MICROBIAL DEGRADATION OF POLYBROMINATED DIPHENYLETHERS IN SEWAGE SLUDGE MIKROBIÁLNÍ DEGRADACE POLYBROMOVANÝCH DIFENYLETHERŮ V ODPADNÍCH KALECH Jana Zlámalíková 1), Kateřina Demnerová 1), Martina Macková 1), Jana Hajšlová 2), Jana Pulkrabová 2), Michaela Nápravníková 2), Hana Stiborová 1) 1) VŠCHT Praha, Ústav biochemie a mikrobiologie, Technická 3, 166 28 Praha 6 e-mail:
[email protected] 2) VŠCHT Praha, Ústav chemie a analýzy potravin, Technická 3, 166 28 Praha 6
Abstract: Polybrominated diphenylethers (PBDEs) are used as flame retardants although they represent a significant environmental pollution problem. These compounds are structurally similar to polychlorinated biphenyls (PCBs), polychlorinated dibenzo-p-dioxins (PCDDs), polychlorinated dibenzofurans (PCDFs) and dichloro-diphenyl-trichloroethane (DDT), therefore their chemical properties are very similar – they are persistent, lipophilic with bioaccumulative properties and resistant to acids, hydroxides and redox reactions. Despite their low acute toxicity, the lower brominated congeners operate as endocrine disruptors, neurodevelopment toxicants and/or carcinogens. PBDE were detected in the air, sediments, sewage sludge, soil or water. Studies have also confirmed their presence in fish, birds that feed on fish as well as in human blood, adipose tissue and breast milk. The aim of our study is expansion of knowledge about microbial degradation of PBDEs. We have studied aerobic degradation of PBDEs in sewage sludge from Hradec Králové and Modřice. PBDEs decrease was analyzed using gas chromatography with a single mass analyser operated in negative chemical ionization mode (GC-MS/NCI). We have found out that concentration of lower brominated congeners (BDE 28, BDE 47, BDE 49, BDE 66, BDE 85, BDE 99, BDE 100, BDE 153, BDE 154 and BDE 183) decreased by 67,1 % in sewage sludge from Hradec Králové or 29,7 % in sewage sludge from Modřice and concentration of BDE 209 (decaBDE) decreased by 76,5 % in sewage sludge from Hradec Králové or 83,5 % in sewage sludge from Modřice after 11 months of cultivation. We have studied also the ecotoxicity of sewage sludge using bioassays with the seeds of Lactuca sativa and bacteria Vibrio fischeri. The ecotoxicity of sewage sludge and mineral medium decreased using the bioassay with Lactuca sativa, but the ecotoxicity of mineral medium did not significantly change using the bioassay with Vibrio fischeri. Acknowledgements: This work was sponsored by grants MSMT NPVII GA CR 104/08/P188, MSM 6046137305 and internal grant of ICT 320 08 00 17.
2B06151,
Keywords:
polybrominated diphenylethers (PBDEs), sewage sludge, biodegradation, ecotoxicity 1. Úvod Polybromované difenylethery (PBDE), používané jako bromované retardátory hoření, představují jeden z problémů znečištění životního prostředí. Protože jsou strukturně podobné polychlorovaným bifenylům (PCB) a dichlordifenyltrichlorethanu (DDT), mají také podobné chemické vlastnosti – jsou perzistentní a lipofilní povahy, mají vysokou odolnost vůči kyselinám, zásadám a redoxním reakcím, snadno se sorbují na sedimenty a prachové částice, mohou být bioakumulovány v tukových tkáních živočichů. Jejich přítomnost byla prokázána u nižších i vyšších živočichů včetně člověka [1,2,3]. Vyrábějí se 3 komerční směsi PBDE – dekabromdifenylether (DeBDE), octabromdifenylether (OcBDE) a pentabromdifenylether (PeBDE) [4]. Rozvoj v jejich produkci nastal v 70. letech minulého století, kdy se začaly používat v elektronickém, automobilovém a textilním průmyslu. Od té doby jejich produkce a kontaminace životního prostředí neustále vzrůstá [1]. Na základě výsledků toxicity PeBDE a OcBDE směsí pro živé organismy je od roku 2004 zakázáno tyto směsi v zemích Evropské
unie používat [5]. DeBDE směs se používá nadále bez omezení, protože zatím nebyl shromážděn dostatek informací o jeho toxicitě, transformaci a bioakumulaci [6]. Nedávné studie poukazují na to, že DeBDE by mohl být debromován na toxičtější produkty fotodegradací pomocí slunečního záření nebo mikrobiální degradací [7,8]. Existuje studie dokazující, že níže bromované kongenery působí jako endokrinní disruptory u hormonů štítné žlázy [3]. Některé hydroxylované deriváty PBDE jsou strukturně podobné thyroxinu (T4), a proto mohou interferovat s transthyretinem, proteinem, kterým je thyroxin transportován, a ovlivňovat tak jeho rovnováhu v organismu [4]. V současné době je snahou mnoha vědeckých pracovišť vyvinout či zdokonalit metody, které by byly levnější a šetrnější k životnímu prostředí než standardní fyzikálně-chemické metody, které mnohdy nejsou šetrné k životnímu prostředí a jsou energeticky a finančně náročné. Jednou z možností je aplikace mikroorganismů schopných degradovat daný polutant do kontaminovaného prostředí. Hlavním cílem je rozšíření znalostí v oblasti biodegradace bromovaných retardátorů hoření, zejména PBDE, jak pomocí autochtonní mikroflóry přítomné v kalech kontaminovaných PBDE, tak konsorciem mikroorganismů z těchto kalů vyizolovaných. 2. Experimentální část a výsledky 2. 1 Mikrobiální degradace PBDE v odpadních kalech Po dříve provedeném monitoringu kontaminace a ekotoxicity kalů z ČOV, jsme k našemu experimentu zvolili kaly z ČOV Hradec Králové: ∑BDE = 605,2 ng/g (BDE 28, BDE 47, BDE 49, BDE 66, BDE 85, BDE 99, BDE 100, BDE 153, BDE 154 a BDE 183), BDE 209 = 685,3 ng/g) a z ČOV Modřice (Brno): ∑BDE = 205,2 ng/g (BDE 28, BDE 47, BDE 49, BDE 66, BDE 85, BDE 99, BDE 100, BDE 153, BDE 154 a BDE 183), BDE 209 = 1402,6 ng/g). K aerobní kultivaci autochtonní mikroflóry bylo použito 15 g kalu s 35 ml minerálního média ve dvou variantách: Varianta A: Bez přídavku kvasinkového extraktu. Varianta B: S přídavkem kvasinkového extraktu (zdroj kofaktorů, které si nejsou schopny mikroorganismy syntetizovat). Směs byla inkubována při teplotě 28 ºC na rotační třepačce při 130 RPM bez přístupu světla po dobu 3, 7 a 11 měsíců. Minerální médium, resp. kvasinkový extrakt byly pravidelně doplňovány. Úbytek PBDE byl stanoven po 3, 7 a 11 měsících kultivace, ekotoxicita byla stanovena na počátku experimentu, po 3 a 11 měsících kultivace. 2. 2 Analýza PBDE během aerobní degradace Extrakce kapalina – kapalina byla použita pro izolaci PBDE z minerálního média obahaceného kalem. Extrakčním činidlem byl isooktan. Směs byla třepána 2 hodiny, poté bylo rozpouštědlo vhodně naředěno, přeneseno do skleněné vialky a analyzováno. Analýza probíhala na plynovém chromatografu Agilent 6890 s hmotnostním detektorem Agilent 5975 Inert XL operujícím v módu negativní chemické ionizace (GC-MS/NCI). Podmínky analýzy byly následující: kapilární kolona DB-XLB (30 m (15 m pro analýzu BDE 209) × 0,25 mm × 0,1 µm); teplotní program 105 °C po dobu 2 min, 20°C/min do 300 °C, dále isotermě po dobu 5 min (pro analýzu BDE 209: 80 C po dobu 2 min, 20 °C/min do 280 C a 5 C/min do 320 C, dále isotermě po dobu 5 min); nosný plyn – helium, průtok 1,5 ml/min; nástřik 1 µl v nástřikovém módu pulsní splitless při teplotě 275 °C (pro analýzu BDE 209: 285 C). Chemická ionizace byla prováděna pomocí methanu, teplota interface, iontového zdroje a kvadrupólu byla 280 C, 150 C, respektive 150 C. Obrázek 1 zachycuje pokles celkové koncentrace 10 sledovaných kongenerů PBDE a kongeneru BDE 209 při aerobní degradaci autochtonní mikroflórou v kalu z ČOV Hradec Králové a v kalu z ČOV Modřice při kultivaci ve variantě A a variantě B.
Aerobní degradace PBDE v kalu Hradec Králové 800
700
ng/g sušiny
600
500
400
300
200
100
0
ΣBDE
BDE 209
Aerobní degradace PBDE v kalu Modřice 1600 1400
ng/g sušiny
1200 1000 800 600 400 200 0
ΣBDE
BDE 209
Obr. 1 Pokles celkové koncentrace 10 sledovaných kongenerů PBDE a kongeneru BDE 209 při aerobní degradaci autochtonní mikroflórou
2. 3 Testy ekotoxicity během aerobní degradace Ekotoxicita byla monitorována na počátku experimentu, po 3 a 11 měsících mikrobiální degradace pomocí tří testů: a) Test inhibice růstu kořene salátu hlávkového ve vodném výluhu - modifikovaná metoda: Kal byl oddělen od minerálního média centrifugací (5000 RPM, 3 min), médium bylo přečištěno pomocí filtrace a naředěno destilovanou vodou v poměru 1 : 3 a v takto připraveném extraktu byla stanovena míra inhibice růstu kořene. b) Test inhibice růstu kořene salátu hlávkového kontaktním testem - modifikovaná metoda: Kal oddělený od minerálního média byl vysušen (t = 50 °C), zhomogenizován pomocí třecí misky a naředěn kontrolním substrátem (směs pikýrovacího substrátu a říčního písku v hmotnostním
poměru 3 : 7) v poměru 1 : 7. Míra inhibice růstu kořene byla stanovena ve 40 g této směsi za použití 9 semen salátu hlávkového. c) Stanovení inhibičního účinku na světelnou emisi bakterie Vibrio fischeri: Bylo použito minerální médium připravené postupem uvedeným v bodě a).
Základem vyhodnocení u testů inhibice růstu kořene salátu hlávkového je průměrná délka kořene zjištěná v testovaném vzorku a kontrole. Míra inhibice se počítá pro podle vzorce:
I I I>0 I<0 Lcelk,c Lcelk,v
Lcelk,c
Lcelk,v
Lcelk,c
100
inhibice nebo stimulace růstu kořene [%] inhibice růstu kořene stimulace růstu kořene průměrná délka kořene v kontrole [mm] průměrná délka kořene ve vzorku [mm]
Kontrolní (referenční) roztok pro test inhibice růstu kořene ve vodném výluhu byl připraven dle ISO 11269-1,1993. Jako kontrola pro kontaktní test byla použita směs pikýrovacího substrátu a říčního písku v hmotnostním poměru 3 : 7. Stanovení inhibičního účinku na světelnou emisi bakterie Vibrio fischeri bylo provedeno dle ČSN EN ISO 11348-2, 2000. Relativní inhibice H je definována jako:
H H I Iref
1
I I ref
100
relativní inhibice luminiscence [%] intenzita světla produkovaného indikátorovými bakteriemi ve zkumavce s testovaným vzorkem intenzita světla ve zkumavce s referenčním (netoxickým) vzorkem
Obrázek 2 zachycuje změny ekotoxicity minerálního média během degradačního pokusu. Médium bylo naředěno destilovanou vodou v poměru 1:3.
Relativní inhibice luminiscence bakterie Vibrio fischeri
100
RIL / %
80
60
40
20
0
kal Hradec Králové
kal Modřice
Inhibice růstu kořene salátu hlávkového ve vodném výluhu 100
80
I/%
60
40
20
B 11 po
11 po
kal Hradec Králové
m ěs íc íc h
A m ěs íc íc h
m ěs íc íc h 3 po
po
3
m ěs íc íc h
pů vo dn í
A
B
0
kal Modřice
Obr. 2 Změny ekotoxicity minerálního média během degradačního pokusu po naředění destilovanou vodou v poměru 1:3.
Obrázek 3 zachycuje změny ekotoxicity kalu během degradačního pokusu. Kal byl naředěn kontrolním substrátem (směs pikýrovacího substrátu a říčního písku v hmotnostním poměru 3 : 7) v hmotnostním poměru 1:7.
Kontaktní test se semeny salátu hlávkového 100
80
I/%
60
40
20
B 11 po
11 po
kal Hradec Králové
m ěs íc íc h
A m ěs íc íc h
m ěs íc íc h 3 po
po
3
m ěs íc íc h
pů vo dn í
A
B
0
kal Modřice
Obr. 3 Změny ekotoxicity kalu během degradačního pokusu po naředění kontrolním substrátem v poměru 1:7.
3. Závěr 3. 1 Analýza PBDE během aerobní degradace Při aerobní degradaci pomocí autochtonní mikroflóry se nám podařilo snížit celkovou koncentraci 10 kongenerů PBDE (BDE 28, BDE 47, BDE 49, BDE 66, BDE 85, BDE 99, BDE 100, BDE 153, BDE 154 a BDE 183) a koncentraci kongeneru BDE 209. V případě kalu z ČOV Hradec Králové došlo po 11 měsících k poklesu 10 kongenerů PBDE o 67,1 % a kongeneru BDE 209 o 76,5 % ve variantě B. V případě kalu z ČOV Modřice byl zaznamenán po 11 měsících úbytek 10 kongenerů PBDE o 29,7 % a kongeneru BDE 209 o 83,5 % ve variantě B. 3. 2 Změny ekotoxicity během aerobní degradace Na základě provedených testů ekotoxicity s kaly a minerálními médii po aerobní degradaci můžeme říci, že došlo k poklesu ekotoxicity testovaných kalů (na základě kontaktního testu se semeny salátu hlávkového). V případě ekotoxicity minerálních médií test inhibice růstu kořene salátu hlávkového v minerálním médiu svědčí o poklesu ekotoxicity média během degradace, avšak test inhibičního účinku na luminiscenci bakterie Vibrio fischeri vykazuje spíše mírný nárůst ekotoxicity média během degradace. Protože kal obsahuje také jiné toxické látky (těžké kovy, PCB, PAU, DDT, ...) je možné, že docházelo také k degradaci těchto látek a některé produkty degradace mohly vést ke zvýšení jeho ekotoxicity. Poděkování Autoři děkují Dr. Ing. Monice Stavělové za pomoc při získání vzorků kontaminovaných kalů a sedimentů a za finanční podporu projektů MŠMT NPVII 2B06151, GA ČR 104/08/P188, MSM 6046137305 a interní grant 320 08 00 17.
Použitá literatura [1] U.S. Department of Health and Human Services, Public Health Service, Agency for Toxic Substances and Disease Registry (2004): Toxicological profile for polybrominated biphenyls and polybrominated diphenyl ethers [2] RAHMAN, F., LANGFORD, K. H., SCRIMSHAW, M. D., LESTER, J. N. (2001): Polybrominated diphenyl ether (PBDE) flame retardants. The Science of the Total Environment 275: 1-17 [3] DE WIT, C. A. (2002): An overview of brominated flame retardants in the environment. Chemosphere 46: 583-624 [4] HARDY, M. L. (2002): The toxicology of the three commercial polybrominated diphenyl oxide (ether) flame retardants. Chemosphere 46: 757-777 [5] Official Journal of the European Union L 42: 45 (2003) [6] Uptake of the risk assessment of bis(pentabromophenyl)ether (decabromodiphenylether). Final environmental draft of May 2004, 114 (2004) [7] SODERSTROM, G., SELLSTROM, U., DE WIT, C. A., TYSKLIND, M. (2004): Photolytic debromination of decabromodiphenyl ether (BDE 209). Environ. Sci. Technol. 38: 127-132 [8] HE, J., ROBROCK, K. R., ALVAREZ-COHEN, L. (2006): Microbial reductive debromination of polybrominated diphenyl ethers (PBDEs). Environ. Sci. Technol. 40: 4429-4434
