NÁVODY PRO CVIČENÍ Z MIKROBIOLOGIE
Studijní text Fakulty životního prostředí UJEP
Josef Trögl, 2008
1
2
3
4
5
6
7
8
Úvod ................................................................................................................................... 4 1.1 Organizace laboratorních cvičení............................................................................... 4 1.1.1 Protokoly ............................................................................................................ 4 Bezpečnost a hygiena práce v mikrobiologické laboratoři ................................................ 6 2.1 Zásady bezpečné práce v mikrobiologické laboratoři................................................ 6 2.2 Další zásady práce v mikrobiologické laboratoři ....................................................... 6 2.3 První pomoc při mimořádnostech a úrazech .............................................................. 7 Principy sterilní práce......................................................................................................... 8 3.1 Sterilační metody........................................................................................................ 8 3.1.1 Sterilace povrchů................................................................................................ 9 3.1.2 Sterilace médií a laboratorního nádobí............................................................... 9 Kultivační techniky .......................................................................................................... 10 4.1 Média........................................................................................................................ 10 4.2 Kultivace mikroorganismů ....................................................................................... 11 4.3 příprava agarových misek ........................................................................................ 11 4.4 Očkování na pevné půdy .......................................................................................... 12 Optické mikroskopické techniky...................................................................................... 13 5.1 Optický mikroskop ................................................................................................... 13 5.2 Základní postup při mikroskopování........................................................................ 13 5.3 Mikroskopování s imerzním olejem......................................................................... 14 5.4 Použití počítací komůrky ......................................................................................... 14 5.5 Vitální barvení kvasinek........................................................................................... 15 5.6 Gramovo barvení bakterií......................................................................................... 15 5.6.1 Úvod ................................................................................................................. 15 5.6.2 Postup ............................................................................................................... 16 Kultivační stanovení počtu heterotrofních mikroorganismů v různých prostředích........ 17 6.1 Základní používané procedury ................................................................................. 17 6.1.1 Procedura 1.: Roztěr vzorku na agarovou plotnu ............................................. 17 6.1.2 Procedura 2.: Desítkové ředění vzorků ............................................................ 18 6.2 Postupy ..................................................................................................................... 18 6.2.1 Postup 1.: Izolace mikroorganismů z povrchů ................................................. 18 6.2.2 Postup 2.: Kultivační stanovení mikroorganismů v půdě................................. 19 6.2.3 Postup 3: Měření spadu mikroorganismů ze vzduchu...................................... 20 6.2.4 Poznámky ke všem postupům .......................................................................... 20 6.3 Vyhodnocení výsledků ............................................................................................. 20 Vliv vnějších podmínek na mikroorganismy ................................................................... 21 7.1 Vliv antibiotik na růst bakterií ................................................................................. 21 7.1.1 Postup ............................................................................................................... 21 7.1.2 Vyhodnocení .................................................................................................... 21 7.2 Vliv osmotické hladiny na růst mikroorganismů ..................................................... 21 7.2.1 Postup ............................................................................................................... 22 7.2.2 Vyhodnocení .................................................................................................... 22 7.3 Vliv teploty na životaschopnost mikroorganismů.................................................... 22 7.3.1 Postup ............................................................................................................... 22 7.4 Vliv ultrafialového záření na růst mikroorganismů ................................................. 22 7.4.1 Postup ............................................................................................................... 22 7.4.2 Vyhodnocení .................................................................................................... 23 křivka mikroorganismů ...................................................................................... 24 Růstová 8.1 Postup práce ............................................................................................................. 24
2
8.1.1 Zaočkování buněk do kapalného média ........................................................... 24 8.1.2 Kultivace mikroorganismů ............................................................................... 25 8.1.3 Měření hustoty buněčné koncentrace ............................................................... 25 8.1.4 Poznámky ......................................................................................................... 25 8.2 Vyhodnocení výsledků ............................................................................................. 25 9 Zadání jednotlivých Úloh................................................................................................. 27 9.1 Očkování mikroorganismů ....................................................................................... 27 9.2 Vliv antibiotik na růst bakterií ................................................................................. 27 9.3 Gramovo barvení mikroorganismů .......................................................................... 27 9.4 Kultivační stanovení počtu mikroorganismů v různých prostředích ....................... 27 9.5 Růstová křivka mikroorganismů .............................................................................. 28 9.6 Vliv vnějších podmínek na mikroorganismy ........................................................... 28 9.7 Hodnocení kultury kvasinek pomocí počítací komůrky .......................................... 28 10 Použitá média a roztoky ............................................................................................... 29 10.1 Kultivační média ...................................................................................................... 29 10.1.1 LB (Luria Broth) .............................................................................................. 29 10.1.2 Plate count agar (PCA)..................................................................................... 29 10.1.3 Malt extract ...................................................................................................... 29 10.1.4 Škrobový agar .................................................................................................. 29 10.2 roztoky...................................................................................................................... 29 10.2.1 Fyziologický roztok.......................................................................................... 29 10.2.2 fosfátový pufr 0,066 M pH 7............................................................................ 29 10.3 Barviva ..................................................................................................................... 30 10.3.1 Krystalová violeť.............................................................................................. 30 10.3.2 Safranin ............................................................................................................ 30 10.3.3 Methylenová modř ........................................................................................... 30 10.3.4 Lugolův roztok ................................................................................................. 30 11 Přílohy .......................................................................................................................... 31
3
1
ÚVOD
Tento text slouží pro potřeby výuky cvičení z mikrobiologie na Fakultě životního prostředí Univerzity Jana Evangelisty Purkyně v Ústí nad Labem. Studenti by si ho měly prostudovat před začátkem cvičení, aby byli teoreticky seznámeni s tím, co je čeká při praktické výuce. Každá kapitola se zabývá nějakým vyučovaným postupem, podobné práce jsou sdruženy. V každé kapitole naleznete teoretický úvod do problému, principy práce, vlastní postup práce a závěrečné zhodnocení výsledků.
1.1
ORGANIZACE LABORATORNÍCH CVIČENÍ
Praktická laboratorní cvičení jsou podmínkou pro udělelní zápočtu u studentů denního studia a účast na nich je povinná. Je možné uznat jednu absenci, ale jen v oddůvodněných případech a po řádné omluvě. Pokud student vynechá cvičení, může si ho nahradit s jinou skupinou (umožní-li to kapacita a je-li daná práce ještě v programu). V posledním týdnu semestru (datum bude upřesněno) budou probíhat náhradní cvičení pro studenty se dvěma absencemi. Na tato cvičení je třeba se přihlásit emailem (
[email protected]). Studenti s více absencemi (až na oprávněné výjimky) nedostanou zápočet a budou nuceni znovu si zapsat předmět 1MIKR v následujícím roce. Cvičení sestávají z pěti praktických laboratorních prací v rozsahu dvě vyučovací hodiny a jednoho samostatného terénního odběru. Z každé práce musí studenti sepsat a odevzdat protokol. Na laboratorní cvičení je třeba mít s sebou plášť a dodržovat bezpečnostní předpisy (ignorování bezpečnosti práce může být důvodem k vyloučení studenta z laboratoří). Na každé laboratorní cvičení je k dispozici návod, který by si měl student před cvičením přečíst a pochopit principy práce. Student, který bude působit nepřipraveným dojmem může být z laboratoří vyloučen.
1.1.1
PROTOKOLY
Smyslem protokolu je zadokumentovat provedenou práci tak, aby bylo možné ji později reprodukovat, odhalit případné experimentální chyby či identifikovat faktor, který způsobuje neočekávané výsledky. Protokol by měl být stručný a výstižný a měl by obsahovat všechny důležité údaje (navážky, inkubační časy, primární i přepočítané výsledky apod.). Zejména je třeba zdůraznit a zdůvodnit případné odchylky od standardního postupu. Pokud zpracováváte nějaká statistická data (např. máte průměr z deseti měření) je třeba je doplnit alespoň základní statistickou charakteristikou (průměr ± směrodatná odchylka) apod. Protokol by měl proto obsahovat tyto prvky: • • • •
•
jména studentů, identifikaci skupiny ("lichý čtvrtek od 8,00" apod.), datum práce. stručný princip práce (několik vět) stručnou metodiku (není třeba opisovat postup z návodu, ale je třeba vypsat údaje potřebné pro další vyhodnocování, např. navážky, objemy či teploty). primární nezpracované výsledky v podobě tabulek či grafů (např. počty mikroorganismů v jednotlivých polích počítací komůrky, počty narostlých kolonií apod.). přepočty primárních výsledků na porovnatelné rozumné veličiny (např. stěry z plochy v počtech CFU/cm2, počty mikroorganismů v kapalině v CFU/ml apod.). Doporučuji nepsat jen vzorce, ale i číselné dosazení, pak je možné lépe odhalit chybu.
4
•
Stručný slovní závěr („V 1 gramu vzorku jsme zjistili XX±YY CFU“, „Neznámý mikroorganismus byl určen jako gramnegativní“ apod.)
Vzorový protokol je v příloze Dále platí následující pravidla: •
• •
•
Protokoly odevzdávejte v písemné podobě na příštích laboratorních cvičeních. Pokud práce zahrnuje i kultivaci, jejíž výsledek bude znám až na příštích cvičeních, pak se termín pochopitelně o cvičení posouvá. Doporučuji zpracování na počítači a tisk, nejlépe oboustranný. V případě malých nedostatků budou tyto prokonzultovány a protokol uznán, v případě závažných nedostatků bude protokol vrácen k přepracování. Některé práce budou probíhat ve skupinách 2-4 studentů, v takovém případě odevzdávejte pouze jeden protokol za celou skupinu. Stejně jako skupinová práce je dílem všech, je i protokol dílem všech a všichni by se měli podílet na jeho sepsání. Udělá-li protokol jen jeden člen skupiny, měli by si ho ostatní alespoň přečíst. Případné vrácení pak padá na celou skupinu. Oblíbené výmluvy „to psal kolega a já ani nevím, jak to spočítal“) nebudou pochopitelně uznány. Kdo bude mít omluvenou a uznanou absenci, měl by se seznámit s protkokoly ostatních (praktické otázky z cvičení mohou být v testu).
Při sepisování protokolů se snažte používat zdravý selský rozum. Občas se v protokolech objeví zjevně zcela nesmyslné výsledky, např. "v jednom ml vody jsme zjistily 1,3.109 gramů mikroorganismů".
5
2
BEZPEČNOST A HYGIENA PRÁCE V MIKROBIOLOGICKÉ LABORATOŘI
Každá laboratorní práce představuje potenciální riziko. Nesprávným postupem práce je možné ohrozit vlastní bezpečnost, bezpečnost ostatních, stejně jako způsobit materiální škody. Proto je bezpodmínečně nutné se seznámit se zásadami bezpečné laboratorní práce a tyto dodržovat. Na prvním cvičení stvrdí studenti svým podpisem, že byly se zásadami bezpečné práce seznámeni a že se zavazují je dodržovat. Kromě běžných laboratorních rizik s sebou nese mikrobiologická práce i zvýšené zdravotní riziko vyplývající z práce z živými mikroorganismy, které mohou být potenciálně patogenní. I když v rámci výuky nebudou studenti pracovat přímo se známými patogeny, některé práce zahrnují kultivace nedefinované kultury (např. stěrů z veřejně dostupných míst) a riziko infekce proto vždy hrozí.
2.1
ZÁSADY BEZPEČNÉ PRÁCE V MIKROBIOLOGICKÉ LABORATOŘI
1. V laboratoři je dovoleno pracovat jen pod dohledem pedagogického pracovníka, provádět jen ty úkony, které povolí, a je nutné dodržovat jeho pokyny a nařízení. 2. Při práci je třeba se chránit přiměřenými ochrannými pomůckami. Každý musí mít oblečen ochranný plášť, v případě těsnějšího kontaktu s potenciálně nebezpečným materiálem je třeba používat gumové rukavice. 3. V laboratoři je zakázáno jíst, pít a kouřit. 4. Je třeba dbát zvýšené hygieny. Při každém odchodu z laboratoře je třeba si důkladně umýt ruce mýdlem, v případě potřeby i desinfekčním činidlem. 5. Dojde-li ke kontaminaci předmětu (např. oděvu, tašky apod.) mikrobiální kulturou, je třeba vždy provést desinfekci, např. otření desinfekčním roztokem. 6. V laboratoři nesmí pracovat lidé, kteří by tím byly vystaveni výrazně zvýšenému zdravotnímu riziku. Jedná se např. o alergiky na některý mikroorganismus či látku, se kterou se pracuje, osoby s oslabeným imunitním systémem a těhotné ženy. 7. Každý úraz, byť i jen oděrku, je třeba hlásit pedagogickému pracovníkovi, kvůli zvýšenému riziku infekce rány. 8. Rozbité laboratorní sklo je třeba odkládat do zvláštní k tomu určené nádoby. Je-li kontaminováno mikrobiologickou kulturou, musí se před vyhozením desinfikovat. Robité sklo se nesmí sbírat rukou! 9. Každý laboratorní postup je třeba si promyslet, aby nedocházelo k závažným chybám a ohrožení zdraví či majetku. 10. Potenciálně nebezpečné operace je třeba dělat vždy jen předepsaným způsobem na určeném místě a s ohledem na bezpečnost svou i ostatních. 11. Při práci v blízkosti kahanu dbejte zvýšené opatrnosti, aby nedošlo k zahoření např. oděvu či vlasů. 12. Ke každé mikrobiální kultuře je třeba chovat se tak, jako by byla patogenní. Ke každé chemikálii je třeba se chovat tak, jako by byla jedovatá. 13. Suspenze mikroorganismů je zakázáno pipetovat ústy, vždy je potřeba použít balónek.
2.2
DALŠÍ ZÁSADY PRÁCE V MIKROBIOLOGICKÉ LABORATOŘI
1. V laboratoři je třeba udržovat pořádek. Úspěšnost většiny prací závisí na čistotě prostředí. 6
2. Po každé práci je třeba uklidit po sobě, zejména uvolnit své pracovní místo, umýt použité nádobí, očistit objektiv mikroskopu apod. 3. Použité mikrobiální kultury se musí po ukončení práce likvidovat, např. autoklávováním či roztokem desinfekčního činidla. 4. Snažte se pracovat tiše, aby i ostatní měli klid na vlastní práci.
2.3
PRVNÍ POMOC PŘI MIMOŘÁDNOSTECH A ÚRAZECH
Stane-li se Vám úraz či jiná mimořádnost, zanechte práce (vyjma odvrácení bezprostředního ohrožení dalších lidí) a zavolejte pedagogický dozor, který poskytne první pomoc. 1. Dostane-li se mikrobiální kultura do úst, je třeba ústa vypláchnout a vykloktat desinfekčním roztokem, např. 1% KMnO4 či zředěným Lugolovým roztokem 2. Kontaminovanou pokožku je třeba otřít desinfekčním činidlem, např. 0,1% Ajatinem. 3. Při zasažení oka mikrobiologickým materiálem je třeba vypláchnout oko borovou vodou. V případě zasažení chemikálií, je třeba oko důkladně vypláchnout proudem vody a poté borovou vodou. 4. Každou otevřenou ránu je třeba vydesinfikovat.
7
3
PRINCIPY STERILNÍ PRÁCE
Sterilní prostředí je základem úspěšné mikrobiologické práce. Mikroorganismy jsou všude okolo nás (ve vzduchu, ve vodě, na kůži…) a pro úspěch experimentu je třeba je usmrtit nebo alespoň silně omezit. Dodržujte tyto pokyny: • Pracujte v čistém prostředí, kde se nepráší, nevíří prach apod. S tím souvisí např. i zavřená okna. • Pracovní plochu si vždy vysterilujte, např. ajatinem nebo ethanolem. • Pokud není k dispozici laminární box, pracujte v okolí zapáleného kahanu. • Ruce si před prací umyjte řádně mýdlem, popř. i desinfekčním činidlem. • Pracujte rychle, ale pochopitelně bezpečně. • Nikdy se nedotýkejte sterilních částí misek, baněk apod. (tj. obvykle těch vnitřních) rukou. • Používejte pouze sterilní pomůcky. Ty pomůcky, které už přišly do styku s mikrobní kulturou, znovu nepoužívejte. • Nepokládejte sterilní pomůcky (pinzety, kličky, zátky apod.) na pracovní plochu. • Otevíráte-li sterilní nádobu, dělejte to vždy co nejblíže u kahanu a jen po nezbytně nutnou dobu. Je-li to možné, sterilujte zátku i hrdlo baňky lehkým ožehnutím v plameni (pozor na zahoření!)
3.1
STERILAČNÍ METODY
V laboratoři se používají nejčastěji tyto sterilační metody: • Vlhké teplo je účinnější než suché a ještě vyšší účinnosti se dosahuje za vyššího tlaku. Zařízení pro sterilaci mokrým teplem pod tlakem se nazývá autokláv. V autoklávu je možné sterilovat vše, co není citlivé na teplo, vlhko a tlak, např. média, nástroje, nádobí atd. • Suché teplo nemá takovou sterilační účinnost a proto musí působit delší dobu (typicky 2 hodiny). Používá se hlavně pro sterilaci čistého nádobí, které je potřeba mít suché. • Filtrace přes filtr s menšími póry než je velikost bakteriálních buněk se používá pro tekutiny (kapaliny a plyny) citlivé na teplo. Zařízení, ve kterém je možné pracovat sterilně v proudu filtrovaného vzduchu se nazývá laminární box nebo též flow-box. • Chemické látky se používají ke sterilaci tam, kde není možné použít předchozí techniky a kde aplikace chemikálií nevadí. Příkladem je sterilace povrchů ethanolem. Chemikálie mohou být jak mikrobicidní (zabíjejí mikroorganismy), tak pouze mikrobistatické (brání rozmnožování). Spektrum mikrobicidních látek je veliké, např. oxidační činidla (peroxid vodíku, chlór apod.), kationaktivní detergenty (ajatin), alkoholy (ethanol) apod. Z mikrobistatických látek se nejčastěji používají antibiotika. • Záření s dostatečnou energií (UV, gama) se nejčastěji používá pro sterilaci nepravidelných povrchů a vzduchu a pro speciální aplikace. Tzv. germicidní lampa emituje UV záření o vlnové délce 260-270 nm, které má nejvyšší mikrobicidní účinky. Ozařování gama zářením se někdy používá pro speciální sterilace, např. půdy. • Plamen je velice účinný sterilační prostředek, ale dost nebezpečný. Používá se pro sterilaci kovových nástrojů (kličky, pinzety) a též pro sterilaci okolního vzduchu, neníli k dispozici flow-box.
8
3.1.1
STERILACE POVRCHŮ
Ke sterilaci povrchů (pracovního stolu apod.) používáme v našich laboratořích buď 50% roztok etanolu nebo 0,1% roztok ajatinu. Oba roztoky jsou k dispozici u výlevky ve střičkách. Stříkněte přiměřenou dávku na sterilovaný povrch a rozetřete buničinou nebo papírem. Jinou možností je použití germicidní lampy, tyto operace ale provádí vyučující obvykle mezi cvičeními, např. přes noc.
3.1.2
STERILACE MÉDIÍ A LABORATORNÍHO NÁDOBÍ
Všechna média používaná v rámci cvičení z mikrobiologie jsou sterilovatelná autoklávováním (120°C, 0,1 MPa, 15 min). Podobně je možné sterilovat většinu skleněného, porcelánového i kovového nádobí a též plastové výrobky, které tyto podmínky vydrží (např. polypropylenové kádinky). Autokláv je vysokotlaké zařízení, které smí obsluhovat jen řádně proškolená osoba. Obsluha autoklávu bude proto pouze předvedena a všechny sterilní pomůcky budete dostávat už připravené.
9
4
KULTIVAČNÍ TECHNIKY
Kultivace (pěstování) mikroorganismů představuje základ mikrobiologické práce. Má ale svá specifika: • Mikroorganismy obvykle rostou rychle. Protože jsou všude kolem nás, je třeba při práci dbát na sterilitu prostředí, nástrojů i kultivačních médií. • Různé mikroorganismy mají rozdílné nároky na svou výživu i podmínky kultivace. Proto je třeba vždy pečlivě zvážit složení kultivačního média, teplotu kultivace, aeraci a další faktory. • Kultivace trvá v závislosti na organismu několik dní až několik týdnů.
4.1
MÉDIA
Správná volba kultivačního média je základem úspěšné kultivace. Používaná média je možné rozdělit podle několika hledisek: • Podle původu lze rozdělit média na přirozená (mléko, krev, listí apod.), syntetická (jejichž složení je přesně definováno a jsou připravena z čistých chemikálií) a polosyntetická (obsahující některé živiny přesně definované a jiné směsné). • Podle skupenství dělíme média na kapalná a ztužená. • Podle obsahu živin dělíme média na bohatá (všechny živiny jsou v nadbytku) a limitovaná (jedna živina nebo několik živin je nedostatku). • Podle selektivity dělíme média na obecná (na nichž roste mnoho skupin mikroorganismů) a selektivní (na kterých roste jen několik skupin mikroorganismů). I když je složení kultivačních médií různé, má každé médium toto obecné složení: • Zdroj uhlíku. Nejčastěji se používají sacharidy (glukóza), aminokyseliny, peptidy a lipidy, ale lze použít např. i uhlovodíky a jejich deriváty. Autotrofní mikroorganismy vyžadují zdroj CO2, pak je obvykle třeba dobrá aerace. • Zdroj dusíku. Dusík je základem mnoha nezbytných komponent organismů. Nejobecnější jsou organické zdroje dusíku (např. aminokyseliny), ale většina mikroorganismů je schopná využít i amonné ionty, dusičnany a dusitany. Některé skupiny mikroorganismů jsou schopné fixovat i vzdušný dusík, ty vyžadují dobré provzdušnění. • Zdroje dalších minerálních látek. Zejména se jedná o zdroj fosforu (nejčastěji fosforečnany), síry (nejčastěji sírany), biogenních kovů (železa, mědi, zinku atd., obvykle v podobě iontů) a solí (zejména chloridy sodný a draselný). • Selektivní činidla, způsobující omezení růstu některých skupin mikroorganismů. Jedná se např. o antibiotika. • Speciální látky pro auxotrofy. Některé mikroorganismy ztratily schopnost syntetizovat si všechny své organické látky a ty je jim třeba přidávat do prostředí (tzv, auxotrofové). Nejčastěji se jedná o některé aminokyseliny či vitamíny. • Voda. • Látky upravující pH, např. pufry. • Ztužovadlo u ztužených médií (agar, želatina). Ztužování médií se provádí nejčastěji agarem. Agar je polysacharid (polygalaktóza) izolovaný z mořských řas. Většina mikroorganismů ho neumí rozložit a využít jako živinu. Agar taje při 96°C a tuhne při 40°C, čehož se využívá při ztužování médií, které je možné po sterilaci za tepla rozlít a po vychladnutí ztuhnou.
10
Selektivity médií je možné dosáhnout v zásadě dvěma způsoby. Negativní selektivity se dosahuje přídavkem látek, které inhibují růst některých skupin mikroorganismů (jsou pro ně toxické) a jiných ne. Nejčastěji se používají antibiotika a některá barviva (např. bengálská červeň pro inhibici růstu bakterií). Pozitivní selektivity se dosahuje použitím některé méně obvyklé živiny, kterou umí využít jen omezená skupina mikroorganismů.
4.2
KULTIVACE MIKROORGANISMŮ
Mikroorganismy rostou obvykle několik dní a vyžadují vhodnou teplotu a aeraci (tj. přístup vzduchu; anaerobní mikroorganismy by naopak mít přístup vzduchu neměly). Ztužená média se obvykle kultivují v termostatu s výměnou vzduchu. Misky se kultivují v tzv. zavěšené poloze, tj. agarem nahoru. Důvodem je kondenzace vody, která takto kape pouze na víčko, zatímco v opačném případě by kapala na agar a rozmývala rostoucí kulturu. Kapalná média se obvykle kultivují v termostatované třepačce (vodní nebo vzduchové). Kapalné médium se obvykle umisťuje do kónické Erlenmayerovy baňky, popř. do kultivační láhve. Třepání zajišťuje dostatečnou aeraci kultury. Pozor ale na průchodnost zátky. Zátka nesmí být přikryta alobalem (kterým se kryje proti zvlhnutí v průběhu sterilace) a nesmí být ani mokrá, protože přes kapalinu prochází vzduch daleko hůř.
4.3
PŘÍPRAVA AGAROVÝCH MISEK
Média se nejčastěji ztužují agarem, obvykle v koncentraci 1-2%. Ztužené médium se nejčastěji připravuje do zkumavek (tzv. šikmý agar) a na misky. Médium se rozlévá do sterilních misek po autoklávování za přiměřené teploty (cca 50-70°C) ve sterilním prostředí (v okolí kahanu nebo v laminárním boxu). Plastové misky (obvykle polystyrénové) jsou dodávány už od výrobce sterilní, skleněné je třeba před tím vysterilovat v autoklávu. Po zatuhnutí se nechají misky kultivovat, aby se odhalily případné kontaminace. Postup: 1. Připravte požadované kapalné kultivační médium a nalijte ho do sterilační láhve („pyrexky“). 2. Přidejte cca 1-2% agaru, agar se při nízké teplotě nerozpustí ani při intenzivním míchání, nechte ho proto usadit na dně. 3. Sterilujte médium v autoklávu. 4. Po skončení sterilace nechte médiu zchladnout na teplotu cca 70°C. 5. Sterilujte pracovní stůl ajatinem a zapalte kahan. 6. Připravte si na stůl sterilní misky. 7. Sterilační láhev držte v pravé ruce (vzhledem k teplotě doporučuji použít izolační rukavice), levou rukou lehce odklopte víčko misky a nalijte do misky přiměřenou dávku média tak, aby vznikla vrstva cca 0,5 cm tlustá. Misku poté ihned přiklopte. 8. Po skončení rozlévání lehce ožehněte hrdlo lahve i špunt v plameni (opravdu jen lehce, aby plastové části nechytily nebo se nedeformovaly) a zavřete. 9. Počkejte až agar v miskách zatuhne a dejte je inkubovat do inkubátoru v zavěšené poloze (tj. agarem nahoru). Stejným způsobem můžete rozlévat i médium se zaočkovaným mikroorganismem. Pak bude zajištěn homogenní nárůst v celém objemu misky. Je ale třeba dbát na to, aby agar byl vytemperovaný na přijatelnou teplotu (obvykle 40°C, při nižších teplotách už agar tuhne, vyšší zase bývají inhibiční).
11
4.4
OČKOVÁNÍ NA PEVNÉ PŮDY
K přeočkování mikroorganismu z kapalného nebo pevného média na agarové médium se obvykle používá klička sterilovaná plamenem. Pomůcky: kahan, očkovací klička Postup přeočkování z pevného média: 1. Sterilujte pracovní stůl ajatinem a zapalte kahan. 2. Připravte si na stůl misky s připraveným agarovým médiem a misky s přeočkovávaným mikroorganismem. 3. Sterilujte očkovací kličku v oxidační části plamene (tj. nad oranžovou redukční částí, cca uprostřed plamene). Klička by se měla viditelně rozpálit. 4. Otevřete původní misku a ochlaďte kličku buď o vnitřní stěnu či víčko (u skleněných misek) nebo o agar v oblasti, kde není viditelný nárůst mikroorganismů. 5. Naberte malé množství kultury na kličku. 6. Zavřete původní misku a otevřete novou. 7. Několika tahy rozetřete mikroorganismus po agaru. 8. Zavřete misku a vysterilujte znovu kličku. 9. Nechte novou misku inkubovat v inkubátoru v zavěšené poloze. Postup přeočkování z kapalného média: 1. Sterilujte pracovní stůl ajatinem a zapalte kahan. 2. Připravte si na stůl misky s připraveným agarovým médiem a původní kapalnou kulturu. 3. Sterilujte očkovací kličku v oxidační části plamene (tj. nad oranžovou redukční částí, cca uprostřed plamene). Klička by se měla viditelně rozpálit. 4. Levou rukou otevřete baňku s kapalnou kulturou, zátku nepokládejte, ale držte ji stále v ruce. 5. Namočte kličku do kultury, aby se ochladila (měla by slyšitelně zasyčet). 6. Po zchladnutí lehce zamíchejte kličkou v médiu a vytáhněte ji z baňky. 7. Otevřete misku a několika tahy rozetřete mikroorganismus po agaru. 8. Zavřete misku. 9. Zátku i hrdlo baňky lehce ožehněte plamenem (pozor, aby zátka nechytila!) a zavřete 10. Nechte novou misku inkubovat v inkubátoru v zavěšené poloze.
12
5 5.1
OPTICKÉ MIKROSKOPICKÉ TECHNIKY OPTICKÝ MIKROSKOP
Optický mikroskop je technické zařízení, které umožňuje vidět objekty výrazně zvětšené za použití přirozeného světla. Princip fungování je založen na dvou čočkách, které nazýváme objektiv a okulár. Mikroskop se skládá z mechanické a optické části. Mechanická část mikroskopu zahrnuje kromě jiného nohu mikroskopu (tzv. stativ), pohyblivý stoleček s upevňovadly pro přichycení vzorku, makrometrický a mikrometrický šroub pro zaostřování a revolverový měnič objektivů. Optická část zahrnuje už zmiňované objektivy (obvykle několik) a okulár, optické filtry, clonu a zdroj světla. Naše mikroskopy využívají elektrickou lampu a nejsou proto závislé na vnějším zdroji světla. Obraz vstupující do mikroskopu je objektivem zvětšen a otočen a takto zvětšený obraz je poté ještě zvětšen okulárem. Výsledné zvětšení mikroskopu je pak součinem obou zvětšení. Okulár má obvyklé zvětšení 10x nebo 20x, objektivy 5x až 100x, výsledné zvětšení mikroskopu tak může být až 2000 násobné. Obraz, který v okuláru vidíme je otočený (hlavou vzhůru). Optické zvětšování má svoje limity dané zejména vlnovou délkou použitého světla a optickými vlastnostmi optických částí mikroskopu. Maximální rozlišení detailů je dáno tzv. numerickou aperturou objektivu A=n sin α, kde n je index lomu prostředí mezi čelní čočkou objektivu a preparátem, α je polovina otvorového úhlu objektivu (úhel mezi dvěma krajními paprsky, které mohou projít do objektivu). Rozlišovací schopnost (tj. nejmenší vzdálenost mezi dvěma odlišitelnými body) se pak vypočítá a = λ/A. Rozlišovací schopnost mikroskopu ovlivňuje i tzv. hloubku ostrosti. Ta představuje vlastně vzdálenost dvou na sebou položených rovin, pouze mezi kterými je obraz ostrý. Čím větší rozlišovací schopnost, tím menší hloubka ostrosti. Numerická apertura každého objektivu by na něm měla být napsána, obvykle pod číslem udávajícím jeho zvětšení. Index lomu vzduchu je cca 1, vody 1,25; chceme-li zvýšit rozlišovací schopnost mikroskopu, musíme použít mezi vzorkem a objektivem prostředí s vyšším indexem lomu. K tomu slouží tzv. imerzní oleje, jejichž index lomu se pohybuje kolem 1,3-1,4. Maximální dosažitelná rozlišovací schopnost bývá u světelných mikroskopů cca 0,2 µm1. Clona mikroskopu funguje stejně jako u fotoaparátu - omezuje otvorový úhel objektivu. Tím je snížena rozlišovací schopnost mikroskopu, ale zvyšuje se hloubka ostrosti.
5.2
ZÁKLADNÍ POSTUP PŘI MIKROSKOPOVÁNÍ
Pozorovaný objekt se obvykle umisťuje na tzv. podložní sklíčko a často se také přikrývá krycím sklíčkem. Tím se zajišťuje nízká tloušťka vrstvy nutná pro dobré pozorování objektu. 1. Pozorovaný objekt umístěte na podložní sklíčko a přikryjte krycím sklíčkem. 2. Makroskopickým šroubem přesuňte stoleček do nejnižší polohy a upevněte do něj sklíčko. 3. Na revolverovém měniči nastavte objektiv s nejmenším zvětšením, koukejte do okuláru a pomalu otáčejte makroskopickým šroubem, dokud neuvidíte zvětšený obraz. 4. Mikroskopickým šroubem doostřete obraz, aby nebyl rozmazaný. 1
Vzhledem k tomu, že běžné bakterie mají rozměry v řádu mikrometrů (typicky 2µm), jsme schopni při maximálním rozlišení odlišit na délku bakterie max. cca 10-20 bodů. Ve světelném mikroskopu tak těžko uvidíme struktury jako cytoplazmatická membrána, ribozómy či bičíky, jejichž rozměry jsou menší. Pro zobrazení těchto struktur už je potřeba elektronový mikroskop.
13
5. Přepínejte postupně objektivy na vyšší zvětšení (vyjma zvětšení 100x, které vyžaduje imerzní olej), obraz vždy doostřete mikroskopickým šroubem. 6. S objektem můžete posouvat všemi směry pomocí směrových koleček umístěných po stranách stolečku.
5.3
MIKROSKOPOVÁNÍ S IMERZNÍM OLEJEM
Pro největší dosažené zvětšení slouží objektiv zvětšující 100x. Aby ale bylo možné obraz zaostřit, je třeba zvýšit index lomu prostředí mezi objektem a objektivem. K tomu slouží imerzní olej. Při použití imerzního oleje se nesmí použít krycí sklíčko, ale objektiv se namáčí přímo do oleje. Postupujte následovně: 1. Na objekt na podložním sklíčku kápněte kapku imerzního oleje. 2. Upevněte objekt na stoleček v nejnižší poloze. 3. Nastavte objektiv s nejvyšším zvětšením. 4. Pomalu otáčejte makroskopickým šroubem dokud se objektiv jemně nenamočí v imerzním oleji. 5. Od teď už koukejte do okuláru a pomalu dohledejte a doostřete objekt pomocí mikroskopického šroubu.
5.4
POUŽITÍ POČÍTACÍ KOMŮRKY
Počítací komůrka je speciální mikroskopické sklíčko, ve kterém je vybroušena mikroskopická nádržka s přesně danou hloubkou, na jejímž dně jsou vyznačeny různě velké čtverce o definované ploše. Pod mikroskopem je možné počítat, kolik buněk se nachází v každém čtverci a ze znalostí rozměrů čtverce a hloubky nádržky je pak možné přepočítat počet buněk na jejich celkovou koncentraci. Pomůcky: Mikroskop, počítací komůrka, krycí sklíčko, kapátko. Postup: 1. Opatrně povolte šrouby na počítací komůrce a odsuňte držáky sklíčka stranou. 2. Do mininádržky kápněte malé množství buněčné suspenze. 3. Přikryjte krycím sklíčkem tak, aby nevznikly bubliny a přebytečná kapalina odtekla do přilehlých drážek. 4. Přisuňte držáky sklíčka a opatrně ale pevně je utáhněte. 5. Pozorujte pod mikroskopem při zvětšení 100x nebo 400x. Vyhodnocení: Spočítejte počet buněk nejméně v 10 čtvercích. Buňky, které přesahují z jednoho čtverce do druhého počítejte vždy jen na dvou sousedních stranách čtverce. Na volbě stran nezáleží, ale musí být dodržena v celém počítání. Z výsledků 10 čtverců vypočítejte aritmetický průměr a směrodatnou odchylku (nejlépe za pomocí počítače) a výsledek přepočítejte na skutečnou koncentraci buněk v suspenzi. Poznámky: 1. Počítací komůrka bývá hluboká „jen“ 0,1 mm, nicméně při 400násobném zvětšení se jedná o velkou hloubku. Aby bylo možné zaostřit jak na buňky, tak na čáry na dně, je nutné nastavit vysokou clonu světla. Intenzitu osvícení lze ještě ovlivnit regulačním potenciometrem, který je na mikroskopu vpravo dole. 2. Počítání v počítací komůrce je vhodné pro „větší“ buňky, jako jsou např. kvasinky či řasy. Pro bakterie se příliš nehodí, neboť většina bakterií je při zvětšení 400x bez
14
obarvení špatně viditelná, maximálně jako malé nezřetelné tečky. Vzhledem k tloušťce komůrky není možné použít zvětšení 1000x. 3. V kultuře kvasinek je i příměs bakterií, které se nepočítají. Rozpoznat malé bakteriální a velké kvasinkové buňky by neměl být problém. 4. Je-li počet buněk ve čtverci příliš velký tak, že je prakticky nemožné je přesně spočítat, je nutné kulturu příslušně zředit vodou nebo fyziologickým roztokem. V takovém případě ale dejte pozor na správný přepočet ředění na výslednou koncentraci.
5.5
VITÁLNÍ BARVENÍ KVASINEK
V technologických provozech využívajících kvasinky se používá k odhadu živé a mrtvé populace tzv. vitální barvení. Nejčastěji se barví methylenovou modří ve vhodném pufru (fosfátový pufr pH 4,6), ale lze použít i jiná barviva. Barvivem se obarví jen mrtvé buňky, u kterých se po smrti zvyšuje propustnost cytoplazmatické membrány. Živé buňky zůstanou neobarvené. Barvivo samotné je ale mírně toxické, proto je nutné obarvené buňky ihned pozorovat, jinak se zvýší podíl mrtvých buněk. Potřeby: Mikroskop, podložní a krycí sklíčko, slabý roztok methylenové modři v pufru, kapátko Postup: 1. Na podložní mikroskopické sklíčko naneste malou kapku suspenze kvasinek 2. Přikápněte malou kapku methylenové modři a přikryjte opatrně mikroskopickým sklíčkem 3. Pozorujte pod mikroskopem při zvětšení 100x-500x. Vyhodnocení: Spočítejte počet obarvených (mrtvých) a neobarvených (živých) buněk nejméně v 10 zorných polích mikroskopu. Pro každé zorné pole vypočítejte podíl mrtvých buněk v procentech a ze všech 10 polí pak aritmetický průměr a směrodatnou odchylku (nejlépe na počítači). Poznámky: 1. Ve směsi se pravděpodobně budou nacházet kromě kvasinek i bakterie s podstatně menšími buňkami. Bakterie nepočítejte. 2. Pokud narazíte na pučící kvasinku, počítejte ji jako jednu. 3. Dvě cca stejně velké byť neoddělené buňky už ale počítejte za dvě. 4. Pokud buňky tvoří pseudomycelium, počítá se každá dorostlá buňka. 5. Pro otestování obarvení se doporučuje nejprve obarvit pokusně usmrcenou kulturu kvasinek. Malou kapku kultury na podložním sklíčku protáhněte několikrát opatrně plamenem kahanu, čímž dojde k usmrcení buněk. Pak přikápněte methylenovou modř a pozorujte zabarvení buněk pod mikroskopem.
5.6 5.6.1
GRAMOVO BARVENÍ BAKTERIÍ ÚVOD
Různé barvící techniky jsou při mikroskopování hojně využívané. Jejich smyslem je zdůraznit některé struktury, popř. je odlišit od jiných struktur. Barvení podle Grama je procedura, kterou objevil v roce 1884 tým dánského vědce Hanse Christiana Grama a která umožňuje rozlišit grampozitivní a gramnegativní bakterie. V době
15
objevu nebylo známo mnoho o struktuře bakteriální stěny, nicméně Gramovo barvení se začalo používat jako jeden z diagnostických a taxonomických ukazatelů a používá se tak dodnes. Principem procedury je barvení usmrcené bakteriální kultury roztokem krystalové violetě a Lugolova roztoku2 a následné odbarvení působením organického rozpouštědla, např. ethanolu nebo acetonu. Grampozitivní bakterie zůstanou filaově obarvené i po působení organického rozpouštědla, zatímco gramnegativní se odbarví. Aby byly i odbarvené gramnegativní bakterie lépe pozorovatelné pod mikroskopem, dobarví se kultura nějakým světlejším barvivem, nejčastěji safraninem na červeno. Důvodem různého chování bakterií ke Gramovu barvení je rozdílná struktura buněčné stěny. Grampozitivní bakterie mají peptidoglykanovou vrstvu velice silnou (20-80 nm), navíc vyztuženou tzv. teichoovou kyselinou. Teichoová kyselina je tvořena polyglycerolfosfátem nebo polyribitolfosfátem navázaným na aminokyseliny nebo sacharidy peptidoglykanu. Teichoová kyselina může tvořit až 50% sušiny buněčné stěny. Na povrchu peptidoglykanové vrstvy mají grampozitivní bakterie navázané další polysacharidy složené zejména z monosacharidů glukózy, manózy a galaktózy. Struktura těchto polysacharidů je specifická pro různé taxonomické skupiny grampozitivních bakterií. Tyto polysacharidy jsou také první strukturou bakteriální buňky, na kterou reaguje imunitní systém při průniku bakterie do organismu vyšších živočichů. Gramnegativní bakterie mají ve srovnání s grampozitivními peptidoglykanovou vrstvu velice tenkou (1-3 nm) a bez teichoové kyseliny. Nad touto vrstvou mají ale ještě tzv. vnější membránu, která je složena zejména z fosfolipidů, bílkovin a lipopolysacharidů3. Tyto lipopolysacharidy představují opět první bakteriální strukturu, na kterou reaguje imunitní systém. Mezi peptidoglykanovou vrstvou a vnější membránou je tzv. periplazmatický prostor, ve kterém jsou mj. umístěny některé enzymy. Ve vnější membráně jsou poměrně časté póry tvořené bílkovinou porinem, které pronikají skrz periplazmatický prostor a peptidoglykanovou vrstvu až k cytoplazmatické membráně. Krystalová violeť i jod jsou nízkomolekulární látky, které snadno projdou buněčnou stěnou i cytoplazmatickou membránou mrtvé buňky. Uvnitř buňky pak spolu reagují za vzniku větších molekul, které už ale přes hustý peptidoglykan grampozitivních bakterií zpět neprojdou. Aplikace organického rozpouštědla vede k rozpuštění vnější lipidové membrány gramnegativních bakterií. Protože jejich peptidoglykan je řidší a slabší, vede tato operace naopak ke zvýšení propustnosti buněčné stěny a gramnegativní bakterie se tak odbarví.
5.6.2
POSTUP
Následující postup zopakujte několikrát pro vzorky grampozitivních i gramnegativních bakterií. 1. Vezměte podložní mikroskopické sklíčko a pomocí kličky na něj rozetřete malé množství bakteriální suspenze narostlé na agarové misce. 2. Kulturu vysušte nad plamenem a pak fixujte protažením v plameni. 3. Na fixovaný preparát kápněte kapku krystalové violeti, nechte působit cca 15-20 sekund a přebytečné barvivo slijte 4. Přikápněte kapku Lugolova roztoku, nechte působit 15-20 sekund a přebytečné barvivo slijte. 5. Opláchněte barvivo ethanolem a hned poté vodou. Přebytečnou vodu odcákněte. 6. Kápněte na vzorek roztok safraninu a nechte působit cca 1 minutu. 7. Opláchněte sklíčko vodou a vysušte nad kahanem. 8. Kápněte na obarvený preparát malou kapičku imerzního oleje a pozorujte při zvětšení 10x100. Poznámky: • Gramovo barvení vyžaduje poměrně přesnou práci a na první pokus se obvykle nepovede. V takovém případě nezoufejte a zkuste to znovu. • Nejčastější problémy bývají způsobené příliš hustou kulturou bakterií, příliš dlouhou fixací v plameni a příliš dlouhým odbarvováním ethanolem.a
2 3
Lugolův roztok je vodný roztok směsi jódu a iodidu draselného Lipopolysacharidy jsou tvořeny lipidy s navázaným polysacharidem
16
6
KULTIVAČNÍ STANOVENÍ POČTU HETEROTROFNÍCH MIKROORGANISMŮ V RŮZNÝCH PROSTŘEDÍCH
Principem metody je izolace (extrakce) mikroorganismů z prostředí, jejich zředění ve vhodném médiu a roztěr na agarovou misku s vhodným médiem. Při vhodném zředění vyroste z každé mikrobiální buňky jedna viditelná kolonie jejích klonů. Tyto kolonie je pak možné spočítat a přepočítat na počet mikroorganismů v původním vzorku. Touto metodou je možné stanovit pouze množství životaschopných mikroorganismů kultivovatelných na použitém médiu4. Výsledné číslo proto používá jednotku CFU (Colony Forming Units = Kolonie tvořící jednotky = KTJ). Použitím různých médií je možné selektivně stanovit jen některé mikroorganismy (např. houby, laktobacily apod.). V takovém případě se do média přidává nějaká látka (např. anitibiotikum), která inhibuje růst jiných mikroorganismů (negativní selekce). Na druhou stranu je možné limitovat např. jednu živinu (např. zdroj uhlíku či dusíku) pomocí substrátu, který umí využít jen omezená skupina mikroorganismů (pozitivní selekce). Použitím bohatého média je možné stanovit velké množství různých mikroorganismů. Izolace z konkrétního prostředí závisí na jeho vlastnostech. Posledním krokem metody je ale vždy roztěr extraktu na agarovou misku, kultivace a počítání narostlých kolonií.
6.1 6.1.1
ZÁKLADNÍ POUŽÍVANÉ PROCEDURY PROCEDURA 1.: ROZTĚR VZORKU NA AGAROVOU PLOTNU
Roztěr suspenze na agarovou misku je prováděn pomocí skleněné zahnuté tyčinky („hokejky“). Tu je třeba těsně před roztěrem desinfikovat namočením do ethanolu a ožehnutím plamenem (pozor na hořlavé věci v blízkosti!). Na jednu misku o průměru 10 cm se obvykle dávkuje 100 µl suspenze, kterou je poté třeba rozetřít po celé ploše misky. Miska musí být přiměřeně předsušená, na agaru by neměly být kapičky vody. Pomůcky: Skleněná hokejka, miska se ztuženým médiem, kádinka, pipeta, kahan Postup: 1. Sterilní pipetou naberte 100 µl bakteriální suspenze a kápněte do misky. Objem suspenze můžete „rozkapat“ na více míst na misce, budou se alespoň lépe roztírat. 2. Namočte skleněnou hokejku do kádinky s ethanolem a ožehněte nad plamenem. Takto vysterilovanou hokejkou rozetřete suspenzi po agaru, dokud se nevsákne poslední kapka. Mezi pipetováním a roztěrem by měla být co nejkratší prodleva, jinak se část suspenze vsákne do agaru v místě nakápnutí a výsledky budou zkreslené. 3. Přikryjte misku víčkem a inkubujte v zavěšené poloze (tj. agarem nahoru). Poznámky: • Při práci dodržujte maximální sterilitu. Pracujte v blízkosti kahanu, pracovní plochu před tím potřete ajatinem. Hokejku sterilujte těsně před použitím a sterilní ji nikam nepokládejte. Víčko misky odklopujte co nejméně jen na nezbytně nutnou dobu. 4
Odhaduje se, že současnými technikami je kultivovatelných jen cca 1% organismů, na selektivních médiích i daleko méně. I proto tradiční roztěrové metody ustupují novým metodám, jako např. odhad živé biomasy pomocí obsahu fosfolidivoých mastných kyselin.
17
6.1.2
PROCEDURA 2.: DESÍTKOVÉ ŘEDĚNÍ VZORKŮ
Vzhledem k tomu, že mikroorganismů bývá ve vzorku velmi mnoho, je potřeba před vlastním roztěrem provést příslušné zředění, aby počet narostlých kolonií byl počitatelný, dostatečně přesný a zároveň nedocházelo k vzájemnému negativnímu ovlivňování kolonií a tím pádem zkreslení výsledků. Počet narostlých kolonií by měl být v intervalu 30-300. K tomu se používá tzv. desítkové ředění. Jeho principem je postupné ředění suspenze vždy na 10x nižší koncentraci čistým fyziologickým roztokem. Pomůcky: Zkumavky, pipeta, fixa na sklo. Postup: 1. Připravte si 3 zkumavky a označte si je „10x“, „100x“ a „1000x“. 2. Do každé zkumavky napipetujte sterilní pipetou 4,5 ml sterilního fyziologického roztoku. 3. Do první zkumavky označené „10x“ napipetujte 0,5 ml buněčné suspenze získané extrakcí či stěrem testovaného materiálu. 4. Zkumavku promíchejte na vortexu. 5. Odeberte 0,5 ml 10x zředěné suspenze a napipetujte je do zkumavky s označením „100x“. 6. Zkumavku promíchejte na vortexu. 7. Odeberte 0,5 ml 100x zředěné suspenze a napipetujte je do zkumavky s označením „1000x“. 8. Zkumavku promíchejte na vortexu Poznámky: • Pracujte maximálně sterilně. Snažte se nedotknout pipetou žádného nesterilního povrchu. • Suspenzi nepipetujte ústy, použijte balónek.
6.2 6.2.1
POSTUPY POSTUP 1.: IZOLACE MIKROORGANISMŮ Z POVRCHŮ
Ke stanovení počtu bakterií na povrchu objektů se používá otěr sterilní buničinou namočenou ve fyziologickém roztoku. Tato buničina je pak důkladně proprána ve fyziologickém roztoku, který je po zředění rozetřen na agarovou misku. Pomůcky: Erlenmayerova baňka s 25 ml fyziologického roztoku, Erlenmayerova baňka s kousky buničiny, pinzeta, pravítko. Postup: 1. Vyhlédněte si vhodný povrch, ze kterého budete stěr provádět a vyměřte si ho. Rozměry by měly být řádově 10x10 cm. Rozměr může být i odlišný, ale měl by být přesně změřený. Výsledek pak bude vyjádřen v CFU / cm2. Pokud si vyberete objekt s členitým povrchem (např. kliku či záchodové prkénko), je vhodné ho setřít celý a výsledek vyjádřit v CFU / objekt. Rozměry objektu by mely být řádově srovnatelné s 10x10 cm. 2. Vybalte sterilní pinzetu z alobalu.
18
3. Pinzetou vytáhněte kousek buničiny. 4. Přiměřeně namočte kousek buničiny ve fyziologickém roztoku v Erlenmayerově baňce a důsledně setřete zvolený povrch. 5. Buničinu vhoďte do baňky s fyziologickým roztokem. 6. Body 3.-5. můžete několikrát opakovat s novými kousky buničiny, aby byl stěr úplný. 7. Erlenmayerovu baňku pořádně několikrát protřepejte a nechte několik minut stát, aby došlo k uvolnění setřených mikroorganismů. 8. Zřeďte extrakt 10x, 100x a 1000x (procedura 2.). 9. Rozetřete od každého ředění 100 µl na misku s PCA agarem (procedura 1.) a inkubujte v zavěšené poloze. Poznámky: • Pracujte maximálně sterilně. Sterilní pinzetu vybalte až na poslední chvíli, obě Erlenmayerovy baňky otvírejte jen na nezbytně nutnou dobu. • Namočená buničina by měla být jen vlhká a neměl by z ní kapat fyziologický roztok. • Buničiny se nedotýkejte rukou ale vždy jen pinzetou, aby nedošlo ke kontaminaci vzorku početnou mikrobiální kulturou z kůže ruky. • Všechny kousky buničiny z jednoho povrchu dávejte pochopitelně do jedné společné baňky.
6.2.2
POSTUP 2.: KULTIVAČNÍ STANOVENÍ MIKROORGANISMŮ V PŮDĚ
Principem metody je extrakce mikroorganismů do vhodné kapalné směsi (fosfátový pufr pH 7 + fyziologický roztok + neionogenní detergent TWEEN). Suspenze je pak zředěna a rozetřena na agarovou misku. Pomůcky: Erlenmayerova baňka, váhy, lžička, odměrný válec Postup: 1. Vzorek půdy homogenizujte (řádně promíchejte). 2. Odvažte cca 1 gram vzorku do Erlenmayerovy baňky (navážka nemusí být přesně 1 gram, ale je nutné znát skutečnou navážku pro pozdější přepočet). 3. Do baňky přidejte 50 ml fosfátového pufru a 50 ml fyziologického roztoku. 4. Zavřete baňku a půdu důkladně roztřepejte. Pokud jsou i po intenzivním třepání ve vzorku hrudky, rozdrťte je skleněnou tyčinkou sterilovanou ethanolem a ožehem. 5. Baňku nechte hodinu třepat na třepačce při 200 rpm. 6. Nechte půdu usadit na dně a odeberte 0,5 ml suspenze (pokud možno bez půdy) pro další ředění. 7. Zřeďte vzorek 10x, 100x a 1000x (procedura 2.). 8. Příslušná ředění rozetřete na misku s PCA agarem (procedura 1.) a inkubujte v zavěšené poloze. Poznámky: • Snažte se pracovat maximálně sterilně. Neotvírejte baňky na delší dobu než je nezbytně nutné. • Snažte se, aby Váš vzorek půdy byl homogenní. Zejména je třeba dát pozor na přítomnost velkých kamínků, kořenů apod., které pak zkreslují celkové výsledky.
19
6.2.3
POSTUP 3: MĚŘENÍ SPADU MIKROORGANISMŮ ZE VZDUCHU
K odhadu množství mikroorganismů ve vzduchu můžete použít spadovou metodu. Její princip je jednoduchý, v daném prostředí se nechá na jednom místě po definovaný čas ležet otevřená miska s vhodným médiem a po kultivaci se spočítají kolonie. Metoda není nijak přesná, záleží hodně na proudění vzduchu, počasí a dalších faktorech, nicméně dává jistý obraz o možné mikrobiální kontaminaci ze vzduchu. Pomůcky: Miska s agarovým médiem, hodinky. Postup: 1. Vyberte si vhodné prostředí, ve kterém budete měřit spad mikroorganismů. 2. Umístěte na vhodné místo misku s agarem a odklopte ji. 3. Po uplynutí daného času misku přiklopte a inkubujte v zavěšené poloze. Poznámky: • Čas můžete volit různě, od několika minut až po hodinu. V prašném prostředí stačí kratší čas, v klidném a čistém prostředí je potřeba delší.
6.2.4 • •
6.3
POZNÁMKY KE VŠEM POSTUPŮM Snažte si vždy pracovat maximálně sterilně. Při vysokých ředěních může kontaminace značně zkreslit výsledky. Neleňte a všechny zkumavky, baňky a misky si řádně označte, popř. i jménem a datem. Snižujete tím riziko záměny vzorků.
VYHODNOCENÍ VÝSLEDKŮ
Získané hodnoty CFU je vždy nutné přepočítat na výchozí materiál či objekt. K tomu je nutné znát přesné rozměry resp. navážky vzorků. Postup: 1. Vyberte misku, na které je nárůst kolonií v intervalu 30-300. 2. Spočítejte narostlé kolonie. 3. Vynásobte číslo příslušným zředěním a pak ještě 10x (protože pipetujete jen 0,1 ml suspenze na misku), čímž dostanete počet mikroorganismů v suspenzi v jednotkách CFU / ml. 4. Vynásobte tento údaj původním objemem suspenze v ml a vydělte navážkou resp. plochou vzorku. Tím dostanete kýžený údaj v CFU/g resp. v CFU/cm2. Poznámky: • Každý vzorek by se měl správně pro každé ředění rozetřít 2x-3x a výsledek statisticky zhodnotit. Kapacita laboratoře ale pro dvoj- až trojnásobné navýšení počtu vzorků nestačí. • Výsledky spadu vyjadřujte jako CFU/hod/cm2.
20
7 7.1
VLIV VNĚJŠÍCH PODMÍNEK NA MIKROORGANISMY VLIV ANTIBIOTIK NA RŮST BAKTERIÍ
Antibiotika představují chemicky nesourodou skupinu látek přírodního i umělého původu, jejichž společným znakem je, že mají negativní účinek na bakterie a zároveň slabší účinek na vyšší organismy. Mohou se proto používat mj. jako léčiva nebo činidla zabraňující nežádoucímu růstu mikroorganismů. Různá antibiotika působí na bakterie různým mechanismem, obvykle inhibují nějakou životně důležitou činnost např. transkripci (ansamyciny), translaci (tetracyklin), syntézu buněčné stěny (penicilin), zvyšují propustnost buněčné membrány (polymyxiny) atd. Působí-li určité antibiotikum na konkrétní bakteriální kmen, nazýváme tento kmen citlivým na dané antibiotikum. Nemá-li antibiotikum vliv na daný kmen, hovoříme o tom, že je tzv. rezistentní na dané antibiotikum. Rezistence může být buď aktivní, kdy bakteriální kmen produkuje enzymy rozkládající antibiotikum, nebo pasivní, kdy kmen má cílové místo působení antibiotika změněné tak, že toto se nemůže navázat a negativně působit. Aktivní rezistence bývá často kódována na plazmidech a může se konjugací přenášet i na další bakteriální kmeny, i nepříbuzné.
7.1.1
POSTUP
Následující postup zopakujte 2x pro dva vzorky bakterií. 1. Na misku s PCA agarem rozetřete hokejkou 100 µl bakteriální suspenze. 2. Na různá místa dostatečně daleko od sebe umístěte pinzetou papírové disky s různými antibiotiky 3. Inkubujte misku agarem dospodu
7.1.2
VYHODNOCENÍ
Po několika dnech kultivace vyhodnoťte vliv antibiotik na nárůst bakterie. Je-li kmen citlivý na působení antibiotika, nenarostou v okolí disku žádné bakterie. Je-li kmen rezistentní, budou bakterie růst i v těsném okolí antibiotického disku. Do protokolu shrňte výsledky do tabulky, ve které u každého antibiotika a bakteriálního kmenu označte působení pomocí znamének „+“ (citlivý kmen) a „-“ (rezistentní kmen).
7.2
VLIV OSMOTICKÉ HLADINY NA RŮST MIKROORGANISMŮ
Osmotickou hladinou se rozumí koncentrace rozpuštěných látek v prostředí a má významný vliv na růst mikroorganismů. Ocitne-li se buňka v prostředí, ve kterém je koncentrace rozpuštěných látek jiná než uvnitř buňky, dochází k samovolným procesům směřujícím k rovnovážnému stavu, tedy vyrovnání obou koncentrací. Protože ale většina rozpuštěných látek (zejména iontů) přes membránu samovolně projít nemůže, vyrovnávají se koncentrace přesunem vody. V hypotonickém prostředí, kde je koncentrace rozpuštěných látek nižší, dochází k přesunu vody do buňky a k jejímu bobtnání, popř. až k prasknutí. Pevná buněčná stěna takovémuto bobtnání brání a v buňce je pak permanentní osmotický tlak, který tlačí cytoplazmatickou membránu na buněčnou stěnu. Je třeba dodat, že i tato mechanická ochrana má svůj limit a v extrémně hypotonickém prostředí dochází k praskání i u buněk s pevnou stěnou. V hypertonickém prostředí je koncentrace rozpuštěných látek vyšší a dochází k odvodňování buňky a jejímu smrštění. Proti hypertonickému prostředí buněčná stěna nijak nechrání a organismy žijící v takových prostředích používají jiné způsoby ochrany.
21
Vliv osmotické hladiny budeme testovat na miskách s LB médiem s koncentrační řadou chloridu sodného. Do každé misky zaočkujte dva mikroorganismy a sledujte, zda na něm rostou či ne.
7.2.1
POSTUP
1. Čtyři připravené misky s LB médiem a koncentrační řadou NaCl (0 – 10 – 20 – 30 g/l) si řádně popište a fixou rozdělte na dvě poloviny. 2. Do každé poloviny každé misky zaočkujte jeden zadaný mikroorganismus 3. Misky uzavřete a dejte inkubovat
7.2.2
VYHODNOCENÍ
Po kultivaci vyhodnoťte nárůst při jednotlivých koncentracích NaCl a výsledky vyneste do tabulky s označím + (roste) či – (neroste). Na závěr vymezte interval koncentrace NaCl, který je pro daný mikroorganismus vhodný.
7.3
VLIV TEPLOTY NA ŽIVOTASCHOPNOST MIKROORGANISMŮ
Teplota ovlivňuje výrazně životaschopnost i fyziologii mikroorganismů. Vyšší teploty působí zpravidla negativně, denaturují bílkoviny, poškozují membrány a v konečném důsledku mikroorganismy hubí. Cílem práce je najít závislost mezi životaschopností mikroorganismu, teplotou a dobou působení.
7.3.1
POSTUP
1. Agarovou misku si fixou rozdělte na 6 výsečí a každou označte příslušným časem. 2. Do sady 6 zkumavek napipetujte po 2 ml suspenze mikroorganismu. 3. Zahřívejte zkumavky na vodní lázni, každou zkumavky jiný zadaný čas. K času přidejte 1 minutu navíc na vytemperování. 4. Po skončení intervalu zkumavku vyjměte a ihned zaočkujte kulturu na agarovou misku. 5. Kultivujte v inkubátoru v zavěšené poloze.
7.4
VLIV ULTRAFIALOVÉHO ZÁŘENÍ NA RŮST MIKROORGANISMŮ
Ultrafialové záření působí na mikroorganismy obvykle letálně. Příčinou je silná absorbance UV záření některými biogenními molekulami, zejména nukleovými kyselinami a bílkovinami. Silné dávky UV záření se používají pro usmrcování mikroorganismů. Cílem práce je hledání doby působení UV záření, který způsobí kompletní usmrcení všech mikroorganismů. Princip spočívá v tom, že se kultura na misce ozáří UV zářením, část plochy se ale pokryje alobalem. UV záření přes alobal neprochází a proto pod ním mikroorganismy vyrostou i při letální dávce UV záření.
7.4.1
POSTUP
1. Připravte si tři čisté Petriho misky a jednu prázdnou. 2. Vytemperovanou kulturu mikroorganismu v kapalném médiu s agarem rozlijte na misky.
22
3. Vystřihněte z alobalu několik menších koleček a sterilní pinzetou jimi přikryjte několik míst na misce. Kolečka by měla pokrývat cca polovinu plochy misky. 4. Vložte misku pod germicidní lampu, odklopte víčko a ozařujte po stanovený čas (1-510 minut). 5. Přikryjte znovu misku a dejte inkubovat v zavěšené poloze.
7.4.2
VYHODNOCENÍ
Po kultivaci sundejte pinzetou alobalovou masku a porovnejte rozdíl v nárůstu pod vlivem UV záření a bez tohoto vlivu.
23
8
RŮSTOVÁ KŘIVKA MIKROORGANISMŮ
Růstová křivka mikroorganismů představuje grafické znázornění závislosti buněčné koncentrace na čase. Její tvar je závislý na kultivovaném mikroorganismu, složení média a vnějších podmínkách (teplota, obsah kyslíku apod.). Růstová křivka má čtyři hlavní fáze: 1) Lag-fáze. V této fázi se množství buněk s časem nemění, kultura neroste. Mikroorganismy se adaptují na nové prostředí a připravují se na dělení. 2) Exponenciální fáze. V této fázi se buňky rozmnožují geometrickou řadou a buněčná koncentrace se v pravidelných intervalech zdvojnásobuje. Tento interval nazýváme dobou zdvojení nebo též generační dobou a představuje důležitou charakteristiku organismu při definovaných podmínkách. Za optimálních podmínek mohou bakterie dosáhnout generační doby i pod 30 minut. 3) Stacionární fáze. V této fázi už nedochází k celkovému růstu buněčné koncentrace. Některé buňky se sice ještě dělí, jiné ale hynou a lyzují a oba procesy jsou v rovnováze. Stacionární fáze nastává obvykle z důvodu vyčerpání živin nebo nakumulování toxických koncentrací zplodin organismu. 4) Fáze odumírání. V této fázi buněčná koncentrace klesá; většina buněk postupně hyne. Tyto základní fáze jsou propojeny přechodovými fázemi, fází zrychlujícího se růstu, fází zpomalujícího se růstu a fází zrychlujícího se odumírání. Mezi nejdůležitější údaje zjišťované z růstové křivky patří délka lag-fáze a generační doba v exponenciální fázi. Koncentraci buněk v médiu je možné určovat mnoha způsoby. Nejčastěji se ale používá turbidimetrické stanovení, které je založeno na rozptylu světla. Zařízení k jeho měření se nazývá spektrofotometr a má bohaté využití nejen v mikrobiologii, ale zejména v analytické chemii. Principem stanovení je ozáření vzorku v kyvetě světlem o určité vlnové délce, přičemž některé paprsky se na buňkách rozptýlí mimo optickou dráhu. Detektor pak zaznamená intenzitu světla, které prošlo kyvetou bez rozptýlení. Z poměru intenzity světla které do vzorku vchází a které je detektorem zaznamenáno se vypočítá tzv. optická densita (OD) a ta je v intervalu 0-1 přímo úměrná buněčné koncentraci. I OD = log in , kde I představuje intenzitu vstupujícího resp. vystupujícího světla. I out Při OD vyšším než cca 1 už není závislost lineární a vzorek je třeba před měřením zředit tak, aby OD bylo v intervalu 0-1.
8.1
POSTUP PRÁCE
Vzhledem k tomu, že laboratorní cvičení trvají jen dvě vyučovací hodiny a růstovou křivku je třeba měřit déle, bude jednu křivku měřit několik skupin studentů ve cvičeních po sobě. Práce bude probíhat ve skupinách 2-4 studentů, každá skupina bude měřit dvě křivky jednoho mikroorganismu s různými podmínkami růstu. Podmínky je třeba si dobře zapsat, protože každá skupina bude mít jiné. Závěrem protokolu bude konstatování, které podmínky vyhovují organismu lépe.
8.1.1
ZAOČKOVÁNÍ BUNĚK DO KAPALNÉHO MÉDIA
Buňky už budou zaočkovány před začátkem laboratorních cvičení z pevného média.
24
8.1.2
KULTIVACE MIKROORGANISMŮ
Kultivace mikroorganismů bude probíhat na vzduchové třepačce při zadané teplotě a otáčkách třepání. Třepání je důležité pro správné provzdušnění bakteriální suspenze. Jelikož při odběrech je třeba třepačku zastavit, snažte se o co nejkratší prodlevy v třepání, aby mikroorganismy netrpěly nedostatkem kyslíku.
8.1.3
MĚŘENÍ HUSTOTY BUNĚČNÉ KONCENTRACE
Buněčná koncentrace bude měřena turbidimetricky na přístroji Spekol při vlnové délce 600 nm. Odběr vzorku pro měření bude prováděn v intervalu cca 30 minut. Interval nemusí být úplně na minutu přesný, ale při každém odběru je třeba zapsat přesný čas odběru (s přesností na minuty). 1. Zvedněte víko třepačky, která se tím zastaví. 2. Vytáhněte své baňky a víko opět přiklopte. 3. Z baňky odeberte pipetou 2 ml suspenze do kyvety. 4. Vložte kyvetu do spektrofotometru (pozor na správnou orientaci) a změřte optickou densitu při 600 nm. 5. Zapište naměřené výsledky do protokolu. 6. Vyjměte kyvetu a vylijte suspenzi do připravené nádoby na odpad (ne do výlevky!) 7. Vypláchněte kyvetu vodou. 8. Opakujte kroky 3-7 pro druhou suspenzi. 9. Vraťte baňky na třepačku a čekejte na další interval.
8.1.4 • • • • •
8.2
POZNÁMKY Protokol si neodnášejte, aby do něj mohly zapisovat i další skupiny. Po skončení práce poslední skupiny si vyzvedněte kopii, abyste mohli vypracovat protokol. Pokud naměřená OD překročí hodnotu 1, pipetujte nadále už jen 1 ml a připipetujte 1 ml vody. Tím se suspenze zředí 2x; změřenou hodnotu OD pak vynásobte dvěma a zapište do protokolu. Pokud někde ukápnete buněčnou suspenzi, ostříkněte jí ajatinem a setřete buničinou. Změřené vzorky nevracejte zpět do baněk ani je nevylévejte do výlevky. Použijte speciální nádobu s desinfekčním roztokem. Mikroorganismy, které budete používat, nejsou patogenní. Přesto pracujte v rukavicích a zabraňte styku bakteriální suspenze s kůží, očima či ústy. Pokud si potřísníte ruce buněčnou suspenzí, umyjte si je důkladně vodou a mýdlem.
VYHODNOCENÍ VÝSLEDKŮ
Naměřená data vyhodnoťte tímto způsobem: • Zpracujte tabulku, ve které budou všechna primární data (čas odběru, OD, ředění) i přepočítaná data (čas od začátku, OD násobené ředěním). • Vytvořte graf růstové křivky (pokud ho budete dělat v Excelu, pak použijte X-Y bodový graf, ne spojnicový, který nemá reálnou osu X!). • Vypočítejte délku jednotlivých fází. • Vypočítejte generační dobu bakterií v exponenciální fázi. Generační dobu vypočítejte z této rovnice:
OD = OD0 2
25
t g
kde OD je optická densita na konci exponenciální fáze, OD0 je optická densita na začátku exponenciální fáze, t je uplynulý čas a g je generační doba.
26
9
ZADÁNÍ JEDNOTLIVÝCH ÚLOH
Následující kapitola shrnuje zasání jednotlivých úloh, které se v rámci cvičení z mikrobiologie budou dělat. Zadání obsahuje vždy určitý úkol, odkaz na kapitolu, ve které jsou uvedeny konkrétní procedury a postupy, a požadavky na protokol. Protokol se vztahuje vždy ke konkrétní úloze, tj. děláte-li více úloh za den, odevzdáte více protokolů.
9.1
OČKOVÁNÍ MIKROORGANISMŮ
Zadání: Každá pracovní skupina si přeočkuje ze zásobních misek požadované organismy na vlastní misky a nechá je nakultivovat. Postupy: 4 Poznámky: Misky si pečlivě označte (organismus, pracovní skupina, datum očkování) abyste je později našli i mezi miskami ostatních. Protokol: žádný.
9.2
VLIV ANTIBIOTIK NA RŮST BAKTERIÍ
Zadání: Otestujte vliv antibiotik na růst bakterií. Antibiotika i bakteriální druhy budou zadány až na cvičení. Postupy: 7.1 Poznámky: Misky si pečlivě označte (organismus, pracovní skupina, datum očkování) abyste je později našli i mezi miskami ostatních. Protokol: Do protokolu uveďte: • Zadané druhy mikroorganismů a antibiotik • Popis vzhledu kultury na misce po kultivaci • Slovní závěr (bakterie XXX je/není citlivá na antibiotikum YYY).
9.3
GRAMOVO BARVENÍ MIKROORGANISMŮ
Zadání: Gramovým barvením obarvěte jednu grampozitivní a jednu gramnegativní bakterii jako standard a pozorujte pod mikroskopem. Poté obarvěte zadanou neznámou bakterii a určete, zda se jedná o grampozitivní či gramnegativní druh. Postupy: 5.6 Protokol: Do protokolu uveďte: • Které mikroorganismy jste barvili (u neznámého vzorku uveďte číslo) • Co jste viděli (barvu, tvar a velikost buněk, shluky apod.) • Jak jste určili neznámý vzorek.
9.4
KULTIVAČNÍ STANOVENÍ POČTU MIKROORGANISMŮ V RŮZNÝCH PROSTŘEDÍCH
Zadání: Kultivačním způsobem určete množství mikroorganismů ve vzorku půdy a na vybrané ploše, a množství spadaných mikroorganismů ze vzduchu na vybraném místě. Postupy:6 Poznámka: Vzorek půdy si přineste vlastní, odebraný max. několik dní před stanovením a uchovávaný po tu dobu v lednici. Protokol: Do protokolu uveďte: • Charakteristiku vzorků (místo odběru, okolí, u půdy i okolní flóru, hloubku apod.) • Kvantitativní údaje (navážku půdy, plochu stěru, dobu expozice spadu ze vzduchu atd.).
27
• • •
9.5
Počty narostlých kolonií po kultivaci Detailní přepočet primárních dat na konečné jednotkové údaje (u půdy CFU/g, u stěru CFU/cm2, u spadu CFU/cm2/hod). Slovní závěr (Ve vzorku AAA jsme určili…..).
RŮSTOVÁ KŘIVKA MIKROORGANISMŮ
Zadání: Změřte (spolupracujte na změření) a vyhodnoťte růstovou křivku zadané bakterie za dvou různých kultivačních podmínek. Postupy: 8 Poznámky: Mostečtí studenti mající laboratoře v bloku změří celé křivky. Ústečtí studenti vzhledem k pouze nedostatečným dvěma hodinám cvičení budou měřit růstové křivky ve spolupráci s dalšími skupinami (budou na sebe navazovat). Protokoly vytvoří každá skupina zvlášť. Protokol: Do protokolu uveďte: • Zadaný mikroorganismus a podmínky kultivace • Tabulku primárních dat (čas odběru, nárůst buněk, případné poznámky o ředění vzorků). • Grafické znázornění křivek (v jednom grafu obě křivky) • Odečet délky jednotlivých fází, detailní výpočet generační doby v exponenciální fázi růstu • Slovní zhodnocení (vypočítaná data a zhodnocení podmínek kultivace).
9.6
VLIV VNĚJŠÍCH PODMÍNEK NA MIKROORGANISMY
Zadání: Naměřte vliv několika faktorů na životaschopnost vybraných mikroorganismů. Konkrétní faktory i mikroorganismy vám budou zadány na cvičení. Postupy:7 Protokol: Do protokolu uveďte: • Zadané faktory a mikroorganismy • Charakteristiku expozice (intenzita, délka trvání, dávka apod.) • Případné výpočty • Slovní zhodnocení výsledků
9.7
HODNOCENÍ KULTURY KVASINEK POMOCÍ POČÍTACÍ KOMŮRKY
Zadání: U zadaného vzorku kvasinek určete buněčnou koncentraci a podíl živých a mrtvých buněků. Postupy:5.4, 5.5 Protokol: Do protokolu uveďte: • Zadaný vzorek • Primární data (údaje z 10 čtverců a 10 zorných polí) • Přepočet výsledků včetně statistického zhodnocení • Slovní závěr
28
10 POUŽITÁ MÉDIA A ROZTOKY 10.1 KULTIVAČNÍ MÉDIA 10.1.1 LB (LURIA BROTH) Bohaté médium pro kultivaci bakterií. Trypton 10 g/l Yeast extract 5 g/l NaCl 10 g/l pH se upravuje před autoklávováním na cca 7,2 ± 0,2.
10.1.2 PLATE COUNT AGAR (PCA) Bohaté médium využívané ve ztužené podobě při kultivačních stanoveních heterotrofních mikroorganismů. Trypton Yeast extract Glukóza pH se upravuje na 7,0 ± 0,2.
5 g/l 2,5 g/l 1 g/l
10.1.3 MALT EXTRACT Bohaté médium vhodné pro kultivaci mikroskopických hub. Malt extract pH se upravuje na 7,2 ± 0,2.
20 g/l
10.1.4 ŠKROBOVÝ AGAR Ve ztužené podobě (s přídavkem 10 g/l agaru) se používá pro kultivaci amylolytických bakterií, např. bacilů. Trypton Yeast extract Glukóza Škrob pH se upravuje na 7,0 ± 0,2.
5 g/l 2,5 g/l 1 g/l 10 g/l
10.2 ROZTOKY 10.2.1 FYZIOLOGICKÝ ROZTOK Chlorid sodný
10 g/l
10.2.2 FOSFÁTOVÝ PUFR 0,066 M PH 7 Roztok A: Na2HPO4.12H2O 23,637 g/l Roztok B: KH2PO4 8,98 g/l Do 500 ml odměrné baňky se odměří 306 ml roztoku A a dolije se roztokem B po rysku. Jiným poměrem roztoků A a B lze dosáhnout jiného pH.
29
10.3 BARVIVA 10.3.1 KRYSTALOVÁ VIOLEŤ Roztok A: Krystalová violeť v 96% ethanolu 25 g/l Roztok B: Štavelan amonný ve vodě 10 g/l Smíchá se 20 ml roztoku A a 80 ml roztoku B, zfiltruje se.
10.3.2 SAFRANIN Safranin Po rozpuštění se roztok zfiltruje.
2,5 g/l
10.3.3 METHYLENOVÁ MODŘ Methylenová modř 0,3 g 96% etanol 30 ml Voda 100 ml Barvivo se rozpustí v etanolu, přidá se destilovaná voda a nakonec se zfiltruje.
10.3.4 LUGOLŮV ROZTOK Jód Jodid draselný Voda
1g 2g 300 ml
30
11 PŘÍLOHY Vzorový protokol Jméno: Dřevák Patlák Skupina: Ústí n.L. sudý čtvrtek 10:00 Datum práce: 1.11.2007 Cíl práce: Určení buněčné koncentrace kvasinek Saccharomyces cerevisiae, určení podílu živých buněk ve vzorku vitálním barvením. Princip práce: V počítací komůrce se v deseti komůrkách o definovaném objemu spočítá průměrný počet buněk a přepočítá na počet v 1 ml. Methylenová modř obarví jen mrtvé buňky, poměr mezi živými a mrtvými se pak spočítá v 10 vizuálních polích mikroskopu. Výsledky: 1. Počítání kvasinek v počítací komůrce zvětšení 10x10, čtverec 0,04 mm2, hloubka 0,1 mm Počet
Čtverec 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Průměr. Sm.odchylka.
46 53 72 41 58 35 62 43 42 54 50,6 10,7
Počet na ml 1,2E+07 1,3E+07 1,8E+07 1,0E+07 1,5E+07 8,8E+06 1,6E+07 1,1E+07 1,1E+07 1,4E+07 1,3E+07 2,7E+06
Přepočet buněk ve čtverci na počet v ml probíhal následovně: Objem jedné komůrky je 0,04x0,1 = 0,004 mm3. V 1 ml je 1000 / 0,004 = 250 000 komůrek. Touto hodnotou je třeba násobit množství buněk v komůrce na počet buněk v 1 ml. 2. Určení podílu mrtvých buněk ve vzorku zvětšení 10x40, obarveno methylenovou modří Zorné pole 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Průměr. Sm.odchylka.
Živé (světlé) Mrtvé (modré) Podíl mrtvých 23 3 11,54% 41 5 10,87% 9 1 10,00% 16 2 11,11% 34 2 5,56% 27 1 3,57% 30 3 9,09% 22 1 4,35% 5 0 0,00% 9 1 10,00% 7,6% 3,8%
Závěr: V testovaném vzorku bylo 1,3.107±0,3.107 buněk na ml, podíl mrtvých buněk činil 7,6±3,8%.
31
Růstová křivka mikroorganismů – naměřená data Datum: Zúčastnění studenti (jména, kontakty):
Čísla vzorků a podmínky měření:
Čas měření
Vzorek 1: OD
Poznámka
32
Vzorek 2: OD
Poznámka
