Élő sejtben: molekulagépezetek sokasága
Biomolekulák és sejtek mechanikai tulajdonságai
Tovakúszó keratinocita
Mikrotubulus dinamikus instabilitás
Kellermayer Miklós Semmelweis Egyetem Biofizikai és Sugárbiológiai Intézet
Vezikulum transzport kInezinnel
Fehérjeszintézis riboszómán http://multimedia.mcb.harvard.edu
Miért egyedi molekulák?
Miért egyedi molekulák?
1. Egyének azonosíthatók a tömegben
2.Véletlenszerű eseményeket fedezetünk fel
Microtubuláris rendszer
Egyedi mikrotubulusok treadmilling
Kvantumpont pislogás
Yao et al. PNAS 102, 14284
Miért egyedi molekulák?
Miért egyedi molekulák?
3. Párhuzamos útvonalon haladó folyamatokat ismerhetünk meg
4. Biomolekulák mechanikáját jellemezhetjük
Kigombolyodott állapot
Hajlítási rugalmasság
Motor fehérje működés
T2 bakteriofág
Kinezin lépegetés
Konformációs tér
Natív állapot
Rövid anyagtudomány
Merevségi (vagy rugó-) állandó
Merev testek rugalmassága: Hooke törvény
F ΔL =E A L Anyag Gyémánt Acél Üveg Plexi Gumi Selyem Keratin Aktin Kollagén Tubulin Elasztin
F = erő A = test keresztmetszete L = nyugalmi hossz ΔL = megnyúlás F/A = feszültség ΔL/L = relatív megnyúlás E=Young féle vagy elasztikus modulus (Pa) Youngmodulus (GPa) 1200 211 73 3 0.02 5-10 2.4 2.3 2 1.9 0.002
Merevségi (vagy rugó-) állandó (k=F/ΔL) nem anyagfüggő paraméter. A merevségi állandó (k) függ a test alaki paramétereitől, az erő irányától, és azt mutatja meg, hogy egységnyi megnyúlást mekkora erő idéz elő.
Longitudinális merevség: A
Hajlítómerevség: F
2r
L
κ=
F EA = ΔL L
F
4 π Er 4 κ= 3 L3
A Kuhn szegmens (“freely jointed chain”) és a perzisztencia hossz (“wormlike chain”)
A polimerlánc és a bolyongó mozgás (random walk) közötti kapcsolat
FJC (freely jointed chain): Kuhn segmens = leff
WLC (wormlike chain):
θ(s)
s
⎛ s⎞ ha s elég nagy, cosθ ( s) s függvényében lecseng: cosθ ( s) =
exp⎜− ⎟ ⎝ lp ⎠ lp=perzisztencia hossz
ha s<
>lp, akkor cosθ ( s) ~0, azaz θ(s) 0˚ és 360˚ közötti értékeket ugyanolyan valószínûséggel vehet fel.
A polimerlánc alakja hasonlítható a Brown mozgáshoz (random)
Egyenesvonalú mozgás esetén:
R = v( t2 − t1)
R
= l1 2 [ v( t2 − t1)]
Bolyongó mozgás esetén:
12
R=elmozdulás, v= átlagos sebesség, t1, t2=mérési időpontok, l=átlagos korrelált lépéshossz
A perzisztencia hossz értelme: az a hossz, amelyen belül a lánc megtartja irányát (emlékszik rá). A perzisztencia hosszon túl a lánc elfelejti irányítottságát.
“Termikus” rugalmasság
A polimérek alakja a bolyongó mozgásra emlékeztet
A polimerlánc átlagos alakja leírható egyszerű paraméterek segítségével:
R 2 = 2Lp L A perzisztenciahossz a lánc hajlítómerevségével áll összefüggésben: minél rövidebb Lp, annál hajlékonyabb a lánc, és megfordítva.
EI Lp = kBT
Brown-mozgás - “random walk” rN
“Négyzetgyök törvény”:
R 2 = Nl 2 = Ll
EI = hajlítómerevség E=Young modulus I=hajlítási tehetetlenségi nyomaték (körkeresztmetszetű rúd esetében I=r4π/4)
R R = vég-vég távolság N = elemi vektorok száma
kB =Boltzmann állandó T abszolút hőmérséklet.
Merev Szemiflexibilis Flexibilis
Lp>>L
r1
l = ri = korrelációs hossz ri = elemi vektor Nl = L = kontúrhossz l összefüggésben van a hajlítómerevséggel.
Lp~L Lp<
Bolyongó (diffúzióvezérelt) mozgás esetén R=elmozdulás, N= elemi lépések száma, L=teljes megtett út, és l=átlagos szabad úthossz.
Biopolimérek mechanikája Entrópikus rugalmasság
Biopolimérek rugalmassága l = korrelációs hossz (hajlítómerevséget jellemzi) L = kontúrhossz
Termikus gerjesztésre a polimerlánc random, ide-oda hajló fluktuációkat végez.
Merev lánc l>>L
Nő a lánc konformációs entrópiája (elemi vektorok orientációs rendezetlensége).
Szemiflexibilis lánc l~L
Mikrotubulus
Aktin filamentum
Az entrópiamaximumra törekvés miatt a polimerlánc rövidül.
Flexibilis lánc l<
Vizsgálható paraméterek: erő 160
80
Titin (lézercsipesz)
140 120
DNS molekula
Molekuláris szingularitás: nanomechanikai ujjlenyomat
dsDNS (lézercsipesz)
60
Erő (pN)
8 0 6 0 4 0
40
Rekombináns poliprotein
DNS fogantyú I27
0
0 2
3
4
5
0
6
20
30
80
Rekombináns titin fragmentum (AFM)
Amiloid fibrillum (AFM)
500
10
Megnyúlás (μm)
Megnyúlás (μm)
300 200 100
200 pN
Erő (pN)
400
Rekombináns titin fragmentum (AFM)
dsDNS (lézercsipesz)
60
Erő (pN)
1
Erő (pN)
0
Erő (pN)
Vizsgált fehérje
20
2 0
40
20
50 nm
0 20
40
60
80
100
Megnyúlás (nm)
120
140
50 nm
0
Megnyúlás (nm)
RUGALMASSÁG + SZERKEZETI VÁLTOZÁS ("ÁTMENET")
200 pN
Erő (pN)
100
0
10
20
Megnyúlás (μm) Kooperatív átmenet 65 pN-nál DNS-RNS hibrid
30
Megnyúlás (nm) Fűrészfog alakú átmenetek Egyenlő távolság a fogak között
Egyedi molekulák vizsgálata: manipuláció rugólapka technikákkal
Egyedi molekulák vizsgálata: manipuláció mező alapú technikákkal
Hogyan fogjunk meg egyetlen molekulát?
MOLEKULA - FOGANTYÚ GEOMETRIA
Belépő fénynyaláb P1
Lézerrel!
Fénytörő mikrogyöngy
F=ΔP/Δt
P2 ΔP
mikrogyöngy ~ 1 µm
“Tractor beam”, Star Trek Enterprise
molekula ~ 10 nm A mikrogyöngyöket mint fogantyúkat alkalmazzuk.
HOGYAN RAGADJUNK MEG EGY MOLEKULÁT? Például "molekulahegesztéssel"!
Csomókötés egyetlen molekulafonálra lézercsipesszel Aktin filamentum
Fotoreaktív keresztkötők
DNS
Fáziskontraszt kép
Fluoreszcencia kép
Nem-specifikus Fotoreaktív N3 (azid) csoport UV megvilágítás
Fluoreszcencia kép Arai et al. Nature 399, 446, 1999.
A lézercsipesszel erőt is lehet mérni!
A lézercsipesz virtuális rugó "Pikotenziométer"
Lézercsipesz: “virtuális rugó”
molekula Latex gyöngy
Δx ≈ nanométer tartomány K ≈ 0.01 - 1 pN/nm F ≈ pikonewton tartomány
Mozgatható mikropipetta
Két lézersugaras optikai csipesz berendezés
AFM
Egyedi titinmolekulák vizualizálása AFM-mel
Egyedi miozin filamentumok vizualizálása Atomerő mikroszkópia
Doméncsoportok korrelált organizációja
“Random coil” filamentum globuláris fejjel (C-terminális)
“fej”
Szintetikus miozin filamentum Egyedi miozinmolekulák feloldhatóak vizes közegben
miozin molekula
“farok”
1.6 1.2 0.8 0.4 0 4 0 -4
Topografikus magasság (nm)
200 nm Autokorreláció függvény
0
200 400 600 Axiális távolság (nm)
800
100 nm
Miozin filamentumok nanomechanikája Erő (pN) = Rugóállandó (pN/nm) * Elhajlás (nm)
Oxigén atomok rhodium egykristály felületén
Periodicity of repetitive force peaks correlates with spacing of charged regions along backbone Reverzibilis átmenetek (#)
Nyújtás - Relaxáció
#
#
#
Periodicitás
#
4.15 nm
8.3 nm Erő
Egymolekula erőspektroszkópia
AFM történelem
14.3 nm
43 nm
Megnyúlás
Richard P. Feynman: “There is plenty of room at the bottom” 1959. december 29.
a "nanovilág" léptéke: 1 nanométer
AFM Rugólapkák és hegyek
Atomerő mikroszkóp (Atomic Force Microscope = AFM) bakteriorodopszin
DNS
fotodetektor
lézer rugólapka
minta
DNS
Piezoelektromos hatás Inverz piezoelektromos hatás Piezoelektromosság (Pierre és Jacques Curie, 1880): "nyomáselektromosság"
Direkt piezoelektromos hatás: bizonyos kristályokban mechanikai deformálásra fellépő elektromos polarizáció (P): Inverz piezoelektromos hatás: bizonyos kristályokban potenciálkülönbség hatására fellépő deformáció:
titin
Pásztázó tűszondás mikroszkópia (Scanning Probe Microscopy = SPM)
Rugólap méretei
40
μm
μm
10-
10
0-2
00
2 μm
0,3-
Rugólapkák készítése
AFM alapok
Képalkotási módok Oszcillációs mód – biológiai minták esetében ideális. Kontakt mód
Pásztázó képalkotás Emberi hajszál
fotodetektor
Amplitudó f=5-400kHz
lézer
2 µm
rugólapka Oszcillációs vezérlő jel
rugólapka
Detektált jel
Z-piezo: vertikális mozgatás
minta A tű a felszínt követi, konstans amplitudó mellett.
Magasság kontraszt
Amplitudó kontraszt
Fázis kontraszt
Ideális képalkotás feltételei
Képalkotási hibák, felbontás
Felszín: kösse a mintát Nem specifikus kötés: csillám, grafit. Specifikus kötés: keresztkötőkkel (amino-, carboxil-, SH-csoportok) A felszín legyen sima (lehetőleg atomi simaságú – csillám, grafit) Rugólap: legyen kellően flexibilis, k≈ 50 – 0,03 N/m. Rugólap tűje: nem alakulhat ki erős interakció a minta és a tű között átmérője legyen „minél kisebb”: 5 - 80nm. Minta: legyen minél laposabb ne legyen viszkózus „Az AFM hátrányai” Időfelbontás: perces nagyságrendbe esik Csak felszínhez kötött minta vizsgálható Csak felszínen zajló folyamat követhető nyomon
Béta-amyloid fibrillumok
DNS
Vvt kenet
Fibrin hálózat
Képek: ATP-szintáz
HeLa sejtek
Képek: endotél sejtek
Nanolitográfia Lithos: kő, gráfia: rajzolni
fotodetektor
lézer
rugólapka felszín
Pablo Picasso: "Don Quixote" polikarbonát felszínbe rajzolva
1 μm
Nanolitográfia
Nanolitográfia
10µm
Szekvenciális két-hullámhossz STIRF-AFM
Height
Lágy minta manipulációja STIRFAFM segítségével
Amplitude
Filamentum hasítás
Sejt abláció Előtt
Után
Előtt
Után
*
Actin
Cytokeratin
* * 10 µm
10 µm
Pancreas carcinoma cells
5 µm
Termikus rugólapka-kalibráció
Molekulanyújtás atomerőmikroszkóppal
Termikusan gerjesztett rugólapka: harmonikus oszcillátor
alapelvek
m
Termikusan gerjesztett rugólapka kitérésének Fourier spektruma
Rezgés (Amplitudó)2
Frekvencia (kHz)
Titinmolekula nanomechanikája lézercsipesszel
Titin: rugalmas molekuláris “gyöngyfüzér” Izomköteg Izomrost
100
60 55
80 Szarkomer
D ~28 nm C
50
Domén kitekeredés
Vékony filamentum
M
Vastag filamentum
Z
Erő (pN)
45
Z
Nemlineáris rugalmasságra szuperponált domén kitekeredés A-B
Miofibrillum
Összehúzódás
Erővezérelt szerkezetváltozások:
Erőválasz
60
C
40 1.75
1.8
1.85
D
40 B Nemlineáris rugalmasság
20
Nemlineáris rugalmasság
A I-szakaszbeli szegmens
tandem Ig-régió
Ig-domén (7-szálú ß-hordó)
F
0
Titin
0 PEVKdomén
E
E
0.5
1 1.5 Megnyúlás (µm)
2
tandem Ig-régió
A domének egymás után, a mechanikai stabilitásuk növekvő sorrendjében tekerednek ki.
2.5
F
A titin nanomechanikai boncolása PEVK domén
Egyedi szekvencia
120 100 I1
I15
N2-B
I27
I84
Force (pN)
Szívizom N2-B I105 COOH
NH2
PEVKI
pN
80 60 40 20 0
Vázizom (soleus) I1
I15 I27
I79 N2-A
PEVK
I84
I105
nm 0
50 100 150 200 250
I
I55-62
Konstitutívan kifejeződő tandem Ig régió
Differenciálisan kifejeződő tandem Ig régió
II
2
1.5
1
0.5
Lp PEVKI Lp PEVKII Lp PEVKIII
0
50
Entrópikus (féregszerű) lánc
-
Titin I55-62: viszkoelasztikus elem
Perzisztenciahossz (Lp)
+
200 pN
Erő
15
Erő
5
100
200
300
400
300
Kontrakció
+
A titin doméneket párhuzamosan csatolt H-hidak stabilizálják
20 Gyakoriság
Kitekeredési erő (pN)
250
+ + + - - + + ++ + + + + - - - + + - + + + + ++ + + ++ + + + + +
50 nm
0
200
- - - - - -Elektrosztatikus
ΔL = 29.8 ± 3.5 nm
10
150
-
merevedés
Konstitutívan kifejeződő tandem Ig régió
Az összehúzódást az entrópiamaximumra törekvés vezérli
0
100
Ionerősség (mM)
III
Klónozott és mechanikailag manipulált titin fragmentumok
Kitekeredési események
Flexibilitás nő: •ionerővel •a C-terminális felé
2.5
0
COOH
NH2
Effektív perzisztenciahossz (nm)
Ig domén
Alternatív hasítás:
Titin PEVK: hangolható rugó
Erő
350
A mechanikai stabilitás biológiai logikája
Makroszkópikus mechanikai stabilitás Effektív ragasztóanyag a párhuzamos csatolás elvén
Szerkezetet összetartó H-hidak párhuzamos csatolása
Nagy kitereredési erő
Szerkezetet összetartó H-hidak soros csatolása
Alacsony kitereredési erő
Mesterséges gecko talp Nanotechnológiával készítve
Gecko talp felületi tapadása: Párhuzamosan csatolt Van der Waals kötések a serték és a felület között
A megnyújtott titin bejárja a gombolyodási fázisteret Vajon milyen útvonalon? Folded WLC Feltekert WLC
Native
Force (pN)
Erő
Natív
80
60
40
KitUnfolded ekert W WLC LC
100
Spontán gombolyodási folyamat: Diffúzió az energiaprofilon?
Részlegesen gombolyodott
Titin nanomanipulálás erővisszacsatolt lézercsipesszel Referencia jel (erő) T12 anti-titin ellenanyaggal bevont gyöngy
Mért jel (+/-) (erő)
titin
Partially unfolded
sulfo-SANPAH keresztkötővel bevont latex gyöngy
Feedback vezérlés
20
Unfolded Kitekert 0 0
1
2
3
4
5
6
7
8
mozgatható mikropipetta
Konformációs tér
Extension (µm)
Megnyúlás
Σ
Natív állapot
Vezérelt kimenet (+/-) (piezo mogás)
Csapdázott gyöngy
Mozgatott gyöngy
Konstans-erő kísérlet egyetlen titinmolekulán
Titin kitekeredés konstans erőnél Lépcsőméret eloszlás 30
120
rám
pa
0 3000
3800
“Low-force clamp” Kiteredési görbe
2500
Megnyúlás (nm)
Freqency
erő
2000
3600
5
1802
3400 3200 3000
0
1696
0
10
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
Idő (103 s)
6
40
50
60
~28 nm lépcsők 20
25
Idő (s)
3
30 x10
15
20
1
3
25 x10
A várttól eltérések mutatkoznak a lépcsőméret eloszlásban, a monoexponenciális idő-megnyúlás görbe lefutásában és az erőfüggő sebességi állandó összefüggésben.
x10
30
Erőfüggő sebességi állandók 1484
Idő (s) Visszatekeredési görbe
20
1590
15
5
10
Step size (nm)
2600
1000
15
10
Monoexponenciális Singleexponential fit görbeillesztés
2800
1500
Megnyúláslépcsők többsége: egyedi doménkitekeredési esemény
20
0 4000
-1
ázi
100
Rate constant (s )
Kv
40
25
Megnyúlás (nm)
80
Megnyúlás (nm)
Erő (pN)
Erő (pN)
28.02 ± 14.06 SD
“High-force clamp”
0.1
~20-perces adatsor
94 97 100
130
Feedback force (pN)
Doménkitekeredés hirtelen ugrásokban
Szerkezeti átmenetek alacsony erőnél Molekuláris fáradás Domén kitekeredés
Doméncsoportok korrelált szerkezeti elrendeződést mutatnak
Topografikus magasság (nm)
Autokorreláció függvény
200
400
600
800
Axiális távolság (nm)
T12 9D10 (PEVK)
20 pN 10 pN
Nagy lépcső (>100 nm)
Z
Trombitás et al. J. Struct. Biol. 1998.
Titin T12 és 9D10 ellenanyagokkal megragadva
Elsimult átmenet
Idő (s)
Idő (s)
Megnyúlás (μm)
30 pN
Kellermayer et al. BBA Bioenergetics 2003
5-10 doménből álló csoportok kooperatíven tekeredhetnek ki.
Sima
40 pN
5 pN
0
Nagy lépcső
50 pN
Megnyúlás (µm)
Megnyúlás (µm)
1.6 1.2 0.8 0.4 0 4 0 -4
Kitekeredési ugrások
60 pN
“farok”
Erő (pN)
“fej”
70 pN
Erő (pN)
Erő (pN)
80 pN
Az elsimult és nagy, lépcsőszerű átmeneteket a PEVK doménben kialakuló rövid- és hosszútávú elektrosztatikus kölcsönhatások okozhatják, amelyek a mechanikai fáradás alapjául szolgálnak. Megnyúlás (μm)
A visszatekeredési útvonal változatos még egyetlen molekula esetén is
0
Kitekert állapot
Gyors kontrakció (entrópikus kollapszus)
1000
500
40
Fluktuációk
Erővezérelt ki- és visszatekeredés 100 0
~700 nm 1500
Szerkezeti fluktuációk (A fázis időtartama rövidül az erő csökkenésével)
Idő (s)
1000
Végső kontrakció (ritkán tapasztalható)
30
Domén unfolding
50
60
70
Megnyúlás (nm)
1500
Erő (pN)
Megnyúlás (nm)
Kitekeredés
4 pN
80
“Teljesen” feltekert állapot 90
3
x10
Idő (s) Az erőt ~3 pN alá kell csökkenteni jelentős domén visszatekeredéshez. A fluktuáció diffuzív keresés a konformációs térben. Részleges viszatekeredés: doméncsoportok kooperatívan tekeredhetnek.
Részleges refolding
Megnyúlás (μm)
2000
Fluktuációk
Erő (pN)
Erő (pN) 100
Megnyúlás (μm)
Erő (pN)
Titin gombolyodás konstans erőnél
500
0 60
80
100
120
Idő (s)
Idő (s)
140
160
180
3
x10
Titinben: -Kooperatív kitekeredés -Mechanikai fáradás -Diffuzív keresés a konformációs térben -Kooperatív visszatekeredés -Mechanikai erő és random fehérjeszakaszok modulálhatják a gombolyodás folyamatát
