Penulis lahir di Solo pada tanggal 23 Maret 1949. Anak ketiga dari lima bersaudara dari ayah K. L. Halim (almarhum) clan ibu Na Winarti. Penulis rnenyelesaikan pendldikan Sajana Muda jurusan Biolog Fakultas Keguruan Ilmu Eksakta IKIP Jakarta pada tahun 1973. Tahun 1974 melanjutkan penddikan Strata- 1 j urusan Biologi Fakultas Keguruan Ilmu Eksakta K I P Jakarta, lulus tahun 1976. Tahun 1986 mengikuti pendidkan S-2 dan 1988 lulus pendidikan Strata-', (Magister Sains), Program Studi Biologi MIPA Fakultas Pascasajana Universitas Gadjah Mada (UGM) dengan spesialisasi Kultur Jaringan Tanaman. Tahun 1997 mengikuti pendidikan Strata-3 (Program Doktor) pada Program Studi Biolog Fakultas Pascasajana Institut Pertanian Bogor (IPB). Sejak 1973 menjadi asisten luar biasa pada jurusan Biolog FKIE
LKIP
Jakarta. Pada 1980 sampai sekarang menjadi tenaga pengajar di jurusan Biolog Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Negeri Jakarta (uNJ)-
Penulis menikah dengan Drs. A. J. V. Tumilisar, beputra dua orang,
Ir. Alva M.Tumilisar dan Enrico M. Tumilisar S.Si.
UCAPAN TERIlMA KASIH
Berangkat dar~kesadaran bahwa penulis memulai tugas belajar di program S3 IPB dengan sosok keberadaan yang sangat minimum, balk dari keterbatasan
pengetahuan, kesiapan mental dan kelengkapan prasarana fisik, maka terselesaikannya disertasi ini tidak mungkm menjadi kenyataan tanpa perkenan Tuhan yang setiawan dan rahmani. Sebentuk puji dan syukur penulis bubungkan kehadapan Tuhan Maha Pengasih dan Penyayang yang senantiasa menyertai sampai dibatas a h r tugas ini. Penulis teringat kepada banyak pihak yang telah memberikan bantuan dan dorongan serta doa bag terselesaikannya disertasi ini. Pada tempatnya penulis mengucapkan terima kasih secara khusus dan dengan tuius kepada : Prof. Dr. Ir. Edi Guhardja, M.Sc sebagai Ketua Komisi Pembimbing; Dr. Ir. Said Harran; Dr. Drh. Bambang Pontjo Priosoeryanto, M.Sc; Prof. Dr. Ir.
L i w Winata Gunawan (alm); Dr. ir. Puspa Dewi Tjondronegoro (alm) sebagai Anggota Komisi Pembimbing, yang telah mernbimbing selarna penelitian hingga penyelesaian disertasi. Pengelola bea siswa BPPS Direktorat Jenderal Pendidikan Tinggi Departemen Pendidikan dan Kebudayaan, Rektor Institut Pertanian Bogor (IPB) dan Direktur Program Pascasarjana IPB atas dukungan dana dan kesempatan yang diberikan untuk mengikuti stud Program Doktor. Kepada Rektor Universitas Negeri Jakarta (UNJ), Dekan Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alarn serta Ketua Jurusan Biologi yang telah memberi ijin melanjutkan studi.
Khususnya kepada Prof. Dr. Ir. Livy Winata Gunawan (alm) yang telah membantu pengadaan dana penelitian melalui proyek penelitian Tim Pascasaj a m
(URGE) nomor: 047IADD.IIMTPP- IV/URGE/1999 dengan judul: Screening for stable expression of antiviral and anticarcinogenic protein ,from in vltro transfinned culture of tropical plants for biomedical uses.
Keluarga Dr. Mutha1ib.A. DSPD yang telah memberikan bantuan dana untuk menyelesaikan penelitian. Kepala Pusat Penelitian dan Pengembangan Bioteknologi Cibinong, Kepala Laboratoriurn Fennentasi Bioteknologi Cibinong beserta staf Kepala Laboratorium Imunologi Narnru-2 Depkes RI, beserta staf. Kepala Laboratorium Kultur Jaringan Tanaman BDP-TPB beserta staf. Kepala Laboratorium Fisiolog Turnbuhan beserta staf, atas pemberian ijin dan kesempatan untuk menggunakan fasilitas laboratonurn. Semua pihak dan individu yang tidak dapat disebut satu persatu, khususnya Drs. Darmawan Rijadi yang dengan setia membantu sejak awal studi hingga terselesaikamya disertasi ini. m r n y a kepada pihak keluarga, yang telah memberikan pengertian, dorongan moril dan material serta bantuan doa selama penulis mengikuti studi program S3. Bogor, Agustus 200 1 Penulis
DAFTAR IS1
DAFTAR TABEL
.................................................................
DAFTAR GAMBAR
...........................................................
DAFTAR LAMPRAN
...........................................................
.............................................................. 1. Latar Belakang .. 2 . Tujuan Penelifian ............................................................ . 3 . Hlpotesis ..................................................................... 4 . Manfaat Penelitian........................................................... 3
I1. TDJJAUAN PUSTAKA ...................................................... 1. Tanaman Blustru ............................................................ 1. 1. Sejarah ................................................................. 1. 2 . Morfologi . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1. 3 . Habitat .................................................................. 1. 4 . Kegunaan ..............................................................
2 . Kultur Jaringan Tanarnan ................................................. 3. Kultur Akar Transgenik ................................................... 3. 1. Biologi Agrobacterzum rhizogenes ................................ 3 . 2 . Genetik Akar Transgefuk ........................................... 3 . 3 . Kultur Akar Transgenik . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4 . Susunan Anatomi Akar Luffs cylindricu (L.) Roem ....... ......
5 . Protein Bioaktif pada Tanaman .......................................... 5 . 1. Penyebaran Protein Penginaktivasi Ribosom ..................... 5. 2 . Stmktw Protein Penginaktivasi Ribosom ........................ 5. 3 . Aktivitas Biolog Protein Penginaktivasi Ribosom ............. 6. Ekstraksi dan Purifikasi Protein Bioahf . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6. 1. Ekstraksi dan Purifikasi ............................................. 6 . 2 . Analisis Fraksi ........................................................ 6. 3 . Elektroforesis Ekstrak Protein ...................................... 7. Pengujian Protein Bioaktif secara In Vitro .............................. 7 . 1. Kultur Sel Lestari .................................................... 7. 2 . Macam Sel Lestari ................................................... 7. 3 . Uji Aktivitas Protein Bioaktif ......................................
xiv
I11. BAHAN DAN METODE ...................................................
Penelitian 1: Kultur Akar Transgenik Blustru secara In Vitro .......... 1. Bahan ........................................................................ 2 . Pembuatan Me&a Murashige dan Skoog ............................... 3 . Pembuatan MeQa untuk Inokulasi Bakteri ............................. 4 . Inokulasi Agrobacterium rhizogenes .................................... ... ............................................................... 5. Pernilihan Blji ... 6. Sterilisasi B i j ~............................................................... 7. Inisiasi Akar Transgeruk ..........:....................................... 8. Pembuatan Preparat Penampang Akar .................................. Penelitian 2: Produksi Protein Bio*f Blustru ........................... 1. Ekstraksi dan Purifikasi Biji B1usb-u .................................... 2. Ekstraksi dan Purifikasi Akar Transgenik .............................. 3. Elektroforesis ............................................................... Penelitian 3: Pengujian Akbvitas Protein Bio&f Akar ................ Transgenik dan Biji Blustru secara In Vipo 1. Bahan ........................................................................ 2 . Pembuatan MeQa Kultur Sel ............................................. 3. Pengujian Aktivitas Fraksi-Fraksi Protein Bioaktrf secara In ........ Vitro IV. I-USIL DAN PEMBPLHASAN .............................................
Penelitian 1 : Kultur Akar Transgenik Secara In Vitro 1. 1 . Kultur Akar Transgenik Blustru Secara In Vitro ................ 1 . 2 . Susunan Anatomi Akar LuHa cyZindrica ............................ Penelitian 2 : Ekstraksi dan Purifikasi Protein Bioaktif Blustru ....... 2 . 1. Ekstraksi dan Funfikasi Protein Bioahf Biji Blustru ............ 2 . 2 . Ekstraksi dan Purifikasi Protein Bioakhf Akar Transgenik ...... Blustru Penelitian 3: Pengujian Aktivitas Protein Bioaktif secara In Vitro. . . . 3. 1. Pengujian Protein Bioaktif dari Biji dan Akar Transgenik ...... Terhadap Sel Hela 3. 2 . Pengujian Aktivitas Protein B i o ~ dari f Biji dan Akar ........ Transgenik terhadap Sel Melanoma 3. 3. Pengujian Protein Bioaktif dari Biji dan Akar Transgen~k...... Terhadap Sel K-562
DAFTAR PUSTAKA ............................................................
30
DAFTAR TABEL
No.
Halaman
1 . Rata-Rata Pertum buhan Akar Transgenik AT- I dan AT-2 dalam MS Cair Tanpa Hormon Nilai Konsentrasi Fraksi-Fraksi Protein Biji Serta Volume yang diperoleh setelah kromatografi Nilai Konsentrasi Fraksi-Fraksi Protein Akar Transgenik yang diperoleh Setelah Kromatografi dan Pemekatan Nilai F dan Perbandingan Taraf Nyata (Pr>F) dari Respon Mortalitas dan Antiproliferasi pada Sel HeLa Hasil Uji Perbandingan Berganda Duncan dari Protein Bioaktif Terhadap Respon Mortalitas pada Sel HeLa Hasil Uji Perbandingan Berganda Duncan dari Protein Bioaktif Terhadap Respan Antiproliferasi pada Sel HeLa Nilai F dan Perbandingan Taraf Nyata (Pr>F) dari Respon Mortalitas dan Antiproliferasi pada Sel Melanoma Hasil Uji Perbandingan Berganda Duncan dari Protein Bioaktif Terhadap Respon Mortalitas pada Sel Melanoma Hasil Uji Perbandingan Berganda Duncan dan Protein Bioaktif Terhadap Respon Antiproliferasi pada Sel Melanoma Nilai F dan Perbandingan Taraf Nyata (Pr>F) dari Respon Mortalitas dan Antiproliferasi pada Sel K-562 Hasil Uji Perbandingan Berganda Duncan dan Protein Bioaktif Terhadap Respon Mortalitas pada Sel K-562 Hasil Uji Perbandingan Berganda Duncan dari Protein Bioaktif Terhadap Respon Antiproliferasi pada Sel K-562
.......
63
DAFTAR GAMBAR
Halaman
No. 1. Struktur Protein Penginaktivasi Ri bosom Tipe- 1 dan
............
33
Tanaman Biustru (Lufu cyl~ndricu (L.) Roem) dengan Buahnya
............
46
(1) Bunga betina - soliter; (3) Bunga betina sudah *a& pembuahan; (3) Bunga jantan pada satu tangkai karangan bunga
............
46
Tipe- 2
Buah Benunur Satu Bulan, Kulit Hijau Muda
..............................
Buah Berumur Dua Bulan Kulit Benvarna Hitam
.........................
Jaring-Jaring (Iuffa) pada Buah yang Sudah Kering
.......................
(1) Hipokotil Membesar Tepat pada Bagian Terinfeksi ,-!grobucter~urnrhizogenes (2) Akar Panjang dengan Rambut-rambut Halus (3) Akar Panjang kurus, Rambut Sedikit (4) Akar Pendek, Gemuk, Tidak Berambut
..................
47 47 48
53
( I ) Akar Transge~llk Tumbuh dengan Banyak Cabang, Panjang (2) Akar Lebih Pendek, Agak Gemuk, Muncul Beberapa Akar pada Bagian Terinfeksi Bakteri (3) Akar Gemuk, Pendek Berambut Halus (3) Akar Panjang Bagian Pangkal Berambut dan Kearah Ujung Akar Tidak Berambut
............
54
Akar Transgenik yang Muncul Tepat pada Bagian Hipokotil yang Diinokulasi Agrobucterium rhizogenes Umur 2 Minggu
............
55
Kultur Akar Normal Berumur 4 Minggu
....................................
55
Pertumbuhan Lambat Akar Transgenik dari Salah Satu Klon Umur 4 Minggu
............
56
Perturnbuhan Cepat Akar Transgenik dengan Cabangcabang Lateral Umur 4 Minggu
............
56
14. Pertumbuhan Cepat Akar Transgenik dan Salah Satu Klon Umur 4 Mmggu
............
57
Pertumbuhan Cepat Akar Transgenik Umur 4 Minggu, Memendu Cawan Petri
............
57
Kultur Akar Transgenik dalam Media Cair Tanpa Hormon dan Tanpa Antibiotik Berumur 2 Mnggu
............
60
Kultur Akar Transgenik dan Klon yang Lain, Terlihat Rambut Akar yang Halus, Berumur 2 Minggu
............
60
Kultur Akar Normal Sebagai Kontrol dalam Media MS ............ Cair Tanpa Hormon dan Tanpa Antibiotik, Akar Berumur 4 Mnggu
61
Kultur Akar Transgenik dari Klon yang Pertumbuhannya Larnbat Umur 4 Minggu
............
61
Kultur Akar Transgenik dari Klon yang Perturnbuhannya Sedang Umur 4 Minggu
............
62
Kultur Akar Transgenik dan Klon yang Perturnbuhannya Cepat Urnur 4 Minggu
............
62
Kurva Pertumbuhan Akar Transgenik AT-1 dan AT-2 ............ dalam Meda MS Cair Tanpa Hormon dan Tanpa Antibiotik serta AN Sebagai Kontrol
63
Penampang Melintang Akar Transgenik yang ............ Pertumbuhamya Cepat dan Bercabang (1) Epidermis; (2) Korteks; (3) Endodermis; (4) Metaxilem dan (5) Floem
68
Penampang Melintang Akar Transgenik Tunggal Tidak ............ Bercabang Terllhat: (1) Berkas Xllem Pentark; (2) Korteks; (3) Endodermis
68
Penampang Melintang Akar dari Spokotil yang Tidak ............ Terinfeksi Bakteri (1) Epidermis; (2) Korteks; (3) Endodermis; (4) Berkas Xilem Triark; (5) Metaxilem; (6) Floem
69
Penampang Melintang Akar Normal dari Kultur In Vitro ............ (1) Epidermis; (2) Korteks; (3) Endodennis; (4) Perisikel; (5) Metaxilem Tersebar; (6) Floem
69
Penampang MeIintang Akar Normal dari Dalam Tanah (1) ............ Epidermis; (2) Korteks; (3) Endodemis; (4) Perisikel; (5)
70
Metaxilem; (6) Protoxilem; (7) Floem; (8) Akar Lateral dengan Trakeid Penampang Melintang Akar Normal dengan Berkas Xilem Menyebar 1. Epidermis; 2. Korteks; 3. Endodermis; 4. Pensikel; 5. Metaxilem; 6. Floem
... ... ... . ..
70
Penampang Melintang Akar Normal Penampang Membujur Akar Lateral. 1. Korteks; 2. Metaxilem; 3. Protoxilem; 4. Floem; 5. Akar lateral dengan trakeid
. . . . . . ... . . .
71
Penampang Melintang Akar Normal dan Akar Lateral (1) Epidermis; (2) Korteks; (3) Akar Lateral; (4) Trakeid
. . . ... .. . ...
71
Akar Blustru yang Siap Diekstrak ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .. . ... ..
75
Biji Blustru Tua yang Siap Diekstrak . .. . .. .. . ... ... . . . . .. . .. ... ... .. . . . . . ..
75
... ... .. . ... . . . ... ... ... ... ... . .. ...
76
Daun Blustru yang Siap Diekstrak . .. . . . . .. ... ... .. . ... ... ... . . . ... .. . .. . . . . .
76
Buah Blustru Muda yang Siap Diekstrak
Ekstrak Kasar (Sampel) Akar, Biji, Buah dan Daun Blustru Hasil Pemisahan Protein Biji dengan Kromatografi Gel
... ... ... .. .
. . . . .. . .. . . . ... . ..
77 78
... ... ... ...
80
Elektroforesis SDS - PAGE dari Protein Bioakhf Biji ... ... ... ... Nomor (1) Fraksi A; (2) Fraksi B; (3) Fraksi C; (4) Fraksi D; (5) Marker; (6) Fraksi E; (7) Fraksi F
80
Hasil Pemisahan Protein Akar Transgenik dengan ... ... ... ... Kromatografi Gel
83
Sampel dari Keempat Fraksi Protein Akar Transgenik Blustru Setelah Kromatografi
... ... ... ...
86
Elektroforesis SDS - PAGE dari Protein Bioaktif Akar ... ... . . . ... Transgenik, Nomor (1) Marker Protein BM 29 kDa; (2) Fraksi A; (3) Fraksi B; (4) Fraksi C; (5) Fraksi D
86
Sel K-562 (1) Sel Hidup; (2) Sel Mati dalam Bilik Hitung . .. ... ... ... (Haemositometer) dengan Pembesaran 1OOX
88
Sampel dari Keenam Fraksi Protein Biji Blustru Setelah Kromatografi
43. Sel K-562 berkelompok (1) Sel Hidup; (2) Sel Mati ... ... .. . .. . . .. . .. . . . . Sel K-562 dalarn Medla Kultur RPMI 1640 dengan Pembesaran 100 X Sel HeLa Terlihat Membentuk Amoeboid Pembesaran 100 X
dengan
Sel HeLa, Inti Sel Terlihat Jelas dengan Pembesaran lOOX Sel HeLa dalam Media RPMI 1640 dengan Pembesaran 50X Sel Melanoma (A-375) Setelah diberi Perlakuan Protein Bioaktif dengan Pembesaran 1OOX Sel Melanoma (A-375) Mengalami Confluence Harnpir 100% dengan Pembesaran 100 X Pengaruh Konsentrasi Protein Bioaktif Biji Blustru Terhadap Mortalitas Sel HeLa Pengaruh Konsentrasi Protein Bioahf Biji Blustru Terhadap Antiproliferasi Sel HeLa Pengamh Konsentrasi Protein Bioaktif Akar Blustru Terhadap Mortalitas Sel HeLa Pengaruh Konsentrasi Protein Bioaktif Akar Blustru Terhadap Antiproliferasi Sel HeLa Pengaruh Konsentrasi Protein Bioaktif Biji Blustru Terhadap Mortalitas Sel Melanoma Pengaruh Konsentrasi Protein Bioakhf Biji Blustru Terhadap Antiproliferasi Sel Melanoma Pengaruh Konsentrasi Protein Bioaktif Akar Blustru Terhadap Mortalitas Sel Melanoma Pengaruh Konsentrasi Protein Bioakhf Akar Blustru Terhadap Antiproliferasi Sel Melanoma Pengaruh Konsentrasi Protein Bioaktif Biji Blustru Terhadap Mortalitas Sel K-562 Pengaruh Konsentrasi Protein Bioaktif Akar Blustru Terhadap Antiproliferasi Sel K-562
88
No .
Halaman
1 . Identifikasi Lufa qtindrica (L.) Roem
.....................................
122
2. Bahan Media Murashige clan Skoog (MS) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
123
3. Media Kultur Akar Trmsgenik
124
...............................................
4 . Media Yeast Manitol Agar (YMA) ..........................................
125
5. Media Kultur Sel Tumor ......................................................
126
6. Bahan Pembuatan Preparat Penampang Akar
127
..............................
7. Prosedur Kerja Kultur Akar Transgenik ....................................
129
8 . Ekstraksi dan Pwifikasi Biji Lufu cylindricu (L.) Roem .................
130
9. Ekstraksi dan Purifikasi Akar Transgenrk L u f u cylindrica ...............
131
(L.) Roem 10. Rancangan Pengujian Sel Tumor .............................................
132
11. Elektroforesis ...................................................................
133
