Organizace genomu eukaryot a prokaryot GENE Mgr. Zbyněk Houdek
Stavba prokaryotické buňky
Prokaryotické jádro – nukleoid – 1 molekula 2-řetězcové DNA (chromozom – kružnicová struktura), bez jaderné membrány. Nepohlavní rozmnožování a nedělí se mitoticky:
replikace, transkripce a translace.
Organely přenosu GI prokaryot
Nukleoid: p. chromozom - 2-řetězcová kružnicová DNA (nepostradatelné geny), proteiny podobné histonům (HLP) a p. nehistonové povahy, které se pojí k cytoplazm. mem. – počátek replikace DNA.
Chromozom (replikon = 1 počátek replikace) tvoří nadšroubovicovou (záporné vinutí) nebo relaxovanou či solenoidovou str.
Monoploidní – 1 sada genů.
Plazmidy – mimochromozómové genofory (postradatelné geny). Ribosomy obsahují - sedimentační koeficient p. ribosomů je 70 S:
30S – ová podjednotka. 50S – ová p.
Replikace u prokaryot
Replikace chromozomu a plazmidů – oboje replikony. Začátek replikace – místo ori – vytvoření replikační vidlice (rozestup DNA-řetězců – přerušení vodíkových vazeb). Jednosměrná replikace – 1 směr (původní hypotéza). Dvousměrná r. (správná hypotéza) – oba směry navzájem opačné. R. otáčející kružnicí (viry, bakterie) – kružnicové vlákno se neštěpí, ale otáčí se a zároveň slouží jako templát pro syntézu nového vlákna.
Fáze a enzymy replikace DNA
Iniciace – zahájení v místě ori a vytvoření 2 replikačních vidlic. Elongace – připojování nových nukleotidů k matricovému DNA-řetězci. Terminace – pochody zakončující replikaci. Všechny pochody jsou řízeny specifickými enzymy:
Tři druhy DNA-polymeráz: DNA-polymeráza I (Kornbergův e.) – katalyzuje replikaci DNA v mezerách mezi Okazakiho fragmenty. DNA-polymeráza II a III. DNA-ligáza – spojování polynukleotidů (spojování Okazakiho fragmentů). DNA-primáza – syntéza RNA-primeru DNA-helikáza – přerušuje vodíkové vazby mezi 2 DNA řetězci DNA-gyráza (topoizomeráza) – upravuje strukturu DNA-řetězců před vytvořením replikační vidlice.
Transkripce u prokaryot
Katalyzuje enzym RNA-polymeráza nebo RNAtranskriptáza – syntéza dlouhých primárních RNAtranskriptů na matrici DNA-řetězce a váže se na promotor. Typy primárních transkriptů: Mediátorová RNA (mRNA) – přepis GI ve strukturních genech, matrice pro syntézu polypeptidového řetězce na ribosomu (u bakt. není sestřih). Prekurzorová ribozomová RNA (pre-rRNA) – transkript genů pro rRNA, postranskripční úprava ve funkční typy rRNA. Prekurzorová transférová RNA (pre-tRNA) – transkript genů pro tRNA, postranskripční úprava ve funkční typy tRNA.
Uvedené primární transtkripty mohou být polygenní (polycistronní – přepisy více genů).
Bakteriální translace
Výchozími látkami pro translaci jsou standardní aminokys. (20 + selenocystein) v cytoplazmě, ale musí být chemicky aktivovány. Probíhá na ribozomech, kde se tvoří polypeptidy za účasti tRNA podle GI na mRNA a enzymů aminoacyl-tRNA-syntetáz. Průběh bakteriální translace dělíme na 3 fáze: Iniciace – vytvoření iniciacního komplexu (ribzom -70S, mRNA a iniciační tRNA vstupuje do peptidového místa na ribozomu a váže se antikodonem na iniciační kodon rRNA – AUG). Elongace – prodlužování polypeptidového řetězce– řízena proteiny (elongační faktory). Terminace – zakončení syntézy polypeptidu, které je signalizováno terminačním kodonem (UAA, UAG, UGA)– řízena p. (terminační f.).
Prokaryotické ribosomy
Sedimentační koeficient je 70S (30 a 50S). Skládají se ze 5S-, 16S- a 23S-rRNA. Vazebná místa na ribozomu:
Vazebné místo pro mRNA – 30S podjednotka (napojení na 3´-konec 16SrRNA). A-místo (aminoacylové m.) – mezi 30S a 50S podjednotkami – navázání aminoacyltRNA. P-místo (peptidylové m.) – mezi 30S a 50S podjednotkami – váže tRNA na jejímž 3´konci je syntetizovaný polypeptidový ř. E-místo (výstupní místo) pro deacylovanou tRNA, která odevzdala svou aminokys.
Souběh transkripce, translace a degradace mRNA
U prokaryot může translace a degradace mol. mRNA začínat dříve, než je dokončena transkripce (syntéza mRNA). Všechny procesy probíhají ve směru 5´k 3´, tak mohou probíhat současně. U prokaryot není aparát pro syntézu polypeptidů oddělen jadernou mem. od syntézy mRNA. Urychlení syntézy – na 1 mRNA pracuje více ribozomů – polyribozomy (vzdálenost mezi nimi je asi 80 nukleotidů).
Schématický model eukaryotické buňky:
1 - jadérko; 2 - jádro; 3- ribozom; 4 – vezikul; 5 -endoplazmatické retikulum; 6 - Golgiho aparát; 7 - cytoskelet; 8 - hladké endoplazmatické retikulum; 9 - mitochondrie; 10 - vakuola; 11 cytosol; 12 - lysozom; 13 - centriola
Buněčné jádro
Nukleus obsahuje genetický materiál buňky. Jde o nějvětší organelu (10-20 µm). Je ohraničena dvojitou jadernou membránou, v níž se nacházejí póry tvořené speciálními bílkovinami (100 proteinů):
Důmyslná struktura, která je propustná pro malé mol. rozpustné ve vodě. RNA a proteiny jsou tříděny na základě jaderného lokalizačního signálu, speciálních receptorů a energie (proteiny jádro). Transport sestřižené mRNA z jádra.
Jadérko (nukleolus) je malá vnitřní část buněčného jádra kulovitého tvaru, která obsahuje hodně ribozomální RNA ( rRNA). rRNA vzniká přímo v jadérku a následně v něm vznikají i ribozómy). Vzniklé ribozómy se asociují přímo s rRNA, po té jsou jadernými póry transportovány ven do cytoplazmy. Jadérko není od zbylé karyoplazmy odděleno žádnou membránou.
Struktura eukaryotických chromozomů
Počet chromozomů v jádrech bb. určitého druhu e. org. je závislý na tom zda se jedná o b. somatickou nebo gametickou: Gamety (vajíčka, spermie) – v jádře haploidní počet ch. (druhově specifický – např. člověk n=23, potkan n=21, drosofila n=4). Somatické bb. mají dvojnásobný počet ch.- diploidní stav (2n).
Chemická struktura: DNA, histony, nehistonové p., RNA chromatin. DNA je vázána na histony jako nukleoproteinový komplex – nukleozom (Kornberg 1974). Nukleozomy spojené spojnicovou DNA tvoří negativní nadšroubovicové vlákno – 11 nm. Toto vlákno se sbaluje do 30 nm chromatinového vlákna, které se během metafáze váže na nehistonové proteinové lešení.
Stupně struktury eukaryotických chromozomů
Specializované sekvence DNA chromozomů
3 typy specializovaných sekvencí: Replikační počátky – začátek duplikace DNA (více replikač. počátků). Centromery – zajišťují rozchod replikovaných ch. do dceřinných b. při dělení (na centromeře proteinový komplex kinetochor, který váže duplikované ch. na dělící vřeténko). Obsahují repetitivní nukleotidové sekvence. Telomery – na obou koncích ch., které obsahují repetitivní nukleotidové sekvence – umožňují replikaci konců ch. Protože primery nemohou vznikat na konci ch. – docházelo by ke ztrátám koncových oblastí. Existuje enzym telomeráza, která tyto sekvence syntetizuje. Dále telomery chrání ch. před působením DNA-nukleáz, které degradují konce DNA-molekul.
Transkripce a úpravy RNA u eukaryot
Transkripce u eukaryot je složitější:
RNA se syntetizuje v jádře a musí se pak přenést do cytoplazmy (ribozomy-translace). Eukaryotický transkript = 1 gen. Většina primárních transkriptů prochází před transportem do cytoplazmy 3 podstatnými modifikacemi: K 5´koncům prim. transkriptů se připojí 7metylguanozinové čepičky. K3´koncům těchto odštěpených transkriptů se připojí úseky poly(A). Vyštěpují se introny.
Translace u eukaryot
E. ribosomy: Jsou tvarem a funkcí velmi podobné prokaryotním, skládají se také ze 2 podjednotek (velká 60S, malá 40S), ale sedimentační koeficient je vyšší = 80S (18S, 5S, 5.8S, 28S). Translace se uskutečňujě u eukaryot ve 2 nebo třech místech b. (živočichové – cytoplazma, mitochondrie; rostliny ještě navíc v chloroplastech). Translace v mitochondriích a chloroplastech – ribosomy, sedimentační k.=60S – podobný jako u bakterií stejný průběh translace jako u bakterií.
Průběh eukaryotické translace
Na ribozomech 80S a princip je shodný jako u bakterií, ale u eukaryot je iniciační tRNA s navázaným methioninem připojena k malé podjednotce r. (jako jediná tRNA v b. se pevně váže na tuto podjednotku) za asistence několika proteinů (iniciačních f.). Pak se malá podjednotka váže na 5´-konec mRNA (rozpoznán podle čepičky) a začne podél mRNA ve směru 5´3´ a hledat 1. kodon AUG, který je rozpoznán antikodonem iniciační tRNA (váže na P-místo). Po jeho nalezení se odpojí iniciační faktory a připojí se velká podjednotka a začíná elongace – navázání 2. tRNA s aminokys. do A-místa. Terminace je shodná s prokaryoty – stejné terminační kodony (UAA, UAG, UGA).
Mutace
Mutace jsou změny v genotypu organismu oproti normálu. Org. se změněným genotypem vlivem mutace – mutant. Velká většina mutací je naprosto náhodných, cílená mutageneze se používá téměř výhradně pro vědecké účely. Pravděpodobnost jedné takovéto chyby se pohybuje v řádech asi 10-7 (náhodné při replikaci, bez zjevné vnější příčiny – spontánní mutace). Pravděpodobnost vzniku mutace se zvyšuje působením některých fyzikálních nebo chemických činitelů mutagenů indukované mutace.
Mutace somatické a gametické
Mutace mohou vznikat v jakémkoli org. (viry, prokaryota, eukaryota). Vyskytují se nejen v jakékoli buňce, ale i vývojovém stádiu org. U vyšších org. jsou bb. zárodečné (germinální) linie (vznik gamet) odděleny od ostatních typů bb. (somatické bb.). Podle výskytu mutace v určitém typu bb. dělíme mutace na gametické a somatické. Gametické m.: vyskytují se pouze u bb. zárodečné linie (přenáší se na potomstvo, ale jen na určitý podíl potomků). Somatické m.: vyskytují se naopak pouze v somatických bb. (nepřenáší se na potomky).
Mutageny, promutageny Mutageny: Účinným fyzikálním mutagenem je např. záření (ionizující = rentgenové paprsky) nebo neionizující (UV záření) změna ve struktuře DNA. Chemickými mutageny jsou silná oxidační činidla (např. H2O2), alkyl deriváty a analogy bazí (mitomycin C), které se naváží do polynukleotidových řetězců. Promutageny: Látky, které nejsou rovnou mutagenní, ale stávají se mutagenními metabolickým působením org. (enzymová reakce). Kancerogeny: Látky, kterými se aktivují geny způsobující kancerogenezi. Prokarcerogeny: Látky, které se stávají karcerogenní vlivem metabolické aktivace (aflatoxiny).
Klasifikace mutací
Genové (bodové) mutace jsou změny v genetické informaci, které proběhly v jednom genu a nenarušily stavbu chromozómu (změna fenotypové vlastnosti-nádorová onemocnění, srpková anémie). Chromozómové mutace vedou ke zlomům a k přestavbám struktury chromozómů (větší skupiny genů, jsou pozorovatelné mikroskopem). Genomové mutace jsou změny v počtu chromozómů (dobře pozorovatelné pod mikroskopem).
Mutace genové
• Substituce je náhrada báze původní sekvence bází jinou. • Transice je záměna purinového nukleotidu za purinový a pyrimidinového za pyrimidinový. • Transverze je záměna purinového nukleotidu za pyrimidový a naopak. • Posunové mutace: • U delece jde o ztrátu jednoho nebo více nukleotidů původní sekvence. • Adice (inzerce) – zařazení jednoho nebo více nadbytečných nukleotidových párů.
Mutace měnící a neměnící smysl
Mutace neměníci smysl (samesense mutation), kdy je i přes mutaci zařazena stejná aminokyselina. Jsou způsobeny substitucemi na třetí pozici kodonu. Tichá mutace (silent mutation) se změnou v kodonu, která se neprojevuje ve funkci polypeptidového řetězce. Mutace měnící smysl (missense mutation), které mění smysl polypeptidového vlákna, které způsobí zařazení odlišné aminokyseliny při proteosyntéze. Nesmyslné mutace (nonsense mutation), které zapříčiní vznik předčasného terminačního kodonu v sekvenci DNA. Výsledkem je zcela nefunkční protein.
Chromozomální mutace
Jsou to všechny úchylky chromozomů – změna struktury a tvaru. Zjišťují se analýzou karyotypu, jako tvarové a strukturální odchylky od normálního karyotypu. Tyto změny na chromozomech nazýváme chromozomové aberace. Jedná se o velký počet genů a odráží se ve fenotypu jedince. Důležité je jaký chromozom byl zasažen a jakým typem aberace – zlom v určitém místě chromozomu fragment.
Typy aberací
Poruchy párování ch. při dělení bb. poruchy oplození, reprodukce dále ve fenotypu neplodnost, snížená životaschopnost a mortalita. Heterozygotní a.: znamenají výlučně strukturální změnu na 1 ch. z páru (asi 1% gamet). Homozygotní a.: velmi vzácné, protože musí dojít ke stejnému zlomu v obou ch. Intrachromozomální a.: přestavby uvnitř 1 ch. nebo páru – delece, duplikace, inverze, kruhový ch., translokace … Interchromozomální a.: a. zasahuje 2 ch. páry nebo 2 různé ch. – různé translokace a fůze ch.
Genomové mutace
• •
Změny v počtu chromozomů od normálního stavu. Aneuploidie – ztráta nebo nadbytečná přítomnost některých jednotlivých chromozómů – monozomie, trizomie – u člověka trizomie 21 ch. Downům syndrom. Polyploidie – početní změny celých sad chromozómů, časté u rostlin – větší vzrůst šlechtitelské postupy. Haploidie – redukce celých ch. sad. Heteroploidie – označení variability počtu chromozomů v jádrech a aneuploidní charakter (dlouhodobě kultivované bb. in vitro).
Opravy mutací
Organismy jsou do jisté míry schopny mutace v DNA opravit: enzymové komplexy k těmto biochemickým reakcím.
Fotoreaktivace – opravy poškození způsobeného UV zářením v 2-řetězcové DNA kovalentní vazby mezi pyrimidiny (tyminy), opravný enzym se aktivuje denním světlem – rozpojení a oprava DNA do původní struktury. Excisní oprava – vystřižení poškozeného úseku a nahrazením správného úseku DNA (nukleázy, polymerázy a ligázy). Rekombinační oprava (málo probádaná) – rekombinační výměna poškozených oblastí mezi 2 mol. DNA 1 opravená mol. a 1 mol. s kumulovanými poškozenými oblastmi.
