9. Előadás Fehérjék
Előzmények
Peptidkémia
1901 E.Fischer : Gly-Gly
1932 Bergman és Zervas : Benziloxikarbonil csoport
Analitikai kémia 1923 F. Pregl : Mikroanalitika Kromatográfia
Protein kémia
1952 Stein and Moore : Aminosav analizis 1954 P. Edman : Protein szekvenálás
Elektroforézis 1963 B. Merrifield : Szilárd fázisú peptid szintézis 1988 Á. Furka : Kombinatorkus peptid szintézis
Röntgen (X-ray) krisztallográfia NMR Tömeg spektroszkópia
1955 F. Sanger : Az inzulin priemr szerkezete 1962 M.F. Perutz és J. C. Kendrew A myoglobin térszerkezete
A peptid kötés: amid kötés (E.Fischer, 1902)
N-terminális
C-terminális
Dipeptid: 2 Oligopeptid : 2-15 Polipeptid: >15
Kötéstípusok a fehérjékben Kovalens
Amid Diszulfid
- CO – NH -S–S-
Nem kovalens Hidrofób, Van der Waals
H-híd (inter és intra)
ionos
Fehérjék szerkezetének meghatározása
1. Tisztítás – homogén minta előállítása 2. Aminosavsorrend (primer szerkezet) meghatározása - aminosavösszetétel - aminosavsorrend - N-terminális aminosav - C-terminális aminosav 3. Térszerkezet (3D) meghatározása - szekunder (másodlagos) - tercier (harmadlagos, szupermásodlagos) - quaterner (negyedleges)
1. Fehérje izolálás – gélelektroforézis (egy- és kétdimenziós)
Salmonella thyphimurium SDS-PAGE, 200 µg protein, 3,5 x 0,8 cm
14C
Autoradigram, 2D, E. Coli proteinek, 10 µg, jelzett aminosav a táptalajban, 2,3 x 1,3 cm, exp. 825 h
Gélelektroforézis
Egydimenziós gélelektroforézis (méret szerint)
HeLa sejtmag fehérjék Swiss-Prot
Fehérjék kimutatása, mennyiségi meghatározása a) Amino csoport kimutatás b) Biuret próba Reagens: CuSO4/NaOH λ = 540-550 nm
c) Lowry-Hartree Reagens: biuret + 3 H2OxP2O5x13 WO2x5 MoO3 10 H2O, Folin-Ciocalteu-fenol λ = 720-750 nm
d) BCA (bicinoninic acid, Reagens: biuret + BCA
λ = 562 nm
e) Bradford reagens (trifenil-metion)
λ = 595 nm
2. Primer szerkezet 1. Diszulfid-híd felbontása
2.1. Aminosav összetétel meghatározása 2.1.1. Hidrolizis
O
O H2O / 6M HCl
NH2-CH2- C
105
oC
NH2-CH2- C
NH-CH-COOH Gly-Ala
CH3
glicin
+
NH-CH-COOH
OH
CH3 alanin
2.1.2. Elválasztás, származékképzés
Ioncserés kromatográfia, Rockefeller Intézet, 1950 Gyanta: vízben nem oldódó polimer SO3- csoportokkal Detektálás: ninhidrin reakció , λ = 570 nm
2.1.3.1. Származékképzés és elválasztás Származékképzés: o-ftálaldehid Elválasztás:HPLC, Detektálás: λg = 360 nm λe = 455 nm
Hunkapiller et al. Science, 1984
2.1.3.2. Származékképzés D/L-aminosav meghatározására NO2 NH
* CH
CONH2
CH3
+
O 2N
H2N
*
CH
COOH
Q
F
1-fluor-2,4-dinitrofenil5-L-Ala-amid (FDAA)
(D,L) pH 9,0; 10 perc
NO2 NH
*
CH
NO2 CONH2
NH
CH3
CH3 O 2N
*
NH CH
O 2N
*
NH CH
COOH
COOH
Q
Q
D,L-származék
*
CH
L,L-származék
HPLC elválasztás
CONH2
2. 2. Aminosav sorrend meghatározása 2.2.1. N-terminális 2.2.1.1. Sanger reakció, 1958, inzulin
NO 2 2
NO2
F
+ H2N
4
CH
CO -
NaHCO3
R
R
O 2N
NH C H
CO -
+ HF
O 2N
1-fluor-2,4-dinitro benzol NO 2
NO 2 NH CH
CO -
6 M HCl
NH CH R
R O2N
2,4-dinitrofenil fehérje
COOH
+ aminosavak
O 2N
2,4-dinitrofenil aminosav λ=254 nm
2.2.1.2. 1-dimetilamino-naftalin-5-szulfonil klorid (Dansyl-klorid, Hartley, 1963) H3C
N
CH3
+ O
S
NH2-L-K-A-D-P-N-R-F-G-A-D-L-COOH
O
Cl
H3C
N
CH3
bázis pH 7,5-8,0
+HCl O S O NH-L-K-A-D-P-N-R-F-G-A-D-L-COOH
H3C
N
CH3
6 M HCl hidrolizis
O S O NH-Leu-COOH
(Dansyl-aminosav)
+
K, A, D, P, N, R, F, G-COOH λ g=360 nm λ e=480 nm
2.2.2. C-terminális NH2-L-K-A-D-P-N-R-F-G-A-D-L-COOH
+
H2N - NH2 90o C 20 -100 óra
+NH
3
-L – CO -NH-NH2,
+NH
K-CO-NH-NH2.....+NH3-L-COO-
3-
2.3. Edman lebontás (P. Edman, Lund, 1950)
1. lépés: Reakció fenilizotiocianáttal (addició) 2. lépés: Hidrolizis 3. lépés: A feniltiohidantoin származék azonosítása
1. lépés: Reakció fenilizotiocianáttal N=C=S
+
NH2 - CH – CO -.....
pH 8-9, 40 oC R S II NH - C - NH - CH – CO -..... 2. lépés: Hidrolizis (H+/TFA)
R
anilinotiozolinon származék
fenilhidantoin (PTH) aminosav
feniltiocarbamil származék
3. lépés: A feniltiohidantoin származék azonosítása
2.4. Fehérjék feldarabolása 2.4.1. Kémiai hasítás 2.4.1.1. Reakció brómciánnal (BrCN),
+ H2O, H+
Met -
NH2-CH-COOH (CH2)2 OH
homoszerin
2.4.1.2. Reakció hidroxilaminnal (NH2 - OH) Asp - Gly 2.4.1.3. Reakció 2-nitro-4-tiociano - benzoesav - Cys
O2N HOOC
N=C=S
2.4.2. Enzimatikus hasítás Terminológia (Schechter, Berger) -S4 – S3 – S2 – S1 – S1’ – S2’ - S3’ – S4’ – enzim - P4 –P3 – P2 – P1 – P1’ – P2’ - P3’ – P4’ – szubsztrát
- P4 –P3 – P2 – P1 – OH + H- P1’ – P2’ - P3’ – P4’ – Szerin proteázok: tripszin (Arg, Lys) P1, trombin, kimotripszin (Tyr, Trp, Phe) P1, elasztáz, kallikrein.. Cisztein proteáz: papain, actinidin... Karboxil proteáz: pepszin, katepszin D (lizoszoma), LysC (Lys) P1, GluC (Glu, Asp)... Aminoproteáz: AspN (Asp)P1..... Metalloproteáz: temolizin, karboxipeptidáz A...
Primer szerkezet, aminosavsorrend - összegzés
Szerkezeti hierarchia
Az amid kötés
Delokalizáció, 2 e, 3 atom - Gyenge N bázis - Erős H-híd - Részleges kettős kötés - Síkalkat - Cisz/transz izoméria
Nomenklatúra
A Ramachandran térkép - bevezetés
A Ramachandran térkép
Másodlagos szerkezet típusai
A Ramachandran térkép - összefoglalás
Konformerek energiatartalma Források :
kötéshossz (Ed) – változatlan vegyértékszög (Eo) – változatlan torziós szög (Eω) - változik
Nem kötött atomok távolsága (Ew) Kötő elektronpárok kölcsönhatása (Eh) Elektrosztatikus kölcsönhatás (
∆E = ∆Ed + ∆Eo + ∆Eω + ∆Ew + ∆Eh + ∆Ee Példa: Fehérje 100 aminosavból a) ha: 10 konformáció/as lehetséges akkor: 10100 konformer
b) ha: 2 konformáció/as lehetséges akkor: 1030 konformer
Szupermásodlagos szerkezetek
Görög kulcs
Béta kígyó Csoportosítás Alfa (α)
csak alfa hélix
Béta (β)
csak béta réteg
Alfa + béta ( α + β) hélix és réteg egymástól távol Alfa/béta (α/β) hélix és réteg egymással kölcsönhatásban
Negyedleges szerkezet - a kollagén
A protemika alapjai
Eredet (taxonomia)
Fehérje expresszió 1. Fehérje-expresszió Lizis
Sejtlizátum -nukleinsavak -fehérjék -lipidek -szénhidrátok ........
Primer szerkezet - aminosavsorrend
E lv ála sz tá s - elekroforézis - kromatográfia - UC
Izolált fehérje
Szerkezetvizsgálat - kémiai, enzimatikus lebontás - MS - bioinformatika
Annotáció
Primer szerkezet -alegységek -poszt-transzlációsmodosulások
Funkció(k) -Ca2+ kötés -Znfinger -ATPkötés
Térszerkezet
Lokalizáció
Rokonság más fehérjével
Asszociáció betegséggel
A protemika alapjai Eredet (taxonómia)
Fehérje expresszió lizis
Sejtlizátum -nukleinsavak -fehérjék -lipidek -.....
Elválasztás (elektroforézis, UC...)
Izolált fehérje
Szerkezetvizsgálat (kémiai lebontás, MS..
Primer szerkezet (aminosavsorrend) Annotáció Alegységek Poszt-transzlációs
Térszerkezet
Lokalizáció
Funkciók: fémion Kötődés, ATP kötés
Rokonság más fehérjékhez
Asszociáció betegséggel
Fehérje bioszintézise
Nem fehérje alkotó természetes aminosavak
A) H 2N
CH
COOH
C H2
H 2N
C H2
- CO2 Glu dekarboxiláz
C H2
C H2
C H2
HOOC
γ-aminovajsav (GABA)
HOOC
Glu
Lys/Met
+ C-vitamin (máj)
C H3 + N C H2
H 3C
C H3 C H O H C H2
Karnitin •Zsiranyagcsere •Mitokondrium transzport •Sejtpermeabilitás
HOOC
Állat, ember + Növény -
B)
β
α
H2N CH2
CH2 COOH
béta-alanin C H3 HO
C H2
C
CH
H 3C
OH
CO
pantoténsav
NH C H2
C H 2 COOH
C) H 2N
CH
COOH
C H2
H 2N
SH
1. – CO2 2. oxidáció
cisztein
(máj, B6)
C H2
Állat Ember Növény
C H2 SO 3 H
taurin
+ -
•epesav alkotórész •neurotranszmitter •vérlemezke migrén?
D) H 2N
CH
COOH
(CH 2 ) 3 HN
C
NH2
argináz +H2O
NH
H 2N
CH
COOH
(CH 2 ) 3
+
NH2
H 2N
C
NH2
O
ornitin
arginin
H 2N
karbamid (urea) +NH3, + CO2 CH
COOH
(CH 2 ) 3
•urea ciklus (máj) •hagyma, fokhagyma •detoxifikáció
HN
C
NH 2
O
citrulin (citrullus lat görögdinye)
E) C H3 HN
C H 2 COOH
szarkozin (izom)
H2N-CN C H3 H 2N
C
N
C H 2 COOH
NH
kreatin . H2O (N-metil-guanidino-ecetsav) op: 303 oC • izom • H2PO4-NH -
(kreatin-foszfát)
