý, vystřídá RNA primázu DNA polymeráza (pol ), která vytvoří DNA primer, cca 35 nukleotidů dlouhý. Nakonec jiná DNA polymeráza (pol a pol ) dokončí syntézu řetězce (až několik tisíc bází). Ligáza - spojuje kratší úseky DNA do delších. 72
6. Centrální dogma a genová regulace Replikace Replikace celého genomu eukaryotické buňky probíhá na mnoha místech současně. Replikační vidlička se obvykle vytváří jedna na úsek o několika tisících nukleotidů. Při replikaci vznikají z jedné dvoušroubovice DNA dvě dvoušroubovice a v obou nových dvoušroubovicích pochází jedno vlákno z původní DNA a druhé je nově syntetizované, jedná se tedy o semikonzervativní proces. Specifické DNA polymerázy jsou v bakteriích a virech a jsou tak zajímavým cílem pro selektivní inhibici, jejich inhibováním je někdy možno zpomalit replikaci patogenů, v jiných případech je mikroorganizmus schopen využít replikačního mechanizmu hostujících buněk. DNA polymerázy jsou obecně vhodné cíle léčby nádorových onemocnění, protože v nádorové tkáni probíhá replikace v daleko větším měřítku než v normální tkáni a její inhibice tak poškodí více nádor než zdravou tkáň. 73
6. Centrální dogma a genová regulace Transkripce proces přenosu genetické informace z DNA na mRNA mRNA potom slouží jako matrice pro syntézu proteinů transkripce probíhá v jádře, kde DNA dependentní RNA polymerázy syntetizují řetězec RNA, který je komplementární k jaderné DNA tato RNA se označuje jako pre-mRNA a obsahuje tzv. introny a exony exony nesou vlastní genetickou informaci, introny jsou oblasti primárního transkriptu, jež nejsou translatovány do struktury proteinu finální mRNA vznikne z pre-mRNA odstraněním intronů a připojením polyA konce a 5‘-čepičky toto jsou charakteristiky, podle kterých buňka pozná, že se jedná o mRNA, tedy matrici pro syntézu proteinů a mRNA je těmito částmi chráněna před degradací nukleázami
74
6. Centrální dogma a genová regulace Transkripce
75
6. Centrální dogma a genová regulace Transkripce je regulována pomocí tzv. transkripčních faktorů (TF), které se váží na promotorové oblasti cílových genů celá řada signálních cest ovlivňuje chování TF – jejich schopnost vázat se na cílové sekvence, stabilitu a lokalizaci vzniklá mRNA je transportována z jádra do cytoplazmy, kde dochází k dalšímu procesu – translaci
76
6. Centrální dogma a genová regulace Translace
přepis informace z mRNA do primární struktury proteinu probíhá na ribozómech ribozóm se skládá z malé a velké podjednotky a tvoří jej RNA s funkcí katalyzátoru a podpůrné proteiny molekula mRNA slouží jako matrice k ribozómu dále přistupuje tRNA, nesoucí na jedné své části příslušné aminokyseliny a obsahující sekvenci tří nukleotidů (kodonů) specifických pro každou aminokyselinu v jiné části nukleotidová sekvence tRNA je komplementární k sekvenci v mRNA a tedy pořadí trojic nukleotidů (tripletů, kodonů) v mRNA určuje pořadí aminokyselin ve vznikajícím proteinu
77
