No title

Zvyšování konkurenceschopnosti studentů oboru botanika a učitelství biologie CZ.1.07/2.2.00/15.0316

Houby v lékařské biotechnologii Produkce antibiotik a dalších lékařsky užitečných produktů  Patrně už i naši předkové používali různých plísní jako terapeutických prostředků pro bakteriím  Mnoho ANTIBIOTIK je běžně využíváno z bakterií, hlavně z aktinomycet. Antibiotika houbového původu běžně využívané v medicíně jsou penicilin, cephalosporin a fusidová kyselina (produkují ji rody Fusidium /Hypocreales/ nebo Mucor ), které jsou antibakteriální a látka griseofulvin, která je antifungální.  Největšího objemu výroby dosahují 2 skupiny těchto antibiotik: peniciliny a cefalosporiny. Čisté preparáty P. notatum penicilin produkujících kmenů začaly být široce využívány až ve 40–tých letech k léčení infikovaných ran. V té době penicilin byl vyčištěn, ale nebyl široce využitelný pro civilní využití.  Než byl penicilin zaveden jako první skutečné antibiotikum, bylo zkoumáno tisíce metabolitů, které byly produkovány hlavně houbami a aktinomycetami pro antimikrobiální aktivitu. Houby neprodukují jenom antibiotika, ale i další spektrum lékařsky užitečných látek, jako NÁMELOVÉ ALKALOIDY, DERIVÁTY STEROIDŮ, PROTINÁDOROVÉ LÁTKY A IMUNOREGULÁTORY.

HISTORIE  Objev antibiotik spolu s aplikací hygienických praktik u lékařů (např. mytí rukou a použití sterilizovaných nástrojů) je jeden z nejdůležitějších objevů v současné medicíně. Dnes banální zranění, jako je škrábnutí, s sebou dříve nesla riziko infekce a smrti.  Již 2500 let př. n. l. používali v Číně k léčbě infekcí obklady z plesnivého sojového mléka.  První skutečně účinné objevené antibiotikum pocházelo z plísně. Francouzský doktor Ernest Duchesne zaznamenal už v roce 1896 fakt, že určité plísně rodu štětičkovec (Penicillium) ničí bakterie. Duchesne a jeho výzkum však zůstal zapomenut po celou generaci.  Alexander Fleming během svého výzkumu antibakteriálního působení lysozymu kultivoval baktérie na agarových plotnách a jedna z nich byla napadena plísní druhu Penicillium notatum. Fleming zaznamenal čistou zónu kolem plísňového podhoubí a pochopil, že plíseň vylučuje něco, co růst bakterií zastavilo. I když nebyl schopen sloučeninu izolovat, svůj objev v roce 1929 popsal ve vědecké literatuře. Protože plíseň byla rodu Penicillium, nazval tuto sloučeninu penicilin.

POUŽITÍ  Antibiotika se používají především k léčbě infekčních stavů, někdy však též preventivně (tzv. antibiotická profylaxe).  V současnosti je však velkým problémem CHYBNÉ POUŽITÍ ANTIBIOTIK zvláště pak použití nevhodného antibiotika (proti rezistetnímu původci) nebo předepsání antibiotik při léčbě virových onemocnění, jako je rýma nebo chřipka. Při nedodržení celé předepsané dávky antibiotik, obvykle pro pacientův subjektivní pocit zlepšení, nejsou patogenní mikroorganismy zcela zničeny. Kromě selhání léčby vede toto chování k rozvoji antibiotické rezistence u neúplně zahubených populací bakterií.  Antibiotika se uplatňují i v jiných oblastech, než je medicína. Podávání malých množství ANTIBIOTIK HOSPODÁŘSKÝM ZVÍŘATŮM zvyšuje jejich přírůstky.  Také při kultivacích MIKROORGANISMŮ V BIOTECHNOLOGICKÝCH LABORATOŘÍCH se používají antibiotika, a to v tkáňových kulturách či růstových mediích za účelem potlačení nežádoucí bakteriální kontaminace (v selektivních médiích). Často se používá kombinace několika antibiotik a antimykotik, aby došlo k pokrytí celého spektra mikroorganismů.

PENICILLIN  V roce 1927 Sir A. Fleming nechal růst na miskách čistou kolonii Staphylococcus aureus, když mu zkontaminovala. Na misce se objevila jasná široká zóna okolo houbové kolonie, což Flemingovi ukázalo, že nějaká látka pronikala do okolí a dovedla zabíjet nebo inhibovat růst bakterií.  Fleming izoloval tuto plíseň a určil ji jako Penicillium notatum (nyní zařazeno do P. chrysogenum) a zjistil, že působí proti gram-pozitivním bakteriím.

 PRŮMYSLOVÁ VÝROBA s využitím povrchové kultivace však byla zahájena AŽ V ROCE 1941 v USA. Jednalo se o první průmyslově vyráběné antibiotikum. V tomto případě byl použit jako produkční mikroorganismus Penicillium notatum, kmen izolovaný již Flemingem. Pro submersní technologii, která následovala krátce poté byl použit nový producent – Penicillium chrysogenum, od něhož jsou odvozeny kmeny, které se používají pro výrobu penicilinových antibiotik i v současnosti. Kolonie Penicillium chrysogenum

Biosyntéza β-laktamových antibiotik vychází ze 3 aminokyselin – valinu, leucinu a α-aminoadipové kyseliny. β-laktamová antibiotika působí převážně na G+ bakterie; polosyntetické preparáty mají též účinnost proti některým Gbakteriím. Mechanismus účinku těchto látek spočívá v inhibici syntézy buněčné stěny katalyzované transpeptidasami. Přírodní peniciliny jako např. penicillin G a penicillin V byly brzy nahrazeny semisyntetickými peniciliny - methicillin, ampicillin, carbenicillin, amoxicillin, etc.

Masová produkce penicilinu v 50.- tých letech 20. století

Biosyntéza penicilinu

VÝROBA PENICILINU Produkční kmen se UCHOVÁVÁ ve formě LYOFILIZOVANÝCH SPOR, resp. vegetativního mycelia v ochranném mediu (např. glycerol) v hluboko mrazících boxech (- 70 °C). Příprava inokula má několik stupňů a provádí se v nutričně bohatém mediu při teplotách okolo 25 °C. Doba zdvojení buněk se pohybuje okolo 6 hodin.  PRODUKČNÍ MEDIUM obsahuje pomalu utilizovatelné C-zdroje, např. DEXTRINY, ŠKROBY, SACHAROSU; rostlinné i živočišné oleje, ethanol. Nzdroj může zajišťovat corn-steep (produkt z kukuřičných zrn), mouka z bavlníkových semen ap. Tyto suroviny obsahují také dostatek síry. Nezbytná je APLIKACE PREKURZORŮ, v závislosti na typu produkovaného penicilinu. Penicilin G (benzylpenicilin) vyžaduje fenyloctovou kyselinu v množství cca 0,47 g/g. Dávkování se provádí kontinuálně po celý produkční interval (kyselina je toxická). Penicilin V (fenoxypenicilin) vyžaduje fenoxyoctovou kyselinu v množství cca 0,50 g/g.

VÝROBA PENICILINU II. Technologické zařízení - Průmyslově byly realizovány BATCH A FED-BATCH PROCESY. Objem: 40 až 200 m3; v současnosti i více; fermentory typu air-lift, resp. MÍCHANÝ TURBÍNOVÝ FERMENTOR (materiál antikoro – vyšší koncentrace Fe má inhibiční vliv).  Regulace procesu se provádí na základě měřených veličin:  Teplota (23 až 28 °C),  Tlak (nárůst parciálního tlaku CO2 na 0,08 atm. může snížit produkci penicilinu až o 50% ),  pH (6,5 – 7,0),  Koncentrace kyslíku (0,4 až 1,0 mmol/l/min),  Koncentrace biomasy,  Základní složení media,  Koncentrace produktu. DOSTATEČNÉHO NÁRŮSTU BIOMASY by mělo být dosaženo BĚHEM PRVNÍCH 40 HODIN KULTIVACE. Rozhodující podíl penicilinu je produkován ve fázi ZPOMALENÉHO RŮSTU A FÁZI STACIONÁRNÍ (sekundární metabolit). V určitém rozmezí velmi nízké růstové rychlosti populace platí přímá závislost mezi touto rychlostí a rychlostí produkce penicilinu. Konečná koncentrace biomasy je limitována parametry zařízení (kapacita aeračního zařízení, chlazení).

VSÁDKOVÁ (BATCH) KULTIVACE – buňky rostou z inokula do požadované density a po té je kultivační médium odstředěno a produkt je izolován PŘÍTOKOVÁ VSÁDKOVÁ (FED-BATCH) KULTIVACE - v určité fázi růstu je přidáno médium nebo vhodná látka pro zvýšení buněčné denzity nebo produkce KONTINUÁLNÍ KULTIVACE – kultura je po celou dobu kultivace udržována v exponenciální fázi růstu. Konstantní je koncentrace média a složení produktů.

Typický míchaný bioreaktor (fermentor)

Množství penicilinu vyprodukovaného na jednotku objemu závisí na:  a) koncentraci biomasy (počtu buněk) - dána typem zařízení  b) specifické rychlosti syntesy penicilinu  c) délce produkční fáze.

Fermentory

IZOLACE PENICILINU  Jednotlivé izolační kroky vycházejí z vlastností media v němž je penicilin obsažen a z fyzikálněchemických vlastností samotného produktu.  Penicilin (G, V) je silná kyselina, vyrábí se ve formě různých solí. Meziprodukty biosynthesy se snadno rozkládají v kyselém prostředí. Také penicilin G má v kyselém prostředí nižší stabilitu ve srovnání s penicilinem V. Molekula penicilinu může být snadno štěpena β-laktamasami.  Vlastní izolační proces se obvykle skládá z následujících kroků:  ochlazení kultivačního media na teplotu 0 až 4 °C (zamezení rozkladu βlaktamasami)  oddělení biomasy (mycelia) ve vakuovém rotačním filtru  snížení pH na hodnoty 3 až 4 (rozklad vedlejších produktů) extrakce penicilinu do organického rozpouštědla (amylacetát, cyklické ketony ap.)  odstranění barviv a dalších nečistot na koloně s aktivním uhlím  zvýšení pH na 5 až 7 a následná krystalizace v podobě sodné nebo draselné soli  izolace, promytí a sušení krystalů Purifikační kroky zahrnují rekrystalizaci, sterilní filtraci a sterilní vakuovou destilaci (injekční forma – PENICILIN G, tabletová forma – PENICILIN V).

Technologický proces

Příprava kultivačních medií, inokula a vlastní kultivační proces mají mnoho společných rysů pro výrobu většiny antibiotik, tedy nejen βlaktamových.

Rod Penicillium  Rod Penicillium patří mezi vláknité houby, vlákna jsou septovaná.  Rozmnožuje se asexuálně (je řazen do pomocné skupiny Deuteromycota, pokud je nalezeno pohlavní stadium, tak do Ascomycetes).  Jeho zástupci mohou být isolováni ve formě spor nebo vegetativně rostoucího mycelia zejména z půdního prostředí, ze vzduchu a z nejrůznějších potravin.  Většina druhů tohoto rodu patří mezi půdní saprofyty a podílí se na kolonizaci a mineralizaci rozmanitých organických materiálů. Tyto druhy mají velký význam při koloběhu prvků. Některé druhy patří mezi parazity, napadají především suché plody (obilí a další) a podílejí se na biodeterioraci těchto potravin.  Za podmínek parazitického růstu produkují mykotoxiny.  Některá penicilia napadají i měkké ovoce (citrusy, jablka, hrušky, meruňky a další) a svojí činností způsobují velké ekonomické ztráty

 Penicilia se nevyznačují žádnými specifickými růstovými podmínkami, využívají poměrně široké spektrum zdrojů uhlíku včetně řady pentóz, což není u hub běžné. Ze zdrojů dusíku jsou utilizovány amonné ionty, dusitany, dusičnany, močovina i aminokyseliny.  Penicilia jsou známa produkcí dalších sekundárních metabolitů s antimikrobními účinky (patřící mezi polyketidy, alkaloidy, terpeny, steroly, βlaktamy deriváty šikimové kyseliny a mastných kyselin). Tyto metabolity se však z řady důvodů nevyrábějí.  Některé metabolity mají význam jako mykotoxiny. Produkce mykotoxinů byla popsána u 60 – 70 druhů. Penicilia napadají především obilí, sojové boby, fazole, kávu, rýži a kukuřici. Většina mykotoxinů vykazuje kancerogenní účinky pro různé druhy živočichů. Mezi nejznámější patří citrinin (Penicillium sp.), patulin (P.expansum, P. patulinum), cyklopiazonová kyselina (P. griseofulvum, P. patulum), penicilová kyselina (Penicillium sp.), ochratoxiny (Penicillium sp.), rubratoxin (P. rubrum) a další.

Využití zástupců tohoto rodu v technologiích: • PRODUKCE ANTIBIOTIK – penicilin (P. chrysogenum, P. notatum, βlaktamové antibiotikum) griseofulvin (P. griseofulvum – heptaketid) • PRODUKCE ENZYMŮ - β-1,3-glukanasa (P. italicum, P. emersonii) • VÝROBA SÝRŮ – P. roqueforti, P. camemberti

Přírodní penicilíny trpí několika nevýhodami: 1) Jsou rozkládány v žaludku a jako výsledek toho, nejsou tak efektivní, když jsou přijímány ústně 2) Jsou citlivé na enzym penicilinázu, která je produkována penicilinrezistentními bakteriemi, což je fakt který kriticky redukuje jejich efektivitu 3) Jejich účinnost je omezena na gram-pozitivní bakterie

GRISEOFULVIN  Griseofulvin je jediné účinné antifungální antibiotikum produkované houbami. Je produkováno houbou Penicillium griseofulvum (P. urticae). Je ve své podstatě fungistatické více než fungicidní, a protože má malou toxicitu a schopnost akumulovat se v kůži, vlasech a nehtech po ústním podání, je používán ke kontrole povrchových dermatomykoz. Využívá se od 50.- tých let jako systemický fungicid proti houbovým patogenům rostlin.  Produkce griseofulvinu je dosahována použitím media obsahujícího laktózu, výluh z máčených kukuřičných zrn, uhličitan vápenatý, dihydrogenfosforečnanu draselného, přidání chloridu draselného.  Izolace griseofulvinu z růstového media je podobné jako u penicilinu a je rozpuštěno v rozpouštědle, pak může být snadno vyčištěno a krystalizováno.

Penicillium griseofulvum – a Kolonie na agarové misce.

CEPHALOSPORINY  Některé kmeny r. Cephalosporium (Acremonium) produkuje směs antibiotik , které přináležejí k cephalosporinům.  Podobně jako penicilíny jsou cephalosporiny produkovány v dávkované kultuře s glukózou jako zdrojem uhlíku.  Cephalosporiny působí i proti některým Gram-negativním bakteriím.

Cephalosporium acremonium

FUSIDANY  Fusidová kyselina, helvolová kyselina, cephalosporin P jsou antifungální antibiotika, které jsou založeny na základě fusidanové kostry.  Z těchto antibiotik, pouze fusidová kyselina je používaná terapeuticky a je efektivní když je podávána orálně proti grampozitivním infekcím, hlavně penicilin-resistentním staphylokokům.  Fusidová kyselina byla poprvé izolována z houby Fusarium (Fusideum) coccineum, ale i např. z druhu Mucor ramannianus (ramycin), z houby Cephalosporium a nyní v současnosti z Isaria kogana (Ascomycotina)  Helvolová kyselina je produkována více druhy hub, např. Aspergillus fumigatus a Cephalosporium caerulens.

Umbellopsis (Mucor) ramanniana

Isaria sp.

OSTATNÍ ANTIBIOTIKA PRODUKOVANÁ HOUBAMI  Houby produkují velké množství různých látek, které mají antifungální nebo antibakteriální aktivitu, ale pouze několik z nich má použití v medicíně.  Mnoho z těchto látek, např. oosporein (izolovaný z Verticillium psalliotae) jsou také mykotoxiny a mají množství dalších užitečných vlastností, např. mohou být herbicidní nebo antiprotozoálními vlastnostmi.  Antibiotika produkovaná houbami, které našly pouze omezené lékařské využití zahrnují Pecilocin (Variotin) - produkovaný houbou Paecilomyces variotii, fumagilin – produkovaný houbou Aspergillus fumigatus a siccanin – produkovaný houbou Helminthosporium spp.

Paecilomyces variotii

Aspergillus fumigatus

Oudemansiella mucida slizečka porcelánová produkuje antibiotikum MUCIDIN (mucidermin) Má také cytostatický účinek S úspěchem se používá k léčení lidských dermatomykóz

ANTIVIROVÉ LÁTKY  Gliotoxin (produkce některé druhy rodů Aspergillus, Penicillium, Trichoderma) a chaetomin (produkce Chaetomium cochliodes), inhibují multiplikaci RNA virů v kulturách a in vivo. Jsou účinné proti různým virůmpolioviry, a některé chřipkové viry.  Funikulosin – izolovaný z Penicillium funiculosum, inhibuje oba DNA a RNA viry

Penicillium funiculosum

PROTINÁDOROVÉ PŘÍPRAVKY Z HUB  Okolo 300 protinádorových látek bylo izolováno z mikroorganismů, z nich ¾ jsou získány z aktinomycet, 11 % z bakterií a 13 % z hub.  Ze 43 protinádorových látek izolovaných z hub, 23 pochází z nedokonalých hub, 15 ze skupiny Basidiomycotina a 5 ze skupiny Ascomycotina. V současnosti těchto látek bude patrně daleko více (okolo 200 protinádorových)  Mykotoxiny jako např. aflatoxin B1, produkovaný houbou Aspergillus flavus, ačkoliv jsou karcinogenní, tak mají paradoxně slabý protinádorový efekt.  Sterigmatocystiny, produkované Aspergilus versicolor, jsou také účinné proti indukované myší leukémii. Další protinádorové účinky mají látka auguidin (Fusarium), glykoproteinový komplex (Candida), fumigalin (Aspergillus fumigatus).  Ze skupiny Basidiomycotina byly izolovány protinádorové látky z těchto druhů: Coriolus consors, C. versicolor, Schizophyllum commune, Lentinus edodes (lentinan), Ganoderma lucidum, Tremella fuciformus, Cordyceps ophioglossoides, Pleurotus ostreaus, Sclerotinia glucanicum, Inonotus obliquus (čága).

Housenice cizopasná (Cordyceps ophioglossoides

Aspergilus versicolor

Coriolus consors syn. Irpex consors – bránovitka

Schizophyllum commune Klanolístka obecná

Coriolus versicolor Outkovka pestrá

Tremela fuciformis rosolovka řasotvará

Ganoderma lucidum Lesklokorka lesklá

Pleurotus ostreatus Hlíva ústřičná

Lentinus edodes Houževnatec jedlý

IMMUNOSUPRESIVA - CYKLOSPORIN

 Již 50 let se transplantují různé orgány. Pro úspěšnou transplantaci je důležitá imunitní odpověď a odmítnutí orgánu je nevítané.  V minulosti byla používána různá imunosupresiva – jako azathioprin a kortikosteroidy. Naneštěstí tyto látky mají nepříjemné vedlejší účinky pokud jsou používány příliš často a ve velké míře. Tolypocladium inflatum (nyní nazývané Tolypocladium niveum), produkuje látku (cyklopeptid) se zajímavou antifungální aktivitou. Další producenti Trichoderma polysporum a Cylindrocarpon lucidum  Cyklosporin dovede selektivně inhibovat dělení lymfocytů (hlavně T-).  Cyklosporiny jsou nepochybně nejlepší imunosupresiva doposud objevené, které v moderní transplantační medicíně značně snižují riziko odmítnutí orgánu.  Naštěstí, cyklosporin působí efektivně i proti revmatické artritidě, jelikož chronický zánět v této situaci je vlastně poruchou imunity.

Tolypocladium (inflatum) niveum, houba produkující Cyklosporin, je anamorfou druhu Cordyceps subsessilis

GLIOTOXIN  Gliotoxin je sekundární metabolit produkovaný houbou Aspergillus fumigatus  Makrofágy (typ bílých krvinek) – jsou „požírači“ v imunitním systému člověka, které pohlcují nepatřičné částice jako jsou bakterie. Kontaminace touto houbou zabraňovalo připojení i fagocytózu.  Izolovaná látka se nazývá gliotoxin, a tato látka zabraňuje jistým imunitním buňkám množit se  Gliotoxin je imunotoxin, látka která omezuje činnost imunitního systému.  Gliotoxin podobně jako cyklosporin nachází využití v transplantačních operacích nebo transplantacích kostní dřeně.

NÁMELOVÉ ALKALOIDY  Námel neboli sušené sklerocium PALIČKOVICE NACHOVÉ (Claviceps purpurea), napadající žito, znalo lidstvo již ve starověku. Nejprve spíše v souvislosti s jeho toxickými účinky. Obilí obsahující námelová zrna, bylo PŮVODCEM ROZSÁHLÝCH EPIDEMIÍ, které si vyžádali často desetitisíce životů.  Ve středověku byly extrakty z námele používány k VYVOLÁNÍ PORODŮ a k regulaci poporodního krvácení.  První chemicky čistá sloučenina byla z námele izolována v roce 1875 (ergotinin). V roce 1918 byl izolován klinicky využitelný ergotamin. V polovině minulého století byly položeny základy průmyslové produkce námelových alkaloidů.

ROD CLAVICEPS  Rod Claviceps je známý především produkcí námelových alkaloidů. Námelové alkaloidy jednoduššího strukturního provedení jsou produkovány i dalšími houbami (r. Aspergillus, Penicillium) a rostlinami (Convolvulaceae). Claviceps patří mezi askosporogenní houby, je homothalická. Tento rod je representován přibližně 50 druhy, ovšem složitější námelové alkaloidy (amidy lysergové kyseliny) jsou syntetizovány pouze druhy C. purpurea a C. paspali. K produkci těchto látek dochází i v přírodě, a to za podmínek parazitického růstu houby na hostitelské rostlině (obilniny, traviny, při cílené polní produkci je využíváno žito).

Námel (sklerocium)

Claviceps purpurea Paličkovice nachová

Stromata rostoucí ze sklerocia

Perithecia ve stromatu

ŽIVOTNÍ CYKLUS PALIČKOVICE NACHOVÉ Asexuální fáze růstu této houby začíná PŘENESENÍM SPOR (konidie, askospory) do KVĚTNÍCH ORGÁNŮ ROSTLINY. Spory klíčí nejprve v promycelium, posléze se vytvoří SFACELIOVÉ MYCELIUM, které se intenzivně větví a jeho vzdušné hyfy diferencují v konidiofory. Na konidioforech se vytváří velké množství spor, konidií, které květ zcela vyplní. V podmínkách parazitického růstu, v době, kdy SFACELIE vyčerpá květní orgány hostitele, ODŠKRTÍ SEMENÍK OD CÉVNÍHO SVAZKU ústícího do původního květu a umístí se místo něho na ústí floému. Floémová šťáva měla sloužit k výživě diferencující obilky. Zatímco doposud rostla houba na úkor vnitřních květních orgánů hostitele, stává se od tohoto okamžiku novou ŽIVNOU PŮDOU TRVALÝ PŘÍTOK FLOÉMOVÉ ŠŤÁVY. Tato zásadní změna ve výživě je hlavní PŘÍČINOU VZNIKU SKLEROCIA. Sklerocium se vytváří z konidií, které neklíčí ve sfaceliové mycelium, ale zvětšují svůj objem. Sklerocium představuje z fyziologického hlediska KLIDOVÉ STADIUM mezi dvěma obdobími aktivního růstu.

 Sklerocium (není-li sklizeno) se NA KONCI LÉTA UVOLNÍ, přečká zimu v půdě a na jaře (nejdéle po pěti měsících) DIFERENCUJE VE STROMA. Stroma se skládá ze stonku a z hlavy, v níž je ponořeno PERITHECIUM S ASKY obsahujícími askospory. Vyvinuté askospory jsou z aska uvolňovány do vzduchu právě v době, kdy začínají traviny kvést a životní cyklus se může opakovat.

Životní cyklus Paličkovice nachové

SYMPTOMY OTRAVY 1) GANGRENÓZNÍ ERGOTISMUS. Tento syndrom začíná pocitem vyčerpanosti a chladnutím či ztrácením citu v končetinách, potom následují pocity pálení v končetinách (svatý oheň). Postupně NAPADENÉ ČÁSTI OCHRNUJÍ. Končetiny a chodidla zčernávají a mumifikují. Tyto suché gangrény se šíří dále a prsty oběti a dokonce i celé končetiny (podle literárních údajů) odpadávají. 2) KŘEČOVITÝ ERGOTISMUS. Zde je napadený hlavně centrální nervový systém. Symptomy zahrnují pocity mravenčení, a i poškození mozku je běžné. V nejzávažnějších případech má pacient epileptiformní křeče. Úmrtnost je mezi 11-60%. Může ležet jako mrtvý 6 - 8 hodin a pak trpět kožní anestesií, paralysou horních končetin, záškuby paží, deliriem a ztrátou řeči. Zemřít může třetí den po nástupu příznaků. Zvířata postižená konvulsivním ergotizmem se mohou stát divokými, řvou, úzkostně rámusí, následně pojdou.

Onemocnění bylo v minulosti často označováno jako oheň sv. Antonína (v souvislosti s konvulsivní formou). Poslední popsaný případ ergotismu byl ve Francii v roce 1950.

Příznaky jsou způsobovány 2 hlavními složkami (různými chemikáliemi). (1) účinek na svaly: alkaloidy ovlivňující hladkou svalovinu a způsobují vasokonstrikci. (2) účinek na CNS: aminy kys. lysergové, hlavně derivát diethylamid kyseliny lysergové (LSD), má velký potenciál jako halucinogen.

NÁMELOVÉ ALKALOIDY  Hlavní efekt těchto látek je sympatetický efekt mající za následek inhibici hormonu adrenalinu, noradrenalinu a sklerotinu, což způsobuje stažení cév, a druhý účinek je na dělohu pomocí kontrakcí hladké svaloviny. Ale největší farmakologický efekt pochází z přítomnosti diethyamidu kyseliny lysergové (LSD), který má účinky na nervovou soustavu.  Produkce ergotových alkaloidů. Původně byly ergotové produkovány z námele, který přirozeně rostl na travách.

alkaloidy

 Nyní jsou ergotové alkaloidy produkované v kulturách. Claviceps fusiformis, Claviceps purpurea a Claviceps paspali jsou hlavními zdroji námelových alkaloidů. Nyní je možné i mnoho námelových alkaloidů syntetizovat, ale přirozená produkce houbami zůstává stále nejekonomičtější způsob produkce.  Produkce alkaloidů houbou Claviceps sklerocií.

probíhá pouze během růstu

CHARAKTERISTIKA NÁMELOVÝCH ALKALOIDŮ  Chemicky patří mezi alkaloidy tryptofanového typu. Základní část molekuly je tvořena tetracyklickou strukturou zvanou ergolin. Existují 4 hlavní strukturální skupiny: klavinové alkaloidy, lysergové kyseliny, jednoduché amidy lysergové kyseliny, peptidy lysergové kyseliny. klaviny

D-lysergová kyselina

amidy lyserogové kyseliny

peptidy lysergové kyseliny

 Biologická aktivita námelových alkaloidů je SPOJENA S ČINNOSTÍ NEURORECEPTORŮ A NEUROPŘENAŠEČŮ.  Ergolinový skelet má řadu strukturních podobností právě s noradrenalinem, dopaminem nebo serotoninem. Aktivita se projevuje jednak na úrovni modulací psychického stavu, jednak na úrovni činnosti hladkého svalstva.

PRŮMYSLOVÁ PRODUKCE NÁMELOVÝCH ALKALOIDŮ  Produkčními mikroorganismy jsou Claviceps purpurea tvořící při patogenním růstu tmavě fialová sklerocia obsahující převážně peptidové deriváty a Claviceps fusiformis – C. paspali tvořící šedá sférická sklerocia obsahující převážně jednoduché amidy kyseliny lysergové a klaviny. POLNÍ PRODUKCE  INFEKCE obilí se PROVÁDÍ SUSPENZÍ SPOR. Rod Claviceps produkuje jednak konidie (povrchová nebo submersní kultivace) jednak arthrospory (submersní kultivace). Infekce probíhá v době uvolnění klasu z posledního listu s využitím speciálních strojů. V rozmezí asi 4 TÝDNŮ PROBĚHNE vegetativní část životního cyklu této fytopatogenní houby. Výsledkem jsou námelová zrna, která se uvolňují z klasů. V tomto období se provádí tzv. sklizeň, pro kterou byly opět vyvinuty speciální zemědělské stroje. Výtěžek bývá asi 200 kg námele/ha.  Tento typ produkce lze provádět bez hlubších znalostí regulace syntézy alkaloidů, protože celý proces probíhá v PODMÍNKÁCH PŘIROZENÝCH PRO PATOGENA. Nevýhodou je vliv podnebí a počasí na výrobní proces.

REAKTOROVÉ TECHNOLOGIE  Vzhledem k tomu, že produkce alkaloidů probíhá v odlišném fyziologickém stavu mikroorganismu, je nezbytné v průběhu kultivace takovou změnu navodit. Kromě změny a optimalizace zastoupení jednotlivých nutrientů je možné tohoto stavu dosáhnout výrazným zvýšením osmotického tlaku media.

 Kultivační proces trvá 2 až 3 týdny. Zařízení musí splňovat parametry pro dlouhodobé udržení sterility. Produkční kmeny snadno ztrácí schopnost hyperprodukce alkaloidů. Jsou citlivé k mechanickému stresu a celkovému designu fermentorů.  Claviceps můžeme kultivovat na minerálním médiu obsahujícím glukosu, amonné ionty (nebo močovinu, glutamát, aspartát, dusičnany jsou využívány zřídka) a anorganické sole.  Dále je vyžadována přítomnost biotinu a zvýšená tenze oxidu uhličitého.  Růst probíhá optimálně při teplotě blízké 30 °C, produkce alkaloidů v rozmezí teplot 21 – 24 °C, hodnota pH 5 – 6.

IZOLACE  Výchozí materiál (sklerocium, mycelium) se převede do alkalického vodného roztoku a dále se provádí extrakce organickým rozpouštědlem.  Extrakční operace a zahuštění ve vakuové odparce se používají pro další přečištění alkaloidů. Krystalizaci je možné provádět z methanolového roztoku.  Paspalová kyselina se transformuje na lysergovou kyselinu v prostředí hydroxidu amonného za zvýšené teploty.

TOXICKÉ HOUBY  V současnosti již otravy námelovými alkaloidy nemají takovou váhu, ale stále dochází k mnoha otravám, které si sami způsobují nezodpovědní sběrači hub. K některým otravám dochází díky záměně jedlých hub za jedovaté druhy, jiný druh otrav si lidé způsobují sami konzumací hub s halucinogenními účinky.

CYKLOPEPTIDY HEPATONEFROTOXICKÝ SYNDROM  Nejznámějšími cyklopeptidovými látkami jsou amatoxiny, α-amanitin a βamanitin. Oba jsou teplotně stabilní a zůstávají dokonce i po intenzivním vaření.  Symptomy se objevují 8-15 hodin po konzumaci a jsou spojeny s gastoenterickými problémy, jako jsou bolesti břicha, zvracení, nevolnost, akutní průjem a intenzivní žízeň. Toto stadium je následováno vymizením příznaků, ale třetí den nastoupí obrovské poškození jater, koma,smrt.  Tyto toxiny produkují např. Amanita phaloides, Amanita virosa. I další druhy hub produkují tento druh toxinů –druhy r. Lepiota a Galerina unicolor.

Amanita virosa, Muchomůrka jízlivá

Amanita phalloides, Muchomůrka zelená

GYROMITRIN HEPATONEFROTOXICKÝ SYNDROM  Monomethylhydrazin je produkován hydrolýzou gyromitrinu, který je nacházen v houbách r. Gyromitra (ucháč).  Přeměna je závislá na pH hodnotě a je určována kyselostí žaludku.  Jed je nestabilní teplotně a jde ho odstranit vařením a následným vymytím ve vodě.  První symptomy jsou bolesti břicha a objevují se 6 hodin po požití, jsou následovány napadením jater a ledvin.  Monomethylhydrazin je také toxin centrální nervové soustavy a je to toxin charakterizovaný vysokou horečkou.  Tento toxin je obsažen v druhu Gyromitra esculenta – ucháč obecný.

Gyromitra esculenta – ucháč obecný

ORELANINY NEFROTOXICKÝ SYNDROM  Orelaniny je název pro skupinu látek - orellaniny, grzymalin, kortinarin a dva benzoniny.  Všechny tyto látky jsou termostabilní a odolávají vysušení.  Je zde charakteristické zpoždění v nástupu symptomů po požití hub. První symptomy jsou bolení břicha, následováno bolestí svalů, bolestí zad a bolestmi hlavy. K selhání ledvin dochází do 7-17 dnů od požití.  Většina těchto otrav je způsobena požitím pavučinců – r. Cortinarius.

Cortinarius orellanoides Pavučinec plyšový

HAEMOLYTICKÉ OTRAVY  Haemolytické toxiny ničí červené krvinky a tak způsobují anémii. Hemolytické toxiny jsou teplotně labilní a jsou ničeny vařením. Jsou produkovány druhem Amanita rubescens a Amanita vaginata, Lepista nuda

Amanita vaginata – muchomůrka pošvatá

Amanita rubescens muchomůrka růžovka

Čirůvka fialová – Lepista nuda

KOPRINOVÉ TOXINY

ANTABUSOVÝ SYNDROM

 Některé druhy r. Coprinus jsou jedlé a chutné a mohou způsobovat toxické symptomy, pokud jsou konzumované s alkoholem.  Symptomy zahrnují kovovou příchuť v ústech, zčervenání obličeje a krku, pálení na hrudi, nevolnost, zvracení a průjmy. Tyto symptomy trvají asi 2 hod ale mohou se vracet, pokud je alkohol konzumován v následujících 48 hodinách.  Toxická látka se jmenuje koprin a je nacházena v druhu Coprinus atramentarius a Pholiota squarrosa.

Coprinus atramentarius Hnojník inkoustový

Pholiota squarrosa – šupinovka kostrbatá

PSYCHOTROPNÍ TOXINY HALUCINOGENNÍ SYNDROM  Tyto toxiny napadají centrální nervový systém a způsobují halucinace a delirium. Muscimol, ibotenová kyselina a muscazon  Muscimol je nejúčinnější z nich. Tyto toxiny jsou omezeny na druhy r. Amanita (Amanita muscaria, Amanita pantherina). Příznaky zahrnují ospalost a někdy i koma.

Amanita muscaria – muchomůrka červená

Amanita pantherina – muchomůrka tygrovaná

INDOLOVÁ SKUPINA TOXINŮ PSILOCIN A PSILOCYBIN  Tyto toxiny obsahují houby, označované jako rekreační drogy. - Psilocybe semilanceata, Psilocybe cubensis a druhy r. Panaeolus.

Psilocybe semilanceata Lysohlávka kopinatá

Tato houba se stala velmi oblíbeným druhem psilocybinových hub pro indoor pěstování. Její kultivace je totiž poměrně nenáročná, snadnější i než pěstování žampionů a je možné ji pěstovat i podomácku.

Psilocybe cubensis- Lysohlávka kubánská

Panaeolus subbalteatus Kropenatec lemovaný

HORDENIN, N-METHYLTYRAMIN A TYRAMIN  Některé houby skupiny polyporales obsahují tyto alkaloidy, které způsobují nevolnost a symptomy spojené s účinkem na centrální nervový systém jako závratě.  Tyto toxiny se nacházejí např. v druhy Laetiporus sulphureus a Meripilus giganteus.

Laetiporus sulphureus – sírovec žlutooranžový

Vějířovec obrovský - Meripilus giganteus

MUSKARINOVÉ TOXINY MUSKARINOVÝ SYNDROM  Alkaloid muskarin způsobuje pocení asi do 2 hodin po požití, spolu s nevolností a průjmy. Rozmazané vidění se také vyskytuje. Podává se protilátka atropin.  Tyto toxiny jsou nacházeny v druzích Amanita muscaria, Amanita pantherina, Clitocybe dealbata a druzích r. Inocybe.

Clitocybe dealbata - strmělka odbarvená

Vláknice Patouillardova, Inocybe patouillardii

AFLATOXINY Aflatoxiny jsou mykotoxiny produkované toxigenními kmeny Aspergillus flavus (asi 35 % kmenů produkuje aflatoxiny řady B), A. parasiticus (téměř 100 % kmenů je schopno produkovat aflatoxiny řady B i G), A. argeninicus a A. nomius Aflatoxiny mohou být akutně toxické, kancerogenní, mutagenní a teratogenní Při vysokých hladinách se toxicita projeví za 3-6 hodin jako nekróza hepatocytů, poškození srážlivosti a kapilární fragilitou. To může vést k širokým hemoragiím a případné smrti , zevně příznaky otravy doprovázené poškozením jater a žloutenkou

Aspergillus flavus

FUMONISINY  Skupina toxických metabolitů produkovaná primárně druhy Fusarium verticilloides, F. proliferatum a dalšími příbuznými druhy, které napadají kukuřici.  Fumonisin B 1 – je primární hepatotoxin a karcinogen. Potvrzena role fumonisinu FmB1 v etiologii rakoviny jícnu v oblastech jižní Afriky, Číny, kde je častá kontaminace obilí.

 ZEARALENONY Důležitými mykotoxiny druhů rodu Fusarium  Způsobují syndromy hyperestrogenismu u vepřů, hovězího dobytka a drůbeže.

Fusarium verticilloides (syn. F. moniliforme)

TRICHOTECENY (TCTCs)  Produkovány častými kontaminátory kukuřice, pšenice, ječmene rýžehlavně rod Fusarium, dále rody Myrothecium, Trichoderma, Trichothecium, Cephalosporium, Stachybotrys.  Jejich toxický účinek zahrnuje mnoho orgánů – trávicí, vylučovací, nervovou, cévní soustavu, ovlivňuje imunitu Trichotheceny jsou velmi odolné vůči inaktivaci, proces zpracování obilí je neúčinný  Nejznámějším TCTC je deoxynivalenol (DON) – produkován Fusarium graminearum a F. culmorum. Způsobuje anorexii a zvracení.

Trichothecium

STERIGMATOCYSTIN Hepatotoxický a karcinogenní mykotoxin produkovaný druhy Aspergillus flavus, A. nidulans , A. nomius, A. parasiticus, A. versicolora, Penicillium luteum. Nachází se v rýži, kukuřici, ječmenu, ale i kávových zrnech a sýrech. Rody Aspergillus a Penicillium produkují mnoho dalších toxinů – gliotoxin, nitropropionová kyselina, patulin, ochratoxin, penicilinová kyselina, citrinin, cyklopiazonová kyselina, rubratoxiny

DALŠÍ ZPŮSOBY VYUŽITÍ HUB V LÉKAŘSTVÍ TRANSFORMACE STEROIDŮ HOUBAMI  Ve 40-tých letech minulého století bylo zjištěno, že kortikosteroid kortizon a adenokortikotrofní hormon (ACTH) mohou být využity pro svůj velký účinek na ošetření některých lidských revmatických artritid.  Z praktického hlediska nejdůležitější transformace steroidů je syntéza ADRENOKORTIKOIDNÍCH HORMONŮ.  Příklady hub, které jsou schopny transformace sterolů: Rhizopus arrhizus, Fusarium solani, Curvularia lunata, Aspergillus flavus, Penicillium lilacinum.

Curvularia lunata

BIOTRANSFORMACE DALŠÍCH FARMAKOLOGICKY AKTIVNÍCH LÁTEK  Nejen steroidy lze pomocí hub transformovat na jiné produkty, ale i další látky  Příklady takovýchto transformací: Protirakovinná látek jako např. akronin z r. Vinca může být transformována za pomocí houby Aspergillus na mémě toxické, ale stále aktivní deriváty.  Použití hub k těmto účelům přináší ekonomicky významné látky, které by bylo buď náročné nebo velmi nákladné produkovat chemicky

LÉKAŘSKÉ APLIKACE HOUBOVÝCH ENZYMŮ  Příklady využití enzymů z hub v lékařství: Lipázy produkované druhem Aspergillus oryzae a Candida lipolytica jsou používány ke kompenzacím deficiencí lidských pankreatických lipáz  Houbové laktázy se přidávají k mléku, aby tam proběhla reakce, která snižuje intoleranci k mléku.  Lidé, kterým chybí enzym β-galaktozidáza také potřebují tento enzym (produkovaný houbami) dostávat.  Urát-oxidáza, produkována houbou Aspergillus flavus je používá k léčení dny.

ROZMANITÉ VYUŽITÍ HUB V LÉKAŘSTVÍ  Hydrolyzované a očištěné levany produkované r. Aspergillus a kvasinkami jsou používány jako náhrada krevní plasmy.  Nejnovější patenty dokonce popisují použití mycelia hub jako záplaty na rány (Mucor mucedo a Rhizomucor meihei)  Kvasinky produkují malé množství selenomethioninu, který je používán pro radioizotopové skenování pankreasu.  Antibiotikum (toxin) patulin, které je produkováno Penicillium patulum má antispasmotickou aktivitu, a může blokovat kontrakce kolonu.  Griseofulvin izolovaný z P. griseofulvum může pomáhat pacientům s anginou pektoris Pythium oligandrum – léčení dermatomykoz

CHYTRÁ HOUBA  Houbový organizmus Pythium oligandrum proniká svými vlákny do buněk parazita (plísně nebo kvasinky) a čerpá z něho pro svoji výživu potřebné látky. Na podkladě výživové a prostorové kompetice tak vytlačuje z prostorů patogenní kožní houby. Podstatou účinnosti přípravku je produkce enzymů a parazitování na plísňových chorobách.  Po splnění tohoto úkolu ( vyčerpání parazita) mizí z této lokality ( lidské tělo není pro něho přirozené prostředí a není schopen se v tomto prostředí adaptovat) a uvolňuje prostor pro znovuosídlení tzv. normální mikroflórou.  Velmi dobře působí i na neduhy, které nejsou vyvolány houbami jako například lupenka, atopický ekzém, nebo živé rány diabetiků, kde působí převážně enzymatickou formou.

http://www.biotox.cz/toxikon/mikromycety/namel.php