Molekuláris biológiai technikák Wunderlich, Lívius

Molekuláris biológiai technikák Wunderlich, Lívius

Created by XMLmind XSL-FO Converter.

Molekuláris biológiai technikák Wunderlich, Lívius Szerzői jog © 2014 Wunderlich Lívius, Budapesti Műszaki és Gazdaságtudományi Egyetem, Semmelweis Egyetem

Created by XMLmind XSL-FO Converter.

Tartalom Molekuláris biológiai technikák ....................................................................................................... xii Előszó .............................................................................................................................................. xiii 1. Történeti áttekintés ......................................................................................................................... 1 1. 1.1. A molekuláris biológia története .................................................................................... 1 2. A molekuláris biológia objektumai, összefüggései, kísérleti tervezés .......................................... 17 1. 2.1. A molekuláris biológia objektumai .............................................................................. 17 1.1. 2.1.1. Szénhidrátok ................................................................................................. 17 1.2. 2.1.2. Lipidek .......................................................................................................... 18 1.3. 2.1.3. Fehérjék ........................................................................................................ 19 1.4. 2.1.4. Nukleotidok, nukleinsavak ........................................................................... 20 2. 2.2. A molekuláris biológia összefüggései .......................................................................... 22 2.1. 2.2.1. Sejtek ............................................................................................................ 22 2.2. 2.2.2. Makromolekulák keletkezése ....................................................................... 24 2.3. 2.2.3. Határtudományok ......................................................................................... 25 3. 2.3. Kísérleti tervezés .......................................................................................................... 26 3. Elválasztási technikák ................................................................................................................... 28 1. 3.1. Szűrés, koncentrálás ..................................................................................................... 28 2. 3.2. Centrifugálás ................................................................................................................ 30 3. 3.3. Kromatográfia .............................................................................................................. 34 3.1. 3.3.1. Kizárásos kromatográfia ............................................................................... 35 3.2. 3.3.2. Adszorpciós kromatográfia ........................................................................... 35 3.3. 3.3.3. Megoszlási kromatográfia ............................................................................ 36 3.4. 3.3.4. Ioncserés kromatográfia ................................................................................ 37 3.5. 3.3.5. Affinitás kromatográfia ................................................................................ 37 4. 3.4. Gélelektroforézis .......................................................................................................... 38 4.1. 3.4.1. Agaróz gélelektroforézis ............................................................................... 38 4.2. 3.4.2. Pulzáló erőterű gélelektroforézis .................................................................. 41 4.3. 3.4.3. Poliakrilamid gélelektroforézis (PAGE) ....................................................... 41 4.4. 3.4.4. Kétdimenziós (2D) gélelektroforézis ............................................................ 45 5. 3.5. Kapilláris elektroforézis ............................................................................................... 46 4. Sejttenyészetek fenntartása, manipulálása .................................................................................... 48 1. 4.1. Baktériumok ................................................................................................................. 48 1.1. 4.1.1. Baktériumok tenyésztése .............................................................................. 48 1.2. 4.1.2. Baktériumok transzformálása ....................................................................... 49 2. 4.2. Élesztőgombák ............................................................................................................. 50 2.1. 4.2.1. Élesztőgomba tenyésztése ............................................................................ 50 2.2. 4.2.2. Élesztő transzformálása ................................................................................ 51 3. 4.3. Sejtkultúra állatokból ................................................................................................... 51 3.1. 4.3.1. Állati sejtek tenyésztése ................................................................................ 52 3.2. 4.3.2. Állati sejtek transzfektálása .......................................................................... 54 4. 4.4. Növényi sejtkultúra ...................................................................................................... 54 4.1. 4.4.1. Transzgének növényi sejtekbe juttatása ........................................................ 54 5. 4.5. Vírusok ......................................................................................................................... 55 5. DNS-, RNS-, fehérjeizolálási technikák ....................................................................................... 56 1. 5.1. Nukleinsavak izolálása ................................................................................................. 56 1.1. 5.1.1. Genomi DNS-izolálás ................................................................................... 58 1.2. 5.1.2. Plazmid izolálás ............................................................................................ 59 1.3. 5.1.3. DNS-fragment izolálása ................................................................................ 60 1.3.1. 5.1.3.1. Elektroelúció ................................................................................. 60 1.3.2. 5.1.3.2. Alacsony olvadáspontú (low melting point) agaróz alkalmazása .. 60 1.3.3. 5.1.3.3. Olvasztás kaotróp sókkal ............................................................... 61 1.3.4. 5.1.3.4. Préselés a gélből ............................................................................ 61 1.4. 5.1.4. RNS-izolálás ................................................................................................. 61 2. 5.2. Fehérjék izolálása ......................................................................................................... 62 6. Nukleinsav-módosító enzimek ..................................................................................................... 63 1. 6.1. Polimerázok ................................................................................................................. 63

iii Created by XMLmind XSL-FO Converter.

Molekuláris biológiai technikák

1.1. 6.1.1. DNS-polimeráz ............................................................................................. 63 1.2. 6.1.2. RNS-polimeráz ............................................................................................. 66 2. 6.2. Nukleázok .................................................................................................................... 67 2.1. 6.2.1. Dezoxiribonukleázok .................................................................................... 67 2.1.1. 6.2.1.1. Aspecifikus DN-ázok .................................................................... 67 2.1.2. 6.2.1.2. Restrikciós endonukleázok ............................................................ 68 2.2. 6.2.2. Ribonukleázok .............................................................................................. 70 3. 6.3. Ligázok ......................................................................................................................... 70 4. 6.4. Másodlagos DNS-módosító enzimek ........................................................................... 70 4.1. 6.4.1. Alkalikus foszfatázok ................................................................................... 71 4.2. 6.4.2. Polinukleotid-kináz ....................................................................................... 71 4.3. 6.4.3. Metilázok ...................................................................................................... 71 5. 6.5. Térszerkezet-módosító enzimek ................................................................................... 71 5.1. 6.5.1. Helikázok ...................................................................................................... 71 5.2. 6.5.2. Topoizomerázok ........................................................................................... 71 7. Polimeráz láncreakció ................................................................................................................... 73 1. 7.1. A PCR elve ................................................................................................................... 73 2. 7.2. Exponenciális szaporodás ............................................................................................ 75 3. 7.3. A reakcióelegy összetétele ........................................................................................... 76 4. 7.4. Primerek tervezése ....................................................................................................... 76 5. 7.5. A PCR alkalmazási területei, feltételei ......................................................................... 77 6. 7.6. Hőstabil polimerázok ................................................................................................... 77 7. 7.7. A PCR-reakció specifitása ........................................................................................... 78 8. 7.8. Extra szakaszok beépítése ............................................................................................ 78 9. 7.9. Pontmutációk vizsgálata hagyományos PCR-rel .......................................................... 79 10. 7.10. Degenerált PCR, multiplex PCR .............................................................................. 80 11. 7.11. Kvantitatív mérések PCR-rel ................................................................................... 80 12. 7.12. Kvantitatív mérések real-time PCR-rel .................................................................... 81 13. 7.13. Pontmutáció kimutatása real-time PCR-rel .............................................................. 84 8. Szekvenciameghatározás .............................................................................................................. 86 1. 8.1. DNS-szekvenálás ......................................................................................................... 86 1.1. 8.1.1. A Sanger-féle lánctermináción alapuló DNS-szekvenálás ........................... 86 1.2. 8.1.2. Új generációs szekvenálás ............................................................................ 92 2. 8.2. Fehérjeszekvenálás ....................................................................................................... 92 2.1. 8.2.1. Szekvenálás Edman-degradációval ............................................................... 92 2.2. 8.2.2. Szekvenálás tömegspektrométerrel ............................................................... 93 9. Hibridizációs technikák ................................................................................................................ 95 1. 9.1. Southern-blot ................................................................................................................ 95 2. 9.2. Northern blot ................................................................................................................ 96 3. 9.3. Dot blot és slot blot ...................................................................................................... 97 4. 9.4. Nuclease-protection assay ............................................................................................ 98 5. 9.5. DNS-chip (DNA-microarray) ...................................................................................... 99 6. 9.6. Kolónia hibridizáció ................................................................................................... 102 7. 9.7. Fluoreszcens in situ hibridizáció (FISH) .................................................................... 102 10. Vektorok ................................................................................................................................... 104 1. 10.1. Plazmidok ................................................................................................................. 104 1.1. 10.1.1. pBR322 ..................................................................................................... 104 1.2. 10.1.2.Antibiotikumok, rezisztencia ..................................................................... 105 2. 10.2. Bakteriofágok ........................................................................................................... 105 2.1. 10.2.1. λ-fág .......................................................................................................... 105 2.2. 10.2.2. M13 fág ..................................................................................................... 106 3. 10.3. Kék-fehér szelekció .................................................................................................. 107 3.1. 10.3.1. pUC18/19 .................................................................................................. 109 4. 10.4. Vektorok in vitro transzkripcióhoz ........................................................................... 110 5. 10.5. Fágemid vektorok ..................................................................................................... 110 5.1. 10.5.1. pBluescript ................................................................................................ 111 6. 10.6. Kozmidok ................................................................................................................. 111 7. 10.7. Mesterséges kromoszómák ...................................................................................... 113 7.1. 10.7.1. YAC .......................................................................................................... 113 7.2. 10.7.2. BAC .......................................................................................................... 113 iv Created by XMLmind XSL-FO Converter.


7.3. 10.7.3. HAC .......................................................................................................... 8. 10.8. Virális vektorok ........................................................................................................ 11. Klónozás, nukleinsav-könyvtárak ............................................................................................. 1. 11.1. Klónozás restrikciós enzimekkel .............................................................................. 2. 11.2. Ligáz nélküli klónozások ......................................................................................... 2.1. 11.2.1. USER technológia .................................................................................... 2.2. 11.2.2. Háromnukleotidos technológia ................................................................. 2.3. 11.2.3.TOPO-klónozás ......................................................................................... 2.4. 11.2.4. Rekombinációs klónozás .......................................................................... 3. 11.3. Genomi könyvtárak .................................................................................................. 4. 11.4. cDNS könyvtárak ..................................................................................................... 4.1. 11.4.1. Az első szál szintézise .............................................................................. 4.2. 11.4.2. A második szál szintézise ......................................................................... 4.3. 11.4.3. RACE ....................................................................................................... 12. Expressziós rendszerek ............................................................................................................. 1. 12.1. Expressziós vektorok ............................................................................................... 2. 12.2. Expresszió baktériumsejtekben ................................................................................ 3. 12.3. Fehérjetermelés élesztőben ...................................................................................... 4. 12.4. Fehérjeexpresszió bakulovírus segítségével ............................................................. 5. 12.5. Expresszió emlőssejt-tenyészetekben ....................................................................... 6. 12.6. Expresszió állatokban ............................................................................................... 7. 12.7. Sejtmentes fehérjeexpresszió ................................................................................... 13. Mutagenezis, géncsendesítés .................................................................................................... 1. 13.1. Mutagenezis ............................................................................................................. 1.1. 13.1.1. Irányított pontmutációk generálása ........................................................... 1.1.1. 13.1.1.1. A Kunkel-módszer .................................................................... 1.1.2. 13.1.1.2. A metiláción alapuló módszer ................................................... 1.1.3. 13.1.1.3. Restrikciós hasításon alapuló módszer ...................................... 1.1.4. 13.1.1.4. A megaprimer-módszer ............................................................. 1.1.5. 13.1.1.5. Mutagenezis láncközi primerekkel ............................................ 1.2. 13.1.2. Random mutációk készítése PCR-rel ........................................................ 1.3. 13.1.3. Deléciók készítése .................................................................................... 1.3.1. 13.1.3.1. Deléció készítése exonukleázokkal ........................................... 1.3.2. 13.1.3.2. Deléció készítése hiányos primerrel .......................................... 1.3.3. 13.1.3.3. Deléció készítése PCR-rel ......................................................... 1.3.4. 13.1.3.4. Génfúzió PCR-rel ...................................................................... 1.4. 13.1.4. Génkiütött állatok ..................................................................................... 2. 13.2. Géncsendesítés ......................................................................................................... 2.1. 13.2.1. A géncsendesítés elmélete ........................................................................ 2.2. 13.2.2. Géncsendesítési módszerek ...................................................................... 14. Fehérjék kimutatása .................................................................................................................. 1. 14.1. Antitestek termeltetése ............................................................................................. 1.1. 14.1.1. Poliklonális antitestek készítése ................................................................ 1.2. 14.1.2. Monoklonális antitestek készítése ............................................................ 1.3. 14.1.3. Másodlagos antitestek ............................................................................... 2. 14.2. Aptamerek ................................................................................................................ 3. 14.3. Western blot ............................................................................................................. 4. 14.4. ELISA ...................................................................................................................... 15. Fehérje interakciók ................................................................................................................... 1. 15.1. In vitro kapcsolatok kimutatása ................................................................................ 1.1. 15.1.1. Kapcsolatok kimutatása fúziós fehérjével ................................................ 1.2. 15.1.2. Immunprecipitáció .................................................................................... 1.3. 15.1.3. Ko-immunprecipitáció .............................................................................. 1.4. 15.1.4.Gél-shift ..................................................................................................... 1.5. 15.1.6. Kromatin-immunprecipitáció .................................................................... 2. 15.2. In vivo kapcsolatok kimutatása ................................................................................. 2.1. 15.2.1. Élesztő két-hibrid rendszerek .................................................................... 2.1.1. 15.2.1.1. Szolubilis fehérjék kapcsolódásához ......................................... 2.1.2. 15.2.1.2. Membránfehérjék kapcsolódásához .......................................... 2.2. 15.2.2. Élesztő egy-hibrid rendszerek ................................................................... v Created by XMLmind XSL-FO Converter.

114 115 117 117 120 120 121 122 124 125 126 126 127 132 137 137 142 144 146 148 150 150 155 155 155 155 156 157 158 159 160 161 161 162 164 165 165 167 167 169 172 172 172 173 175 176 177 179 181 181 181 182 183 184 185 186 186 187 188 189


2.2.1. 15.2.2.1. Ismeretlen fehérje DNS-kötődése ............................................. 2.2.2. 15.2.2.2. Transzkripciós faktorok promóter/enhancer-preferenciája ........ 2.3. 15.2.3. Élesztő három-hibrid rendszer .................................................................. 16. Felhasznált irodalom .................................................................................................................

vi Created by XMLmind XSL-FO Converter.

189 190 191 193

Az ábrák listája 1.1. http://www.mun.ca/biology/scarr/Friedrich_Miescher.jpg - 2013.08.01. .................................... 1 1.2. http://www.nobelprize.org/nobel_prizes/medicine/laureates/1910/kossel_postcard.jpg - 2013.08.01. 1 1.3. http://ihm.nlm.nih.gov/luna/servlet/detail/NLMNLM~1~1~101421671~182946:-Dr--Phoebus-A-Levene--Photo-by-Lo?printerFriendly=1; http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/f/f0/Tetranucleotide_.png/220pxTetranucleotide_.png - 2013.08.01. .................................................................................................... 2 1.4. http://www.cumc.columbia.edu/psjournal/archive/winter-2004/img/fr_chargaff.jpg; http://www.xtimeline.com/__UserPic_Large/85629/evt101129162000704.jpg - 2013.08.01. .......... 3 1.5. http://sciencemadefun.net/blog/wp-content/uploads/2013/07/rosalindfranklin_photo51.jpg 2013.08.01. ......................................................................................................................................... 4 1.6. http://m.cdn.blog.hu/cr/criticalbiomass/image/post_img/2013/05/Watson_Crick.jpg; http://sp.life123.com/bm.pix/biography3.s600x600.jpg - 2013.08.01. ............................................... 4 1.7. http://www.nobelprize.org/nobel_prizes/chemistry/laureates/1902/fischer.jpg - 2013.08.01. .... 5 1.8. http://www.evi.com/images/thumbs/180/250/dca2bfb7e4db77887c0e5318b5ba0971.jpg; http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/6/6a/Griffith_experiment.svg/450pxGriffith_experiment.svg.png - 2013.08.02. ........................................................................................ 5 1.9. http://www.xtimeline.com/__UserPic_Large/170191/evt120221194300189.jpg; http://biology.kenyon.edu/courses/biol114/KH_lecture_images/How_DNA_works/FG11_02.JPG 2013.08.02. ......................................................................................................................................... 6 1.10. http://dnabioc.wikispaces.com/file/view/hersheychase1953.jpg/33687967/hersheychase1953.jpg; http://biologytb.net23.net/text/chapter11/11images/11-04.gif - 2013.08.02. ...................................... 7 1.11. http://www.nobelprize.org/nobel_prizes/medicine/laureates/1959/kornberg.jpg - 2013.08.03. 9 1.12. http://history.nih.gov/exhibits/nirenberg/images/photos/00_portrait.jpg; http://im.rediff.com/news/2011/nov/24khorana2.jpg; http://www.nndb.com/people/316/000129926/robertw-holley.jpg; http://www.virology.ws/wp-content/uploads/2011/11/genetic_code.gif - 2013.08.03. 9 1.13. http://www.nndb.com/people/478/000131085/werner-arber.jpg; http://www.asbmb.org/uploadedfiles/AboutUs/ASBMB_History/nobel_winners/images/nobel_big/1978N athans.jpg; http://www.nobelprize.org/nobel_prizes/medicine/laureates/1978/smith.jpg - 2013.08.03. 10 1.14. http://www.whatisbiotechnology.org/assets/images/people/berg.jpg - 2013.08.03. ................ 11 1.15. ................................................................................................................................................. 11 1.16. http://www.bioch.ox.ac.uk/glycob/rodney_porter_lectures/2006/southern.jpg - 2013.08.04. . 12 1.17. http://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/wordpress/wp-content/uploads/Milstein-Kohler1982-copy450x315.jpg - 2013.08.04. ................................................................................................................ 13 1.18. http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/c/ce/WalterGilbert2.jpg/220pxWalterGilbert2.jpg; http://www.lifesciencesfoundation.org/content/media/2011/10/10/1953_a_complete_protein_sequence.jpg - 2013.08.04. ..................................................................................................................................... 13 1.19. http://upload.wikimedia.org/wikipedia/en/d/d6/Michaelsmith.jpg - 2013.08.04. .................... 14 1.20. http://www.lifesciencesfoundation.org/content/media/2011/06/24/1982_A_transgenic_mammal_thescientist.com_Ralph_Brinster-large.jpg; http://images.thescientist.com/content/figures/images/yr1996/sept/sep_art/palmiter.jpg - 2013.08.04. ..................... 14 1.21. http://www.aacc.org/SiteCollectionDocuments/hall_of_fame/Mullis_Kary_200.gif - 2013.08.05. 15 1.22. http://www.boston.com/news/globe/west/mello.jpg; http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/7/7e/Andrew_Fire,_Stanford_University.jpg 2013.08.05. ....................................................................................................................................... 16 2.1. ................................................................................................................................................... 17 2.2. http://www.ambrogio-pagani.it/images/trigliceride.jpg; http://en.m.wikipedia.org/wiki/File:Prostaglandin_E1.svg - 2013.08.21. ........................................ 19 2.3. http://www.pnas.org/content/102/22/7835/F1.large.jpg; http://photos1.blogger.com/blogger/4566/894/1600/ProteinStructure-pud.jpg - 2013.08.21. .......... 20 2.4. ................................................................................................................................................... 21 2.5. https://wikispaces.psu.edu/download/attachments/54886630/figure_17_12.jpg - 2013.08.21. . 21 2.6. http://www.chemguide.co.uk/organicprops/aminoacids/dna1.html - 2012.11.20. ..................... 21 2.7. http://www.phschool.com/science/biology_place/biocoach/cells/review.html - 2012.11.23. .. 22

vii Created by XMLmind XSL-FO Converter.


2.8. http://www.cbs.dtu.dk/staff/dave/central_dogma.gif - 2013.08.21. ........................................... 24 2.9. ................................................................................................................................................... 26 2.10. ................................................................................................................................................. 27 3.1. http://www.vial-seals.com/Images/nalgene-syringe-filters.jpg; http://static.coleparmer.com/large_images/2953002APP.jpg - 2013.08.21. ..................................... 28 3.2. http://scientiis.com/laboratorium/catalog/images/Laboratory/F-2731-3.jpeg - 2013.08.21. ...... 29 3.3. http://upload.wikimedia.org/wikibooks/en/d/dd/Dialysis_bag.png - 2013.08.22. ..................... 29 3.4. http://www.piercenet.com/media/SnakeSkinBeaker190x233.jpg - 2013.08.22. ....................... 30 3.5. https://static.thermoscientific.com/images/F139899~wl.jpg - 2013.08.22. ............................... 30 3.6. http://img.medicalexpo.com/images_me/photo-g/laboratory-micro-centrifuge-68382-102771.jpg; http://eshop.eppendorfna.com/upload/productView/Eppendorf-5804R_Multipurpose-Centrifuge-open.jpg; http://fraden.brandeis.edu/figs/techniques/optima_xli.jpg- 2013.08.22. ........................................... 31 3.7. http://eshop.eppendorfna.com/upload/productView/Eppendorf_5430_rotor_F-35-6-30.jpg; http://eshop.eppendorfna.com/upload/productView/Eppendorf_5804-5810_Rotor-A-4-44_4x100ml.jpg 2013.08.22. ....................................................................................................................................... 32 3.8. http://www.sigmaaldrich.com/technical-documents/articles/biofiles/centrifugation-separations.html 2013.08.22. ....................................................................................................................................... 33 3.9. http://lab-training.com/wp-content/uploads/2011/12/liquid-Chromatography-copy2.jpg - 2013.08.23. 35 3.10. http://teaching.shu.ac.uk/hwb/chemistry/tutorials/chrom/gcdiag.gif; http://www.kth.se/polopoly_fs/1.171222!/image/GC6890.jpg - 2013.08.23. ................................... 36 3.11. http://www.uwplatt.edu/chemep/chem/chemscape/labdocs/catofp/chromato/tlc/pic/rfcalc.gif 2013.08.23. ....................................................................................................................................... 36 3.12. http://images.usbio.net/agarose_polymere.jpg - 2013.08.23. .................................................. 38 3.13. http://students.washington.edu - 2011.02.12. .......................................................................... 38 3.14. http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/2/2a/Agarose_Gel,_with_Comb_inserted,_in_a_Gel_Tra y_(Front,_angled_view)_-_SketchUp.png - 2013.08.23. ................................................................. 39 3.15. http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/1/11/Agarose-Gelelektrophorese.png - 2013.08.23. ........................................................................................................................................................... 39 3.16. http://www.musee-afrappier.qc.ca/images/site/large/gel-agarose-adn-nicole-catellier.jpg 2013.08.23. ....................................................................................................................................... 40 3.17. https://lh3.googleusercontent.com/70aOb5sik9M/ShOg05PUyII/AAAAAAAABuA/d0IIlC_4XKY/AMG410b.jpg - 2013.08.22. ..... 41 3.18. ................................................................................................................................................. 42 3.19. http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/6/65/Acrylamide_gel_(zh-cn).svg - 2013.08.23. 42 3.20. http://www.di.uq.edu.au/sparq/images/sdspage.jpg - 2013.08.23. ........................................... 44 3.21. ................................................................................................................................................. 45 3.22. http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/b/ba/2D_electrophoresis.gif - 2013.08.24. 46 3.23. http://www.doping.chuv.ch/en/lad-ec-zone-eng.jpg; http://cdn.grin.com/images/previewobject/document.169088/8fb5e898f0cd96f081f10826fa177ccf_LARGE.png - 2013.08.24. ........... 47 4.1. http://healthdefine.com/wp-content/uploads/2011/06/o157-h7-e.-coli.gif; http://www.niaid.nih.gov/SiteCollectionImages/topics/biodefenserelated/e_coli.jpg - 2013.08.27. 48 4.2. http://2007.igem.org/wiki/images/8/88/Ecoli.jpg - 2013.08.27. ................................................ 49 4.3. http://www.bio-rad.com/webroot/web/images/lsr/products/gene_transfer_rnai/sku_view/global/1652089_view.jpg - 2013.08.27. ............................................................................................................ 49 4.4. http://enfo.agt.bme.hu/drupal/sites/default/files/yeast.jpg; http://www.uwyo.edu/virtual_edge/lab13/images/saccharomyces_cerevisiae.jpg - 2013.08.27. ..... 50 4.5. http://www.microscopyu.com/galleries/dicphasecontrast/images/helapc.jpg - 2013.08.27. ...... 51 4.6. https://www1.imperial.ac.uk/resources/6BE0D194-58A2-41D4-B0C33206251512F4/cell_culture_mol_tox_1_191_196.jpg - 2013.08.28. ............................................... 52 4.7. https://www1.imperial.ac.uk/resources/6BE0D194-58A2-41D4-B0C33206251512F4/cell_culture_mol_tox_1_191_196.jpg - 2013.08.27. ............................................... 53 4.8. http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/1/18/Callus1.jpg - 2013.08.27. .................... 54 5.1. ................................................................................................................................................... 56 5.2. http://www.cultek.com/inf/otros/perfil-proveedores/Perfil%20Macherey%20Nagel/Official_Note__Silica_membrane_vs_Anion_Exchange_20090715.pdf - 2013.09.02. ........................................... 57 5.3. www.promega.com - 2013.09.02. .............................................................................................. 57 5.4. ................................................................................................................................................... 58 viii Created by XMLmind XSL-FO Converter.


5.5. http://www.taqdna.com/rich_files/bilder/DNA_RNA_purification/Plasmid_DNA_Purification_isolation_extraction_Mini prep_Kit.JPG - 2013.09.02. .............................................................................................................. 59 5.6. http://www.geochemicaltransactions.com/content/7/1/3/figure/F3?highres=y - 2013.09.02. ... 61 6.1. http://www.virology.ws/wp-content/uploads/2009/05/dna-polymerase-1.jpg - 2013.09.12. ..... 63 6.2. http://www.bbioo.com/uploadfile/200511/20051115143423244.gif - 2013.09.12. .................. 64 6.3. http://biosiva.50webs.org/dna%20cl51.gif - 2013.09.12. .......................................................... 65 6.4. http://www.vivo.colostate.edu/hbooks/genetics/biotech/enzymes/runoff.gif ........................... 66 6.5. http://bioweb.wku.edu/courses/biol350/EnzymeTools7/Images - 2013.09.12. ......................... 67 6.6. http://www.nationaldiagnostics.com/images - 2013.09.12. ....................................................... 67 6.7. http://www.thermoscientificbio.com/uploadedImages/Products/DNA_RNA_Modifying_Enzymes/Nucleas e/en019_1.gif - 2013.09.12. .............................................................................................................. 68 6.8. http://www.scq.ubc.ca/wp-content/endonuclease2.gif - 2013.09.12. ........................................ 69 6.9. http://www.mun.ca/biology/scarr/Fg15_02.gif - 2013.09.12. .................................................... 70 6.10. http://www.escience.ws/b572/L6/images/CIAP.gif - 2013.09.12. ........................................... 71 7.1. http://2.bp.blogspot.com/_tUQhsS1XUW8/TUBpry3jMII/AAAAAAAAAhk/PRjQkj0Cnsw/s1600/Biofre aks+-+GGS+LIVE+PCR+-+reaction+scheme.jpg - 2013.09.13. ..................................................... 73 7.2. http://www.ridge2000.org/seas/images/lab_thermocycler.jpg - 2013.09.13. ............................ 74 7.3. http://216.74.34.73/m/37/Article/RocheApplied_Lightcycler_Lightcycler_img.jpg - 2013.09.13. 75 7.4. http://enfo.agt.bme.hu/drupal/sites/default/files/pcr_0.png - 2013.09.13. ................................. 76 7.5. ................................................................................................................................................... 79 7.6. ................................................................................................................................................... 79 7.7. http://www.b2b.invitrogen.com/etc/medialib/en/images/ics_organized/brands/molecularprobes.Par.91270.Image.400.351.1.g001355-gif.gif - 2013.09.16. .................................................. 81 7.8. http://www.virologyj.com/content/figures/1743-422X-7-232-9-l.jpg - 2013.09.13. ................. 82 7.9. http://www.malariajournal.com/content/figures/1475-2875-6-41-2-l.jpg - 2013.09.13. ........... 83 7.10. http://www.foodsafetywatch.com/public/images/1050b.gif - 2013.09.13. .............................. 83 7.11. http://www.bio.davidson.edu - 2013.09.16. ............................................................................. 84 8.1. http://users.rcn.com/jkimball.ma.ultranet/BiologyPages/D/ddTTP.gif - 2013.08.06. ............... 86 8.2. http://www.austincc.edu/mlt/mdfund/pictures/sequencing1.gif - 2013.08.06. .......................... 87 8.3. http://www.vialattea.net/spaw/image/biologia/2007_01/7-deaza-dGTP.jpg - 2013.08.06. ....... 89 8.4. ................................................................................................................................................... 89 8.5. http://seqcore.brcf.med.umich.edu/doc/educ/dnapr/seqgels.jpg - 2013.09.18. .......................... 90 8.6. http://genetics.thetech.org/sites/default/files/Seq4.gif; http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/1/18/DNA_sequence.svg/332pxDNA_sequence.svg.png - 2013.09.18. ............................................................................................. 91 8.7. http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/e/e4/EdmanDegradation.png - 2013.09.18. . 92 8.8. http://en.wikipedia.org/wiki/Protein_mass_spectrometry - 2013.09.18. ................................... 93 9.1. http://www.bio.davidson.edu/people/kabernd/seminar/2002/method/lemethod/southblotle.jpg 2013.09.20. ....................................................................................................................................... 96 9.2. http://www.bio-rad.com; http://imagej.nih.gov/ij/docs/examples/dot-blot/dot-blot.jpg ............ 97 9.3. http://216.74.34.73/m/37/Article/ambionf00165.jpg; http://216.74.34.73/m/37/Article/ambionf00137.jpg ........................................................................ 98 9.4. http://en.wikipedia.org/wiki/File:NA_hybrid.svg ................................................................... 100 9.5. http://en.wikipedia.org/wiki/File:Microarray-schema.jpg http://csmbio.csm.jmu.edu/bioweb/Bio480/08Fallmicroarray/group4/microarray%20intro.jpg 2013.09.20. ..................................................................................................................................... 100 9.6. http://wiki.biomine.skelleftea.se/biomine/molecular/images/pic034.gif - 2013.09.20. ........... 102 9.7. http://1.bp.blogspot.com/-EvetKdgrE0/Tmdu9La425I/AAAAAAAAHFQ/lKBI9Qn7ZEU/s1600/01.jpg - 2013.09.26. ......... 103 10.1. http://en.wikipedia.org/wiki/File:PBR322.svg - 2013.09.23. ................................................ 104 10.2. http://bio3400.nicerweb.com/Locked/media/ch19/19_09-lambda-vector.jpg - 2013.09.23. . 106 10.3. http://www.wwnorton.com/college/biology/microbiology2/img/eTopics/sfmb2e_eTopic_1101_2.jpg - 2013.09.25. ................................................................................................................................... 106 10.4. http://www.sigmaaldrich.com/prodimages/b/b3928.jpg - 2013.09.25. .................................. 107 10.5. http://en.wikipedia.org/wiki/File:Blue_white_assay_Ecoli.jpg - 2013.09.25. ....................... 108 10.6. http://openclipart.org/detail/130471/plasmid-vector-by-gsagri04 - 2013.09.25. ................... 109 10.7. http://www.promega.com - 2013.09.25. ................................................................................ 110 ix Created by XMLmind XSL-FO Converter.


10.8. http://www.bio.davidson.edu/courses/molbio/molstudents/spring2003/keogh/pbluescript%2B.gif 2013.09.25. ..................................................................................................................................... 111 10.9. ............................................................................................................................................... 112 10.10. http://www.ebiotrade.com/buyf/productsf/epicentre/fos5fig2.gif - 2013.09.25. ................. 112 10.11. http://www.biochem.arizona.edu/miesfeld/teaching/Bioc471-2/pages/Exam1YAC4.jpg 2013.09.25. ..................................................................................................................................... 113 10.12. http://www.seropia.com/bt/transgenic%20org.html - 2013.09.26. ...................................... 113 10.13. http://chromoresearch.co.jp/e/chromosome/ - 2013.09.26. .................................................. 114 10.14. http://www.lentigen.com/images/product_diagram.jpg - 2013.09.26. ................................. 115 11.1. http://www.accessexcellence.org/RC/VL/GG/images/inserting.gif - 2013.10.01. ................ 117 11.2. http://eu.idtdna.com/pages/images/decoded/cc_blunt-end-cloning_fig-1.png?sfvrsn=0&c=HU 2013.10.2. ....................................................................................................................................... 118 11.3. http://www.addgene.org/static/cms/images/PCR-based-Subcloning-2_1.gif - 2013.10.02. .. 119 11.4. http://openi.nlm.nih.gov/imgs/512/2/1635280/1635280_gkl635f1.png - 2013.09.29. .......... 120 11.5. http://www.sciencedirect.com - 2013.09.29. ......................................................................... 121 11.6. http://2007.igem.org/wiki/images/6/64/BU_topo.jpg - 2013.09.29. ...................................... 122 11.7. http://bioinforx.com/lims1/bxseqtools/ultimate-molecular-cloningguides/images/diagram_directionalTOPO.gif - 2013.09.29. .......................................................... 123 11.8. http://tools.lifetechnologies.com/content/sfs/manuals/gateway_clonaseii_man.pdf - 2013.09.30. 125 11.9. http://www.nature.com/onc/journal/v24/n52/images/1209043f6.jpg - 2013.09.30. .............. 126 11.10. http://www.bio.davidson.edu/genomics/method/cDNA/cDNA3.gif - 2013.10.02. ............. 127 11.11. - 2013.10.02. ........................................................................................................................ 128 11.12. http://dwb4.unl.edu/Chem/CHEM869N/CHEM869NLinks/www.dur.ac.uk/~dbl0www/Staff/Croy/cDNAf igs.htm - 2013.10.02. ...................................................................................................................... 129 11.13. ............................................................................................................................................. 130 11.14. ............................................................................................................................................. 131 11.15. ............................................................................................................................................. 132 11.16. ............................................................................................................................................. 133 11.17. ............................................................................................................................................. 134 11.18. ............................................................................................................................................. 135 12.1. https://www.neb.com/~/media/Catalog/AllProducts/FF91B67397D945E0956F3483174CF7E3/Long%20Description/E8200a.jpg - 2013.10.08. 137 12.2. http://1.bp.blogspot.com/ch_i3COHnPs/Te_Xc48QsjI/AAAAAAAAAiM/eZN9oXY84J0/s1600/Biofreaks+-+GGS+LIVE++Protein+purification+from+E.coli+-+Elution.jpg - 2013.10.08. .................................................. 138 12.3. http://www.agr.kuleuven.ac.be/dp/logt/practicum2001/proef9b.gif - 2013.10.09. ................ 140 12.4. http://wolfson.huji.ac.il/purification/PDF/Literature/Waugh2011.pdf - 2013.10.09. ............ 140 12.5. https://lh6.googleusercontent.com/EZbr0GM7Pg0/TmudbUAhInI/AAAAAAAAB2I/sCsYcaVFr10/w500/GFP.jpg - 2013.10.09. .. 141 12.6. http://www.origene.com.cn/assets/Images/TrueORF/pEX-N-GST.jpg - 2013.10.09. ........... 142 12.7. http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/V19520 - 2013.10.09. ................... 144 12.8. https://tools.lifetechnologies.com/content/sfs/gallery/high/575.jpg - 2013.10.09. ................ 146 12.9. http://tools.lifetechnologies.com/content/sfs/manuals/bevtest.pdf - 2013.10.09. .................. 147 12.10. http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/K482001 - 2013.10.09. ............... 149 12.11. http://www.lifetechnologies.com - 2013.10.04. ................................................................... 151 12.12. http://www.piercenet.com/guide/getting-started-vitro-protein-expression - 2013.10.04. .... 152 12.13. http://www.lifetechnologies.com - 2013.10.04. ................................................................... 152 12.14. http://www.lifetechnologies.com - 2013.10.04. ................................................................... 153 13.1. http://www.tutorgigpedia.com/ed/PCR_mutagenesis - 2013.10.10. ...................................... 155 13.2. http://www.mikeblaber.org/oldwine/bch5425/lect33/kunkel.gif - 2013.10.10. ..................... 156 13.3. http://www.lesbellesregions.fr/rhonealpes/media/2012/09/site-directed-mutagenesis.jpg 2013.10.10. ..................................................................................................................................... 156 13.4. ............................................................................................................................................... 157 13.5. ............................................................................................................................................... 159 13.6. ............................................................................................................................................... 160 13.7. ............................................................................................................................................... 161 13.8. http://mol-biol4masters.masters.grkraj.org/html/Genetic_Engineering5EIn_Vitro_Mutagenesis_files/image005.jpg - 2013.10.13. .............................................................. 163 x Created by XMLmind XSL-FO Converter.


13.9. http://eu.idtdna.com/pages/images/decoded/figure-1.png?sfvrsn=0 - 2013.10.13. ................ 164 13.10. http://www.mikeblaber.org/oldwine/bch5425/lect24/IMG00006.GIF - 2013.10.10. .......... 164 13.11. http://en.wikipedia.org/wiki/Knockout_mouse - 2013.10.13. ............................................. 166 13.12. http://www.linguamedica.jp/mita/20030618/knockout/knockout_files/image004.gif - 2013.10.13. 166 13.13. http://www.pnas.org/content/suppl/2005/07/10/0504439102.DC1/04439Fig7.jpg - 2013.10.13. 168 13.14. ............................................................................................................................................. 170 14.1. http://www.cytographica.com/overheads/antibody.jpg - 2013.10.17. ................................... 173 14.2. http://en.wikipedia.org/wiki/File:Monoclonals.png - 2013.10.17. ......................................... 174 14.3. http://www.genelink.com/newsite/products/images/aptamer_selex.jpg - 2013.10.17. .......... 176 14.4. http://www.western-blot.us/procedure-of-western-blot/western-blot-transfer - 2013.10.20. 177 14.5. http://advansta.com/images/Figures/WB%20Quantum/WBQ_home-Fig1.jpg - 2013.10.20. 178 14.6. http://www.epitomics.com/images/products/sandwich_dual.jpg - 2013.10.20. .................... 179 15.1. ............................................................................................................................................... 181 15.2. http://www.leinco.com/includes/templates/LeincoCustom/images/immunoprecipitation.gif 2013.10.23. ..................................................................................................................................... 183 15.3. http://b2b.bio1000.com/file/upload/201305/30/10-31-18-85-9657.jpg - 2013.10.24. ........... 183 15.4. http://www.piercenet.com/media/EMSAOverview615x416.jpg - 2013.10.24. ..................... 184 15.5. http://www.chemie.uni-hamburg.de/bc/spillner/bc_bredehorst_mitarbeiter_spillner_selektion.JPG 2013.10.24. ..................................................................................................................................... 185 15.6. http://www.promega.com - 2013.10.24. ................................................................................ 186 15.7. http://www.promega.com - 2013.10.24. ................................................................................ 187 15.8. http://www.dualsystems.com - 2013.10.24. ........................................................................... 188 15.9. http://www.takarabiomed.com.cn/sxproducts/clontech/2/160-1.JPG - 2013.10.24. .............. 189 15.10. http://labs.umassmed.edu/WolfeLab/B1H_introsized.png - 2013.10.24. ............................ 190 15.11. - 2013.10.24. ........................................................................................................................ 192

xi Created by XMLmind XSL-FO Converter.

Molekuláris biológiai technikák Wunderlich Lívius

Budapesti Műszaki és Gazdaságtudományi Egyetem, Semmelweis Egyetem, 2014 © Wunderlich Lívius Typotex Kiadó, www.typotex.hu ISBN: 978-963-279-172-2 Creative Commons NonCommercial-NoDerivs 3.0 (CC BY-NC-ND 3.0) A szerző nevének feltüntetése mellett nem kereskedelmi céllal szabadon másolható, terjeszthető, megjelentethető és előadható, de nem módosítható. Készült a TÁMOP-4.1.2/A/1-11/1-2011-0079 számú, „Konzorcium a biotechnológia aktív tanulásáért” című projekt keretében.

xii Created by XMLmind XSL-FO Converter.

Előszó A „Molekuláris biológiai technikák” jegyzet a BME-n tanuló biomérnök BSc. és MSc. hallgatóknak készült a „Molekuláris biológiai módszerek” és az „Új molekuláris biológiai módszerek” tantárgy segédanyagaként. Egyes részei hasznosak lehetnek a genetikát, a mikrobiális genetikát, illetve a biokémiát hallgató diákok számára is. A jegyzet fő célja, hogy biztos elméleti alapok mellett a szükséges gyakorlati tudást is biztosítsa a diákok számára. Erre főleg azért van szükség, mert az egyetemen, anyagi okok miatt, a molekuláris biológiai technikák gyakorlati oktatása egyelőre nem megoldott. A könyv a gyakorlati tudást úgy igyekszik biztosítani, hogy bizonyos technikák esetében az elméleti háttér ismertetése után a gyakorlati lépések megfelelően részletes leírása következik egy apró betűs részben. A szöveg megértését az anyagrészekhez kapcsolódó ábrák segítik. Az anyag úgy lett megszerkesztve és elrendezve, hogy az elején ismertetett, egymástól függetlennek tűnő, egyszerűbb technikák a könyv vége felé összekapcsolhatóak legyenek, és általuk érthetővé váljanak akár teljes kísérleti rendszereket kiszolgáló, komplex technikák is. Igyekeztünk olyan szellemben írni a könyvet, hogy az elsősorban a probléma-megoldásra koncentráljon. A jegyzet (és a hozzá kapcsolódó kontaktóra) anyagát elsajátítva, azt összefüggéseiben megértve, a hallgatók alkalmassá válnak arra, hogy önálló tudományos problémákat oldjanak meg a megfelelő kísérletek megtervezésével és a hozzájuk kapcsolható technikák alkalmazásával. A jegyzet 15 fejezetből áll. Az első fejezet egy történeti áttekintést ad a fontosabb felfedezésekről, a második a molekuláris biológia és határtudományainak összefüggéseiről, valamint a kutatások során szükséges kísérleti procedúráról értekezik. A 3. és 5. fejezetekben a legfontosabb makromolekulákat érintő elválasztási és tisztítási technikákat, a 4. fejezetben pedig az élő sejtek tenyésztéséhez használatos módszereket ismertetjük. A 7., 8. és 9. fejezetben a nukleinsavak sokszorosítására és azonosítására kidolgozott technikákkal, míg a 10., 11. és 12. fejezetben a rekombináns DNS-technikák alkalmazásával és a technikák hozadékával (például specifikus fehérjék termeltetésével) foglalkozunk. A 13. fejezet genetikai mutációk generálását és a géncsendesítés mechanizmusát, a 14. fejezet a fehérjék kimutatási módszereit, a 15. fejezet pedig a fehérjék által létrehozott kapcsolatok vizsgálati módszereit írja le. A molekuláris biológia a jövő tudománya. Reményeink szerint a jegyzet hozzájárul majd a molekuláris biológia elméletének jobb megértéséhez, és elősegíti a mérnökhallgatók tervezési képességeinek fejlődését.

xiii Created by XMLmind XSL-FO Converter.

1. fejezet - Történeti áttekintés 1. 1.1. A molekuláris biológia története A molekuláris biológia egy viszonylag fiatal tudományág. Születésének pontos időpontját nehéz lenne meghatározni, magát a kifejezést először Warren Weaver matematikus használta 1938-ban. Szerinte az élet nem volt más, mint fizikai és kémiai folyamatok összessége, ezen folyamatok vizsgálati eszköztárát nevezte ő molekuláris biológiának. Általánosan azt mondhatjuk, hogy a tudományterület elsősorban az élet szubcelluláris összetevőinek, azon belül is főleg az élethez szükséges szerves makromolekulák (elsősorban fehérjék és nukleinsavak) tulajdonságainak megfigyelését és megváltoztatását lehetővé tévő technikák összessége. A molekuláris biológia tudományának fejlődése összefonódik a nukleinsavak megismerésének történetével. 1869-ben Friedrich Miescher svájci orvos és biológus (1-1. ábra) izolált sejtmagból egy foszfátgazdag anyagot, melyet „mag-anyagnak” (nuclein) nevezett el. 1889-ben Richard Altmann német patológus fedezte fel a maganyag savas természetét, és ő használta rá először a nukleinsav elnevezést. A nukleinsavakban lévő bázisok (adenin, guanin, citozin, uracil, timin) felfedezése és elnevezése Albrecht Kossel német orvos (1-2. ábra) nevéhez fűződik, aki 1885 és 1901 között végezte ez irányú kutatásait. A nukleinsavakban jelen lévő ribóz és dezoxiribóz felfedezése Phoebus Levene litván/amerikai biokémikus (1-3. ábra) nevéhez fűződik. Ugyancsak az ő nevéhez fűződik a nukleotidok pontos szerkezetének, és egymáshoz cukor-foszfát kötéssel való kapcsolódásuknak felfedezése is (1919), bár ő még úgy gondolta, hogy a négyféle nukleotid egymáshoz kapcsolódva gyűrűszerű tetranukleotidokat képez. Egészen 1950-ig ez volt az általánosan elfogadott vélemény, amikor is Erwin Chargaff(1-4. ábra) kimutatta, hogy a DNS-ben az adeninnek és atiminnek, valamint a guaninnak és a citozinnak a mennyisége páronként megegyezik (A%=T%, G%=C%). Ezt az összefüggést nevezzük az első Chargaff-szabálynak. A DNS kettős hélixének szerkezetét végül Rosalind Franklinnak, James Watsonnak és Francis Cricknek sikerült megfejteni 1953-ban (1-5. ábra, 1-6. ábra), Utóbbi kettő a felfedezésért Nobel-díjat is kapott Maurice Wikins fizikussal együtt.

1.1. ábra - http://www.mun.ca/biology/scarr/Friedrich_Miescher.jpg - 2013.08.01.

1.2. ábra http://www.nobelprize.org/nobel_prizes/medicine/laureates/1910/kossel_postcard.jpg 2013.08.01.

1 Created by XMLmind XSL-FO Converter.

-

Történeti áttekintés

1.3. ábra http://ihm.nlm.nih.gov/luna/servlet/detail/NLMNLM~1~1~101421671~182946:-Dr-Phoebus-A--Levene--Photo-by-Lo?printerFriendly=1; http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/f/f0/Tetranucleotide_.png/220p x-Tetranucleotide_.png - 2013.08.01.



1.4. ábra http://www.cumc.columbia.edu/psjournal/archive/winter2004/img/fr_chargaff.jpg; http://www.xtimeline.com/__UserPic_Large/85629/evt101129162000704.jpg 2013.08.01.



1.5. ábra http://sciencemadefun.net/blog/wpcontent/uploads/2013/07/rosalindfranklin_photo51.jpg - 2013.08.01.

1.6. ábra http://m.cdn.blog.hu/cr/criticalbiomass/image/post_img/2013/05/Watson_Crick.jpg; http://sp.life123.com/bm.pix/biography3.s600x600.jpg - 2013.08.01.

-

A nukleinsavak szerkezetének felfedezésén kívül más nagyon fontos felfedezések is szükségesek voltak a molekuláris biológia tudományterületének fejlődéséhez. Mindenképp említést kell tennünk Emil Fischer német kémikusról (1-7. ábra), aki a XIX. század végén és a XX. század elején igen jelentős felfedezéseket tett többek között a szénhidrátok és a fehérjék szerkezetének megismerésében. Többek között Fisher tudta először a sztereoizomereket elkülöníteni egymástól, ő szintetizált először monoszacharidokat, peptideket.



A tudósok körében egészen a XX. század közepéig vita volt arról, hogy a tulajdonságok átörökítésében a fehérjéknek, vagy a nukleinsavaknak van-e szerepe. A többség a fehérjék örökítő szerepét támogatta. Látszólag ezt az elméletet támogatta az a tudományos megfigyelés, mely az egy gén – egy enzim hipotézishez vezetett (George Beadle, Edward Tatum, 1941). Bár Fred Griffith 1928-ban híres kísérlete alapján már feltételezte, hogy az örökítőanyag nem fehérje. Kísérletében kétféle, patogén és nem patogén baktériummal fertőzött egereket. Észrevette, hogy a hővel elölt patogén baktériumok önmaguk nem pusztították el az egereket, de azokat élő, nem patogén baktériumokkal együtt injektálták, akkor az egerek elpusztultak. Ebből arra következtetett, hogy a patogén baktérium hővel történt kezelése után is megtartotta „transzformáló” tulajdonságát (1-8. ábra). Valódi áttörést azonban csak az 1944-ben publikált Avery–MacLeod–McCartykísérlet hozott. Ebben az elölt baktériumok különböző makromolekuláit (RNS, DNS, fehérje, szénhidrát, lipid) izolálták, és kiderítették, hogy csak a DNS-nek volt transzformáló aktivitása (a patogén baktériumból izolált DNS nem patogén baktériummal keverve megölte a kísérleti állatot, míg a többi összetevőnek nem volt ilyen hatása) (1-9. ábra). Egy másik, 1952-ben publikált kísérlet igazolta ezt az elméletet. A Hershey–Chasekísérletben radioaktív foszforral, illetve radioaktív kénnel jelölt bakteriofágokkal fertőzött baktériumokból nyert bakteriofágok radioaktivitását vizsgálták. A kapszidok leválasztása után csak a radioaktív foszfort tartalmazó fágok által fertőzött baktériumok lettek radioaktívak. Ezzel a kísérlettel azt sikerült bizonyítani, hogy a baktériumba bejutó DNS tartalmazza a fágok szaporodásához szükséges örökítőanyagot, nem pedig a baktérium felszínén maradó, fehérjékből álló fág-kapszid (1-10. ábra).

1.7. ábra - http://www.nobelprize.org/nobel_prizes/chemistry/laureates/1902/fischer.jpg - 2013.08.01.

1.8. ábra http://www.evi.com/images/thumbs/180/250/dca2bfb7e4db77887c0e5318b5ba0971.jpg; http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/6/6a/Griffith_experiment.svg/4 50px-Griffith_experiment.svg.png - 2013.08.02.



1.9. ábra - http://www.xtimeline.com/__UserPic_Large/170191/evt120221194300189.jpg; http://biology.kenyon.edu/courses/biol114/KH_lecture_images/How_DNA_works/FG11 _02.JPG - 2013.08.02.



1.10. ábra http://dnabioc.wikispaces.com/file/view/hersheychase1953.jpg/33687967/hersheychase19 53.jpg; http://biologytb.net23.net/text/chapter11/11images/11-04.gif - 2013.08.02.



Az 1950-es évektől kezdődő több mint három évtized rengeteg új molekuláris biológiai felfedezést hozott. 1956ban felfedezték az első, DNS-polimerizációt katalizáló enzimet (E. coli DNS-polimeráz I, Arthur Kornberg) (1-11. ábra). Bár már évek óta feltételezték létezését, 1960-ban sikerült először az mRNS molekulák létét bizonyítani. 1961-ben történt az első áttörés a genetikai kód megfejtésében, amikor Marshall Nirenberg és munkatársai kimutatták, hogy a poliuracilt tartalmazó RNS polifenilalanin peptidet kódol. Nirenberg, majd Har Gobind Khorana segítségével sikerült a teljes, minden tripletet tartalmazó kódszótárt 1966-ig megalkotni. Kettejükkel együtt Robert Holley is Nobel-díjat kapott 1968-ban, ő az átíráshoz szükséges tRNS felfedezéséért (1-12. ábra). Az első restrikciós hasításért felelős enzimek jelenlétét Werner Arber fedezte fel 1962-ben, a restrikciós enzimek használatának kifejlesztéséért a molekuláris biológiában Daniel Nathansszal és Hamilton Smith-szel együtt kapott Nobel-díjat 1978-ban (1-13. ábra). Smith 1970-ben karakterizálta az első restrikciós endonukleázt, Nathans készítette el az első restrikciós térképet 1972-ben (az SV40 vírusét). Paul Berg (1-14. ábra) nevéhez fűződik az első, restrikciós endonukleázzal hasított DNS-darabok összeligálása, ezáltal az első rekombináns DNS létrehozása (1972). Herbert Boyer és Stanley Cohen (1-15. ábra) a rekombináns DNS-t már egy élőlénybe (E. coli) juttatta, ahol a genetikai anyag képes volt replikálódni, és továbbörökítődni.



1.11. ábra http://www.nobelprize.org/nobel_prizes/medicine/laureates/1959/kornberg.jpg 2013.08.03.

-

1.12. ábra - http://history.nih.gov/exhibits/nirenberg/images/photos/00_portrait.jpg; http://im.rediff.com/news/2011/nov/24khorana2.jpg; http://www.nndb.com/people/316/000129926/robert-w-holley.jpg; http://www.virology.ws/wp-content/uploads/2011/11/genetic_code.gif - 2013.08.03.



1.13. ábra http://www.nndb.com/people/478/000131085/werner-arber.jpg; http://www.asbmb.org/uploadedfiles/AboutUs/ASBMB_History/nobel_winners/images/ nobel_big/1978Nathans.jpg; http://www.nobelprize.org/nobel_prizes/medicine/laureates/1978/smith.jpg - 2013.08.03.



1.14. ábra 2013.08.03.

-

http://www.whatisbiotechnology.org/assets/images/people/berg.jpg

1.15. ábra -


-


A molekuláris biológia ilyen gyors fejlődése megdöbbentette a tudományos világot. Most már képesek lettünk az örökítőanyag fajok közti célzott transzferére, ezáltal teljesen új, addig még nem létező tulajdonságú élőlények létrehozására. Reális veszélye látszott annak, hogy a kontrollálatlan kutatás olyan új, akár patogén organizmusok létrehozásához vezethet, amelyek súlyos, akár az egész világra kiterjedő járványok kialakulását okozhatják. Ezért vezető kutatók moratóriumot hirdettek az idegen organizmusokba ültetendő rekombináns DNS-kutatások területén, amíg általános megegyezés nem születik azokról a rendszabályokról, amelyek a kutatások további biztonságos folytatásához szükségesek. 1975 februárjában Paul Berg szervezett egy konferenciát a kaliforniai Asilomarba, ahol a világ vezető kutatói megállapodtak a rekombináns DNS-technikát érintő korlátozásokról. A megállapodás kiterjedt a kutatásban használható élőlényekre, a szükséges kísérleti protokollok pontos betartására, megfelelő műszerezettségi kívánalmakra (steril fülke, alacsony nyomású laboratóriumok, veszélyes hulladékok kezelése). A kísérletek veszélyessége szempontjából négy kategóriát állítottak fel, mindegyik kategóriához megfelelő elővigyázatossági intézkedéseket rendelve. Megtiltották patogén organizmusok használatát transzgénikus kísérletekhez, és toxinok génjeinek használatát rekombináns DNS létrehozásakor. A konferencia után immár az új rendszabályok szerint folytak a kutatások. 1975-ben Edwin Southern (1-16. ábra) felfedezte a DNS-szakaszok azonosítására szolgáló, hibridizáción alapuló technikát, melyet róla Southern-blotnak neveztek el. Ugyancsak 1975-ben állítottak elő először monoklonális antitesteket hibridómasejtek segítségével (Georges Köhler, Cèsar Milstein) (1-17. ábra). A következő jelentős felfedezés a DNS szekvencia-analízisének technikája volt. A két legismertebb technika párhuzamosan került kifejlesztésre, az egyik a Walter Gilbert nevéhez fűződő kémiai hasításos módszer, a másik a Frederick Sanger (1-18. ábra) nevéhez fűződő láncterminációs módszer. Bár csak ez utóbbi terjedt el széles körben, a két kutató 1980-ban Nobel díjat kapott felfedezéseiért (Paul Berggel megosztva). 1978-ban Michael Smith (1-19. ábra) készítette az első pontmutációt irányított mutagenezissel. 1978 több szempontból is jelentős év volt: ekkor készült el rekombináns technológiával az első humán genomi könyvtár és az első gyógyászati célra használt rekombináns fehérje (emberi inzulin: humulin). 1982-ben Ralph Brinster és Richard Palmiter (1-20. ábra) készítették el az első, idegen gént hordozó emlősállatot, a transzgenikus egeret. Ugyanebben az évben fejeződik be az első vírus, a λ-fág teljes genomjának megszekvenálása.

1.16. ábra http://www.bioch.ox.ac.uk/glycob/rodney_porter_lectures/2006/southern.jpg 2013.08.04.


-


1.17. ábra - http://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/wordpress/wp-content/uploads/MilsteinKohler1982-copy-450x315.jpg - 2013.08.04.

1.18. ábra http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/c/ce/WalterGilbert2.jpg/220pxWalterGilbert2.jpg; http://www.lifesciencesfoundation.org/content/media/2011/10/10/1953_a_complete_prot ein_sequence.jpg - 2013.08.04.



1.19. ábra 2013.08.04.

-

http://upload.wikimedia.org/wikipedia/en/d/d6/Michaelsmith.jpg

-

1.20. ábra http://www.lifesciencesfoundation.org/content/media/2011/06/24/1982_A_transgenic_m ammal_the-scientist.com_Ralph_Brinster-large.jpg; http://images.thescientist.com/content/figures/images/yr1996/sept/sep_art/palmiter.jpg - 2013.08.04.



1985 igen jelentős dátum a molekuláris biológia történetében. KaryMullis (1-21. ábra) ekkor fejleszti ki a polimeráz láncreakción alapuló technikát (PCR), mely gyökeresen megváltoztatja a kutatási lehetőségeket. A PCR-technika segítségével DNS-szakaszok szaporíthatóak fel specifikusan, igen rövid idő alatt, igen nagy mennyiségben. Ugyanebben az évben kezdik el azt az akkor még kilátástalannak tűnő projektet, amely az emberi genom teljes bázissorrendjének megismerésére szolgál. Ehhez felhasználják az akkoriban ismert molekuláris biológiai technikák jelentős részét (restrikciós emésztés/ligálás, genomi könyvtárak készítése, PCR, Sanger-féle láncterminációs szekvenálás), és feltételezik, hogy a technikák fejlődésével a szekvenálás üteme nagyságrendekkel felgyorsul (ez valóban így is történt). Más, a kutatásokhoz használt élőlények genomjának feltérképezése vagy már elkezdődött, vagy csak ezután fog. A human genom project (HUGO) farvizén, vagy attól függetlenül sikerül megszekvenálni az első eukarióta kromoszómát (élesztő 3. kromoszóma, 1985), az első prokarióta genomot (Haemophylus influenzae (1991). 1991-ben befejezik az élesztő genomját, majd megszekvenálják az E. coli genomját, (1997), a Caenorhabditis elegans genomját (1998). Többek között az ecetmuslinca (Drosophyla melanogaster) és a házi egér (Mus musculus) genomjának szekvenciája is elkészül. Az emberi genom teljes szekvenciájának felderítése 2003-ra készül el.

1.21. ábra http://www.aacc.org/SiteCollectionDocuments/hall_of_fame/Mullis_Kary_200.gif 2013.08.05.

-

Még egy nagyon fontos, viszonylag új technikáról muszáj szót ejteni. Craig Mello és Andrew Fire (1-22. ábra) 1998-ban felfedezik az RNS-interferencia jelenségét (amiért Nobel-díjat kapnak 2006-ban). Erre a jelensége



épül a ma általánosan elterjedt géncsendesítési technika kis inhibitoros RNS-ek (siRNS-ek) felhasználásának segítségével.

1.22. ábra http://www.boston.com/news/globe/west/mello.jpg; http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/7/7e/Andrew_Fire,_Stanford_Universi ty.jpg - 2013.08.05.

A molekuláris biológiai technikák napjainkban is fejlődnek. Elsősorban a műszerek fejlődésének köszönhetően ma már jó néhány munkaigényes folyamatot sikerült automatizálni; a nagy mintaszámmal dolgozó laborokban robotok sokkal gyorsabban és precízebben tudnak bizonyos részfolyamatokat elvégezni, mint az emberi munkaerő. Többek között a számítógépes adatfeldolgozás nagymértékű felgyorsulása tette lehetővé az olyan technikák kifejlődését, mint például az új generációs szekvenciaanalízis-technikák. Segítségükkel manapság egy-egy élőlény genomjának meghatározása nem évekbe, csak napokba telik.


2. fejezet - A molekuláris biológia objektumai, összefüggései, kísérleti tervezés 1. 2.1. A molekuláris biológia objektumai A molekuláris biológiai technikák alkalmazása során elsősorban biológiai eredetű molekulákkal foglalkozunk, mint pl. a szénhidrátok, lipidek, fehérjék és nukleinsavak.

1.1. 2.1.1. Szénhidrátok A szénhidrátok közé soroljuk a mono-, oligo- és poliszacharidokat. A monoszacharidok 3–7 szénatomszámú molekulák, melyek szénen és hidrogénen kívül oxigénatomokat is tartalmaznak (összegképletük C nH2nOn vagy ezt megközelítő). A legismertebb monoszacharidok a glukóz, fruktóz, mannóz, galaktóz. A természetben mint szállítandó tápanyag vagy a di-, oligo- vagy poliszacharidok építőköveként van jelen. Két monoszacharid összekapcsolódva diszacharidot alkot. Legismertebb képviselői a maltóz, szacharóz, laktóz, cellobióz. Biológiai rendszerekben elsősorban mint táplálék vagy ozmotikum játszanak szerepet, de megjelennek poliszacharidok lebomlásának köztes termékeként is. A mono- és diszacharidok többsége édes ízű, ezért ezeket cukroknak is hívjuk. Néhány monoszacharid összekapcsolódásával keletkeznek az oligoszacharidok. Önállóan nagyon ritkán fordulnak elő, legtöbbször fehérjékhez vagy membrán-lipidekhez kötődnek, módosítva azok élettani sajátosságait. A poliszacharidok nagyon sok monoszacharid építőkőből szintetizálódott polimerek, melyek elsősorban strukturális építőelemként vagy tartaléktápanyagként vannak jelen az élőlényekben. Legfontosabb képviselőik a cellulóz, glikogén, amilóz, amilopektin (2-1. ábra).

2.1. ábra -


A molekuláris biológia objektumai, összefüggései, kísérleti tervezés

1.2. 2.1.2. Lipidek A lipidek (zsírok, olajok) fizikai tulajdonságaikban különböznek a többi makromolekulától. Részben, vagy teljesen hidrofób vegyületek, polimereket nem képeznek. Hidrofób tulajdonságuk a bennük lévő nyílt vagy gyűrűs, hosszú szénhidrogénláncoktól eredeztethető. A nyílt láncúak közül a legegyszerűbbek a zsírsavak, melyek lebontásával (oxidálásával) a sejtek igen jelentős mennyiségű energiához tudnak jutni. A telített és a telítetlen zsírsavak fontos alkotóelemei a triglicerideknek (tartaléktápanyag) és a foszfolipideknek


A molekuláris biológia objektumai, összefüggései, kísérleti tervezés (sejtmembrán-alkotó). A gyűrűs lipidek közül a legismertebbek a szteránvázas vegyületek és az eikozanoidok. A szteránváz négy egymáshoz kapcsolódó gyűrűből áll, melyekről különböző oldalláncok erednek. A legismertebb szteránvázas vegyület a koleszterin, mely fontos sejtmembrán-alkotó. A koleszterinből képződhetnek az epesavak és fontos szteroid hormonok is. A koleszterin zsírsavval képzett koleszterin-észterek formájában is szállítódhat vagy tárolódhat a sejtekben. Az eikozanoidok hosszú zsírsavból (arachidonsav) képződnek, egy gyűrűt tartalmaznak. Legismertebb képviselőik a prosztaglandinok, leukotriének, tromboxánok. Szerepük a sejtek közötti kommunikációban van (2-2. ábra).

2.2. ábra http://www.ambrogio-pagani.it/images/trigliceride.jpg; http://en.m.wikipedia.org/wiki/File:Prostaglandin_E1.svg - 2013.08.21.

1.3. 2.1.3. Fehérjék Az élő szervezetek tulajdonságainak döntő részét a bennük lévő fehérjék igen változatos felépítése teszi lehetővé. A változatos felépítés alapja a fehérjék alapegységeinek eltérő szerkezetében keresendő. Ezek az alapegységek az aminosavak. A Föld összes élőlényében mindössze huszonháromféle aminosav építi fel a fehérjéket, amelyekből húszféle minden élőlényben előfordul. Ezek a proteogén aminosavak az amino- és a karboxicsoportot összekötő szénatomhoz kapcsolódó oldalláncokban különböznek egymástól. Az aminosavak polimerizációja során létrejött polipeptidlánc az oldalláncok tulajdonságainak következtében feltekeredik, és jellegzetes struktúrát alkot, az adott polipeptidláncra kizárólagosan jellemző tulajdonságokkal (2-3. ábra). Az így létrejött fehérjék részt vesznek a sejtek és a sejtalkotók strukturális felépítésében, és szinte kizárólag fehérjékhez köthető az élőlényekben végbemenő biokémiai reakciók katalízise. Gyakran a feltekeredett fehérjék más fehérjékkel kapcsolódnak, fehérje-komplexeket hozhatnak létre. A komplexek létrejötte fontos előfeltétele lehet a fehérjék megfelelő működésének.



2.3. ábra http://www.pnas.org/content/102/22/7835/F1.large.jpg; http://photos1.blogger.com/blogger/4566/894/1600/ProteinStructure-pud.jpg 2013.08.21.

1.4. 2.1.4. Nukleotidok, nukleinsavak A nukleotidok olyan vegyületek, amelyek alapvetően három különböző jellegű részből állnak: egy gyűrűs monoszacharidból (pentózból), egy aromás szerves bázisból, és egy vagy több foszfát-csoportból (2-4. ábra). A pentóz alkotórész lehet ribóz vagy dezoxiribóz. Nukleotidok találhatóak a nukleinsavakban, de szerepelhetnek koenzimként, prosztetikus csoportként, vagy energiatároló molekulaként is. A nukleotidok polimerizációjával keletkeznek a nukleinsavak. A polimerizáció során pentóz-foszfát lánc keletkezik, amelyről szerves bázisok ágaznak le. A ribonukleinsavakban (RNS) adenin, guanin, citozin és uracil bázisok találhatóak, a dezoxiribonukleinsavakban (DNS) az uracil helyett timin van. Az RNS egyszálú, többféle funkciója lehetséges. Az mRNS-ek kódolják a fehérjék aminosav-szekvenciáját. A tRNS-ek szállítják az aminosavakat a fehérjeszintézis helyére, és felelősek a kódok felismeréséért (2-5. ábra). Az rRNS-ek a fehérjeszintézis komplexeiben, a riboszómákban találhatóak, ott strukturális és katalitikus funkciókat töltenek be. Számos más fontos funkcióhoz is szükségesek RNS-molekulák, például a splicinghoz, más RNS-ek éréséhez, telomérek szintéziséhez, génregulációhoz stb.


A molekuláris biológia objektumai, összefüggései, kísérleti tervezés A DNS antiparalel kettős szálat alkot, a szemben lévő szálak bázisai között hidrogénhíd (H-híd) kötések teremtik meg a kapcsolatot szigorúan meghatározott módon: adeninnel szemben mindig timin, guaninnal szemben mindig citozin található; előbbi kettő 2 db, utóbbi kettő 3 db H-híddal kapcsolódik egymáshoz (2-6. ábra). A DNS szerepe az információ tárolásában és továbbörökítésében van.

2.4. ábra -

2.5. ábra - https://wikispaces.psu.edu/download/attachments/54886630/figure_17_12.jpg - 2013.08.21.

2.6. ábra 2012.11.20.

-

http://www.chemguide.co.uk/organicprops/aminoacids/dna1.html


-


2. 2.2. A molekuláris biológia összefüggései A molekuláris biológia nem egy teljesen különálló tudományág, más tudományágakkal szorosan összefügg, átfed. A molekuláris biológiai technikák alkalmazásával vizsgált makromolekulák sem önmagukban léteznek a természetben, élő rendszerek (sejtek, szövetek) alkotóelemei. Ez az alfejezet ezeket az összefüggéseket tárgyalja; röviden összefoglaljuk a makromolekulák (elsősorban a nukleinsavak és a fehérjék) keletkezését, sejtben betöltött szerepüket, és szót ejtünk a molekuláris biológiával rokon tudományterületekről.

2.1. 2.2.1. Sejtek Az élőlények alapegysége a sejt. A sejteket kívülről sejtmembrán határolja, mely egy kettős foszfolipid-réteg, benne integráns fehérjemolekulákkal. A membránon belül található viszkózus állományt nevezzük citoplazmának. A citoplazma legnagyobb részét víz alkotja, de nagy mennyiségben találhatóak benne fehérjeés RNS-molekulák. A prokarióta sejtekben nincsenek sejtszervecskék, a DNS-állomány nincs elválasztva a citoplazmától. Az eukarióta sejtekben már találunk sejtszervecskéket, melyeket szintén foszfolipid kettős membrán határol. A DNS itt a sejtmagban található. Az eukarióta sejtek sejtmembránjában foszfolipideken és fehérjéken kívül egy másik fajta lipid, koleszterin is található. A sejtmagon kívül számos más sejtszervecske is található az eukarióta sejtekben: mitokondriumok, endoplazmás retikulum (ER), Golgi-készülék, lizoszómák, peroxiszómák. Növényi sejtekre jellemző organellumok a színtestek (plasztisz) és a vakuólum (2-7. ábra). A mitokondriumok és a színtestek valamikor önálló prokarióta élőlények voltak, saját DNSállománnyal rendelkeznek.

2.7. ábra - http://www.phschool.com/science/biology_place/biocoach/cells/review.html 2012.11.23.





2.2. 2.2.2. Makromolekulák keletkezése Az örökítés során a DNS szemikonzervatív úton megkettőződik (replikálódik); a két szál elválik egymástól, és mindkét szálra megszintetizálódik az antiparalel komplementer szál. A két új DNS adja az osztódás során keletkező két sejt genetikailag identikus örökítőanyagát. A sejtben a DNS többszörösen feltekeredik, hogy a rengeteg kódolt információt viszonylag kis helyen tárolhassa. Az információ kisebb szakaszokban, ún. génekeben tárolódik a hosszú láncon belül. Ezekről a génekről történik az RNS-ek átíródása (transzkripció) egy pontosan meghatározott polimerizációs reakciósorozat folyamán. A sejt szükségleteinek megfelelően mindig csak bizonyos génekről történik RNS-átíródás, a többi gén nem működik. A képződött mRNS-ekről (eukariótákban a poszttranszkripciós érést követően) végül fehérjék íródnak át. (A képződött tRNS-ekről és rRNS-ekről nem történik fehérjeátírás). Ezt a folyamatot transzlációnak hívjuk, az mRNS nukleotidsorrendje lefordítódik a keletkező fehérje aminosav-sorrendjére. A jó néhány évtizede lefektetett, ún. centrális dogma szerint tehát a DNS kódolhat DNS- és RNS-átírást, az RNS pedig kódolhat fehérjeátírást (2-8. ábra). Ma már tudjuk, hogy RNS szolgálhat mintául DNS és RNS közvetlen átírásához is.

2.8. ábra - http://www.cbs.dtu.dk/staff/dave/central_dogma.gif - 2013.08.21.



A szénhidrátok és lipidek makromolekulái energiaigényes, soklépéses biokémiai reakciókban keletkeznek kis molekulatömegű alapegységekből. A biokémiai reakciók katalizátorai döntő többségben specifikus fehérjék, melyek aminosav-sorrendje a sejt DNS-ében van kódolva, ily módon a sejt összes makromolekulájának keletkezése végső soron visszavezethető a benne található DNS bázissorrendjére.

2.3. 2.2.3. Határtudományok Az élőlények tulajdonságainak és a bennük található örökítőanyagnak a kapcsolatát a genetika tudománya vizsgálja. A sejtek, sejtszervecskék struktúráját és viselkedését a sejtbiológia, a sejtek tulajdonságainak és a bennük lévő fehérjéknek a kapcsolatát pedig a biokémia tudományág tanulmányozza. A molekuláris biológia az említett tudományokkal nagyrészt átfed, megpróbál kapcsolatot teremteni gének, fehérjék és tulajdonságok között. Molekuláris biológiának leginkább azokat a kísérleti módszereket hívjuk, amelyek alkalmazásával ezek a kapcsolatok kideríthetők. Ma már a genetikusok, sejtbiológusok és biokémikusok többsége használ


A molekuláris biológia objektumai, összefüggései, kísérleti tervezés molekuláris biológiai módszereket kutatásai során, ezért ez a három, eredetileg jól körülhatárolható tudományterület kezd egyre inkább összefolyni (2-9. ábra).

2.9. ábra -

3. 2.3. Kísérleti tervezés A problémák molekuláris biológiai oldalról történő megközelítésének van egy általános kísérleti sémája. Természetesen nem minden kísérleti rendszerben szükséges a teljes sémán végigmenni, de ez egy jó kapaszkodót nyújt, ha egy feltett tudományos kérdésre kísérletek útján szeretnénk megtalálni a helyes választ. Az esetek többségében valamilyen élő rendszerből indulunk ki, és valamely rá jellemző makromolekulát szeretnénk megvizsgálni vagy manipulálni. Ehhez a különböző alkotóelemeket el kell különítenünk egymástól, egy adott molekulatípusra fókuszálva. Ilyenkor az adott molekulatípust (RNS-eket, fehérjéket, DNS-t stb.) izolálnunk kell a szövetből vagy a sejtkultúrából. A molekulatípusok különböző tulajdonságait felhasználva, megfelelő izolálási technikák segítségével tudjuk ezt megtenni. Bizonyos molekulatípusokon (DNS, RNS) belül a molekulák hasonló tulajdonságúak, míg más esetekben (pl. fehérjék) a tulajdonságok nagyon eltérőek lehetnek. Az izolálási lépések során használt, a későbbi felhasználás szempontjából felesleges vagy káros anyagokat különböző tisztítási mechanizmusokkal tudjuk eltávolítani. Gyakran előfordul, hogy az így kapott heterogén keveréket további részekre szükséges bontanunk, akár addig, hogy csak egyetlenegy fajta molekulát kapjunk. Legtöbbször ezt valamilyen elválasztási technikával oldjuk meg, az adott molekulára jellemző specifikus fizikai tulajdonságo(ka)t kihasználva. Az izolálási, tisztítási, elválasztási folyamatok szükségszerűen felcserélődhetnek, ismétlődhetnek, akár változó kondíciókkal. Minden esetben a megfelelő tisztaságú és mennyiségű makromolekula kinyerése a célunk. 26 Created by XMLmind XSL-FO Converter.

A molekuláris biológia objektumai, összefüggései, kísérleti tervezés Az izolálási, tisztítási, és elválasztási folyamatok során kapott termékünket ellenőriznünk kell. Ehhez valamilyen azonosítási módszerre van szükségünk. Ha az izolált és azonosított termék bizonyos paramétereit szeretnénk kideríteni, akkor különböző vizsgálati módszereknek is alávethetjük. Bizonyos esetekben nem csak tisztított, hanem tisztítatlan mintákból is történhet az azonosítás vagy a vizsgálat. Ilyenkor az adott molekula jelenlétét különböző analitikai módszerekkel tudjuk kimutatni. Előfordul, hogy a makromolekula azonosításával, vagy minőségi/mennyiségi vizsgálatával le is zárul a kutatás kísérletes része. Az esetek egy részében azonban a kitisztított anyagot valamiféleképpen manipulálni szeretnénk, hogy a megváltoztatott kémiai szerkezet hatására bekövetkező biokémiai/élettani tulajdonságok változását tanulmányozhassuk. A manipuláció után szinte törvényszerűen ismétlődnek majd a szükséges izolálási, tisztítási, elválasztási, azonosító és vizsgálati lépések. A tulajdonságok sikeres megváltoztatását minden esetben ellenőrizni kell, a hatásukra létrejött biokémiai/élettani változásokat pedig kísérletesen mérni szükséges (lehetőleg numerikusan) (2-10. ábra). A kísérleteket mindig a legnagyobb előrelátással, a lehetséges zavaró körülmények kiiktatásával kell megtervezni. Igyekezzünk a már bevált technikák minél pontosabb adaptációjára, a körülmények standardizálására. A kísérletekben elengedhetetlen a megfelelő kontrollok használata. A negatív kontrollok használata esszenciális, de amennyiben lehetséges, pozitív kontrollokat is használjunk.

2.10. ábra -


3. fejezet - Elválasztási technikák Az egyes molekulákat bizonyos fizikai és kémiai tulajdonságaik (méret, tömeg, elektromos töltés, polaritás) különbözőségét kihasználva tudjuk elválasztani egymástól. Az elválasztáshoz legtöbbször valamilyen külső hajtóerő alkalmazása szükséges. Ilyen hajtóerő például a nyomás, a gravitációs erő, az elektromos vagy mágneses erőtér. Ezeket a hajtóerőket egyesével, vagy akár kombinálva is használhatjuk az egyes elválasztási technikák során. A fejezetben az egyes technikákat ismertetjük, mint látni fogjuk, hasonló elven alapuló elválasztási technikák hajtóereje lehet más és más.

1. 3.1. Szűrés, koncentrálás A legegyszerűbb és legtöbbet használt technikák közé tartoznak, alkalmazásukkor többnyire a részecskék méretének, illetve adott térfogatra vonatkoztatott tömegének különbözőségét használják ki. Legtöbbször szennyeződéseket, mikroorganizmusokat, víruspartikulumokat vagy makromolekulákat szoktunk ezekkel a módszerekkel eltávolítani az oldatból. Szűrés során különböző mérettartományba eső molekulákat tudunk egymástól elválasztani. Valamilyen porózus membránra van szükségünk, amelynek pórusmérete meghatározza, hogy mekkora részecskék tudnak átjutni az egyik oldalról a másikra. A molekuláris biológiában elsősorban mikroorganizmusokat vagy makromolekulákat (pl. fehérjéket) szoktak elválasztani egymástól, vagy más jellegű anyagoktól. A legegyszerűbb szűrők a medicinában általánosan használatos műanyag fecskendőkre illeszthetőek, a megszűrendő oldatot a fecskendő dugattyújának nyomásával préseljük át a membrán pórusain. Molekuláris biológiában a szűrést leginkább sterilizálásra használják. Ha a szűrő sterilizálva volt, és a pórusméret elég kicsi (átmérője 0,2 µm), akkor ezen a módon tudunk hőérzékeny anyagot (pl. fehérjéket, szénhidrátokat) tartalmazó oldatokat csírátlanítani (ezáltal steril oldatokat kapunk). Ha nagyobb mennyiségű steril oldatra van szükségünk, akkor vákuum segítségével tudjuk átszívatni oldatunkat a szűrőn keresztül (3-1. ábra). Az egyszer használatos steril műanyag szűrők elég drágák, érdemes csak akkor használni őket, ha a csírátlanítás más úton (pl. hőkezeléssel) nem valósítható meg.

3.1. ábra http://www.vial-seals.com/Images/nalgene-syringe-filters.jpg; http://static.coleparmer.com/large_images/2953002APP.jpg - 2013.08.21.

A szűrés egyik speciális esete a koncentrálás. Ilyenkor a membrán pórusain keresztül kipréseljük a folyadék többségét, hogy a pórusoknál nagyobb részecskék (víruspartikulumok, fehérjék stb.) a maradék, jóval kisebb térfogatú folyadékrészben immár nagyobb koncentrációban legyenek jelen. A folyadék átpréseléséhez többnyire centrifugális erőt használunk. Igen változatos térfogatú, pórusméretű és felépítésű koncentrátorokat tudunk vásárolni a biotechnológiai cégektől (3-2. ábra).


Elválasztási technikák

3.2. ábra - http://scientiis.com/laboratorium/catalog/images/Laboratory/F-2731-3.jpeg 2013.08.21.

A szűrés másik, igen gyakran használt speciális esete a dialízis. Akkor használjuk, ha kisebb méretű részecskéktől, pl. bizonyos ionoktól szeretnénk megtisztítani az oldatban lévő makromolekuláinkat (3-3. ábra). A dializálandó oldatunkat megfelelő pórusméretű dialízis-zsákba töltjük, melynek két végét speciális csipesszel légmentesen lezárjuk. A zsákot ezután egy nagy térfogatú, az eltávolítandó részecskéket nem tartalmazó folyadékba helyezzük, melynek következtében az eltávolítandó részecskék lassú diffúzióval kihígulnak a zacskóban (3-4. ábra). A folyamatot akár többször is megismételhetjük a dializáló oldat rendszeres lecserélésével. A dialízis viszonylag lassú folyamat, érdemes a dializáló oldatot folyamatosan, lassan kevertetni, és a makromolekulák (pl. fehérjék) degradációját megelőzendő hidegben (pl. hideg szobában vagy hűtőben) végezni. A dialízis egyik fejlettebb változata, hogy nem csipesszel lezárt dialízismembrán-zacskóba, hanem előre gyártott dialízis-kazettába töltjük a dializálandó oldatot. Ilyenkor a kazetta peremén található lyukon keresztül megfelelő méretű injekciós tűvel fecskendezhetjük be, vagy szívhatjuk ki az oldatunkat (3-5. ábra).

3.3. ábra 2013.08.22.

-

http://upload.wikimedia.org/wikibooks/en/d/dd/Dialysis_bag.png


-


3.4. ábra - http://www.piercenet.com/media/SnakeSkinBeaker190x233.jpg - 2013.08.22.

3.5. ábra - https://static.thermoscientific.com/images/F139899~wl.jpg - 2013.08.22.

2. 3.2. Centrifugálás 30 Created by XMLmind XSL-FO Converter.


Talán a legelterjedtebb elválasztási forma a centrifugálás. Az elválasztás sűrűség szerint történik. A centrifuga tulajdonképpen megnöveli azt a gravitációs erőteret, melynek segítségével a nagyobb sűrűségű molekulák a cső aljára ülepednének, csak nagyon lassan. A sokszorosára (gyakran sok ezerszeresére) növelt erőtér segítségével az ülepedés jelentősen meggyorsítható. Jellemzően centrifugálással lehet csapadékokat és sejtalkotókat ülepíteni folyadékokból, különböző folyadékfázisokat szeparálni egymástól, vagy sűrűséggradiens segítségével szeparálni különböző tömegű partikulumokat, molekulákat. A centrifugálás során sosem szabad elhanyagolni a kiegyensúlyozást; a rotorban úgy kell elhelyeznünk az azonos tömegű csöveket, hogy a centrifugálás során a rotor tengelyére ható erők összege 0 legyen. Ellenkező esetben súlyos, maradandó károsodást okozhatunk a műszerben vagy/és a rotorban. Igények szerint többféle centrifugatípusból választhatunk. Kis mennyiségű minta esetén mikrocentrifugát érdemes használni. A 0,2–2 ml végtérfogatú centrifugacsövekben szögrotor segítségével maximum 15 000– 30 000 g relatív gyorsulás segítségével választhatjuk el a frakciókat. Nagyobb térfogatú mintákhoz vagy nagyobb fordulatszámhoz nagyobb méretű és teljesítményű centrifugát kell használni. Biológiai mintákról lévén szó, fontos, hogy a centrifugatér hűthető legyen. Leggyakoribb a 4 ºC hőmérsékleten történő centrifugálás. Ezekbe a centrifugákba többnyire különböző nagyságú és alakú centrifugacsövek illeszthetőek, attól függően, milyen rotort és milyen csőtartót használunk a centrifugáláshoz. A rotorok többnyire egymással cserélhetőek; többféle szögrotor és többféle kilendülőfejes rotor tartozhat ugyanahhoz a centrifugához. (Szögrotorban a forgás során a minták mindig ugyanabban a szögben állnak, míg kilendülőfejes rotorban a minták a forgás hatására kilendülnek. Utóbbi esetben az ülepítés mindig a cső alja irányába történik.) A rotorok jellege szabja meg az elérhető maximális fordulatszámot is. Ha nagyon nagy relatív gyorsulásra van szükségünk (például bizonyos sejtalkotók izolálásakor), akkor ultracentrifugát kell használnunk. Az ultracentrifugák nagyon alacsony nyomáson és mindig hűtött állapotban üzemelnek, hogy a levegő ellenállása kisebb legyen és a rotorok nagy forgási sebességének hőtermelését kompenzálják. Segítségükkel akár több százezer (akár egymillió) g relatív gyorsulás is elérhető.

3.6. ábra http://img.medicalexpo.com/images_me/photo-g/laboratory-microcentrifuge-68382-102771.jpg; http://eshop.eppendorfna.com/upload/productView/Eppendorf-5804R_MultipurposeCentrifuge-open.jpg; http://fraden.brandeis.edu/figs/techniques/optima_xli.jpg2013.08.22.



3.7. ábra http://eshop.eppendorfna.com/upload/productView/Eppendorf_5430_rotor_F-35-630.jpg; http://eshop.eppendorfna.com/upload/productView/Eppendorf_58045810_Rotor-A-4-44_4x100ml.jpg - 2013.08.22.



Ultracentrifuga segítségével használatos a gradiens centrifugálás technikája. Ilyenkor viszonylag nagy sűrűségű anyagok segítségével a centrifugacsőben sűrűséggradienst hozhatunk létre a különböző sűrűségű oldatok óvatos egymásra rétegezésével (3-8A. ábra), vagy hosszú ideig tartó, a mintával együtt történő centrifugálással (3-8B. ábra). Az előbbi esetben a szedimentációs tulajdonságuk, az utóbbiban a sűrűségük alapján választhatóak el az anyagok. Leggyakrabban cézium-kloridot (például nukleinsavak és fehérjék elválasztásához), szacharózt, ficollt vagy percollt (sejtalkotók vagy víruspartikulumok elválasztásához) használnak sűrűséggradiens-képző anyagként.

3.8. ábra http://www.sigmaaldrich.com/technicaldocuments/articles/biofiles/centrifugation-separations.html - 2013.08.22.



3. 3.3. Kromatográfia Kromatográfia során a molekulákat egy folytonos (többnyire szilárd, vagy szilárdhoz adszorbeálódott folyadék) „álló fázis”, és a mintánkat tartalmazó, az álló fázison keresztülhaladó „mozgó fázis” segítségével választjuk el. 34 Created by XMLmind XSL-FO Converter.


Az elválasztás a molekulák valamely fizikai vagy kémiai tulajdonsága alapján történik. Aszerint, hogy az elválasztandó molekulák mely jellegzetes tulajdonságát használjuk ki, megkülönböztetünk kizárásos, megoszlási, adszorbciós, ioncserés és affinitás kromatográfiákat. A mozgó fázis jellege szerint megkülönböztetünk gáz- és folyadékkromatográfiát. A kromatográfia legtöbbször egy henger alakú (gázkromatográfia esetén spirál alakban feltekert, igen hosszú) csőben történik (oszlopkromatográfia, 3-9. ábra), de történhet kromatográfia vékony rétegen (pl. speciális papírlapon) is. Különbözőféleképpen detektálhatjuk a kromatográfiás elválasztás eredményét. Detektálhatunk látható, infravörös vagy ibolyántúli fényt, fluoreszcenciát, radioaktív sugárzást, vagy használhatunk tömegspektrométert is az azonosításhoz.

3.9. ábra - http://lab-training.com/wp-content/uploads/2011/12/liquid-Chromatographycopy2.jpg - 2013.08.23.

3.1. 3.3.1. Kizárásos kromatográfia Kizárásos kromatográfiával eltérő méretű molekulákat tudunk elválasztani egymástól. Az elválasztás lényege, hogy az oszlopot olyan apró gyöngyökkel töltjük meg, amelyeknek a belseje szivacsszerűen üreges. (Az apró gyöngyök többnyire agarózból, dextránból vagy poliakrilamidból készülnek, a folyadékban géles állagú anyagot alkotnak. Ezt a kromatográfiatípust ezért gélkromatográfiának is nevezik.) Az elválasztandó anyagot tartalmazó mintát az oszlop tetejére tesszük, majd hagyjuk, hogy az oszlopon keresztülfolyva az elválasztott mintánk végül az oszlop alján távozzon. Az oszlopot felülről folyamatosan folyadékkal tápláljuk, az alul kifolyó mintát pedig frakciónként összegyűjtjük. Az oldatban lévő nagyobb molekulák méretük miatt nem képesek a gyöngyök belsejébe hatolni, ezért a köztük lévő réseken keresztül viszonylag gyorsan az oszlop aljára érnek, így a korábban leszedett frakciókban találhatóak. A kisebb molekulák azonban bejutnak a gyöngyökbe, ott zegzugos útjuk hosszabb ideig tart, ezért csak később érnek az oszlop aljára, így a későbbi frakciókban találjuk majd meg őket.

3.2. 3.3.2. Adszorpciós kromatográfia Az adszorpciós kromatográfia során azt használjuk ki, hogy az elválasztandó molekuláknak eltérő a polaritásuk. Attól függően, hogy az elválasztandó molekulák polaritása inkább az álló fázis, vagy inkább a mozgó fázis polaritásához hasonlít jobban, lassabban vagy gyorsabban fognak mozogni. Itt az oszlop polaritási tulajdonságai határozzák meg, hogy az adott anyag milyen gyorsan halad át rajta. Minél hasonlatosabb a molekula polaritása az oszlopéhoz, annál jobban kötődik hozzá, annál lassabban halad át rajta. Természetesen különböző oldószerek vagy oldószerkeverékek használatával jelentősen változtatható az asszociáció foka. Az adszorpciós kromatográfia egyik fajtája a gázkromatográfia is. Itt nem folyadék, hanem inert gáz áramlik az oszlopban (többnyire hélium, nitrogén vagy hidrogén), ez szállítja az elpárologtatott mintából származó molekulákat (3-10. ábra).



3.10. ábra - http://teaching.shu.ac.uk/hwb/chemistry/tutorials/chrom/gcdiag.gif; http://www.kth.se/polopoly_fs/1.171222!/image/GC6890.jpg - 2013.08.23.

3.3. 3.3.3. Megoszlási kromatográfia A megoszlási kromatográfia is hidrofil és hidrofób kölcsönhatásokon alapszik. Az elválasztás elősegítésére különböző polaritású komponensekből álló oldószerkeverékeket alkalmazunk. A szilárd fázishoz inkább hasonló polaritású oldószerkomponens molekuláinak egy része a gyöngyökhöz tapad, ezek alkotják a tulajdonképpeni álló fázist. Az elválasztandó anyagok polaritásuknak megfelelően oszlanak meg az álló és a mozgó fázis odószerkomponensei között. Ha a keverékben növeljük az álló fázis polaritási tulajdonságaival megegyező polaritású komponens arányát, akkor az az elválasztandó molekulák motilitásának megnövekedését fogja eredményezni (mivel a mozgó fázis oldószerkeverékének polaritása hasonlóbb lesz az álló fáziséhoz). Tipikus megoszlási kromatográfia a papír- és a vékonyréteg-kromatográfia (3-11. ábra). Az oldószer mozgatásának hajtóerejét itt a hajszálcsövesség adja. Hidrofil álló fázison inkább a hidrofób oldószer-molekulák, hidrofób álló fázison inkább a hidrofil oldószer-molekulák és a bennük jobban oldódó anyagok haladnak gyorsabban.

3.11. ábra http://www.uwplatt.edu/chemep/chem/chemscape/labdocs/catofp/chromato/tlc/pic/rfcalc .gif - 2013.08.23.



3.4. 3.3.4. Ioncserés kromatográfia Az ioncserés kromatográfiával töltéssel rendelkező részecskéket tudunk elválasztani egymástól. Ilyenkor az álló fázis (az oszlopban lévő gyanta) töltéssel rendelkező funkciós csoportokat tartalmaz, a mozgó fázis ellenkező töltésű molekulái (például az elválasztani kívánt anyagok) képesek megtapadni a gyanta felszínén. Az elúció során az oszlopon átfolyó oldószer összetételét megváltoztatjuk, vagy a pH-t változtatjuk, vagy az ionerősséget növeljük benne. Előbbi esetben a kapcsolódó anyagok töltésének megváltozása, utóbbi esetben az ellenionok kompetíciója miatt a megkötődött anyagok eluálódnak az oszlopról. Az elúció függ az anyagunk töltésének erejétől, és az oldószer ionerősségétől. Gyakran lépcsőzetes, vagy gradiens elúcióval lehet egy adott molekulát elválasztani a többitől (az előbbi esetben az oldószer összetételét szakaszosan, az utóbbi esetben folyamatosan változtatjuk).

3.5. 3.3.5. Affinitás kromatográfia 37 Created by XMLmind XSL-FO Converter.


Affinitás kromatográfia esetén az oszlopra olyan anyag van kötve, mely nagy affinitással, specifikusan köt az elválasztani kívánt molekulához. Jó példa erre, ha egy enzimfehérjét szeretnénk tisztítani, ekkor a szubsztrátot, vagy ahhoz nagyon hasonló molekulát kell kötnünk az oszlophoz. Specifikus antitestekkel is tudunk fehérjéket tisztítani affinitás-oszlopon. Az affinitás kromatográfia csak egyféle anyag (többnyire egyféle fehérje) megtisztítására szolgál. Az elúció a pH vagy az ionerősség változtatásával, illetve szabad specifikus kötőmolekula (pl. a szubsztrát) nagy feleslegben történő adásával kivitelezhető.

4. 3.4. Gélelektroforézis Gélelektroforézis segítségével a makromolekulálat három fizikai tulajdonságuk, a méretük, alakjuk és a töltésük alapján tudjuk elválasztani. A gél egy térhálós szerkezetű anyag, mely a háló fonalai között igen sok vizet (jelen esetben megfelelő ionerejű és kémhatású puffert) tartalmaz. A gélelektroforézist leggyakrabban nukleinsavak és fehérjék elsősorban méret szerinti elválasztására használják. A nukleinsavak fajlagos (adott méretre vonatkoztatott) töltése ugyanannyi, ezért ha alakjuk is megegyezik (pl. mind lineáris), akkor az elválasztás kizárólag a méretük szerint megy végbe. A fehérjék töltése függ a bennük lévő aminosavak minőségétől és a futtató puffer kémhatásától. Ha azt szeretnénk, hogy a fehérjék is csak a molekulatömegük szerint választódjanak el, és a mozgás sebességét sem a fehérje töltése, sem az alakja ne befolyásolhassa, akkor a fehérjék inter- és intramolekuláris kapcsolatait meg kell szüntetnünk, és a nukleinsavakéhoz hasonló, fajlagosan közel azonos töltést kell létrehoznunk. Méret szerinti elválasztás esetén nem szabad elfeledkeznünk arról, hogy az ismeretlen mintáink mellett mindig kell futtatnunk egy ismert tömegű/hosszúságú fehérjéket/nukleinsevakat tartalmazó ún. molekulamarkert. A gélelektroforézisnek a térhálót alkotó anyag minőségétől függően két fajtája van: az agaróz és a poliakrilamid gélelektroforézis.

4.1. 3.4.1. Agaróz gélelektroforézis Tengeri vörösmoszatokból nyerhető az agar-agar nevű gélképző anyag, melyet már a középkori Japánban használtak zselésítésre, táplálékok készítésére. Ma is használják, a molekuláris biológiában és a mikrobiológiában elsősorban baktériumok, élesztőgombák, vagy növényi kalluszok tenyésztéséhez, mint a táptalajok szilárdító közegét. Alapvetően kétféle poliszacharid építi fel, a kémiailag heterogén molekulákból álló agaropektin és a homogén agaróz. Az agaróz poliszacharid agarobióz építőkövekből áll, mely egy diszacharid: D-galaktóz és 3,6-anhidro-L-galaktopiranóz kapcsolódik egymáshoz 1-4 kötéssel (3-12. ábra). Az agarózt porszerű kiszerelésben árusítják, melyet 0,7–4 tömegszázalékban szokták a folyadékhoz (megfelelő összetételű pufferhez) keverni, majd melegítéssel csaknem 100 °C-on felolvasztani. A felolvasztott gél kb. 45 °C-ig lehűlve nem szilárdul meg. Megszilárdulás után ismét csak magas hőmérsékleten (100 °C) olvad meg újra. Ezt a jelenséget hiszterézisnek nevezzük (3-13. ábra).

3.12. ábra - http://images.usbio.net/agarose_polymere.jpg - 2013.08.23.

3.13. ábra - http://students.washington.edu - 2011.02.12.



A felolvasztott agaróz gélt addig kell kevertetnünk, amíg teljesen homogén, szinte víztiszta nem lesz. Ezután vízfürdővel 50-55 °C-ig kell hűtenünk, mert a túl forró folyadék tönkreteheti a műanyag tálcát. A gélt ezután vízszintes felületre helyezett, megfelelően (pl. ragasztószalaggal) elmaszkolt speciális tálcába öntjük. A minták felviteléhez ún. zsebek szükségesek, ezért a gél fölé, az egyik oldal közelébe csaknem a tálca aljáig leérő műanyag „fésűt” illesztünk, hogy a gél megszilárdulása után a fésű fogainak helyén üregek (zsebek) maradjanak (3-14. ábra). A gél megszilárdulása után a fésűt óvatosan kihúzzuk a zsebekből (érdemes előtte a fésű környékét megnedvesítenünk, hogy a keletkező vákuum ne szakítsa ki a zsebeket). A tálca két végét szabaddá kell tennünk (pl. leszedjük a ragasztószalagot), majd a tálcát egy ún. gélfuttató kádba helyezzük. A kádat megfelelő ionerősségű futtató pufferrel töltjük, hogy az éppen ellepje a gélünket. Ezután pipettázzuk az elválasztandó mintát a gélzsebekbe. Mivel a mintákhoz glicerint kevertünk, azok lesüllyednek a zsebek aljába (ez a szintén a mintákhoz kevert brómfenolkék festék miatt jól látszik). Ha minden mintát betöltöttünk, rátesszük a futtatókádra a tetejét, és elektromos áram segítségével a gélen elválasztjuk makromolekuláinkat (315. ábra).

3.14. ábra http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/2/2a/Agarose_Gel,_with_Comb_insert ed,_in_a_Gel_Tray_(Front,_angled_view)_-_SketchUp.png - 2013.08.23.

3.15. ábra http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/1/11/AgaroseGelelektrophorese.png - 2013.08.23. 39 Created by XMLmind XSL-FO Converter.


Agaróz gélelektroforézis során jellemzően nukleinsavakat választunk el egymástól. A nukleinsavak negatív töltésűek, mindig a pozitív pólus felé futnak, csakúgy, mint a vizualizáció elősegítésére felvitt festékek (brómfenolkék, xiléncianol stb.). Futtatás közben a nukleinsavak nem látszanak (a 3-15. ábra kissé megtévesztő lehet), a gélen futó festékek fognak nekünk segíteni, hogy mennyi ideig szükséges az elektroforézist folytatni. Az agarózgél viszonylag nagy tartományban (0,1–20 kilobázispár) képes a nukleinsavakat elválasztani, de a gél felbontása elég rossz. Kisebb fragmentek elválasztásához töményebb, nagyobb fragmentek elválasztásához hígabb gélt használunk. A futtatáshoz használt pufferben Tris-hidroximetil-aminometán (TRIS), etilén-diamin-tetraecetsav (EDTA) és borát vagy acetát található. (A puffer neve ezért TBE vagy TAE, ugyanaz a puffer található a gélben is.) A megfelelő ideig történt futtatás után a feszültséget kikapcsoljuk, és a gélt megfestjük. A nukleinsavak esetében a gélt valamilyen, a nuleinsavakhoz kötődni képes, interkalálódó fluoreszcens festék (például etídiumbromid, EtBr) oldatában inkubáljuk, majd az elválasztott nukleinsavakat a fluoreszcens festéket gerjeszteni képes fénnyel (etídium-bromid esetében UV-fénnyel) vizualizálhatjuk (3-16. ábra).

3.16. ábra - http://www.musee-afrappier.qc.ca/images/site/large/gel-agarose-adn-nicolecatellier.jpg - 2013.08.23.



4.2. 3.4.2. Pulzáló erőterű gélelektroforézis Nagyobb DNS-fragmentek elválasztása is megvalósítható agaróz gélelektroforézissel. Ehhez azonban az szükséges, hogy a DNS-darabok ide-oda mozgatásával elősegítsük a térhálón történő átjutásukat. Ezt úgy oldjuk meg, hogy az elektromos erőtér pozitív pólusa nem mindig a gél alja felé húzza a nukleinsavat, hanem időről időre más irányba is. Ehhez speciális elektroforézis készülék szükséges. Többfajta is ismeretes, a legismertebbek nem lefelé (a gél alja felé), hanem felváltva, bizonyos szögben jobbra-balra rángatják a DNS-t. Ennek a rángatásnak az eredője egy lefelé irányuló futtatás (3-17. ábra).

3.17. ábra https://lh3.googleusercontent.com/70aOb5sik9M/ShOg05PUyII/AAAAAAAABuA/d0IIlC_4XKY/AMG410b.jpg 2013.08.22.

4.3. 3.4.3. Poliakrilamid gélelektroforézis (PAGE) Az akrilamid (3-18. ábra) kettős kötésének köszönhetően képes polimerizálódni, hosszú láncok képződhetnek. Ha N,N’-metilén-biszakrilamiddal (biszakrilamid, bisz) együtt polimerizálódik, az két szomszédos láncba is 41 Created by XMLmind XSL-FO Converter.


beépülhet, összekötve azokat. Így egy térhálós szerkezet alakulhat ki, mely hidrofil tulajdonsága miatt gélképző anyag. Ez a térháló kovalensen kötött, melegítésre sem olvad meg. A térháló sűrűségét megszabja az oldott akrilamid koncentrációja és az akrilamid/biszakrilamid aránya (3-19. ábra).

3.18. ábra -

3.19. ábra - http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/6/65/Acrylamide_gel_(zhcn).svg - 2013.08.23.



A gél elkészítéséhez általában előre elkészített akrilamid/bisz tömény (30%, 40%) oldatát szoktuk használni, melyben az akrilamid:biszakrilamid arány előre meghatározott (19:1, 29:1, 37,5:1). A gélt vízzel és pufferrel megfelelő arányban kihígítjuk, szükség esetén detergenst is adunk az oldathoz. A poliakrilamid géleket vertikálisan (függőlegesen) futtatjuk, és így is készítjük el őket. Két üveglapot megfelelő műanyag lapkák (spacerek) segítségével olyan közel szorítunk egymáshoz, hogy a két lap közötti távolság igen csekély, 0,75–2 mm legyen. Az üveglapok alját gumipárnára szorítjuk, hogy a közéjük töltött gél alul ne folyjon ki (az oldalán ezt a spacerek akadályozzák meg). Az előbb elkészített akrilamidos folyadékhoz katalizátorokat, ammóniumperszulfátot (APS) és tetrametilén-diamint (TEMED) adunk, amely elősegíti a polimerizációt. Gyors keverés



után az oldatot légmentesen a két üveglap közé kell töltenünk, ahol körülbelül 20 perc alatt megszilárdul (3-20. ábra).

3.20. ábra - http://www.di.uq.edu.au/sparq/images/sdspage.jpg - 2013.08.23.

Ha nukleinsavakat futtatunk, futtató puffernek az agaróz gélelektroforézisnél megismert puffert (pl. TAE, TBE) használunk. Általában rövidebb DNS-fragmentumokat (pl. PCR primerek) szoktak elválasztani tömény (20%) poliakrilamid gélen, mert a technika sokkal jobb felbontású, mint az agarózgél-elektroforézis. Ilyenkor általában 19:1 akrilamid:biszakrilamid keveréket használunk a gél készítésénél. Mivel a fehérjék eltérő töltésűek, fehérjék futtatásakor olyan futtató puffert kell választanunk, amely lúgos kémhatású. Ilyenkor a fehérjékben lévő aminosavak oldalláncainak többsége deprotonálódik, a fehérjék negatív töltésűek lesznek, és a pozitív pólus felé fognak futni. Azonban a fehérjék alakja, feltekeredettségének mértéke, és a fehérje-fehérje kapcsolatok többsége nem változik meg. Mivel a natív konformáció megmaradt, ezt natív gélelektroforézisnek hívjuk. Ha azt szeretnénk, hogy a nyílt láncú nukleinsavakhoz hasonlóan a fehérjék is csak a méretük szerint váljanak el, akkor a fehérjemintánkat megfelelő módon elő kell kezeljük, és a futtatópuffer összetételét is meg kell változtatnunk. A fehérjemintáinkhoz ilyenkor nátrium-dodecil-szulfát (SDS) detergenst és valamilyen redukálószert (β-merkaptoetanolt vagy ditiotreitolt (DTT) adunk. Az SDS a fehérjékhez aspecifikusan kötődik, kitekeri a fehérjéket és ionos tulajdonsága miatt megközelítőleg azonos fajlagos (negatív) töltést biztosít a fehérjéknek. A redukálószer melegítésre elredukálja az intermolekuláris diszulfidhidakat, végleg megszüntetve a fehérjék natív térszerkezetét. A futtató pufferbe szintén detergenst (SDS) kell tenni, hogy a fehérjék egységesen kitekeredett konformációja ne alakuljon vissza a futtatás során. SDS-PAGE során többnyire kétfázisú gélt kell öntenünk. Az alsó fázis (szeparáló gél) elkészítését már ismertettük, de itt SDS-t is kell az oldatba tennünk. és a gélt is csak bizonyos magasságig (a belógó fésűfogak alsó pereme alá néhány milliméterrel) tölthetjük az üveglapok közti rést. Az öntés után az alsó fázis tetejére valamilyen alacsony felületi feszültségű és fajsúlyú folyadékot (pl. izopropanolt vagy butanolt) kell rétegeznünk, hogy a megszilárdult gél felszíne buborékmentes és teljesen sík alakú legyen. Az alsó fázis megszilárdulása után a maradék alkoholt leöntjük, majd elkészítjük a gél felső fázisát (tömörítő gél) (3-19. ábra). Ez annyiban különbözik az alsó fázistól, hogy hígabb (4-5%, szemben az alsó fázis tipikusan 7,5–12,5%ától), és kémhatása savasabb (pH: 6,8 az alsó fázis pH: 8,8-hoz képest). Az APS és a TEMED hozzámérése után



a felső fázist rátöltjük a már megszilárdult alsó fázis tetejére, majd a fésű óvatos, légmentes beillesztése után hagyjuk azt is megszilárdulni. A kész gélt tartalmazó üveglapokat hozzáerősítjük a futtatókádhoz, majd a korábban már leírt módszer segítségével óvatosan kihúzzuk a fésűt a zsebekből. A futtatókád alsó és felső tartályát is feltöltjük futtató pufferrel, hogy a gél felső és alsó pereme buborékmentesen illeszkedjen a tartályokban lévő folyadékhoz. Ügyeljünk arra, hogy csak a gél zárja a két pólus közötti áramkört, máshol ne haladhasson át töltés, csak a gélen keresztül. A gél zsebeit futtatás előtt érdemes pipettával kitisztítani, mert az utólag polimerizálódott akrilamid hullámossá teheti a zsebek alját, vagy el is tömheti azokat. A minták zsebekbe töltését követően az elektroforézis a szokásos módon történik. Ha kétfázisú gélünk van, akkor a tömörítő gélben futva a mintánk a pH-különbségek (itt most nem ismertetendő következményei) miatt összetömörödik, és az elválasztandó fehérjék mintegy egy vonalban érik el a szeparáló gél felszínét. Itt kezdődik el a fehérjék elválása egymástól. A futtatás befejezése után a fehérjék több módon is detektálhatóak. Vagy aspecifikusan festjük őket coomassievagy ezüstfestékkel (3-21. ábra), vagy a fehérjéket membránra átvive, antitestekkel specifikusan mutathatjuk ki bizonyos fehérjék jelenlétét. (Ezt az utóbbi módszert a későbbiekben részletesen ismertetjük).

3.21. ábra -

4.4. 3.4.4. Kétdimenziós (2D) gélelektroforézis Ha egy sejt vagy sejtalkotó összes fehérjéit szeretnénk vizsgálni, akkor nem elég őket csak a méretük szerint vizsgálni, mert sok hasonló méretű fehérje lehet, amelyek elfedik egymást a gélen. Nagyon valószínű azonban, hogy nem fogunk két olyan fehérjét találni, amelyeknek a tömege és az izoelektromos pontja is ugyanaz. (Az izoelektromos pont az a kémhatás, ahol a fehérjék nettó elektromos töltése 0.) Ezt kihasználva az összes fehérjét el tudjuk választani egymástól, ha előbb izoelektromos pont szerinti, majd méret szerinti elválasztást végzünk. Az izoelektromos pont szerinti elválasztást egy folytonos pH-gradienst tartalmazó agaróz vagy poliakrilamid gélcsíkban hozzuk létre. Ezt hívjuk izoelektromos fókuszálásnak. A pH-gradienst a csíkban amfoter jellegű, ikerionos szerkezetű elektrolitok (amfolitok) hozzák létre, amelyeket többnyire három komponens statisztikus kondenzációjával hoznak létre. Elektromos áram hatására a fehérjék töltésüknek megfelelően mozognak. Közben protonokat adnak le vagy vesznek fel, a környezetükben lévő pH-tól függően. A vándorlás egész addig folytatódik, amíg a fehérje töltése 0 nem lesz, ott a fehérjék vándorlása megszűnik. A fókuszálás után a gélcsíkot egy SDS-poliakrilamid gél felszínére helyezzük, és a fehérjéket a tömegük szerint megfuttatjuk (3-22. ábra). Az izoelektromosan fókuszált és méret szerint megfuttatott fehérjék elkülönülnek egymástól, bármilyen festési technikával vizualizálhatóak.



3.22. ábra http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/b/ba/2D_electrophoresis.gif 2013.08.24.

-

5. 3.5. Kapilláris elektroforézis A kapilláris elektroforézis nem egy vertikális vagy horizontális gélben, hanem egy kapilláris belsejében történik. Ebből értelemszerűen következik, hogy egyszerre mindössze egyetlen minta futtatható egy kapillárisban. Többféle elv szerint történhet az elválasztás. A legismertebb az ún. elektroozmotikus áramlás elvén működő elválasztási technika, melynek során elsősorban töltéssel rendelkező részecskéket tudunk elválasztani egymástól, tömegük és töltésük alapján. A leggyakrabban használt technika során a kapilláris fala többnyire negatívan töltött, ezért az elektroforézisfolyadék pozitív ionjai kiülnek a kapilláris falára, mintegy pozitív hengert képeznek. (A negatív töltést például úgy lehet biztosítani, hogy a kapilláris belső falát egy könnyen deprotonálódó anyaggal, például Si-OH csoportokat tartalmazó szilanollal vonják be. A szilanol már pH=3 fölött deprotonálódik, így a semleges (vagy lúgos) pufferekkel történő elektroforézis során negatív töltést kap.) Amikor elkezdjük az elektroforézist, a pozitív henger a negatív pólus felé kezd vándorolni, húzza magával a henger belsejében lévő folyadékot. Ennek az lesz az eredménye, hogy a kapillárisban lévő folyadékoszlop egyenletesen vándorol a negatív pólus felé. A folyadékoszlopban lévő, elválasztandó anyagok is a negatív pólus felé vándorolnak. A pozitív töltésű ionok gyorsabban, a negatívok lassabban haladnak, mint a semleges molekulák. Minél nagyobb a töltés, és minél kisebb a részecske mérete, annál nagyobb lesz a futás eltérése a folyadékoszlop sebességével mozgó semleges molekuláéhoz képest (3-23. ábra). Fontos megemlíteni a kapilláris gélelektroforézist, mely során különböző nagyságú töltéssel rendelkező polimereket (például DNS-darabokat) tudunk elválasztani egymástól. A kapillárisban ilyenkor egy gélmátrix található, mely a nagyobb molekulák mozgását lassítja. Egy kapilláris elektroforézis készülék gyakran több párhuzamos kapillárist tartalmaz, amely lehetővé tesz több minta egyidejű elválasztását. Az elválasztást a kapillárisok végén valamilyen detektor (fénydetektor, fluoreszcens detektor) érzékeli. A kapilláris elektroforézis sokkal jobb felbontóképességgel rendelkezik, mint a 46 Created by XMLmind XSL-FO Converter.


legtöbb kromatográfiás technika, ezért alkalmazásával már igen kicsiny (akár egy nukleotidnyi) különbségeket is ki lehet mutatni a minta molekulái között.

3.23. ábra http://www.doping.chuv.ch/en/lad-ec-zone-eng.jpg; http://cdn.grin.com/images/previewobject/document.169088/8fb5e898f0cd96f081f10826fa177ccf_LARGE.png - 2013.08.24.


4. fejezet - Sejttenyészetek fenntartása, manipulálása A molekuláris biológiai módszerek alkalmazása során gyakran szükségünk van valamilyen élő organizmusra, vagy sejtekből álló kultúrára. Az élő sejtek felhasználhatóak lehetnek adott makromolekulák izolálására, makromolekulák hatásainak in vivo (élő rendszeren belüli) vizsgálatára, vagy makromolekulák célzott szaporítására, termeltetésére. Ebben a fejezetben az élő rendszerek fenntartásával, szaporításával, esetleges átalakításával kapcsolatos technikákról lesz szó. Csak a molekuláris biológiában leggyakrabban használt rendszereket ismertetjük, a módszerek közti átfedéseket igyekszünk minimalizálni.

1. 4.1. Baktériumok A baktériumok szinte minden klasszikus molekuláris biológiai módszerekkel végzett kutatás elengedhetetlen organizmusai. Elsősorban nukleinsavak sokszorosításában és fehérjék termeltetésében használjuk őket. A legjobban karakterizált és a leggyakrabban használt faj az Escherichia coli bélbaktérium (4-1. ábra). Az E. colinak igen sok törzse van, nagy részüket mesterségesen állították elő egy már ismert törzs genetikai módosításával. Az így előállított törzsek nem patogének, nem kell attól félni, hogy a velük dolgozókat megfertőzik, megbetegítik. A vad típushoz képest különböző mértékben lehetnek mutánsok. A mutáció többnyire valamilyen enzim, például endonukleáz, proteáz, metiláz, rekombináz, a DNS hibajavító vagy a metabolikus utak valamilyen enzimének defektusát, hiányát eredményezi. Az egyes törzsek tartalmazhatnak extrakromoszómális DNS-t is (plazmidot), melyek extra tulajdonságot biztosítanak a baktériumoknak (például valamilyen antibiotikum elleni rezisztenciát kódoló géneket tartalmaznak). Az egyes törzsek genetikai hátterét mindig ismernünk kell, hogy adott feladatra való alkalmasságukat ellenőrizni tudjuk.

4.1. ábra - http://healthdefine.com/wp-content/uploads/2011/06/o157-h7-e.-coli.gif; http://www.niaid.nih.gov/SiteCollectionImages/topics/biodefenserelated/e_coli.jpg 2013.08.27.

1.1. 4.1.1. Baktériumok tenyésztése A baktériumokat folyadékkultúrában és szilárd táptalajon (agarlemezen) is lehet tenyészteni, 37 ºC optimális hőmérsékleten. E. coli tenyésztéséhez a szükséges tápoldathoz triptont (tripszinnel emésztett kazeint), élesztőből készített extraktumot és NaCl-ot szoktak adni, szilárd lemez készítése esetén ezt 1,5% agarral egészítik ki. 121 ºC-on, magas nyomáson történő autoklávozással sterilizálhatjuk a tápoldatot. 48 Created by XMLmind XSL-FO Converter.

Sejttenyészetek fenntartása, manipulálása A folyékony kultúrában lévő baktériumokat hígítás után tudjuk agarlemezekre széleszteni. A lemezekről a baktériumokat aztán új lemezekre vagy folyadékkultúrába olthatjuk. A folyadékkultúrában tenyésztett baktériumokat gyorsan fel kell használni a kísérletekhez, míg az agarlemezeken (plate-eken) tenyésztettek 4 ºCon tárolva egy hónapig is életképesek maradnak. Hosszabb ideig tartó tároláshoz más módszer kell: a sűrű baktérium-szuszpenziót 15-20% glicerinnel egészítjük ki, szuszpendálás után mélyfagyasztásnak ellenálló steril műanyag csövekbe töltjük, majd szárazjégen hűtött alkohollal -70 ºC-ra hűtjük. A csöveket ezután -70 ºC-os hűtőben tároljuk.

4.2. ábra - http://2007.igem.org/wiki/images/8/88/Ecoli.jpg - 2013.08.27.

1.2. 4.1.2. Baktériumok transzformálása Transzformálásnak hívjuk azt a folyamatot, amikor idegen DNS-t juttattunk a baktériumokba. A hatékony transzformációhoz a baktériumok sejtfalát megfelelően átjárhatóvá kell tenni, anélkül hogy a baktérium elpusztulna (ezt a módszert úgy hívják, hogy „kompetenssé” teszik a sejtet). A transzformálás jellegének megfelelően alapvetően két fajta: kémiai, vagy elektrokompetens sejteket készíthetünk. Baktériumsejtek „kompetenssé” tétele során a baktériumokat középső-késő logaritmikus növekedési fázisig (OD600=0,4-0,6) szaporítják, majd centrifugálással ülepítik őket. Elektrokompetens sejtek készítésekor a baktériumokat többször jéghideg desztillált vízzel mossák, majd a sűrű szuszpenziót összekeverik a bejuttatni kívánt DNS-sel. Ezt a keveréket steril elektroporációs küvetta (4-3. ábra) aljába töltik buborékmentesen, majd rövid ideig elektromos feszültséget kapcsolnak rá. A feszültség következtében a baktériumok sejtfala átjárhatóvá válik a DNS számára. Kémiailag kompetens sejtek készítésekor a baktériumokat centrifugálás után különböző oldott sókat (CaCl2, MgCl2, MnCl2, KCl, polietilén-glikol) tartalmazó pufferekben mossák, többször egymás után. Többféle módszert dolgoztak már ki kémiailag kompetens sejtek készítésére, amelyek a baktériumok szaporításának módjában, illetve a mosópufferekben lévő ionösszetételükben különböznek egymástól. Leggyakrabban CaCl2-dal kompetenssé tett sejteket használnak transzformációhoz, mert ezeket a legkönnyebb előállítani. A kompetens sejteket nem szükséges azonnal felhasználni: 7,5% dimetil-szulfoxid (DMSO), vagy 15% glicerin hozzákeverése, majd folyékony nitrogénben fagyasztás után alikvotokban (több részre szétosztva) érdemes tárolni -70 °C-on. A kémiai kompetens sejtekkel nem elektroporáció, hanem hősokk segítségével transzformálnak. A kompetens sejtekhez (ha tárolva voltak, azok jégen történő olvasztás után) keverik a bejuttatni kívánt DNS-t, majd jégen történő, kb. 30’ inkubáció után 30–60 másodpercig (leggyakrabban 45 másodpercig) 42 °C-os vízfürdőbe helyezik a csöveket. A hősokk után a mintát jégen hűtik, majd tápoldat hozzáadása után 45 percig kevertetve inkubálják a kultúrát 37 °C-on. Ezalatt a bejutott sejtek a sokkot követően regenerálódnak és a DNS-ről elkezdenek átíródni azok a gének, melyek az antibiotikum-rezisztenciát okozzák. Ezután a sejteket ülepítik, majd a megfelelő antibiotikumot tartalmazó lemezekre szélesztik őket (többnyire 2-3 darab lemezre, egy-egy nagyságrenddel különböző baktériumkoncentrációban). A lemezeken csak az antibiotikum-rezisztens (az idegen DNS-t hordozó) baktériumokból nőnek ki kolóniák.

4.3. ábra http://www.biorad.com/webroot/web/images/lsr/products/gene_transfer_rnai/sku_view/global/1652089_view.jpg - 2013.08.27.


Sejttenyészetek fenntartása, manipulálása

DNS baktériumba juttatására a fent leírt módszereken kívül van egy további lehetőség is, a virális transzdukció. Ilyenkor a baktériumot fertőzni képes bakteriofág kapszidjába kell az idegen (vagy részben idegen) DNS-t csomagolni. A fág fertőzésekor annak genetikai anyaga (itt az idegen DNS) bejut a baktériumsejtbe. Az idegen DNS-darabok rendszerint tartalmaznak egy olyan gént is, amely kifejeződve rezisztenssé teszi az adott baktériumot bizonyos sejttoxinokra (antibiotikum-rezisztencia gén). A sejttoxint adagolva csak azok a baktériumok maradnak majd életben, amelyek az idegen DNS segítségével védekezni tudnak a toxinok ellen, ezért ez a DNS-szakasz nem tűnik el a baktériumok osztódása során.

2. 4.2. Élesztőgombák Az élesztőgombafélék családjának tagjai igen változatos megjelenési és alkalmazkodási formákkal bírnak. Közülük legismertebb, a sejt- és molekuláris biológiában leginkább tanulmányozott egysejtű gomba a sörélesztő (Saccharomyces cerevisiae) (4-4. ábra). Fehérjeexpresszióhoz manapság leginkább egy másfajta élesztőt, a metanol-metabolizáló Pichia fajok egyikét (Pichia pastoris, Pichia methanolica) használják.

4.4. ábra http://enfo.agt.bme.hu/drupal/sites/default/files/yeast.jpg; http://www.uwyo.edu/virtual_edge/lab13/images/saccharomyces_cerevisiae.jpg 2013.08.27.

2.1. 4.2.1. Élesztőgomba tenyésztése Az élesztőt a baktériumokhoz hasonlóan folyadékban és lemezen is lehet tenyészteni, 28-30 ºC maximális hőmérsékleten. A szükséges tenyésztési, átoltási, tárolási technikák nagyban megegyeznek az E. colinál olvashatókkal. Az eukarióta sejtek szaporodása lassabb a prokariótákénál; mind folyadékkultúrában, mind 50 Created by XMLmind XSL-FO Converter.

Sejttenyészetek fenntartása, manipulálása agarlemezen lassabb növekedést tapasztalunk. A szélesztés után a gombatelepek például csak 3-4 nap növekedés után láthatóak jól szabad szemmel. A baktériumokhoz hasonlóan a molekuláris biológiában szintén mutáns vagy transzgenikus élesztőtörzseket használnak. Leginkább aminosavak és nukleotidok szintéziséhez szükséges enzimek génjei vannak kiütve ezekben a törzsekben, így ezek az enzimdeficiens törzsek csak a megfelelő aminosavakat, ill. szerves bázisokat tartalmazó tápoldatban képesek életben maradni és szaporodni. A vad típusú törzseket ún. minimál médiumon is tudjuk tenyészteni, amelyben megtalálhatóak a szükséges sók és vitaminok, foszfátionok, szénforrás (pédául glükóz formájában) és nitrogénforrás (ammónium-szulfát formájában). Az előbb említett mutáns törzsek nem képesek minimál médiumon szaporodni, ezért megfelelő aminosav- és nukleotid-forrásról kell gondoskodnunk. Ilyenkor legtöbbször élesztő-extraktumot és előemésztett, oligonukleotidokból és aminosavakból álló állati fehérjemaradékot (peptont) szoktak a tenyésztőmédiumba tenni. Ha egyes aminosav-metabolizmusban részt vevő enzimek jelenlétére akarunk szelektálni (amelyek génjét transzformálással juttathatjuk be a mutáns élesztősejtbe), akkor minimál médiumot alkalmazunk ún. dropout mix-szel kiegészítve. Ez a keverék tartalmaz minden szükséges aminosavat és szerves bázist, kivéve azokat, amelyekre az adott kísérletben szelektálnunk kell. Ezen a módon mutathatjuk ki, hogy az általunk az élesztőbe juttatott genetikai anyag tartalmazza-e a metabolizmushoz szükséges enzimeket. Az élesztősejtek 4 ºC-on, agarlemezen tárolva több hónapig is életképesek maradnak. Hosszabb ideig tartó tárolásuk a baktériumsejtekhez hasonlóan (-70 ºC-on) történik.

2.2. 4.2.2. Élesztő transzformálása Az élesztősejtek transzformálása hasonlít a baktériumok hősokkal történő transzformálására, de annál kissé bonyolultabb és jóval időigényesebb folyamat. Itt is többféle módszert dolgoztak már ki, a legáltalánosabban használt módszer szerint polietilén-glikolt, lítium-acetátot és egyszálúsított (többnyire lazac spermából izolált) DNS-t használnak a transzformáció hatékonyságának a növelésére. Az éjszaka során felszaporodott élesztő-sejtkultúrát reggel ki kell hígítani (OD600=0,1-re), majd 2-3 osztódási ciklust kell várni (ez élesztőknél elég lassú, 3–5 óra hosszat tartó folyamat (OD600=4,5-5-ig). A sejtek ülepítése után hideg desztillált vízzel történő, többszörös mosás következik. A mosások után az élesztősejteket tartalmazó pelletet egy polietilén-glikolt (PEG), lítium-acetátot (LiAc) és egyszálúsított ún. carrier DNS-t tartalmazó mixszel keverik össze, ehhez adják majd a transzformálni kívánt DNS-t. Alapos rázás után következhet a 42 °C-os hősokk, az élesztőtörzstől függően 15–45 percig. Tenyésztő médium (YPD) hozzáadásával és kb. 1 órán át tartó kevertetéssel szokták a hősokk után az élesztők normális metabolizmusát visszaállítani. A sejtek összegyűjtése után szokták a transzformánsokat megfelelő aminosav-hiányos lemezekre széleszteni. Az aminosav-szintézishez szükséges enzim génjét tartalmazó, idegen DNS-darabot hordozó élesztők túlélnek, utódaik kolóniát alkotnak. Az élesztők transzformációs hatékonysága jóval (akár 3-4 nagyságrenddel) alacsonyabb, mint a baktériumoké.

3. 4.3. Sejtkultúra állatokból Az állati (emberi) szervezet szöveteiből alapvetően háromféle sejtkultúra származtatható: 1. Az immortalizált sejtek valamilyen malignus (rákos) szövetekből származnak. Ezek a sejtek (általában genetikai mutációk következményeként) elvesztették a korlátlan szaporodást gátló mechanizmusuk néhány fontos elemét. Előnyük, hogy bár legtöbb tulajdonságukban hasonlatosak az adott szövet differenciálódott sejtjeihez, korlátlan szaporodásuknak köszönhetően hosszú időn át fenntarthatóak, tenyészthetőek. A fontosabb sejtvonalak jól karakterizáltak, bárki számára megvásárolhatóak, a velük végzett kísérletek eredményei más kutatócsoportok eredményeivel könnyen összevethető. Hátrányuk, hogy azért nem minden tulajdonságunk hasonló az egészséges sejtekhez, ezért a sejtek vizsgálatakor kapott kísérlet eredmények nem mindig extrapolálhatóak az egészséges szövet működésére (4-5. ábra).

4.5. ábra - http://www.microscopyu.com/galleries/dicphasecontrast/images/helapc.jpg - 2013.08.27.



2. Az őssejtek vagy korai embrióból, vagy már kialakult szövetekből nyert pluripotens sejtek leszármazottai. Ezeknek a sejteknek a differenciáltsági foka igen kicsi, a legtöbb differenciált testi sejtre jellemző, osztódást gátló mechanizmus még nem alakult ki bennük. Őssejteket elsősorban differenciációs, regenerációs kísérletekhez használnak, az elhalt szövetek újraépülését remélik jövőbeli terápiás alkalmazásuktól. 3. Primer sejtkultúrák mindig újonnan izolált állati sejtekből származnak, a sejtek kevésszer vagy ritkán szaporodnak, eltarthatóságuk legtöbbször néhány nap (vagy hét). Ebből következik, hogy primer sejteken a kísérleteket nagyon jól kell időzíteni, és az izolálást követően lehetőleg mindig ugyanabban az időpontban elvégezni. A primer sejtkultúra előnye, hogy sejtjeinek működése nagyon hasonlatos az élő szövetéhez, és bármely állat bármely általunk választott szövetét vizsgálhatjuk in vitro (az élő szervezeten kívül).

3.1. 4.3.1. Állati sejtek tenyésztése A sejttenyészetek a sejttípustól függően lehetnek folyadékkultúrák, vagy letapadó sejtek. A táptalajnak tartalmaznia kell sókat, vitaminokat, aminosavakat, valamilyen szénforrást (többnyire glükózt), és valamilyen (pl. bikarbonátos) pufferrendszert. Kiegészítőként sokszor használnak extra glutamint, piruvátot, antibiotikumokat és antimikotikumokat (utóbbi kettőt a bakteriális, illetve gombafertőzések elkerülése ellen). A sejtek életben maradásához folyamatos szignálokat, ún. túlélési jelet kell biztosítani. Ezért emlőssejttenyészetben a médiumhoz 10%-ban újszülött borjú vérszérumát (FBS) adagolják. A tápoldat kémhatásának esetleges változását (többnyire savasodás) a hozzákevert fenolvörös indikátor színváltozásával (sárgára) követhető nyomon. Emlőssejteket többnyire 37 ºC-t, 5% CO2-t és magas páratartalmat biztosító inkubátorokban tenyésztenek (4-6. ábra).

4.6. ábra - https://www1.imperial.ac.uk/resources/6BE0D194-58A2-41D4-B0C33206251512F4/cell_culture_mol_tox_1_191_196.jpg - 2013.08.28.


Sejttenyészetek fenntartása, manipulálása Mivel az izolált sejtek immunrendszer hiányában rendkívül könnyen elfertőződhetnek, a megfelelő sterilitást folyamatosan biztosítanunk kell. A médium összetevőit lehetőleg sterilen érdemes vásárolni, ha ez nem lehetséges, akkor a kész médiumot sterilre kell szűrni. Gumikesztyűben, mindig steril pipettákkal és edényekkel dolgozzunk, a flaskákat kizárólag steril, folyamatos légáramlást biztosító, ún. lamináris fülkében nyissuk ki (47. ábra). A sejtek kezelésekor, manipulálásakor is mindig steril oldatokat használjunk.

4.7. ábra - https://www1.imperial.ac.uk/resources/6BE0D194-58A2-41D4-B0C33206251512F4/cell_culture_mol_tox_1_191_196.jpg - 2013.08.27.

Mivel a sejtek tápanyagaikat elhasználják, a sejtsűrűségtől függően rendszeresen cserélni kell a médiumot. Ez letapadó sejteknél igen egyszerű: A régi médiumot pipettával leszívjuk, a 37 °C-ra előmelegített újat pedig óvatosan (hogy a sejtek a folyadékárammal ne sodródjanak le a műanyagról) rátöltjük a sejtekre. Folyadékkultúránál a sejteket össze kell gyűjteni steril centrifugacsövekbe. Alacsony fordulatszámon (~200 g) történő centrifugálást követően a felülúszó eltávolítása után a sejteket új tápoldatba kell felvenni. Ha a sejtek nagyon elszaporodtak, vagy új kultúrát akarunk indítani, akkor át kell oltanunk őket (ezt nevezik passzálásnak). Folyadékkultúrából a sejtek átoltása igen egyszerű: a sűrű sejtkultúrából megfelelő mennyiséget pipettázzunk át az új médiumba. Letapadó kultúránál az átoltás kissé bonyolultabb: a használt médium leszívása után a sejteket foszfát pufferrel (PBS) mossuk, majd annak eltávolítása után tripszin-oldatot mérünk rájuk. Néhány perces, 37 ºC-on történő emésztést követően a sejtek elvesztik tapadásukat a flaska oldalához, lekerekednek, lebegnek az oldatban. Ha az összes sejt feljött, kevés (mondjuk 10 ml) médium hozzáadásával felszuszpendáljuk a sejteket, majd az új médiumba áttesszük a megfelelő mennyiséget (többnyire néhány cseppet). Emlőssejteket 4 °C-os hűtőben nem tudunk tárolni, hosszú távú tároláshoz a sejteket le kell fagyasztanunk. A sejteket új, kis térfogatú médiumban szokták összegyűjteni. A fagyasztómédiumnak a szokásos anyagok mellett tartalmaznia kell még 10%-nyi dimetil-szulfoxidot (DMSO) is. Gyakran extra FBS-sel (30%-ig) is ki szokták egészíteni a médiumot. A sejteket a fagyasztó médiumban felszuszpendáljuk, majd a szuszpenziót steril fagyasztócsövekbe töltjük. A fagyasztást lassan végezzük: Először 4 °C, utána -20 °C, végül -70 °C-ra hűtjük különböző hűtőszekrényekben és fagyasztókban. A -70 °C-ról kivett mintát folyékony nitrogénben tároljuk. A lassú fagyást elősegíti, ha a csöveket jól szigetelő hungarocell dobozba zárjuk. Ilyenkor akár közvetlenül a -70 °C-os hűtőbe is tehetjük őket. A fagyasztással szemben a sejtek felolvasztását igen gyorsan kell végeznünk, hogy a már kiolvadt részek ne fagyhassanak vissza. Ezt vagy 37 °C-os vízfürdőbe merítéssel, vagy a meleg tenyerünkben történő görgetéssel, rázogatással oldjuk meg. A felolvadt sejteket le kell centrifugálni, majd a fagyasztófolyadék eltávolítása után felvehetjük őket a szokásos tápfolyadékukban. Ha arra vagyunk kíváncsiak, hogy két különböző sejt milyen hatással van egymásra az általuk termelt hormonokon vagy anyagcseretermékeken keresztül, akkor ko-kultúrát hozhatunk létre. Ilyenkor a kétféle (például a különböző szövetekből származó) sejtet tartalmazó médium csak egy vékony hártyával van elválasztva, amelyen a sejtek nem tudnak átjutni, viszont a folyadék és a benne oldott anyagok közlekedhetnek az eltérő sejttípusok között. Előfordulhat az az eset is, hogy egy összefüggő szövetet próbálunk meg mesterséges táptalajban fenntartani. Ezek az állatokból izolált szövetek néhány napig fenntarthatóak károsodás nélkül. Ha immortalizált limfocitákat és B-sejteket fúzionáltatunk, ún. hibridoma sejteket kapunk. Ezeket a sejteket monoklonális antitestek készítésére szokták felhasználni (lásd: 14. fejezet). 53 Created by XMLmind XSL-FO Converter.


3.2. 4.3.2. Állati sejtek transzfektálása Állati sejtekbe könnyebb bevinni idegen DNS-t, mint sejtfallal rendelkező sejtekbe. A sejteket nem kell kompetenssé tenni a transzfekció előtt. Többféle kémiai és nem-kémiai módszert is kifejlesztettek, ezek közül a legfontosabbak: 1. Igen finom kalcium-foszfát csapadékhoz kapcsolódva a DNS még nem teljesen ismert mechanizmussal jut át a sejtmembránon. 2. A liposzómák piciny lipidmembránnal határolt zsákocskák, amelyek könnyen fuzionálnak a sejtmembránnal. A liposzómába csomagolt DNS így könnyen bejuthat a sejt belsejébe. 3. Elektroporáció során az alkalmazott elektromos feszültség teszi átjárhatóvá a sejtmembránt. 4. Virális transzdukcióval is be lehet juttatni idegen DNS-t, ha azt előzőleg a sejtkultúrát fertőzni képes vírus kapszidjába juttatták. A transzfektált DNS többnyire nem épül be a gazdasejt genomjába. A transzfektált sejtekkel végzett kísérletek egy részében ez nem is probléma, az ilyen tranziensen transzfektált sejtek is ki tudják fejezni a bejuttatott idegen DNS-ről (episzómáról) a szükséges fehérjét. Bizonyos virális replikációs origókat tartalmazó episzómák megfelelő virális fehérjéket expresszáló sejtekben képesek replikálódni, így az utódsejtekbe kerülni. Ha az idegen DNS beül a gazdasejt genomjába, akkor azt a sejtet stabil transzfektánsnak hívjuk. A stabil transzfektánsokat szelektálni tudjuk az idegen DNS-sel bevitt markergén segítségével.

4. 4.4. Növényi sejtkultúra A növényi rügyekből vagy gyökércsúcsból lehetséges totipotens sejteket izolálni. Ezekből a sejtekből tudunk szilárd agarlemezen, vagy folyadékban szaporodni képes sejtkultúrát növeszteni. A médiumba inorganikus sókat, vitaminokat, növényi hormonokat és szerves anyagokat kell tenni. A szuszpenziós kultúrát általában 22 °C-os inkubátorban, rázatás mellett tenyésztjük. Agarlemezen ún. kallusz nő a sejtekből, ami egy amorf sejtmassza (4-8. ábra). Kallusz viszonylag hosszabb ideig tárolható szobahőmérsékleten. Hogy a sejtek genetikai megváltozását, vagy a fertőzésveszélyt elkerüljék, gyakran mélyfagyasztva is tárolják a sejteket. A jég tönkreteszi a sejtfalat, ezért vagy magas só-koncentráció alkalmazásával, vagy dehidratálással ezt meg kell akadályozni. A fagyasztást megelőzően a sejteket krioprotektív anyagokkal hosszabb ideig inkubálják, majd nagyon lassan, kontrolláltan hűtik le a sejteket. A fagyott sejteket folyékony nitrogénban tárolják.

4.8. ábra 2013.08.27.

-

http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/1/18/Callus1.jpg

-

4.1. 4.4.1. Transzgének növényi sejtekbe juttatása A növényi sejtek sejtfala miatt a szokásos transzformációs technikák nem működnek. Az egyik módszer szerint a transzgént tartalmazó plazmidot egy fém (gyakran arany) nanorészecske felületére kötik, úgy „lövik” a sejtmagba (egy ún. génpuskával). A másik lehetséges út, hogy a sejtfalat enzimekkel leemésztik, és a


Sejttenyészetek fenntartása, manipulálása megmaradt ún. protoplasztot transzformálják konvencionális módokon, például elektroporációval. Gyakran használnak baktérium (pl. Agrobacterium tumefaciens) közvetítésével létrejött géntranszfert is.

5. 4.5. Vírusok A vírusok nem tekinthetőek valódi élőlényeknek, hiszen nincs saját metabolizmusuk. Elsősorban, mint vektorok játszanak fontos szerepet, vagyis idegen DNS-t képesek nagy hatékonysággal az adott célsejtbe juttatni. A bakteriális vírusokat bakteriofágoknak (vagy rövidítve: fágoknak) hívjuk. A fágok saját genetikai állományának egy részét kicserélve tudjuk a kívánt szekvenciákat a baktériumokba juttatni. A rovarsejtek fertőzéséhez gyakran bakulovírusokat használunk. Emlőssejtekbe a legismertebb virális transzporterek a lentivírusok és az adenovírusok. A fertőzésveszély elkerülése végett utóbbi kettővel csak igen nagy körültekintéssel, megfelelően felszerelt laboratóriumban szabad dolgozni.


5. fejezet - DNS-, RNS-, fehérjeizolálási technikák A makromolekulák közül molekuláris biológiában leggyakrabban a nukleinsavak és a fehérjék vizsgálatával foglalkoznak, ezért mi is az ezek izolálásához szükséges lépéseket ismertetjük. Hasonlítsuk össze stabilitási szempontból a DNS-, az RNS- és a fehérjemolekulákat. Ha a fizikai behatásokra, pl. a nyíróerővel szembeni stabilitásuk alapján nézzük, akkor a DNS (elsősorban a genomi DNS) óriási hossza miatt igen sérülékeny, könnyen elszakad, míg az RNS- és a fehérjemolekulákra ez egyáltalán nem jellemző. Ha azt vizsgáljuk, hogy ugyanezek az anyagok mennyire érzékenyek különböző, az izolálási technikák során használt vegyszerek (erős sók, szerves oldószerek, detergensek stb.) hatására, akkor egészen más képet kapunk: A DNS szerkezete túléli a vegyszerek károsító hatását, az RNS szerkezete már kicsit érzékenyebb, de a fehérjék kimondottan érzékenyek az említett vegyszerekre, melyek gyakran irreverzibilis károsodást okozhatnak szerkezetükben. Elsődleges szerkezetük ugyan megmarad, de másodlagos, harmadlagos szerkezetük károsodása funkcióvesztéshez vezethet. (Nukleinsavak esetén a másodlagos és harmadlagos szerkezet károsodása többnyire reverzibilis, nem vezet funkcióvesztéshez; az elsődleges szerkezet tárolja az információt.) Még egy tulajdonságot kell összehasonlítanunk, az ún. biológiai érzékenységet (vagy stabilitást). A sejtek lízise során felszabadulnak olyan enzimek, amelyek az említett makromolekulákat bontják (dezoxiribonukleázok, ribonukleázok, proteázok). Mennyiségük, stabilitásuk, reaktivitásuk és az izolálás során használt vegyszerekkel szembeni ellenálló-képességük szabja meg azt, hogy az adott makromolekula mennyire tűnik érzékenynek az izolálás során. Mind a háromféle makromolekulánk érzékeny biológiai szempontból, de különböző mértékben. A dezoxiribonukleázok (DN-ázok) mennyisége viszonylag csekély, többnyire kétértékű kationokat igényelnek működésükhöz. Ha ezeket a kationokat valamilyen kelátorral (pl. EDTA-val) kivonjuk a rendszerből, gátoljuk a DN-ázok működését. A proteázok esetében ez keményebb dió: többféle speciális proteáz-inhibitort kell adnunk a rendszerhez és alacsony hőmérsékleten (4 °C) dolgoznunk, hogy a fehérjedegradációt elkerüljük. A ribonukleázok (RN-ázok) igen stabil enzimek, ionokat nem igényelnek működésükhöz, vegyszerekkel és még a magas hőmérséklettel szemben is igen ellenállóak. Csak speciális, ún. kaotróp ionokat (5-1. ábra) tartalmazó vegyszerekkel semlegesíthetőek. (A kaotróp anyagok – szemben az ún. kozmotrópokkal – megbontják a makromolekulákon belüli másodlagos kötőerőket, ezáltal tönkreteszik azok natív térbeli szerkezetét). A fentiekből következik, hogy biológiailag a DNS a legkevésbé, az RNS a leginkább érzékeny makromolekula.

5.1. ábra -

1. 5.1. Nukleinsavak izolálása Nukleinsavak izolálására többféle technika létezik, mindegyikben közös, hogy el kell távolítani a más jellegű makromolekulákat (szénhidrátokat, lipideket, és legfőképp a fehérjéket). A sejtlízis során gátolni kell a nukleinsavakat bontó enzimek (nukleázok) működését, majd a nukleinsavakat ki kell nyerni a törmelékből. A hagyományos módszerek számos, az emberi egészségre is káros vegyszer (pl. fenol, kloroform stb.) használatát igénylik. E módszerek szerint a sejtlízist követően extrakcióval távolítják el a szükségtelen makromolekulákat, majd a nukleisavakat kicsapják, centrifugálják, mossák, és szárítás után vizes oldatban oldják. A folyamat meglehetősen időigényes, de megfelelő precizitással tiszta nukleinsavakat kaphatunk.


DNS-, RNS-, fehérjeizolálási technikák Az újabb módszerek a nukleinsavaknak azt a tulajdonságát használják ki, hogy kaotróp ionokat tartalmazó sók jelenlétében a nukleinsavak igen erősen kötődnek az üveg felületére. Ha ilyen sókat használnak sejtlíziskor, a nukleinsavakat szilikagyöngyökön vagy szilikamembránon specifikusan ki lehet kötni (5-2. ábra). (A pontos mechanizmus még nem teljesen ismert, a feltételezett modell szerint a kaotróp sók megbontják a vízmolekulák közti H-híd kötést, a hidrátburkát vesztett nukleinsav vagy hidrogén-híd kötéssel, vagy a deprotonálódott szilikáthoz kötődő kationokon keresztül tud kötni a Si-OH-hoz.) A szilikamembránról mosás után igen tiszta nukleinsav eluálható le vízzel, vagy vizes pufferrel. Az ionerősség és a kémhatás változtatásával specifikálni lehet, hogy a szilikamembránhoz inkább DNS, vagy inkább RNS kötődjön, ezért ezek külön is izolálhatóak, ha más-más körülményeket teremtünk. A szilikamembránnal történő nukleinsav-izolálás gyors és egyszerű. Ha ezt a technikát választjuk, akkor érdemes valamely biotechnológiai cég által elkészített, az izoláláshoz szükséges felszerelés- és vegyszercsomagot („kitet”) megvásárolnunk. A szilikagyöngy vagy szilikamembrán többnyire egy lyukacsos aljú, műanyag hengerbe kerül (5-3. ábra), amelyen centrifugálással, vagy vákuummal tudjuk átpréselni a folyadékot. Itt történik a nukleinsavak megkötése és mosása, és innen történik meg az elúció is.

5.2. ábra http://www.cultek.com/inf/otros/perfilproveedores/Perfil%20Macherey%20Nagel/Official_Note__Silica_membrane_vs_Anion_Exchange_20090715.pdf - 2013.09.02.

5.3. ábra - www.promega.com - 2013.09.02.


DNS-, RNS-, fehérjeizolálási technikák

Szilikamembrán vagy szilikagyöngy alternatívájaként árulnak anioncserélő (pozitívan töltött) oszlopokkal működő nukleinsav-tisztító kiteket is. Elsősorban nagyobb mennyiségű, nagy tisztaságú nukleinsavak kinyerésére használják őket. Különböző (elsősorban anyagi) szempontok miatt előfordulhat, hogy inkább a hagyományos módszerekkel történő nukleinsav-izolálási technikákat használjuk. A következőkben ezeket a módszereket ismertetjük.

1.1. 5.1.1. Genomi DNS-izolálás Genomi DNS izolálásánál több dologra kell ügyelnünk. Első, hogy a DNS minél kevésbé törjön össze. Érdemes a minta mérése során széles szájú pipettahegyeket használni, és a mintát minél kevesebb rázatásnak kitenni. Nagyon fontos követelmény a DN-áz-mentesség biztosítása. Ezt megfelelő összetételű pufferrel biztosítjuk. Az izolálás végén megfelelően tiszta DNS-t kell kapjunk (a tisztaság befolyásolhatja a DNS későbbi felhasználhatóságát). A DNS-t izolálhatjuk szövetből, sejtkultúrából, vérből. Az első esetben a szövetet valamilyen módon össze kell törnünk, homogenizálnunk kell. Ez történhet szoros dugattyút tartalmazó ún. potter, elektromos, apró késeket tartalmazó homogenizátor, vagy dörzsmozsár segítségével. A sejtek lízise „lízis puffer” hozzáadásával történik, mely általában tartalmaz Tris-t, kelátort (EDTA), detergenst (SDS) valamint RN-ázt. A DNS a sejtmagban fehérjékhez kötődik, ezeket el kell távolítanunk róla, ezért a homogenizált mintát 100μg/ml proteináz K kezelésnek vetjük alá (50 °C, 3 óra). A további tisztítást alapvetően két módon valósíthatjuk meg: 1. Fenolos extrakcióval: A mintát azonos térfogatú fenollal óvatosan összerázzuk, majd az ülepítés után a felső, a DNS-t tartalmazó víztiszta fázist új centrifugacsőbe mérjük át. A procedúrát többször ismételhetjük mindaddig, amíg centrifugálás után a fenolos fázis tetején már nem látunk fehér csapadékot. Ezután vizes fázisban maradó kevés fenolt kloroformos extrakcióval távolítjuk el. 2. Gradiens centrifugálással: Ultracentrifugában, CsCl gradiens segítségével a lehető legkíméletesebben tudjuk elválasztani egymástól a genomi DNS-t és a szennyeződéseket. A módszer azonban igen időigényes, és igen drága műszerezettséget (ultracentrifuga) igényel. A tiszta DNS-t vagy dialízissel, vagy alkoholos kicsapással kaphatjuk meg. A 70% etanolt, vagy 50% izopropanolt és megfelelően magas ionkoncentrációt tartalmazó oldatban a DNS kicsapódik, amit vagy egy pálcikára tekerve, vagy centrifugálás során tudunk elválasztani az oldattól (5-4. ábra).

5.4. ábra -



1.2. 5.1.2. Plazmid izolálás Gyakran van szükség arra, hogy baktériumokból genomi DNS-től mentes extrakromoszomális DNS-t (plazmidot) izoláljunk. A médiumától megszabadított, felszuszpendált sejteket legtöbbször lúgos sejtlízissel tárjuk fel. A feltáró oldatban NaOH-on kívül SDS is található, mely a fehérjék hidrofób részeihez köt. A lúg hatására a DNS kettős szála is felnyílik. A feltárás után egy semlegesítési reakció következik: tömény káliumacetátot mérünk a lizátumhoz. A gyors semlegesítődés hatására a plazmid DNS újra párosodik, megtalálja a komplementer szálat, a genomi DNS viszont csak részben. Ennek eredményeképp a genomi DNS-molekulák egymással és a hozzájuk kapcsolódó fehérjékkel óriási komplexeket alkotnak. Káliumionok precipitálják az SDS-t, ami csapadékba viszi a megkötött fehérjéket és a hozzájuk kötött genomi DNS-t. A csapadékot centrifugálással el tudjuk távolítani, a víztiszta felülúszóból (esetleges fenolos/kloroformos extrakciók után) pedig alkohollal kicsapható a plazmid DNS. Ha sok különböző mintából származó plazmidot izolálunk egyszerre, érdemes az itt leírt módszer helyett szilikamembrán vagy szilikagyöngy segítségével működő plazmid-izoláló kitet használni, mert jelentős idő és munka takarítható meg vele (5-5. ábra).

5.5. ábra http://www.taqdna.com/rich_files/bilder/DNA_RNA_purification/Plasmid_DNA_Purification_isolation _extraction_Miniprep_Kit.JPG - 2013.09.02.



1.3. 5.1.3. DNS-fragment izolálása Ha egy gélen elválasztott DNS-szakaszra van szükségünk a további kísérletekhez, akkor ezt a fragmentet izolálni kell a gélből. Az izolálásra több módszer is lehetséges, itt ezeket fogjuk ismertetni. Nem csak DNS, hanem RNS gélből való izolálására is alkalmasak ezek a módszerek, de erre sokkal ritkábban kerül sor.

1.3.1. 5.1.3.1. Elektroelúció Az agarózgélben megfuttatott fragment alá szikével egy bevágást ejtünk, a bevágásba DEAE-(dietilaminoetil)-cellulóz papírt helyezünk. Ezután az elektroforézist folytatjuk addig, amíg a DNS-fragment ráfut a papírra. A papírt kivesszük a zsebből és mikrocentrifuga-csőbe helyezzük. Először magas sókoncentrációjú pufferrel mossuk, majd alacsony sókoncentrációjú pufferrel eluáljuk a DNS-t a papírról. További lépések (fenolos extrakció, alkoholos kicsapás) szükségesek a DNS-fragment tisztításához és koncentrálásához. DEAE cellulóz helyett használhatunk dialízismembránt is. Ilyenkor az egész fragmentet ki kell vágni a gélből, amit azután elektforézis-puffert tartalmazó dialíziszsákba zárunk. Az elektroforézis során a DNS kivándorol a gélből, de a dialízismembrán pórusain nagy mérete miatt nem tud áthatolni. Az elektroforézis végeztével a membránban lévő folyadékot egyszerűen ki kell pipettázni a dialíziszsákból, a DNS a már ismert módokon tisztítható, szükség esetén kicsapható. Ma már kaphatóak direkt az elektroelúció elősegítésére tervezett speciális készülékek is. Ezek segítségével a megfuttatott gélből egyszerre az összes DNS-t (vagy RNS-t) frakciónként eluálni lehet, utólag kiválasztva a számunkra fontosakat. A készülékek részletes működési elvét itt most nem ismertetnénk.

1.3.2. 5.1.3.2. Alacsony olvadáspontú (low melting point) agaróz alkalmazása 60 Created by XMLmind XSL-FO Converter.

DNS-, RNS-, fehérjeizolálási technikák Fragmentizolálás céljára lehet vásárolni olyan speciális agarózt, mely már alacsonyabb hőmérsékleten (~65 °C) megolvad. A futtatás után az agarózból kivágjuk azt a részt, ahol az izolálni kívánt fragment található, TE (20 mMTris, 1 mM EDTA, pH:8) puffert mérünk rá, majd mikrocentrifuga csőben felolvasztjuk (65 °C-on). A nukleinsavat fenolos/kloroformos extrakcióval tudjuk tisztítani. Ha a gélben lévő poliszacharidoktól szeretnénk könnyen megszabadulni, érdemes agaráz enzimmel azokat feldarabolni. Ilyenkor a kivágott géldarabot az agaráz enzim pufferével több lépésben ekvilibráljuk, majd a géldarab megolvasztása után azt 42 °C-ra lehűtjük (itt még nem fog megszilárdulni az agaróz), majd agaráz enzimmel órákon át emésztjük. Az emésztés után jöhet a szokásos extrakciós tisztítás. A módszer hátránya, hogy nagyon időigényes, és a speciális, alacsony olvadáspontú agaróz is igen drága.

1.3.3. 5.1.3.3. Olvasztás kaotróp sókkal Ismert jelenség, hogy kaotróp tulajdonságú sók ionjai tönkreteszik a polimerek másodlagos szerkezetét. Ezt teszik a poliszacharidokkal is. Ennek következtében az agaróz gél már 55 °C-on megolvad. A kiszabaduló nukleinsavak kaotróp ionok oldatában kötnek az olvasztás után hozzáadott üveggyöngyökhöz. A gyöngyök centrifugával gyorsan ülepíthetőek. Alkoholos pufferekkel a megkötődött nukleinsavak moshatóak, alacsony sókoncentrációjú, alkoholmentes pufferekkel pedig eluálhatóak a gyöngyökről.

1.3.4. 5.1.3.4. Préselés a gélből Ez egy igen egyszerű elven működő technika. Lényege, hogy valamilyen piciny lyukon keresztül a gélből a folyadékot a benne lévő nukleinsavakkal együtt kipréseljük. Alkalmas erre egy injekciós fecskendő igen pici lyukú tűvel, vagy porózus műanyag lapon keresztül történő centrifugálás. Az oldatból a nukleinsavat a már ismert technikák egyikével (extrahálás-kicsapás, vagy kaotróp ionokkal szilikagélhez kötés) tisztíthatjuk.

1.4. 5.1.4. RNS-izolálás Már említettük, hogy igen sokféle RN-áz létezik a sejtekben, vannak közöttük nagyon stabil enzimek. A bőrünkről, hajunkból folyamatosan kerülnek elhalt sejtek a környezetünkbe, nem túlzás azt állítani, hogy a belőlük kiszabaduló RN-ázok mindenütt ott vannak. RNS-izolálásnál tehát elsődleges szempont, hogy megakadályozzuk az RN-ázok hozzáférését a mintánkhoz. Az izolálást nagyon tiszta körülmények között, gyorsan, és lehetőleg minél alacsonyabb hőfokon (jégben hűtve) végezzük. Előre letisztított laborasztal és pipetták, tiszta kesztyű, RN-áz-mentes oldatok és műanyag áru elengedhetetlen előfeltételek. Az RNS-munkához használt oldatainkat elkészítés után 1/1000-ed térfogat dietilpirokarbonáttal (DEPC) rázzuk össze, mert az tönkreteszi az RN-ázt. A DEPC-et 15 perces autoklávozással tudjuk elbontani. A manapság kapható, laboratóriumban használt víztisztító készülékek többnyire olyan tisztaságú vizet szolgáltatnak, amelyet szükségtelen további kezelésnek (pl. DEPC) alávetni. Hagyományosan a sejteket kaotróp sókat (guanidin-izotiocianát, guanidin-hidroklorid) tartalmazó lizáló pufferrel tárjuk fel, mely tartalmaz detergenst (nátrium-szarkozilát) és diszulfid-hidakat bontó redukálószert (β-merkaptoetanol) is. A homogenizálás után centrifugálással eltávolítjuk az esetleges sejttörmeléket, majd magas sókoncentrációjú (2M nátrium-acetát, pH:4) pufferrel savanyítjuk az oldatot. A szokásos extraháláshoz savas kémhatású (pH:~4,5) fenolt használunk, az extrahálást többször ismételhetjük. A kicsapást +1 térfogat izopropanollal (alacsony pH-n a DNS nem csapódik ki), a mosást 70%-os etanollal végezzük. Száradást követően az RNS-t DEPC-cel kezelt vízbe vesszük fel. Ha csak mRNS-ekre van szükségünk, az izolálást követően oligo-dT oszlopkromatográfiával tudjuk azokat kinyerni. Ha totális RNS-t izolálunk, annak épségét gélelektroforézissel tudjuk ellenőrizni (elsősorban a riboszomális RNS-eket jelentő, jól elkülönült, két vastagabb csík alapján, 5-6. ábra).

5.6. ábra - http://www.geochemicaltransactions.com/content/7/1/3/figure/F3?highres=y 2013.09.02.



Manapság már kapni olyan vegyszerkeverékeket (Trizol, Tri stb.), amelyben a kaotróp ionoktól kezdve a fenolon át a pufferekig minden megtalálható. Ha ezekben homogenizáljuk a mintánkat, utána egy egyszerű kloroformos extrakcióval külön tudjuk választani az RNS-t tartalmazó vizes fázist, amiből a szokásos módon (izopropanollal, etanollal) csaphatjuk ki az RNS-t. Egyre elterjedtebbek az RNS-izoláló kitek is. Ezek az RNS szilikagél, illetve anioncserélő-oszlop iránti affinitását használják ki.

2. 5.2. Fehérjék izolálása Fehérjéket a fiziológiás körülményekhez jobban ragaszkodó technikákkal szoktak izolálni, mert érzékenyek a nagyobb sókoncentráció- és pH-változásokra, vagy az oldhatósági körülmények megváltozására. Egy tipikus izoláló pufferben valamilyen pufferhatású anyag (foszfát, Tris), kelátor (EDTA, EGTA), megfelelő sókoncentráció, detergensek (SDS, Tween-20) és proteáz-inhibitorok (fenilmetil-szulfonil-fluorid, benzamidin, pepsztatin) találhatóak. A sejtek lízise hidegen zajlik, hogy a fehérjék degradációját minimalizáljuk. A homogenizátumból azután igen változatos módszerekkel választhatjuk el vagy tisztíthatjuk a szükséges fehérjéket (3. fejezet).


6. fejezet - Nukleinsav-módosító enzimek A cím egy kicsit félrevezető lehet, mert a nukleinsavakat nukleotidokból szintetizáló enzimeket is ebbe a csoportba soroltuk. Az alábbi kategóriákat tudjuk megkülönböztetni: Polimerázok Nukleázok Ligázok Másodlagos módosító enzimek Térszerkezet módosító enzimek Ebben a fejezetben a fenti csoportokba tartozó, a molekuláris biológiában leggyakrabban használt enzimek felsorolása történik. Ismertetjük az enzimek specifitását, főbb jellemzőit, és a legfontosabb felhasználási területüket. Ha az említett felhasználási területeket az olvasó nem ismeri, nem kell megijednie; ilyenkor tovább kell lapozni, a jegyzet későbbi részeiben többségük ismertetésre kerül. Akkor lesz érdemes visszalapozni ehhez a fejezethez, hogy az enzimek tulajdonságainak függvényében lehessen értelmezni az adott technikát.

1. 6.1. Polimerázok A polimerázok katalizálják a nukleotidokból történő nukleinsavláncok felépülését. A polimerizáció energiaigényes, a láncba beépüléskor a nukleotid-trifoszfátok magas energiájú foszfoanhidrid-kötése felhasad, ami a szükséges energiát szolgáltatja. A felszabaduló pirofoszfát két inorganikus foszfáttá történő hasadása pedig a reakciót (energetikailag) egyirányúvá teszi. Működésük mechanizmusából következik, hogy a polimerizáció kizárólag 5’-3’ irányú lehet (ez alól az élővilágban nincs kivétel). Megkülönböztetünk DNS- és RNS-polimerázokat, értelemszerűen ezek DNS vagy RNS polimerizációját katalizálják. A különböző polimerázok eltérhetnek sebességi állandójukban, hőstabilitásukban, hibajavító képességükben, processzivitásukban, a módosított nukleotidok felismerésének képességében.

1.1. 6.1.1. DNS-polimeráz A DNS-polimerázok a DNS egyik szálának polimerizációját katalizálják. Működésükhöz többnyire szüksége van egy templát szálra, amely mintául szolgál az új szál szintéziséhez. A templát szál többnyire DNS, de vannak RNS-dependens DNS-polimerázok is. Szintén fontos feltétel, hogy a nukleinsav legalább egy rövid részen dupla szálú legyen (egy komplementer szakaszra, ún. primerre van szükség), a DNS-polimerázok innen képesek 5’-3’ irányban hosszabbítani a láncot (6-1. ábra).

6.1. ábra - http://www.virology.ws/wp-content/uploads/2009/05/dna-polymerase-1.jpg 2013.09.12.


Nukleinsav-módosító enzimek

Molekuláris biológiában igen sokféle DNS-polimerázt használnak az elvégzendő feladat igényeinek megfelelően. Standard körülmények között az egyik leggyakrabban használt enzim az E. coli DNS-polimeráz I enzimének (limitált proteáz hasítással létrehozott) egy darabja, az ún. Klenow fragment. Jellemző rá, hogy nemcsak 5’-3’ polimeráz, de 3’-5’exonukleáz aktivitása is van, az 5’-3’ exonukleáz aktivitása viszont hiányzik. Általánosan használják a DNS második szálának megszintetizálására, radioaktív próbák készítésére, 5’ túlnyúló végek feltöltésére és 3’ túlnyúló végek visszaemésztésére (ún. „tompa végek” készítésére). A Klenow fragmenthez nagyon hasonló a működése a T4 és a T7 bakteriofágok polimerázainak. A T4 polimeráz 3’-5’ exonukleáz aktivitása kb. 200-szor nagyobb a Klenow fragmenténál, ezért az enzim jóval pontosabb átírásra képes (kevesebb hibát ejt a polimerizáció során). Leggyakoribb alkalmazási formái: a 3’-vég visszaemésztése során tompa vég (blunt end) vagy 5’ túlnyúló vég keletkezhet, tompa végű vagy ligálásindependens klónozási technikáknál tudjuk ezt kihasználni. Nagy pontossága (fidelitása) és hiányzó 5’-3’ exonukleáz aktivitása miatt polimerázként használható irányított mutációk bevitelére szolgáló reakciókban. A T7 polimeráz 3’-5’ exonukleáz aktivitása még nagyobb (kb. 1000-szerese a Klenow fragmentének), viszont amivel igazán kitűnik, az a magas processzivitás (ez azt jelenti, hogy ha az enzim megkapaszkodott, nehezen engedi el a DNS-szálat, sokáig tudja a polimerizációt katalizálni ugyanaz a molekula). Elterjedten használják irányított mutageneziseknél, 3’-5’ exonukleáz aktivitását elrontva pedig szekvencia-analízisnél (szekvenáz enzim). Az ép E.coli DNS-polimeráz I-nek van 5’-3’ exonukleáz aktivitása is: Egész addig halad a polimerizáció az egyes szálon, amíg egy dupla szálú részhez nem ér. Ezután azonban az enzim nem áll le: a dupla szálú rész egyik felét 5’-3’ irányban emészti maga előtt, és a helyére új szálat szintetizál (ha talál az oldatban dezoxinukleotid-trifoszfátokat). Ezt a tulajdonságát kihasználva az enzimet elsősorban ún. nick transzlációhoz használják: Ha van a kettős szálú DNS-ünk egyik szálán egy szakadás (nick), az enzim a szakadástól kezdve 5’3’ irányban kicseréli a szálat (mondjuk radioaktívan jelölt nukleotidokat tartalmazó új szálra) (6-2. ábra). DNSpolimeráz I-et használhatunk cDNS második szálának átírásakor is (lásd: 11. fejezet).

6.2. ábra 2013.09.12.

-

http://www.bbioo.com/uploadfile/200511/20051115143423244.gif


-


Hőforrásokban élő organizmusokban hőstabil DNS-polimerázok találhatóak. Ezeknek az ismertetésére a következő fejezetben kerül sor. Ritka, csak RNS-vírusokban található polimerázok az RNS templátról DNS-t szintetizálni képes ún. reverz transzkriptázok. Döntően cDNS-ek (például cDNS-könyvtárak) készítésére szokták őket használni. Egyes reverz transzkriptáz enzimeknek gyenge RN-áz aktivitásuk is van, amit szintén ki lehet használni cDNS-ek második szálának szintézisekor. Templátfüggetlen enzim a terminális dezoxiribonukleotidil-transzferáz (röviden: terminális transzferáz), mely random nukleotidokat beépítve képes egyes szálú DNS-t szintetizálni. Exonukleáz aktivitása nincs, működéséhez kobaltionok szükségesek. Használata igen elterjedt, elsősorban azonos nukleotidokat tartalmazó 3’ túlnyúló végek készítésére használják (homopolimer farkazás) (6-3. ábra).

6.3. ábra - http://biosiva.50webs.org/dna%20cl51.gif - 2013.09.12.



1.2. 6.1.2. RNS-polimeráz Az RNS-polimerázok többnyire DNS-, ritkábban RNS-dependens polimerázok (utóbbiak néhány RNS-vírusban találhatóak). A polimerázok működéséhez nem kell már meglévő dupla szálú szakasz, primer-függetlenek. Néhány speciális RNS-polimerázon (pl. primáz) kívül kötődésükhöz szükségük van egy jól meghatározott nukleotidsorrendű DNS-szekvenciára (promóter-régió), amely közvetlen közeléből elkezdődik az RNSszintézis (a széttekert DNS egyik szálát használva templátnak). Eukariótákban a polimeráz DNS-hez történő kapcsolódása más segédfehérjék (transzkripciós faktorok) segítségével történik. Molekuláris biológiában a DNS-dependens RNS-polimerázok közül elsősorban bakteriofágok (T4, T7 és SP6) polimerázait használják elterjedten. Az RNS-sé átírni kívánt DNS-szakaszt valamelyik (a T4, a T7 vagy az SP6 RNS-polimeráz felismerőhelyének megfelelő) promóter mögé klónozzák. A felszaporított, és izolált génkonstrukciót a gén mögött restrikciós endonukleázzal (lásd később) hasítják. A rendszerbe megfelelő RNS-polimerázt és ribonukleotid-trifoszfátokat adnak, így állítják elő az adott RNS-t in vitro. Ezt hívjuk az RNS „run-off” szintézisének (6-4. ábra).

6.4. ábra - http://www.vivo.colostate.edu/hbooks/genetics/biotech/enzymes/runoff.gif

Az RNS-polimerázok között is akad templátfüggetlen: ez a poli-A polimeráz, mely az mRNS-ek poliadenilációjában részt vesz. A polimeráz specifikus az ATP-re. Molekuláris biológiában mikroinjektálandó



mRNS-ek stabilitásának növelésére, oligodT primerek templátjának elkészítéséhez, és RNS-ek radioaktív jelöléséhez használják.

2. 6.2. Nukleázok A nukleázok a nukleinsavak nukleotidokká, vagy oligonukleotidokká történő degradációját katalizáló enzimek. A DNS-t dezoxiribonukleázok (DN-ázok), az RNS-t ribonukleázok (RN-ázok) bontják. Megkülönböztetünk exo- és endonukleázokat attól függően, hogy a nukleinsavakat a végük felől, vagy a szál belsejében hasítják. Vannak aspecifikusak, és vannak olyanok, amelyek egy adott nukleotidszekvencia felismerése után hasítanak (restrikciós endonukleázok).

2.1. 6.2.1. Dezoxiribonukleázok 2.1.1. 6.2.1.1. Aspecifikus DN-ázok Az aspecifikus DN-ázok nem specifikus (vagy csak nagyon tágan értelmezve specifikus) szekvenciáknál hasítják a DNS-t. Ha egy mintát szeretnénk DNS-szennyeződéstől megszabadítani, akkor általában emlős (pl. szarvasmarha) eredetű DN-áz I-et használunk. A DN-áz I endonukleáz, a DNS-t mono-, di-, tri- és oligonukleotidokra hasogatja. Csak RN-ázmentes DN-ázt használjunk, ha ép RNS-ekre van szükségünk a mintánkban. A BAL31 exonukleáz mindkét végén hasítja a dupla szálú DNS-t. Nick-eknél és gap-eknél (a kétszálú DNSben lévő egyszálú részek) endonukleázként hasítja a DNS-t, de a tisztán egyszálú DNS-t is hasonló módon emészti (6-5. ábra). Leggyakrabban deléciók generálására használják.

6.5. ábra - http://bioweb.wku.edu/courses/biol350/EnzymeTools7/Images - 2013.09.12.

Az S1 endonukleáz egyszálú nukleinsavakat hasít, legyen az láncvégi rész, vagy nem bázispárosodó egyszálú hurok. DNS-en ötször olyan aktív, mint RNS-en. Felhasználási módjai: egyszálú túlnyúló végek eltávolítása, RNS-térképezés (6-6. ábra), (5’, 3’ határok, intron-exon határok felderítése), nuclease protection assay (RNSszintek összehasonlítása), hajtűkanyarok elvágása (pl. reverz transzkripciónál vagy irányított deléció generálásnál), deléciók generálása exonukleáz III enzimmel keverve. (RNS-térképezés során jelölt próba segítségével az adott RNS hosszáról, végeinek elhelyezkedéséről, valamint a belőle kivágódott intronok hosszáról és elhelyezkedéséről nyerhetünk információkat. A többi módszer felhasználhatóságát a későbbiekben ismertetjük).

6.6. ábra - http://www.nationaldiagnostics.com/images - 2013.09.12.



Az exonukleáz III dupla szálú DNS-re specifikus, annak a 3’ végeit emészti, 5’ túlnyúló véget generálva (6-7. ábra). Nem processzív, ezért az emésztés lassú, jól kontrollálható. Sebessége függ az éppen leemészteni kívánt nukleotid bázisától (C>A=T>G). Felhasználási területek: szálspecifikus radioaktív próbák készítése, szekvenáláshoz egyszálú templát készítése, deléciók generálása (S1 nukleáz segítségével). Jó néhány más, aspecifikus DN-ázt is használnak a molekuláris biológiában (exonukleáz VII, „mung bean” nukleáz stb.), ezek működésére azonban itt most nem kívánunk kitérni.

6.7. ábra http://www.thermoscientificbio.com/uploadedImages/Products/DNA_RNA_Modifying_ Enzymes/Nuclease/en019_1.gif - 2013.09.12.

2.1.2. 6.2.1.2. Restrikciós endonukleázok A restrikciós endonukleázokra tekinthetünk úgy is, mint a baktériumok „immunrendszerének” tagjaira, melyeket a vírusok elleni védekezésre fejlesztettek ki. Működésük során specifikusan felismernek egy adott DNSszekvenciát, hozzákötnek a DNS-hez és elhasítják azt. Gyakran képesek ugyanazon DNS-szakasz metilációját is katalizálni. A metilált DNS-szakaszt többnyire nem tudják hasítani a restrikciós endonukleázok. Az enzimeket működés alapján három típusba oszthatjuk:



I. típusú: Több alegységből állnak, ugyanaz a komplex katalizálja a hasítást és a metilálást. A DNS-t a specifikus felismerőhelytől messze, aspecifikusan hasítják. Molekuláris biológiában nem tudjuk őket használni. III. típusú: Az I. típushoz hasonlóan több alegységből állnak, ugyanaz a komplex katalizálja a hasítást és a metilálást. Két, egymással szimmetrikus felismerőhelyük van, de azoktól távol, aspecifikusan hasítanak. Molekuláris biológiában nem tudjuk őket használni. II. típusú: Homo- vagy heterodimerek, a felismerőhely szekvenciájában, vagy annak közvetlen közelében hasítanak, pontosan kiszámítható módon. A komplexeknek metiláz aktivitásuk nincs, működésükhöz Mg2+iont igényelnek. A homodimer enzimek palidrom (visszafele olvasva is ugyanaz) szekvenciákat ismernek fel. Működésük következtében a felszabaduló 5’ végeken foszfát-, a 3’ végeken hidroxilcsoport található. Attól függően, hogy milyen hosszú a felismert palindrom szekvencia, megkülönböztetünk 4, 6 vagy 8 kulcsos enzimeket. Molekuláris biológiában ennek a típusnak az enzimeit használják (6-8. ábra).

6.8. ábra - http://www.scq.ubc.ca/wp-content/endonuclease2.gif - 2013.09.12.

A restrikciós enzimek elnevezése emlékeztet a baktériumfajra, amiben megtalálták, és hogy hányadik enzimet találták meg az adott fajban. Az ugyanazon baktériumfajban talált enzimek hasonló pufferben működnek megfelelően, de a különböző fajokban sokszor nagyon más körülmények uralkodnak. A restrikciós enzimeket gyártó cégek megpróbálnak optimalizált puffer-rendszerek alkalmazásával úrrá lenni a sokszínűségen, és minél kevesebb puffer alkalmazásával lefedni az összes enzim működési optimumát. A pufferek kiválasztásánál figyelembe kell venni a kémhatást, az ionerőt, a főbb kationok jelenlétét, elsősorban több enzim együttes használata esetén. Hőmérséklet-optimum tekintetében is változatosak ezek az enzimek. Előfordulhat az is, hogy az enzim nemcsak a specifikus felismerőhely környékén hasít, hanem másutt is. Ezt hívjuk az enzimek sztáraktivitásának. Ez jellemzően akkor fordulhat elő, ha túl sok enzimmel emésztünk, vagy túl magas a glicerinkoncentráció (>5%), esetleg lúgos a kémhatás (pH>8), vagy szerves oldószerek (EtOH, DMSO) maradtak a reakcióelegyben. 69 Created by XMLmind XSL-FO Converter.


Mesterségesen is elő tudnak állítani teljesen új restrikciós endonukleázokat úgy, hogy az egyik enzim adott felismerőhelyéhez (kapcsoló domén) egy másik enzim hasítóhelyét (nukleáz domén) kapcsolják. A restrikciós endonukleázok felhasználása igen széles körű, elsősorban DNS fizikai térképezéséhez, rokonsági kapcsolatok felderítéséhez vagy genetikai manipulációhoz használják őket.

2.2. 6.2.2. Ribonukleázok Többféle ribonukleáz létezik, részletes jellemzésükre most nem térnénk ki. Mindannyiukra jellemző, hogy az RNS-t degradálják. Elsősorban DNS-minták RNS-től való megtisztítására (RN-áz A), vagy cDNS készítésekor a második DNS-szál szintézise előtt/közben használják (RN-áz H).

3. 6.3. Ligázok A ligázok a DNS replikációjában és a DNS hibajavító folyamataiban vesznek részt. Mindig a nukleinsavak 5’ foszfát-csoportját kapcsolja egy másik lánc utolsó nukleotidjának 3’ –OH csoportjával. A legismertebb, széles specifitású, és ezért a legtöbbet használt a T4 bakteriofág DNS-ligáz enzime. Képes kettős szálú RNSeket, DNS-eket és DNS/RNS hibrideket egymáshoz „ligálni”, vagy kettős szálú nukleinsavakban lévő, egyszálú szakadásokat (nickeket) befoltozni (6-9. ábra).

6.9. ábra - http://www.mun.ca/biology/scarr/Fg15_02.gif - 2013.09.12.

A leggyakrabban használt T4 DNS-ligáz működéséhez ATP energiájára van szükség. A reakció-puffernek tartalmaznia kell még Tris-t (pH:7,8), Mg2+- ionokat, és redukálószert (DTT). A ligáz hőmérsékleti optimuma 20-25 °C. A T4 DNS-ligáz segítségével kapcsolhatunk egymáshoz ragadós, vagy tompa végekkel rendelkező nukleinsavakat, ezért a rekombináns DNS-technikák egyik legfontosabb enzime. Az egyszálú nukleinsavak összekapcsolásához legtöbbször a T4 RNS-ligázt használják. Ez nem csak RNSfragmenteket, de egyszálú DNS-fragmenteket is képes egymáshoz ligálni. Működése a T4 DNS-ligázhoz hasonlóan ATP-függő. Gyakran használják oligonukleotidok kapcsolására egyszálú cDNS-ekhez (például RACE során, lásd: 11. fejezet).

4. 6.4. Másodlagos DNS-módosító enzimek Ide azokat az enzimeket soroljuk, melyek nem két nukleotid kapcsolatát szüntetik meg, vagy hozzák létre. 70 Created by XMLmind XSL-FO Converter.


4.1. 6.4.1. Alkalikus foszfatázok A foszfatáz enzimek katalizálják foszfátcsoportok hidrolízisét nagyobb molekulákról (nukleinsavakról, fehérjékről stb.). Legelterjedtebbek a lúgos vagy semleges közegben működő alkalikus foszfatázok. Molekuláris biológiában legtöbbször arra használják őket, hogy a nukleinsavak 5’ végéről leemésszék a foszfátcsoportot. Erre akkor lehet szükség, ha meg akarják akadályozni, hogy az adott nukleinsav egy nem kívánt ligációs reakcióban részt vegyen (például a linearizált plazmid egyik vége ne a másik végével kapcsolódjon össze) (6-10. ábra). Legismertebbek a bakteriális, az északi rákból származó és a borjúbélből származó alkalikus foszfatázok. Utóbbit (calf intestinal phosphatase, CIP) használják a leggyakrabban.

6.10. ábra - http://www.escience.ws/b572/L6/images/CIAP.gif - 2013.09.12.

4.2. 6.4.2. Polinukleotid-kináz A kinázok foszfátcsoport transzferét katalizáló enzimek. A T4 vagy a T7 bakteriofágokból származó polinukleotid-kinázok az ATP γ-helyzetű foszfátját helyezik az 1-es vagy 2-ős szálú DNS vagy RNS 5’ végére. Az enzim az esetleges 3’ foszfátcsoportok hidrolízisét is katalizálja. A T4 polinukleotid-kináz alkalmazási területei: ligációhoz szükséges 5’ foszfátok generálása, 5’ vég jelölése radioaktív foszfáttal (pl. szekvenáláshoz), 3’ foszfátcsoportok eltávolítása.

4.3. 6.4.3. Metilázok A vad típusú E. coliban Dam (DNS adenin-metiláz) és Dcm (DNS citozin-metiláz) enzimek metilálják a DNS-t, S-adenozil-metionin felhasználásával. A Dam a GATC, a Dcm a CCAGG vagy a CCTGG szekvenciákat ismeri fel. A metilázok szerepe kettős: egyrészt a DNS-hibajavításban, másrészt a replikáció regulációjában vesznek részt. Mivel a metiláció gyakran elrontja a restrikciós endonukleázok felismerőhelyét, gyakran metilázdeficiens E. coli törzseket (dam- vagy/és dcm-) alkalmaznak a kutatómunkához. A metilázokat a molekuláris biológiában elsősorban akkor használják, ha a fenti szekvenciákkal átfedő felismerőhellyel rendelkező restrikciós endonukleázok működését szeretnék akadályozni, vagy elősegíteni (ez utóbbira példa a DpnI restrikciós enzim, mely a metilált GATC szekvenciát ismeri fel és hasítja, de a metilálatlant nem).

5. 6.5. Térszerkezet-módosító enzimek Ide azokat az enzimeket soroljuk, amelyek a nukleinsavak elsődleges szerkezetét nem változtatják meg.

5.1. 6.5.1. Helikázok A helikázok a replikáció során működő enzimek, a DNS két szálát szeparálják egymástól energia befektetésével. Molekuláris biológiai felhasználhatóságuk elsősorban a konstans hőmérsékleten végrehajtott polimerizációs reakciók (például a PCR-hez hasonló elven működő ún. izotermális amplifikáció) elősegítésében rejlik, hogy a reakcióban elkerülhessük a magas hőmérsékletű denaturáló lépéseket.

5.2. 6.5.2. Topoizomerázok



A topoizomerázok a DNS „feltekeredettségi állapotát” szabályozzák. A molekuláris biológiában elsősorban az E. coli Topoizomeráz I enzimjét használják, a sokszorosan feltekeredett (supercoiled) DNS relaxációjához, vagy a később (11. fejezet) ismertetendő TOPO-klónozási technikához.


7. fejezet - Polimeráz láncreakció A polimeráz láncreakció (PCR) annyira fontos technika, hogy külön fejezetben foglalkozunk vele. PCR használatával DNS-szakaszokat tudunk felsokszorozni igen gyors és hatékony módon. Feltalálásakor szinte forradalmasította a molekuláris biológiát; az addig ismert és használt technikák jó részét vagy lecserélték, vagy alternatívát kínáltak az új PCR-alapú technikák.

1. 7.1. A PCR elve A PCR elve nagyon egyszerű: a kétszálú DNS-szakaszt (hődenaturációval) egyszálúsítjuk, majd megszintetizáltatjuk mindkét szál komplementer párját. Ezt ciklikusan ismételve exponenciális módon felszaporítható a kiválasztott DNS-szakasz. A reakciót katalizáló polimeráz enzim tulajdonsága, hogy működéséhez kell egy dupla szálú DNS-rész is, ahonnan a polimerizáció el tud indulni. Ezt a tényt kihasználhatjuk arra, hogy kizárólag csak az a DNS-szakasz sokszorozódjon fel, amelyiket mi szeretnénk. A polimerizációs reakció folyamata a következőképp néz ki: ha egy egyszálú DNS-szakasz ismert részével komplementer szakaszt (ún. primert) készítünk, akkor az megfelelő körülmények között az adott komplementer szekvenciához be fog kötődni (a hibridizáció midig a bázispárosodás szabályainak megfelelően zajlik, adeninnel szemben timin, citozinnal szemben guanin található). Ha DNS-dependens DNS-polimerázt és dezoxinukleotid-trifoszfátokat (dNTP) adunk a fenti reakcióelegybe, akkor a feltapadt primer 3’ végétől elkezdődik a komplementer lánc polimerizációja. A polimerizációs reakciót egy idő után leállítjuk, a két szálat (új és régi) szétválasztjuk (például hődenaturációval). A képződött új szálhoz tervezett komplementer primert (melynek szekvenciája megegyezik a régi szál egy rövid szakaszának a szekvenciájával) is hozzáadjuk a rendszerhez, a második polimerizációs reakcióban az eredeti szállal (vagy egy részével) azonos szekvenciájú termék polimerizálódik. Beláthatjuk, hogy ezt elvben folytathatjuk a végtelenségig; ha minden polimerizációs/hődenaturációs ciklus után újra hozzáadjuk a kétféle primert és az enzimet (a hődenaturáció tönkreteszi az enzimek többségét), és újrafuttatjuk a reakciót, minden lépésben duplázódni fog a templátként szolgáló szakasz komplementere. Mivel az állandóan ismétlődő bemérés igen körülményes és munkaigényes lenne, ezért a reakció kezdetekor nagyon sok, mindkét szállal komplementer primert és hőstabil polimerázt teszünk a reakcióelegybe, minek következtében a két komplementer szál egyszerre szintetizálódik. Nem kell semmi mást csinálni, csak a hőmérsékletet ciklikusan változtatni, hogy minden ciklusban duplázódjon az adott DNS-szakasz. Nézzük részletesen a körülményeket: 1. Ha dupla szálú templátunk van, akkor 94-95 ºC-ra fel kell fűtenünk a reakciócsöveket, hogy a DNS széttekeredjen (denaturáció). 2. A mintákat lehűtjük arra a hőmérsékletre (45–65 ºC), ahol a specifikus primerek megtalálják a komplementer szekvenciájukat, de még nem képesek arra, hogy aspecifikus helyre kötődjenek. (Alacsonyabb hőmérsékleten egymással nem komplementer DNS-szakaszok is képesek aspecifikusan kapcsolódni.) Elvben itt az eredeti DNS két szála is visszakapcsolódhatna, mégsem ez történik, két ok miatt: egyrészt a templát DNS hosszú, sokáig tart, amíg a pontos párosodást megtalálja, másrészt primerből sokkal több van, hamarabb találja meg valamelyikük a komplementer szekvenciát. Ezt a kapcsolódási hőmérsékletet angolul „annealing temperature”-nek hívjuk, a reakció specifitását elsősorban ez határozza meg. 3. A primerek bekapcsolódása után szinte azonnal elkezdődik a polimerizáció. Hogy a polimerizáció megfelelően gyorsan haladjon, a reakció hőmérsékletét fel szokták vinni az enzim működési optimumára (7274 ºC). A felsokszorozni kívánt szakasz hosszának függvényében a reakciót melegítéssel leállítjuk (visszatérés az 1. pontra), ilyenkor szétválik a DNS két lánca, hogy aztán az annealing temperature-ra lehűtve ismét primerek tapadhassanak hozzájuk és újrakezdődhessen a polimerizáció (7-1. ábra).

7.1. ábra http://2.bp.blogspot.com/_tUQhsS1XUW8/TUBpry3jMII/AAAAAAAAAhk/PRjQkj0C nsw/s1600/Biofreaks+-+GGS+LIVE+PCR+-+reaction+scheme.jpg - 2013.09.13.


Polimeráz láncreakció

Az utolsó ciklus után rendszerint még egy hosszabb polimerizációs lépést is alkalmaznak, (72 ºC, 5 perc), amely során az esetleg csonkán maradt szálak is kiegészülhetnek. A fenti leírásból kiderül, hogy a reakció komponenseinek bemérését követően a láncreakció során semmi mást nem kell csinálnunk, mint a hőmérsékletet ciklikusan változtatni. A PCR-készülék igazából nem más, mint egy, a hőmérsékletét gyorsan változtatni tudó termosztát. Többféle PCR-készülék-típus van: 1. A hagyományos, ún. termoblokkos PCR-készülékek többnyire 0,2 ml-es vagy 0,5 ml-es mikrocentrifugacsöveket, és/vagy 96-lyukú PCR-plate-eket képesek kezelni (7-2. ábra). Hogy a minta hőleadása és hőfelvétele megfelelően gyors legyen, speciális, vékony falú csöveket érdemes a kísérletekhez használni. A készülék kapacitásától és az amplikon hosszától függően egy tipikus PCR-reakció 1,5–3 óra alatt le szokott játszódni. 2. A másik fontos készüléktípusban a minták vékony üvegkapillárisokban vannak, hogy gyorsabban átvegyék a külső hőmérsékletet. A kapillárisok egy tárcsán forognak, a hőátadás nem termoblokkon keresztül, hanem a tárcsát körülvevő levegőn keresztül történik (7-3. ábra). Ez utóbbi módszerrel a minták hőmérséklete sokkal gyorsabban változtatható, a PCR-reakció teljes hossza rövid amplikonok esetén akár 20-30 percre csökkenthető.

7.2. ábra - http://www.ridge2000.org/seas/images/lab_thermocycler.jpg - 2013.09.13.



7.3. ábra http://216.74.34.73/m/37/Article/RocheApplied_Lightcycler_Lightcycler_img.jpg 2013.09.13.

-

2. 7.2. Exponenciális szaporodás Tekintsük a hosszú, dupla szálú DNS-templát két szálát két geometriai „egyenesnek”, amelyeknek a 2-2 vége hosszan tekergőzik a végtelenbe. Az első reakció következtében a két egyenesünk mellé szintetizálódott két „félegyenes” is, amelyeknek egyik végét meghatározzák az adott primerek 5’ végei, a másik végük pedig addig polimerizálódik, amíg csak hagyjuk (bizonytalan, hogy milyen hosszú lesz). A második ciklusban már ezekről a félegyenesekről is keletkezik komplementer szál, de az új szálaknak mindkét vége, ezáltal a hossza is meghatározható (a két primer közti szakasz). További ciklusoknál mind a félegyenesek, mind a szakaszok száma növekszik, de a félegyeneseké (amik templátjai az eredeti egyenesek, számuk változatlan) lineárisan, a szakaszoké (templátjaik a félegyenesek és a szakaszok, számuk egyre nő), exponenciálisan. Az exponenciális szaporodás annyira túlnövi a lineárisat, hogy egy tipikus PCR-reakció 20-30 ciklusa után az eredeti templátok és a „félegyenesek” mennyisége elhanyagolható lesz a szakaszokéhoz képest (7-4. ábra). Ha X darab kettős szálú egyenesem volt kezdetben, és 100%-os hatékonysággal működik a reakció, akkor két ciklus után X darab kettős szálú szakaszom keletkezik. Az ezt követő minden ciklusban a szakaszok száma duplázódik, tehát n



ciklust követően X·2n-2 darab szakaszunk keletkezett Ezeket a „szakaszokat” hívjuk PCR-terméknek, gélen megfuttatva ideális esetben csak ez a homogén, egy csíkban futó DNS-fragment látszik.

7.4. ábra - http://enfo.agt.bme.hu/drupal/sites/default/files/pcr_0.png - 2013.09.13.

A PCR hatásfoka többnyire csak elméletben 100%, a valóságban ennél alacsonyabb (90-100%). Ráadásul a termékek száma csak az első néhány ciklusban növekszik exponenciálisan, egy idő után kezdenek elfogyni a primerek, a dNTP-k és a reakciót katalizálni képes szabad enzimek. Ráadásul az enzimek egy része is tönkremehet a hőmérséklet-ingadozástól. Ezért az exponenciális növekedés lelassul, végül leáll; többnyire azelőtt, mielőtt az összes beprogramozott ciklus lefutna. Ebből következik, hogy nagy ciklusszám esetén a ciklussorozat végén a termékek száma gyakorlatilag független az eredetileg a mintához adott templátok számától, inkább függ a termék hosszától, a primerek, a dNTP-k és az enzim mennyiségétől.

3. 7.3. A reakcióelegy összetétele A hagyományos, termoblokkos készülékben a PCR-reakciót többnyire 0,2 vagy 0,5 ml-es, vékony falú mikrocentrifuga-csövekben, vagy direkt erre a feladatra tervezett 96-lyukú plate-ekben végzik. A PCR-reakció térfogata többnyire igen kicsi (25–100 µl), hogy a folyadék a hőmérséklet-változásokat gyorsan követni tudja. A magas hőmérsékletből adódó intenzív párolgás és kicsapódás elkerülésére vagy ásványolajat cseppentenek a reakcióelegy tetejére, vagy még magasabb hőmérsékletre (105 ºC) fűtik a csövek tetejét (ez utóbbi olyan készülékekben lehetséges, amelyek fűthető tetővel rendelkeznek). A reakcióelegyet például Tris puffereli (pH: 8,3–8,8 szobahőmérsékleten), ionerősségét KCl biztosítja (50 mM). A dATP, dGTP, dTTP és dCTP koncentrációit egységesen 200-250 µM köré szoktuk beállítani. Egy reakciócsőbe 0,5–2,5 U (unit) hőstabil polimerázt adunk (ez körülbelül 2-10·1012 db enzimmolekulát jelent csövenként). A primerek koncentrációja páronként 0,1 és 0,5 µM között optimális. Nagyobb primerkoncentráció aspecifikus feltapadást (mispriming) okozhat. A templát koncentrációját is alacsonyan (pikogrammos nagyságrendben) kell tartani, hogy ne merüljön ki hamar a reakcióelegy. (Magas templátkoncentrációnál nagyon hamar elfogyna a primerek és a dNTP-k mennyisége, az exponenciálisan növekvő termékek nem tudnák megfelelően túlnőni a lineárisan szaporodó „félegyeneseket”.)

4. 7.4. Primerek tervezése 76 Created by XMLmind XSL-FO Converter.


A primereket körültekintően kell terveznünk, hogy működőképes és specifikus legyen a reakciónk. A primerek ideális hossza 20 nukleotid körül van (18–25), ennél rövidebb vagy hosszabb primerek aspecifikus feltapadást eredményezhetnek. Primerek tervezésénél a legfontosabb szempont, hogy a két primer feltapadási hőmérséklete (olvadási hőmérséklet, melting temperature, Tm) hasonló legyen. Ha megoldható, igyekezzünk olyan primereket tervezni, amelyek változatos nukleotidszekvenciájúak, a guaninok és citozinok mennyisége hasonló a timinek és az adeninek mennyiségéhez (GC arány ~40–60%), komplementer szekvenciák hiánya miatt sem magukkal (hairpin), sem a másik primerrel (primer dimer) nem tudnak összetapadni. Ajánlatos a repetitív szekvenciák kerülése. A primerek 3’ végén jó, ha C vagy G található, de érdemes kerülni a CG vagy GC végeket. Hogy megkönnyítsük az optimális primerpár tervezését, érdemes primertervező segédprogramokat használnunk, amelyek közül több online is hozzáférhető. Ha komplex genomi mintákat használunk templátnak, a primer szekvenciák specifikusságát érdemes DNS-adatbázissal történő összehasonlítás (pl. BLAST) útján ellenőrizni. A primerek 3’ vége nagyon pontosan kell, hogy illeszkedjen a templát DNS-re, de az 5’ vég igen változatos lehet; az eredeti templát DNS-től jelentősen eltérő szakaszokat, például restrikciós endonukleáz-hasítóhelyeket tervezhetünk ide. A 3’ végek szigorú meghatározottságát pontmutációk vizsgálatánál használhatjuk fel.

5. 7.5. A PCR alkalmazási területei, feltételei Mi mindenre lehet használni a PCR-technikát? Nézzük a legfontosabb példákat röviden: • Genetikai manipulácó (klónozás, irányított mutagenezis) • Adott élőlények jelenlétének kimutatása (bakteriális, virális fertőzések) • Szekvenciaanalízis (szekvenálás „lineáris” PCR-rel) • Mutációk, polimorfizmusok kimutatása (öröklődés, genetikai betegségek, apasági vizsgálat) • Mennyiségi vizsgálatok (specifikus DNS- vagy RNS-szintek mérése) A PCR elméletéből következik és a fenti példákból látszik, hogy bármiféle genetikai szennyeződés nagyban ronthatná a reakció specifitását, hamis pozitív eredményeket produkálva. Ebből következik, hogy a PCRreakcióhoz használt eszközöknek és oldatoknak kontamináció mentesnek kell lenniük. Mindig új, RN-áz- és DN-áz-mentes, steril, lehetőleg szűrővel ellátott pipettahegyeket és hasonlóan tiszta oldatokat használjunk a munkához. Tiszta gumikesztyűben, tiszta, dekontaminált laborasztalon, tiszta pipettával rakjuk össze a reakciókat (többnyire jégben hűtött csövekbe). A reakciócsöveket csak a kimérés/bemérés idejére hagyjuk nyitva. A törzsoldatokat alikvotokban tároljuk. Lehetőleg mindig rakjunk össze egy templát DNS nélküli negatív kontrollt, hogy lássuk, volt-e kontamináció. Kontamináció esetén érdemes először a steril desztillált vizet lecserélni (ez a legolcsóbb), de ha a kontamináció megmaradt, legjobb, ha minden oldatból újat használunk a jövőben. Hatósági bizonyítványok kiadására jogosult, ún. akkreditált laboratóriumokban az előírások még szigorúbbak. Külön helyiségben, gyakran steril elszívófülke alatt rakják össze a PCR-reakciót. Kesztyűn kívül szájmaszk és fejvédő használata is kötelező, a szellőzést is speciális úton biztosítják. A mintákat nem itt, hanem egy külön helyiségben sokszorosítják és futtatják, nehogy az esetlegesen kiszabaduló DNS a levegőbe jutva beszennyezhesse a jövőbeli mintákat.

6. 7.6. Hőstabil polimerázok Honnan származnak a hőstabil polimerázok? A hőforrásokban élő baktériumok fehérjéi igen hőstabilak, így a DNS-polimerázuk is. Legáltalánosabban a Thermus aquaticus baktérium ún. Taq polimerázát alkalmazzák PCR-reakciókhoz. A Taq polimeráznak nincs exonukleáz aktivitása, ezért katalízise gyors (több mint 1000 nukleotid épül be a láncba percenként), processzivitása nagy (nem nagyon disszociál a DNS-ről a polimerizáció közben). Az exonukleáz-aktivitás hiányának ára van: Átlagosan minden 45-ezredik nukleotidot elrontja, nem a komplementer nukleotid épül be az új láncba. Olyan esetekben, amikor hosszú DNS-szakaszt akarnak felerősíteni, vagy nagyon fontos a fidelitás, más polimerázt szoktak használni. A Pfu polimeráz a Pyrococcus furiosus baktériumból nyerhető ki. 3’-5’ exonukleáz aktivitása miatt sokkal ritkábban ront, átlagosan csak minden 380-ezredik nukleotidnál. Használják még a Thermococcus litoralis baktérium ún. Vent polimerázát,



mely fidelitásban az előző kettő között van (neki is van 3’-5’ exonukleáz-aktivitása), viszont hőstabilitása meghaladja az előző kettőét (95 ºC-on fél-életideje 7 óra). Mivel szeretnénk gyorsan, de egyben minimális hibával dolgozni, nagyon hőstabil polimerázok segítségével, a biotechnológiai cégek igyekeznek ennek az elvárásnak eleget tenni. Árusítanak olyan enzimkoktélokat, melyekben megfelelő arányban többféle hőstabil polimeráz található. Egy másik megoldás, hogy rekombináns úton, különböző polimerázokból származó domének fúziójával, vagy bizonyos tulajdonságok mutáció során történt megváltoztatásával hoznak létre teljesen új tulajdonságokkal rendelkező polimerázokat. Ezek a rekombináns polimerázok már precízek, gyorsak, hőstabilak. A PCR-reakciók specifikusságát rontó egyik hibaforrás, hogy az első melegítési lépés során még a DNS teljes széttekeredése előtt a primerek esetleg aspecifikusan odakapcsolódnak az éppen szétnyíló részekhez, és megkezdődik róluk a polimerizáció. Az így létrejött hosszú primerek aztán a későbbi ciklusokban már könnyen hozzákapcsolódhatnak a DNS-hez, iniciálják az aspecifikus polimerizációt, rontva ezzel a kívánt reakció specifikusságát. Hogy ezt elkerüljük, érdemes ún. Hot Start hőstabil polimerázokkal dolgozni. A polimeráz ilyenkor vagy az előre elkészített PCR-csőben, egy viaszszigetelés alatt található (ezt a módszert ma már ritkán használják), vagy egy antitest hozzákapcsolásával van az aktív centruma gátolva. A lényeg az, hogy az enzim az első melegítési lépés során még nem tudja kifejteni katalizáló szerepét. Egy hosszabb (5-10’) 95 ºC-os melegítés után a viasz megolvad és az enzim a reakciótérbe kerül, vagy az enzimhez kapcsolt antitest irreverzibilisen hődenaturálódik, leválik az enzimről, ezáltal az enzim katalízisének nincs további akadálya.

7. 7.7. A PCR-reakció specifitása A reakciót nem csak a primerek és az enzim minőségével tudjuk befolyásolni. Észrevették, hogy bizonyos adalékanyagok hozzáadásával jelentősen nőhet a kitermelés, vagy a reakció specificitása. Nem mindegyik adalékanyagnak ismerik a hatásmechanizmusát. A leggyakrabban használt adalékanyagok a DMSO (dimetilszulfoxid), a betaine, a DTT (ditiotreitol), a BSA (marha vérszérumából származó albumin) és a glicerin. Nagyon rosszul működő, vagy aspecifikus terméket adó reakciók is szinte varázsütésre megjavulhatnak, ha valamelyik komponenst optimális koncentrációban alkalmazzuk (akár többféle komponenst is lehet alkalmazni egyidejűleg). Egy már meglévő primerpár esetén a PCR-reakció specifitását legjobban az annealing temperature optimális beállításával, vagy változtatásával tudjuk elérni. Az optimális hőmérsékleten történő, specifikus PCR-reakcióra két módszert dolgoztak ki: 1. Az egyik az ún. touch-down módszer. Ennek során az első két ciklusban a kapcsolódási hőmérsékleteket 23 fokkal a primerek Tm-e fölé tesszük. Ilyenkor semennyi, vagy csak nagyon kevés primer fog betapadni, de azok nagyon specifikusan csak azokra a helyekre, amelyekkel tökéletes a komplementaritás. A következő két ciklusban 0,5 fokkal lejjebb visszük az annealing temperature-t. Most már nagyobb eséllyel tapadnak be a primerek, de azok is nagyobb számban a már elkészült specifikus amplikonokra. Ezután is 2 ciklusonként megyünk egyre lejjebb a kapcsolódási hőmérséklettel, egészen a T m-ig, vagy az alá 1-2 fokkal. A többi ciklust már ezen a végső kapcsolódási hőmérsékleten pörgetjük, egészen a reakció végéig. Azokon a hőmérsékleteken, ahol már a primerek épp, hogy be tudnak tapadni, felszaporodik a specifikus PCR-termék, ezért az alacsonyabb hőmérsékleten ez sokkal jobban fel fog erősödni, mint az esetleges aspecifikusak. 2. A másik gradiens PCR-készülék alkalmazása. Ez a módszer valójában mindössze arra való, hogy hamar megtaláljuk az optimális primertapadási hőmérsékletet. A gradiens PCR-készülékekben nyolc oszlopban összesen 96 mintát tudunk elhelyezni. Az első és az utolsó oszlopban külön beállítható az annealing temperature, a köztük lévő oszlopokban pedig ez egy kvázi lineáris grádiens szerint változik. Ennek következtében minden oszlopban más-más kapcsolódási hőmérséklettel fut a PCR-reakció. Egyszerre 12 identikus csőben kell végeznünk a PCR-t, minden oszlopba 1-1 csövet helyezve. A termékeket gélen megfuttatva meg tudjuk állapítani, hogy melyik az a kapcsolódási hőmérséklet, ahol már elég nagy mennyiségben megjelenik a termékünk, de a reakció még specifikus (nincsenek extra csíkok a gélen). A jövőben mindig azt az annealing temperature-t kell majd alkalmaznunk az adott primerpárra.

8. 7.8. Extra szakaszok beépítése A PCR-terméknek a két végére szükség szerint extra, általunk meghatározott rövid DNS-szekvenciákat készíthetünk. Ezek a plusz szakaszok új tulajdonságokkal ruházzák fel a keletkezett PCR-terméket: ezek a szakaszok lehetnek restrikciós enzimek felismerőhelyei, promóter-régiók, extra aminosavak kodonjai stb. Ezt 78 Created by XMLmind XSL-FO Converter.


úgy oldjuk meg, hogy a primerek komplementer részei elé szintetizáltatjuk a szükséges nukleotidokat. Mivel csak a primerek 3’ végén szükséges a tökéletes illeszkedés, az 5’ végére tervezhetünk gyakorlatilag bármilyen szekvenciát. Mivel a PCR-reakció során a primerek a termékek szerves részeivé válnak, ezért a primerek extra szekvenciáival is ez történik. Ha hosszabb extra szakaszra van szükség, több egymást követő PCR-rel lehet lépésről lépésre hosszabbítani az eredeti szekvenciát (7-5. ábra).

7.5. ábra -

Leggyakrabban restrikciós endonukleáz-hasítóhelyeket szoktak a PCR termékek végére tervezni, melyek a keletkezett termékek klónozását segítheti elő. Ilyenkor többnyire nem elég kizárólag a felismerést szolgáló 6-8 nukleotiddal hosszabb primert tervezni, mert az enzimek igénylik, hogy egy hosszabb szakasz belsejében legyen a felismerőhely. Ha csak 2-3 nukleotiddal hosszabb primereket tervezünk, az többnyire elég szokott lenni ahhoz, hogy a PCR-termékben az endonukleáz felismerje, és elhasítsa a restrikciós helyeket.

9. 7.9. Pontmutációk vizsgálata hagyományos PCR-rel Pontmutációk vizsgálatánál a primerpár egyik tagját mindig úgy tervezzük, hogy a 3’ nukleotid éppen a mutáns bázist fedje (a primerpár másik tagja az első primerhez képest tetszőleges távolságban, helyezkedhet el). Ha ezen a helyen a bázisok nem komplementerek, a primer 3’ vége nem kapcsolódik a templát szálra. Ilyenkor a polimeráz nem képes a lelógó nukleotid 3’ végére újabb nukleotidot polimerizálni. Mivel tapasztalatok szerint néha mégis leküzdi ezt az akadályt, és még a mutáns primerrel is képződik PCR-termék, a következő finomítással lehet növelni a specificitást: a primerben a 3’ végétől számított harmadik nukleotidot elrontjuk. Ha az utolsó két nukleotid szépen kapcsolódik a templát-DNS-hez, akkor ennek az egy nukleotidnak a kapcsolódása nem oszt, nem szoroz, a polimeráz a primer végétől elindítja a polimerizációt (a reakció végén kapunk PCR-terméket). Ha viszont az utolsó bázis sem kapcsolódik (mutáció), akkor az 1. és a 3. nukleotid „lifegése” megakadályozza, hogy a 2. helyen lévő bázis kössön a komplementeréhez, a primer 3’ végének utolsó 3 nukleotidja nem fekszik majd fel a templát-DNS-re. Ezt az anomáliát a polimeráz már nem tudja kezelni, ilyenkor nem képes a 3’ véget hosszabbítani (a reakció végén nem kapunk PCR-terméket) (7-6. ábra).

7.6. ábra -



10. 7.10. Degenerált PCR, multiplex PCR Ha ismert aminosav-sorrendű fehérjét kódoló, de ismeretlen nukleotid-sorrendű DNS-szakaszt szeretnénk felerősíteni, akkor a genetikai kódszótár segítségével ún. degenerált primereket tervezünk a felszaporítani kívánt DNS-szakasz két végére. Ezekben a primerekben adott helyeken többféle, vagy kevésbé specifikus nukleotidok vannak, ilyenkor végenként valójában nem egyféle, hanem többféle primerből álló keveréket adunk. Gyakran előfordul, hogy anyag- és időtakarékossági célzattal egy csőben egyszerre több PCR-reakciót futtatunk. Ezt hívjuk multiplex PCR-nek. Ilyenkor a primerpárok több, egymástól eltérő hosszúságú amplikont szaporítanak fel. Ilyenkor még fokozottabban kell figyelnünk, hogy az összes primer Tm-e hasonló legyen, és hogy a primerek ne kapcsolódjanak egymással.

11. 7.11. Kvantitatív mérések PCR-rel Korábban már beszéltünk róla, hogy ideális esetben a PCR-termék minden ciklusban duplázódik. Ebből az következik, hogy ha megmérjük a PCR-termék mennyiségét és ismerjük a ciklusszámot, abból kiszámíthatjuk, mennyi DNS-em volt az eredeti mintában (valójában csak két minta DNS-darabszámának összehasonlítását tudom elvégezni). Ezt a gyakorlatban nagyon nehéz megoldani, hiszen a PCR-termékek szokásos módon történő (gélen futtatás, interkalálódó festékkel festés) detektálásának küszöbe már jóval a reakció exponenciális szakasza felett található, ahol már nem érvényes a ciklusonkénti duplázódás. Ezért korábban többféle, viszonylag bonyolult módszert alkalmaztak, például: Különböző hígítási sorokat készítettek a templátokból, majd a reakció közben 10-15 ciklus után 1-2 ciklusonként kapkodták ki a készülékből a csöveket. A megfuttatott PCR-termékek denzitásából, a hígítások és a ciklusszámok ismeretében lehetett következtetni az eredeti DNS



mennyiségére. Mindezt lehetett finomítani radioaktívan jelölt nukleotidok használatával (sokkal alacsonyabb detektálási küszöb), vagy különböző arányú primerek adagolásával (amikor az egyik primer elfogyott, már csak a másik szálról történik átírás (lineáris PCR), ekkor már jóval lassabb és jobban mérhető lesz a DNSmennyiség emelkedése).

12. 7.12. Kvantitatív mérések real-time PCR-rel A mennyiségi meghatározás egy elegáns megoldása az ún. real-time PCR. Ha a reakcióelegyhez a DNS két szála közé interkalálódó, és az interkalálódás következtében fluoreszkáló festéket teszünk, akkor a külső gerjesztés hatására létrejött fluoreszcencia mennyisége egyenesen arányos lesz a kettős szálú DNS, tehát az amplikon mennyiségével. A készülék kialakítása olyan, hogy a fluoreszcenciát a PCR-reakció közben is detektálni tudjuk (7-7. ábra).

7.7. ábra http://www.b2b.invitrogen.com/etc/medialib/en/images/ics_organized/brands/molecular -probes.Par.91270.Image.400.351.1.g001355-gif.gif - 2013.09.16.

A real-time PCR-készülékekben található valamilyen monochromális fényt kibocsátó fényforrás, és egy fluoreszcens detektor. A jobb készülékek már több hullámhosszon is képesek gerjeszteni, illetve detektálni az emittált fényt. A hagyományos PCR-készülékekhez hasonló műszerekben a reakcióelegy valamilyen átlátszó kupakú mikrocentrifuga-csőben, vagy átlátszó fóliával fedett 96-lyukú PCR-plate-ben található, a gerjesztés és a detekció is az átlátszó felületen keresztül történik. Vannak olyan készülékek is, amelyekben a minták átlátszó kapillárisokba kerülnek. A kapillárisok felülete nagyobb, üvegfala hőáteresztőbb, mint a műanyag 81 Created by XMLmind XSL-FO Converter.


centrifugacsöveké. Az ilyen készülékekben a hőmérséklet-változtatás megfelelő hőmérsékletű levegő befúvásával történik. A gyors hőcserét a kapillárisok folyamatos, gyors forgatása teszi lehetővé. Ilyenkor a PCR-reakció specifitását növelheti a nagyon rövid (mindössze 5-10 másodperces) betapadási hőmérséklet (annealing temperature) alkalmazása. A PCR-reakció exponenciális fázisában a különböző minták fluoreszcenciája összehasonlítható, belőlük az eredeti DNS-mennyiségek aránya mérhető. A valóságban ez egy kicsit másképp történik: Megnézik, hogy egy minta fluoreszcenciája mikor ér el egy adott küszöbértéket (treshold) és feljegyzik az ehhez tartozó ciklusszámot (Ct). A két összehasonlítandó minta Ct értékeinek különbségéből (ΔCt) számolható az eredeti minták DNS-aránya. Ha például X minta Ct értéke 3-mal nagyobb, mint Y-é (ΔCt=3), akkor Y mintában 23=8szor annyi DNS volt eredetileg, mint az X-ben (7-8. ábra). A PCR hatékonysága persze nem 100%-os. Az éles kísérletek előtt hígítási sort használva minden primerpárra meghatározhatjuk az adott körülmények között a reakció hatásfokát. Ezt az értéket is figyelembe kell vennünk, ha a pontos arányokra kíváncsiak vagyunk. Általában minimum 90%-os hatékonyságot tekintünk elfogadhatónak, ha ennél alacsonyabb, akkor többnyire a primereket le kell cserélni.

7.8. ábra 2013.09.13.

-

http://www.virologyj.com/content/figures/1743-422X-7-232-9-l.jpg

-

A real-time PCR-reakció esetében különösen fontos a specifitás. Aspecifikus termékek esetén torzulna a mérés. A specifitás növelésére több lehetőség van. Az egyik a reakció körülményeinek és a primerek tulajdonságainak standardizálása. Az esetek többségében a hosszú denaturációs kezdő lépés (94 °C, 3 perc) után kétlépcsős ciklusokat alkalmazunk: 1. 94 °C, 15 sec: ezalatt denaturálódnak az amplikonok 2. 60 °C, 60 sec: Ezen a hőmérsékleten betapadnak a primerek (mindkettő Tm-e 59±1 °C), és megtörténik a polimerizáció (az enzim optimuma 72-74 °C, az általunk használt szuboptimális hőmérsékleten a polimerizáció sebessége jóval kisebb). A felsokszorosítandó szakasz igen rövid, többnyire 60–200 bázispár hosszú, hogy a szuboptimális hőmérsékleten is rövid idő alatt végigérjen az enzim. A primerek tervezéséhez minden esetben számítógépes segédprogramokat kell használnunk, hogy az matematikai algoritmusai segítségével ki tudja nekünk választani az adott szakasz kimutatásához szükséges legoptimálisabb primerpárt. A reakció specifitását kétféleképp tudjuk ellenőrizni. Az egyik módszer, hogy a reakcióterméket gélen megfuttatjuk. A másik módszer kevésbé idő- és munkaigényes: a PCR-ciklusok befejezése után a PCR-terméket nagyon lassú hőmérséklet-emeléssel melegítjük fel. Amikor a termék eléri a rá jellemző olvadási



hőmérsékletet, a két szál elválik egymástól, a fluoreszcencia hirtelen csökken. A melegítés során detektálható fluoreszcencia kirajzol egy olvadási görbét („melting curve”), melynek deriváltjáról könnyen leolvasható az olvadási hőmérséklet. Mivel a különböző PCR-termékek olvadási hőmérséklete nagy valószínűséggel más és más, több PCR-termék aspecifikus felszaporodása esetén többcsúcsú derivált görbét kapnánk. Ha csak egy csúcsot kapunk, az a reakció specifikusságát jelzi.

7.9. ábra - http://www.malariajournal.com/content/figures/1475-2875-6-41-2-l.jpg 2013.09.13.

Ha magát a reakciót szeretnénk specifikusabbá tenni, arra is van mód. A felszaporítandó szakasz közepére tervezünk az egyik szállal komplementer, harmadik oligonukleotidot (ún. TaqMan próbát) is. A TaqMan próba a polimerizációban nem vesz részt, viszont két nukleotidja meg van jelölve egy-egy fluoreszcens festékmolekulával. Az egyik molekulát a real-time PCR-készülék fényforrása gerjeszteni képes, a másik festék („quencher”) viszont közelsége miatt elnyeli az első festék kibocsátott fényét (rezonancia-energiatranszfer). A PCR-reakció során a primerekkel együtt a TaqMan próba is betapad a templátra. Amikor a polimeráz működése közben elérkezik a TaqMan próbához, leemészti azt a DNS-ről, minek következtében a nukleotidjai felszabadulnak. A két különböző festéket tartalmazó nukleotid az oldatban messze kerül egymástól, ezért a rezonancia-energiatranszfer többé nem következik be: a készülék gerjesztésére az egyik festék látható fényt bocsát ki. Minden ciklusban duplázódik a fluoreszcens jel, amit a műszer érzékelni tud. Ez a fluoreszcencia csak akkor jelenik meg, ha az adott DNS-szakasz polimerizálódik, míg az interkalálódó fluoreszcens festékek esetében az aspecifikus polimerizációt nem tudtuk volna elkülöníteni a specifikustól (7-10. ábra).

7.10. ábra - http://www.foodsafetywatch.com/public/images/1050b.gif - 2013.09.13.



13. 7.13. Pontmutáció kimutatása real-time PCR-rel Csakúgy, mint a hagyományos PCR-rel, real-time PCR-rel is lehetséges pontmutációk kimutatása. A módszer nagy előnye, hogy megspórolható a gélelektroforézis és a gélfestés idő- és munkaigényes procedúrája. A realtime PCR-nek van egy olyan speciális változata, amelyet elsősorban nem mennyiségi kimutatásra, hanem pontmutációk felderítésére alkalmaznak. Ebben az esetben TaqMan próba helyett ún. „molecular beacon” (molekuláris fáklya) kapcsolódik a felsokszorosítani kívánt szakasz középső részéhez. A molekuláris beacon speciális, 25–35 hosszúságú oligonukleotid: a középső része a templát DNS-sel, a két vége viszont egymással komplementer. Amikor a molekuláris beacon a templát DNS-hez kapcsolódik, akkor a két vége nem kapcsolódik, egymástól távol vannak. Ha a két végére a TaqMan próbánál már megismert fluoreszcens festékek lettek kapcsolva, akkor a nagy távolság miatt közöttük nincs rezonancia-energiatranszfer, a külső fényforrással gerjesztett festék adott hullámhosszon fluoreszkál, amit mérni tudunk. Minél több amplikonunk keletkezik, annál több molecular beacon próba közepe tud ráülni a komplementer DNS-szálra, annál nagyobb lesz a fluoreszcencia minden ciklusban, közvetlenül az annealing után. Azok molecular beaconök, amelyek nem találnak komplementer DNS-templátot, ilyenkor egy más alakot vesznek fel: a végeik hibridizálódásával „hajtű” (hairpin) alakba rendeződnek, a két festék közel kerül egymáshoz. Ilyenkor létrejön a fluoreszcens rezonancia-energiatranszfer, a gerjesztett festék fluoreszcenciáját a másik festék (quencher) elnyeli, ezekről a molekulákról nem tudunk fluoreszcens fényt detektálni (7-11. ábra). A reakció előrehaladtával egyre kevesebb önmagával tapadó molecular beacon marad az annealing során, a detektálható fluoreszcencia ciklusról ciklusra nő. A polimerizáció optimális hőmérsékletén (72 ºC-on) molecular beacon ledisszociál a templát szálról, nem akadályozza a polimerizációt. (A TaqMan próbával ellentétben a molecular beacon nem degradálódik a reakció során.) A molecular beacon elkészíthető úgy is, hogy a két állapota (templáthoz kötődő vs. önmagával kapcsolódó) közötti energiakülönbség termodinamikailag igen csekély. Ez esetben a molekuláris beacon csak egy picivel szeret jobban kapcsolódni a templát DNS-hez, mint saját magához. Ha viszont a templát-DNS megfelelő szakasza akár egyetlen szakaszban is eltér a molecular beaconétől (pontmutáció), ez utóbbi inkább saját magával kapcsolódik, és a PCR-reakció folyamán nem bocsát ki jelet. A pontmutációk kimutatásának ez egy igen gyors és elegáns, de (a molecular beacon magas ára miatt) korántsem olcsó módja.

7.11. ábra - http://www.bio.davidson.edu - 2013.09.16.




8. fejezet - Szekvenciameghatározás A fehérjék és a nukleinsavak szekvenciáinak meghatározása a molekuláris biológia legfontosabb feladatai közé tartozik. Egyes peptidek szekvenciájának meghatározására már az 1950-es évek óta van lehetőség, elsősorban a láncvégi aminosavak lehasításának és analízisének segítségével. A legfontosabb, ma is használt módszer Pehr Edman nevéhez köthető. A huszadik század hetvenes éveinek végén nyílt először lehetőség arra, hogy a DNS bázissorrendjét meghatározzuk. Három, egymástól különböző technikán alapuló módszert fejlesztettek ki: a Sanger és Coulson nevével fémjelzett +/- szekvenálás módszerét, a Maxam- és Gilbert-féle kémiai hasítás elvén működő módszert és a Sanger-féle láncterminációs módszert. Egyszerűsége miatt csak ez utóbbi terjedt el, a klasszikus szekvenálási technikák közül csak ezt használják manapság.

1. 8.1. DNS-szekvenálás 1.1. 8.1.1. A Sanger-féle lánctermináción alapuló DNSszekvenálás A Sanger-féle szekvenálás során tulajdonképpen egy polimerizációs reakció zajlik. Az ismeretlen DNSszekvencia komplementer szálának egy ismert szekvenciájú részéhez primert tervezünk, majd egy lehetőleg nagy processzivitású polimeráz segítségével elkezdjük átírni a másik szálat. A körülmények a szokásosak: puffer, Mg2+-ionok, dNTP-k szükségesek a reakcióhoz. A reakció 4 párhuzamos csőben zajlik, mindegyik csőbe más-más dideoxi-nukleotidot kell tenni, kis mennyiségben. A 2,3-dideoxi-nukleotidokban a dezoxiribóz harmadik szénatomján sincs hidroxilcsoport, ezért nem képes hozzákapcsolódni a következő nukleotid 5’ foszfátja (8-1. ábra). A dideoxi-nukleotidok megjelenése a láncban tehát terminálja a további polimerizációt, az új lánc nem nő tovább. Mivel csak kevés dideoxi-nukleotid (ddATP, ddCTP, ddGTP vagy ddTTP) kerül egy adott csőbe, a termináció ritka, és véletlenszerű esemény. Keletkeznek olyan szálak, amelyekbe már korán beépül a dideoxi-nukleotid, ezért rövidek maradnak, és keletkeznek olyanok is, amelyekbe sokáig egy darab dideoxi-nukleotid sem épül be, ezért ezek hosszúak lesznek. Ha a négy párhuzamos mintát a reakciót követően gélen megfuttatjuk, a keletkezett szálak nagyság szerint elválnak egymástól. Mivel tudjuk, hogy melyik zsebbe melyik dideoxi-nukleotidot tartalmazó mintát tettük, a gél aljától (rövidebb szálak) indulva, visszafelé haladva leolvashatjuk a DNS szekvenciáját (8-2. ábra).

8.1. ábra 2013.08.06.

http://users.rcn.com/jkimball.ma.ultranet/BiologyPages/D/ddTTP.gif


-

Szekvenciameghatározás

8.2. ábra - http://www.austincc.edu/mlt/mdfund/pictures/sequencing1.gif - 2013.08.06.



Mivel az adott hosszúságú szekvenciák mennyisége külön-külön igen alacsony, a szokásos vizualizálási technikákkal (például EtBr) nem látszanának a gélben, ezért a keletkezett DNS-t valamivel meg kell jelölni. Ez vagy radioaktív, vagy fluoreszcens módon történik. Jelölhető az 5’ vég pl. radioaktív foszfáttal, vagy használhatunk előre megjelölt radioaktív vagy fluoreszcens primereket. Jelölhető radioaktívan az egyik dezoxi-nukleotid is az α-foszfátján; a keletkező polinukleotid-láncba beépülve azt is radioaktívvá teszi. (Ilyenkor elég az adott dezoxi-nukleotidnak csak egy kisebb részét jelölni, jó eséllyel a keletkezett láncok többsége így is tartalmaz majd radioaktív jelölést.) Lehet a láncterminációs dideoxi-nukleotidokat is jelölni, akár radioaktívan, akár fluoreszcensen. Klasszikusan a szekvenálást radioaktív jelöléssel végezték. Ez a technika manapság egyre inkább kiszorul a rutin szekvenálási technikák közül. A szekvenálás kezdetén a templát DNS-t egyszálúsítani kell. Ezt többnyire úgy oldják meg, hogy a DNS-t felmelegítik 95 °C-ra. 5-10 perc alatt a DNS teljesen denaturálódik (egyszálú DNS-t kapunk), majd jégre téve a mintát, hirtelen lehűtik. A gyorsan lehűtött DNS nem tudja olyan gyorsan megtalálni a komplementer szekvenciáját, ezért aspecifikusan, random módon fog kötődni a lehető legközelebbi, gyakran a saját láncán belüli, részben komplementer szakaszokhoz. Ilyenkor egy részben egyszálú hurkokat tartalmazó gubancot alkot, az egyszálú szakaszokhoz képesek más komplementer oligonukleotidok kötődni. Az ilyen gubancot hívjuk egyszálú DNS-nek (holott ez nem teljesen fedi a valóságot). Az egyszálú templát-DNS-hez hozzá kell mérni a primert, majd az egészet 65 °C-ra melegíteni 2 percig. A mintát ezután hagyjuk lassan kihűlni, a primerek betapadnak a komplementer helyekre. Az így előkészített DNS-hez hozzámérjük a reakciómixet: puffer, ionok, módosított T7 polimeráz, dNTP-k (részben jelölt), adott ddNTP. A



reakció szobahőmérsékleten zajlik, adott ideig (általában 5 perc), majd reakciót formamidos pufferrel leállítjuk (a formamid tönkreteszi a fehérjéket, pl. a szekvenázt). Ha genomi DNS-t szekvenálunk, érdemes a szekvenálandó szekvenciát PCR-rel felszaporítani. Ennek több előnye is van. Egyrészt felerősíthetjük a szekvenálás során kapott jelet, másrészt alternatív nukleotidok beépítésével gyengíteni tudjuk az egyszálúsított templát-DNS-en belül kialakuló, a szekvenálás hatékonyságát akadályozó másodlagos szerkezetek kialakulását (a GC-gazdag szakaszok hajlamosak összetapadni, hajtűt képezni). Ha a PCR-reakció folyamán dGTP helyett 7-deazaGTP-t vagy dITP-t (dezoxi-inozin-trifoszfát) használunk, a szekvenálás során a templátszálon belül kialakuló másodlagos szerkezetek gyengébbek lesznek, könnyen átjut rajtuk a polimeráz (8-3. ábra). A reakció érzékenységét hőstabil polimeráz használatával is növelhetjük, ami magasabb hőmérsékleten történő polimerizációt, ezáltal a templát-DNS másodlagos szerkezetének fellazulását teszi lehetővé. Ráadásul ezt kombinálhatjuk egy speciális PCR-reakcióval. Ilyenkor a szokásos szekvenálási reakcióban használtnál jóval több primert és nukleotidot használunk, és a PCR-hez hasonlóan több fűtési-hűtési ciklusban írjuk át a templát-DNS-t (lineáris PCR). Az ismétlődő átírások megsokszorozzák a keletkezett termékek számát, így kevés templát-DNS-ről is sok termék keletkezhet, ami nagyobb jelintenzitáshoz vezethet.

8.3. ábra - http://www.vialattea.net/spaw/image/biologia/2007_01/7-deaza-dGTP.jpg 2013.08.06.

Klasszikusan a minták futtatása szekvenáló gélen zajlik, mely némileg különbözik az eddig ismertetett poliakrilamid géltől. A 4–10% poliakrilamid/biszakrilamid keveréket, TBE puffert 7M ureát tartalmazó gélt keverés után szűrni kell (hogy a legapróbb szennyeződéseket is eltávolítsuk), majd vákuummal lassú keverés mellett ki kell szívatni belőle az oldott gázok nagy részét (hogy az öntés során ne képezzenek buborékokat). A belső felületükön szilánnal (CH3-SiCl2-CH3) előkezelt üveglapok igen közel, mindössze 0,2–0,5 mm-re helyezkednek el egymástól, közéjük öntjük a katalizátorokkal (APS, TEMED) kiegészített gélt. A levegőbuborékok elkerülése végett öntés során érdemes a felszerelt üveglapokat kissé ferdén megdönteni. A gélt nem töltjük csurig. Öntés után a gél tetején az üveglapok közé szorítjuk fésű sima részét, hogy megfelelő vastagságú gél szilárduljon meg a tetején is. A gél megszilárdulása után az ún. cápafog fésűt megfordítjuk, a fogakat picit beleszúrva illesztjük a gél felszínére. A leendő mintáknak így piciny trapéz alakú zsebek keletkeznek. A gélt minták nélkül körülbelül 45 percig 2000-3000 voltos feszültségen elő kell futtatni, hogy megfelelő hőmérsékletű (45-50 °C), majd a zsebek gondos kimosása és a minták (5 μl/zseb) betöltése után kezdhetjük az elektroforézist. A gél egyik felét üresen szokták hagyni; körülbelül 15 perc futtatás után töltik bele ugyanazokat a mintákat, mint az elején. A második mintákat addig futtatják, amíg a brómfenolkék ki nem fut a gélből. Ezen a módon deríthetik ki ugyanazon DNS-darabnak a primerhez távoli és a primerekhez közeli szekvenciáját, összesen 200-300 nukleotid hosszúságban. Futtatás és az egyik üveglap óvatos eltávolítása után a gélt 10% metanolt és 10% ecetsavat tartalmazó oldatban fixáljuk, majd vastag szűrőpapírra visszük át. Műanyag fóliával lefedjük, és vákuum alatt kiszárítjuk. A kiszárított gélre röntgenfilmet helyezünk, és 14–24 óra hosszat röntgenkazettában exponáljuk -80 °C-on, majd előhívjuk (8-4. ábra).

8.4. ábra -



Manapság az esetek többségében már külön arra specializálódott laborok végzik a szekvenálást, mégpedig automatizált módon. A jelölés minden esetben fluoreszcens módon történik, vagy a primereket, vagy a dideoxi-nukleotidot jelölik fluoreszcens festékkel. Utóbbi esetben megvalósítható az, hogy a négy különböző dideoxi-nukleotidhoz négy különböző, ugyanazzal a fénnyel gerjeszthető, de különböző hullámhosszúságú fényt emittáló festéket kapcsolunk. Ilyenkor a szekvenálási reakció négy helyett egyetlen reakciócsőben is végrehajtható (8-5. ábra). A reakcióhoz azonban olyan, genetikailag módosított szekvenáz enzimet kell használni, mely a fluorszcensen jelölt, az eredetitől erősen eltérő szerkezetű dideoxi-nukleotidot is szubsztrátként ismeri fel. Az automata szekvenátorok gyakran 96- vagy 384-lyukú plate-tel dolgoznak, ennyi mintát képesek szekvenálni egyszerre. A mintákat újabban már nem szekvenáló gélen, hanem kapilláris gélelektroforézis segítségével választják el, és fluoreszcens detektorral analizálják. A nagyság szerint elválasztott szakaszokat a detektor az emittált fény hullámhossza szerint azonosítja (8-6. ábra).

8.5. ábra - http://seqcore.brcf.med.umich.edu/doc/educ/dnapr/seqgels.jpg - 2013.09.18.



8.6. ábra http://genetics.thetech.org/sites/default/files/Seq4.gif; http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/1/18/DNA_sequence.svg/332pxDNA_sequence.svg.png - 2013.09.18.



1.2. 8.1.2. Új generációs szekvenálás A legutóbbi időkben új, ún. „új generációs” DNS-szekvenálási technikák fejlődtek ki. Különböző biotechnológiai cégek különböző módszereket fejlesztettek ki a DNS gyors szekvenálására. Mindegyik technológia nagyságrendekkel növeli meg a szekvenálás sebességét, a fent ismertetett Sanger-féle módszerhez képest. Ez igen jelentős időbeli megtakarítást jelenthet: míg a Human Genom Project során közel két évtized és számos laboratórium kooperációja volt szükséges a teljes emberi genom feltérképezéséhez, a legújabb technológiák segítségével ma már elegendő néhány nap és egyetlen készülék ahhoz, hogy egy élőlény teljes genetikai állományát megszekvenálhassuk. Mivel még nem kristályosodott ki, hogy a sokféle módszer közül melyik lesz a „jövő technológiája”, ezeket részleteikben nem ismertetnénk. Annyit azonban érdemes megjegyeznünk, hogy szinte mindegyik technika során valamilyen PCR-reakció erősíti ki a szekvenálni kívánt DNS-szakaszokat, és a kapott információk alapján egy nagy teljesítményű számítógép illeszti össze teljes genommá a szekvenciatöredékeket.

2. 8.2. Fehérjeszekvenálás 2.1. 8.2.1. Szekvenálás Edman-degradációval A fehérjék szekvenálására használt klasszikus módszer az ún. Edman-degradáción alapul, amelyet Pehr Edman az 1950-es években dolgozott ki. A módszer lényege, hogy a fehérjék amino-terminális részéhez gyengén bázikus körülmények között specifikusan kapcsolható fenil-izotiocianát. Savas környezetben, melegítés hatására a kötések elektronszerkezete átalakul, és az előbb felkapcsolódott csoport az első aminosavval együtt lehasad a fehérjéről. A kapott vegyület szerves oldószerekkel extrahálható, majd savas kezelés után valamilyen kromatográfiás módszerrel azonosítható (8-7. ábra). A megmaradó fehérjéhez újra kapcsolható a fenil-izotiocianát, és a ciklus kezdődik elölről. Mivel a reakció hatásfoka nem 100%-os (néha nem kapcsolódik csoport, vagy nem hasad le az aminosav), minden ciklus után egyre több az a fehérjemolekula, amelyiknek az első aminosava el fog térni attól, ami a többség szekvenciájában következne. Ezért a gyakorlatban mindössze 30 aminosav hosszúságig szokták elvégezni a fehérje szekvenálását. Hogy a fehérje többi részének szekvenciáját is kiderítsék, valamilyen szekvenciaspecifikus kémiai módszerrel, vagy endopeptidáz enzimek (például tripszin) segítségével szokták a fehérjéket oligopeptidekre emészteni, majd elválasztás után a peptideket külön szekvenálni. Részleges hasítás, vagy különböző specifitású endopeptidázok használatakor a kapott szekvenciák részben átfedhetnek, így kikövetkeztethető a fehérje teljes szekvenciája. Ha már ismert aminosav-szekvenciájú fehérje azonosítására akarjuk használni a reakciót, akkor elég csak az első 5-6 aminosavat megszekvenálni, többnyire az már egyértelműen definiálja a kapott fehérjét. Az Edman-degradáción kívül más, a peptidek N- vagy C-terminálisa felőli szekvenálást lehetővé tévő degradációs módszerek is ismeretesek. Elvük nagyon hasonló a fent leírtakhoz, de ezeket részletesen nem ismertetjük.

8.7. ábra http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/e/e4/EdmanDegradation.png 2013.09.18.


-


2.2. 8.2.2. Szekvenálás tömegspektrométerrel A tömegspektrométerrel (mass spectrometer, MS) történő fehérjeszekvenálás viszonylag új technika. Egyre elterjedtebb, idővel teljesen kiszoríthatja az Edman-degradáción alapuló fehérjeszekvenálást. Az Edmandegradációs módszerhez hasonlóan a hosszú fehérjéket itt is rövidebb peptidekre kell hasítani. Ez megoldható például valamilyen specifikus endopeptidáz segítségével. A hasítás következtében keletkezett peptideket valamilyen kromatográfiás eljárással, többnyire HPLC-vel választják el egymástól. Az elválasztott peptideket magas feszültség segítségével, aerosol formájában ionizálják, miközben a peptidek részlegesen fragmentálódnak. Az ionizált fragmenteket a tömegspektrométer a tömeg/töltés hányadosuk alapján el tudja különíteni. (A tömegspektrométer működésének részleteit itt most nem ismertetjük.) Az eljárás finomítható egy újabb fragmentációval és azt követő elválasztással (MS/MS). Az így kapott spektrumo(ka)t számítógép analizálja. Ha már korábbról ismert a spektrum mintázata, akkor következtetni lehet a peptid szekvenciájára. Ha nem ismert a mintázat, akkor a mérést meg kell ismételni úgy, hogy a fehérjét valamely másik enzimmel emésztjük a kromatográfia előtt. Az egymást átfedő peptidekről kapott spektrumokat a számítógép már össze tudja hasonlítani, és következtetni tud a fehérje aminosavsorrendjére (8-8. ábra).

8.8. ábra - http://en.wikipedia.org/wiki/Protein_mass_spectrometry - 2013.09.18.




9. fejezet - Hibridizációs technikák A hibridizációs technikák segítségével adott nukleinsavak méretét, elhelyezkedését, mennyiségét tudjuk meghatározni. Bár a technikák jó részét már az 1970-es években ismerték, még ma is kiterjedten használják őket. A módszerek lényege az, hogy egy (többnyire radioaktívan) jelölt egyszálú, általában 200–2000 nukleotidnyi nukleinsav (próba) specifikusan kötődik az egyszálú nukleinsav komplementer szakaszához. A jelölés következtében tudjuk az adott nukleinsav jelenlétét, mennyiségét kimutatni.

1. 9.1. Southern-blot A technika a nevét Edwin Southernről, a módszer feltalálójáról kapta. Segítségével főleg genomi DNS-t tudunk vizsgálni; deléciókat, inszerciókat, génátrendeződéseket, bizonyos esetekben (restrikciós endonukleáz hasítóhelyek érintettsége esetén) pontmutációk jelenlétét tudjuk kimutatni. Akár genetikai „ujjlenyomatok” készítésére is használható. A módszer lényege, hogy a genomi DNS-t valamely restrikciós endonukleázzal megemésztjük, majd agaróz gélen megfuttatjuk. A futtatás után a DNS-t egyszálúsítani kell; a gélt 1,5 M NaCl, 0,5 M NaOH oldatban inkubáljuk. A denaturáció után többnyire a gél semlegesítése következik; ennek során az egyszálú DNS-ek nem tudnak visszahibridizálni a komplementer szálhoz, mert térben messze kerültek egymástól. A gélből a DNS-t valamilyen technikával nitrocellulóz, vagy nejlon membránra transzferáljuk (9-1. ábra). A transzfer történhet többféle módon: vákuummal, elektromos áram segítségével és a hajszálcsövesség jelenségét kihasználva. Az első kettőhöz speciális készülékre van szükség, ezért az utóbbi technika a legelterjedtebb. Ha az utóbbi, kapilláristranszfer technikát használjuk, akkor a gélt valamilyen transzfer pufferrel (pl. 1,5 M NaCl, 0,15 M Na-citrát) átitatott vastag szűrőpapírra helyezzük, amelynek végei egy transzfer-puffert tartalmazó tankba lógnak. A gél tetejére helyezzük a nitrocellulóz membránt, annak a tetejére pedig egy köteg papírtörülközőt teszünk. A papírtörülközők tetejére plexi- vagy üveglap kerül, melynek súlya egymáshoz préseli a papírtörülközőket. A papírtörülköző-torony benne lévő apró kapillárisok miatt kiszívja a gélből a folyadékot, ami alulról folyamatosan pótlódik. A folyadék sodorja magával a DNS-t is, ami viszont a nitrocellulóz membránon nem jut át, ahhoz hozzáköt. Így gyakorlatilag elkészíthető a gélnek a membrán-„replikája”. Akár két replikát is készíthetünk ugyanarról a gélről. Ha két membránt teszünk a gél két oldalára, akkor papírtörülközők segítségével mindkét oldalra ki tudjuk belőle szívatni a DNS-t. Hátránya ennek a módszernek, hogy csak a gélben eredetileg található folyadékmennyiség használható a DNS transzferéhez, nincs folyadékutánpótlás, ezért a transzfer minősége rosszabb lesz, mint az előző esetben. A membránra transzferált DNS-t erősen (kovalensen) rögzíteni kell a membránhoz. Ezt leggyakrabban a következő módokon oldják meg: 1. Szárítókemencében, 80 °C-on kb. 1-2 óra alatt „rásül” a DNS a membránra. 2. Mikrohullámú sütőt használva ez az idő jelentősen megrövidül, akár 2 perc is elég, hogy a nukleinsav a membránhoz kössön. 3. Ultraibolya fény (254 nm hullámhosszú) segítségével 1-2 perc alatt keresztköt egymással a membrán és a DNS. A hosszú ideig tartó besugárzást kerülni kell, mert az UV hatására törik a DNS. A rögzítés után a membránt nejlonzacskóba vagy hibridizációs kamrába zárjuk, majd előzetesen egyszálúsított DNS-t (leggyakrabban lazacsperma-DNS-t vagy csirkevér-DNS-t) tartalmazó oldattal 42–68 °C-on (leggyakrabban 55 °C közelében) 1 óráig prehibridizáljuk a membránt. Az egyszálú DNS aspecifikusan leköt minden helyet a membránon és a gélből származó, membránkötött DNS-en. A prehibridizációval párhuzamosan elkészítjük a radioaktív próbát, melynek többféle módja lehet: • 5’ végjelölés polinukleotid kinázzal és γ-foszfátján radioaktív ATP-vel. • Komplementer próba készítése, mely részben radioaktív nukleotidokat tartalmaz. A próba elkészítéséhez a kimutatni kívánt szakasszal megegyező bázissorrendű templátot, véletlenszerű nukleotidsorrendet tartalmazó, heterogén oligonukleotidokat, ún. random primereket (például random hexamerek), és valamilyen 95 Created by XMLmind XSL-FO Converter.

Hibridizációs technikák

polimerázt (például klenow fragmentet) szekvenciaspecifikus primert is.

használunk.

Random

primerek

helyett

használhatunk

• Nick transzlácó E. coli DNS-polimeráz I és radioaktív nukleotidok segítségével (lásd 6. fejezet). • Aszimmetrikus PCR-reakció (az egyik szálból sokkal több lesz), vagy lineáris PCR-reakció (csak az egyik, a komplementer szál szaporodik fel) radioaktív nukleotidok felhasználásával. • In vitro transzkripció radioaktív nukleotidokkal (ilyenkor radioaktív RNS a kapott próba) A prehibridizáció után az oldathoz hozzáadjuk a radioaktív próbát, és 3–12 órát hibridizáltatjuk a membránhoz kötött DNS-hez. A hibridizáció során a specifikus próbák a komplementer helyekről leszorítják az aspecifikusan kötődő DNS-t, és bekötnek a helyére. A hibridizáció után egyre alacsonyabb koncentrációjú sóoldatokkal mossuk a membránt, hogy az aspecifikus helyre kötődött próbák lejöjjenek róla. Mosás után a membránt szárítjuk, majd átlátszó fóliába csomagoljuk, és röntgenfilmmel exponáljuk 16–24 óra hosszat (autoradiográfia). Az előhívás után tudjuk kiértékelni a filmet (9-1. ábra).

9.1. ábra http://www.bio.davidson.edu/people/kabernd/seminar/2002/method/lemethod/southblotl e.jpg - 2013.09.20.

2. 9.2. Northern blot Northern blottal adott specifikus gének működése következtében termelődött RNS-ek szintjét hasonlítjuk össze. A kísérlet menete nagyon hasonlít a Southern blotnál megismerttel. Az RNS-eket méret szerint elválasztjuk, majd specifikus próbákkal hasonlítjuk össze a különböző mintákban lévő, adott génről átíródott RNS-ek mennyiségét, amiből következtetni tudunk az adott gének expressziós aktivitására. Fontos különbség, hogy az elektroforézis előtt az RNS-eket nem kell restrikciós endonukleázzal emészteni, a különböző méretű RNS-ek szépen elválnak egymástól. (A nagyon sokféle mRNS olyan sűrű csíkozást alkot, hogy a gélt megfestve a csíkokat egy halvány, elmosódott oszlopnak látjuk.)



A northern blot egyik legfontosabb alapfeltétele, hogy ép RNS-t kell hozzá izolálni. Az RNS-ek épségét az izolálást követően agaróz gélelektroforézissel ellenőrizzük: a riboszómák alegységeiben található nagyobb RNS-ek (18S és 28S eukarióta sejtekben) két különálló csíkként látszanak EtBr-festés után. Ha ezek a csíkok nem, vagy nem elég élesen látszanak, akkor feltételezhető, hogy nem csak a riboszomális, de az mRNS-ek is degradálódtak. Degradálódott RNS-t nem szabad northern blot analízishez használni. A denaturáló gélen történő elektroforézis során az összehasonlítandó mintákból származó RNS-ekből egyforma mennyiségeket (pl. 20-20 µg-ot) futtatunk 2,2 M formaldehidet tartalmazó agaróz gélen. Futtatás előtt az RNSek másodlagos szerkezetét nagyrészt meg kell szüntetni, hogy az ne befolyásolja a futás sebességét és ne akadályozza a későbbi hibridizációt. Az RNS-mintákat egy óra hosszat 55 ºC-on kell kezelni glioxállal vagy formaldehid/formamid keverékkel, hogy az RNS másodlagos struktúráit tönkretegyük, és egyszálú RNS-ként, csak a méretének megfelelően fusson a gélben. A mintákat jégre tesszük, glicerint és brómfenolkék festéket tartalmazó gélfelvivő pufferrel keverjük, majd a gél zsebeibe töltjük, és kezdődhet az elektroforézis. Az elektroforézist formaldehidet tartalmazó pufferben, alacsony feszültségen végezzük, hogy minél jobb elválasztást kapjunk. A hosszú (sokszor egész éjszakán át tartó) elektroforézis után a gélt DEPC-kezelt desztillált vízben mossuk, majd a későbbi transzfer puffer összetételével azonos, vagy nagyon hasonló összetételű oldattal ekvilibráljuk. A transzfer a Southern blotnál megismerthez hasonlóan történik, gyakran más transzfer puffert használunk a nitrocellulóz, és mást a töltött nejlonmembránra történő transzferhez. A membránokra a már ismert módokon (UV, mikrohullám, hő) rögzítjük az RNS-t. A próbák előállítása, a prehibridizáció, a hibridizáció, a mosás, az expozíció és az előhívás ugyancsak a már ismertetett módon történik, néhány csekély metodikai különbséggel (9-1. ábra). A röntgenfilm feketedésének minták közötti különbözőségét az adott RNS-darabok mennyiségének különbsége okozza, ezt denzitométerrel tudjuk kvantifikálni.

3. 9.3. Dot blot és slot blot A dot blot és a slot blot technikákat kizárólag mennyiségi összehasonlításra alkalmazzuk. Ezeket a technikákat akkor alkalmazzuk, ha korábbi kísérletekben már meggyőződtünk arról, hogy az adott próba kizárólag az általunk kívánt nukleotidszekvenciához köt (például a korábbi Southern blot vagy northern blot hibridizáció során egyetlen csíkot kaptunk az adott mintában, nem voltak aspecifikus jelölődések). Ekkor megspórolhatjuk a nukleinsavak egymástól való elválasztását. Dot blot esetén ugyanazt a nukleinsav-mennyiséget egyforma térfogatban (pl. 20µl) kell oldanunk, majd pipettával felcsepegtetnünk egymás mellé. Slot blot esetében az azonos térfogat nem szükséges, ugyanis ilyenkor azonos felületű lyukakat tartalmazó műanyag keret és vákuum segítségével fogjuk a nukleinsavakat a membránra szívni (9-2. ábra). Száradás után a membrán sorsa ugyanaz, ami az előző két esetben. Itt is denzitometriás módszerrel próbáljuk kvantitálni a különböző mértékben feketedett pontokat.

9.2. ábra - http://www.bio-rad.com; http://imagej.nih.gov/ij/docs/examples/dot-blot/dotblot.jpg



4. 9.4. Nuclease-protection assay Csakúgy, mint a northern blotot, ezt is elsősorban adott génekről átíródott specifikus RNS-szintek összehasonlítására használják. Használható még RNS-térképezésre (3’, 5’ végek, intronok felderítése). A technika lényege, hogy itt nem a membránon, hanem a reakciócsőben történik a próba hibridizációja. Előre gyártott, radioaktív próbákat érdemes vásárolni, melyek komplemeterek a kimutatni kívánt RNS-sel. Gazdaságossági szempontokat is figyelembe véve legtöbbször nem egyfajta, hanem többfajta RNS-hez való próbákat szoktak egy csőben árulni, így egyszerre több (akár 8-10-12, általában ugyanabban az élettani folyamatban szerepet játszó) gén expresszióját tudjuk egyidejűleg vizsgálni. A lényeg, hogy a próbák hossza megfelelően nagy mértékben különbözzön, hogy azok a gélen jól elkülöníthetőek legyenek. A radioaktív próbákat feleslegben kell az RNS-mintához adni, hogy minden specifikus RNS-re jusson. A hibridizáció a hőmérséklet emelésével, majd lassú csökkentésével történik. A mintához ezután adjuk hozzá a nukleázt. DNS-próba esetén S1 nukleázt, RNS próba esetén pedig többnyire egyszálú RNS-t emésztő enzimkeveréket szoktunk használni (de az S1 nukleáz is működik). Az emésztés során elemésztődnek az egyszálú RNS-ek, az egyszálú próbák, az RNS/RNS és az RNS/DNS hibridek túlnyúló végei (RNStérképezésnél a dupla szálból kilógó, egyszálú hurkok is leemésztődnek). A mintákat ezután poliakrilamid gélen megfuttatjuk, a gélt megszárítjuk, és röntgenfilmmel exponáljuk (9-3 ábra). Az előhívott film denzitométerrel értékelhető. A membránreplika kiiktatása miatt a nukleáz-protection assay 20–100-szor érzékenyebb, mint a northern blot.

9.3. ábra http://216.74.34.73/m/37/Article/ambionf00165.jpg; http://216.74.34.73/m/37/Article/ambionf00137.jpg



5. 9.5. DNS-chip (DNA-microarray) A chiptechnológia használható génexpresszió (mRNS-mennyiségek) relatív mérésére, de használható genomok összehasonlítására, SNP (pontmutáció) detektálására, alternatív splicing és génfúzió kimutatására. A DNS-chip egy olyan lapocska, mely nagyon sok (akár több tízezer) piciny cellára van osztva. Mindegyik cellában ugyanannak az organizmusnak egy-egy génjét, vagy génvariánsát reprezentáló oligonukleotidok (25 vagy 60 bázis hosszúak, a fejlesztő cégtől függően) igen sok kópiája található a cella aljához rögzítve. A chipek celláiba az oligonukleotidokat mesterségesen szintetizálják ún. fotolitografikus ciklusokban: minden sötét/fény ciklusban újabb bázis szintetizálódik a lánchoz. A vizsgálandó mintában lévő, többnyire igen heterogén nukleinsav-állományt a hibridizáció előtt valamilyen fluoreszcens jelöléssel kell ellátni. Többnyire cDNS, ritkábban RNS felhasználásával történik a hibridizáció. Ennek során a jelölt nukleinsavak mind-mind az őket reprezentáló cellában lévő, kötött oligonukleotidhoz hibridizálnak. A nem komplementer, aspecifikus hibridizáció megfelelő körülmények között lemosható a chipről (9-4. ábra). Alapesetben minden mintához külön chipet kell használni. Ha egy adott specifikus nukleinsavból több volt az egyik mintában, mint a másikban, akkor abból több is hibridizál a megfelelő cellába,



ezáltal nagyobb fluoreszcens jelet kapunk a nukleinsavhoz kötött festék gerjesztésekor az egyik chipen, mint a másikon.

9.4. ábra - http://en.wikipedia.org/wiki/File:NA_hybrid.svg

A chipek úgy vannak kialakítva, hogy néhány zsebben negatív és pozitív kontroll próbák találhatók. A hibridizáció előtt a pozitív próbákhoz kapcsolódni képes nukleinsavakat keverünk a mintánkhoz. Mivel a hozzáadott oligonukleotidok mennyisége ismert, ezekkel a kontrollokkal tudunk kalibrálni a kapott fluoreszcencia intenzitása alapján. Vannak olyan készülékek, amik két különböző hullámhosszú fluoreszcens fényt tudnak detektálni. Ezzel lehetővé válik, hogy két különböző mintát ugyanazon a chipen vizsgáljunk. A két mintát különböző színű fluoreszcens festékkel megjelölve az emittált fény intenzitásának alapján kideríthető, hogy adott specifikus nukleinsavak mely mintában voltak többségben (9-5. ábra). A hibridizált fluoreszcens próbák fényintenzitásának összehasonlítását sohasem szemmel végezzük; a fluoreszcens detektor által mért eredményt számítógép analizálja, a fényerősséget a kontrollokra normalizálja. Több kísérlet statisztikai analízise után tudjuk csak egyértelműen igazolni az esetleges különbségeket. Ma már kaphatók olyan chipek, amelyek ugyan kevesebb gén analízisével (amelyek mindegyike valamilyen kapcsolatba hozható a vizsgálni kívánt élettani folyamattal), de több párhuzamos mérést tesznek lehetővé egyszerre, ezáltal gazdaságosabbá téve a technikát.

9.5. ábra http://en.wikipedia.org/wiki/File:Microarray-schema.jpg http://csmbio.csm.jmu.edu/bioweb/Bio480/08Fallmicroarray/group4/microarray%20int ro.jpg - 2013.09.20.





A DNS-microarray igen hatékony technika, nagyon sok változót tud egyszerre vizsgálni. Hátránya, hogy még nagyon drága, speciális műszerezettséget kíván, és a kapott eredmények csak hozzávetőleges pontosságúak, meg kell őket erősíteni valami más technikával (real-time PCR, northern-blot stb.) is.

6. 9.6. Kolónia hibridizáció Kolónia hibridizációval azt tudjuk kideríteni, hogy a sok lehetséges közül melyik baktériumkolónia (vagy bakteriofág-mező) tartalmazza az általunk vizsgálni kívánt DNS-darabot (vagy expresszál egy specifikus RNSt). A baktériumkolóniákra kör alakú, a petricsésze aljának felületével megegyező méretű nitrocellulóz (vagy nejlon) membránt teszünk. A membrán és a petricsésze egyes pontjait bejelöljük, hogy a későbbiekben vissza tudjuk idézni a pontos orientációt. A membránra odatapad a kolóniákban lévő baktériumok egy része. A membránt óvatosan leszedjük a plate-ről, majd a rátapadt baktériumkolónia-maradékokkal felfelé NaOH-t és SDS-t tartalmazó pufferbe áztatott szivacsra helyezzük. A puffer átitatja a membránt, a baktériumok elpusztulnak és felnyílnak, a bennük lévő DNS denaturálódik. A membránt óvatosan egy neutralizáló oldatot tartalmazó szivacsra tesszük át, minek a hatására az egyszálú DNS hozzáköt a membránhoz. Esetleges proteázos emésztéssel eltávolíthatjuk a DNS-hez kötődő fehérjéket. A membránt többször mossuk, majd kiszárítjuk. Ezután ugyanúgy kezeljük, mint southern blot esetén. Az előhívott röntgenfilmen lévő fekete foltok megmutatják, mely baktériumkolóniákban van jelen a keresett nukleinsavdarab (9-6. ábra).

9.6. ábra - http://wiki.biomine.skelleftea.se/biomine/molecular/images/pic034.gif 2013.09.20.

-

7. 9.7. Fluoreszcens in situ hibridizáció (FISH) A FISH-assay segítségével citogenetikai vizsgálatok során adott DNS-szakaszok jelenlétét és lokalizációját tudjuk kimutatni a kromoszómában. A vizsgálni kívánt szövetet vagy sejteket a tárgylemezen fixáljuk, majd permeabilizáljuk. A DNS az üveg tárgylemez felszínére tapad. Az így kapott mintát rövid, aspecifikus DNSszakaszokkal kell prehibridizálni. A specifikus próbát fluoreszcensen kell jelölni (pl. fluoreszcens nukleotidok



beépítésével nick-transzláció vagy PCR-reakció során), majd a prehibridizáció után 12 órán keresztül inkubálni a jelölt próbával. A mosások után a jelölés fluoreszcens mikroszkóp segítségével vizualizálható (9-7. ábra).

9.7. ábra http://1.bp.blogspot.com/-EvetKdgrE0/Tmdu9La425I/AAAAAAAAHFQ/lKBI9Qn7ZEU/s1600/01.jpg - 2013.09.26.


10. fejezet - Vektorok A vektorok olyan genetikai elemek, melyek képesek idegen DNS-t az élő sejtbe juttatni. A leggyakoribb vektorok plazmidok vagy bakteriofágok (rövidítve: fágok), de használnak a kettő kombinációjával létrehozott kozmidokat, vagy óriási rekombináns DNS-t tárolni képes mesterséges kromoszómákat is. A vektorokat a molekuláris biológiában betöltött funkciójuk szerint két csoportba oszthatjuk: klónozó vagy expressziós vektorok. Néha ez a határ nem is olyan éles, vannak olyan vektorok, amelyek mindkét funkciónak megfelelnek. A klónozó vektorok arra valók, hogy általában sok-sok lehetséges DNS-szekvencia közül valamelyiket felvegyék és azt egy különálló élőlénybe (legtöbbször baktériumba) juttassák. Mivel majdnem minden baktérium más és más genetikai állománnyal fog rendelkezni, a belőlük kinövő telepeket tudjuk majd genetikailag azonosítani (például a már ismertetett kolóniahibridizáció technikájával). Az expressziós vektorokba egy jól meghatározott, felsokszorosított DNS-szekvenciát ültetünk, ilyenkor minden vektorba elméletileg ugyanaz a szekvencia kerül. Ezek a vektorok a beültetett DNS-szakasz előtt tartalmaznak valamilyen promóterszekvenciát, ezáltal az adott DNS-ről RNS és az esetek többségében fehérje termelődik, ha a vektort a megfelelő organizmusba juttatjuk. A fehérjeexpressziós rendszerekről a következő fejezetben lesz szó.

1. 10.1. Plazmidok A plazmidok cirkuláris, extrakromoszomális DNS-darabok, természetes körülmények között is megtalálhatóak baktériumokban. Az F plazmidok az ún. szexplazmidok, segítségükkel azonos fajba tartozó baktériumok között horizontális géntranszfer lehetséges. Az R plazmidok a reszisztenciaplazmidok, valamilyen anitbiotikum elleni rezisztenciát biztosító gén található rajtuk. A Col plazmidok kolicinogén faktorokat (antibiotikumokat) termelnek más baktériumok ellen. A plazmidok önálló replikonok; saját replikációs origóval rendelkeznek, replikácójuk többnyire független a kromoszóma replikációjától, vagy a sejtosztódástól. A replikáció a replikációs origó jellegéből fakadóan történhet kétféleképpen: Téta-replikációval (a 2 szál egy helyen szétnyílik, és mindkét oldalon megszintetizálódik a komplementer szál), vagy ún. „rollingcircle” replikációval (az origónál az egyik lánc elhasad, a keletkező nick-nél keződik el ugyanennek a szálnak a szintézise). Ez utóbbi replikációtípus nagyon elterjedt egyes vírusoknál, hosszú, egyszálú konkatamereket képezhetnek ezen a módon.

1.1. 10.1.1. pBR322 A molekuláris biológiában mesterséges úton, különböző DNS-darabok „összevarrásával” létrejött plazmidokat használnak. Az egyik legrégebben használt vektor a pBR322. A replikációs origón kívül tartalmaz két (ampicillin és tetraciklin) antibiotikum-rezisztencia gént is, melyek lehetővé teszik a transzformált baktériumok kiszelektálását (10-1. ábra). A pBR322 már pozitív és negatív szelekcióra is alkalmas: csak azok a baktériumok maradnak életben az antibiotikumos táptalajon, amelyekbe bejutott a plazmid. Ha idegen DNS-t ültetünk a második antibiotikum-rezisztencia gén közepébe, és erre az antibiotikumra szelektálunk, csak azok a klónok fognak életben maradni, amelyek plazmidjai nem tartalmazák az inzertet. A pozitív, a plazmidban idegen DNS-t tartalmazó, ezért a második fajta antibiotikumos táptalajon elpusztuló baktériumok visszakeresése replika (másolat) plate-ek segítségével történik. (Az új, második antibiotikumot tartalmazó táptalajt az első plate-ről nitrocellulóz membránra itatott telepekkel fertőztük.) Ezekből a pozitív klónokból lehet kiválasztani néhányat, további vizsgálat céljára. A plazmidokba jellemzően 1–20 kilobázispáros idegen szekvenciát lehet beilleszteni. Hosszabb szekvenciák már nem stabilak (könnyen rekombinálódhatnak), és a nagyméretű plazmidok transzformációs hatékonysága is rohamosan csökken, ezért az ennél hosszabb szekvenciákat nem plazmidba szokták klónozni.

10.1. ábra - http://en.wikipedia.org/wiki/File:PBR322.svg - 2013.09.23.


Vektorok

1.2. 10.1.2.Antibiotikumok, rezisztencia Mik azok az antibiotikumok? Tulajdonképpen mérgek, melyek valamilyen (többnyire enzim-gátlás) mechanizmus révén toxikusak azokra a sejtekre, amelyek szenzitívek az adott antibiotikumra. A rezisztenciát a plazmidról átíródó fehérje okozza, mely valamilyen módon (többnyire a toxikus anyag lebontásával vagy szerkezeti módosításával) kivédi a toxicitást. A molekuláris biológiában használt antibiotikumok jó része (de nem mindegyik!) a fehérjeszintézis valamelyik lépését gátolja. Mivel prokariótákban és eukariótákban a fehérjeszintézisben részt vevő enzimek struktúrája eltérő (gondoljunk csak a riboszómák különbözőségére), az általunk használt antibiotikumok specifikusan vagy csak a prokarióta-, vagy prokarióta és eukarióta sejtekre egyaránt toxikusak. Prokarióta-antibiotikumok például az ampicillin, tetraciklin, streptomicin, kanamicin, kloramfenikol, míg pro- és eukariotákra egyaránt toxikus a zeocin, a blasticidin, a hygromicin B, a G418, a puromicin, a neomicin.

2. 10.2. Bakteriofágok A bakteriofágok a baktériumokon élősködő vírusok. Genetikai állományukat a baktériumba juttatva átprogramozzák annak a működését. A vírusok ún. korai génjeinek működése a virális genom megsokszorozódására, késői génjeik működése pedig a vírus fehérjeburkának elkészítésére hivatott. Bakteriofágokkal mint vektorokkal képesek vagyunk az általunk kívánt DNS-t a baktériumsejtbe juttatni.

2.1. 10.2.1. λ-fág A lambda-fág egy 48,5 kilobázispár hosszú, nyílt kettős szálú DNS-t tartalmaz. A DNS középső, körülbelül 20 kbp. részét ki lehet cserélni idegen DNS-re anélkül, hogy a fág szaporodási rátája, replikációs képességei sérülnének. A lambda-fág jellemzően klónozó vektor: klónozás során DNS-ének a két szélét (fágkarok) hozzáligáljuk a DNS-könyvtárból származó, körülbelül 15-20 kilobázispár (kbp.) fragmentekhez, majd a kész konstrukciókat csomagoljuk a vírus kapszidfehérjéibe. A teljes bakteriofág genomnak a beültetés után 38 és 53 kbp. közé kell esnie, hogy a kapszidba történő csomagolás megtörténjen (10-2. ábra). A fertőző rekombináns 105 Created by XMLmind XSL-FO Converter.

Vektorok

vírusok képesek DNS-üket bejuttatni, majd megsokszorozni az E.coli sejtben. A burokfehérjék megtermeltetése után a vírusok a baktérium lízisét előidézve ki tudnak szabadulni a sejtből, hogy aztán újabb gazdasejteket fertőzzenek. (A fertőzés-szaporodás ciklusukkal ún. plakkokat képezhetnek baktériumpázsitot tartalmazó agarlemezen.)

10.2. ábra - http://bio3400.nicerweb.com/Locked/media/ch19/19_09-lambda-vector.jpg 2013.09.23.

2.2. 10.2.2. M13 fág Az M13 egy hosszú bakteriofág, melynek cirkuláris egyszálú (single-stranded, ss.), 6407 nukleotidból álló DNS-e van (10-3. ábra). A fertőzés után a DNS-hez megszintetizálódik a második lánca, ezt az állapotot hívják replikatív formának. A fág a már ismertetett „rollingcircle” módon replikálódik, a fertőzés korai szakaszában a keletkező egyes szál mindig újra kiegészül kettős szállá. A fertőzés késői szakaszában a második DNS-szál szintézise gátlódik, a keletkező egyszálú DNS-ek kerülnek majd be az új fágokba. Ugyancsak késői szakaszban termelődnek meg a kapszid fehérjéi, amik becsomagolják a ss.fág DNS-eket. Az M13 fágfertőzés lassítja ugyan a baktérium szaporodását, de többnyire nem lizálja a sejtet: szépen elhagyja anélkül, hogy az elpusztulna. A bakteriofág DNS-e dupla szálú formában manipulálható, idegen DNS-szakaszok ültethetők bele. Az M13 fág DNS-ét nem csak klónozó vektorként, de expressziós vektorként is használhatjuk; az in vitro fehérjekapcsolatokat vizsgáló „fág-display” technikához is M13 bakteriofágot használunk (lásd: 15. fejezet).

10.3. ábra http://www.wwnorton.com/college/biology/microbiology2/img/eTopics/sfmb2e_eTopic_1 101_2.jpg - 2013.09.25.


Vektorok

3. 10.3. Kék-fehér szelekció A +/- antibiotikum-szelekciónál van egyszerűbb út is, hogy kimutassuk az idegen DNS sikeres integrálódását a plazmidba. Ilyenkor a DNS-darabot nem az antibiotikum-rezisztencia, hanem a β-galaktozidáz enzim egyik alegységének génjének közepébe integráljuk. Ha a gént elrontjuk, nem termelődik funkcióképes β-galaktozidáz enzim. Ezt úgy tudjuk detektálni, hogy míg az ép enzim a tejcukor helyett adott mesterséges szubsztrátot (Xgal) elhasítja és kék termék keletkezik, addig az inzertet tartalmazó génről nem keletkezik működőképes enzim, az nem hasítja az X-galt, ezért fehér színű baktériumtelep nő ki az agarlemezen (10-4. ábra).

10.4. ábra - http://www.sigmaaldrich.com/prodimages/b/b3928.jpg - 2013.09.25.


Vektorok

A lacZ gén kettős szabályozás alatt áll. Alacsony glükóz szint esetén a baktériumokban cAMP keletkezik, amely aktiválja a CAP (catabolite activator protein) transzkripcós faktort. Aktiváció hatására a CAP homodimert képez, beköt a lacZ gén promóteréhez, szétnyitja a DNS két szálát, minek következtében az RNS-polimeráz oda tud kapcsolódni, hogy elkezdhesse a gén átírását. Hogy ez megvalósulhasson, a baktériumokat glükóz-mentes agarlemezen kell tenyészteni. De ez a gén működésének csak az egyik, még nem elégséges feltétele. A lacZ promóter szekvenciája mögött található egy operátor-régió, melyhez hozzákapcsolódik egy inhibitor fehérje (LacI), amely gátolja az RNS-polimeráz kapcsolódását. (A lacI génnek gyenge konstitutív promótere van, ezért a fehérje mennyisége mindig alacsony, de állandó szinten termelődik). A gént úgy tudjuk meghajtani, ha ezt az inhibitort is leszedjük az operátor-régióról. Ehhez egy másik tejcukoranalógot, az enzim által emészthetetlen kötést tartalmazó izopropil-β-D-galaktopiranozidot (IPTG) adjuk az agarlemezhez, mely a baktériumsejtbe bejutva az inhibitor fehérje térszerkezetét megváltoztatja, így az disszociál a DNS-ről (10-5. ábra).

10.5. ábra - http://en.wikipedia.org/wiki/File:Blue_white_assay_Ecoli.jpg - 2013.09.25.


Vektorok

3.1. 10.3.1. pUC18/19 A talán legrégebbi, igen elterjedt, kék-fehér szelekciót lehetővé tévő vektorok a pUC18 és pUC19 vektorok. Ezek legnagyobbrészt az M13 fág DNS-ét tartalmazó rekombináns vektorok. Tartalmaznak tétamegkettőződéshez szükséges replikációs origót, ampicillin-rezisztencia gént (a róla termelődő β-laktamáz bontja az ampicillin és a karbanecillin antibiotikumok 4-atomos gyűrűjét), és a β-galaktozidáz enzim egyik (α) peptidjének a génjét (10-6. ábra).

10.6. ábra 2013.09.25.

-

http://openclipart.org/detail/130471/plasmid-vector-by-gsagri04

-

A β-galaktozidáz enzim valójában egy négy alegységből álló homotetramer. Alegységei 1024 aminosavból állnak. A 11.-41. amiosavakra deléciós, ezért működésképtelen β-galaktozidázzal (ezt hívják ω-peptidnek) 109 Created by XMLmind XSL-FO Converter.

Vektorok

rendelkező mutáns törzsek képesek visszanyerni laktózbontó képességüket, ha egy rövid, mindössze az első 59 aminosavat (ez az ún. α-peptid) kódoló DNS-szakaszt juttatnak be és fejeztetnek ki a sejtben. A két peptid összetapad, ugyan peptidkötéssel kovalensen nem kötődik, együtt mégis működőképes enzimet alkot. A kékfehér szelekcióhoz használt E. coli törzsek csak a lacZω gént tartalmazzák (10-5. ábra). A baktériumba juttatandó pUC18/19-en található a LacZ α-peptid génje. Ebben a lacZα génben található egy ún. polilinker régió (multicloning site, MCS), amely igen sok II. típusú restrikciós endonukleáz hasítóhelyét tartalmazza, egy viszonylag rövid szakaszon belül. Ez azért jó, mert ezekre a helyekre lehet majd beilleszteni az idegen DNS-t.

4. 10.4. Vektorok in vitro transzkripcióhoz In vitro transzkripció során a reakció mikrocentrifuga-csőben zajlik. Többnyire a polilinker régió mindkét oldalán található egy-egy promóter régió (T3, T7 vagy SP6), amely a megfelelő, adott bakteriofágra jellemző RNS-polimeráz felismerőhelye. A polilinker helyre illesztett DNS-szekvencia így mindkét irányban átírható; az „antisense” RNS akár kontrollként szolgálhat majd a „sense” RNS-sel végzett kísérletekben. In vitro módon átírt RNS-ekkel vizsgálható például azok térszerkezete, kapcsolódása fehérjékhez, enzimatikus aktivitása (ribozimek) vagy mikroinjektálást követően hatása az élő sejtekre (akár, mint virális szekvenciákat tartalmazó RNS-ek). Az így átírt mRNS-eket használhatjuk in vitro transzlációhoz is. Természetesen jelölt RNS-eket is készíthetünk, amelyeket például blot-hibridizációnál, in situ hibridizációnál, nuclease-protection assay-nél, használhatunk. Az in vitro transzkripcióhoz használatos vektorok jellemző képviselői a pGEM vektorcsalád tagjai. A pGEM vektorok tartalmazzák a lacZα gént, melynek belsejében található a MCS. Az MCS két oldalán pedig a kétféle, RNS-polimeráz specifikus promóter régió (például SP6 és T7) helyezkedik el. A transzgén sikeres beültetése után kék-fehér szelekcióval lehet kiválasztani a pozitív klónokat. Vannak olyan pGEM vektorok is, amelyeket nyitottan, ragadós végekkel (túlnyúló 3’ T-vel) árusítanak. Ez a PCR-termék egyszerűsített klónozását teszi lehetővé (lásd később). A ragadós végek melletti restrikciós endonukleáz hasítóhelyek ebben az esetben nem elsősorban a klónozást, hanem az in vitro transzkripció során szükséges nyílt konstrukciók létrehozását segítik („run-off” RNS-szintézis) (10-7. ábra).

10.7. ábra - http://www.promega.com - 2013.09.25.

5. 10.5. Fágemid vektorok A fágemid vektorok olyan plazmidok, melyek képesek kétszálú (téta-replikáció), és egyszálú („rolling circle”) replikációra is. Ez úgy lehetséges, hogy mindkét replikációfajtához szükséges replikációs origót tartalmazzák. 110 Created by XMLmind XSL-FO Converter.

Vektorok

A fágemid vektorok mind transzformációval, mind transzdukcióval (virális fertőzéssel) be tudnak jutni a baktériumba. Ha egy fágemid vektort tartalmazó baktériumot ún. helper-fággal fertőzünk, akkor a fágemid „rolling circle” replikációval megsokszorozódik, és a helper-fág DNS-e által termelt virális kapszidokban kijut a sejtből. (A fágemid vektor nem kódolja a fágkapszid fehérjéit, ezért van szükség a vad típusú helper-fágra a vektor becsomagolására és sejtből való kijuttatására.) A távozó fágok között helper-fágok is vannak, de kisebb mennyiségben, mint a fágemidet tartalmazó fágok (rosszabbul pakolódik a DNS-ük, mint a fágemid vektor). Egyszálú fágemid vektorban lévő DNS-szakaszokat használtak korábban szekvenálási reakció templátjaként. Ma az egyszálú formát elsősorban irányított mutagenezis létrehozására használják (lásd: 13. fejezet). A fágemidet tartalmazó fágok képesek újabb baktériumokat nagy hatásfokkal fertőzni, így a fág segítségével létrejött géntranszfer (transzdukció) hatásfoka sokkal jobb, mint bármelyik ismert transzformációs eljárás.

5.1. 10.5.1. pBluescript A pBluescript vektorok igen összetettek. A kétféle replikációs origón kívül tartalmaznak ampicillin-rezisztencia gént, lacZα gént multicloning site-tal (kék-fehér szelekcióhoz), T3 és T7 promóter régiókat (in vitro transzkripcióhoz) (10-8. ábra). A pBluescript vektorok használhatók kónozásra (ampicillin és kék-fehér szelekció), a konstrukciók helper-fág segítségével egyszálúsíthatóak (fág-forma), használhatóak szekvenálásra, irányított mutagenezisre, in vitro transzkripcióra. Tulajdonképpen mind az előbb példaként ismertetett pGEM, mind pedig a pBluescript olyan fágemid vektorok, amelyek mind in vitro transzkripcióra, mind klónozásra (majd a pozitív klónok szelektálására), mind szekvenálásra, mind irányított mutagenezisre alkalmasak. Csak azért szenteltünk két külön alfejezetet a transzkripciós vektorok és a fágemid vektorok ismertetésére, mert nem mindegyik fágemid vektor használható in vitro transzkripcióra, és nem mindegyik, in vitro transzkripcióra használható vektor viselkedik fágemidként.

10.8. ábra http://www.bio.davidson.edu/courses/molbio/molstudents/spring2003/keogh/pbluescript %2B.gif - 2013.09.25.

6. 10.6. Kozmidok 111 Created by XMLmind XSL-FO Converter.

Vektorok

A kozmidok (cosmid) olyan, λ-fág alapú vektorok, melyekből hiányoznak a λ-fág génjei, de megtalálható bennük a DNS becsomagolásához elengedhetetlen cos-régió. A kozmidokban van téta-replikációhoz szükséges replikációs origó, tehát a baktériumban kétszálú plazmidként tudnak replikálódni (10-9. ábra). Gyakran találunk bennük f1 replikációs origót rolling circle replikációhoz, és/vagy SV40 (SimianVacuolating virus 40) replikációs origót is, ami az emlőssejtekben történő replikációt teszi lehetővé. 40-45 kbp. hosszú szekvenciát lehet egy kozmidba illeszteni. A konstrukciók elkészítése után a DNS-t kapszidfehérjékkel keverjük, amely így fertőzőképes fággá áll össze. Ezzel a fággal fertőzve a sejteket, tudjuk a konstrukciót E. coliba juttatni, ahol az cirkularizálódik, és replikációra képessé válik.

10.9. ábra -

A fozmidok (fosmid) olyan kozmidok, melyek alapjai baktériumok F-plazmidja. Olyan szakaszokat tartalmaznak, melyek alacsony kópiaszámot biztosítanak számukra a sejten belül (repE), és olyan géneket (parA, parB, parC), melyek szaporodás során a fozmidok egyenlő eloszlását biztosítják az utódsejtek között (10-10. ábra). Az alacsony kópiaszámnak köszönhetően a beléjük klónozott DNS-szakaszok sokkal stabilabbak, kevésbé rekombinálódnak. Mintegy 40 kbp-os idegen DNS-szakaszt képesek a fozmidok tárolni.

10.10. ábra 2013.09.25.

-

http://www.ebiotrade.com/buyf/productsf/epicentre/fos5fig2.gif


-

Vektorok

7. 10.7. Mesterséges kromoszómák A mesterséges kromoszómák olyan vektorok, melyek igen nagy méretű DNS-darabot (több száz, néha ezer kbp.) képesek tárolni, ezáltal remekül használhatóak genomi könyvtárak készítéséhez. Olyan régiók és gének találhatóak rajtuk, melyek lehetővé teszik a sejtosztódás során az utódsejtekbe való vándorlásukat.

7.1. 10.7.1. YAC A YAC (yeast artificial chromosome) egy mesterséges kromoszóma, mely tartalmaz centromér, telomér, és az élesztőben történő replikációhoz szükséges szakaszokat. Megtalálható bennük az antibiotikum-rezisztencia gén (E. coliban történő szaporításhoz), valamint aminosav-, ill. nukleotid-szintézishez szükséges enzimek, mint szelekciós markerek (10-11. ábra). A YAC kapacitása igen nagy: 100–3000 kbp. hosszúságú idegen DNS-t is hordozni képes. Az összeligált rekombináns YAC-ot juttatjuk be az élesztősejtbe. A YAC előnye, hogy igen nagy DNS-darabokat, akár óriásgéneket is képes hordozni 1-1 klón. Az élesztőben a génekről esetlegesen expresszálódott fehérjék poszttranszlációsan tovább érhetnek, kialakítva ezáltal a megfelelő natív szerkezetet. A YAC hátránya viszont, hogy a YAC-klónok genetikailag nem stabilak, gyakran találnak közöttük ún. kimérákat, melyek vagy a klónozás során, vagy rekombináció következtében jöttek létre. Ezekben a kimérákban az egyes genetikai elemek nem a megfelelő sorrendben helyezkednek el, ami meggátolhatja a helyes szekvencia felderítését.

10.11. ábra http://www.biochem.arizona.edu/miesfeld/teaching/Bioc4712/pages/Exam1YAC4.jpg - 2013.09.25.

7.2. 10.7.2. BAC A BAC (bacterial artificial chromosome) vektorok mesterséges bakteriális kromoszómák. F-plazmid alapúak, tartalmaznak olyan géneket/szakaszokat, amelyek az alacsony kópiaszámot, és az osztódás során az utódsejtek közötti egyenlő eloszlást biztosítják (parA, parB, parC, repE). Kapacitásuk 120–300 kbp, genomi könyvtárak készítésére kiválóan alkalmasak. Tartalmaznak antibiotikum-rezisztencia gént, többnyire valamilyen (például kék-fehér) szelekcióra alkalmas gént (lacZα), és néha T7, T3 vagy SP6 fágok promóter-régióit a MCS két oldalán (in vitro transzkripcióhoz) (10-12. ábra). A fozmidoktól annyiban különböznek, hogy a BAC-ok nem mindig képesek bakteriofágokba csomagolódni: egyrészt a sokkal nagyobb inzert miatt, másrészt a cos régió esetleges hiánya miatt. Stabilitásuk viszont hasonló a fozmidéhoz, sokkal nagyobb, mint a YAC-é (nagyon alacsony a rekombinációs rátájuk).

10.12. ábra - http://www.seropia.com/bt/transgenic%20org.html - 2013.09.26.


Vektorok

Nagyobb stabilitásuk miatt választották őket a humán genomi könyvtár hordozóiként a Human Genom Project folyamán, melynek célja a teljes emberi genom megszekvenálása volt. Igen gyakran használják őket teljes vírusgenomok klónozására és vizsgálatára. Ilyenkor olyan BAC-ot használnak, ami alkalmas emlőssejtekben való szaporodásra. A sejtekben a BAC-ból „kiszabadul” a virális inzert, aminek (esetleges genetikai manipuláció során megváltozott) működését vizsgálni lehet. A technika előnye, hogy míg emlőssejtekben vírusok nagy mennyiségben való tenyésztése sokkal nehézkesebb, baktériumban könnyen lehet nagy mennyiségű, esetleg módosított vírusgenomot felszaporítani, amit a vizsgálat során visszajuttatnak az emlőssejtbe. Gyakran használnak BAC-okat hosszú DNS-szakaszok eukarióta (élesztő, emlős stb.) integrálására. Ilyenkor a vektorok a genom megfelelő szakaszával homológ rekombinációs szakaszokat tartalmaznak. A PAC a BAC-hoz nagyon hasonló felépítésű és működésű mesterséges kromoszóma. A P1 bakteriofág genetikai állományának módosításával készült rekombináns vektor. A P1 fág tartalmaz olyan elemeket (cre/loxP), amelyek a fág genomjának integrálódását segíti elő. Ezek a szakaszok segíthetik a legalább részben P1 fág eredetű vektorok integrálódását a gazdasejt genomjába.

7.3. 10.7.3. HAC Az emberi mesterséges kromoszómák (human artificial chromosome, HAC) viszonylag új keletű vektorok. Emlős- (emberi) sejtekben ideális vektorok: tartalmazzák mindazokat a régiókat, amelyek emlőssejtekben történő megmaradásukhoz és megfelelő időben történő szaporodásukhoz szükséges (10-13. ábra). Kópiaszámuk állandó, igen alacsony (1-2), a többi kromoszómával egy időben replikálódnak. Nincs limit, hogy mekkora DNS-szakaszt ültetünk beléjük, elvileg bármekkora, hosszú intronokkal ellátott gének befogadására alkalmasak. A virális vektorokkal szemben nagy előnyük, hogy rekombinációs hajlandóságuk sokkal alacsonyabb, ezért genetikailag sokkal stabilabbak. A HAC-ok felhasználási területe elsősorban a génterápiás kezeléseknél lehet elsődleges. Ezeknél a kezeléseknél fontos követelmény, hogy az expresszáltatni kívánt fehérjék mennyisége szigorúan kontrollált legyen, és a gyógyulást követően a gének végleg kikapcsolhatóak legyenek. Ennek egyik megoldása, hogy kondicionális HAC-okat gyártanak, amely adott körülmények között nem képesek az utódsejtekbe vándorolni, így elvesznek. In vivo alkalmazásukat hátráltatja, hogy még nincs olyan mechanizmus, amellyel megfelelő hatékonysággal a célsejtekbe tudnák juttatni (jelenleg a transzdukciós hatékonyság 5 százezred körül van).

10.13. ábra - http://chromoresearch.co.jp/e/chromosome/ - 2013.09.26. 114 Created by XMLmind XSL-FO Converter.

Vektorok

8. 10.8. Virális vektorok Csakúgy, mint a prokariótáknál, eukarióták esetében is lehetséges alternatíva a transzgének bejuttatása vírusok segítségével. A virális vektorok a gazdavírus jellegétől függően vagy integrálódnak a genomba (retrovírus, például lentivírus eredetű vektorok, 10-14. ábra), vagy episzómaként vannak jelen a sejtben (adenovírus, poliómavírus, papillómavírus, vagy Epstein–Barr-vírus eredetű vektorok). Az emlőssejt-tenyészetekben alkalmazott virális vektorok egyik fontos felhasználási területe lehet a génterápiás gyógyítás.

10.14. ábra - http://www.lentigen.com/images/product_diagram.jpg - 2013.09.26.


Vektorok

A virális vektorok nagy előnye, hogy a vírus segítségével nagy hatásfokkal jutnak be a célsejtbe. Az integrálódás előnye, hogy minden utódsejtben megtalálható lesz a transzgén, Hátránya, hogy ha valamely átíródó, vagy szabályozó régió közepére integrálódik, génmutációt okozhat, aminek következménye lehet valamely fehérje alul- vagy túlműködése. Ezek a genetikai változások súlyos elváltozásokat, gyakran rákos proliferációt okozhatnak. Az episzomális vektorok előnye, hogy az integrálódás káros következményeivel nem kell számolnunk. Hátránya, hogy az episzómák szaporodása gyakran nem függ a sejt osztódástól. Az episzómák száma az utódsejtekben igen változó lehet, megfelelő replikáció és eloszlási mechanizmsok híján túlszaporodhatnak az utódsejtekben, vagy eltűnhetnek az utódsejtekből. Ezért hosszú távon azok a virális vektorok jelenthetik a génterápiás kezelésekre a megoldást, amelyek nem integrálódnak, episzómaként alacsony, de stabil kópiaszámban vannak jelen a sejtekben, replikációjuk a gazdasejtéhez kötött, osztódás során egyenlő arányban jutnak az utódsejtekbe. A kutatók ma már egyre közelebb járnak egy ilyen ideális vektor elkészítéséhez.


11. fejezet - Klónozás, nukleinsavkönyvtárak A molekuláris biológiában a klónozás kifejezés jelentése eltér attól, amit sejtbiológiában, ill. általánosságban értünk alatta. Itt már azt a folyamatot is klónozásnak nevezzük, amikor idegen DNS-t illesztünk valamilyen vektorba. Természetesen a vektort ezután élő sejtekbe juttatva szaporítjuk fel, egyetlen genetikailag megváltozott sejt szaporodásával keletkeznek annak identikus változatai, klónjai. Ha egy adott élő rendszerből származó nukleinsavak összességét illesztjük ugyanannak a vektornak sok-sok példányába, majd mindegyik konstrukciót más-más sejtbe juttatjuk, akkor egy könyvtárat hozunk létre, melynek köteteiben ott rejlik az adott élő rendszerre jellemző genetikai információ. Csakúgy, mint az igazi könyvtárban, bizonyos kulcsszavakkal (genetikai próbákkal) rá tudunk keresni az olvasni (vizsgálni) kívánt kötetre. A könyvtárak reprezentálhatják a teljes organizmust, vagy annak egy speciális részét. Kétféle könyvtárat különböztetünk meg: genomi és cDNS könyvtárat. Könyvtárnak nevezhetjük magát a vektor nélküli DNSszakaszok összességét („DNS-pool”) a DNS-szakaszokat vektorokba illesztve, vagy az idegen DNS-szakaszokat tartalmazó vektorokat hordozó organizmusokat.

1. 11.1. Klónozás restrikciós enzimekkel Két duplaszálú DNS-darabot a legegyszerűbben úgy tudunk egymáshoz illeszteni, ha mindkettőnek a végén ugyanolyan végeket generáló restrikciós endonukleázzal történt a hasítás. Ha a restrikciós endonukleáz ún. ragadós végeket generál, akkor a végeken lévő egyszálú szakaszok hidrogénhíd kötésekkel összetapadhatnak, a két (mindkét szálon egy-egy) hiányzó dezoxiribóz-foszfát kötést pedig ligáz enzim segítségével hozzuk létre. Így tudunk a legegyszerűbb módon például lineáris DNS-t klónozni cirkuláris plazmidba (11-1 ábra). A lényeg, hogy mindkét DNS-t ugyanazzal az (vagy ugyanolyan komplementer ragadós végeket generáló) enzimmel emésszük.

11.1. ábra 2013.10.01.

-

http://www.accessexcellence.org/RC/VL/GG/images/inserting.gif


-

Klónozás, nukleinsav-könyvtárak

Sajnos igen gyakran előfordul, hogy a felnyitott plazmid két vége inkább egymáshoz kapcsolódik és ligálódik vissza. Hogy ezt elkerüljük, gyakran alkalikus foszfatázzal (CIP) leszedjük a nyitott plazmid 5’ foszfátjait. A foszfátok hiánya miatt a plazmid önmagával nem ligálódik össze. Mivel az inzerten sértetlenek az 5’ foszfátok, az a vektor 1-1 szálához hozzáligálódik. Az így cirkularizált vektor transzformációs hatékonysága körülbelül 3 nagyságrenddel nagyobb, mint a ligálódni képtelen lineárisé, ezért csak az inzertet is tartalmazó vektorok tudnak transzformálódni. A baktériumsejtbe bejutott konstrukció két megmaradt bemetszését („nick”) a baktérium DNS-hibajavító mechanizmusa kijavítja, még a plazmid gazdasejtben történő replikálódása előtt. Megtörténhet az is, hogy az inzert végein és a vektor klónozó helyén nincs egymásnak megfelelő hasítóhely. Ilyenkor meg lehet próbálkozni tompa végű (blunt end) ligációval, aminek a hatásfoka sokkal rosszabb, mint a ragadós végű (sticky end) ligációnak. Ebben az esetben vagy már eleve tompa véget generáló restrikciós enzimekkel hasítunk, vagy ragadós végeket generáló emésztés után feltöltjük a hiányzó nukleotidokat, illetve leemésztjük a túlnyúló végeket. A vektor önmagával történő kapcsolódását elkerülendő, itt is érdemes azt alkalikus foszfatázzal kezelni a ligáció előtt (11-2. ábra).

11.2. ábra - http://eu.idtdna.com/pages/images/decoded/cc_blunt-end-cloning_fig1.png?sfvrsn=0&c=HU - 2013.10.2.



Ha ismert a beültetni kívánt DNS-szakasz szekvenciája, az is meghatározható, hogy milyen irányban üljön be a vektor adott részébe. Ilyenkor két különböző, egymással nem komplementer ragadós véget generáló restrikciós endonukleázzal emésztjük a vektort és az inzertet. Ez nemcsak az inzert irányát szabja majd meg, hanem a plazmidot is megakadályozza abban, hogy önmagával összeligálódjon. Ahhoz, hogy megfelelő restrikciós endonukleázokkal tudjunk emészteni, először a plazmid MCS-ét kell tanulmányoznunk, és az inzert szekvenciájának és a megfelelő puffer-rendszerek ismeretében kiválasztanunk a két megfelelő restrikciós enzimet. Az inzertet egy PCR-reakcióval, az 5’ végeken a megfelelő restrikcós endonukleázok hasítóhelyeit tartalmazó primerek segítségével szoktuk sokszorosítani, majd restrikciós hasítás után ligálni az ugyanezen enzimekkel felnyitott plazmidba (11-3. ábra).

11.3. ábra - http://www.addgene.org/static/cms/images/PCR-based-Subcloning-2_1.gif 2013.10.02.



A fent leírt klónozási folyamatok több, egymást követő reakciók sorozatai. Az egyes reakciók között a DNSdarabokat (PCR-termék, vágott inzert, vágott plazmid, CIP-kezelt plazmid) mindig megfelelő módon tisztítanunk kell (kromatográfia, fragment izolálás, DNS-kicsapás), hogy a szennyeződéseket eltávolítsuk (mono- és oligonukleotidok, enzimek, pufferek) a soron következő reakció hatékonyságának érdekében.

2. 11.2. Ligáz nélküli klónozások A ligáz nélküli klónozási technikákban az a közös, hogy a konstrukciók előállításához szükséges reakciók közül elhagyható az általában igen időigényes ligálási lépés. A beültetni kívánt inzertben lévő restrikciós endonuekleáz helyekre sem kell tekintettel lennünk, mivel az inzertet nem emésztjük semmilyen restrikciós enzimmel.

2.1. 11.2.1. USER technológia A technológia lényege, hogy olyan hosszú ragadós végeket gyártunk a reakció során, amelyek összetapadva cirkuláris DNS-t eredményeznek, nem kell ligázzal megerősítenünk a kötődést. A transzformált plazmid két szálát azután a baktérium saját ligázai kapcsolják össze. A klónozáshoz speciális plazmidot kell terveznünk/vásárolnunk. A plazmidot egy restrikciós endonukleázzal elhasítjuk, majd egy másik, csak az egyik DNS-szálat hasító enzimmel kezeljük. Az eredeti, és a nick-et okozó hasítások között a komplementer szál el tud távolodni a nyílt plazmid két végéről, amelyek így két igen hosszú, de egymással összetapadni nem képes ragadós véget tartalmaznak. A túlnyúló végek utolsó, 3’ nukleotidja mindig dTMP. A beültetni kívánt szakaszt olyan primerek segítségével sokszorosítjuk fel, amelyek a specifikus részüktől 5’ irányban egy dezoxi-uridint, majd a plazmid túlnyúló végével megegyező szekvenciát tartalmaz. A PCR-reakció után a tisztított fragmentet enzimkeverékkel (USER) kezeljük, mely felismeri a DNS-be nem illő uracilt, és kivágja a szálból a dUMP-t. (Az enzimkeverékben kétféle, a DNS-hibajavítás során használatos enzim van: az uracil DNS-glikoziláz az uracil bázist vágja le a dezoxiribózról, az endonukleáz VIII pedig a láncban maradt dezoxiribóz 3’ és 5’ foszfodiészter kötéseit hidrolizálja, kihasítva a dezoxiribózt a láncból.) A PCR-fragment végeken megmaradt részek statisztikusan ledisszociálódhatnak, a plazmid ragadós végeivel komplementer szakaszok jönnek létre. Összekeverés után a vektor és az inzert így össze tud tapadni, lehet transzformálni a gazdasejtbe (11-4. ábra).

11.4. ábra 2013.09.29.

-

http://openi.nlm.nih.gov/imgs/512/2/1635280/1635280_gkl635f1.png


-


2.2. 11.2.2. Háromnukleotidos technológia A klónozás elmélete nagyon hasonló az előzőhöz, itt is a hosszú, ragadós végeket használjuk ki. A vektort restrikciós endonukleázzal hasítjuk, majd T4 DNS-polimerázt teszünk hozzá, de csak egyféle nukleotidot (mondjuk dTTP-t). A vektor úgy lett kialakítva, hogy a hasítóhelytől 5’ irányba mozogva elég sokáig hiányzik az egyik fajta nukleotid (a 11-5. ábrán ez a timidilát). A T4 DNS-polimeráznak egy gyenge 3’-5’ exonukleáz aktivitása van: visszaemészti az egyik szálat egészen az első dTMP-ig (ha az előbb említett példánál maradunk). (Valójában azt is leemészti, de a polimeráz aktivitása sokkal nagyobb, dTTP jelenlétében azonnal visszahelyezi a láncba.). Ugyanez történik a beillesztendő DNS-szakasszal is. A felerősítéshez tervezett primerek 5’ végére a vektor egyszálú részével komplementer szakaszt tervezünk. A PCR-terméket tisztítása után T4 DNS-polimerázzal kezeljük. A T4 DNS-polimeráz ezekkel a primerekkel komplementer szálat fogja hasogatni, dATP jelenlétében az első adenilátig. A fragmentek tisztítása után a vektor és a PCR-termék homológ szakaszai hibridizálnak egymással, a konstrukció ligálás nélkül bejuttatható a gazdasejtbe (11-5. ábra). A szakirodalomban tulajdonképpen ezt a módszert nevezik ligálás-independens klónozásnak, mi azonban egy hasonló fogalom (ligáz nélküli klónozás) alatt minden, ligáz enzim nélkül működő technikát összesítettünk. Megkülönböztetésképpen, a ragadós végek jellemző tulajdonsága miatt neveztük el háromnukleotidos technológiának.

11.5. ábra - http://www.sciencedirect.com - 2013.09.29.



2.3. 11.2.3.TOPO-klónozás Ezt a technológiát használva nem ligázt, hanem topoizomerázt használunk a DNS-szakaszok összekapcsolásához. (A topizomerázok olyan enzimek, melyek elvágják a DNS kettős szálát, majd DNStérszerkezeti változás után ugyanott összeillesztik őket.) A topoizomeráz gyárilag a nyitott vektor 3’ –OHcsoportjához van kapcsolva kovalensen, egy foszfátcsoporton keresztül. A vektor tartalmazhat mindkét végén 3’ túlnyúló timidilátot, vagy valamelyik végén 5’ túlnyúló szekvenciát (ragadós végek) a kapcsolódás hatékonyságának növelésére (és az önligálódás elkerülésére). Az inzertet a PCR-reakció során vagy olyan hőstabil polimerázzal (például Taq polimeráz) szaporítjuk fel, amelyek túlnyúló adenilátot készítenek (11-6. ábra), vagy olyan primert használunk a PCR-hez, amelynek 5’ vége komplementer a vektor túlnyúló végére (11-7. ábra). (Ez utóbbi esetben a vektor túlnyúló vége statisztikusan le tudja szorítani az inzert egyik szálát a másikról, hibridizál vele.) A topoizomeráz létrehozza a kovalens kötést a fragmentek között, a gazdasejt hibajavító mechanizmusai pedig elvégzik a tökéletes kapcsolódást (lelógó szálak leemésztése, „nick”-ek összeligálása).

11.6. ábra - http://2007.igem.org/wiki/images/6/64/BU_topo.jpg - 2013.09.29.



11.7. ábra http://bioinforx.com/lims1/bxseqtools/ultimate-molecular-cloningguides/images/diagram_directionalTOPO.gif - 2013.09.29.



2.4. 11.2.4. Rekombinációs klónozás A rekombinációs klónozás során az egyik vektorban lévő inzertet helyezzük át a másik vektorba (szubklónozás). Jellemzően ez akkor szokott megtörténni, ha egy klónozó vektorból juttatunk át egy DNSszakaszt egy expressziós vektorba, hogy ott kifejeződhessen. Ehhez szükség van arra, hogy mindkét vektorban egymással kompatibilis szekvenciák legyenek a klónozó kazetta két végén, hogy a kazetták egymással homológ rekombináció során kicserélődhessenek. Többnyire szükség van még valamilyen, a rekombinációt segítő enzimre (rekombináz, transzpozáz), amely a rekombináció incidenciáját jelentősen megnöveli akár in vivo, akár in vitro körülmények közt. A rekombináción alapuló klónozás egyik legismertebb, és talán leggyakrabban használt fajtája az ún. Gatewaytechnológia. A klónozás során két plazmiddal dolgozunk, egy klónozó (donor vektor) és egy expressziós („destination” vektor) plazmiddal. Az ún. donor plazmidba az idegen DNS beültetését végezhetjük hagyományos módon, restrikciós endonukleázok és ligáz enzim segítségével, de a technológiát kifejlesztő cég TOPO-klónozásra, vagy rekombinációs klónozásra alkalmas vektorokat is ajánl és árusít. Utóbbi esetben a PCR-fragmentet olyan primerekkel szaporítjuk fel, melyek 5’ végükön tartalmazzák a λ fágokban található, azok integrációjáért felelős attB1 és attB2 szekvenciákat. (A Gateway-technológia fejlesztése során a szekvenciákat több helyen módosították, hogy növeljék a rekombinációs reakció hatékonyságát és specifikusságát.) A donor vektorban is megtalálhatóak ezekkel kompatibilis szekvenciák (attP1 és attP2), ha a PCR-fragmentet és a vektort ún. „clonase” (klonáz) enzim jelenlétében összekeverjük, akkor in vitro rekombináció történhet, a PCR-fragment beülhet a vektorba. (A rekombináció következtében a vektorba integrálódott inzertet attL1 és attL2 szekvenciák fogják határolni). A vektor att szekvenciái által eredetileg közrefogott rész a rekombináció során kihasad, ami lehetőséget ad a pozitív (rekombináción átesett) klónok szelektálására (11-8. ábra).



A plazmidban található valamilyen antibiotikum (például ampicillin) rezisztencia gén, amely csak a megfelelően transzformált baktériumokat engedi kinőni az antibiotikumos lemezen. A vektorban továbbá az attP1 és attP2 szekvenciák között többnyire két gén található: a ccdB gén és a kloramfenikol rezisztencia (CmR) gén. A CcdB fehérje gátolja az E. coli egyik fajta topoizomeréz enzimének (giráz) a működését, ezért azok a klónok, melyekbe a nem rekombinálódott plazmid jut, elpusztulnak. (A ccdB gént tartalmazó, eredeti donor plazmidot speciális, CcdB-rezisztens E. coli törzsben sokszorosíthatjuk fel). A pozitív klónok telepeinek replikáját kloramfenikol antibiotikum-kezelésnek is alávethetjük. A kezelés során a rezisztenciagént már nem hordozó telepek nem fognak kinőni (az esetek többségében ez minden telepre igaz lesz). Az eredeti lemezen így is visszakereshetjük a pozitív klónokat (emlékezzünk: a pBR322 esetén is hasonlóan szelektáltunk a kétféle antibiotikummal). A restrikciós emésztéssel/ligálással, TOPO-klónozással, vagy rekombinációs klónozással kapott konstrukciót ún. „entry clone”-nak hívják. A konstrukciót felsokszorozzuk, szekvenálással ellenőrizzük, majd mikrocentrifuga-csőben hozzákeverjük az expressziós, ún. „destination” plazmidot és a „clonase” enzimet. Ez szintén tartalmaz egy anibiotikum-reszisztencia gént (mást, mint az „entry” klón plazmidja), valamint egy expressziós kazettát. Ebben a kazettában található valamilyen promóter szakasz, esetleg operátor régió, valamint a két, az „entry” vektorral homológ szakasz (attR1 és attR2), amelyeken keresztül a rekombináció történik. E két szakasz között található a már előbb is említett két markergén (ccdB és (CmR), amely sikeres rekombináció esetén kiesik és szelekcióval a megfelelő klónok elkülöníthetőek (11-8. ábra). Az expressziós plazmidban a rekombináció következtében attB1 és attB2 szekvenciák fogják határolni a beültetett DNS-t (csakúgy, mint esetleg az eredeti PCR-termékben). A ccdB és a CmR gének az eredeti donor plazmidba, a keletkező attP szakaszok közé kerülnek, amely antibiotikum szelekciós nyomás hiányában eltűnik a baktériumpopulációból. Bár a legtöbb esetben a rekombináció a PCR-terméktől az „entry” konstrukción keresztül az expressziós klón felé halad, ez nem egyirányú utca, a reakciót meg is lehet fordítani. Ha például egy már meglévő expressziós konstrukció mellé szeretnénk létrehozni egy másikat, akkor az inzertet az eredetiből „visszarekombináltatjuk” egy donor plazmidba, ahonnan ismét be lehet illeszteni egy „destination” vektorba.

11.8. ábra http://tools.lifetechnologies.com/content/sfs/manuals/gateway_clonaseii_man.pdf 2013.09.30.

-

3. 11.3. Genomi könyvtárak A genomi könyvtárakat úgy hozzuk létre, hogy egy adott élőlényből kinyert genomi DNS-t valamilyen módon rövidebb szakaszokra daraboljuk. A darabolás történhet fizikai aprítással, vagy restrikciós endonukleázzal történő emésztéssel. Az így kapott DNS-darabokat restrikciós endonukleázzal elhasított, vagy már eredetileg nyílt állapotban vásárolt vektorokba ligáljuk. Az így elkészített konstrukciókat azután valamilyen organizmus (baktérium, élesztő, bakteriofág) sejtjeibe (vagy kapszidjaiba) juttatjuk. Ezeket a sejteket (vagy bakteriofágokat) szélesztjük táptalajt (vagy baktériumpázsitot) tartalmazó agarlemezen, majd valamilyen technikával (például kolónia hibridizációval) keresünk rá az általunk kívánt DNS-t tartalmazó kolóniára.



Vannak olyan kísérletek, amelyekhez felesleges a könyvtárat vektorokba illesztenünk. Ha például azt szeretnénk megtudni, hogy egy transzpozon, vagy egy adott virális eredetű DNS a genom mely részébe ült bele, akkor ezt ún. reverz PCR-technikával tudjuk kideríteni. A genomot restrikciós endonukleázzal emésztjük. A restrikciósan hasított DNS-fragmenteknek a két végét összeligáljuk, majd a vírus (vagy transzpozon) DNS-re tervezett, ún. kifelé mutató primerek segítségével végezzük el a PCR-t. A PCR-termék ilyenkor a két végén tartalmazza a vírusszekvenciákat, középen pedig a vírus-DNS-t két oldalról körülvevő genomi szakaszokat. A PCR-terméket ezután vektorba lehet ültetni, és meg lehet szekvenálni, így feltérképezhető az a genomi régió, amelybe a vírus (vagy transzpozon) beült (11-9. ábra).

11.9. ábra 2013.09.30.

-

http://www.nature.com/onc/journal/v24/n52/images/1209043f6.jpg

-

4. 11.4. cDNS könyvtárak A cDNS könyvtárakhoz mindig totál, vagy mRNS-ből kell kiindulnunk, amit az adott élőlényből (szövetből, sejtkultúrából) izolálunk. Ez a cDNS könyvtár reprezentálja majd az adott sejtek RNS-összetételét.

4.1. 11.4.1. Az első szál szintézise Az RNS izolálása és épségének (gélelektroforézisel történő) kimutatása után először egy komplementer DNS (cDNS) szálat kell szintetizálnunk. A reakcióhoz megfelelő pufferre, dNTP-kre, reverz transzkriptáz enzimre és primerekre van szükségünk. Ha csak egyfajta, ismert nukleotidszekvenciájú RNS-t akarunk átírni, akkor specifikus primerre, ha az összes mRNS-t át akarjuk átírni, akkor oligo-dT primerre (ez az mRNS-ek poli-A farkához tud hibridizálni), ha az összes RNS-t, akkor random primerekre (például random dekamerekre) van szükségünk (11-10 ábra). (A random primerek sokféle, véletlen nukleotidszekvenciájú primert jelentenek. Ezek



többé-kevésbé aspecifikusan kötődhetnek az RNS jórészt komplementer szakaszaihoz, elősegítve ezzel a DNSpolimerizációt. A random primerek gyakran nem az RNS végéhez tapadnak, ezért ez utóbbi esetben nem feltétlenül fogjuk átírni a teljes hosszúságú RNS-t.)

11.10. ábra 2013.10.02.

-

http://www.bio.davidson.edu/genomics/method/cDNA/cDNA3.gif

-

Az RNS-t és a primereket összekeverjük, majd 85 °C-ra melegítjük körülbelül 5 percig. Kivesszük az inkubátorból, és jégre tesszük, hogy azonnal kihűljön. Ekkor tapadnak be a primerek. A csőhöz jégen hozzámérjük az előre összekevert többi reagenst, majd nagyon gyors keverés és centrifuga után 42-44 °C-on zajlik a polimerizációs reakció, körülbelül 1 óra hosszat. A reakciót 10 percig tartó 70 °C-os melegítéssel állítjuk le (tönkretesszük a hőérzékeny reverz transzkriptázt). Adott mRNS-szintek real-time PCR-rel történő kimutatásához nem is kell tovább mennünk: Az egyszálú DNS ugyanúgy alkalmas a PCR-reakcióra, mint a kétszálú, csak eggyel több ciklusra van szüksége ugyanakkora fluoreszcencia generálásához. (Az RNS nem alkalmas templát a PCR-reakcióhoz). Ha azonban az átírt cDNSeket vektorokba szeretnénk ültetni, akkor meg kell szintetizálnunk a cDNS második szálát is. Ha időt akarunk spórolni, lehetőségünk van arra, hogy a reverz transzkripcióval egy időben PCR-reakcióval erősítsük ki a kívánt cDNS szekvenciát a sok közül. Ezt a módszert nevezzük RT-PCR-nek. (Nem tévesztendő össze a real-time PCR-rel. Ha az RT-PCR reakciót real-time detektálással kapcsoljuk össze, akkor azt real-time RT-PCR-nek nevezzük.) Ehhez legalább egy specifikus primerre van szükségünk, a másik lehet az aspecifikus oligo dT. A két egymást követő reakció (reverz transkripció és PCR) működhet ugyanabban a reakciópufferben, csak a két polimerizációs reakciót más-más polimeráz (reverz transzkriptáz vs. Taq polimeráz) fogja katalizálni.

4.2. 11.4.2. A második szál szintézise A cDNS második szálának szintézise több módon is történhet. A technikákban közös, hogy az RNS-szál eltávolítása után (vagy eltávolítása közben) valamilyen DNS-dependens DNS-polimerázzal szintetizáljuk meg a komplementer szálat. A legnagyobb problémát a priming okozza: A heterogén állománynak köszönhetően nincs olyan ismert szekvencia, amelyre primert tudnánk tervezni. Erre a következő technikákat dolgozták ki: 1. A DNS/RNS hibridről melegítéssel vagy lúgos kezeléssel leszedjük az RNS-szálat. Az egyszálú cDNS 3’ vége visszahajlik a szálra, ún. hajtűt képez, és primerként szolgálhat a második lánc szintéziséhez. (Az egyszálú nukleinsavak végei termodinamikai okokból hajlamosak visszahajlani, és a részlegesen komplementer szakaszok bázispárosodásával hajtű alakot felvenni. Az így kialakult szerkezetek nem stabilak; az egyszálú nukleinsav sok, hasonlóan instabil szerkezete folyamatosan alakulgat át egymásba.) A polimerizációhoz klenow fragmentet szoktunk használni, a reakció végén a hajtűkanyart S1 nukleázzal emésztjük (11-11. ábra). 2. A DNS/RNS hibridhez RN-áz H és E. coli DNS-polimeráz I keverékét adjuk. Az RN-áz H emésztés eredményeként az RNS-szál több helyen bevágódik (nickek keletkeznek), ami a DNS-polimeráz I-nek megfelelő primer a polimerizáció megkezdéséhez. 5’-3’ exonukleáz aktivitásának köszönhetően a DNS127 Created by XMLmind XSL-FO Converter.


polimeráz I leemészti az előtte lévő RNS-fragmenteket, és DNS-sel cseréli le őket. A reakció végén ligáz enzim kapcsolja össze a cDNS második szálának a darabjait (11-12. ábra). 3. A hibrid szál RNS-felének eltávolítása után terminális transzferáz és például dCTP segítségével oligo-dC farkat rakunk az első szálra, ezután oligo-dG primer segítségével szintetizáljuk meg a második szálat (1113. ábra). 4. Az előző módszer finomítása, hogy poli-A farokhoz hibridizáló oligo-dT és az oligo-dC farokhoz hibridizáló oligo-dG primerek 5’ végére még egy-egy, restrikciós endonukleáz hasítóhelyet tartalmazó szekvenciát is tervezünk. Ha ezek az extra szekvenciák elég specifikusak, még specifikus PCR-rel is fel tudjuk erősíteni a fragmenteket. A (jellemzően két különböző) restrikciós endonukleázzal történt hasítás után a cDNS az előző három módszertől eltérően közvetlenül ültethető a vektorba (11-14. ábra).

11.11. ábra - - 2013.10.02.



11.12. ábra http://dwb4.unl.edu/Chem/CHEM869N/CHEM869NLinks/www.dur.ac.uk/~dbl0www/S taff/Croy/cDNAfigs.htm - 2013.10.02.



11.13. ábra -



11.14. ábra -



Az első három módszernél elő kell készíteni a cDNS-eket a beültetésre. Először tompa végeket készítünk nekik, (erre T4 polimeráz és dNTP mix adása a leghatékonyabb, lásd 6. fejezet). Ezután specifikus metilázok és SAM segítségével metiláljuk a fragmentet, hogy a restrikciós endonukleázok ne ismerjék fel őket. Metilálás után polinukleotid kinázzal és ATP-vel kiegészítjük az esetleg hiányzó 5’ foszfátokat. Ezután restrikciós endonukleáz hasítóhelyeket tartalmazó adaptorokat ligálunk a szakaszok két végéhez. A kész fragmenteket azután restrikciós endonukleázzal hasítjuk, amik csak az adaptorokon belül tudnak vágni. Az így keletkezett ragadós végekkel tudjuk a cDNS-eket a megfelelő ragadós végeket tartalmazó, nyitott vektorba beleültetni. Természetesen minden reakciólépés után inaktiválnunk kell az enzimeket és tisztítanunk a DNS-t (például oszlopkromatográfiával), hogy a szennyeződés ne zavarja a soron következő reakciót. A negyedik módszer sokkal kényelmesebbnek tűnik, de itt számolnunk kell azzal, hogy a restrikciós endonukleázok esetleg hasítják a cDNS-szekvenciáink egy részét. Ezek a cDNS-ek teljes hosszúságukban ilyenkor nem lesznek a könyvtár részei, esetleg csak darabjaikban.

4.3. 11.4.3. RACE Ha a cDNS könyvtárból sikerült azonosítanunk azt a klónt, amelyet kerestünk, akkor az inzert DNS-t meg kell szekvenálnunk a vektorra specifikus primerek segítségével. A cDNS-készítés technikájának hiányosságai (leginkább a polimerázok nem túl magas processzivitása) miatt azonban előfordulhat, hogy a vektorban talált cDNS szakasz 3’, de még gyakrabban az 5’ vége hiányzik a teljes mRNS szekvenciájához képest. Hogy kiderítsük, mi az igazság, újra elővesszük az izolált RNS-mintát, és ún. RACE (rapid amplification of cDNA ends) technológiát használunk. Először is a szekvencia-analízis eredményét felhasználva génspecifikus primereket készíttetünk, melyek hibridizálni képesek az általunk megszekvenált cDNS-szekvencia középső részével (vagy a cDNS templátjául szolgáló RNS középső részével). Ha az 5’ vég szekvenciáját szeretnénk az RNS-nek felderíteni, akkor az első szál szintéziséhez nem oligo dT, hanem az RNS közepére specifikus primert használjuk. Mivel ez közelebb van az 5’ véghez, nagyobb az esély arra, hogy a reverz transzkriptáz végigszintetizálja az első szálat. Ezután homopolimer farkazás következik terminális transzferáz és mondjuk dATP segítségével. Oligo dT primerrel készítjük el a másik szálat. Ha a specifikus és az oligo dT primerek 5’ végeihez restrikciós endonukleáz hasítóhelyet kódoló részeket tervezünk, akkor PCR-rel felszaporítható a szakasz, majd restrikciós endonukleázzal történő emésztést követően a vektorba ültethető (10-15. ábra). Ha a 3’ vég szekvenciát keressük, akkor az oligo dT primerrel átírt cDNS első szálát használjuk templátként, és a másik specifikus primer segítségével átírjuk a cDNS 3’ végét. A PCR-t követően a primerek 5’ végén lévő extra, restrikciós emésztőhelyeket tartalmazó szakaszokat ugyanúgy használhatjuk, mint az 5’ RACE esetében (10-16. ábra).

11.15. ábra -



11.16. ábra -



Van a RACE-nak olyan specifikus változata, mely biztosítja, hogy csakis a teljesen ép RNS-eket vizsgálhassuk. Az 5’ RLM-RACE esetében a reverz transzkripció előtt az RNS-eket egy alkalikus foszfatázos emésztésnek vetjük alá. Ez leszedi a sérült 5’ végű mRNS-ekről az 5’ foszfátcsoportot, míg az ép, 7-metil-guanidin sapkát horgozó mRNS-eket nem bántja. Ezután a foszfatázt (CIP) eltüntetjük a rendszerből. Második lépésben egy dohány savas pirofoszfatázt (TAP) adunk az RNS-hez, mely leszedi a 7-metil-guanilát sapkát, és szabad foszfátot hagy az 5’ végen. Az eredetileg ép RNS-ek 5’ végéhez így képesek vagyunk egy specifikus, egyszálú adaptert kapcsolni a foszfáton keresztül, míg a foszfátot nem tartalmazó, eredetileg sérült RNS-ek nem kapják meg ezt az adaptert. Ezután történik meg a reverz transzkripció, majd az adapterhez és a középső szakaszokhoz tervezett specifikus primerek segítségével a PCR-reakció (11-17. ábra). 3’ RLM-RACE esetében az első szál átírásához szükséges primer 5’ TTTTTVN, ahol V lehet háromféle nukleotid, kivéve dTMP, az N pedig lehet mind a 4-féle nukleotid. Így összesen 12-féle primerrel végezzük az első szál szintézisét. (A primer szekvenciája biztosítja, hogy kizárólag az éretlen transzkriptum és a poli-A farok csatlakozási pontjától kezdődjön csak el a cDNS első szálának az átírása.) Természetesen a primerek 5’ végéhez speciális adapter szekvencia van tervezve. A második szál átírását itt is 5’ adaptert tartalmazó, a cDNS-re specifikus primerrel végezzük (11-18. ábra). Az adapterekre specifikus primerekkel végzett PCR-reakciók és azt követő restrikciós hasítások következtében, a cDNS 3’ illetve 5’ fragmentje vektorba ültethető. A felszaporított vektorban lévő szakaszt aztán szekvenciaanalízissel ellenőrizhetjük.

11.17. ábra -



11.18. ábra -




12. fejezet - Expressziós rendszerek A molekuláris biológiai munkák egyik fontos feladata, hogy a gének „megszólaltatásával” fehérjéket termeljenek. E fehérjéknek a működését in vivo és in vitro is tanulmányozhatjuk, de akár ipari (például gyógyászati) célra is fel lehet őket használni. Ebben a fejezetben a fehérjék előállításának legismertebb és leggyakrabban alkalmazott technikáit szeretnénk ismertetni, kiemelve a technikák felhasználhatóságát, előnyeit, hátrányait. Elsősorban a baktériumsejtben, az élesztőben, bakulovírus segítségével rovarsejtekben, valamint emlőssejt-tenyészetekben történő fehérje-túltermelési módszereket ismertetünk. Bár léteznek más expressziós rendszerek is (növényi sejtekben, nyálkagombákban, Drosophila-sejtekben stb.), de ezeket kisebb jelentőségük miatt nem tárgyaljuk. Szabadföldi növényekben is lehetséges gazdaságosan előállítani bizonyos fehérjéket, de ez igen időigényes, és többnyire komoly ipari kapacitásra van szükség a fehérjék kinyeréséhez, tisztításához. Első lépésben a megfelelő hosszúságú, a fehérjét kódoló DNS-t (többnyire cDNS-t) kell az expressziós vektorba klónozni. A fehérje termeltetéséhez igényeinknek és a lehetőségeknek megfelelően használhatunk erős vagy gyenge, konstitutív vagy indukálható promótereket. Megfelelő szignál szekvenciák N-terminálishoz történő fúziója meghatározhatja a termelt fehérje végső helyét: citoplazmába, valamilyen sejtorganellumba, vagy a sejten kívülre. A fehérje detektálása, tisztítása, vízoldhatóbbá tétele érdekében további speciális fehérjedoméneket kódoló DNS-szekvenciákat fuzionáltathatunk a cDNS-ünkhöz (lásd alább). Többnyire eukarióta (főleg emlős, emberi) eredetű fehérjéket szoktak overexpresszálni, ez az expressziós rendszer kiválasztásánál fontos szempont lehet. Bár még kevéssé elterjedt technológia, a jövőben valószínűleg egyre fontosabb szerepet fog betölteni a szintetikusan előállított génekről történő fehérjeexpresszió. A szintetikus DNS-t számítógép segítségével úgy tervezik meg, hogy a fehérjeszintézis szempontjából optimális legyen a kodonösszetétele (az azonos aminosavakat kódolók arányosan oszoljanak el az adott tRNS-mennyiségek függvényében), és a kodonok egymáshoz viszonyított helyzete (ehhez az egymás után érkező tRNS-ek kölcsönhatásait kell figyelembe venni). Az új fehérjék tervezése során akár elhagyhatóak a működésükhöz szükségtelen részek, vagy megváltoztatható az adott fehérjék specifitása, szabályozhatósága. Természetesen ehhez rengeteg tapasztalati információra van szükség az adott fehérjéről és a genetikai változtatások várható élettani eredményéről. Ezeket az információkat számítógépes adatbázisok formájában tárolják, amelyeket a tervezéshez szükséges, fejlett tervezőprogramok tudnak használni.

1. 12.1. Expressziós vektorok Milyen részekből állnak az expressziós vektorok? Az egy vagy több replikációs origón kívül mindig megtalálható benne valamilyen antibiotikum-rezisztencia gén (ampicillin, kanamicin, tetraciklin), egy olyan rész, ahová a gén cDNS-e beültethető (többnyire MCS, lásd: 10. fejezet), ez előtt pedig egy promóter-régió, a hozzá kapcsolódó régiókkal (pl. operátor-régió) kiegészítve. Gyakran találhatók még a vektorokban olyan peptidek vagy fehérjék DNS-szekvenciái, amelyek a termelődő fehérjéhez kapcsolódva annak detekcióját vagy tisztítását könnyítik meg (ezeket fúziós jelölésnek vagy fúziós „tag”-nek hívjuk). Amennyiben a fehérje Cterminálisára nem lesz extra szakasz fuzionáltatva, az MCS végére szoktak három különböző leolvasási keretben egy-egy STOP-kodon szekvenciát elhelyezni. Nézzük most az ún. fúziós „tag”-eket, hogy mi mindenre lehet őket használni. Affinitáskromatográfiával történő tisztításhoz általában háromféle „tag”-et használunk: a maltóz-kötő fehérjét (maltose-binding protein, MBP), a glutation-S-transzferázt (GST), és a hat konszekutív hisztidinből álló, ún. 6xHis-tag-et. A MBP 42,5 kDa protein, maltózhoz, vagy annak polimerjéhez, az amilózhoz képes nagyon specifikusan kötni. Az amilózt kovalensen kötik a kromatográfiás oszlop gyöngyeihez. A MBP-fúziós fehérjék vízben való oldhatósága jelentősen megnőhet (a „tag” nélküli fehérje oldhatóságához képest), ezért előszeretettel alkalmazzák bakteriális expressziós rendszerekben. A fúziós „tag” révén az oszlophoz specifikusan kötődnek a rekombináns fehérjék. Kötődés után az oszlopról az aspecifikusan kötődő szennyeződéseket lemossuk, majd az általunk termeltetett, fúziós fehérjét maltóz hozzáadásával eluálhatjuk. A tiszta fúziós fehérjét így már különböző vizsgálatoknak lehet alávetni (12-1. ábra)

12.1. ábra https://www.neb.com/~/media/Catalog/AllProducts/FF91B67397D945E0956F3483174CF7E3/Long%20Description/E8200a.jpg 2013.10.08. 137 Created by XMLmind XSL-FO Converter.

Expressziós rendszerek

A mosás általában valamilyen (akár többféle, egymást követő) pufferrel történik. Ez a folyamat az aspecifikusan az oszlophoz kötődött molekulák (pl. más fehérjék) eltávolítására szolgál. Az elúció során kompetíció révén a nagy mennyiségű szabad maltóz leszorítja a maltózkötő tag-gel rendelkező fehérjét az amilóz oszlopról. A GST-fúziós fehérjék az oszlophoz kovalensen kötött glutationhoz (GSH) kötnek specifikusan. A GST egy 26 kDa protein, a fúziós tag segítségével történő fehérjetisztítás folyamata a MBP-éhez hasonló, csak ebben az esetben szabad glutationnal történik a fúziós fehérjék elúciója (12-2. ábra).

12.2. ábra http://1.bp.blogspot.com/ch_i3COHnPs/Te_Xc48QsjI/AAAAAAAAAiM/eZN9oXY84J0/s1600/Biofreaks++GGS+LIVE+-+Protein+purification+from+E.coli+-+Elution.jpg - 2013.10.08.



A 6xHis-tag az előzőeknél jóval rövidebb peptid, kevésbé változtatja meg az termeltetett fehérje méretét. A hisztidin nikkel-ionokhoz képes koordinatív kötéssel kapcsolódni; minden nikkel-ionhoz 2 hisztidin kapcsolódhat. A nikkel-ion 6 koordinatív kötésben vehet részt; a másik négy vegyértékével a gyantára kötött nitril-triacetáthoz kapcsolódik. A fúziós fehérje a hat hisztidinnek köszönhetően specifikusan kötődik a nikkelionokat tartalmazó oszlophoz, amelyről alacsony (60 mM) koncentrációjú imidazollal történt mosás után magas (300–600 mM) koncentrációjú imidazollal eluálható.



Nemcsak a nikkel, de többféle kétértékű kation is képes a hisztidinhez kötni. Különféle rendszerekben kobalt-, ill. rézionokat is használhatnak fehérjekötésre. A specificitás és a kötődés erőssége közösen határozzák meg ezen ionok felhasználhatóságát. A nikkel-ionok még elég specifikusan, és már megfelelően erősen is kötődnek a hisztidinhez, ezért őket használják a leggyakrabban fehérjetisztítások során.

12.3. ábra 2013.10.09.

-

http://www.agr.kuleuven.ac.be/dp/logt/practicum2001/proef9b.gif

-

A tisztításhoz használt fúziós tag-ek gyakran akadályozzák a termeltetni kívánt fehérje natív szerkezetének, vagy a működésének vizsgálatát, ilyenkor azoktól érdemes megszabadulni. Ez akkor lehetséges, ha a termeltetni kívánt fehérje és a fúziós tag DNS-szekvenciája közti részen kódolva van egy olyan pepdidszekvencia, amelyet valamilyen proteáz specifikusan felismer, és elhasít (úgy képzeljük el, mint a restrikciós endonukleázokat a DNS-hasításakor). A gyantához specifikusan kötődő fehérje ilyenkor nemcsak elúcióval, hanem proteázos hasítással is mobilizálható (12-1. ábra, 12-2. ábra). A gyanta utána elucióval regenerálható, és újra használható. A specifikus proteázok közül a legjobban ismertek a véralvadási kaszkád proteázai. A legtöbb esetben trombin, vagy X faktor felismerőhelyeit alkalmazzuk, de létezik olyan rekombináns proteáz is (PreScission), amely a termeltetett fehérje C-terminálisán egyetlenegy extra aminosavat sem hagy (a proteáz a felismerő-helyének Nterminálisán hasít), ezáltal pontosan a kívánt aminosav-szekvenciájú fehérje tisztítható affinitáskromatográfiával. A rendszerben maradt proteázokat gyöngyökhöz kötött, specifikus antitestekkel kötjük meg, amelyek így centrifugálással eltávolíthatóak. Ha rekombináns úton előállított proteázunk (akár az elvágandó, tisztított fúziós fehérjével megegyező) fúziós tag-et tartalmaz, antitest helyett a tag-hez kötődő, gyöngyhöz immobilizált ligand segítségével is eltávolítható a rendszerből (12-4. ábra). Ilyenkor a fúziós fehérjénket a proteázos emésztés előtt eluáljuk az affinitásoszlopról.

12.4. ábra - http://wolfson.huji.ac.il/purification/PDF/Literature/Waugh2011.pdf 2013.10.09.



Nem csak a tisztíthatóság vagy az oldhatóság elősegítése lehet a tag-ek feladata. Megfelelő antitestek hiányában gyakran előfordulhat az, hogy a termeltetett fehérje jelenlétét, mennyiségét nem lehet detektálni. Ha a fehérjéhez ismert immunogenitású, 8-10 aminosav hosszú peptidet fuzionálunk, akkor azt a peptid ellen termeltetett, a biotechnológiai cégeknél megvásárolható antiesttel ki lehet mutatni. Ilyen immunogén tag-ek például a Myc-, a FLAG-, a HA- és a V5-tag. Az expresszáltatott fehérje sejten belüli, in vivo kimutatáshoz más módszert kell alkalmazni. Ilyenkor a fehérjéhez ismert enzimatikus, vagy fluorszcens tulajdonságokkal bíró fehérjéket kell fuzionáltatni. Ilyen enzim például a luciferáz, mely a sejtbe juttatott luciferint bontva fény kibocsátását katalizálja, ezáltal megmutatja a fehérje sejten belüli, vagy a szervezeten belüli elhelyezkedését. A másik, hasonló feladatra használt fehérje a green fluorescent protein (GFP), mely adott hullámhosszú fénnyel gerjesztve zöld fényt bocsát ki (12-5. ábra).

12.5. ábra https://lh6.googleusercontent.com/EZbr0GM7Pg0/TmudbUAhInI/AAAAAAAAB2I/sCsYcaVFr10/w500/GFP.jpg 2013.10.09.



2. 12.2. Expresszió baktériumsejtekben A baktériumokban történő fehérjetermeltetés nagy előnye, hogy olcsón, gyorsan, nagy mennyiségű fehérje termeltethető ezen az úton. Ha ezek a legfontosabb szempontjaink, mindenképp mérlegelnünk kell ezt a fehérjeexpressziós alternatívát. Hátránya lehet, hogy a fehérjék poszttranszlációs módosulásai (például glikoziláció) hiányt szenvedhetnek. Szintén gyakran előfordul, hogy a termelődött fehérje a fázisok szétválasztásakor vízben oldhatatlannak bizonyul. A termelt fehérje mennyiségének növelése érdekében fontos a megfelelő E. coli törzs kiválasztása. Fehérjeexpresszióra leggyakrabban talán a BL-21(DE3) törzset alkalmazzák, mely egyrészt bizonyos bakteriális proteázokra deficiens (kevésbé degradálódik a már megtermelt fehérje a baktériumon belül), másrészt termeli a T7-fág RNS-polimeráz enzimét (ez T7 promóterrel meghajtott gének esetében fontos). A baktériumokban használatos expressziós vektorok legtöbbször lac promótert és operátort, vagy T7 promótert (amely erősebb, mint a lac promóter) és lac operátor régiót (lásd: 10. fejezet) találunk. Ha a baktériumban található lacI gén, amelyről az operátor régióhoz kapcsolódó, gátló fehérje konstitutívan termelődik, akkor szabályozhatóvá válik a fehérjénk termelődése (12-6. ábra). A szabályozhatóság azért lehet fontos, mert a kontrollálatlan overexpresszió a baktérium szaporodásának akadályozásához (felemészti az erőforrásokat), sokszor a baktérium pusztulásához vezethet (például átjárhatóvá teszi a sejtmembránt vagy aspecifikusan kapcsolódva más struktúrákhoz, akadályozza az anyagcserét). A megtermeltetett fehérjét többnyire a baktériumszuszpenzió feldolgozásával nyerjük ki.

12.6. ábra - http://www.origene.com.cn/assets/Images/TrueORF/pEX-N-GST.jpg 2013.10.09.



A baktériumokat középső log fázisig (OD600~0,5-0,6) szoktuk szaporítani (ezt éjszakára leoltott és felnőtt baktériumkultúra reggeli kihígításával, és a szaporodás folyamatos monitorozásával lehet nyomon követni), ezután következik az IPTG-vel történő indukció. Az indukció többnyire 2–6 óra hosszat tart (néha tovább), ezalatt termelődnek meg az általunk használni kívánt fehérjék. Ha túl sokáig tart az indukció, akkor a termelődött fehérjék egyrészt részlegesen lebomolhatnak, másrészt óriási mennyiségük miatt egyszerűen elpusztítják a baktériumsejteket. Ezért hosszabb indukciós idő alatt néha alacsonyabb hőmérsékletet (30 °C) használunk, hogy a fehérjék degradációját megakadályozzuk (a proteázok kevésbé működnek). Az indukció végén a sejtszuszpenziót lehűtik, és a továbbiakban alacsony hőmérsékleten (jégen) dolgozunk. A sejteket centrifugával történt ülepítés után foszfát-pufferben (PBS) szuszpendáljuk, majd proteáz-inhibitorok és detergensek hozzádása után feltárjuk (többnyire ultrahangos „szonikálással”). Nukleázok alkalmazása opcionális. Alternatívaként a feltáró pufferbe sejtfal-emésztő enzimeket (lizozim) teszünk, majd a sejtfaluktól megszabadított sejteket nyíróerő alkalmazásával (vortex, fecskendő) durrantjuk szét. A baktériumsejtek feltárása és a sejttörmelék eltávolítása (ülepítés centrifuga segítségével) után a felülúszóhoz adjuk a speciális ligandot (amilóz, GSH, nikkel) tartalmazó gyantát. Hidegben történő inkubációt (körülbelül 1 óra) követően a gyantát pufferrel többször mossuk, majd megtörténhet a fúziós fehérje elúciója, vagy lehasítása. Ha a fehérje (akár a megfelelő proszttranszlációs módosítások hiánya miatt) hidrofób részeket tartalmaz, akkor előfordulhat, hogy a centrifugálást követően nem a felülúszóban, hanem a sejttörmelékben (zárványtest, „inclusion body”) marad. Ilyenkor megkísérelhetjük a szolubilizálását többféle módon, akár a különböző módszerek kombinációjával: kaotróp anyagokkal (5–8 M guanidin-HCl vagy 6–8 M UREA), erős detergensekkel (SDS), a pH növelésével vagy csökkentésével, szerves oldószerek használatával (például acetonitril/propanol keverékkel), vagy mechanikusan (szonikálással, vagy hirtelen nagy nyomáscsökkenést produkálni képes, ún. „French press”-szel). Természetesen a fehérjét szolubilizálás után natív körülményekhez közeli állapotba kell hozni (renaturálni kell). Többnyire lassú, néha többlépéses dialízissel cserélik le a szolubilizáló puffert, ilyenkor az erős detergenseket is gyengébbekre cserélik a dialízis során. Dialízis helyett gélszűréssel, vagy az oldószer koncentrálási lépésekkel egybekötött folyamatos lecserélésével is lehet próbálkozni, a lényeg, hogy a fehérjék az oldatban maradjanak, ne csapódjanak ki. Az egyik legsikeresebb renaturációs eljárás, ha az affinitásoszlophoz kötődő fehérjén cseréljük le a szolubilizáló puffert. Legegyszerűbben ezt a 6xHis-taggel rendelkező fehérjéknél alkalmazhatjuk, hiszen a hisztidin-oldalláncok nikkelhez kötődését az oldatban lévő kaotróp anyagok nem akadályozzák. A fehérjék kicsapódását akadályozhatja aminosavak, polietilén-glikol, szacharóz, foszfolipidek, fémionok, DTT, valamint oxidált/redukált glutation megfelelő koncentrációban történő alkalmazása. A fehérjék megfelelő



minőségben/mennyiségben történő kinyerése zárványtestből empirikus kísérletezés eredménye, szinte nem is használható ugyanaz a recept két különböző fehérje esetében. A fehérjeexpresszióra kiválóan alkalmas BL-21(DE3) E. coli törzs szekréciós aktivitása igen kicsi, ezért az expresszálódott fehérjék döntő többségben a sejtplazmában maradnak. Az utóbbi időkben azonban egyre több olyan konstrukciót állítottak össze, amelyekben a fúziós fehérje- vagy peptidrész a periplazmás térbe, vagy a tápoldatba orientálja a termeltetett fehérjét. Ez megkönnyíti a fehérjék tisztítását, a periplazmás tér oxidatívabb közege pedig az interamolekuláris diszulfid-hidak kialakulása révén elősegítheti a termeltetett fehérje oxidatív feltekeredését.

3. 12.3. Fehérjetermelés élesztőben Az élesztőben történő fehérjetermeltetés előnyei közé tartozik, hogy bár kevésbé gyors, mint a baktériumban történő expresszió, mégis viszonylag olcsó, és nagy mennyiségű fehérjét produkál (a termelt fehérje mennyisége akár meg is haladhatja a baktériumok produkcióját). Baktériumokhoz képest előny, hogy az expresszió akár oxigén hiányában is működhet, a termeltetett fehérje megjelenési helye szabályozható (sejtorganellumokba, tápfolyadékba), és az élesztő jól karakterizált poszttranszlációs módosításaival az emlősfehérje natív szerkezetéhez jobban hasonlító fehérjét termelhet. Hátrányai: 1. Lassabb szaporodási rátája miatt jóval nehezebb és időigényesebb megtalálni a log-fázis optimális időpontját az indukcióhoz, 2. Az élesztő expressziós rendszerek elkészítése, beállítása és működtetése jóval bonyolultabb a bakteriális rendszereknél, 3. Emlősfehérjékhez képest a glikán oldalláncok sokkal kiterjedtebbek, az élesztők „hiperglikozilálják” fehérjéiket az emlősökéhez képest, ráadásul a glikánok építőkövei is részben mások, mint az emlősfehérjék esetében. Az élesztők között vannak olyan fajok, amelyek alkalmasabbak fehérjék overexpressziójára, mint a közönséges sörélesztő. A Pichia fajok (például Pichia pastoris, Pichia methanolica) tartalmaznak egy olyan enzimet (alkohol-oxidáz, AOX), amelynek segítségével viszonylag magas koncentrációjú metanolt tartalmazó tápoldatban is életben tudnak maradni. Az alkohol-oxidáz termelődését ráadásul a metanol indukálja (hasonlóan, mint baktériumsejtekben az IPTG a lac operon esetében), lehetőséget adva arra, hogy az AOX promóter-régiót indukált fehérjetermeltetésre használják. A fehérje-overexpresszióhoz használt Pichia törzsek proteáz-deficiensek (hogy a megtermeltetett fehérje nehezebben degradálódjon), és többnyire jó néhány aminosavra, nukleotidra auxotrófok (az auxotrófia megszűnésével tudjuk a pozitív klónokat szelektálni). Kevés saját fehérjét szekretálnak, így szekretálódó fehérjék termeltetését követően szinte csak a mi rekombináns proteinünket találjuk a tápoldatban, megkönnyítve ezzel tisztítását. A Pichia törzsekben főleg N-glikánok keletkeznek, nincs hiperglikoziláció. 1,3-kötésű glikánok nem keletkeznek, ezért a Pichiákban termeltetett fehérjék kevésbé immunogének (gyógyászati célra alkalmasak). A Pichiában termeltetett fehérje cDNS-ét erre a célra készített expressziós plazmidba kell ültetni. A plazmidban található replikációs origó és antibiotikum-rezisztencia gén, hiszen a konstrukciót baktériumban szokták felszaporítani. Az élesztőben történő szelekcióhoz található benne valamely, aminosav- vagy nukleotidanyagcseréhez szükséges enzim génje (akár több is). (Ha nem auxotróf törzzsel dolgozunk, szelekcióra használhatóak például a zeocin és blasticidin antibiotikumok is.) A klónozó-kazetta (legtöbbször restrikciós endonukleázok hasítóhelyeit tartalmazó MCS) előtt található az AOX1 promóter, mely glükóz jelenlétében nem működik, viszont glükóz hiányában és metanol jelenlétében igen. Ha fehérjénket a tápfolyadékba akarjuk termeltetni, akkor cDNS-ét olyan vektorba kell illesztenünk, amely a MCS előtt tartalmazza a sörélesztő α(mating)faktor DNS-szekvenciáját (12-7. ábra). A termelődött fúziós fehérje a szignál peptid jelenléte miatt szekretálódni fog.

12.7. ábra - http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/V19520 - 2013.10.09.



A genetikai manipuláció eredményeképp létrejött, a transzgént hordozó konstrukciót baktériumban történő felszaporítást követően tisztítjuk, majd többnyire restrikciós endonukleáz segítségével linearizáljuk. Erre azért van szükség, mert a nyílt DNS (a szakadás helyén) könnyebben rekombinálódik a genommal, mint a cirkuláris. (Plazmid formájában a bejuttatott DNS eukariótákban többnyire nem tud szaporodni, integrálódnia kell a genomba.) A transzformációt érdemes sejtfal nélküli szferoplasztokon vagy elektroporáció segítségével végezni, a Pichia törzsek ugyanis kevéssé transz formálhatóak a sörélesztő esetén gyakran használt kémiai módszerekkel (PEG, LiCl). A megfelelő mennyiségben és hatásfokkal transzformálódott konstrukció akár több példányban is integrálódhat a genomba, a homológ szakaszok (pl. AOX1, HIS4) közti rekombináció eredményeképpen. A több transzgént hordozó genom nagyobb mennyiségű idegen fehérjét is fog termelni; egyre növekvő szelekciós nyomás alkalmazása, Southern blot, dot blot, real-time PCR vagy az expresszió monitorozása segít kideríteni, hogy a szelekciót túlélt klónok közül melyek tartalmazzák a legtöbb beültetett kópiaszámot, melyek a legalkalmasabbak fehérjetermeltetésre. A Pichia törzsek glükózos táptalajon gyorsan szaporodnak. Az indukció előtti nap éjszakára a glükózos táptalajt glicerinesre kell cserélni, hogy a glükóz jelenléte ne akadályozza az AOX promóter működését. Másnap 0,5% metanolt tartalmazó tápoldatba tesszük a sejteket, amely az AOX1 promóteren keresztül indukálja a transzgén expresszióját. Ilyenkor nagyon fontos a megfelelő levegőztetés: a sejtkultúra térfogata maximum 10–30%-a legyen a flaska térfogatának, és a flaska tetején a kupak ne legyen túl szoros. Az indukció akár több napig is eltarthat. Minden 24. órában mintát kell venni az expresszió monitorozásához, és a metanol fogyása miatt a sejteket újra kell indukálni. A megfelelő időpontban azután megtörténik a sejtek feltárása enzimesen (pl. zymolyase vagy lyticase enzimek segítségével), vagy mechanikusan (French press, üveggyöngyökkel történő rázatás, fagyasztás/olvasztás ciklusok használatával). Centrifugálás után a felülúszót ugyanúgy kezeljük, mint ahogy azt a baktériumok esetében láttuk (affinitásoszlopon kötik ki a specifikus fehérjéket). Ha az élesztő a médiumba szekretálta a fehérjét, akkor a médiumból centrifugálással eltávolítjuk a sejteket, a maradék törmeléket kiszűrjük, majd a médiumot átengedjük az affinitásoszlopon. Az oszlop mosása, a fehérje elúciója/emésztése a már megismert módokon zajlik. 145 Created by XMLmind XSL-FO Converter.


4. 12.4. Fehérjeexpresszió bakulovírus segítségével A rovarsejtben történő fehérjetermeltetés legismertebb fajtája a bakulovírus segítségével működő expressziós rendszer. A bakulovírus az Autographa californica lepke ún. nukleáris polihedrózis vírusa. Az expresszió a Spodoptera frugiperda molylepke lárvájának petefészkéből nyert, immortális sejtvonalaiban történik (Sf9 vagy Sf21 sejtvonalak). Ezek a sejtvonalak letapadó és szuszpenziós kultúrában is képesek tenyészni. A sejtek speciális körülmények között, 27-28 °C-os termosztátban, szérummentes (vagy alacsony szérumkoncentrációjú) „Grace’sinsectcellculture médiumban”, pH: 6,1–6,4 közötti kémhatáson tenyésznek. A vírus módosított, de még életképes virionokat gyártani képes genomjába (bacmid) egy nem esszenciális fehérje génjének a helyére illesztik az expresszáltatni kívánt fehérje cDNS-ét, amelyről a vírus életciklusa során a rovarsejtben átíródik a fehérje. Mivel a vírusok replikálják magukat, a rovarsejt pusztulásával igen sok fertőzőképes vírushoz juthatunk. A technika alkalmazása során nem az első, hanem az összegyűjtött vírusokkal végzett második vagy harmadik fertőzési ciklus során termelődött fehérjéket tisztítják a sejtekből. A bakulovírus segítségével történő expresszió előnye, hogy viszonylag olcsón, viszonylag gyorsan, nagyon nagy mennyiségű fehérjét termeltetünk. (Azért ipari méretű fehérjetermelésre nem használható, ellentétben pl. az élesztővel.) Ráadásul a rovarsejtek poszttranszlációs mechanizmusai nagyon hasonlóak az emlősökéhez; még a fehérjék glikánjainak mintázata is jobban hasonlít az emlősökére, mint az élesztőben termeltetett fehérjéké. Mivel a vírus genomja igen nagy, még genomi DNS-eket is képes magába fogadni, a splicing mechanizmusa a rovarsejtben lezajlik. A transzgén klónozása a bacmidba rekombináción alapul. A kifejezni kívánt gént valamely, korábban már ismertetett klónozási módon egy speciális plazmidba illesztjük, amelyben az expressziós kazetta két végén a vírusvektorral homológ, transzpozícióra alkalmas szekvenciák (Tn7R, Tn7L) találhatóak. A gén előtt található az ún. polihedrin gén promótere (12-8. ábra). A promóter akkor aktív, amikor a vírus kapszidjához szükséges fehérjék szintézise folyik. (A polihedrin a bakulovírus kapszidjának több mint 50%-át kitevő fehérje.) A vírusvektor (bacmid) egy kör alakú óriásplazmid, amely tartalmaz antibiotikum-rezisztencia gént és az előbb említett homológ szekvenciákat. A homológ szekvenciák a LacZα peptidjének a génjébe lettek integrálva úgy, hogy a génről termelődő fehérje megtartotta a működését. A bacmidot, a kifejezni kívánt gént tartalmazó donor plazmidot, és egy ún. helper plazmidot ugyanabba a baktériumsejtbe kell juttatni. Mivel mindhárom plazmidon van antibiotikum-rezisztencia gén (három különböző), három antibiotikumra együttesen kell szelektálni a klónokat. A helper plazmidról expresszálódik a transzpozáz enzim, mely az inzert bacmidba kerülését katalizálja. A sikeres transzpozíció kék-fehér szelekcióval detektálható. A már csak a bacmid megmaradásához szükséges antibiotikumon tenyésztve a pozitív klónt, a másik két plazmid szelekciós nyomás hiányában eltűnik; a baktériumból plazmidot izolálva tisztán megkaphatjuk a transzgént tartalmazó bacmidot.

12.8. ábra 2013.10.09.

-

https://tools.lifetechnologies.com/content/sfs/gallery/high/575.jpg


-


A bacmidot ezek után rovarsejtekbe (Sf9 vagy Sf21) transzfektáljuk. A bejuttatott DNS megfertőzi a sejteket; a bacmidok replikálódnak, majd vírus kapszidfehérjéket termelnek. Mivel a transzgén is kapszidfehérje promótere mögé van ültetve, a kapszidfehérjékkel egyszerre termelődik az általunk kívánt fehérje is. A bacmid a kapszidba pakolódik, és mint fertőzőképes vírus hagyja el a lizálódó sejtet. A fertőzéstől a sejt pusztulásáig tartó ciklus néhány nap alatt lezajlik. A kiszabaduló vírusokat összegyűjtjük, koncentrációjukat (titerüket) meghatározzuk, majd újabb rovarsejteket fertőzünk velük. A fertőzéskor viszonylag nagy víruskoncentrációt használunk. A második (és még inkább a harmadik) fertőzési ciklus végén termelődő fehérjéket a pusztulófélben lévő sejtek detergenssel történő lízisével nyerhetjük ki (12-9. ábra). A megtermeltetett fehérjék hasonló módon tisztíthatóak, mint ahogy azt láttuk a bakteriális fehérjeexpresszió esetében.

12.9. ábra 2013.10.09.

-

http://tools.lifetechnologies.com/content/sfs/manuals/bevtest.pdf


-


5. 12.5. Expresszió emlőssejt-tenyészetekben Mivel in vitro szerkezeti vizsgálatokhoz, vagy ipari (gyógyászati) célra nagy mennyiségű fehérjére van szükség, ezekre a célokra korábban emlőssejt-tenyészeteket nem használtak, azok alacsony kitermelési rátájuk miatt. Az utóbbi időben azonban egyre újabb sejtvonalak és tenyésztési feltételek kidolgozásával lehetővé vált emlős sejtkultúrákat használni nagyobb mennyiségű fehérje termeltetésére is. Emlőssejteket expresszióra használni akkor van értelme, ha a poszttranszlációs módosulások annyira fontosak, hogy már egy kicsiny különbség az eredeti fehérjéhez képest (pl. a fehérjéhez kötődő glikánok szerkezetében) is jelentős működésbeli különbséget okoz. A tudományos kutatás során emlős sejtvonalakban leginkább akkor expresszáltatunk fehérjéket, ha azoknak a sejten belüli szerepét szeretnék tanulmányozni in vivo. A fehérjék sejten belüli elhelyezkedését a vizsgálni kívánt fehérje génjéhez fuzionáltatott riportergének (luciferáz, GFP) segítségével tudjuk vizsgálni. Az emlős expressziós vektorokban megtalálhatóak mind a bakteriális, mind az emlős rendszerekben történő szelekciót lehetővé tévő antibiotikum-rezisztencia gének. A fehérjék termeltetéséhez többnyire erős (általában virális) promótereket használnak, gyakran enhancer régiókkal kiegészítve (12-10. ábra). A vektorok tartalmazhatják a bakteriális fehérjeexpressziónál már ismertetett fúziós peptidek DNS-szekvenciáit, némely vektorban megtalálható a fehérjét különböző sejtalkotókba irányító szignálpeptidek szekvenciája is. A gerincesek fehérjéihez információt szolgáltató DNS-szakasz az ATG start-kodon környékén általában speciális, konzervatív, ún. Kozak-szekvenciát tartalmaz, amely ugyan csak néhány konzervált nukleotid, 148 Created by XMLmind XSL-FO Converter.


nélkülük a transzláció többnyire nem, vagy csak kisebb hatásfokkal indul el. Más eukariótákban is találhatók Kozak konszenzus-szekvenciák, amelyek azonban különbözhetnek a gerincesekétől. Eukarióta sejtekben a legtöbb plazmid nem képes szaporodni, csak ha a gazdasejt genomjába integrálódik. Transzfektált emlőssejtek esetén megkülönböztethetünk tranziens transzfektánsokat (ilyenkor a vektor nem integrálódott a genomba, az expresszió néhány napig, legfeljebb egy-két hétig vizsgálható) és permanens transzfektánsokat (ilyenkor a vektor a transzgénnel a genomba integrálódott). Az integrációt elő tudják segíteni egy helper plazmid transzfektálásával, mely egy integráz enzim génjét tartalmazza. Az integráció többnyire homológ rekombinációval zajlódik le; ha a transzgént tartalmazó vektor egy szakasza homológ az emlőssejt genomjának egy szakaszával, akkor akár az egész plazmid beleintegrálódhat a genomba. Az integráció sikerét szelekcióval tudjuk ellenőrizni: csak azok a sejtek lesznek hosszú távon antibiotikum-rezisztensek, amelyek genomjában a vektorban lévő antibiotikum-rezisztencia gén is megtalálható. A túlélő klónok az osztódásaik során keletkezett utódsejtekkel együtt piciny kolóniákat alkotnak a petricsésze alján. Ezeket a kolóniákat úgynevezett klónozó-hengerek segítségével fizikailag izoláljuk a többi kolóniától, leemésztjük a petricsésze aljáról, és új flaskában sejttenyészetet indítunk az azonos genotípusú sejtekből. Ez gyakorlatilag egy új sejtvonalnak tekinthető. Emlőssejtekben történő fehérjetermeltetés esetén is követelmény lehet az indukálhatóság. Használhatjuk a baktériumokban már megismert sémát: vegyünk egy erős virális promótert (pl. citomegalovírus promóter, CMV-promóter), és illesszünk utána valamilyen operátor-régiót (például lac operon operátor-régióját). Ekkor egy második, gátló fehérjét (LacI) konstitutívan expresszáló plazmid jelenléte esetén az emlőssejtben nem termelődik az általunk kifejezni kívánt fehérje. Ha azonban a gátló fehérjét leszedjük az operátorrégióról (pl. IPTG-vel), az átírás megindul. Többféle hasonló, vagy kicsit más elven működő konstrukciót fejlesztettek ki emlőssejtekben történő fehérjetermeltetés szabályozására.

12.10. ábra 2013.10.09.

-

http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/K482001


-


6. 12.6. Expresszió állatokban Állatokban történő fehérjetermeltetésre akkor van szükség, ha nagy mennyiségű fehérjére van szükségünk (például a gyógyszeripar számára), és azon fontos a tökéletes poszttranszlációs módosulások jelenléte. A transzgenikus állatok előállítása igen bonyolult és lassú folyamat, erről részletesebben majd a következő fejezetben (13. fejezet) lesz szó. A fehérje termeltetését úgy kell megoldanunk, hogy az ne okozzon kárt az állat fejlődése során, és a termelt fehérje lehetőleg az állat elpusztítása nélkül kinyerhető legyen. Ez emlősállatokban viszonylag egyszerűen megoldható: tejbe szekretálódó fehérjéket kell előállítani. Ezt úgy lehet megvalósítani, hogy a kívánt fehérje cDNS-ének szekvenciájához szekréciós szignált illesztünk, és a célfehérje termelődését az α-laktalbumin vagy β-kazein génjének promótere szabályozza. (Az α-laktalbumin és a β-kazein kizárólag terhesség alatt, az emlő mirigysejtjeiben termelődő fehérjék.) Ezen a módon készül például a gyógyászatban a pancreatitis kezelésére használt fehérje, az α1-proteáz inhibitor. A tejből literenként akár 20 gramm α1-proteáz inhibitor is kinyerhető.

7. 12.7. Sejtmentes fehérjeexpresszió Ha nincs időnk expressziós rendszerek beállítására, és csak kis mennyiségű fehérjére van szükségünk, sejtmentes, in vitro fehérjetermeltetéssel is próbálkozhatunk. Ilyenkor a transzkripció és a transzláció is gyakran ugyanabban a tesztcsőben zajlik. A gyorsaság mellett a technika másik nagy előnye, hogy a fehérjétkönnyebb a reakció után tisztítani. 150 Created by XMLmind XSL-FO Converter.


Miket kell a reakciócsőbe tenni? Kétféle templátot használhatunk: mRNS-t (12-11. ábra), vagy cDNS-t. Az mRNS-t vagy tisztítottuk valamilyen sejtből, vagy in vitro transzkripcióval átírtuk valamely specifikus cDNSről. Az RNS átírásához szükségünk van valamilyen fehérjeszintetizáló apparátusra. Nagyon időigényes és drága lenne a szintézis összes alkotóelemét (tRNS, riboszóma, aminosavak, energia, enzimek, ionok, puffer stb.) egyesével mérni a reakciócsőbe, ezért ezt úgy oldjuk meg, hogy valamilyen sejt (leggyakrabban búzacsíra vagy nyúl retikulocita) teljes (detergens-mentes) lizátumát használjuk a reakcióhoz. A keveréket ki kell egészíteni megfelelő ionokkal (K+, Mg2+), aminosavakkal, ATP-vel, kreatin-foszfáttal és kreatin-kinázzal.

12.11. ábra - http://www.lifetechnologies.com - 2013.10.04.

A nyúlból származó retikulociták in vivo elsősorban hemoglobint szintetizálnak (ez köti le fehérjeszintetizáló kapacitásuk 90%-át), igen nagy mennyiségben. (A retikulociták sejtmagjukat már elveszített, éretlen vörösvértestek. Nagy mennyiségű globin mRNS és fehérjeszintetizáló apparátus található bennük). A sejtlizátumot először Ca2+-dependens mikrokokkusz nukleázzal kezelik, amely degradálja az mRNS-eket. A Ca2+-ionok EGTA-val történő megkötésével inaktiválják a nukleázt, és ezt a lizátumot használják a transzlációhoz. Nyúl retikulocita lizátum helyett igen népszerű alternatíva a búzacsíra lizátum használata. Nagy fehérjeszintetizáló apparátusa mellett viszonylag kevés saját mRNS-e van, az alacsony háttér miatt az exogén mRNS-ről termelődött fehérjéket könnyen lehet tisztítani. Búzacsíra lizátumot érdemes használni, ha a mintánk kontaminálva van rövid RNS fragmentumokkal, kétszálú RNS-ekkel, vagy oxidált tiolokkal, amelyek gátolnák a retikulocita lizátum megfelelő működését. Gyakori problémát jelenthet, hogy az in vitro transzkripcióval előállított mRNS-ek nem viselnek 5’-sapkát, ami a transzlációjuk hatékonyságát jelentősen csökkentheti. Ezt a problémát kétféleképpen szoktuk orvosolni:



1. A transzkriptumot GTP-vel, S-adenozil-metioninnal és Vaccinia vírus „capping” enzimmel inkubálják. 2. Olyan vektorban történik a transzláció, amelyről a szintetizálódott mRNS 5’ végére egy rövid, ECMV vírus eredetű IRES (internal ribosome entry site) szekvencia kerül. Az IRES szekvencia jellegzetes másodlagos szerkezetet vesz fel, mely elősegíti a riboszóma betapadását az mRNS-re. Ha cDNS-t használunk, azt többnyire vektorba ültetve adjuk a reakcióelegyhez. Többnyire a korábban már ismertetett, in vitro transzkripcióra kifejlesztett T7, T3, vagy SP6 bakteriofágok promóter-szekvenciáját is tartalmazó vektorokat használják (12-12.ábra). A transzlációnak kétfajta módja van: vagy a transzkripciós reakció után, a reakciótermékből kiindulva indítjuk a transzlációs reakciót (ez tulajdonképpen az előbb említett, RNS-templáttal működő transzlációt jelent, 12-13. ábra), vagy egy reakciócsőben, párhuzamosan történik a transzkripció és a transzláció (12-14. ábra). Ez utóbbi esetben többnyire E. coli baktériumsejt lizátumát használjuk, a megfelelő kiegészítőkkel (E. coli esetében kreatin-foszfát és kreatin-kináz helyett foszfoenolpiruvátot és piruvát-kináz enzimet használunk).

12.12. ábra - http://www.piercenet.com/guide/getting-started-vitro-protein-expression 2013.10.04.




Az E. coli sejtlizátum nagyon gazdag endogén mRNS-ekben is, ezért a sejtlizátumot preparációja során hosszabb ideig inkubálják, hogy ez az mRNS-háttér, és a róluk készült, rövid fél-életidejű fehérjék többsége degradálódjon. A gyors RNS-degradációs potenciál miatt ezt a rendszert szinte csak egyidejűleg történő in vitro transzkripcióra és transzlációra használjuk. (Néhány virális mRNS nagyobb rezisztenciát mutat az E. coli nukleázaival szemben, ezek átírásához használhatjuk a bakteriális sejtlizátumot.) Mivel az E. coli transzlációs apparátusa viszonylag egyszerű és kevésbé kontrollált, mint az eukarióta rendszerek, fehérjeszintetizáló képessége jóval hatékonyabb, ami lehetővé teszi nagyobb mennyiségű exogén fehérje termelődését.





13. fejezet - Mutagenezis, géncsendesítés Adott fehérjék in vivo szerepét a leginkább úgy vizsgálhatjuk, ha az illető fehérjét megváltoztatjuk, vagy egyszerűen eltüntetjük a sejtekből. A molekuláris biológiai módszerek alkalmazása lehetőséget ad nekünk erre. A legismertebb módszereket szeretnénk ebben a fejezetben összefoglalni.

1. 13.1. Mutagenezis Mutagenezis alatt valamilyen permanens genetikai változás generálását értjük. Már a genetika hőskorában felismerték, hogy a radioaktív sugárzás vagy bizonyos vegyületek random mutációkat generálhatnak az élőlények genomjában. Az így létrehozott, még életképes élőlények vizsgálatával a genetika tudománya jelentős haladást tudott elérni. Ma már inkább nem a random, hanem az irányított mutációk hatására létrejövő változások vizsgálatán van a hangsúly.

1.1. 13.1.1. Irányított pontmutációk generálása Ilyenkor egyetlen nukleotidot cserélnek ki egy tetszőleges másik nukleotidra. A módszer elve nagyon egyszerű, és mindig ugyanaz: az egyszálú DNS-re egy olyan primert hibridizáltatnak, amelynek a közepén ott van a mutáns nukleotid. Polimerázzal megszintetizálják a DNS másik szálát; a képződő dupla szálú DNS egyik szála mutáns, a másik szála „vad” típusú lesz. A következő replikációs lépés után az egyik dupla szálú DNS mindkét szála mutáns, a másik dupla szálú DNS mindkét szála „vad” típusú lesz (13-1. ábra). Hogy a mutáns DNS-ek arányát megnöveljék a vad típusúakhoz képest, többféle módszert is kidolgoztak.

13.1. ábra - http://www.tutorgigpedia.com/ed/PCR_mutagenesis - 2013.10.10.

1.1.1. 13.1.1.1. A Kunkel-módszer A mutagenizálni kívánt DNS-szakaszt M13 bakteriofágba illesztjük, mellyel dUTP-áz és uracil-N-glikozilázdeficiens E. colit fertőzünk. A DNS-hibajavító mechanizmusra deficiens baktériumokban a replikáció során olyan egyszálú M13 fágok keletkeznek, melyek DNS-ében a timin bázisok helyett néha uracil található. A fágok egyszálú DNS-ére tervezett, pontmutációt hordozó primer segítségével in vitro megszintetizáljuk a másik szálat. Ha ezt a dupla szálú DNS-t olyan E. coli sejtbe transzformáljuk, amelynek a DNS-hibajavító mechanizmusa ép,


Mutagenezis, géncsendesítés

akkor a dezoxi-uridinek kivágódnak a „vad” típusú láncból, a lánc darabokra szakad, és a keletkező új M13 fágok már csak a mutáns szálat fogják tartalmazni (13-2. ábra).

13.2. ábra - http://www.mikeblaber.org/oldwine/bch5425/lect33/kunkel.gif - 2013.10.10.

1.1.2. 13.1.1.2. A metiláción alapuló módszer Ebben az esetben a mutáltatni kívánt DNS-szakaszt hordozó plazmidot olyan baktérium-törzsben kell szaporítani, amelyben a Dam metiláz (DNA adenin methylase) enzim génje nincs kiütve. A baktériumból izolált, metilált plazmidhoz két mutáns primer és lineáris PCR-reakció segítségével megszintetizáljuk a komplementer szálakat, amelyek, mivel a csőben nem voltak sem metilázok, sem SAM (amelytől a metilcsoport származik), nem tartalmaznak metilációt. A PCR-reakció végén a kész egyszálú plazmidok hibridizálnak egymással. Többségben lesznek azok, amelyek egyik szálukon sem tartalmaznak metilációt. Ha DpnI restrikciós endonukleázt adunk a rendszerhez, az felismeri és emészti a Dam metiláz által metilált DNSszekvenciákat. Azokban a kétszálú plazmidokban, amelyekben egyik szálon sincs metiláció, nem történik emésztés. Mivel utóbbiak tartalmazzák a mindkét szálon mutáns nukleotidot, és ezek a zárt (mindkét szálon 1-1 nicket tartalmazó) plazmidok tudnak csak megfelelő hatásfokkal transzformálódni, a szelektív táptalajon kinövő baktériumkolóniák szinte mindegyike ezt a mutáns plazmidot fogja tartalmazni (13-3. ára).

13.3. ábra - http://www.lesbellesregions.fr/rhonealpes/media/2012/09/site-directedmutagenesis.jpg - 2013.10.10.



1.1.3. 13.1.1.3. Restrikciós hasításon alapuló módszer A módszer során nem egy, hanem két mutáció együttes bevitelére van szükség. Az inzertet tartalmazó plazmid két szálát hővel elválasztjuk egymástól, majd kétféle primert keverünk hozzá: az egyik primer homológ az inzert egy részével és tartalmazza a mutáns nukleotidot, a másik primer a plazmid egy olyan szakaszára homológ, amelyen a plazmidot csak egy helyen hasítani képes restrikciós enzim hasítóhelye van. Ennek a primernek az enzim felismerőhelyét elrontó pontmutáció van a közepén. Amikor a hőmérséklet gyors csökkentésével a plazmidhoz hibridizáltatjuk a primereket, nagy az esélye annak, hogy adott templátra vagy mindkét primer hibridizálódik, vagy a templát komplementer szála kapcsolódik vissza, és akkor egyik primer sem képes erre. Azokra a templátokra, ahova a primerek tapadtak, a primerek, dNTP-k és polimeráz (klenow fragment) segítségével megszintetizálják a komplementer szálakat. A dupla szálú plazmidokat ezután az említett restrikciós endonukleázzal kezelik, majd baktériumokba transzformálják. Amely plazmidokban a restrikciós hely elmutálódott (és nagy eséllyel a másik primer által bevitt mutáció is jelen van az egyik szálon) nem történik emésztés, a cirkuláris plazmid könnyen transzformálódik. Az emésztett nyílt plazmidok transzformációs hajlandósága több nagyságrenddel kisebb. A plazmidokat tartalmazó klónokat antibiotikummal szelektálják. A plazmidok a replikáció során létrehoznak vad és két helyen pontmutációt tartalmazó utódplazmidokat. A baktériumkultúrából történt plazmidizolálás után újabb restrikciós emésztésnek vetjük alá a konstrukciókat: csak a mutáns plazmidok maradnak cirkularizálva, a vad típusúak linearizálódnak. Újra transzformálva a baktériumokat azok most már csak a mindkét szálon mutációt tartalmazó konstrukciókat fogják tartalmazni (13-4. ábra).

13.4. ábra -



1.1.4. 13.1.1.4. A megaprimer-módszer Pontmutáció generálásához nagyon kézenfekvő és jó eszköz a PCR használata: a megaprimer-módszert akkor lehet használni, ha a pontmutációt nem a hosszú DNS-szakasz közepére, hanem valamelyik széléhez közelebb szeretnénk generálni. A feladat két, egymást követő PCR-reakcióval oldható meg. Előbb egy rövidebb szakaszt szaporítunk fel, az egyik primert a szakasz mutációhoz közelebbi végére, a másik, mutáns primert pedig a jövendő mutációt tartalmazó rész környékére. Az első PCR eredménye egy olyan szakasz, amely az egyik végéhez közel tartalmazza a kívánt mutációt. Ennek a terméknek az egyik szála használható primernek a második PCR-reakcióban (ez a megaprimer), míg a másik primert az eredeti templát másik végére kell tervezni (13-5. ábra). (Nagyon gyakran aszimmetrikus PCR-t alkalmaznak, hogy az egyik szál sokkal nagyobb mennyiségben szaporodjon fel.) Ha az első két primer olvadási hőmérséklete (Tm) jóval alacsonyabb, mint a második primerpáré (a megaprimer esetén ez nem meglepő, a párját meg egyszerűen magas Tm-űre kell tervezni), a két reakció ugyanabban a csőben, egymás után elvégezhető, más annealing temperature-t használva. Ilyenkor a két reakció között mindössze az új primert kell a csőbe tenni, és az elfogyott dNTP-ket kell pótolni, utána azonnal indítható a második PCR-reakció. A magasabb olvadási hőmérséklet miatt az esetleg még a reakciócsőben maradt eredeti primerek nem képesek a templátra tapadni, nem zavarják a második reakciót. Ennek a módszernek nagy előnye, hogy nem kell az első reakció után PCR-fragmentet tisztítani.



13.5. ábra -

1.1.5. 13.1.1.5. Mutagenezis láncközi primerekkel Ezt a módszert kell akkor használni, ha a pontmutációt a DNS-szakasz közepén kell előidézni. Itt is két PCRreakció használatos, de azokat nem egymás után, hanem egymással párhuzamosan kell elvégezni. A DNSszakasz két felét külön-külön szaporítjuk fel, mindkét esetben az egyik primer a pontmutáció környéki szakaszra homológ és szekvenciájában hordozza a mutáns nukleotidot. A PCR-reakciók után a megtisztított termékeket összekeverjük, majd magas hőmérsékletre melegítjük, hogy denaturálódjanak. Az elegyet ezután lehűtjük; az esetek többségében az egyes szálú DNS-szakaszok megtalálják a homológ párjukat. Egy kis részük azonban nem a párjukhoz, hanem a másik PCR-reakcióban keletkezett, egyszálúsított termék, a mutáns primer szekvenciáját hordozó homológ szakaszához tapad. Ez az összetapadt rész a két szakasz feltapadt primerének is felfogható: DNS-polimeráz (például klenow fragment) és dNTP-k segítségével fel tudjuk tölteni mindkét szálat. (Ez csak az 5’ túlnyúló végeket tartalmazó hibridszekvenciákra igaz, a 3’ túlnyúlókat tartalmazó hibrideket nem tudjuk kiegészíteni, hiszen 3’-5’ irányban nem haladhat a polimerizáció.) Az így képződött szakasz identikus lesz az első reakciókban a két párhuzamos PCR-hez alkalmazott templáttal, mindössze egyetlen nukleotidpárnyi különbséggel (ez lesz a bevitt pontmutáció). Ezt a szakaszt az első két PCR-ben is használt, a szakasz végeire tervezett primerrel lehet felerősíteni és ezt követően esetleg valamilyen vektorba klónozni (13-6. ábra).



13.6. ábra -

1.2. 13.1.2. Random mutációk készítése PCR-rel Ha egy teljes fehérje funkcióvesztésének lehetséges genetikai okaira vagyunk kíváncsiak, akkor érdemes véletlenszerű mutációkkal megváltoztatni 1-1 aminosavat a fehérjék szerkezetében, és a keletkezett polipeptidláncok működését összehasonlítani. Ezen a módon nem csak funkcióvesztéses, hanem új tulajdonságokkal bíró fehérjéket is előállíthatunk. A random mutációk a fehérje cDNS-én történnek, a különböző polipeptiláncokat termelő klónok genetikai információjának visszakeresésével tudjuk őket azonosítani. Az így kapott információk segítségével a továbbiakban már célzott mutációkkal próbálhatjuk meg a fehérjék működését megváltoztatni. A véletlenszerű mutációk generálásának az alapja a Taq polimeráz nem túl jó fidelitása (viszonylag sokszor hibáz, a többi hőstabil polimerázhoz képest). A másolás pontosságát MnCl2 a PCR-reakcióelegyhez történő adásával és egymástól eltérő koncentrációjú dNTP-k alkalmazásával tudjuk tovább rontani. A reakciót optimalizálni kell: A PCR hatékonyságát, az amplifikálni kívánt szakasz hosszát is figyelembe kell vennünk, amikor a megfelelő reakcióelegyet összeállítjuk. Nem szabad, hogy a reakció során egy adott hosszúságú DNSszakaszon túl sok mutáció keletkezzen (mert akkor szinte biztos, hogy funkcióképtelen fehérjét kapunk). Minél nagyobb a PCR-reakció ciklusszáma, annál valószínűbb valamilyen mutáció keletkezése. Ebből következik, hogy nem csak a dNTP-k arányát, vagy a Mn2+ koncentrációját érdemes változtatni, de a templát mennyiségével és a reakció ciklusszámával is befolyásolható a mutáció gyakorisága.



Egy tipikusnak mondható reakcióelegy 1-1 mM dCTP-t és dTTP-t, 0,2 mM dGTP-t és dATP-t, 0,5 mM MnCl2t, 2 µM 5’ és 3’ primert, és megfelelő DNS-templátot tartalmaz. A ciklusszámot általában érdemes alacsonyan, 15 ciklus körül tartani.

1.3. 13.1.3. Deléciók készítése 1.3.1. 13.1.3.1. Deléció készítése exonukleázokkal Azt a DNS-szakaszt, aminek a közepéből el szeretnénk távolítani egy darabot, egy vektorba illesztjük. Ezután az adott DNS-szakasz közepén lévő restrikciós endonukleáz-hasítóhelynél linearizáljuk a plazmidot. Ilyenkor a kérdéses DNS-szakasz két darabban, a linearizált konstrukció két végén található. Most kétféle módon lehet rövidíteni a lineáris DNS végeit: vagy Bal 31 nukleázt használunk (csak emlékeztetőül: a Bal 31 kettős szálú DNS exonukleáz), vagy exonukleáz III és S1 nukleáz keverékét (az exonukleáz III a dsDNS 3’ végétől emészti vissza az egyik szálat, az S1 nukleáz pedig az egyszálú nukleinsavakra specifikus, leemészti a keletkező 5’ túlnyúló végeket). Az exonukleáz III viszonylag lassú működése miatt a második eset jobban kontrollálható, a gyakorlatban inkább ez használatos. Az enzimreakció leállítása után statisztikusan különböző hosszúságú fragmenteket kapunk (az emésztés hosszának változtatásával is manipulálhatjuk a keletkezett fragment hosszát). A nyílt DNS-eket (ez most már egy heterogén populáció) újra összeligáljuk (13-7. ábra), és a transzformáció után keletkezett klónok tulajdonságait vizsgálhatják (például: mekkora deléciót tud elviselni egy promóter régió, hogy még képes legyen meghajtani a mögötte ülő riportergént).

13.7. ábra -



1.3.2. 13.1.3.2. Deléció készítése hiányos primerrel Az előző módszertől eltérően itt pontosan, nukleotidra meg lehet határozni, hogy mely DNS-szakasz essen ki egy adott génből. Készíteni kell egy primert, amelynek két vége homológ a kiejteni kívánt darab melletti szekvenciákkal, de a közepén nincs semmi, ami kiejteni kívánt szekvenciával kapcsolódhatna. A manipulálni kívánt gént tartalmazó plazmidot egyszálúsítjuk (hővel), majd gyors hűtéssel hozzáhibridizáltatjuk a primert (vektornak használhatunk egyszálú M13 fágot is). A hibridizáció következményeként az eltüntetni kívánt egyszálú szakasz mintegy kitüremkedik a hibridizált szakaszok közül. A másik szál kiegészítése és a ligáció után a plazmidot olyan enzimatikus kezelésnek vetjük alá, mely eltávolítja a hurkot (például S1 nukleázos 162 Created by XMLmind XSL-FO Converter.


kezelés vagy restrikciós endonukleázzal nick vágása, majd ezt követő exonukleáz III-as emésztés). A hurok helyére megszintetizálható a primerrel homológ szekvencia, amely már nem tartalmazza a deletált szakaszt (138. ábra).

13.8. ábra - http://mol-biol4masters.masters.grkraj.org/html/Genetic_Engineering5EIn_Vitro_Mutagenesis_files/image005.jpg - 2013.10.13.

Nem feltétlenül kell egyszálúsított plazmid, vagy M13 fág-genom alapú konstrukciót használnunk templátnak. Ha nem túl hosszú szakaszt akarunk eltávolítani, akkor bármilyen kétszálú DNS-darabon előidézhetjük a deléciót, ha egy PCR-reakciót végzünk a kivágandó szakasz nukleotidjait tartalmazó primer segítségével (13-9. ábra). Ugyanezen a módon tudunk rövidebb inzerteket a DNS-szakaszunkba ültetni, ilyenkor az egyik primer a közepén tartalmazza az extra nukleotidokat (13-9.) ábra.



13.9. ábra 2013.10.13.

-

http://eu.idtdna.com/pages/images/decoded/figure-1.png?sfvrsn=0

-

1.3.3. 13.1.3.3. Deléció készítése PCR-rel Ez a módszer nagyon hasonlít ahhoz, amikor pontmutációt idéztünk elő láncközi primerek segítségével. A különbség annyi, hogy nem kell mutáns primereket használni, a primereket a megmaradó szekvenciarészek végeire készíttetjük. A primereket úgy kell tervezni, hogy 5’-végükön a kapcsolódni kívánt szekvenciával homológ farkat tartalmazzanak. A PCR-reakció ezután ugyanazt a templátot tartalmazó két párhuzamos csőben zajlik. A termékek végeinek hibridizáltatása után kiegészíthető a teljes szál, majd PCR-rel történt szaporítás után megkapjuk a deléciót tartalmazó terméket (13-10. ábra).

13.10. ábra - http://www.mikeblaber.org/oldwine/bch5425/lect24/IMG00006.GIF 2013.10.10.



1.3.4. 13.1.3.4. Génfúzió PCR-rel A génfúzió készítése azért került ebbe az alfejezetbe, mert gyakorlatilag ugyanúgy zajlik, mint a deléció készítése PCR-rel (13-10. ábra). A különbség csak annyi, hogy a párhuzamos PCR-reakciónkban különböző DNS-templátot használunk. (Használhatjuk természetesen ugyanazt a templátot is, ha az összefűzni kívánt két szakasz ugyanazon a DNS-láncon van. Ilyenkor a két szakasz által közrefogott szekvenciát technikai szempontból tekinthetjük akár egy óriási, deletálandó szekvenciának is.)

1.4. 13.1.4. Génkiütött állatok A génkiütött állatok nagyon fontos objektumai a kutatásoknak. A gén eltávolításával eltávolítunk egy fehérjét, aminek így a sejtben betöltött szerepéről (mennyire fontos, milyen folyamatokban játszik szerepet stb.) rengeteg információt kaphatunk. A génkiütés technikáját használhatjuk transzgenikus állatok létrehozására is. Mivel a technika egéren a leggyorsabb és a legjobban kidolgozott, ezért most ezen a példán fogjuk ezt bemutatni. A fejlődő egérembriót hólyagcsíra (blastocysta) állapotban kivesszük az anyaállatból, majd az embryoblast sejtjeit izolálják (pluripotens embrionális őssejtek). Az izolált sejtekbe olyan konstrukciókat transzfektálunk, melyek tartalmazzák a kiütni kívánt gén két végével homológ szekvenciákat, de a középső szakasz helyett egy saját promóterrel meghajtott antibiotikum-rezisztencia gén található. Ha ez a szakasz homológ rekombinációval integrálódik a genomba, akkor azt vagy az anyai, vagy az apai eredetű kromoszómán teszi (a két kromoszómán egy időben történő integrációnak az esélye csaknem nulla). Ebben az esetben a sikeresen rekombinálódott sejtek hosszú antibiotikumos kezelésekre is rezisztensek lesznek, míg a transzgént nem integrált sejtek elpusztulnak. Egy-egy életben maradt sejtből osztódással klónok keletkeznek, ezeket különkülön szaporítjuk tovább. Amikor már elég sejt keletkezett, akkor másik anyaállatból egy újabb blastocystát veszünk ki, és abba injektálják a transzgénikus sejteket (13-11. ábra). A sejtek oda fognak tapadni a hólyagcsíra eredeti embryoblast sejtjeihez, fejlődésükben, működésükben gyakorlatilag megkülönböztethetetlenné válnak tőlük.



13.11. ábra - http://en.wikipedia.org/wiki/Knockout_mouse - 2013.10.13.

A blastocystákat egy álvemhessé tett anyaegérbe visszajuttatjuk, amiben azok kiméra egérkékké fejlődnek: bizonyos szerveik, testtájaik a blastocysta eredeti („vad típusú”) sejtjeiből erednek, mások a transzgénikus sejtekből. Szerencsés esetben a gonádok a génkütött sejtekből fejlődnek ki, ezért az egerek leendő ivarsejtjei is génkiütöttek lesznek. Ha két ilyen egér párosodik egymással, az öröklés szabályai szerint az utód 25%-os valószínűséggel mind a két szülőtől a génkiütött kromoszómát örökli, a gén hiánya fenotípusosan is meg fog nála jelenni (13-12. ábra).

13.12. ábra http://www.linguamedica.jp/mita/20030618/knockout/knockout_files/image004.gif 2013.10.13.


-


A génkiütés nagyon jó módszer, de nem mindig tökéletes megoldás. A heterokromatin állományban való elhelyezkedés, a kiterjedt metiláció, vagy a génben lévő repetitív szekvenciák gyakorisága a genomban megakadályozhatja, hogy célzott, sikeres génkiütés történjen. Előfordulhat, hogy a gén olyan fontos fehérjét kódol, amelynek a hiánya már az embrionális korban letális. Ilyenkor a fehérje in vivo szerepét csak embrionális korban, vagy kondicionális mutánsokon tudjuk vizsgálni. (A kondicionális mutációk csak adott körülmények között jelennek meg fenotípusosan.) Az is megtörténhet, hogy a gén kiütése valamilyen oknál fogva (pl. redundancia) semmiféle hatással nincs az egér életére. Bár evolúciósan viszonylag közel vannak, mégsem biztos, hogy a génkiütött egerekben történő változások emberekben is hasonló módon manifesztálódnának.

2. 13.2. Géncsendesítés Bizonyos fehérjék sejtből való eltüntetésére nem a génkiütés az egyetlen módszer. A fehérjék termelődését meg lehet akadályozni úgy is, hogy a gént kódoló DNS-szakasz épségben megtalálható az adott élőlény genomjában. A gének expresszióját elvben akadályozni lehetne az adott mRNS átírásának gátlásával. Ezt úgy lehetne megoldani, hogyha csakis az adott génre specifikus transzkripciós faktor működését gátolnánk valahogy. Az eukarióta sejtekben azonban egy-egy transzkripciós faktor több gén működéséért is felelős, és egy adott gén működését is több transzkripciós faktor együttes, vagy egymást kizáró jelenléte határozza meg. Ezért a gyakorlatban a géncsendesítés nem a transzkripció szintjén, hanem a keletkezett RNS féléletidejének jelentős csökkentésén alapszik. A géncsendesítésnek ez a mechanizmusa a természetben is előfordul: Vírusfertőzések elleni védekezésnél, vagy génexpresszió szabályozásánál találkozhatunk vele.

2.1. 13.2.1. A géncsendesítés elmélete A géncsendesítés elmélete a következő: az adott génről képződött RNS egyik részéhez egy kb. 21-bázis hosszú komplementer RNS képes egy adott enzimkomplex jelenlétében tapadni. A kapcsolódás vagy csak egy



térbeli gátat képez és így akadályozza a transzlációt (elsősorban nem teljesen tökéletes bázispárosodású, viszonylag széles specifitású miRNS-ek – mikro-RNS-ek – esetében), vagy az enzimkomplexribonukleáz működésének következtében elhasad a kiválasztott RNS (ez főleg tökéletes szekvenciahomológiával bíró, igen specifikus miRNS-ek esetében jellemző), és ennek következtében nem íródik át a fehérje. Hogyan keletkeznek ezek a kis komplementer szakaszok, az ún. mikro-RNS-ek (miRNS)? Nagyobb, nem transzlálódó RNS-ek bizonyos részeiből. Ezek az RNS-ek a sejtmagban saját magukkal bázispárosodnak, részben feltekerednek. Ezt a formát hívják pri-miRNS-nek. Ezek az RNS-ek a sejtmagon belül érnek: RN-ázok bizonyos részeiket leemésztik, csak egy kb. 70 bázis hosszúságú, nagyrészt hajtű alakúpre-miRNS marad. Ez kijut a sejtmagból és tovább alakul: egy „Dicer” nevű RN-áz enzim levágja a hajtű hurkát és az esetleg nem bázispárosodó lelógó részeket. Az eredmény egy 19–23 bázispár hosszú, dupla szálú RNS lesz, melynek mindkét 3’ végén 2-2-nukleotid túllóg. Ezt nevezzük miRNS-nek, vagy siRNS-nek. (siRNS-nek nevezzük azokat, amelyek nem endogén módon jöttek létre, hanem a sejten kívülről érkeztek, például virális eredetűek, vagy mesterségesen szintetizáltak.) Ez a rövid, dupla szálú RNS több fehérjével együtt egy enzimkomplexszé áll össze, miközben az RNS kitekeredik, és az egyik szála ledisszociál a komplexről. A ledisszociált RNS-szálat a citoplazma ribonukleázai elemésztik. A megmaradó egyszálú, 19–23 nukleotidnyi RNS-t kötő enzimkomplexet nevezik RISC-nek (RNA-induced silencing complex). A RISC az egyes szálú RNS-e segítségével képes a célzott RNS komplementer szakaszához kötődni és annak átírását a már ismertetett módokon akadályozni (13-13. ábra). Ha a célzott RNS hasítása bekövetkezett, a RISC komplex új préda után tud nézni (ez a csendesítési forma hatékonyabb, mint a sima térbeli gátlást okozó kapcsolódás).

13.13. ábra http://www.pnas.org/content/suppl/2005/07/10/0504439102.DC1/04439Fig7.jpg 2013.10.13.


-


2.2. 13.2.2. Géncsendesítési módszerek Hogyan válasszuk ki, hogy melyek azok a szekvenciák, amelyeket a RISC felismer? Legegyszerűbb, ha a tudományos irodalomban utánanézünk, hogy van-e már előzménye az általunk kiválasztott gén csendesítésének. Ha már volt sikeres csendesítés, érdemes nekünk is ugyanazzal a konstrukcióval próbálkoznunk először. A különböző biotechnológiai cégek is már egyre több gén csendesítéséhez árusítanak kipróbált, validált siRNSeket. Ha ezek nem lehetséges opciók, akkor érdemes különböző számítógépes programok segítségével (az siRNS-eket gyártó cégek online biztosítják az ezekhez való hozzáférést) megtervezni a lehetséges legjobb konstrukciókat. Előny, ha egy génre több siRNS-t is tervezünk, majd a kezdeti kísérletek során kiválaszthatjuk a legjobbakat. Az sem baj, ha egyszerre több siRNS-t használunk párhuzamosan, ha azok együtt képesek a gén csaknem teljes csendesítésére. Egy jó géncsendesítési kísérletben az adott gént reprezentáló mRNS-ek számát akár 1–5%-ra is csökkenthetjük az eredetihez képest. Kétféle módja van a géncsendesítésnek. Az RNS-alapú géncsendesítés esetén vagy kétszálú siRNS-eket, vagy hajtű alakú pre-miRNS-eket használunk. Ezeket transzfektáljuk a sejtkultúra sejtjeibe (speciális, RNStranszfekcióra alkalmas reagenseket is lehet kapni). Gyakorlatilag mindegy, melyik RNS-formát választjuk, az eukarióta sejtekben benne vannak az RNS-ek átalakulását segítő mechanizmusok enzimjei (dicer, argonauta). Ha sejtkultúrán dolgozunk, rövid, féléletidejű fehérjét akarunk kiütni, vagy több lehetséges siRNS-t akarunk kipróbálni, akkor mindenképpen ezzel a módszerrel érdemes a géncsendesítést kezdenünk. A megvásárolt RNS viszonylag olcsó, ha jól transzfektálódó sejtvonalat választunk, viszonylag gyorsan kaphatunk kísérleti 169 Created by XMLmind XSL-FO Converter.


eredményeket. Valamivel drágábban hozzá lehet férni módosított nukleotidokat tartalmazó RNS-ekhez is. Ezek lehetnek erősebb bázispárokat képzők, vagy kevésbé érzékenyek a sejtekben lévő RN-ázokra. Ez utóbbi tulajdonságuk miatt stabilabbak a hosszabb, féléletidejű fehérjéknél (akár terápiás célra is) is használhatóak. A DNS-alapú géncsendesítés valójában ugyanúgy siRNS-ekkel dolgozik, mint az RNS-alapú. Ilyenkor azonban nem RNS-t transzfektálunk a sejtekbe, hanem egy olyan vektort, mely tartalmazza a megfelelő premiRNS szekvenciáját, és egy megfelelően erős promótert, amely majd az RNS átírását biztosítja. A vektorba ültetett szekvencia a két végén tartalmaz kb. 20-20 bázispárnyi, egymással komplementer szakaszt (a képződő RNS-ben ez a két rész fog egymással összetapadni, majd egyikük a degradálandó RNS-hez kötni), és középen egy konszenzus szekvenciát, amelyről az RNS-hajtű hurka íródik át. Ezt a hurkot ismeri majd fel a dicer enzim, ami a kétszálú siRNS-t kialakítja (13-14. ábra).

13.14. ábra -

A DNS-alapú géncsendesítésnek sok előnye van. Egyrészt a vektor integrálódhat a sejt genomjába, így egy permanens, gyakorlatilag génkiütött állapotot hozhatunk létre. A promóter és a hozzá kapcsolódó szakaszok jellegétől függően a géncsendesítés erőssége, szövetspecifitása regulálható. Ha olyan promótereket alkalmazunk, amelyekhez az RNS-polimeráz III köt, azok igen erős siRNS-átíródást okoznak, viszont nem szövetspecifikusak. Az RNS-polimeráz II-t kötő promóterek gyengébbek, viszont szövetspecifikusak. Ezzel a módszerrel az is megvalósítható, hogy a géncsendesítés az adott élőlénynek csak egy meghatározott szövetében, vagy egy adott sejtvonalban csak indukció hatására valósuljon meg. 170 Created by XMLmind XSL-FO Converter.


Ha géncsendesítéssel próbálunk egy adott fehérje szerepéről információkat szerezni, nem szabad megfeledkezni néhány fontos dologról: • Az siRNS-en keresztül működő géncsendesítés nem azonnali hatású, nagyban függ az adott fehérje féléletidejétől (akár több hét is lehet, mire a sejtben már jelen lévő fehérje lebomlik) • A sejtekbe való transzfekció hatékonysága nagymértékben befolyásolhatja a géncsendesítés hatékonyságát (a transzfekció hatékonyságát gyakran párhuzamosan transzfektált riportergének kifejeződésével vizsgálják) • Ha sok, ugyanarra a génre tervezett siRNS hatékonyságát vizsgáljuk, érdemes először több csoportban néhányat együtt transzfektálni, majd a leghatékonyabb csoport tagjait külön-külön vizsgálni a következő kísérletben • Mindig használjunk kontrollokat, például scrambled (véletlenszerű nukleotidokból álló) siRNS transzfektálásával • Az siRNS hatékonyságát a lehető legtöbb módon ellenőrizzük (northern blot, western blot, sejtfunciók ellenőrzése).


14. fejezet - Fehérjék kimutatása Míg adott szekvenciájú nukleinsavakat döntően hibridizáción alapuló technikákkal lehet specifikusan kimutatni, addig fehérjék specifikus kimutatására ez nem alkalmas. A fehérjék szintézisük után feltekerednek, felveszik a rájuk jellemző térszerkezetet. Natív állapotukban adott fehérjéket elsősorban az egyéni harmadlagos szerkezetük alapján lehet megkülönböztetni egymástól. A fehérjék specifikus kimutatására legalkalmasabbak az ellenük termeltetett antitestek, vagy a szelektált aptamerek.

1. 14.1. Antitestek termeltetése Antitesteket élő állatokban, vagy sejtkultúrákban termeltetnek: egérben, nyúlban, kecskében, birkában, marhában, szamárban, patkányban és csirkében termeltetett antitestek a leggyakoribbak. Antitestek termeltetéséhez mindig antigén szükséges. Antigénként a kimutatni kívánt fehérjét, a fehérje fúziós tag-ekkel kiegészített variánsát, vagy az adott fehérje egy immunogén részét reprezentáló peptidet használnak. Attól függően, hogy az antitestet termelő sejtek egy, vagy több immunsejt utódai, megkülönböztetünk monoklonális és poliklonális antitesteket. A monoklonális antitestek egyformák, a poliklonális antitestek különbözőek olyannyira, hogy az sem biztos, hogy ugyanazt az epitopot (felismerőhelyet) ismerik fel a kérdéses fehérjén. Jó néhány biotechnológiai cég foglalkozik antitestek termelésével és árusításával. Ezek az antitestek többnyire igen drágák, és korántsem biztos, hogy megfelelően specifikusak. (Vásárlás előtt próbáljunk minél több információt szerezni a választott antitestről. Ennek legegyszerűbb módja, hogy a termékkatalógusban, vagy valamilyen tudományos publikációban ellenőrizzük az antitesttel készült western blot képét, ha az hozzáférhető). Gyakran előfordulhat az is, hogy az általunk kimutatni kívánt fehérje ellen nem található antitest a piacon (vagy nem megfelelő). Ilyenkor rá vagyunk kényszerülve arra, hogy saját magunk állítsuk elő a megfelelő antitesteket.

1.1. 14.1.1. Poliklonális antitestek készítése A poliklonális antitestek előállításához antigéneket kell az állat bőre alá (szubkután) injektálni, hogy az immunrendszer sejtjei antitesteket termeljenek ellenük. Az antitesteket a vérből lehet majd kinyerni. Az injektálás előtt az antigén vizes oldatát ásványolaj/növényi olajkeverékkel, ún. Freund’s adjuvánssal keverjük, emulziót készítünk belőle. Az ásványolaj emulzióból az antigének csak lassan tudnak kijutni, ezért az immunizálás eredményeképpen egy hosszú és erős antitestválaszt kapunk. Az első injektálás alkalmával inaktivált mycobacteriummal kevert, ún. komplett Freund’s adjuvánst alkalmazunk. A mycobacterium stimulálja az immunrendszert. Az immunizálást meghatározott időközönként (nyúl esetében például hetenként) ismételjük, de ekkor már inkomplett, mycobacterium nélküli Freund’s adjuvánssal. (Ezt követően az állat már csak az antigén ellen termel antitestet, a mycobacterium ellen nem.) A specifikus antitestek növekvő jelenlétét minden héten vérvétellel ellenőrizzük, negatív kontrollként az immunizálás előtti vérszérumot használjuk. Körülbelül 4-5 héten belül az antitest-koncentráció olyan magas lesz, hogy érdemesebb nagyobb mennyiségű vért venni (a kisebb állatokat kivéreztetni), és abból antitestet tisztítani. Az antitesteket többnyire a vérszérumból tisztítjuk: a levett vért a centrifugacsőben hagyjuk megalvadni, majd centrifugálás után a tiszta felülúszót mérjük át óvatosan egy tiszta csőbe, ez lesz a vérszérum. Vérplazmából is történhet az antitest-tisztítás. Ilyenkor a vért mindenképpen véralvadásgátló szert (Na-citrát, EDTA stb.) tartalmazó flaskákba kell gyűjteni, hogy ne alvadjon meg. Centrifugálással el kell távolítani az alakos elemeket, a felülúszó lesz a vérplazma. A szérumból többnyire protein A-t vagy protein G-t tartalmazó oszlopon tisztítják az antitesteket. (A protein A és a protein G különböző típusú baktériumok felszíni fehérjéi. Az antitestek Fc részét kötik specifikusan, így védekeznek az antitestes immunválasz ellen.) Ilyenkor a szérumban lévő, megfelelő Fc részt tartalmazó összes antitest aspecifikusan felkötődik, a kötött antitesteket alacsony, vagy magas kémhatású oldattal le lehet eluálni az oszlopról. Az elúció után az antitesteket az antigént tartalmazó oszlopon tisztítják, hogy csakis az adott fehérje elleni antitestek kötődjenek, az esetleges más fertőzések ellen termelődött antitestek ne (14-1. ábra). (Az is bevett eljárás, ha az első lépésben nem izolálják az antitesteket protein A, vagy protein G segítségével külön, hanem rögtön az antigént tartalmazó oszlopon engedik át a vérszérumot.) Ha antigénként fúziós fehérje volt használva, akkor a fúziós tag-hez kapcsolódó antitesteket ki lehet szűrni a fúziós peptidet kötő affinitásoszlop segítségével.


Fehérjék kimutatása

14.1. ábra - http://www.cytographica.com/overheads/antibody.jpg - 2013.10.17.

1.2. 14.1.2. Monoklonális antitestek készítése A monoklonális antitestek előállítása sokkal lassabb, jóval munkaigényesebb és jóval nagyobb technikai felszereltséget igénylő folyamat. A monoklonális antitestek az esetek többségében egér eredetűek. A procedúra során a megfelelő antigénekkel egereket oltunk, majd az immunitás kialakulása után az egér lépének immunsejtjeit (B-sejtek) izoláljuk (ezek termelik az antitesteket, mindegyik sejt más-más antitestet). A B sejteket ezután polietilén-glikol segítségével fuzionáltatjuk immortális humán myeloma (tumor) sejtekkel. A B-sejt/myeloma sejt hibridet hibridóma sejtnek hívjuk. Hogy csak a hibridóma sejtek szaporodhassanak tovább, az eredeti myelomák ne, szelekciós táptalajban növesztjük a sejteket (az eredeti B-sejtek szaporodása korlátozott, egy idő múlva úgyis kihalnak a tápoldatból).



A myeloma sejtvonal sejtjeiből hiányzik a hipoxantin-guanin-foszforibozil-transzferáz (HGPRT) enzim, ezért purin nukleotidok szintézise a mentő utakon nem zajlik. Ha aminopterint teszünk a médiumba, az gátolja a dihidrofolát-reduktáz (DHFR) enzimet, ami a purin tukleotidok és a timidilát de novo szintéziséhez is elengedhetetlen. Ilyenkor a myeloid sejtek nem tudnak replikálódni, végül elpusztulnak, hiába teszünk az aminopterin mellé hipoxantint és timidint (HAT médium). A hibridóma sejtekben viszont a B-sejtek révén megtalálható a HGPRT enzim, ezért HAT médiumban a mentő utak segítségével fel tudja építeni nukleotidjait. Az életben maradt hibridóma sejteket tartalmazó médiumot kihígítjuk, majd egy-egy sejtet sok pici cellát tartalmazó, ún. mikrotiter plate-ekben felszaporítunk. A B-sejt eredetnek köszönhetően a hibridóma sejtek antitesteket szekretálnak a médiumba. A hibridómasejt-kolóniákat összehasonlítjuk antigénre való specifikusság szempontjából, és csak a legjobbakat szaporítjuk tovább. Az antitesteket a hibridómasejt-kultúra tápoldatából lehet kinyerni a médium szűrése, dialízise, majd az előbb ismertetett affinitáskromatográfiás lépések segítségével (14-2. ábra).

14.2. ábra - http://en.wikipedia.org/wiki/File:Monoclonals.png - 2013.10.17.



1.3. 14.1.3. Másodlagos antitestek Most már tudjuk, hogy az antitest specifikusan hozzáköt az adott fehérjéhez, de ezt csak akkor látjuk, ha az antitestet valami látható dologgal megjelölik. Az esetek többségében ez úgy zajlik, hogy nem a fehérjére specifikus antitestet jelölik, hanem a fehérjéhez kötő (elsődleges) antitest Fc részét használva antigénnek, az ellen termeltetnek egy másik (másodlagos) antitestet, és azt jelölik meg. Attól függően, hogy az elsődleges antitestet milyen organizmusban termeltettük, a másodlagos antitest lehet anti-egér, anti-nyúl, anti-kecske stb. antitest. Természetesen az elsődleges antitestet termelő fajtól eltérő organizmusban termeltetett másodlagos antitestet szoktunk használni (például nyúlban termeltetett anti-egér antitestet, ha az elsődleges antitest egérben, vagy egér eredetű sejtekben termelődött). A másodlagos antitesteket vagy fluoreszcens festékkel, vagy valamilyen enzimmel (torma-peroxidáz, alkalikus foszfatáz) szokták konjugálni. (A piacon kaphatóak jó minőségű, elfogadható árú másodlagos antitestek, házilag ne próbálkozzunk másodlagos antitestek gyártásával és jelölésével.) 175 Created by XMLmind XSL-FO Converter.


Gyakran vizsgált fehérjéknél előfordul, hogy az antitestet árusító cég már az elsődleges antitestet jelöli, így lerövidítve a detektáláshoz szükséges kísérleti időt.

2. 14.2. Aptamerek Az aptamerek mesterségesen előállított nukleinsavak vagy peptidek, melyek az antitestekhez hasonló specifitással és affinitással képesek adott fehérjékhez kötni. (Léteznek nem fehérje jellegű molekulákra specifikus aptamerek is, ezekről azonban itt nem ejtünk szót.) Az aptamerek használata viszonylag új keletű, még nem terjedt el széles körben. Az előállításukhoz szükséges technológia is még folyamatos fejlődésen megy keresztül. Előnyük az antitestekkel szemben, hogy viszonylag kis méretűek, kevéssé immunogének, ezért in vivo kimutatásra vagy terápiás célokra különösen alkalmasak. A nukleinsav-alapú aptamerek (többnyire egyszálú RNS vagy DNS) tartalmaznak egy változó hosszúságú variábilis régiót, melyek a nukleinsavak térszerkezetét nagyon eltérővé tehetik. Az aptamereket leggyakrabban véletlenszerű (vagy ismeretlen) nukleotid-sorrendű, többnyire in vitro előállított nukleinsav-tömegből szelektálhatjuk ki. A szelekció manapság már leginkább automatizált módon zajlik. A sokféle nukleinsavat a gyöngyökhöz kötött, kimutatni kívánt fehérjével kell inkubálni, majd a keletkezett komplexeket centrifugálással el lehet különíteni. A gyöngyökön lévő fehérjéhez specifikusan kötött nukleinsavakat ezután fel kell szaporítani, a terméket pedig újabb kötődési reakciónak alávetni. Ezeket a lépéseket kell mindaddig ismételni, amíg végül már csak egyféle nukleinsav lesz található a rendszerben, amely igen erősen köti a célfehérjét. Ezt a nukleinsavat jelölhetjük, majd használhatjuk az adott fehérje kimutatására. DNS-aptamerek esetében a szelekció során a felszaporítás PCR-reakcióval történik. A reakciótermékből egy kis alikvotot viszünk majd át a soron következő kötődési reakcióba. RNS aptamerek esetén két lehetőségünk van: vagy RNS-dependens RNS-polimerázzal történik az amplifikáció (mivel ez hőérzékeny, minden polimerizácós ciklusnál újra kell adagolnunk), vagy reverz transzkripciót követő PCR-reakcióval. A PCRreakciót in vitro transzkripciós lépésnek kell követni, hogy a soron következő RNS-célfehérje kötődési reakciót elvégezhessük (14-3. ábra).

14.3. ábra - http://www.genelink.com/newsite/products/images/aptamer_selex.jpg 2013.10.17.

A peptid aptamerek többnyire olyan polipeptidek, amelyeken egy 10-20 aminosavból álló mesterséges hurkot hoztak létre (melyet többnyire egy diszulfid-híd határol). A gyakorlatban leginkább a bakteriális tioredoxin-A fehérje génjét egészítik ki a hurkot alkotó aminosavak nukleotidszekvenciáival. Ez a nukleotidszekvencia itt is random, a róla keletkező peptidhurok igen variábilis lesz. A variábilis peptidek 176 Created by XMLmind XSL-FO Converter.


kötődését a célfehérjéhez leginkább élesztő-kéthibrid rendszerekkel, vagy fág-display rendszerekkel detektálhatjuk (lásd: 15. fejezet). Ezek a szelekciós rendszerek igen idő- és munkaigényesek, ami oka lehet annak is, hogy a nukleinsavakból készült aptamerek jóval elterjedtebbek, mint a peptid alapú aptamerek.

3. 14.3. Western blot A western blot technika poliakrilamid gélen elválasztott fehérjék specifikus detektálására szolgál. A western blot tulajdonképpen egy immunoblot technika, mely során a gélelektroforézissel elválasztott fehérjéket szilárd hordozóra (membránra) kötjük, majd jelenlétüket (mennyiségüket) specifikus antitestekkel (esetleg aptamerekkel) detektáljuk. (A technika alapelve nagyon hasonlít a korábban ismertetett Southern és northern blot technikákéhoz.) A western blot technika menete a következő: a futtatás előtt esetlegesen előkezelt mintákat (detergensek, hődenaturálás, diszulfid-hidak redukálása) a gélzsebekbe töltjük, majd a fehérjéket elektromos áram segítségével a gélen elválasztjuk egymástól. A futtatás befejeztével a megfelelő méretben körbevágott gélt buborékmentesen, vízzel előnedvesített nitrocellulóz membránra (vigyázat, tömény metanolban feloldódik!), vagy metanolban nedvesített és ún. transzfer-pufferben ekvilibrált PVDF (polyvinylidene-fluorid) membránra helyezzük. A membrán alá és a gél tetejére helyezett, lehetőleg vastag vagy többrétegű, előnedvesített szűrőpapírokból ún. „szendvicset” készítünk. (Gyakran folyadékban illesztjük össze a szűrőpapír-membrán-gélszűrőpapír szendvicset, hogy az egész buborékmentes maradjon.) A fehérjéket a gélről a membránra elektromos áram segítségével visszük át (14-4. ábra). Mivel a transzferhez használt puffer lúgos kémhatású, a fehérjék a pozitív elektród felé fognak vándorolni – a gélhez képest mindig a pozitív elektród irányába kell helyezni a membránt. Transzfer után a membránt 5% zsírmentes tejport tartalmazó pufferben (TBS-Tris puffer vagy PBS-foszfát puffer) blokkoljuk. A blokkolás analóg a már megismert prehibridizációval; a membránhoz aspecifikusan fehérjéket kötünk. Blokkoláshoz tejfehérjék helyett lehet mást is használni (BSA-t, zselatint stb.), de a tejpor messze a legolcsóbb, és igen jó eredményt biztosít. Körülbelül egy óra blokkolás után az elsődleges antitestet tartalmazó oldattal történő inkubáció következik. Az oldat összetétele: TBS (vagy PBS), 1% zsírmentes tejpor, 0,1% Tween 20 (detergens). Az antitest hígítása 1:200–1:100 000-ig terjedhet az antitest töménységétől és specifitásától függően, érdemes először az 1:1000 hígítással próbálkozni. Érdemes minél kisebb térfogatban dolgozni (8-10 ml), hogy kevesebb antitestet kelljen használni. Legalább 1 óráig történik az inkubáció, lehetőleg billegő-tálcán, hogy az antitestes oldat a membrán minden szegletét érje. Az antitestek a kötődésük során leszorítják az aspecifikusan kötődő tejfehérjéket azokról a fehérjékről, melyeket specifikusan felismernek. Az inkubáció és az antitestes oldat leöntése után a membránt öblítés után legalább 3x5 percig mossuk (TBS vagy PBS, 1% zsírmentes tejpor, 0,1% Tween 20 keverékében, most már végig ugyanezzel az összetételű oldattal érdemes dolgozni). Mosások után tegyük hozzá a másodlagos antitestet általában 1:2000– 1:5000 hígításban. Egyórás billegtetés, majd az antitestes oldat leöntése után legalább egyórás mosás következik, miközben 3-4-szer érdemes lecserélni a mosófolyadékot.

14.4. ábra - http://www.western-blot.us/procedure-of-western-blot/western-blot-transfer - 2013.10.20.



Az elsődleges, majd a másodlagos antitesttel történt inkubáció, majd az alapos mosások után előhívhatjuk a membránt. A másodlagos antitestet többféle módon lehet detektálni, ennek elősegítésére az antitestek tormaperoxidázzal történő konjugációja a legelterjedtebb. Ebben az esetben közvetlenül előhívás előtt luminol és hidrogén-peroxid keverékét adjuk a membránhoz. A torma-peroxidáz katalízisének következtében a fehérjéhez kötődött első- és másodlagos antitestek helyén fényreakciót kapunk, amelyet zöld fényre érzékeny röntgenfilmmel detektálhatunk (14-5. ábra). A film feketedésének mértékéből következtetni tudunk a vizsgálandó fehérjék egyes mintákban lévő mennyiségeinek arányaira.

14.5. ábra - http://advansta.com/images/Figures/WB%20Quantum/WBQ_homeFig1.jpg - 2013.10.20.



4. 14.4. ELISA Ha biztosan tudjuk, hogy az adott antitest specifikus, és semmi máshoz nem kötődik, csak a felismerendő fehérjéhez, akkor felesleges a fehérjéket egymástól elválasztanunk ahhoz, hogy a kérdéses fehérje mennyiségi arányait össze tudjuk hasonlítani a különböző mintákban. Ilyenkor egy műanyag, 96-lyukú lemez (microtiter plate) minden lyukába a célfehérjét felismerő, ismert mennyiségű antitestet adunk, ami hozzáköt a cella aljához. A kötődés (és a felesleg kimosása) után a cellák felületének antitesttel nem borított részeit aspecifikus fehérjékkel (például BSA-val) blokkoljuk, hogy ezután a cellába már csak az antitesten keresztül tudjon más fehérje bekötni. Ezután a lyukakba bemérjük a különböző koncentrációjú fehérjemintákat, a mintákban lévő, kimutatandó fehérjék specifikusan hozzákapcsolódnak az antitestekhez. A kapcsolódás után a felesleges folyadékot eltávolítjuk, majd elsődleges (másik epitophoz kapcsolódó, mint a cellák aljára ültetett antitest) és másodlagos antitestek oldataival inkubáljuk a mintákat. A másodlagos antitestekhez kötődő fluoreszcens fény vagy enzim generálta színreakciók összehasonlításának segítségével deríthetjük ki a mennyiségi viszonyokat. A másodlagos antitest használata kikerülhető, ha az elsődleges antitesthez fluoreszcens festéket vagy biotint kötöttek. Az utóbbi esetben a biotint a streptavidin specifikusan köti; a streptavidinhez kötött enzimet vagy fluoreszcens jelölést a már ismert módokon detektáljuk (14-6. ábra). Az ELISA (ezyme-linked immunosorbent assay) gyors, kvantitatív, könnyen mérhető, és sok minta párhuzamos mérésére alkalmas. Ma már szinte csak a fent említett szendvics-módszer elvén végzik az ELISA-reakciókat. Az előkészített, antitestekkel borított cellákat tartalmazó microtiter plate-eket az erre specializálódott biotechnológiai cégek árusítják, többnyire a többi hozzávaló reagenssel (antitestek, pufferek, enzim-szubsztrát) együtt. Korábban gyakori eljárás volt, hogy nem az antitesteket, hanem magát a fehérjeminta komponenseit kötik a 96-lyukú lemez aljára. Ez a megoldás ugyan olcsóbb, de a specifikus fehérjék alacsonyabb részaránya miatt sokkal nagyobb hátteret, és sokkal kisebb jelet kapunk az enzimreakció során. Az ELISA egy korábbi verziója a RIA (radioimmunoassay). Itt a másodlagos antitesteket nem enzimekkel, hanem radioaktív izotópokkal jelölték, és nem fluoreszcencia-, hanem radioaktivitás-intenzitást mértek. Az erősen radioaktív izotópok potenciális egészségkárosító hatása miatt azonban ezt a technikát ma már sehol sem használják.

14.6. ábra - http://www.epitomics.com/images/products/sandwich_dual.jpg - 2013.10.20.




15. fejezet - Fehérje interakciók Mivel döntően a fehérjék határozzák meg az élőlények tulajdonságait, a molekuláris biológiai technikákkal végzett kutatások egy jelentős része adott fehérjék működésének alapjaival, többek között a fehérjék más molekulákkal létrejövő kapcsolataival foglalkozik. A fehérjék jellegzetes szerkezetüknek köszönhetően adott térszerkezetű anyagokhoz képesek specifikusan kötődni. Ebben a fejezetben azokat a technikákat ismertetjük, amelyekkel egy adott fehérje kapcsolódási partnerei kideríthetőek. A módszerek között vannak olyanok, amelyek izolált, vagy tisztított fehérjék tesztcsőben (in vitro körülmények közti) kapcsolatait igazolják, és vannak olyanok, amelyek élő sejteken belüli (in vivo) kapcsolatokat mutatnak ki. Az in vivo és in vitro meghatározás önkényes, a módszerek jellege között éles határvonal nem húzható; gyakran in vivo létező komplexeket izolálva in vitro módszerekkel lehet kimutatni.

1. 15.1. In vitro kapcsolatok kimutatása 1.1. 15.1.1. Kapcsolatok kimutatása fúziós fehérjével Ez egy viszonylag egyszerű technika, használatával egy ismert fehérje kapcsolódó fehérjepartnereit tudjuk kideríteni in vitro. Az ismert fehérjét egy affinitáskromatográfiára alkalmas fehérjével vagy peptiddel fuzionáltatva valamilyen expressziós rendszerben meg kell termeltetni, és meg kell tisztítani. Az affinitásoszlophoz kötődő fúziós fehérjét ezután nem kell eltávolítani az oszlopról, hanem ezen az oszlopon kell végigfuttatni azt a sejtlizátumot, amely feltételezések szerint tartalmazhatja a tisztított fehérjéhez kapcsolódó más fehérjéket. Ezek a fehérjék megkötnek. Az aspecifikus kötődésű fehérjéket mosással eltávolítjuk. Ezután az oszlophoz specifikusan kapcsolódó fehérjéket az oszlopról leszedjük (például elúcióval, a kémhatás megváltoztatásával, detergensekkel, forralással stb.) és analizáljuk. Az analízis gyakori lépése az SDSpoliakrilamid gélen történő elválasztás, majd a fehérjék gélből való izolálása és limitált hasítása után történő mikroszekvenálás, vagy tömegspektrometriás vizsgálat. Ha vannak feltételezések, hogy mi lehet a kapcsolódó fehérje, azt a gélelektroforézist követő western blot technikával, specifikus antitest segítségével igazolni lehet (15-1. ábra).

15.1. ábra -


Fehérje interakciók

1.2. 15.1.2. Immunprecipitáció Az immunprecipitáció valójában nem elsősorban fehérjekapcsolatokat vizsgáló módszer, részben a technikai hasonlóságok miatt került ebbe a fejezetbe. Ez a technika főleg arra való, hogy a sejtlizátumban nagyon kis mennyiségben jelen lévő fehérjét koncentrálja, ezáltal láthatóvá tegye például a western blot során (vagy mérhetővé tegye az aktivitását egy adott enzimreakcióban). A kis mennyiségű fehérje elleni specifikus antitesteket hozzáadjuk a sejtlizátumhoz, majd az antitestek Fc részét kötni tudó protein A-t vagy protein G-t kötő agaróz gyöngyöket kell a keverékhez adni. A gyöngyökhöz odakötnek az antitestek, amelyek magukkal hozzák a felismert fehérjéket. (Már a kísérlet előtt, akár kovalensen is hozzá lehet kötni a protein A-s vagy protein G-s gyöngyöket az antitestekhez; ugyanazt az eredményt kapjuk, ha ezekhez köt hozzá a koncentrálandó fehérje.) A gyöngyöket koncentrálással ülepítjük, mossuk, majd a kötött fehérjéket gélelektroforézissel (és ehhez kapcsolódó western blottal) analizáljuk, vagy megvizsgáljuk az enzimaktivitásukat. Ez a módszer elsősorban az adott fehérjék mennyiségi kimutatására alkalmas.



15.2. ábra http://www.leinco.com/includes/templates/LeincoCustom/images/immunoprecipitation.g if - 2013.10.23.

1.3. 15.1.3. Ko-immunprecipitáció Ez a módszer nagyon hasonlít a fúziós fehérjékkel való horgászáshoz, de itt antitestet használunk, és nincs expressziós rendszerben történő fúziós fehérje-termelés. Az ismert fehérjére specifikus antitesteket a már ismertetett módon kötjük fel a protein A (vagy protein G) agaróz gyöngyökre. Ezeket a gyöngyöket inkubáljuk a sejtlizátummal, amelynek során az antitestekhez kiköt az ismert, vizsgálni kívánt fehérje, ami hozza magával a hozzá közvetlenül, vagy közvetve kapcsolódó fehérjéket. A gyöngyök mosása után SDS-gélelektroforézissel választjuk el egymástól az interakciós partnereket, amelyeket azután a már ismert módokon (western blot, mikroszekvenálás, tömegspektrometria) azonosíthatunk (15-3. ábra). A ko-immunoprecipitáció félig-meddig in vivo módszernek is tekinthető, hiszen a sejtlizátumban már eredetileg meglévő fehérjekomplexeket mutatja ki. A módszer lényege a fehérje-fehérje interakció kimutatása, használhatjuk a fúziós fehérjékkel történő horgászás alternatívjaként is. Ilyenkor a fúziós tag nélküli (overexpresszáltatott és/vagy tisztított) fehérjéket specifikus antitestekkel kötjük a gyöngyökhöz, és azokkal horgászunk a sejtlizátumban. Természetesen az így felfedezett fehérjekapcsolatok kizárólag in vitro kapcsolatoknak tekinthetőek. Előfordulhat, az is, hogy a gyöngyökhöz nem specifikus antitesteket kötünk, hanem specifikus aptamert, vagy valamilyen specifikus ligandot.

15.3. ábra 2013.10.24.

-

http://b2b.bio1000.com/file/upload/201305/30/10-31-18-85-9657.jpg


-


1.4. 15.1.4.Gél-shift A gél-shift módszerrel azt lehet kideríteni, hogy egy adott DNS-szakaszhoz vagy RNS-molekulához kapcsolódik-e valamely fehérje in vitro. A vizsgálni kívánt (radioaktívan) jelölt nukleinsavat agaróz- vagy natív poliakrilamid gélen futtatjuk. A másik gélzsebbe olyan mintát teszünk, ahol a nukleinsavhoz előzetesen hozzákevertük a sejtlizátum fehérjéit. Ha a lizátum hozzáadásának eredményeképp a nukleinsav futása a gélben lassul, ez azt jelenti, hogy valamilyen fehérje specifikusan hozzákötődött, és így megnövelte a tömegét. Azt hogy a lassulás valóban fehérjekötődés miatt következett be, úgy bizonyítjuk, hogy nem radioaktív, ugyanazt a szekvenciát hordozó nukleinsavat is adunk az eddigi keverékhez. Ilyenkor a nem radioaktív nukleinsav le fogja szorítani a radioaktív nukleinsav egy részét a kötésből, ezért azok ismét gyorsabb vándorlást produkálnak. A nukleinsav-fehérje kötés specifikussága mutáns nukleotidok alkalmazásával bizonyítható: ha a nem-radioaktív nukleinsav (pont)mutációt tartalmaz, akkor nem lesz képes leszorítani a radioaktívat a kötésből, tehát marad a lassabb vándorlás a gélben. A specifikusan kötődő fehérjét a már ismert módszerek egyikével azonosíthatjuk. Még egy fajta nagyon elegáns azonosításra van lehetőség, melynek neve szupershift. Ha sejtjük, milyen fehérje kapcsolódik a nukleinsavhoz, akkor az ellene termeltetett antitestet is belekeverjük a sejtlizátumba, és úgy futtatjuk meg a mintát a gélen. Az antitest kapcsolódása még jobban le fogja lassítani a radioaktív nukleinsav futását a gélen (15-4. ábra).

15.4. ábra - http://www.piercenet.com/media/EMSAOverview615x416.jpg - 2013.10.24.

15.1.5. Fág-display technika A fág-display technika protein-protein vagy protein-DNS interakciókat képes kimutatni in vitro. Alkalmazásával arra a kérdésre kaphatunk választ, hogy egy adott fehérje vagy nukleinsav (DNS, RNS) mely másik fehérjéhez kapcsolódik specifikusan. A kísérlethez M13 bakteriofágot használunk. Az M13 fágok DNS-ébe egy adott organizmus adott sejtjeiből kinyerhető cDNS-könyvtárat klónozunk úgy, hogy azok kifejeződve fúziós fehérjét alkossanak a fág-kapszid 184 Created by XMLmind XSL-FO Converter.


egyik burokfehérjéjével. A különböző vektor-konstrukciókkal transzformált baktériumokból kiszabaduló fágok azt a fehérjét fogják a burokfehérjéjükhöz fúzionáltan megjeleníteni, amelyik cDNS-e a genomjukba lett integrálva. A sokféle fágot tartalmazó szuszpenziót olyan lemezre vagy oszlopra öntjük, amelyen immobilizálva van a feltételezett interakcióra képes fehérje vagy nukleinsav. Azok a fágok fognak specifikusan kötődni, melyeknek felszíni fehérjéi specifikusan kötődnek az immobilizált fehérjéhez (nukleinsavhoz). Az aspecifikus kötődésű fágokat lemossuk, majd a specifikusa kötődő fágokat is leszedjük a gyantáról (például a kémhatás megváltoztatásával). A specifikusan kötődő fágokkal azután újrafertőzzük baktériumokat. Az ezekből kiszabaduló fágoknak már jóval nagyobb része fog specifikusan kötődni az immobilizált fehérjékhez (nukleinsavakhoz). A következő mosás már olyan körülmények között zajlik, amelyek között már csak a legerősebben kötődő fágok maradnak a gyantához kötött fehérjékhez kötve. Ezt a felszaporítás-kiszelektálás ciklust többször is el lehet végezni, minden alkalommal az egyre specifikusabban kötődő fágok maradnak az oszlopon. A végén kiszelektálható az a fág, amely a legspecifikusabban kötődő fehérjét hordozza a burkán. Ennek a fágnak szokták megvizsgálni a beültetett cDNS-ét, hogy mely fehérje szekvenciáját kódolja (15-5. ábra).

15.5. ábra http://www.chemie.unihamburg.de/bc/spillner/bc_bredehorst_mitarbeiter_spillner_selektion.JPG - 2013.10.24.

1.5. 15.1.6. Kromatin-immunprecipitáció Kromatin-immunprecipitációval kideríthető, hogy egy adott protein mely DNS-szakaszokhoz köt. A módszer a ko-immunprecipitációhoz hasonlóan félig meddig in vivo módszernek tekinthető. A vizsgálat során feltárják a sejteket, majd a sejtlizátumban a nukleinsavakat Staphylococcus aureus-ból származó ún. micrococcal nuclease enzimmel emésztik. Az emésztés során a DNS kisebb szakaszokra vágódik. Az emésztés után a lizátumhoz az adott protein elleni antitesteket keverik a mintához. Az antitestek specifikusan kötik a fehérjéket, amik specifikusan kötődnek az érintett DNS-szakaszokhoz. Az antitesteket az ismert módon, Fcrészüknél fogva protein A-t (vagy protein G-t) tartalmazó gyöngyökhöz lehet kötni, így immobilizálva az antitest/fehérje/DNS komplexeket. A gyöngyöket centrifugálják, mossák, majd a DNS-szakaszokat izolálják a rendszerből. A DNS-szakaszok végeit tompává alakítják, és vektorokba ligálják őket. A vektorokat baktériumokba transzformálják, majd a kinövő klónokból plazmidot izolálnak. A tisztított plazmidok szekvenálása során derítik ki az adott fehérjéhez kötődő DNS-szakaszok nukleotid-sorrendjét.



Az imént leírt módszer elsősorban nagyon erős fehérje-DNS kapcsolatok kimutatására alkalmas, pl. hisztonfehérjék esetében. Főleg hisztonfehérjék poszttranszlációs módosulásait vizsgálják a segítségével. A gyengébben kötődő transzkripciós faktorok vizsgálata során a sejtlizátumban először kovalensen keresztkötik a fehérjéket a nukleinsavakkal (például formaldehid, vagy UV-sugárzás segítségével). Ezután történik a DNS-lánc törése, többnyire ultrahanggal történő szonikálással. Az antitesttel történt immunprecipitáció után a fehérjéket proteázokkal emésztik le a DNS-ről, a DNS-szakaszok azonosítása az előbbieknek megfelelően zajlik (15-6. ábra).


A kötődő DNS-fragmentumok azonosítására van egy egyszerűbb módszer is. A DNS-szakaszokat izolálásuk után megjelölhetjük fluoreszcens festékkel. Ha az adott élőlény genomját reprezentáló DNS-chipet használunk, akkor az adott DNS-szekvenciák a nekik homológ szakaszokhoz fognak kötni. Ezt nevezzük ChIP on chip technológiának. Mivel a chiphez kötött nukleinsav-szakaszoknak a szekvenciáját ismerjük, tudni fogjuk, hogy az adott fehérje mely DNS-szakaszokhoz való kötődést preferálja in vivo.

2. 15.2. In vivo kapcsolatok kimutatása 2.1. 15.2.1. Élesztő két-hibrid rendszerek 186 Created by XMLmind XSL-FO Converter.


Élesztő két-hibrid rendszerrel fehérje-fehérje kapcsolatokat tudunk detektálni in vivo. A módszer a különböző gének szabályozásában szerepet játszó transzkripciós faktorok felépítésén és működésén alapul. Az élesztő hibridrendszereken kívül léteznek bakteriális hibridrendszerek is. Ezekkel metodikailag könnyebb dolgozni, viszont az esetek többségében megvan a lehetőség arra, hogy a keletkező fehérjék feltekeredése máshogy történik, mint eukariótákban, ami megkérdőjelezheti az asszociációs kísérletek eredményeinek a hitelességét.

2.1.1. 15.2.1.1. Szolubilis fehérjék kapcsolódásához A transzkripciós faktorok két egymástól eltérő funkciójú részből állnak. Az egyik doménjük specifikusan felismeri az adott DNS-szakaszt (DNS-kötő domén), a másik doménjük odavonzza az RNS-polimeráz enzimet (transzaktivátor-domén), hogy az katalizálja a gén átírását RNS-sé. Észrevették, hogy a két doménnek nem feltétlenül kell egy peptidláncon lenniük; ha két különböző fehérjeként termelődött doméneket valami fizikai közelségbe hozza, akkor a transzkripciós faktor működőképes lesz, elindítja az adott gén átírását. Az élesztősejtbe sorban háromféle plazmidot kell transzformálnunk: 1. Az első plazmidon található egy promóter-régió (amit majd a használt transzkripciós faktor DNS-kötő doménje fel fog ismerni), mögötte egy riportergénnel. A riportergénről termelődő fehérje lehet fluorszecens fehérje (GFP), lehet valamilyen szín- vagy fényreakciót generálni képes enzim (β-galaktozidáz, luciferáz), vagy lehet valamilyen, az élesztő auxotrofiáját komplementálni képes aminosav- vagy nukleotidanyagcserében működő enzim. Az esetek többségében a riportergént tartalmazó plazmidot nem szükséges az élesztőbe transzformálnunk, ugyanis kaphatóak olyan, direkt a két-hibrid rendszerre kifejlesztett élesztőtörzsek, amelyek a genomjukban hordozzák a riportergént a megfelelő promóter-régió mögött. 2. A következő plazmidon található egy konstitutív promóter mögött átíródó fúziós fehérje. A fehérje két részből áll: az előbb említett riportergén promóter-régiójához kötődni képes transzkripciós faktor DNS-kötő doménjéből és a vizsgálni kívánt fehérjéből (ezt a fehérjét hívják „csalinak”). 3. A harmadik vektorban szintén konstitutív promóter mögött található a másik fúziós fehérje: az említett transzkripciós faktor transzaktivátor doménjéhez egy cDNS-könyvtár véletlenszerű tagja van fuzionáltatva (ezt hívják „áldozatnak”). A „csali” és „áldozat” összehozására az egymást követő transzformálásokon kívül van egy másik lehetőség is. Ha mindkét konstrukciót „ellenkező nemű” haploid élesztőbe juttatjuk, akkor az élesztők „párosításával” létrejött diploid utódokban mindkét konstrukció jelen lesz. Az egymást követő transzformálások és szelektálások után az összes élesztősejt azonos lesz abban, hogy mind a riportergént, mind a DNS-kötő domén/csalifehérje konstrukciót tartalmazza. A harmadik konstrukció viszont minden élesztősejtben más és más lesz, hiszen ezekbe a könyvtár különböző tagjait tartalmazó vektorokat transzfektálják. Ha valamelyik élesztősejtben a vizsgálandó, ismert fehérje, és a cDNS-könyvtárról termelődő fehérje kapcsolódik, az fizikai közelségbe hozza a hozzájuk fuzionáltatott transzkripciós faktor két doménjét, mely így el fogja indítani a riportergén átírását (15-7. ábra). A riportergént kifejező élesztőklónokat megvizsgálva kideríthető az „áldozat” fehérje cDNS-e. Ebből kiderül, hogy mely fehérje kapcsolódik a kiszemelt fehérjéhez az élesztősejten belül.




2.1.2. 15.2.1.2. Membránfehérjék kapcsolódásához A membránokba lévő fehérjék nem képesek odaúszni a DNS-hez és ott összekapcsolódva működőképes transzkripciós faktort alkotni. Membránfehérjék kapcsolódásának vizsgálatához az egyik lehetséges megoldás az ún. split-ubiquitin rendszer alkalmazása. A rendszer elméleti háttere a következő: Az ubiquitin egy olyan kis fehérje, amelyek képes a fehérjékhez kapcsolódni, kijelölve őket a későbbi proteaszomális degradációra. Létezik egy olyan enzim, az ubiquitin-proteáz, amely képes az ubiquitint a hozzá kapcsolódó fehérjéről lehasítani. Az ubiquitint mesterségesen szét lehet választani két alegységre, melyek képesek összetapadni egymással, az összetapadt proteint a ubiquitin-proteáz szubsztrátként felismeri. Ha a két mesterséges alegység (Nub és Gub) egyikébe egy pontmutációt illesztenek (a Nub 3. izoleucinját glicinre cserélik: NubG) akkor a két alegység nem képes egymással összekapcsolódni, csak akkor, ha két egymással kapcsolódó fehérjéhez vannak kapcsolva, és ez a kapcsolódás térbeli közelségbe hozza az alegységeket. Ha az alegységek összenyomódtak, akkor az ubiquitin proteáz ezt szubsztrátként felismeri és a hozzá kapcsolódó proteinszekvenciát a specifikus hasítóhelynél lehasítja. Ha ez a lehasadt protein egy transzkripciós faktor, akkor a membrántól elszabadulva képes a DNS-hez odakapcsolódni, és ott meghajtani a riportergént. A szolubilis fehérjéknél ismertetetthez képest az élesztőbe transzfektált konstrukciók közül kettő összetétele az alábbiak szerint módosul: 2. A második plazmid a konstitutív promóter után egy három részből álló fúziós fehérjét kódol. A szekvencia tartalmazza a „csali” membránprotein cDNS-ét (ezt ismerjük, a fehérje interakcióira vagyunk kíváncsiak), az ubiquitin C-terminális részének (Cub) szekvenciáját, ehhez kapcsolva az 1. plazmid riportergénjét meghajtani képes transzkripciós faktor szekvenciája. 3. A harmadik plazmid a konstitutív promóter után tartalmazza az adott organizmus cDNS-könyvtárának véletlenszerű darabját (szerencsés esetben erről íródik át az „áldozat” membránfehérje), ehhez kapcsolódik az ubiquitin pontmutációt szenvedett N-terminálisának (NubG) szekvenciája. Ha a két membránfehérje kapcsolódik egymáshoz, akkor az ubiquitin két fele is „összenyomódik”, ezt az ubiquitin proteáz észreveszi (az enzim élesztősejtekben is megtalálható), elhasítja a C-terminális és a transzkripciós faktor közötti szekvenciát. A transzkripciós faktor szabaddá válik, és ki tudja fejteni a hatását (158. ábra).

15.8. ábra - http://www.dualsystems.com - 2013.10.24.



2.2. 15.2.2. Élesztő egy-hibrid rendszerek Az egy-hibrid rendszerek felépítése és működési elve nagyon hasonló a két-hibrid rendszerekéhez, ezért csak a legfontosabb különbségeket ismertetjük. Alapvetően kétféle egy-hibrid rendszer létezik, mindkettő DNS-protein kapcsolatot vizsgál.

2.2.1. 15.2.2.1. Ismeretlen fehérje DNS-kötődése Az egyik fajta egy-hibrid rendszerben azt lehet kideríteni, hogy egy adott DNS-szekvenciához mely fehérjék kötnek specifikusan. Az élesztőbe mindössze kétféle konstrukciót kell transzfektálni: 1. Az első plazmidban található az ismert szekvenciájú DNS-szakasz, majd rögtön utána található a riportergén szekvenciája. 2. A második plazmidban a konstitutívan működő promóter után fúziós fehérje található. A fúziós fehérje két részből áll: az adott organizmus cDNS-könyvtárának véletlenszerű tagjából és egy ismert transzkripciós faktor (például GAL4) transzaktivátor doménjéből. Amelyik élesztőben a véletlenszerű cDNS-ről olyan fehérje íródik át, amely az adott DNS-szekvenciához specifikusan tud kötődni, abban a transzkripciós faktor transzaktivátor doménja iniciálni fogja a riportergén átíródását (15-9. ábra). Az élesztőklónokból szerzett cDNS-információ alapján lehetséges a DNS-kötő fehérje aminosav-sorrendjét meghatározni.

15.9. ábra 2013.10.24.

-

http://www.takarabiomed.com.cn/sxproducts/clontech/2/160-1.JPG


-


2.2.2. 15.2.2.2. Transzkripciós faktorok promóter/enhancer-preferenciája A másik fajta egy-hibrid rendszerben arra keressük a választ, hogy egy adott DNS-kötő fehérje (például transzkripciós faktor) milyen nukleotid-sorrendet preferál a kötőhelyén. Megvalósíthatósági szempontok miatt ezt a fajta egy-hibrid rendszert baktériumban (E. coliban) és nem élesztőben szokták alkalmazni (egyszerűbb, és nem jár információvesztéssel). A másik típusú egy-hibrid rendszerhez hasonlóan itt is kétfajta konstrukciót kell transzfektálni a megfelelő E. coli törzsbe: 1. Az első plazmidon az általunk vizsgálni kívánt fehérje (transzkripciós faktor) és a bakteriális DNSpolimeráz II ω alegységének cDNS szekvenciái találhatóak, a róluk átíródó fúziós fehérjét („csali”) konstitutív promóter hajtja meg. 2. A második plazmidon a riportergén előtt található RNS-polimeráz kötőhely elé egy általunk választott hosszúságú (többnyire 20–40 bázispár) random szintetizált szekvencia-poolból származó DNS-szekvenciát illesztenek. Minden plazmidban más és más random szekvencia található majd a riportergén előtt. Ha a fúziós fehérje kapcsolódni képes valamelyik random szekvenciához, akkor az ω alegységhez kapcsolódni fog az RNS-polimeráz többi része, és elindul a riportergén kifejeződése. Minél erősebb lesz a kötődés, a génkifejeződés annál erősebb, annál nagyobb szelekciós nyomásnak tud például az adott baktériumkolónia ellenállni. Többfajta random szekvencia is alkalmas lesz arra, hogy génexpressziót okozzon. A különböző szekvenciákat összehasonlítva meg tudjuk határozni a vizsgált fehérje nukleotid-preferenciáját, és hogy a specifikus kötődés során melyek a fontosabb és melyek a kevésbé fontos nukleotidok (15-10. ábra).

15.10. ábra - http://labs.umassmed.edu/WolfeLab/B1H_introsized.png - 2013.10.24.



2.3. 15.2.3. Élesztő három-hibrid rendszer Az élesztő három-hibrid technika arra a kérdésre keres választ, hogy ismert RNS-molekulához mely fehérjék (vagy ismert fehérjéhez mely RNS-molekulák) kötődnek specifikusan. A rendszer feltételezi, hogy van már olyan ismert RNS/fehérje párunk, amely egymáshoz specifikusan tud kötődni. A három-hibrid rendszer nagyon hasonlít a két-hibrid rendszerhez mind elméleti, mind gyakorlati megvalósításában, csak még egy (a már említett, ismert RNS/fehérje) specifikus kapcsolódást feltételez. Ezek alapján az élesztőbe négy különböző konstrukciót kell bevinnünk: 1. Az első plazmidon található egy promóter-régió (amit majd a használt transzkripciós faktor DNS-kötő doménje fel fog ismerni), mögötte egy riportergénnel (ugyanúgy, ahogy ezt a két-hibrid rendszernél láttuk, de többnyire ebben az esetben is már az élesztő genomja tartalmazza a konstrukciót, transzformálni nem kell). 2. A második konstrukcióban található egy konstitutív promóter mögött átíródó fúziós fehérje. A fehérje két részből áll: a fenti konstrukció promóter régiójához kötődni képes transzkripciós faktor DNS-kötő doménjéből, és az előbb említett, ismert RNS-kötő fehérjéből. 3. A harmadik vektorban szintén konstitutív promóter mögött található egy fúziós gén, amiről RNS keletkezik, de az nem transzlálódik. A fúziós RNS (vagy hibrid RNS) első tagja az ismert RNS-kötő fehérjéhez köt specifikusan, a másik tagja pedig a fehérjekötődés szempontjából vizsgálni kívánt RNS-szekvencia. 4. 4. A negyedik vektorban konstitutív promóter mögött található egy másik fúziós fehérje: Az említett transzkripciós faktor transzaktivátor doménjéhez egy cDNS-könyvtár véletlenszerű tagja van fúzionáltatva (csakúgy, mint a két-hibrid rendszernél).



Ha az ismert, vizsgálandó fúziós RNS-hez valamelyik élesztőklónban kötődik a könyvtárból származó cDNS-ről átíródott fehérje, akkor a transzkripciós faktor DNS-kötő és transzaktivátor doménje elég közel kerül ahhoz, hogy meghajtsa a riportergént (15-11. ábra). Ismert fehérjék és ismeretlen RNS-ek kapcsolódását is ugyanezzel a módszerrel lehet detektálni. Ilyenkor a 3. plazmidba a vizsgálandó RNS DNS-szekvenciája helyett cDNS-könyvtár tagjait kell inzertálni, a negyedik plazmidba pedig nem a cDNS-könyvtárat, hanem a vizsgálandó fehérje szekvenciáját kell helyezni (15-11. ábra).

15.11. ábra - - 2013.10.24.


16. fejezet - Felhasznált irodalom Albets, Bruce – Bray, Dennis – Hopkin, Karen – Johnson, Alexander – Lewis, Julian – Raff, Martin – Roberts, Keith – Walter, Peter: Essential Cell Biology. 3rd edition, Garland Science, New York, NY, 2010. Alberts, Bruce – Johnson, Alexander – Lewis, Julian – Raff, Martin – Roberts, Keith – Walter, Peter: Molecular Biology of the Cell. 5th edition, Garland Science, New York, NY, 2008. Gene Transfer and Expression in Mammalian Cells. Szerkesztette: Savvas C. Makrides Kiadó: Gulf Professional Publishing, Houston, TX, 2003. Mammalian Cell Biotechnology in Protein Production. Szerkesztette: Hansjörg Hauser, Roland Wagner. Kiadó: Walter de Gruyter, Berlin, Németország, 1997. Sambrook, Joseph – Russel, David: Molecular Cloning – A laboratory manual. 3rd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 2001. www.clontech.com www.genomics.agilent.com www.lifetechnologies.com www.millipore.com www.neb.com www.roche-applied-science.com www.springerprotocols.com/


Molekuláris biológiai technikák Wunderlich, Lívius

Recommend Documents