SAMENVATTING
Samenvatting
Coeliakie is een genetische aandoening waarbij omgevingsfactoren en meerdere genen bijdragen aan de ontwikkeling van de ziekte. De belangrijkste omgevingsfactor welke een rol speelt bij coeliakie is het eiwit gluten. Dit eiwit is aanwezig in graan, zoals tarwe, gerst en rogge en het zorgt ervoor dat we alledaagse producten zoals brood of pasta kunnen bewerken. De enige twee tot nu toe bekende genetische factoren zijn genen waarvan er één op chromosoom 6 ligt en codeert voor het HLA-DQ2/DQ8 molecuul en het andere op chromosoom 19 ligt en codeert voor een eiwit genaamd MYO9B. Klinische symptomen varieren van typische diarree, abnormale absorptie van voedingsstoffen of een groei achterstand tot vermoeidheid, bloedarmoede, gewichtsverlies of helemaal niets. De enige therapie bestaat uit een levenlang glutenvrij dieet. De ziekte manifesteert zich indien een patient gluten binnenkrijgt en dit zich door het slijmvlies van de dunne darm werkt. Daar aangekomen is gluten in staat om een abnormale immuunrespons te activeren welke zal gaan leiden tot verschillende veranderingen in het slijmvlies: lymfocytose (Marsh I), een abnormale groei van de crypten (Marsh II) en een progressieve afbraak van de darmvlokken (Marsh III). De kennis over de ontwikkeling van de ziekte is in de laatste jaren flink gegroeid. We weten nu onder andere dat gluten zowel het aangeboren als het verworven immuunsysteem kan activeren. Dit neemt echter niet weg dat diepere kennis van het karakter van de immuunrespons en het mechanisme achter de verandering van de opbouw van het weefsel in de dunne darm nog steeds niet aanwezig zijn. Het in dit proefschrift beschreven onderzoek voorziet in nieuwe inzichten in de moleculaire mechanismen van zowel het verworven als het aangeboren immuunsysteem en de mechanismen welke verantwoordelijk zijn voor de vlokatrofie. Het aan het licht brengen van nieuwe aspecten van de patho-physiologie van de ziekte was de belangrijkste impuls in de zoektocht naar kandidaatgenen die iemand vatbaar maken voor coeliakie. Hoofdstuk 3 beschrijft de transcriptionele veranderingen in de dunne darm van coeliakie patienten met afgebroken darmvlokken (Marsh III) ten opzichte van gezonde controles. We vergeleken expressie profielen van 15 goed gekarakteriseerde Marsh III en zeven controle biopten in een microarray experiment waarbij gekeken werd naar 19.500 genen. We lieten zien dat een set van 109 genen betrokken is bij lange termijn afbraak van het weefsel. Een groot aantal van deze genen heeft een functie in proliferatie en differentiatie cascades en zijn mogelijk betrokken bij de homeostase binnen de darmvlokken. Dit werd verder ondersteund door de expressiepatronen van Marsh III patienten op een glutenvrij dieet te vergelijken met gluten etende Marsh III patienten. Deze analyse resulteerde in een tweede set van 120 genen welke duiden op verminderde mitotische activiteit in Marsh III patienten na het wegnemen van gluten uit het dieet. Gebaseerd op deze resultaten durfden wij te stellen dat de beide verschillende processen van abnormale groei van de crypten en vlokatrofie moleculair verweven zijn met elkaar. De hypothese is dan ook dat cellen in de crypten niet in staat zijn om hun terminale differentiatie programma af te maken om zo naar de vlokken toe te migreren wat uiteindelijk verantwoordelijk is voor het vormen van de vergrootte crypten 119
Samenvatting
en vervolgens vlokatrofie. Een tweede microarray experiment werd uitgevoerd om specifiek de transcriptionele activiteit van de genen gerelateerd met de immuunrespons tijdens het vernieuwen van het darmslijmvlies te meten. Zoals beschreven in hoofdstuk 4 hadden wij de mogelijkheid om, met behulp van 66 biopten van coeliakie patienten in verschillende stadia van herstel en van controles, een virtueel tijdsreeks experiment uit te voeren waarmee we zowel verschil in expressie van immuun gerelateerde genen als de dynamiek van hun expressiepatroon tijdens weefselregeneratie kunnen bepalen. De resultaten van dit experiment gaven aan dat expressiepatronen van genen welke verschil in expressie vertonen, een geleidelijke afname of toename lieten zien vanaf het moment dat de behandeling was gestart tot het moment van volledig herstel. Interessant was dat deze observatie niet strookte met de afzonderlijke histologische stadia waarmee de diagnose gesteld wordt. Deze resultaten wezen erop dat, ondanks morfologische verschillen, Marsh I en Marsh II patienten op moleculair niveau gezien niet verschillen van Marsh III patienten. Zodoende stelden we voor dat deze patienten gezien moeten worden als coeliakie patienten zolang ze goed reageren op een glutenvrij dieet. De classificatie van genen betrokken bij de aangeboren of verworven immuunrespons lieten een even grote betrokkenheid zien van beide immuunresponsen indien gluten uit het dieet wordt verwijderd. Onze resultaten gaven indicaties dat interferon gamma de onstekingsreactie kan handhaven door stimulatie van de transcriptie van chemokines en cytokines welke, via de JAK-STAT1 cascade, de Th1 immuunrespons activeren. Wat betreft de aangeboren immuunrespons lieten expressie studies genen zien die betrokken zijn bij het aantrekken van neutrofielen in de lamina propria van coeliakie patienten. Dit resultaat werd verder ondersteund door middel van immunohistochemie waarbij neutrofielen met behulp van specifieke antistoffen in zowel Marsh III patienten als in patienten in complete remissie (Marsh 0) werden aangetoond. Deze resultaten impliceerden dat coeliakie patienten constant over een actief aangeboren immuunsysteem beschikken, ongeacht het aan- of afwezig zijn van weefselschade en blootstelling aan gluten. We speculeerden dan ook dat het verhoogde neutrofielen infiltraat het onderliggend effect van het MYO9B-eiwit onthult. MYO9B kan betrokken zijn bij een verminderde intestinale integriteit en kan daardoor een rol spelen in de verhoogde permeabiliteit van de darmen zoals aanwezig in coeliakie. Het integreren van gen-expressie data met bekende linkage data, gecombineerd met kennis van het ziektebeeld van de ziekte, leidde ons naar twee functionele kandidaatgenen die vervolgens werden getest in associatiestudies zoals beschreven in hoofdstuk 5 en 6. Het propyl-endopeptidase (PREP) is een enzym dat in staat is om proline-rijke glutenpeptides af te breken. We stelden voor dat een veranderde PREP activiteit verantwoordelijk zou kunnen zijn voor een inefficiente afbraak van glutenpeptides, wat weer kan leiden tot een opéénstapeling van immuunsysteem stimulerende glutenpeptides en dus een rol zou kunnen spelen in de ontmanteling van de glutentolerantie. 120
Samenvatting
Om de rol van het PREP-gen als primaire factor in coeliakie te onderzoeken, hebben we een sequentie-analyse en een genetische associatiestudie uitgevoerd en hebben we de PREPenzymactiviteit bepaald in biopten van coeliakie patienten en controles. Onze resultaten van de genetische associatiestudie en de activiteitsmetingen lieten zien dat PREP niet het ziekteveroorzakende gen is in de nederlandse coeliakie populatie, zoals beschreven in hoofdstuk 5. Hoofdstuk 6 beschrijft de associatiestudie welke is uitgevoerd op de functionele kandidaat signal transducer and activator or transcription 1 (STAT-1), welke ook nog gelokaliseerd is onder de linkage piek op de lange arm van chromosoom 2. Dit eiwit wordt gereguleerd door interferon gamma. We speculeerden dat elke genetische variatie die de transcriptionele activiteit van dit eiwit zou veranderen, verantwoordelijk zou kunnen zijn voor de schadelijke immuunrespons zoals we zien in coeliakie. Echter, er werd opnieuw geen bewijs gevonden voor positieve associatie binnen de nederlandse populatie. De gen-expressie studies die in dit project zijn uitgevoerd op biopten van coeliakie patienten en controles hebben geleid tot de identificatie van nieuwe cascades die betrokken zijn bij het ziektebeeld van coeliakie. Deze verkregen kennis zal zeker bijdragen aan het onderzoek naar genen betrokken bij het ontstaan van coeliakie. Bovendien zal de integratie van genetische en genomische informatie de sleutel zijn tot de ontwikkeling van diagnostische handvatten die bij zullen dragen aan de identificatie van personen met een verhoogd risico op coeliakie en tot nieuwe therapeutische mogelijkheden leiden.
121
