Epidemiologie polyomavirových infekcí Vojtěch Šroller
VA
T
Oddělení imunologie, Ústav hematologie a krevní transfuze, Praha 2, U Nemocnice 1
N
EK
O
PÍ
R
O
[email protected]
Odborný konzultační den, HPV a HPyV, Charvátův sál, 9. června 2015
Historie - polyomaviry 1953 Ludwig Gross- myší polyomavirus - agens způsobující nádor slinných žláz u myší, různé typy nádorů u novorozených myší
•
1960 Bernice E. Eddy- opičí polyomavirus SV40 buněčná linie makaka rhesuse použitá pro přípravu inaktivované poliovakcíny obsahuje agens způsobující nádory u křečků
VA
O
R
Historické označení Papovaviridae – králičí papillomavirus, myší polyomavirus, vakuolizující virus (= SV40) - dnes polyomaviry a papillomaviry
O
PÍ
•
T
•
1971 – objeveny lidské polyomaviry JCV a BKV
•
2008 – Lidský polyomavirus Merkelových buněk (MCPyV) – objeven v kožním karcinomu z Merkelových buněk
N
EK
•
VA
• neobalené viry s ikosahedrální kapsidou ~45nm (příbuzné papillomavirům)
T
Polyomaviry - virion
O
• celosvětově rozšířené, promořenost populace vysoká
PÍ
R
• přenos fekálně-orální cestou, respiračně
O
• primární infekce bezpříznaková, celoživotní persistentní infekce
N
EK
• oportunní patogeny, reaktivace viru během immunosuprese
Polyomaviry - genom ori
• genom tvoří kruhová dvojřetězcová DNA
Small t
T
5000
VA
• replikační počátek, oblast regulace transkripce
PÍ
R
O
• geny pro časné nestrukturální proteiny (T-ag, t-ag, 57kT) (t = tumor antigen) regulace buněčného cyklu, replikace virové DNA
O
• 3 kapsidové proteiny (VP1,VP2,VP3)
N
EK
• mikroRNA – autoregulace transkripce
Large T
VP2
1000
4000
KIV-Stockholm 60 5040 bps
3000
2000
VP1
VP3
Životní cyklus polyomavirů
T
• tkáňová specifita dána interakcí virových a buněčných faktorů
EK
O R PÍ
O
• transkripce časná (T-ag), replikace virové DNA (T-ag a buněčná DNA polymeráza) spolu s transkripcí genů pro virové strukturní proteiny (VP1, 2, 3), tvorba kapsid
VA
• Vazba na receptory, endocytoza, transport virové kapsidy do jádra, uvolnění DNA
N
• lyze buňky, uvolnění virionů z jádra
• viremická fáze, silná imunitní odpověď, latentní infekce Převzato z Fishman (2002).
Polyomaviry a nádory
T
• Virové T-antigeny - onkogeny
VA
• v infikované buňce interakce s p53 a pRB, vstup do S-fáze a inhibice apoptozy
PÍ
R
O
• deregulace buněčného cyklu, transformace a imortalizace infikovaných buněk v kultuře
O
• Schopnost polyomavirů vyvolat nádory u laboratorních zvířat – myši , křečci
N
EK
• 2008 – první lidský nádorový polyomavirus MCPyV – polyomavirus karcinomu z Merkelových buněk • Zkoumá se úloha dalších lidských polyomavirů při vzniku nádorů
N
EK
O
PÍ
R
O
VA
T
Polyomaviry - taxonomie
Van Gheule, Rev.Med.Virol 2012
Polyomaviry – rozšíření
N
EK
O
R
PÍ
• lidských polyomavirů známe 13
O
VA
• mezi jednotlivými druhy jsou nepřenosné; jejich vývoj pravděpodobně probíhal společně s jejich hostitelskými druhy, evolučně velmi staré viry
T
• Polyomaviry infikují savce a ptáky, ale i ryby
Lidské polyomaviry rok
poprvé nalezen
JCV
1971
mozková tkáň, progresivní multifokální encefalopatie (PML), pacient s Hodgkinovým lymfomem
BKV
1971
moč, imunosuprimovaný pacient po tranplantaci ledviny
KIV
2007
respirační sekret, dítě, respirační problémy
WUV
2007
respirační sekret, dítě, respirační problémy
MCPyV
2008
karcinom z Merkelových buněk
HPyV6
2010
kůže
HPyV7
2010
kůže
TSPyV
2010
kožní výrůstky Trichodysplasia spinulosa, pacient po transplantaci srdce
HPyV9
2011
MWPyV
2012
EK
O
PÍ
R
O
VA
T
virus
N
sérum, pacient po tranplantaci ledviny stolice, kožní výrůstky WHIM (Warts Hypogammaglobulinemia, Infections and Myelokathexis syndrome
STLPyV
2013
stolice, dítě
HPyV12
2013
játra
NJPyV
2014
Endoteliální buňky, nekrotická místa, pacient po transplantaci slinivky
Lidské polyomaviry - BK BKPyV
T
• Seroprevalence 80-90 %
VA
• přenos orálně/respiračně v dětství, bezpříznaková infekce
O
• Persistence v epiteliálních buňkách ledvin a močových cest, vylučován močí (5%)
O
PÍ
R
• Reaktivace u immunodeficientů: Polyomavirová nefropatie u příjemců Tx ledviny (1-10%, rejekce štěpu 15-50%) Hemoragická cystitida u příjemců HSCT (cidofovir)
EK
• Existence až 5 serotypů (Ib1, Ib2, II, III, IV), odlišitelné neutralizačním testem
N
• Diagnostika- Q-PCR v krvi, moči, ISH v biopsiích (PVN)
Polyomavirus JC JCPyV
VA
T
• Seroprevalence 50-80%
O
• Persistence v epiteliálních buňkách ledvin a v B lymfocytech, vylučován močí (20%)
PÍ
• Reaktivace u immunodeficientů:
R
• Geografické varianty, 14 genotypů (Evropa 1-4)
EK
O
invaze do CNS, produktivní infekce oligodendrocytů , abortivní infekce astrocytů, přestavby - regulační oblast virového genomu, gen pro kapsidu
N
Progresivní multifokální leukoencefalopatie (PML) - AIDS, transplantovaní, imunosupresivní terapie při léčbě roztroušené sklerózy (RS) – natalizumab • Diagnostika- Q-PCR v krvi, mozkomíšním moku
Polyomavirus MCPyV • Seroprevalence 50-90%
T
• Součást kožní mikroflory, běžně na povrchu kůže zdravých jedinců (DNA)
VA
• Karcinom z Merkelových buněk (MCC) – MCPyV etiologickým agens u 80%
R
O
virus se masivně pomnoží, integrace do buněčného genomu, charakteristická mutace v genu pro velký T-antigen, ztratí schopnost replikovat DNA
O
PÍ
• Diagnostika- Q-PCR
EK
Karcinom z Merkelových buněk (MCC) vzácný, maligní kožní nádor kůže, incidence 0.2-0.5/100 000/rok
•
Rizikové faktory jsou světlá pokožka, věk, UV záření, imunosuprese (AIDS, CLL, 3-30x vyšší riziko)
N
•
MCC
Další lidské kožní polyomaviry HPyV6, HPyV7 a TSPyV
T
• Seroprevalence HPyV6 70-90% HPyV7 35-65% TSPyV 70-80%
VA
• Na kůži, nízká prevalence
N
EK
O
PÍ
• TSPyV – vzácné kožní onemocnění u pacientů po tranplantaci srdce (trichodysplasia spinulosa, TS)
R
O
• HPyV6 – může přispívat ke vzniku proliferační chorby kůže u osob léčených BRAF inhibitory (?) • HPyV7 - kožní vyrážky u pacientů po transplantaci plic (?)
TS
VA
T
Polyomaviry WU a KI
O
• Seroprevalence KIPyV 55-90% WUPyV 69-98%
PÍ
R
• Nalezeny v nasopharyngeálním aspirátu dětí s repirační infekcí
N
EK
O
• V respirační traktu prevalence 0.5 – 7%, patogenze není známa
EK
O
VA
PÍ
• Patologie není známá
N
O
20-50% 75 % 68-70% 23-33% 20%
R
• Seroprevalence HPyV9 MwPyV STLPyV HPyV12 NJPyV
T
Lidské polyomaviry HPyV9, MwPyV, STLPyV, HPyV12 a NJPyV
Seroprevalence MCPyV, JCPyV a BKPyV podle věku Itálie pacienti-různí (947)
VA
T
ČR zdravé osoby (991) 100
O
90
R
80
PÍ
60
MCPyV
50
JCV
O
40
20 10 0 6-9
10-19
20-29
30-39
EK
30
BKV
40-49
50-59
>59
N
Seroprevalence (%)
70
Age group (years)
Viscidi RP, et al. Clin Vaccine Immunol. 2011
BKV 6
Hladiny protilátek proti PyV podle věku
5
T
3
VA
OD index
4
2
O
1
R
0
5 4
N
OD index
6
3
7 6 5 4 3
2
2
1 0
8
OD index
EK
7
>59
JCV
O
8
10-19 20-29 30-39 40-49 50-59 Age group (years)
PÍ
MCPyV
6-9
1 6-9
10-19 20-29 30-39 40-49 50-59 Age groups (years)
>59
0
6-9
10-19
20-29
30-39
40-49
Age groups (years)
50-59
>59
Polyomaviry SV40 a LPV • Opičí viry – SV40, makak rhesus, LPV, kočkodan
VA
T
• SV40, onkogenní u hlodavců, kontaminanta injekční polio vakcíny v 50. -60. letech 20. století • SV40 DNA nalezena v některých lidských nádorech (90. léta 20. století)
N
EK
O
PÍ
R
O
• LPV - protilátky nalézány u 20% lidí od 80.let 20. století • Možná křížová reaktivita s velmi podobným HPyV9, objeven 2011
O
PÍ
R
O
VA
T N
EK
Martina Saláková Viera Ludvíková Eva Hamšíková Šárka Němečková Jan Musil Ruth Tachezy
N
EK
O
PÍ
R
O
VA
T
Polyomaviry SV40 a LPV
Polyomaviry BK a JC BK
R
O
VA
Reaktivace u immunodeficientů: • Polyomavirová nefropatie u příjemců Tx ledviny • Hemoragická cystitida u příjemců HSCT • Existence více (2 ?) serotypů
T
• Persistence v epiteliálních buňkách ledvin a močových cest, vylučován močí (5%)
PÍ
Diagnostika- Q-PCR v krvi, moči, ISH v biopsiích (PVN)
O
JC
EK
• Persistence v epiteliálních buňkách ledvin a v B lymfocytech, vylučován močí (20%)
N
Reaktivace u immunodeficientů: • invaze do CNS, produktivní infekce oligodendrocytů a abortivní infekce astrocytů • Progresivní multifokální leukoencefalopatie, AIDS, transplantovaní, imunosuprimovaní, natalizumab při léčbě MS Diagnostika- Q-PCR v krvi, mozkomíšním moku
Polyomaviry BK a JC BK
R
O
VA
Reaktivace u immunodeficientů: • Polyomavirová nefropatie u příjemců Tx ledviny • Hemoragická cystitida u příjemců HSCT • Existence více (2 ?) serotypů
T
• Persistence v epiteliálních buňkách ledvin a močových cest, vylučován močí (5%)
PÍ
Diagnostika- Q-PCR v krvi, moči, ISH v biopsiích (PVN)
O
JC
EK
• Persistence v epiteliálních buňkách ledvin a v B lymfocytech, vylučován močí (20%)
N
Reaktivace u immunodeficientů: • invaze do CNS, produktivní infekce oligodendrocytů a abortivní infekce astrocytů • Progresivní multifokální leukoencefalopatie, AIDS, transplantovaní, imunosuprimovaní, natalizumab při léčbě MS Diagnostika- Q-PCR v krvi, mozkomíšním moku
Polyomaviry BK a JC BK
R
O
VA
Reaktivace u immunodeficientů: • Polyomavirová nefropatie u příjemců Tx ledviny • Hemoragická cystitida u příjemců HSCT • Existence více (2 ?) serotypů
T
• Persistence v epiteliálních buňkách ledvin a močových cest, vylučován močí (5%)
PÍ
Diagnostika- Q-PCR v krvi, moči, ISH v biopsiích (PVN)
O
JC
EK
• Persistence v epiteliálních buňkách ledvin a v B lymfocytech, vylučován močí (20%)
N
Reaktivace u immunodeficientů: • invaze do CNS, produktivní infekce oligodendrocytů a abortivní infekce astrocytů • Progresivní multifokální leukoencefalopatie, AIDS, transplantovaní, imunosuprimovaní, natalizumab při léčbě MS Diagnostika- Q-PCR v krvi, mozkomíšním moku
T
Cíle práce
PÍ
R
O
VA
1. Stanovení protilátkové odpovědi proti polyomavirům u naší zdravé populace
N
EK
O
2. Získání informace o výskytu DNA polyomavirů
Detekce protilátek proti virové kapsidě MCPyV JCV a BKV v lidském séru
T
• Protilátky jsou měřeny metodou ELISA
VA
• Antigen – prázdné kapsidy (VLP) složené z proteinu VP1 MCPyV, BKV nebo JCV připravené v bakulovirovém expresním systému bac-to-bac (Invitrogen)
R
O
• HPyV6 a HPyV7 VP1, kromě VLP také příprava antigenu v E.coli (GST fúzní protein)
N
EK
O
PÍ
• Pozitivní kontrola – séra z myší imunizovaných hotovými VLP nebo DNA vakcínou (Gene gun) exprimující příslušný VP1 protein (rychlejší)
N
EK
O
PÍ
R
O
VA
T
Bac-to-Bac Baculovirus Expression System (Invitrogen)
Kapsidový protein VP1 na elfo a EM VLP
T
MCPyV BKV JCV MuPyV
O
BKV ~45 nm
N
EK
O
PÍ
R
MCPyV ~45 nm
VA
50 kDa
HPV 16 ~55 nm
anti-JCV+
68,7 %
56,6 %
72,9 %
47,7 %
62,3 %
70 %
55,4 %
64,2 %
67,1%
58 %
anti-MCPyV+
všichni
991
63,4 %
děti 6-9 roků
107
58,9 %
ženy
496
muži
495
EK
O
PÍ
R
O
N
VA
anti-BKV+
sub populace
N
T
Prevalence anti-VP1 PyV u populace ČR
Seroprevalence MCPyV, JCV a BKV podle věku Itálie pacienti-různí (947)
VA
T
ČR zdravé osoby (991) 100
O
90
R
80
PÍ
60
MCPyV
50
JCV
O
40
20 10 0 6-9
10-19
20-29
30-39
EK
30
BKV
40-49
50-59
>59
N
Seroprevalence (%)
70
Age group (years)
Viscidi RP, et al. Clin Vaccine Immunol. 2011
BKV 6
Hladiny protilátek proti PyV podle věku
5
T
3
VA
OD index
4
2
O
1
R
0
5 4
N
OD index
6
3
7 6 5 4 3
2
2
1 0
8
OD index
EK
7
>59
JCV
O
8
10-19 20-29 30-39 40-49 50-59 Age group (years)
PÍ
MCPyV
6-9
1 6-9
10-19 20-29 30-39 40-49 50-59 Age groups (years)
>59
0
6-9
10-19
20-29
30-39
40-49
Age groups (years)
50-59
>59
Existuje křížová reaktivita protilátek proti VP1 MCPyV, JCV a BKV v lidském séru?
T
5
VA
3
O
r2=0.029
2
R
BKV OD index
4
0
2
4
O
0
PÍ
1
6
MCPyV OD index
EK
50 vzorků séra, věk 30-39 let
N
Korelační test
BKV X MCPyV JCV X MCPyV JCV X BKV
r2 =0,029 r2 = 0,010 r2 = 0
8
86
77 (90%)
O
O
N
Všichni
53 (62%)
193 (88%)
148 (67%)
306
270 (88%)
201 (66%)
220
EK
Muži
HPyV7
VA
HPyV6
PÍ
Ženy
N
R
Dárci
T
Prevalence anti-VP1 HPyV6 a HPyV7 u dárců (skupina z r. 2010)
Metody - Detekce MCPyV DNA v lidských tkáních ve stěru a výplachu
T
• DNA ekvivalentní 30,000 buněk z
PÍ
(buněčný gen) v real-time PCR (TaqMan proba a primery) byly dále testovány
R
• Vzorky pozitivní na RNAsuP
O
VA
tkáně nebo 5 ul DNA z kožního stěru
N
EK
O
• TaqMan proba a primery pro realtime PCR (Q-PCR) v oblasti v Tantigenů (LT3) a kapsidového proteinu VP1 (Toracchio et al., 2010) .
VP1
LT3
MCV DNA+
HPyV6 DNA+
HPyV7 DNA+
25
72%
4%
8%
25
40%
0%
0%
Kožní stěr
14
43%
0%
0%
Orální výplach
10
20%
0%
0%
R
O
Zdraví dobrovolníci Kožní stěr
T
Počet osob
VA
Materiál
Populace
PÍ
Prevalence HPyV-DNA u zdravých dobrovolníků
N
Immunosuprimovaní
EK
O
Orální výplach
Virová nálož u zdravých osob Kožní stěry a výplachy dutiny ústní, stanovení virové nálože MCPyV pro jednotlivce. HPyV6 a HPyV7 detekujeme pouze desítky kopií ve stěru.
VA
T
1,0E+05
O R O
PÍ
1,0E+03
EK
1,0E+02
1,0E+01
N
počet genomů MCPyV
1,0E+04
1,0E+00 1
2 3
4 5
6 7
8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25
dobrovolník
Stěr Výplach
Zdraví
9
CLL
24
pozitivní (%)
VA
počet
O
Skupina
T
CLL a MCPyV Prevalence MCPyV DNA v PBMC u zdravých a imunosuprimovaných jedinců (B-CLL)
2 (8)
O
PÍ
R
1 (11)
N
EK
Množství DNA v PBMC u obou skupin bylo <0.01 genomu/buňku
V MCC je běžně nalézáno >1 MCPyV genomu/buňku
35
VA
33,3
30
O
25 Prevalence (%)
21,7
EK
3,3
O
8,3
MCPyV
N
0
PÍ
15
5
21,7
R
20
10
T
Prevalence polyomavirů MCPyV, HPyV6 a HPyV7 ve zdravých tonsilách (60 parafinových vzorků)
HPyV6
0 HPyV7
TTV
TTMV
TTMDV
MCPyV a další polyomaviry v ČR SOUHRN Protilátky proti MCPyV nalezeny u 63% obyvatel, což odpovídá publikovaným údajům z Evropy a USA
•
MCPyV DNA je běžně přítomna v kožních stěrech a výplachu z krku zdravých dobrovolníků. Záchyt a kvantita vyjádřená počtem kopií genomu MCV v kožních stěrech je vyšší než ve výplachu z krku. Přítomnost protilátek a nález MCV DNA na kůži a v dutině ústní spolu korelují.
•
HPyV6 a HPyV7 DNA se na kůži vyskytuje vzácně, nenašli jsme ji ve výplaších z krku.
•
MCPyV DNA jsme nalezli pouze asi v 10 % PBMC CLL pacientů a zdravých jedinců. V tonsilách od zdravých jedinců jsme nalezli MCPyV DNA a HPyV6.
DALŠÍ CÍLE •
N
EK
O
PÍ
R
O
VA
T
•
Zjistit seroprevalenci HPyV6 a HPyV7 v obecné populaci ČR
Martina Saláková Viera Ludvíková Eva Hamšíková Petra Vochozková Šárka Němečková
N
EK
O
PÍ
R
O
VA
T
Jitka Forstová Martin Freiberk
Práce je podporována grantem P304/10/1511 GAČR
T
VA
O
R
PÍ
O
EK
N
GST VP1 HPyV 6 a 7 fuzní proteiny: pGEX v E.coli BL21 Flag
VP1 46kDa
T
GST 26kDa
VA
Ptac
HPyV6
HPyV7
N
GST ELISA
EK
O
PÍ
R
GST VP1:
O
~ 75kDa
Izolace: French press
Bac6
GST7
Bac7
86
77 (90%)
77 (90%)
67 (78%)
53 (62%)
184 (84%)
193 (88%)
170 (77%)
148 (67%)
220
261 (86%)
270 (88%)
237 (78%)
201 (66%)
O
VA
GST6
Všichni
EK
N
Muži
O
PÍ
Ženy
N
R
Dárci
306
T
Prevalence anti-VP1 HPyV 6 a 7 u dárců (skupina z r. 2010)
Genom polyomavirů
O
PÍ
R
• geny pro časné nestrukturální proteiny (T-ag, t-ag, 57kT) (t = tumor antigen) regulace buněčného cyklu, váže pRb (p53), replikace virové DNA
VA
T
• Genom tvoří ds DNA ~5200 bp, replikační počátek, oblast regulace transkripce
O
• pozdní agnoprotien (může chybět)
EK
• 3 kapsidové proteiny (VP1,VP2,VP3)
N
• virová miRNA stěpí časné virové mRNA
Polyomaviry
VA
T
•
O
PÍ
R
O
BKV - polyomavirová nefropatie (PVAN) hemoragická cystitida (HSCT) JCV - progresivní multifokální leukoencefalopatie (PML) AIDS, transplantace, natalizumab MCPyV - MCC, imunosuprese, CLL TSPyV- trichodysplasia spinulosa, tranplantace
ori
N
EK
Small t 5000
VP2
1000
4000
Large T
KIV-Stockholm 60 5040 bps
3000
2000
VP1
VP3
Lidské polyomaviry výskyt
komplikace
seroprevalence
JC
běžná infekce v dětství, virus persistuje v epitelu ledvin, B- lymfocytech
reaktivace při imunodeficitu (transplantace) terapie,AIDS), do CNS, progresivní multifokální leukoencefalopatie (PML)
~ 50-80%
BK
běžná infekce v dětství, virus persistuje v epitelu ledvin,
reaktivace při imunodeficitu, hemoragická cystitida (HSCT), polyomavirová nefropatie (transplantace ledviny)
~ 90%
KI
respirační trakt, děti
respirační ?
~ 55-90%
WU
respirační trakt, děti
respirační ?
~ 69-98%
MCPyV
kůže
HPyV6
kůže
HPyV7
kůže, sliznice
TSV
kůže
HPyV9
sérum
N
EK
O
PÍ
R
O
VA
T
virus
karcinom z Merkelových buněk
~ 45-80%
?
~ 69%
?
~ 35%
trichodysplasia spinulosa při imunodeficitu
?
?
?
Seroprevalence polyomavirů • serokonverze v dětství
O
PÍ
• ELISA založená na kapsidových proteinech nebo prázdných kapsidách (VLPs)
R
• hemaglutinace (MCPyV-ovce)
EK
50-80 %
T
JC
• neutralizační test založený virionech nebo VLPs s reportérovým genem.
BK
80-90 %
KI
55-90 %
O
• Metody stanovení protilátek proti kapsidě
N
seroprevalence
VA
• většina dospělých seropozitivní
virus
WU
69-98 %
MCPyV
45-80 %
HPyV6
69-80 %
HPyV7
35-60 %
TSV
70-80 %
HPyV9
18-50 %
HPyV10
N
EK
O
PÍ
R
O
VA
T
Comparison of anti-Merkel cell polyomavirus (MCV) VP1 antibody titers in 68 patients with Merkel cell carcinoma (MCC; blue) and 82 controls (gold).
Touzé A et al. JCO 2011;29:1612-1619
©2011 by American Society of Clinical Oncology
Karcinom z Merkelových buněk (MCC) a MCPyV
VA
T
• polyomavirus MCPyV objeven v roce 2008 v 8 z 10 nádorů (80%) karcinomu z Merkelových buněk (MCC) • MCC vzácný, agresivní nádor kůže , incidence 0.5/100 000/rok • Rizikové faktory jsou světlá pokožka, věk, UV záření, imunosuprese (AIDS, CLL)
O
• MCC MCPyV+, genom viru je náhodně vložen v jedné nebo více kopiích do buněčné DNA
PÍ
R
• virus se nereplikuje, nejsou produkovány virové kapsidové proteiny (VP1, VP2, VP3)
N
EK
O
• produkována zkrácená forma virového T-ag (důsledek mutace či delece), přispívá k transformaci buněk (vazba pRB, aktivace 4E-BP1, regulace translace) • Virus hraje roli při vzniku MCC
Polyomaviry HPyV6 a HPyV7 • polyomaviry HPyV6 a HPyV7 byly nalezeny na kůži zdravých jedinců • není známo, zda způsobují nějaké onemocnění
MCC
Úloha MCPyV při vzniku karcinomu z Merkelových buněk (MCC)
T
MCC • MCC vzácný, agresivní nádor kůže (CK20), snadno metastazuje, incidence 0.5/100 000/rok
O
VA
• Rizikové faktory jsou světlá pokožka, věk, UV záření (často na kůži vystavené slunci), imunosuprese (AIDS, CLL)
R
MCC a MCPyV
N
EK
O
PÍ
• virovou DNA lze nalézt v ~80%, nádorů genom viru je náhodně vložen v jedné nebo více kopiích do buněčné DNA • ve virové DNA je gen pro T-ag je zkrácen (chybí C-konec proteinu, ztráta replikační funkce), zkrácený protein je produkován, přispívá k transformaci buněk • v MCC nejsou produkovány virové kapsidové proteiny VP1
Feng H et al., Science 2008;319:1096-100.
VA
T
Úloha MCPyV při vzniku karcinomu z Merkelových buněk (MCC)
• MCPyV DNA jako prognostický marker u MCC pacientů
PÍ
R
O
Pokud je v primárním nádoru MCPyV DNA v množství > 1 genom/buňku je prognoza přežití (roky) výrazně lepší než pokud je < 1 genom/buňku či MCPyV negativní
O
• protilátky proti MCPyV jako prognostický marker u MCC pacientů
N
EK
Pro pacienty s vyšší hladinou anti-MCPyV protilátek je prognoza přežití lepší
• Dva různé typy MCC?
Výsledky 1 Detekce MCPyV DNA v karcinomu z Merkelových buněk • FFPE vzorky MCC od 19 pacietů (průměrný věk 75 let, rozmezí 48-98 let),
O
VA
T
19 primárních karcinomů, navíc od 2 pacientů recidivy, z Vinohradské nemocnice a 12 FFPE z FN Bulovka • barvení IHC na T-ag MCPyV (protilátka CM2B4)
pozitivní /celkem
%
DNA (Q-PCR)
25/35
71.4
15/21
71.4
EK
O
PÍ
R
metoda detekce
N
IHC (CM2B4)
• DNA Q-PCR, 19 T-ag+VP1, 4 T-ag • většina MCC >1 kopie virové DNA/buňku (Q-PCR) • 12 kontrolních FFPE melanomů negativní pro MCPyV
Výsledky 1 Zmražený MCC - mutace v genu pro T-ag MCPyV 1540
delece
2866
N
EK
O
PÍ
R
O
VA
T
M1, M2
V nádoru celý genom MCPyV V nádorech (MCC) charakteristické mutace T-ag které vedou k předčasnému zkrácení Tag v C-koncové části. Takový protein není schopen replikovat virovou DNA ale může vázat pRB. Část ORF pro T-ag ORF může být zkrácena během integrace do genomu. Replikace viru může být znemožněna i mutací ve virovém replikačním počátku. Příkladem je bodová mutace v jednom z osmi T-vazebných motivů GAGGC nalezena u izolátu z nádoru (MC350) .
Shuda M et al. PNAS 2008;105:16272-16277
T VA O R PÍ O EK N
MCC, IHC barvení protilátkou proti MCPyV T-ag (CM2B4) , 10x , 20x, 40x, (MUDr T.Jirásek)
Výsledky 2
T
Prevalence MCPyV, HPyV6, HPyV7 DNA u zdravých a imunosuprimovaných jedinců
Material
N
EK
Skin swabs Oral rinses Immunosupressed Skin swabs Oral rinses Healthy
Tested
O
Group
PÍ
R
O
VA
Kožní stěry a výplachy dutiny ústní, zdraví jedinci a pacienti AML po transplantaci kostní dřeně (5 měsíců), detekce virové DNA Q-PCR
25 25 14 10
MCPyV positive (%) 18 (72) 10 (40) 6 (43) 2 (20)
HPyV6 positive (%) 1 (4) 0 (0) 0 (0) 0 (0)
HPyV7 positive (%) 2 (8) 0 (0) 0 (0) 0 (0)
Výsledky 2 Prevalence MCPyV, HPyV6 a HPyV7 DNA u zdravých jedinců
N
EK
O
PÍ
Percent
R
O
VA
T
Kožní stěry a výplachy dutiny ústní, detekce Q-PCR pro jednotlivé viry
Výsledky 2 – variabilita kapsidového proteinu VP1 MCPyV 2 sekvence od zdravých jedinců
CLUSTAL 2.1 multiple sequence alignment
MAPKRKASSTCKTPKRQCIPKPGCCPNVASVPKLLVKGGVEVLSVVTGEDSITQIELYLNPRMGVNSPDLPTTSNWYTYTYDLQPKGSSPDQPIKENLPA MAPKRKASSTCKTPKRQCIPKPGCCPNVASVPKLLVKGGVEVLSVVTGEDSITQIELYLNPRMGVNSPDLPTTSNWYTYTYDLQPKGSSPDQPIKENLPA MAPKRKASSTCKTPKRQCIPKPGCCPNVASVPKLLVKGGVEVLSVVTGEDSITQIELYLNPRMGVNSPDLPTTSNWYTYTYDLQPKGSSPDQPIKENLPA MAPKRKASSTCKTPKRQCIPKPGCCPNVASVPKLLVKGGVEVLSVVTGEDSITQIELYLNPRMGVNSPDLPTTSNWYTYTYDLQPKGSSPDQPIKENLPA MAPKRKASSTCKTPKRQCIPKPGCCPNVASVPKLLVKGGVEVLSVVTGEDSITQIELYLNPRMGVNSPDLPTTSNWYTYTYDLQPKGSSPDQPIKENLPA ****************************************************************************************************
12a MCC339 R17a V_30 V_5
YSVARVSLPMLNEDITCDTLQMWEAISVKTEVVGISSLINVHYWDMKRVHDYGAGIPVSGVNYHMFAIGGEPLDLQGLVLDYQTEYPKTTNGGPITIETI YSVARVSLPMLNEDITCDTLQMWEAISVKTEVVGISSLINVHYWDMKRVHDYGAGIPVSGVNYHMFAIGGEPLDLQGLVLDYQTQYPKTTNGGPITIETV YSVARVSLPMLNEDITCDTLQMWEAISVKTEVVGISSLINVHYWDMKRVHDYGAGIPVSGVNYHMFAIGGEPLDLQGLVLDYQTEYPKTTNGGPITIETV YSVARVSLPMLNEDITCDTLQMWEAISVKTEVVGISSLINVHYWDMKRVHDYGAGIPVSGVNYHMFAIGGEPLDLQGLVLDYQTEYPKTTNGGPITIETV YSVARVSLPMLNEDITCDTLQMWEAISVKTEVVGISSLINVHYWDMKRVHDYGAGIPVSGVNYHMFAIGGEPLDLQGLVLDYQTEYPKTTNGGPITIETV ************************************************************************************:**************:
12a MCC339 R17a V_30 V_5
LGRKMTPKNQGLDPQAKAKLDKDGNYPIEVWCPDPSKNENSRYYGSIQTGSQTPTVLQFSNTLTTVLLDENGVGPLCKGDGLFISCADIVGFLFKTSGKM LGRKMTPKNQGLDPQAKAKLDKDGNYPIEVWCPDPSKNENSRYYGSIQTGSQTPTVLQFSNTLTTVLLDENGVGPLCKGDGLFISCADIVGFLFKTSGKM LGRKMTPKNQGLDPQAKAKLDKDGNYPIEVWCPDPSKNENSRYYGSIQTGSQTPTVLQFSNTLTTVLLDENGVGPLCKGDGLFISCADIVGFLFKTSGKM LGRKMTPKNQGLDPQAKAKLDKDGNYPIEVWCPDPSKNENSRYYGSIQTGSQTPTVLQFSNTLTTVLLDENGVGPLCKGDGLFISCADIVGFLFKTSGKM LGRKMTPKNQGLDPQAKAKLDKDGNYPIEVWCPDPSKNENSRYYGSIQTGSQTPTVLQFSNTLTTVLLDENGVGPLCKGDGLFISCADIVGFLFKTSGKM ****************************************************************************************************
300 300 300 300 300
12a MCC339 R17a V_30 V_5
ALHGLPRYFNVTLRKRWVKNPYPVVNLINSLFSNLMPKVSGQPMEGKDNQVEEVRIYEGSEQLPGDPDIVRFLDKFGQEKTVYPKPSVAPAAVTFQSNQQ ALHGLPRYFNVTLRKRWVKNPYPVVNLINSLFSNLMPKVSGQPMEGKDNQVEEVRIYEGSEQLPGDPDIVRFLDKFGQEKTVYPKPSVAPAAVTFQSNQQ ALHGLPRYFNVTLRKRWVKNPYPVVNLINSLFSNLMPKVSGQPMEGKDNQVEEVRIYEGSEQLPGDPDIVRFLDKFGQEKTVYPKPSVAPAAVTFQSNQQ ALHGLPRYFNVTLRKRWVKNPYPVVNLINSLFSNLMPKVSGQPMEGKDNQVEEVRIYEGSEQLPGDPDIVRFLDKFGQEKTVYPKPSVAPAAVTFQSNQQ ALHGLPRYFNVTLRKRWVKNPYPVVNLINSLFSNLMPKVSGQPMEGKDNQVEEVRIYEGSEQLPGDPDIVRFLDKFGQEKTVYPKPSVAPAAVTFQSNQQ ****************************************************************************************************
400 400 400 400 400
12a MCC339 R17a V_30 V_5
DK---GKAPLKGPQKASQKESQTQEL DK---GKAPLKGPQKASQKESQTQEL DK---GKAPLKGPQKASQKESQTQEL DKQDKGKAPLKGPQKASQKESQTQEL DK---GKAPLK----ASQKESQTQEL ** ****** ***********
N
EK
O
PÍ
R
O
VA
T
12a MCC339 R17a V_30 V_5
423 423 423 426 419
100 100 100 100 100
200 200 200 200 200
VA
T
Výsledky 3 Prevalence anti-VP1 MCPyV protilátek a MCPyV DNA u dobrovolníků
detekce testováno pozitivní
sérum
antiMCPyV
77.8
25
18
72
25
10
40
PÍ
O
DNA
14
R
18
%
N
výplach z krku
DNA
EK
kožní stěr
O
materiál
U 78.6 % (11 z 14) seropozitivních jedinců jsme nalezli MCPyV na kůži
Výsledky 3 Seroprevalence anti MCPyV, BKV a JCV protilátek u zdravé populace
O
VA
T
991 vzorků sér, serologické přehledy 2001 (Státní zdravotní ústav). Všechny věkové skupiny od 6 let výše. ELISA testy pro VLPs MCPyV, BKV a JCV.
PÍ
R
věk/ do 21 (%) >21 (%) protilátky n=351 n=640 52
69
BKV
78
61
JCV
48
63
N
EK
O
MCPyV
Výsledky 3 MCPyV, BKV a JCV specifické protilátky u zdravé populace
R PÍ O EK N
Procent pozitivních
O
VA
T
Počet osob s BKV protilátkami se s přibývajícím věkem snižuje, u JCV a MCPyV protilátek je to naopak. Vysoká seroprevalence pro všechny PyV je již ve věkové skupině 6-10 let.
věk
Výsledky 3 prevalence anti-VP1 MCPyV protilátek u dárců krve
VA
T
průměrný věk 35 let, rozmezí 20 - 68 let,
Dárci krve
n
ženy
126
muži
62.6
304
205
67.4
430
284
66.0
PÍ
79
EK N
celkem
%
O
R
O
anti - MCPyV
Průběh infekce MCPyV u zdravých a imunosuprimovaných jedinců
VA
T
Screening sér zdravých a imunosuprimovaných jedinců na přítomnost anti-MCPyV protilátek
R
O
- MCPyV VP1 gen (kodonově modifikovaný, AddGene Ch.Buck) do vektoru pFastBacDual pod polyhedrynový promotor
O
PÍ
- ELISA založená na VP1 MCPyV VLPs produkovaných rekombinatními bakuloviry v hmyzích buňkách (Vierka Ludvíková)
EK
- pozitivní myší séra – myši imunizované DNA vakcínou, GeneGun, VP1 gen ve vektrou pBSC
N
Testování buněčné imunity u zdravých jedinců -buněčná imunita proti virovým proteinům (T-ag, VP1) ELISPOT, produkce IL-2, IL-4, IFN-gamma (Šárka Němečková)
Soubor FFPE MCC od MUDr Jiráska
VA
T
• 23 vzorků od 19 pacietů (19 primární karcinomy, 4 reidivy od 2 pacientů) • IHC na markerů (Ck20, Ck7, TTF-1, CgA, NSE)
PÍ
13 (72 %) 5 (28 %)
R
pozitivních negativních
O
• IHC na T-ag MCPyV u 18 primárních karcinomů (protilátka CM2B4)
N
EK
O
• Izolace DNA na detekci MCPyV (Q-PCR - MCPyV, RNaseP)
Sledování infekce dalšími lidskými polyomaviry
VA
T
- příprava rekombinantních bakulovirů produkujících VLPs z VP1 HPyV6 a HPyV7 (kodonově modifikovaný, AddGene)
R
O
- rekombinantní bakuloviry produkjící VLPs z VP1 dalších polyomavirů (BKV, JCV, MuPyV) (PřFUK)
O
PÍ
- detekce DNA z virů HPyV6, HPyV7, HPyV9 (ELISA ?) u zdravých a imunosuprimovaných jedinců
N
EK
- místa integrace MCPyV v MCC, také CLL
Průběh infekce MCPyV u zdravých a imunosuprimovaných jedinců - zjišťování DNA sekvence izolátů ori
PÍ
R
O
VA
T
LT3/LT3i
T
N
EK
O
Vp1
Část genomu MCPyV amplifikovaná při nested PCR pomocí samdy primerů LT3/LT3i , další sady primerů jsou používány pro amplifkaci delších genomových fragmentů, pro celé genomy RCA (podle Feng et al. Science 2008, upraveno).
T VA
N
EK
O
PÍ
R
O
Děkuji za pozornost
