Mezőgazdaságtudományi Kar
A szarvasmarha növekedési hormon és növekedési hormon receptor gének AluI polimorfizmusának vizsgálata magyar holstein-fríz bikanevelő állományban
Doktori értekezés
Kovács Katalin
Gödöllő 2006
1
A doktori iskola Megnevezése:
Állattenyésztés-tudományi Doktori Iskola
Tudományága:
Mezőgazdaságtudomány
Vezetője:
Prof. Dr. Horváth László, D.Sc. Tanszékvezető egyetemi tanár Szent István Egyetem, Mezőgazdaság- és Környezettudományi Kar, Halgazdálkodási Tanszék
Témavezető:
Prof. Dr. Fésüs László, D.Sc. Tudományos tanácsadó, egyetemi magántanár Állattenyésztési és Takarmányozási Kutatóintézet
………………………
………………………
a programvezető jóváhagyása
a témavezetők jóváhagyása
2
Tartalomjegyzék 1
Bevezetés ____________________________________________ 5
2
Irodalmi áttekintés_____________________________________ 9
2.1
A növekedési hormon ___________________________________9
2.1.1 2.1.2 2.1.2.1 2.1.2.2 2.1.2.3 2.1.2.4 2.1.2.5 2.1.2.6 2.1.2.7 2.1.2.8 2.1.2.9
2.2
A növekedési hormon szerkezete és szintézise ___________________ 9 A növekedési hormon hatásai _______________________________ 11 Általános metabolikus hatások__________________________ 11 Laktogenikus hatás___________________________________ 14 A takarmányfelvételre gyakorolt hatás ___________________ 19 Egyéb vérparaméterekre gyakorolt hatás __________________ 20 Kondícióra gyakorolt hatás ____________________________ 20 BST hatása a kezelt tehenek borjaira _____________________ 22 Reprodukciós hatás __________________________________ 22 GH hatása a fertőző betegségek (tőggyulladás) gyakoriságára _ 25 A növekedési hormon és az immunrendszer _______________ 26
A növekedési hormon gén ______________________________29
2.2.1 2.2.1.1 2.2.1.2 2.2.1.3 2.2.1.3.1 2.2.1.3.2 2.2.1.3.3 2.2.1.4
Ismert polimorfizmusok ___________________________________ 30 TaqI polimorfizmus __________________________________ 30 MspI polimorfizmus__________________________________ 32 AluI polimorfizmus __________________________________ 34 Az AluI polimorfizmus és a szomatotropin elválasztás ____ 34 Az AluI polimorfizmus és a tejtermelés ________________ 36 Az AluI polimorfizmus és a hústermelés _______________ 38 Egyéb polimorfizmusok _______________________________ 40
2.3
Növekedési hormon receptor ____________________________41
2.4
Növekedési hormon receptor gén ________________________42
3
Anyag és Módszer ____________________________________ 45
3.1
Állatok, mintavétel ____________________________________45
3.2
A genomiális DNS izolálása _____________________________46
3.3
PCR-RFLP módszer ___________________________________47
3.3.1 3.3.2 3.3.2.1 3.3.2.2 3.3.3 3.3.3.1 3.3.3.2 3.3.4 3.3.5 3.3.6
A polimeráz láncreakció előkészítése _________________________ 47 Használt primerek ________________________________________ 47 GH gén, AluI polimorfizmus (L/V lókusz) ________________ 47 GHR gén, AluI polimorfizmus (A/G lókusz)_______________ 48 A PCR reakció___________________________________________ 49 GH gén, AluI polimorfizmus (L/V lókusz) ________________ 49 GHR gén, AluI polimorfizmus (A/G lókusz)_______________ 50 Restrikciós emésztés (RFLP)________________________________ 51 Az elválasztó mátrix előkészítése az elektroforézishez ____________ 51 Elektroforézis ___________________________________________ 51
3
3.4
Adatbáziskezelés és statisztikai vizsgálatok ________________52
3.4.1 3.4.1.1 3.4.1.2 3.4.1.2.1 3.4.1.2.2
4
Eredmények és megbeszélésük __________________________ 56
4.1
Allél- és genotípus-megoszlási értékek ____________________56
4.1.1 4.1.1.1 4.1.2 4.1.2.1
4.2
Statisztikai analízis _______________________________________ 53 Populációegyensúly-vizsgálatok ________________________ 53 Hatásvizsgálat ______________________________________ 54 GLM (általános lineáris modell) ______________________ 54 Dominancia és additív hatás _________________________ 55
GH gén, AluI polimorfizmus (L/V lókusz) _____________________ 56 Populációgenetikai számítások _________________________ 60 GHR gén, AluI polimorfizmus (A/G lókusz) ___________________ 64 Populációgenetikai számítások _________________________ 66
Statisztikai analízis ____________________________________68
4.2.1 Leíró statisztika __________________________________________ 68 4.2.2 Hatásvizsgálat ___________________________________________ 73 4.2.2.1 A növekedési hormon gén AluI polimorfizmusa és a vizsgált tulajdonságok közötti összefüggés _______________________________________ 73 4.2.2.1.1 Többváltozós variancianalízis eredményeinek összehasonlítása73 4.2.2.1.2 A független változók hatásai _________________________ 77 4.2.2.1.3 A genotípusátlagok összevetése ______________________ 79 4.2.2.2 A növekedési hormon receptor gén AluI polimorfizmusa és a vizsgált tulajdonságok közötti összefüggés _______________________________________ 87 4.2.2.2.1 A többváltozós variancianalízis eredményeinek összehasonlítása 87 4.2.2.2.2 A független változók hatásai _________________________ 91 4.2.2.2.3 A genotípusátlagok összevetése ______________________ 93
5
Következtetések és javaslatok ___________________________ 99
6
Új tudományos eredmények ___________________________ 102
7
Összefoglalás _______________________________________ 104
8
Summary __________________________________________ 109
9
Irodalomjegyzék_____________________________________ 114
10
Köszönetnyilvánítás ________________________________ 139
11
Rövidítések jegyzéke _______________________________ 141
4
Bevezetés
1 BEVEZETÉS A kérődzők teje, mint az emberi szervezet számára nélkülözhetetlen fehérjék, ásványianyagok és vitaminok egyik legfontosabb állati eredetű forrása a kezdetektől kiemelt szerepet játszott az ember táplálkozásában. A tehéntej mennyiségének és összetételének az ember igényei szerinti befolyásolása és alakítása a mindenkori tenyésztői munka központi része volt. A hagyományos tenyésztési eljárások mellett a tejtermelés és az egyéb kiemelten
fontos
gazdasági
értékmérő
tulajdonságok
fejlesztése
meglehetősen lassú ütemben haladhatott és a különböző tulajdonságok között fennálló korrelációk miatt bizonyos korlátok között fejlődve komplex nézőpontot igényelt. Földünk lakosságának gyors ütemű növekedésével egyre nagyobb
az
igény
a
magas
fehérjetartalmú,
ugyanakkor
könnyen
„előállítható” és „hozzáférhető” táplálékforrás iránt. A tej, illetve a nagy változatosságot mutató tejtermékek minőségi és hatékony előállítása fontos részét képezhetik az élelmezési gondok megoldásának. Az Európai Unió egyre több tagállamában a minőségi tejtermelést ösztönzik, a tej fogyasztás és feldolgozás szempontjából előnyös összetételének (tejfehérje-, tejzsír tartalom) pénzbeli támogatásával. A tejtermelés bonyolult fiziológiai háttere miatt a termelt tej mennyiségét és összetételét számos endogén és exogén tényező befolyásolhatja. Az eredményes tenyésztői munka titka mindkét faktorcsoport optimalizálása a hatékony tejtermelés érdekében. Tehát a fenotípus kialakításáért felelős genotípus x környezet interakció tényezői egyaránt fontosak, ha a fenotípusban maradandó változásokat szeretnénk elérni. A környezeti feltételek javítása, illetve az állatok igényei szerint való alakítása a helyi 5
Bevezetés vezetők feladata és sok esetben a gyakorlati tenyésztés legnagyobb buktatója is. A genotípus fokozatos átalakítása, illetve a kedvező genotípusú állatok megtartására irányuló szelekció egészen a múlt század 80-as éveivel bezárólag az igen sok időt igénylő és sokszor nem eléggé hatékony hagyományos tenyésztési eljárások segítségével történt. Az 1980-as években a rekombináns DNS technológiák elterjedésével már lehetővé vált, hogy a hagyományos
technológiát
molekuláris
genetikai
módszerekkel
is
kiegészítsék. A tejelő tenyészetekben a tejtermelésre irányuló elsődleges szelekció miatt a laktáció élettani hátterének megértése kiemelkedő fontosságú. A tőgymirigy kifejlődése és tejelválasztó működése endokrin szabályozás alatt áll. A szteroidok és a fehérje hormonok (mint pl. a növekedési hormon és prolaktin) fő szerepet játszanak ebben a szabályozásban. Ezen fehérjehormonok elválasztási mintája genetikailag determinált. A tejtermelés, ha csak az endogén faktorokat vesszük figyelembe, tipikusan poligénes tulajdonság, amelyet számos genetikai lókusz szabályoz. Ezért a laktációs teljesítmény előrejelzésére olyan jelölő géneket keresnek, melyek szoros kapcsoltságot mutatnak a tejelválasztást kódoló génhelyekkel. A jelölő gén módszere azt jelenti, hogy az adott génekhez közeli, vagy éppen a génen belüli régióban olyan DNS markereket próbálnak azonosítani, amelyek kapcsoltan öröklődnek az adott génnel és esetleg szerepet játszanak a vizsgált kvantitatív tulajdonság kifejlődésében vagy fiziológia folyamatainak szabályozásában. A növekedési hormon körül az elmúlt évtizedekben kialakult viták nagyszámú kutatást kezdeményeztek ezen a téren (lásd 2.1 fejezet). A hormonnak a tejtermelés fokozása céljából való adagolása ellen sikeres kampány indult, olyannyira, hogy Európában ma állat- és humán 6
Bevezetés egészségügyi szempontok miatt tilos exogén eredetű szomatotropint juttatni állati szervezetbe. Ennek kissé ellentmondóan, az Egyesült Államokban nem tiltott a használata, sőt viszonylag nagy tételben folyik előállítása rekombináns baktérium-törzsekkel. Az Európában hatályban levő tilalom miatt is fontos lenne tehát a szervezet saját tartalékait mozgósítani és hasznosítani ezen a téren. Dolgozatom célja, hogy a szarvasmarha növekedési hormon és növekedési hormon receptor gént, mint a tejtermelés lehetséges genetikai markereit vizsgálva kapcsolatot keressek a tejelválasztás, tejtermelés és a hormon, valamint a receptora, illetve az ezeket kódoló gének különböző változatai között. Célkitűzéseim részletesen kifejtve a következők: ¾ A szarvasmarha növekedési hormon gén és a növekedési hormon receptor gén ismert polimorfizmusainak kimutatására szolgáló módszer kidolgozása
a
hazai
körülményekre
és
a
lehetőségek
figyelembevételével, a nemzetközi irodalomban leírt módszerek alapján.
E
módszernek
a
molekuláris
genetikai
laboratóriumi
gyakorlatban való pontos és megbízható alkalmazása. ¾ A magyar holstein-fríz törzsállomány bikanevelő teheneinek genetikai vizsgálata a növekedési hormon génre és a növekedési hormon receptor génre
nézve.
A
génváltozatok
előfordulási
gyakoriságának
feltérképezése a vizsgált reprezentatív tehén állományban. Ezen kívül az egyes genotípusok (illetve növekedési hormon/hormon receptor polimorfizmusok), valamint a tejtermelés és tejösszetétel - mint 7
Bevezetés gazdaságilag fontos tulajdonság - közötti genetikai kapcsoltság, illetve összefüggés keresése; illetve az irodalmi adatok alapján az eddig közölt külföldi eredményekkel való összevetése. ¾ A növekedési hormont és receptorát kódoló gén polimorfizmusai és a szaporodásbiológiai tulajdonságok és adatok (első elléskori életkor, két ellés közötti idő) közötti összefüggés, illetve genetikai kapcsoltság keresése holstein-fríz bikanevelő tehén állományokban.
8
Irodalmi áttekintés
2 IRODALMI ÁTTEKINTÉS 2.1 A növekedési hormon 2.1.1 A növekedési hormon szerkezete és szintézise A növekedési hormon (GH; STH, szomatotropin) egy 190, illetve 191 aminosavból álló egyszerű polipeptid hormon. A prekurzor molekula (melyet 217 aminosav épít fel) alternatív érési folyamatától és a két eltérő lánctól (α és β) függően az N terminális végén alanint vagy fenilalanint tartalmaz (WOOD és mtsai, 1989) és megközelítőleg 22 kDa súlyú. Fiziológiai állapotban két hormon kapcsolódik egymáshoz két diszulfid hídon keresztül, egy dimert képezve (WALLIS, 1992). A szomatolaktogenikus hormonok családjába tartozik, melynek tagja még a prolaktin, a placentáris laktogén és számos növekedési faktor is (IGFI, IGFII, stb.) (COSMAN és mtsai, 1990). Ezen fehérjecsaládba tartozó anyagok receptorainak struktúrája igen hasonló (BURTON és mtsai, 1994). A felsorolt hormonok szövetspecifikus
szintézisük
ellenére
számos
evolúciós,
strukturális,
immunológiai és biológiai folyamat résztvevői és mindegyik különböző mértékű laktogenikus, szomatotropikus, metabolikus és immunomodulációs hatással rendelkezik (BERCZI és NAGY 1987; ARKINS és mtsai, 1993). A
növekedési
hormon
szerkezetében,
biológiai
szempontból
is
feltételezhetően nagy jelentősséggel bíró, fajok közötti különbségek találhatók. A szarvasmarha növekedési hormon (bovine GH; bGH) hasonlít a juh növekedési hormonra, de több, mint 10%-ban eltér a sertés hormontól, sőt
9
Irodalmi áttekintés mintegy 35-40%-os eltérés tapasztalható, ha a hormon humán változatához hasonlítjuk (WALLIS, 1973). A növekedési hormon termelődése szövetspecifikus, a hipofízis elülső lebenyében, az úgynevezett adenohipofízisben található acidofil sejtek (még pontosabban a szomatotróf sejtek) szintetizálják, melyek a Pit-1 nevű transzkripciós
faktor
hatására
aktiválódnak
(THOMAS,
1998).
A
növekedésért felelős hormonális kaszkádban több, a hipotalamuszban, a hipofízisben, valamint a perifériális szövetekben termelődő hormon szerepel. A növekedési hormon közbülső faktorként vesz részt ebben a folyamatban (ISAKSSON és mtsai, 1987). A szomatotróf sejtek hormonszekréciója nem állandó, az elválasztás ütemét két ellentétes hatású hipotalamikus neuropeptid hormon szabályozza, az egyik a serkentő hatású GHRF (GH-releasing factor; növekedési hormon elválasztó faktor), a másik a gátló szomatosztatin (SST) (GH-release inhibiting factor; növekedési hormon elválasztást gátló faktor) (BAILE és BUONOMO, 1987; GIUSTINA és VELDHUIS, 1998). A szekréciós mintázat ivari dimorfizmust mutat, azaz az összes vizsgált faj esetében a hormonprodukció eltérő volt a két különböző ivarban (GATFORD és mtsai, 1997). A glükokortikoidok
és a pajzsmirigy hormon, mint a
szomatotropin termelés két fontos fiziológiai regulátora, szinergista módon serkentik a hormon szintézisét (MARTIAL és mtsai, 1977), a sejtekben az mRNS felhalmozódását (WEGNEZ és mtsai, 1982) és a növekedési hormon gén transzkripcióját (SPINDLER és mtsai, 1982). A DNS transzkripció szintjén a Pit-1 tarnszkripciós faktor felelős a hormon expressziójának szabályzásáért (THEILL és KARIN, 1993).
10
Irodalmi áttekintés Összességében tehát, neurotranszmitterek, hormonális, metabolikus, takarmányozási és környezeti stimulusok komplex hálózata szabályozza a növekedési hormon hipofizeális elválasztását (TAYLOR, 2001)
2.1.2 A növekedési hormon hatásai A növekedési hormon legfontosabb hatása, hogy közvetlenül, vagy közvetett módon serkenti a posztnatális testnövekedést, stimulálja a sejtnövekedést és –differenciálódást, valamint a csontok és a különböző lágy részek (izom, kötőszövet, zsigerek) fejlődését. A növekedésre gyakorolt közvetett hatását a szomatomedinek
útján
váltja
ki.
A
szomatomedinek
a
májban
(ZOMBORSZKYNÉ és mtsai, 1994) és újabb eredmények szerint talán az összes szövetben (LE ROITH és mtsai, 2001) termelődő, polipeptid szöveti hormoncsoport. Közülük legismertebb a humán szomatomedin C, melyet inzulinszerű növekedési faktorként (IGF) tartanak számon, éppen az inzulinnal rokon hatások alapján (ZOMBORSZKYNÉ és mtsai, 1994). A szomatotropin és az IGF-I általában anabolikus hormonok. A szomatolaktogenikus
hormoncsalád
tagjaként
a
hormon
ezenkívül
rendelkezik még in vivo inzulinszerű és tejelválasztást serkentő hatással is. Speciális gének transzkripcióját szabályozza, befolyásolja mindhárom tápanyag (zsír, szénhidrát, fehérje) intermedier anyagcseréjét, a sejtek túlélését, sőt módosíthatja a szervezet immunfunkcióit is (ISAKSSON és mtsai, 1985). 2.1.2.1 Általános metabolikus hatások A rekombináns DNS technikák elterjedése és fejlődése tette lehetővé a megfelelő mennyiségű rekombináns szarvasmarha növekedési hormon 11
Irodalmi áttekintés (recombinant bovine growth hormone; rbGH) előállítását. Ennek segítségével alkalom nyílott a hormon krónikus metabolikus hatásának és a tápanyagok átcsoportosításáról szóló hipotézis ellenőrzésére a gyakorlatban is. Ezen technológia ötlete először a ‘60-as években merült fel, amikor a tudósok felfedezték, hogy a mikrobiális sejtek felhasználhatók nagy mennyiségű fehérje termelésére. Ezt követően sok kísérlet során a bakteriális DNS-be sikerült bejuttatni egy meghatározott emlős DNS-szakaszt (gént). Az így átalakított baktérium pedig ezután előállította a beillesztett gén által kódolt emlős fehérjét is. A ‘70-es évek végén sikerült a szarvasmarha növekedési hormonjának génjét Escerichia coli-ban klónozni és a ‘80-as évek elején már nagy mennyiségben elő tudták állítani a rekombináns szarvasmarha növekedési hormont. A szomatotropin akut metabolikus hatásai az inzulinhatásokat utánozzák: emelkedik a glükóz és a fehérje felvétel (YOKOTA és mtsai, 1998), a lipolízis folyamata pedig gátlás alá kerül. Ezzel ellentétben, krónikus hatásai az inzulinhatások ellentetjei: hiperglikémia, hiperinzulinémia, csökkent perifériális glükóz felhasználás és végül fokozott lipolízis. A növekedési hormon valószínűleg nincs közvetlen hatással az inzulinszintre, de csökkenti a perifériális szövetekben az inzulin glükóz felhasználást elősegítő hatását. A hormon szintjének krónikus emelkedése feltehetően összefüggésben van az inzulinrezisztencia kialakulásával. A szomatotropin fiziológiai hatásainak kifejlődéséhez órák, illetve napok szükségesek. Egy kísérlet során májsejt membránokat izoláltak és megállapították, hogy a GH meglehetősen lassan és tökéletlenül disszociál. Ez a jelenség tehető felelőssé hosszú távú növekedésserkentő hatásaiért (BADINGA és mtsai, 1991; TAYLOR, 2001).
12
Irodalmi áttekintés A növekedési hormon sejtszintű hatásmechanizmusának egyik lényeges eleme az adenil cikláz gátlása és ezáltal az intracelluláris cAMP (ciklikus adenil-monofoszfát) szint csökkentése. Az azonban még mindeddig nem teljesen tisztázott kérdés, hogy a nukleotid anyagcsere ily módon való befolyásolásával milyen kapcsolatban vannak a hormon különböző hatásai (ISSAKSON és mtsai, 1985). A
szénhidrát
anyagcserében
a
növekedési
hormon
a
szövetek
inzulinválaszának befolyásolása révén gátolja a májban, az izomban és a zsírszövetben a sejtek glükózfelvételét és felhasználását. A szénhidrát felhasználás
gátlása
útján
hyperglikémiát
okoz.
Védi
a
sejtek
glikogéntartalékát (ZOMBORSZKYNÉ és mtsai, 1994). Az így „tartalékolt” glükóz
egy
része
egyéb
anyagcsere-folyamatok
során
kerül
majd
felhasználásra, pl. fokozódik a tejelválasztás (ETHERTON és BAUMAN, 1998). A hormon a fehérje anyagcserére is anabolikus hatású. Fokozza az aminosavak belépését a sejtbe, serkenti a fehérjeszintézist (különösen a vázizomzatban), gátolja az intracelluláris fehérjebontást (ZOMBORSZKYNÉ és mtsai, 1994). Közvetett módon, az IGF-I faktoron keresztül hat a teljes test fehérje tartalékainak szabályozására. Kalóriaszegény körülmények között a fehérjetartalékokat a zsírdepók rovására igyekszik megőrizni. Az előbbiekből következően tehát, a lipidanyagcserét a lebontás irányába tolja el. A GH közvetlenül, egyrészt a növekedési hormon receptor segítségével, szabályozza az adipocita sejtek differenciálódását, másrészt aktivál egy hormon-szenzitív lipázt, az adenil-ciklázt, és e folyamatok végeredményeként élénkíti a lipolízist (TAYLOR, 2001). Hatására így fokozódik
a
trigliceridek
mobilizálása
és
a
zsírsavégetés.
Ennek
eredményeként kóros esetben, a májban fokozódik a ketonanyagok 13
Irodalmi áttekintés termelődése (ZOMBORSZKYNÉ és mtsai, 1994). In vitro kísérletek eredményei szerint a növekedési hormon inzulin antagonistaként működik a zsíranyagcsere
tekintetében.
Az
acetilkolin-CoA-karboxiláz
enzim
blokkolásával gátolja a lipogenezist a zsírszövetben (VERNON, 1989). A vér magas nem észterifikált zsírsavtartalma (non-esterified fatty acid; NEFA) egy idő után blokkolja a növekedési hormon és az adipociták által termelt leptin szekrécióját (feed-back hatás) (TAYLOR, 2001). A laktáció korai szakaszában (első heteiben) kialakuló negatív energiamérleg is különböző endokrin változások következménye, melyek az ún. késztetett lipid metabolizáció (forced lipid metabolisation) folyamatát okozzák. Ebben az időszakban emelt glukagon, alacsony inzulin koncentráció jellemzi az állatot, ugyanakkor a GH változatlan, illetve lassan emelkedő szintet mutat (HUSZENICZA és mtsai, 2004). A növekedési hormon elválasztás, valamint az elraktározott zsír mennyisége tehát összefügg egymással. Az elhízás szoros kapcsolatban van a vér csökkent GH szintjével és a sejtek GH szekretogógokra adott csökkent válaszreakciójával. Ennek természetesen a fordítottja is igaz, vagyis a kis testsúly magasabb szomatotropin szintet és megemelkedett lipolízist feltételez (POMBO és mtsai, 1999). VERNON és mtsai. (1998) megállapításai szerint a szomatotropin krónikus metabolikus hatását egyaránt kifejti mind a gén transzkripció szintjén, mind pedig a PKC izoformák (a proteinkináz–C egy szerin-treonin proteinkináz, amely a célsejtben az adott fehérjéket foszforilálja, nevét, Ca2+ függősége miatt kapta) anyagcserébe való bevonásával.
14
Irodalmi áttekintés 2.1.2.2 Laktogenikus hatás A szomatotropin tejelválasztást serkentő hatását illetően az első felfedezés orosz kutatók nevéhez kötődik, akik bebizonyították, hogy a hipofízis kivonatot tartalmazó injekció hatására megnövekedett a tejhozam (ASIMOV és KROUZE, 1937). A szarvasmarha növekedési hormon laktogén hatásmechanizmusára vonatkozó első feltételezések szerint a hormon valószínűleg az emlőmirigy alveo-lobuláris állományának fejlődését segíti (ASIMOV és KROUZE, 1937). Majd HUTTON (1957) azt valószínűsítette, hogy a növekedési hormon közreműködésével a tejmirigy számára elérhetőbbé válnak a tej különböző alapanyagai. Ezt igazolta egy későbbi tanulmány is, amely szerint a szomatotropin a tőgy vérellátásának élénkítésével, valamint a glükóznak és egyéb molekuláknak a tejelválasztás szempontjából elérhetőbbé tételével hat a tejhozam növelésére (ETHERTON és BAUMAN, 1998). Később az a nézet vált általánossá, hogy a hormon a zsírszövetben akut lipolízist okoz (ld. metabolikus hatások). Ezt támasztotta alá az a tény is, hogy ha rövid ideig adtak az állatoknak szarvasmarha növekedési hormont (rbGH), akkor az akut módon megemelte a kezelt tehenek vérében a szabad zsírsavak koncentrációját (BAUMAN és MCCUTCHEON, 1986). A vér magas GH szintje tehát serkenti a glükoneogenezist, a lipolízist és így a tejtermelést. A különböző genetikai képességű, a laktáció eltérő fázisában levő és különböző tápanyag-ellátottsági szintű teheneken vizsgálták a növekedési hormon élettani szerepét. A hormon feltehetően krónikus (homeoretikus) módon szabályozza az anyagcsere folyamatokat azáltal, hogy a felszívódott tápanyagok a tejtermelés érdekében használódjanak fel (BAUMAN és CURRIE 1980; HART és mtsai, 1980; HART 1983). Ez az elmélet különösen a nagy termelésű tehenekre igaz és sokan ki is mutatták, hogy az 15
Irodalmi áttekintés ilyen magas teljesítményre képes állatoknak adott szarvasmarha növekedési hormon 6-35 %-kal is megemelheti a tejtermelést (PEEL és mtsai, 1983; RICHARD és mtsai, 1985). Ehhez kapcsolódóan és ezzel egyidőben BARNES és mtsai. (1985) is szoros összefüggést mutattak ki a növekedési hormon szint emelkedése, valamint a tejtermelésre vonatkozó genetikai örökítőképesség között. Az 1980-as években, a DNS technikák elterjedése és fejlődése tette lehetővé a megfelelő mennyiségű rbGH előállítását, ami azután alkalmat adott a növekedési hormon tejelválasztó hatásának gyakorlati bizonyítására. Az első olyan tanulmány, amely növekedési hormonnal kezelt nagy termelésű tehenek drámai módon megemelkedett tejtermeléséről számolt be, 1982-ben született az Amerikai Egyesült Államokban (BAUMAN és mtsai, 1982). Ezt követően
a
szomatotropinnal
kapcsolatos
kutatások
száma
erősen
megnövekedett. A nagy népszerűség oka az volt, hogy az rbGH készítmények a gyors genetikai előrehaladást utánozták abban az értelemben, hogy hatásukra számottevően nőtt a tejtermelés és a takarmányfelvétel (MICHEL és mtsai, 1990). Egy jelentős különbséget találtak azonban a hipofízis eredetű és a rekombináns
szarvasmarha
szomatotropin
között.
A
rekombináns
növekedési hormon molekulák ugyanis teljesen azonos méretűek voltak, a hipofízis kivonat pedig a molekulák méretére nézve erősen heterogén volt (WINGFIELD és mtsai, 1987). Ez a felfedezés azt sugallja, hogy in vivo, vagyis a valóságban, a hormonnak többféle formája létezik, amelyek valószínűleg élettani hatásukat tekintve is eltérnek egymástól. BAUMAN és mtsai. (1985) összehasonlították a rekombináns és a hipofízis eredetű hormon tejelválasztó hatását. Megállapították, hogy a hipofízis eredetű hormon kevésbé növelte a tejtermelést, mint a mesterségesen előállított, rekombináns 16
Irodalmi áttekintés szomatotropin. TOUTAIN és mtsai. (1993) továbbá azt is bebizonyították, hogy a növekedési hormon két formája igen sok dózisfüggő gyógyszertani paraméter (eloszlási térfogat (l/kg), clearance (l/kg/óra)) tekintetében szignifikánsan különbözik egymástól. Ezek a különbségek feltehetően fennállnak a különböző gyártóktól származó rekombináns növekedési hormon termékek között is, hiszen apró különbségek azért vannak az egyes termékek aminosav összetételében (WINGFIELD és mtsai, 1987; BAUMAN és VERNON 1993). Molekuláris genetikai kísérletek eredményei szerint a szarvasmarha növekedési hormont kódoló gén polimorf (lásd 2.2.1.) (ROCHA és mtsai, 1992; ZHANG és mtsai, 1993). Valószínűnek tűnik az is, hogy a növekedési hormon receptorai is különbözőek. Ez az eltérés közrejátszik abban, hogy az egyszerű
rekombináns
különbözhetnek
szarvasmarha
egymástól
a
szomatotropin
szövet-specifikusság
készítmények terén
és
hatásmechanizmusban egyaránt (BURTON és mtsai, 1994). A korábbi elmélettel szemben, miszerint ez a tejhozamnövelő hatás minden esetben létrejön GH receptor nélkül is, kiderült, hogy a növekedési hormon receptor jelenléte a tőgyszövetben elengedhetetlen a hatás teljes kifejlődéséhez (GLIMM és mtsai, 1990). A
laktáció
csúcsa
után
adott
exogén
rekombináns
szarvasmarha
szomatotropin és növekedési hormon elválasztó faktor (growth hormone releasing factor; GRF) növeli a tejtermelést (az rbGH nagyobb mértékben) laktáló állatoknál. Ezt egy kisebb és valamivel később bekövetkező szárazanyagfelvétel növekedés követi hosszú távú (6 hónap) kezelések esetében (LACASSE és mtsai, 1991a,b). BAUMAN és mtsai. (1985) vizsgálatai szerint, rekombináns szarvasmarha szomatotropin kezelés hatására dózistól függően 23-41%-kal nőtt az átlagos 4% tejzsírra korrigált 17
Irodalmi áttekintés tejhozam (fat corrected milk; FCM). A tejtermelés növekedés azonban csupán 16% volt hipofízis eredetű hormon használatakor. Ezt követően még igen sok kísérlet igazolta a rekombináns szarvasmarha növekedési hormon tejelválasztást segítő hatását. Ezekben az egyszerű laktációs kísérletekben rbGH injekció hatására általában 6 és 30% közötti értékkel nőtt a tejtermelés (összefoglalták MCBRIDE és mtsai, 1988; BURTON és MCBRIDE, 1989; BAUMAN és mtsai, 1994). A legtöbb esetben a kezelés megkezdését követően 2-3 napon belül megemelkedett a tejhozam és a hatására a laktáció perzisztenciája is javult (JOHNSSON és HART, 1986; PEEL és BAUMAN, 1987; MCBRIDE és mtsai, 1988). A korábbi tanulmányokban az elért tejtermelési adatok napi gyakorisággal beadott hormoninjekciókat tettek szükségessé (PEEL és BAUMAN 1987; JOHNSSON és HART 1986; MCBRIDE és mtsai, 1988). Azóta kifejlesztettek olyan, retard hormonkészítményeket, amelyeket csupán kéthetente vagy havonta egyszer kell a bőr alá injektálni (HARTNELL és mtsai, 1991; MULLER 1992). Itt azonban ismét fontos megjegyezni, hogy Európában ma már humán egészségvédelmi okokból tilos a szarvasmarhák növekedési hormonnal való kezelése! A tej összetétele változó és a genetikai faktorok mellett nagyban függ pl. a laktáció fázisától, az évszaktól, a takarmányadag összetételétől, valamint az állat takarmányozási státuszától. A rekombináns szarvasmarha szomatotropin intravénás adagolása nem befolyásolja a tejösszetétel előbb említett tényezőktől
függő
változásait,
vagyis
a
normális
variabilitását
(összefoglalta: BAUMAN és MCCUTCHEON, 1986). Számos kísérlet tanúsága szerint az exogén hormon a tej nagyüzemi feldolgozhatóságát sem befolyásolja, mivel hatására nem változik a különböző savófehérjék, kazein 18
Irodalmi áttekintés frakciók, és zsírsavak aránya (PEEL és BAUMAN, 1987; LÉONARD és mtsai, 1990; BAUMAN és VERNON, 1993). MCGUIRE és mtsai. (1995a) a 48 órás takarmánymegvonás hatásait vizsgálták egyszeri GH injekció laktáció közepén történő alkalmazása mellett holstein-fríz teheneknél. Két napos éhezés 66%-kal csökkentette a tejtermelést, 100%-kal növelte a növekedési hormon szintet. Az inzulin és a glükóz koncentrációja meredeken lezuhant, az IGF-I 50%-kal, az IGF-II szint pedig 28%-kal csökkent. Az éheztetett állatok esetében az egyszeri GH injekció hatástalan volt, míg az éheztetési periódus után újra takarmányozott állatoknál 18-24 órával a GH alkalmazása után az IGF-I szint 100%-kal nőtt. Ez az eredmény is igazolni látszik az exogén szomatotropinnak a hozzáférhető tápanyagok átcsoportosítására gyakorolt akut hatásait. 2.1.2.3 A takarmányfelvételre gyakorolt hatás A rekombináns szarvasmarha szomatotropinnal kezelt teheneknél a tejtermelés növekedését követően több hétig nem emelkedik az állatok takarmányfelvétele, ez azonban elegendő a tehenek kondíciójának megőrzésére az egész kezelés alatt (BAUMAN és mtsai, 1994). Két hét után azonban a takarmányfelvétel nő. A takarmányfelvétel növekedésének mértéke függ a tejtermelés növekedésének, a kondíció változásának mértékétől, valamint a takarmány táplálóanyag tartalmától (CHILLIARD 1989). A nagytermelésű, hormonnal kezelt teheneknél, azokban az időszakokban, mikor az energiamérleg negatív, mobilizálódnak a szervezet zsírtartalékai,
így
ezen
állatok
kondíciója
a
laktáció
folyamán
energiamérlegüktől függően állandóan változik. A szomatotropin kezelésre kialakult, nagyobb tejhozamot elősegítő tápanyag-átcsoportosítás elsősorban a nagyobb mennyiségű zsírsav-oxidációra és a glükóz perifériális 19
Irodalmi áttekintés szövetekbe történő szállítására vonatkozik (MCBRIDE és mtsai, 1988; VERNON 1989; DEBOER és KENELLY 1989a,b; BAUMAN és VERNON 1993). A tőgymirigy megnövekedett szubsztrát felhasználása valószínűleg stimulusként szolgál a takarmányfelvételre további ösztönzésére. 2.1.2.4 Egyéb vérparaméterekre gyakorolt hatás A vérplazma hormonszintjét vizsgálva kiderült, hogy a megemelkedett perifériális növekedési hormon szint összefüggésben lehet a tehenek kiemelkedően jó genetikai értékével (KAZMER és mtsai, 1983). Pozitív energiamérleg esetén az exogén szomatotropin növelte a vérplazma hormonszintjét (GH), az IGF-I, valamint az IGFBP-3 és IGFBP-2 (IGF binding protein, IGF kötő fehérje) koncentrációt tejelő tehenekben (VICINI és mtsai, 1991). A hormon ellés előtti alkalmazása hasonló eredményt produkált, hatására megemelkedtek az előzőekben leírt vérparaméterek, valamint az átlagos napi testsúlygyarapodás, a takarmányértékesítés és a színhús aránya. Emellett csökkent az abdominális és az intramuszkuláris faggyú mennyisége (VESTERGAARD és mtsai, 1995; Putnam és mtsai, 1999). IGF I hormonszint hatásait vizsgálva holstein-fríz üszőkben HORVAINÉ (2003) arra a következtetésre jutott, hogy az IGF-I szint a növekedési erélyt befolyásolja. A magas perifériális IGF-I szinttel rendelkező borjak gyorsabban fejlődtek, növekedtek és 14 hónapos korra nagyobb élősúlyt értek el, mint alacsony IGF-I hormonkoncentrációt mutató társaik. 2.1.2.5 Kondícióra gyakorolt hatás A rekombináns bGH kondícióra gyakorolt hatása közvetlen kapcsolatban van a hormon által kiváltott tejtermelési válaszreakciókkal. Rekombináns szomatotropin adagolása esetén (az Egyesült Államokban), ha a tejtermelésre 20
Irodalmi áttekintés fordított energiafelhasználás meghaladja a takarmánnyal felvett energiát, természetszerűleg
negatív
kondícióromláshoz
vezet
energiamérleg (SODERHOLM
alakul és
ki,
mtsai,
ami 1988).
azután Ez
a
kondícióromlás azonban általában nem lépi túl azt a mértéket, ami egyébként is várható ilyenkor a tápanyagigényt bemutató táblázatok alapján. Vagyis a kondícióromlás, a teljes laktáción át tartó hormonkezelés alatt is egyenes összefüggésben van a tejtermelés színvonalával (BAUMAN és mtsai, 1994). Az ilyen esetekben tapasztalt kondícióveszteséget általában kompenzálja az a tejtermelés növekedésből származó nyereség, amit a teljes laktáció alatt adagolt hormon okozhat (BAUMAN és mtsai, 1994). Ha ezen tehenek energiamérlege újra pozitív lesz, akkor a kondíciójuk is a hormonkezelés előtti értékre áll vissza (SODERHOLM és mtsai, 1988). A kontrol állatokhoz viszonyított nagyobb takarmányfelvétel, ami a kezelés félidejében és végén (BURTON és mtsai, 1990a), valamint valószínűleg a szárazra-állításkor és a következő laktáció elején (MCBRIDE és mtsai, 1990) tapasztalható egész biztosan közrejátszik a jó kondíció visszanyerésében. Megvizsgálták ezen kívül azt is, hogy vajon a nagytermelésű, de szomatotropinnal nem kezelt tehenek is ugyanolyan mértékben veszítenek-e kondíciójukból, illetve később visszanyerik-e azt, mint kezelt társaik. A vizsgálatok bebizonyították ezt a feltevést, mivel a növekedési hormon nincs hatással a takarmány emészthetőségére. Az ivarzáselőrejelzés is ugyanolyan pontosságú volt a kezelt állatokban, mint a kezeletlenek esetében. Ez a tény is alátámasztja, hogy a GH hatástalan a tápanyagok felhasználásának hatékonyságát illetően (TYRRELL és mtsai, 1988; GALLO és mtsai, 1988). Nagy jelentősséggel bír továbbá az is, hogy a rekombináns növekedési hormon milyen mértékben változtatja meg a test összetételét a laktáció során. A testsúly-gyarapodáshoz szükséges, valamint a súlyveszteség által nyert 21
Irodalmi áttekintés tápanyagok egy meghatározott testösszetétel kialakulását eredményezik. Mind BROWN és mtsai. (1989), mind pedig MCGUFFEY és mtsai. (1989) egyaránt bebizonyították, hogy a rekombináns szarvasmarha szomatotropin megváltoztatja az állatok testének felépítését. Ezek a változások azonban az energiamérleg előjele, valamint a tejtermelés színvonalának segítségével előre jelezhetők voltak. Így tehát sem a testsúly-gyarapodások, sem pedig a súlyveszteségek nem a növekedési hormon kezelés hatására történnek (BAUMAN és mtsai, 1994). 2.1.2.6 BST hatása a kezelt tehenek borjaira Az ezidáig publikált kísérletek eredményei szerint nincs különbség a szarvasmarha szomatotropinnal kezelt és a kontroll tehenektől származó borjak születéskori, vagy választáskori súlya között (összefoglalta: MCBRIDE és mtsai, 1988). Amióta kiderült, hogy a növekedési hormon nem képes átjutni a humán méhlepényen (GITLIN és mtsai, 1965) és csak korlátozott mértékben serkenti a magzat IGF-I elválasztását (PARKES és mtsai, 1984), azóta általánosan elfogadott vélemény, hogy szarvasmarha fajban a rekombináns szarvasmarha szomatotropinnal való kezelés nem lehet közvetlen hatással a magzat fejlődésére. GALLO és BLOCK (1990b) számol be arról, hogy a hormonnal kezelt tehenek borjainak plazma glükóz, nem-észterezett
szabad
zsírsav
(NEFA;
non-esterified
fatty
acid)
koncentrációja, és albumin, összfehérje, hemoglobin, inzulin, kortizol, növekedési hormon, IGF-I szintje, valamint vér pH-ja és puffer kapacitása hasonló volt a kontrol anyáktól származó borjaknál tapasztalt értékekhez. A súlygyarapodás üteme, a marmagasság, valamint a szívátmérő szintén hasonló volt a kontrol és a kezelt anyák borjainál (ANDERSON és mtsai, 1989; GALLO és BLOCK 1990b). 22
Irodalmi áttekintés 2.1.2.7 Reprodukciós hatás Számos hosszútávú kísérlet igazolta, hogy a rekombináns szarvasmarha növekedési
hormon
hatással
van
a
tehenek
szaporodásbiológiai
teljesítményére is. Ezekben a kísérletekben a következő tendencia volt megfigyelhető: a kezelt állatoknál hosszabb volt a szervízperiódus (3-5 nappal) (ELVINGER és mtsai, 1988; GIBSON és mtsai, 1990), a fogamzásra jutó termékenyítések száma több volt (0,5- 1 értékkel) és alacsonyabbnak bizonyult a fogamzási ráta (5-10%-kal) (COLE és mtsai, 1988; LÉONARD és mtsai, 1990), mint a kezeletlen kontroll csoportban. Ezek a tendenciaszintű eltérések
a
hormon
dózisának
növelésével
(≥40
mg/nap)
még
kifejezettebbekké váltak (THOMAS és mtsai, 1987), de az alacsony kísérleti tehénlétszám, valamint a magas szórásértékek miatt nem bizonyultak szignifikánsnak. Nagyszámú kísérleti eredmény reprodukciós adatainak halmozott elemzésekor is világosan kivehető ugyanezen tendencia, de ismételten szignifikáns különbségtétel nélkül (HARD és mtsai, 1988). A csökkent reprodukciós hatékonyságra utaló tendencia hátterét elemezve felvetődött a kérdés, hogy vajon az a növekedési hormon kifejezett, szaporodásra gyakorolt hatásának köszönhető-e. Egyrészt vizsgálták a rekombináns szomatotropin közvetlen hatásait az ösztrusz ciklussal összefüggő hormontermelésre, másrészt a negatív energiamérleg által a reprodukciós hatékonyságra közvetett módon kifejtett hatásokat. A luteinizáló hormon (LH) pulzációs elválasztása elengedhetetlenül szükséges az ovulációhoz, így ennek a hormonnak kulcsszerepe van az ösztruszciklus normális működésében. SCHEMM és mtsai. (1990) pozitív összefüggést mutattak ki a rekombináns szarvasmarha növekedési hormon kezelés, valamint a tehenek vérplazmájának LH koncentrációja között. Az rbGH injekciót követő első két ösztrusz ciklust vizsgálva megállapították, 23
Irodalmi áttekintés hogy különösen a bazális és az átlag plazma LH szint volt magas a kontroll állatok hasonló értékeihez viszonyítva. Ez az rbGH kezelés és LH szint közötti kapcsolat független volt az állatok szervízperiódusának hosszától és alacsonyabb termékenyülési ráta esetén is kimutatható volt. Ezt követően GALLO és BLOCK (1991) igazolta, hogy a GnRH (gonadotropic releasing hormone, gonadotropikus elválasztó faktor) indukált LH válasz felerősödött 14 nappal az ellés után a rbGH-val kezelt tehenekben. Fiziológiás körülmények között, ellés után 14 nappal még nincs kapcsolat a petefészek eredetű
szteroidok
között
a
hipotalamusz-hipofízis-gonád
tengelyen
(CARRUTHERS és mtsai, 1980), ezért a növekedési hormon vagy közvetlen módon befolyásolta az LH szekréciót, vagy közvetett módon, a hozzáférhető energiaraktár módosításán keresztül (WEAVER, 1987). A két héttel ellés után adott növekedési hormon nem befolyásolta az endogén LH szekréciós mintázatot, vagyis nem változtatta meg az elválasztás pulzációját, frekvenciáját és amplitudóját sem (SHEMM és mtsai, 1990) és nem hatott az LH szekrécióra a GnRH-s indukciót követően sem (GALLO és BLOCK, 1991). Ezek az eredmények azt feltételezik, hogy a rekombináns szarvasmarha szomatotropin nem befolyásolja negatív irányban az ösztrusz ciklusok rendszerességét (BURTON és mtsai, 1994). Az ösztusz ciklus alatt a progeszteron (a ciklus másik kulcsfontosságú hormonja) szekréciójában bekövetkező változások módosíthatják a tehenek ivarzási viselkedését (DAVIDGE és mtsai, 1987). Éppen ezért feltételezték, hogy az rbGH-val kezelt tehenek alacsonyabb reprodukciós teljesítménye a nem észlelt ivarzásoknak is köszönhető, amelyek a szomatotropin progeszteron szekrécióra gyakorolt hatásának tulajdoníthatók. In vitro tanulmányok kimutatták, hogy a szarvasmarha granulóza sejtekben a növekedési hormon szabályozza (a helyben termelődő IGF-I segítségével) a 24
Irodalmi áttekintés progeszteron szintézisét (SAVION és mtsai, 1981; ADASHI és mtsai, 1985). SHEMM és mtsai. (1990) pozitív korrelációt mutattak ki az rbGH kezelés és a plazma progeszteron koncentrációja között. GALLO és BLOCK (1991) az ösztusz ciklus és a vemhesség alatt rbGH-val kezelt teheneknél emelt progeszteron szekréciót találtak. Feltételezték, hogy az rbGH kezelés által stimulált IGF-I szint növekedése okozhatta a magas progeszteron koncentrációt (SPICER és mtsai, 1990). GALLO és BLOCK (1991) kísérleteiből viszont az is kiderült, hogy a szomatotropin kezelés nincs hatással az ösztusz ciklus hosszára és rendszerességére sem. Ebből következtetni lehet arra, hogy az rbGH a megváltozott progeszteron szint ellenére sem befolyásolja az ivarzás detekciót. Ezt a teóriát bizonyították LEFEBVRE és mtsai. (1991), akik a rekombináns szomatotropin ivarzási viselkedésre gyakorolt és nem a progeszteronnak tulajdonítható hatását mutatták ki. Ovarektomizált, nem tejelő üszőket kezeltek rbGH-val és ösztradiol injekciós kezeléssel indukáltak ivarzási viselkedést náluk. 33%-kal kisebb volt az ugrálások gyakorisága, és az időtartama is rövidebb volt, mint a kontroll üszők esetében. 2.1.2.8 GH hatása a fertőző betegségek (tőggyulladás) gyakoriságára Számos tanulmány foglalkozott a rekombináns szarvasmarha növekedési hormonnal kezelt tehenek általános állategészségügyi állapotával (PHIPPS, 1989; FERGUSON, 1990; MOORE és HUTCHINSON, 1992). Az egyetlen laktációs időszakot vizsgáló eredmények azonban azt mutatják, hogy a kezelt tejelő tehenek általános egészségügyi állapota a fertőző betegségek szempontjából nem különbözik kezeletlen társaik helyzetétől (PHIPPS, 1989; BURTON és mtsai, 1990a; SODERHOLM és mtsai, 1988).
25
Irodalmi áttekintés A fertőző betegségek között egyetlen egy kivétel van ebben a tekintetben. Néhány kísérlet ugyanis azt bizonyítja, hogy a rbGH-val kezelt állatoknál nagyobb gyakorisággal fordul elő a tőggyulladás (MCBRIDE és mtsai, 1990; MCGUFFEY és mtsai, 1991). A tőggyulladás előfordulási gyakoriságát azonban sok más tényező is befolyásolhatja, elsődlegesen a környezet és a fejési technológia. Ezek a faktorok természetesen mind a szomatotropinnal kezelt, mind a kezeletlen állatok esetében ugyanúgy hatottak adott állományon belül. Azon állományok esetében azonban, ahol kis mértékű, de következetesen előforduló pozitív összefüggést találtak a tejtermelés és a tőggyulladás előfordulási gyakorisága között, ott a rbGH kezelés nem változtatta meg ezt a fennálló kapcsolatot. (CRAVEN, 1991). BURVENICH és mtsai. (1989b) kutatásai szerint a rbGH kezelés segítette a tejtermelés visszaállását és normalizálódását a kísérletesen fertőzött tőgynegyedekben. Ezenfelül az is kiderült, hogy a rbGH növelte vagy egyszerűen csak nem befolyásolta a szarvasmarhák immunfunkcióit jelző speciális indexeket. A tőggyulladás előfordulásának
gyakorisága
nagyon
csekély
mértékben
ugyan,
de
valamelyest növekedett a rbGH-nal kezelt teheneknél, de ez csupán a magasabb tejtermelés számlájára írható normális körülmény és nem bizonyítható,
hogy
a
rekombináns
szomatotropin
a
gazdaszervezet
immunológiai védekezésének gyengítésével növelné a tőggyulladásra való fogékonyságot (BURTON és mtsai, 1991a,b; 1992a,b). 2.1.2.9 A növekedési hormon és az immunrendszer Mind a szomatolaktogenikus hormonok, mind pedig a szomatomedinek befolyásolhatják a szervezet betegségekkel szembeni ellenálló képességét fenntartó immunológiai folyamatokat (összefoglalták ARKINS és mtsai, 26
Irodalmi áttekintés 1993). Többek között a növekedési hormon és az IGF-I is fontos szerepet játszik a tanult és az öröklött immunválaszok folyamatában, a helyi gyulladásos válaszrekaciókban, a szövetek helyrehozatali és a sebgyógyulási mechanizmusokban, valamint a heamatopoezisben (BERCZI és NAGY, 1987; BAXTER és mtsai, 1991; KELLEY, 1988; WEIGENT és BLALOCK, 1990). Az exogén növekedési hormon pedig bizonyos szempontból éppenhogy lassíthatja az öregedési folyamatot (GOYA és mtsai, 1990; RUDMAN és mtsai, 1990). Ezek után talán nem meglepő, hogy a neuroendokrin-, és az immunrendszer nagyjából azonos fiziológiai stimulusokra (tápanyag mérleg, citokinek, és a betegségek) érzékenyek (összefoglalta KELLEY, 1988; WEIGENT és BLALOCK, 1990; ARKINS és mtsai, 1993). EARLY és mtsai. (1990) tanulmányukban az exogén rekombináns szarvasmarha szomatotropint a feltételezett GH-immunrendszer kapcsolat tesztelésére használták egyébként normális GH státuszú tehenekben. Növendék tinókat kezeltek 10,3 mg/nap rbGH-val 112 napon keresztül. A kezelt tinók átlagosan 15%-kal több testsúlygyarapodást értek el, mint fiziológiás sóoldattal kezelt társaik. A csecsemőmirigy, valamint a lép súlyában azonban nem volt eltérés tapasztalható a két csoport között. Egy másik, hasonló kísérlet szerint a 12,5 mg rbGH/nap kezelésnek nem volt kimutatható hatása a vér polimorf magvas leukociták felvételére és pusztító képességére fiatal üszőkben. Másrészről viszont a szarvasmarha limfociták alapszintű proliferációja megemelkedett, valamint a proliferációs válaszok hőstressz indukálta depressziója csökkent az in vitro módon adagolt rbGH hatására (ELVINGER és mtsai, 1989, 1991). A perifériás vér limfocitái, a szplenociták, a polimorf magvas és a mononukleáris leukociták, valamint a szöveti makrofágok különböző 27
Irodalmi áttekintés fiziológiás állapotukban mind kötődnek és válaszreakciót mutatnak a növekedési hormonra és az IGF-I-re. Mitöbb, a növekedési hormonnak a limfocitákban mutatott receptor-hormon kötődési tulajdonsága hasonló az egyéb, nem limfoid sejtekben kimutatott kötődési affinitásával. Az immunsejtek nem csupán megkötik a növekedési hormont és az IGF-I-t, hanem ezen hormonok mRNS transzkriptumait is előállítják (BURTON és mtsai, 1994). A keringő növekedési hormon feltehetőleg tehát az immunfunkciók hosszú-távú regulációját végzi valószínűleg a takarmányozási, egészségi, metabolikus és környezeti stressz idején. Ebben a tekintetben mind a szomatotropin, mind az IGF-I úgy tűnik, hogy kritikus szerepet játszik az elsődleges és a másodlagos limfoid szervek működésének és cellularitásának fenntartásában, valamint a vérképzés teljes folyamatának szabályozásában (BURTON és mtsai, 1994). Hipofizektomizált állatoknál mind a sejtes, mind pedig a humorális immunválasz hiányzik. Az immunválaszt azonban akár GH akár prolaktin (PRL) injekció beadásával vissza lehet állítani. A bromokriptinnel (a PRL termelést specifikusan gátló anyag) kezelt állatok a hipofizektomizáltakhoz hasonló immunválaszt adtak és ebben az esetben is GH és PRL beadásával helyreállt a fiziológiás állapot. A genetikailag törpe egyedek esetében, amelyeknél mind a két hormon hiányzik, szintén hasonló a helyzet. Sok fajban (az embert is beleértve) a GH és a PRL is stimulálja a csecsemőmirigy működését és serkenti a thymulin, a csecsemőmirigy hormonjának elválasztását. Számos tanulmány foglalkozott a GH immunsejtekhez való kiemelkedő affinitásával. A növekedési hormonnak az immunológiai folyamatokban résztvevő sejtek proliferációs válaszaira gyakorolt hatását valószínűleg az IGF-I közvetíti. Azok a kísérletek, amelyek egybehangzó 28
Irodalmi áttekintés eredményei szerint PRL antiszérum segítségével blokkolni lehetett egy sor immunválaszt, vezettek ahhoz a felfedezéshez, hogy az immunreakciókban résztvevő sejtek maguk is képesek növekedési hormon és prolaktin termelésére (GALA, 1991).
2.2 A növekedési hormon gén A növekedési hormont kódoló gén egy több más gént is (prolaktin gén, chorio-somatotropin gén) magában foglaló család tagja. Ezen gének mind egy egyszerű, ősi szekvencia változatai (NIALL és mtsai, 1973; MILLER és mtsai, 1983). A növekedési hormon gén teljes nukleotid szekvenciája ismert. A gén 1793 bázispár hosszúságú, 4 intront (A-D; 248, 227, 227 és 274 bp hosszú) és 5 exont tartalmaz, amely egy 786 bázisból álló érett mRNS-t kódol (WOYCHIK és mtsai, 1982). Az 5’ határoló szakaszban talált TATAAA szekvencia is valószínűleg a transzkripció megindítását segíti (GORDON és mtsai, 1983). A keletkezett mRNS a későbbiekben változásokon megy át és egy olyan szakaszt is tartalmaz, amely a transzláció folyamán nem íródik át aminosavvá, hanem feltehetően a keletkezett fehérje stabilitásáért felelős. A gén lókusza a szarvasmarha 19-es kromoszómáján, a q26qter régióban található (HEDIGER és mtsai, 1990). A szarvasmarha, a patkány és a humán növekedési hormon gének magas fokú konzerváltságot (hasonlóságot) mutatnak. Az exonokat elválasztó intronok azonban sokkal kevésbé hasonlítanak egymáshoz. Mind a három előbb
említett
növekedési
hormon
gén
azonban
tartalmaz
egy
konzerválódott, de nem teljesen azonos 40 bázispár hosszúságú szakaszt, az 5’ határoló régión belül. Ez a régió valószínűleg kiemelten fontos szerepet 29
Irodalmi áttekintés játszik a növekedési hormon gén transzkripciójának szabályozásában (GORDON és mtsai, 1983) A MAS (marker segítségével végzett szelekció) programok után, a molekuláris klónozás és a DNS hibridizációs technikák továbbfejlesztésével lehetővé vált a genetikai polimorfizmus-kutatás már a nukleinsavak szintjén is (BECKMANN és mtsai, 1986). Keshet és mtsai. már 1981-ben plazmid segítségével
baktériumban
sikeresen
klónozták
a
szarvasmarha
szomatotropin génjét és β–laktamáz indikátor gén segítségével nagy mennyiségű kópiát állítottak elő belőle.
2.2.1 Ismert polimorfizmusok A szarvasmarha szomatotropin génben több mutációt találtak. Ezek közül a legfontosabbak talán: az AluI polimorfizmus az 5. exonban (amely a fehérje természetű hormonban egy leucin/valin aminosavcserét okoz) (SEAVEY és mtsai, 1971; ZHANG és mtsai, 1992), az MspI polimorfizmust a 3. intronban (ZHANG és mtsai, 1993a; LEE és mtsai, 1994b), a TaqI polimorfizmus, valamint a gén promoter régiójában is felfedeztek egy trinukleotid deléciót (RODRIGUES és mtsai, 1998). Arra is fény derült, hogy a különböző növekedési hormon genotípusok a mendeli öröklődésmenetet követve, öröklődnek. (BECKMANN és mtsai, 1986). 2.2.1.1 TaqI polimorfizmus THEILMANN és mtsai. (1989) a TaqI restrikciós endonukleázzal hasított növekedési hormon gén tekintetében 4 RFLP allélt (Restriction Fragment Length Polymorphism = Restrikciós Hosszpolimorfizmus) különböztettek meg (A:6,2 kb, B:5,2 kb, C:4,5 kb, D:4,3 kb). Ugyanezen szerzők a prolaktin 30
Irodalmi áttekintés gént vizsgálva és MspI restrikciós enzimmel emésztve 2 allélt azonosítottak (A:2,6 kb, B:2,2 kb). ROCHA és mtsai. (1992) a kapott különböző hosszúságú fragmentumok (RFLP-k)
és
a
kvantitatív
tulajdonságok
közötti
összefüggéseket
tanulmányozták nagylétszámú húsmarha populációban. Megállapították, hogy három GH-TaqI allél (B, C, D) szoros kapcsolatban volt az átlagosnál kisebb születéskori súllyal, valamint a születéskori súlyra vetített vállszélességgel. A szóban forgó három allélra nézve homozigóta tehenek az átlagosnál általában 4 kg-mal könnyebb borjakat hoztak a világra, mint az A allélra nézve homozigóta (AA genotípusú) társaik. RENAVILLE és mtsai. (1994), illetve SNEYERS és mtsai. (1994) hasonló következtetésekre jutottak. Megállapításaik szerint az AA genotípusú fehérkék belga bikák 7 és 13 hónapos korban mért élősúlya szignifikáns mértékben nagyobb volt, mint AB genotípusú társaiké. FALAKI és mtsai. (1996a) a növekedési hormont és a növekedési hormon receptort kódoló gént tanulmányozták olasz holstein-fríz bikáknál. A növekedési hormon lókusz változatai nem befolyásolták az általuk vizsgált tejtermelési tulajdonságokat. A receptor gén régiójában TaqI enzimmel hasítva hat különböző hosszúságú fragmentumot és kilencféle mintázatot kaptak. Az itt észlelt polimorfizmus szignifikáns összefüggést mutatott a tejfehérje százalékkal. Ugyanezen szerzők (FALAKI és mtsai, 1996b) tovább tanulmányozva és TaqI restrikciós enzimmel hasítva a növekedési hormon gént, 3 fragmentumot kaptak (A,B,E) (6.2;5.2;1.9 kb). Ezek a következő hat mintázatban fordultak elő: AA, AB, ABE, AE, BB és BE. A statisztikai vizsgálatok kapcsolatot mutattak ki a TaqI enzimmel hasított növekedési hormon fragmentumok, valamint a 305 napos tej-, zsír- és fehérje hozam 31
Irodalmi áttekintés között. Az AE genotípusú állatok termelése jóval alatta maradt AA és AB genotípusú társaik produkciójának. Ezek az eredmények egyértelműen megmutatták, hogy az E fragmentum hatására vonatkozóan még további kutatások szükségesek. Egy évvel később FALAKI és mtsai. (1997) már csaknem a teljes szomatotropin gént (az 1. exon 1. bázisától az 5. exon 21. bázisáig terjedően) és TaqI enzimmel hasított fragmentumait vizsgálták. A 6200 bázispár hosszúságú szakaszt A-val jelölték, az 5200 bázispár hosszúságút pedig Bvel. Ezután a három mintázat (AA, AB, BB) és az olasz szimmentáli szarvasmarhák BLUP eredményei között kerestek statisztikai összefüggést. A szomatotropin gén polimorfizmusai és a tejtermelés közötti összefüggés azonban nem bizonyult szignifikánsnak. A BB genotípusú bikák tejhozamra vonatkozó tenyészértéke magasabb volt az AA bikák hasonló értékénél. Emellett a BB bikák tejfehérje tartalomra vonatkozó tenyészértékei is szignifikánsan (p<0,05) magasabbak voltak. 2.2.1.2 MspI polimorfizmus ZHANG és mtsai. (1992) AluI és MspI restrikciós enzimekkel hasították a szarvasmarha növekedési hormon gén meghatározott szakaszát. Két allélt találtak az 5. exonban (A és B) (AluI enzimmel hasítva) és szintén két allélt (C és D) a 3. (vagy C) intronban (MspI enzimmel hasítva) (ZHANG és mtsai, 1993a). A C allél MspI enzimmel való emésztése után négy különböző hosszúságú fragmentum keletkezik, a D allél pedig három fragmentumból áll. A mutáció következtében tehát elvész egy MspI hasítási hely a 3. intronban. 1. ábra: A növekedési hormon gén két legtöbbet vizsgált polimorfizmusának sematikus ábrázolása 32
Irodalmi áttekintés
exon 3
exon 4
exon 5
...CGCAC'CGGCC...
....GAG'CTGGAA...
MspI hasítási helye (C-D allél), a C allél szekvenciájával AluI hasítási helye (A-B allél), az A allél szekvenciájával (Genbank Accession Number J00008, Woychik és mtsai, 1982)
LEE és mtsai. (1994a) a szomatotropin gén 400 bázispár hosszúságú szakaszát szaporították fel, hogy így tanulmányozhassák a 3. intronban talált polimorf MspI hasítási helyet. Megállapították, hogy az MspI polimorfizmust egy timin inzerciója, valamint egy citozin-guanin tranzíció okozza. Megállapították még, hogy a D allél szignifikáns (p<0,1) kapcsolatban van a bikák tejzsírra vonatkozó örökítő képességével. HOJ és mtsai. (1993), akik dán vörös, valamint norvég vörös tejelő fajtákon végezték kísérletüket, a növekedési hormon gén polimorfizmusai, valamint a magas és alacsony tejzsír tartalomra szelektált vonalak borjainak növekedési hormon
elválasztása
közötti
feltételezett
kapcsolatot
vizsgálták.
Megállapították, hogy a talált polimorfizmus oka a gén 3' régiójában található inzerció (I) vagy deléció (D). Az inzerció a 837-es pozícióban történik és egy timin inzertálódik a láncba. Ezzel egyidejűleg egy citozin-guanin tranzíció is bekövetkezik a 838-as pozícióban. Eredményeik szerint a dán vörös fajtában a magas tejzsír termelésre szelektált csoportban nagyobb volt a D haplotípusok aránya. A TRH (tireotróp hormon) injekciót követő növekedési hormon elválasztás mértéke pedig az CC genotípusú borjakban volt nagyobb (HOJ és mtsai, 1993). 33
Irodalmi áttekintés Ezt később megerősítette SULIMOVA és mtsai. (2002) kísérlete. Ők is azt találták, hogy az D allél és a tejzsírtermelés között pozitív szignifikáns kapcsolat áll fenn. LAGZIEL és mtsai. (1999) szintén összefüggést találtak az MspI lókusz és a holstein-fríz fajta tejtermelési tulajdonságai között. Egyetlen bika 523 ivadékát vizsgálva kiderült, hogy erre a polimorfizmusra nézve heterozigóta (CD) lányoknál homozigóta (CC) féltestvéreikhez képest szignifikánsan magasabb tejfehérje százalék és éves tejfehérje kg volt tapasztalható. A heterozigóták által termelt tej szomatikus sejtszáma is alacsonyabb volt CC féltestvéreikhez viszonyítva. Részben hasonló eredményekre jutott az a kísérlet is, amelyben 1086 lengyel tarka tejelő tehén szerepelt. A tehenek első három laktációját vizsgálva bebizonyosodott, hogy a bGH/MspI lókuszra nézve CC homozigóta egyedek termelték a legtöbb tejet, de a heterozigóta (CD) teheneknél magasabb volt a tej zsírszázaléka (DYBUS, 2002b). 2.2.1.3 AluI polimorfizmus ZHANG és mtsai. (1993b) AluI enzimmel emésztették a növekedési hormon gént és két allélt találtak (A és B allélnak nevezték). Az A allél a szarvasmarha növekedési hormon azon változatát kódolja, ahol a 127. aminosav leucin (L), a B allél által kódolt változatban a 127. aminosav valin (V). LUCY és mtsai. (1993) az L/V haplotípusok fajták szerinti (a különböző hasznosítási típusokat figyelembe véve) gyakoriságát és eloszlását vizsgálva megállapították, hogy az L allél a tejelő típusú, a V allél pedig a hústípusú fajtákban fordul elő nagyobb gyakorisággal. A gyakorisági értékek mellett meghatározták még az L/V polimorfizmust okozó pontmutációt is: a 127. 34
Irodalmi áttekintés helyen leucint tartalmazó hormon DNS-ében a megfelelő helyen CTG kodon van, míg az azonos helyen leucin helyett valint tartalmazó hormon esetében ez a kodon GTG-re változik. 2.2.1.3.1 Az AluI polimorfizmus és a szomatotropin elválasztás GROCHOWSKA és mtsai. (2001) bizonyították, hogy haplotipusonként jelentősen különbözik STH/IGF-I tengelynek a működése, továbbá az STH:inzulin arány, ennek következtében pedig az egyes genotípusok endokrinológiai,
metabolikus
és
szaporodásbiológiai
jellemzőiben
számottevő, és nagy gyakorlati fontosságú különbségek tételezhetők föl (STH: somatotropic hormone) (HUSZENICZA és mtsai, 2002). SCHLEE és mtsai. (1994) az egyes növekedési hormon genotípusok, valamint az IGF-1 és a növekedési hormon plazmaszintje közötti összefüggéseket vizsgálták. Az LL genotípusú állatok vérében magasabb volt a növekedési hormon koncentráció, mint az LV genotípusúaknál. Az IGF-1 koncentráció viszont éppen az ellenkező képet mutatta, az LV genotípusú állatoknál volt magasabb. Végül is megállapítható volt, hogy a különböző növekedési hormon allélok szignifikáns módon (p<0,05) befolyásolják a növekedési hormon és az IGF-1 vérplazma szintet. GROCHOWSKA és mtsai. (1997) szintén hasonló következtetésekre jutottak. A több, mint 50%-os holstein vérhányaddal rendelkező, átlagosan 11 hónapos üszőket és bikákat vizsgálva megállapították, hogy az L/V lókusz kapcsolatban van a növekedési hormon elválasztással. Azt találták, hogy a VV genotípusú egyedek növekedési hormon szintje szignifikánsan magasabb (p<0,05), mint az LL és az LV genotípusú állatok hasonló értékei. A növekedési hormon elválasztás mintázatában a legnagyobb amplitúdó és a frekvencia érték az LV genotípusú egyedekre volt jellemző. Feltételezhető 35
Irodalmi áttekintés tehát, hogy a V allél jelenléte pozitív kapcsolatban van a növekedési hormon elválasztással. Tovább vizsgálva a TRH indukálta növekedési hormon elválasztási mintázat és az AluI lókusz közötti kapcsolatot, a következő eredményekre jutottak. A GH elválasztás teljes mintázatában nem volt szignifikáns különbség az egyes genotípusok között. Mindazonáltal a VV egyedek alap GH szintje magasabb volt mindkét ivarban, mint társaiké. Sőt, a VV genotípusú bikáknál tapasztalták a legmagasabb amplitúdójú GH elválasztást. Ezek a különbségek azonban nem voltak szignifikánsak, így végső soron megállapítható volt, hogy a különböző L/V genotípusú állatok stimulált GH elválasztási mintázatában nincs különbség (GROCHOWSKA és mtsai, 1999). A tejelő és a hústípusú fajtákat vizsgáló kísérletekből kitűnik, hogy a fiatal tejelő szarvasmarhák magasabb növekedési hormon koncentrációval jellemezhetőek, mint a hústípusú fajták képviselői. Ez a különbség feltehetően a tejelő fajták nagyobb tejtermelést lehetővé tevő genetikai képességére utalhat (GROCHOWSKA és mtsai, 1999). LOVENDHAL és mtsai. (1997) dán holstein és dán jersey fajtákat vizsgálva, az előbbiekkel ellentétben azt állítják, hogy az L allél pozitív összefüggésben van az átlagos növekedési hormon plazmaszinttel (p<0,03) és a növekedési hormon lebomlási idejével (turnover) (p<0,06). Az egyes allélok tej-, zsír- és fehérje termeléssel való szignifikáns kapcsolata viszont ebben a kísérletben nem igazolódott. 2.2.1.3.2 Az AluI polimorfizmus és a tejtermelés A 127. helyen leucin helyett valint tartalmazó rekombináns növekedési hormonnal kezeltek tejelő tehenek tejtermelése a kezelés hatására nagyobb mértékben növekedett. Ebből arra következtettek, hogy a V allélt hordozó 36
Irodalmi áttekintés tehenek valószínűleg több tejet termelnek, mint az L allélt hordozó társaik (EPPARD és mtsai, 1992). SABOUR és mtsai. (1997) összefüggést állapítottak meg az L/V lókusz, valamint a tejhozamra vonatkozó becsült átörökítő képesség (estimated transmitting ability: ETA) között holstein-fríz fajtában. 100, a kanadai tejfehérje projectben használt holstein-fríz bikát vizsgáltak és kimutatták, hogy a V allél vizsgált állományon belüli előfordulási aránya 0,09 volt. Az összefüggésvizsgálat eredményei szerint a V allél sokkal gyakoribb volt az a tejre, és fehérjére vonatkoztatott ETA szerint rangsorolt legjobb bikák között, mint a legrosszabbul teljesítő bikák csoportjában. A bGH/AluI allélvariációk, valamint a tejtermelési tulajdonságok közötti összefüggések feltárását végezte el SABOUR és LIN (1996) kanadai holstein-fríz bikákat használva. Eredményeik szerint a V allél jó tejtermelési tulajdonságokkal (különösen magas tejfehérje termeléssel) járt együtt. Ezt megerősíti az az eredmény is, hogy a V allél a legjobb bikák között fordult elő a legnagyobb gyakorisággal. Mindezzel ellentétben születtek olyan tanulmányok is, ahol az LL genotípus bizonyult a legelőnyösebbnek a tejtermelés szempontjából. Eredményeik azt mutatják, hogy az LL genotípusú egyedek tejhozama, tejzsír és tejfehérje termelése szignifikánsan magasabb volt, mint az LV genotípust hordozó teheneknél. Ez az összefüggés azonban csak az első laktáció esetében volt bizonyítható (DYBUS, 2002a). CHUNG és mtsai. (1996) szerint - akik szintén csak a 305 napos első laktációs tejtermelési adatokat, valamint a tej beltartalmi mutatóit tanulmányozták - a szarvasmarha növekedési hormon lókusz és a tejfehérje százalék között szignifikáns összefüggés van. Kísérletükben az LL
37
Irodalmi áttekintés genotípusú tehenek tejének fehérje százaléka szignifikánsan magasabb volt (p<0,05), mint az LV egyedeké. Ausztrál holstein-fríz szarvasmarhákat vizsgálva SHARIFLOU és mtsai. (1998) kimutatták, hogy a növekedési hormon L allélja - ami eredményeik szerint domináns a V alléllal szemben - magasabb tej-, zsír-, és fehérje termeléssel jár együtt (tej: LL: 6,4%, LV: 5,6%; tejzsír%: LL: 11,2%, LV: 9,9%; tejfehérje: LL: 7,0%, LV: 6,3%). A gén szubsztitúció átlagos hatása 95 l tej, 7 kg tejzsír és 3 kg tejfehérje volt (SHARIFLOU és mtsai, 2000). Ezt az összefüggést erősíti egy másik tanulmány is, ahol 107 borzderes tehén genotipizálását végezték el a növekedési hormonra (AluI lókusz) és a prolaktin génre nézve. A tehenek első három laktációjának felhasználásával megállapították, hogy a legmagasabb tejzsír (4,77%) és tejfehérje százalék (3,55%) az LL genotípusú tehenek esetében volt tapasztalható. A vizsgált lókusz, valamint a tej-, a tejfehérje- és a tejzsírtermelés közötti szignifikáns kapcsolat azonban nem igazolódott. (CHRENEK és mtsai, 1999) Az Amerikai Egyesült Államokban 300 holstein-fríz bikán végzett kísérlet azonban cáfolni látszik a fent említett negatív eredményt. QTL (quantitative trait loci) analízist végezve a szomatotropin gén három polimorf lókuszát tanulmányozták (az 5. exonban /AluI/, a C intronban /MspI/ és a gén 3’ régiójában). Megállapították, hogy a tejhozamot és a tejfehérje százalékot meghatározó QTL-ek minden bizonnyal kapcsoltan öröklődnek a vizsgált növekedési
hormon
lókuszokkal.
A
közöttük
feltételezett
becsült
rekombinációs érték közelített a nullához, a LOD pont értéke azonban egynél kisebb volt (FREEMAN és mtsai, 1998; VUKASINOVIC és mtsai, 1999). A LOD szám (likelihood of odds) használatát MORTON (1955) vezette be és a c=0,05 rekombinációs gyakorisághoz tartozó LOD szám például azt fejezi ki,
38
Irodalmi áttekintés hogy mi annak a valószínűsége, hogy a QTL 0,05 rekombinációs gyakoriság távolságra található a markertől (FÉSÜS és mtsai, 2000). 2.2.1.3.3 Az AluI polimorfizmus és a hústermelés ZWIERZCHOWSKI és mtsai. (1998) kimutatták, hogy a növekedési hormon lókusz szignifikáns módon befolyásolta a 7 és 8 hónapos élősúlyt, valamint a takarmányfelvevő képességet növendék fríz szarvasmarháknál. CHRENEK és mtsai. (1998b) szlovák szimmentáli bikákat vizsgáltak a növekedési hormon L/V lókuszára nézve. A kapott eredmények azt bizonyítják, hogy a VV genotípusú bikák élősúlya és átlagos napi súlygyarapodása szignifikánsan (p<0,05) alacsonyabb volt a többi genotípushoz képest. Ezzel összefüggésben az is bebizonyosodott, hogy ez a lókusz a hideg vágott féltest minőségét és mennyiségét, valamint az értékes húsrészek és a zsír mennyiségét is befolyásolja. OPRZADEK és mtsai. (1999) kísérletei szerint ugyanis az LL és az LV genotípusú bikák szignifikánsan nagyobb hús depozícióra voltak képesek és ezáltal, vágott féltestük is nagyobb súlyú lett, mint homozigóta VV társaiknak. A két homozigóta genotípus között (LLVV) ez a különbség elérte a 3,2 kg-t (az LL bikák javára), míg a heterozigóták előnye a VV bikákkal szemben 2,56 kg volt. Brazíliában
tisztavérű
nellore
bikákon
végzett
kísérlet
is
arra
a
végkövetkeztetésre jutott, hogy az AluI lókusz LL genotípusa és a választástól 15 hónapos korig mért súlygyarapodás között szignifikáns összefüggés van (UNANIAN és mtsai, 2001). ZWIERZCHOWSKI és mtsai. (2001) öt húsmarha fajtában (charollais, limousin, vörös angus, szimmentáli és hereford) bikákkal végeztek vizsgálatokat. A növekedési hormon L/V polimorfizmusa, valamint az 39
Irodalmi áttekintés élősúly és a napi súlygyarapodás közötti kapcsolatot ők is igazolták. Az előbbieknek ellentmondóan azonban azt állapították meg, hogy a homozigóta VV genotípusú egyedek bizonyultak a legnehezebbeknek összehasonlítva LL és LV genotípusú társaikkal , valamint a napi súlygyarapodás mértéke is náluk volt a legnagyobb. A különbség szignifikáns volt és az élősúlynál 30 kg-ot, a napi súlygyarapodás esetén pedig 200-300 g-ot jelentett. Ezenkívül a vizsgált lókusz (bGH/AluI) még a vágott féltest további kilenc paraméterét befolyásolta szignifikáns módon (p<0,05). Valamennyi esetben a VV genotípus bizonyult a legjobbnak. LECHNIAK és mtsai. (1999) a növekedési hormon gén AluI polimorfizmusa (L/V lókusz) és a mesterséges termékenyítésre használt tejelő és hústípusú bikák ondójának minősége, valamint a visszaivarzási arány között kerestek kapcsolatot.
Szignifikáns
tendenciaszinten
összefüggéseket
megállapították,
hogy
ugyan az
LL
nem
találtak,
genotípusú
de
bikák
ejakulátuma általában kisebb térfogatú volt, a VV genotípusú bikák esetében pedig alacsonyabb visszaivarzási százalékot tapasztaltak. Japán kutatók (CHIKUNI és mtsai, 1994) kísérletükben a szarvasmarha növekedési hormon gén 652 bázispár hosszúságú szakaszát (4. intron - 5. exon) amplifikálták, majd ezt követően AluI restrikciós enzimmel hasították. Japán fekete és japán barna szarvasmarha fajtában a növekedési hormon gén három változatát sikerült megkülönböztetniük: • A változat (Leu127,Thr172){a 127. aminosav kodonja: CTG}, • B változat (Val127,Thr172){127. aminosav kodonja: GTG} és • C változat (Val127,Met172){172. aminosav kodonja: ATG}. A C változatot azonban nem sikerült kimutatni holstein-fríz, hereford, és Aberdeen angus fajtákban. Ezenkívül megállapították azt is, hogy az általuk 40
Irodalmi áttekintés vizsgált fajtákban a szomatotropin gén egyes genotípusai nem befolyásolták a hasított féltest minőségi tulajdonságait. 2.2.1.4 Egyéb polimorfizmusok LEE és mtsai. (1994b) a szarvasmarha szomatotropin 428 bázispár hosszúságú fragmentumát tanulmányozták (4. intron, 4. és 5. exon egy része) és a leucin/valin mutáción kívül még további két pontmutációt találtak: egy G-C (guanin- citozin) tranziciót és egy C-T (citozin-timin) transzverziót a 4 intronon belül. RODRIGUES és mtsai. (1998) szintén a növekedési hormon gén promoter régiójában találtak egy új polimorfizmust. Egy 333 bp hosszúságú szakaszt (mely a gén promoter régióját, valamint az 1. exont és az A intront tartalmazta) szaporítottak fel PCR technika segítségével. Húshasznú szarvasmarhákat
vizsgálva
(Nelore,
Chianina)
2
allélt
tudtak
megkülönböztetni, tejhasznú szarvasmarháknál (borzderes, holstein) viszont ezt a polimorfizmust nem lehetett kimutatni. A rövidebb allél szekvenálása után megállapították, hogy a polimorfizmust a TATAAA szekvenciától 9 nukleotid távolságra levő AAG (-35AAG-33) trinukleotid kiesése okozta. Féltestvér és édestestvér párosítások segítségével azt is sikerült bebizonyítaniuk, hogy ez a polimorfizmus a mendeli szabályok szerint öröklődik.
2.3 Növekedési hormon receptor A növekedési hormon élettani hatásai a növekedési hormon receptorral (GHR) való kölcsönhatások révén jutnak kifejezésre. A szomatotropin receptora 620 aminosavból áll és megközelítőleg 120 kDa súlyú. A HBP 41
Irodalmi áttekintés fehérjék (helix bundle peptid) közé tartozik és a citokin-eritropoetin receptorcsalád tagja (ide tartozik pl. a prolaktin receptor is) (CLARK, 1997, THOMAS, 1998) A növekedési hormon receptorok rendkívül sokféle sejttípusban megtalálhatóak, többek között a limfocitákban is jelen vannak (ARRENBRECHT, 1974; GAGNERAULT és mtsai, 1996). A receptor jelátviteli funkciója több lépcsőben zajlik le. Első lépésben, homodimerizáció segítségével két receptor és egy növekedési hormon molekula kapcsolódik össze. Ez az úgynevezett receptor-ligandum komplex, vagyis a növekedési hormon receptor dimer (GH-(GHR)2) aktiválja a Janus kináz 2 másodlagos hírvivő rendszert (THOMAS, 1998). Ez azután módosítja a célszövetek, mint pl. a máj, a zsírszövet, a szív, a vese, a kötőszövet, a hasnyálmirigy, az agy, az ivarmirigyek, a méhlepény és az emlőmirigy anyagcseréjét (KÖLLE és mtsai, 1997; LUCY és mtsai, 1998a). Ebben a jelátviteli folyamatban más mechanizmusok is – mint pl. a kalcium influx - szerepet játszanak (THOMAS, 1998). A növekedési hormon receptor molekulának a membránokban igen nagy arányú a turnovere. Amikor a szomatotropin megkötődik, a receptorligandum komplex gyorsan bekerül a sejtbe, majd mindegyik molekula elbomlik, ellentétben sok más receptorral, ahol maga a receptor később újra felhasználódik (KING és mtsai, 1996). Az IGF-I szintén előidézheti a növekedési hormon receptor degradációját (MIN és mtsai, 1996).
2.4 Növekedési hormon receptor gén A szarvasmarha növekedési hormon receptort kódoló gén a szarvasmarha 20as kromószómájának q17-es régiójában található (PARSONS és mtsai, 1998).
42
Irodalmi áttekintés Bizonyítást nyert, hogy a növekedési hormon receptor gént tartalmazó kromoszóma szegmens legalábbis részben felelős a 20-as kromoszóma QTL hatásaiért. Ismert QTL genotípusú egyedek genomját szekvenálva F-Y (fenilalanin – tirozin; uracil (illetve timin) - adenin csere okozza) szubsztitúciókat azonosítottak a GH receptor gén transzmembrán alegységén belül. Ez az alegység pedig nagy hatással van a tejhozamra, valamint a tej beltartalmi mutatóira (BLOTT és mtsai, 2003). A növekedési hormon receptor génről szarvasmarhában többféle mRNS íródik át, amelyek az 5’UTR (untranslated region) szakaszban különböznek egymástól. RACE technika segítségével összesen 9 féle mRNS 5’UTR változatot (1A – 1I) azonosítottak. Az RPA (ribonukleáz protection assay) módszert alkalmazva kiderült az is, hogy ezek az mRNS-ek leginkább a máj és a vázizomzat sejtjeiben expresszálódnak (JIANG és LUCY, 2001). Ezt megelőzően a GHR gén promoter régiójában egy polimorf (GT)n mikroszatellitet sikerült azonosítani. Az adott lókuszon öt különböző allélt különítettek el. A transzkripció kezdésének helyétől ez a polimorf szakasz – 90 bp távolságra helyezkedik el (LUCY és mtsai, 1998b). Finn szerzők előállították és felszaporították a GH receptor gén 3’ határoló régiójának 273 bp hosszú szakaszát. Ezen a szakaszon belül három különböző hosszúságú változatot és egy bázishelyettesítő mutációt találtak. Megállapították, hogy a hosszpolimorfizmust mutató szakaszok (allélok) gyakorisága eltérő volt a széleskörben használt tejelő fajtákban és az őshonos finn fajtában (MOISIO és mtsai, 1998). Az igazi áttörés azonban az volt, amikor a növekedési hormon receptor gén 10. exonjában találtak egy aminosav cserét okozó pontmutációt. Megfelelő primerek segítségével egy 528 bp hosszúságú szakaszt amplifikáltak a genomiális DNS-ből. DGGE módszer (denaturáló grádiens gélelektroforézis; 43
Irodalmi áttekintés MUYZER (1999)) segítségével két allélt és három genotípust találtak. A két homozigóta genotípus DNS fragmentumait tovább vizsgálva, PCR-RFLP módszert használva, négy, pontmutáció okozta polimorfizmust azonosítottak. A fragmentum 5’ végétől ezek a nukleotid szubsztitúciók a 76 (T-C), a 200 (G-A), a 229 (T-C) és a 257 (A-G) pozícióban helyezkedtek el. A mutációk azonosítására a következő restrikciós endonukleázokat használták: MaeII, (p76, p229), NlaIII (p229), NarI (p200), AluI (p257) (p: pozíció). A szomatotropin receptor gén 10. exonja a receptor molekula citoplazmába nyúló részét kódolja. Az 5’ végtől a 200 és a 257 bp-ra található SNP-k (single nucleotide polymorphisms) aminosav cserét okoznak. A 200-as pozíciónál levő mutáció Ala (GCC) – Thr (ACC) cserét okoz, míg a 257-es Ser (AGC) – Gly (GGC) változást (GE és mtsai, 2000).
44
Anyag és módszer
3 ANYAG ÉS MÓDSZER 3.1 Állatok, mintavétel A magyar holstein-fríz bikanevelő tehénpopulációt a dolgozatban egy random módon vett, reprezentatív mintasokaság képviseli. 365 bikanevelő tehén szerepel az elvégzett vizsgálatokban, amelyek az ország különböző térségeiben levő 6 holstein-fríz (HF) tenyészetből származnak (2. ábra). A tenyészetek mintaszáma (állatszáma) 66 és 276 között volt tenyészetenként (1. táblázat). Az adatok 10 évet, minden évben 4 ellési évszakot (tavaszi: februártól áprilisig; nyári: májustól júliusig; őszi: augusztustól októberig; téli: novembertől januárig) ölelnek fel. 2. ábra: A mintavétel helyéül szolgáló 6 HF tenyészet elhelyezkedése
A gazdaságok helye 45
Anyag és módszer 1.
táblázat:
A
vizsgált
bikanevelő
tehénpopuláció
tenyészetenkénti
tehénlétszáma és azok kormegoszlása tenyészet 1 tenyészet 2 tenyészet 3 tenyészet 4 tenyészet 5 tenyészet 6 összesen
N 63 (17,4%) 136 (37,5%) 75 (20,5%) 33 (9,1%) 28 (7,7%) 30 (8,3%) 363 (100%)
1 laktációs 31 53 30 8 14 9 143
2 laktációs 18 41 28 12 12 21 120
3 laktációs 6 27 14 6 0 9 62
4 laktációs 8 15 3 7 2 3 38
Az állatoktól állatorvosi segítséggel vért vettem. A vérvétel minden esetben a torkolati vénából történt. Az így kinyert vérmintát vérvétel után EDTA (etilén diamin tetra ecetsav) tartalmú vércsövekben tároltam a DNS extrakció megkezdéséig egyenletes –20°C-os hőmérsékleten. A genomiális DNS kivonása a sejtmaggal rendelkező fehérvérsejtekből történt.
3.2 A genomiális DNS izolálása A genomiális DNS-t 50 μl teljes vérmintából, annak előkészítése után vontam ki. A mintákat Eppendorf csövekben 500 μl oldattal (Tris-HCl 10mM, pH=7,5; Na2EDTA 1mM, pH=8) háromszor átmostam. Az egyes mosási fázisokat mindig az elegy homogenizálása és 2 perces centrifugálás követte (12000 rpm). Az így keletkezett pelletet 100 μl lízis oldatban feloldottam (Tris 10mM, pH 7,5; KCl 50 mM, tween 20mM 0,5%; proteináz K 0,6μg/μl). Ezek után a szuszpenzió 1 órára 56°C-os vízfürdőbe került, majd a 10 perces 94°C-os vízfürdő hatására az oldatban levő proteináz-K enzim inaktiválódott.
46
Anyag és módszer Az így előkészített DNS mintákat –20°C-on addig tároltam, amíg azokat a PCR
(polimeráz
chain
reaction;
polimeráz
láncreakció)
reakciók
elvégzéséhez szubsztrátként fel nem használtam.
3.3 PCR-RFLP módszer 3.3.1 A polimeráz láncreakció előkészítése A reakciókomponensek összemérése steril fülkében történt. A reakcióelegy (összetételét lásd: 3.3.3.1. és 3.3.3.2. fejezetek) elkészítése, PCR-csövekbe történő szétosztása és a vizsgálandó minták hozzáadása után a kiválasztott DNS szakasz amplifikációja következett. A kezdeti DNS-mennyiség sokszorosítását DNA Thermal Cycler (PerkinElmer, Norwalk, CT, USA) típusú készülék segítségével végeztem. A vizsgálatokhoz a Promega (Madison, Wi, USA) és a Finnzymes cégek vegyszereit használtam.
3.3.2 Használt primerek 3.3.2.1 GH gén, AluI polimorfizmus (L/V lókusz) A növekedési hormon gén AluI polimorfizmusának azonosítására, a gén ismert DNS szekvenciájának (Genbank Accession Number J00008, WOYCHIK és mtsai, 1982) egy 427 bázispár hosszúságú szakaszát közrefogó primerpárt használtam: GH forward
5’CGGACCGTGTCTATGAGAAGCTGAAG3’
GH reverse
5’GTTCTTGAGCAGCGCGTCGTCA3’
A primerek ZHANG és mtsai. (1992) által leírtak alapján készültek. 47
Anyag és módszer A 427 bázispár hosszú szintetizálandó és felszaporítandó DNS szakasz magában foglalja a mutációt tartalmazó 5. exont, 55 bázispárt a 4. exonból, valamint a teljes D intront (4. intron) (3. ábra). 3. ábra: A növekedési hormon gén 427 bp szakaszának előállítása és a a termék szekvenciájában található AluI hasítási hely azonosítása GH F CGGACCGTGTCTATGAGAAGCTGAAG
5’ 3’
Exon 4
Exon 5
3’ 5’
ACTGCTGCGCGACGAGTTCTTG
GH R
gag’ctggaa : az AluI enzim felismerő helye (Genbank Accession Number J00008, WOYCHIK és mtsai, 1982)
3.3.2.2 GHR gén, AluI polimorfizmus (A/G lókusz) A növekedési hormon receptor gén AluI polimorfizmusának azonosítására használt primerek a szarvasmarha GHR gén ismert DNS szekvenciája (HAUSER és mtsai, 1990), valamint a humán GHR gén genomiális DNS szekvenciája (Genbank Accession Number: AF140284; GODOWSKI és mtsai, 1989) alapján készültek. A két primer a gén egy 286 bázispár hosszúságú szakaszát fogta közre.
48
Anyag és módszer GHRE 10F: 5’ CACTTACTTCTGCGAGGTATAGGC 3’ GHRE 10R: 5’ TCAAAGAGAGTAGCACACCGATA 3’ A 286 bázispár hosszú DNS szakasz magában foglalja a mutációt tartalmazó 10. exont (GE és mtsai, 2000) (4. ábra). 4. ábra: A növekedési hormon receptor gén 286 bp szakaszának előállítása és a a termék szekvenciájában található AluI hasítási hely azonosítása GHRE 10F CGGATATGGAGCGTCTTCATTCAG
5’ 3’
3’
Exon 10
5’
TCAAAGAGAGTAGCACACCGATA
GHRE 10R
gagccaag’ct
: az AluI enzim felismerő helye (Genbank Accession Number AF140284, GE és mtsai, 2000)
3.3.3 A PCR reakció 3.3.3.1 GH gén, AluI polimorfizmus (L/V lókusz) A PCR elegy teljes mennyisége 10 μl volt és a következő összetevőkből állt: 1 mM MgCl2, 200 μM dNTP, 0,2 μM GH F primer és GH R primer, PCR puffer (összetétel: 50 mM KCl, 10mM Tris-HCl pH=8,0, 1% Triton X-100), 0,5 U TaqI DNS polimeráz (Promega), valamint 100 ng genomiális DNS.
49
Anyag és módszer A PCR reakció a következő körülmények között zajlott: A ciklusok profilja először egy 1 perces, 94°C-os denaturáló szakaszt tartalmazott. Ezután 32 háromfázisos ciklus követte egymást; ahol az első fázis a 94°C-os denaturáció (30 másodperc) volt, a második fázis a primerek felkapcsolódását segítette a denaturálódott DNS szálhoz (61°C, 1 perc), a harmadik fázisban pedig a DNS szál továbbépítése zajlott 72°C-on (1 perc). A 32 ciklust követően egy 10 perces 72°C-os ciklus zárta a folyamatot.
3.3.3.2 GHR gén, AluI polimorfizmus (A/G lókusz) A PCR elegy teljes mennyisége 40 μl volt és a következő összetevőkből állt: 200 μM dNTP, 0,2 μM GHRE 10F primer és GHRE 10R primer, PCR puffer (10 mM Tris-HCl, 1,5 mM MgCl2, 50 mM KCl, 0,1% pH=8,8, Triton X100), 0,5 U DyNazyme DNS polimeráz (Finnzymes), valamint100 ng genomiális DNS. A PCR reakció a következő körülmények között zajlott: A ciklusok profilja egy 1 perces, 94°C-os denaturáló szakaszt tartalmazott. Ezután 32 háromfázisos ciklus követte egymást; ahol az első fázis a 94°C-os denaturáció (10 másodperc) volt, a második fázis a primerek felkapcsolódását segítette a denaturálódott DNS szálhoz (57°C, 10 másodperc), a harmadik fázisban pedig a DNS szál továbbépítése zajlott 72°C-on (30 másodperc). Végül, a 32 ciklust követően egy 10 perces 72°C-os ciklus zárta a folyamatot.
50
Anyag és módszer
3.3.4 Restrikciós emésztés (RFLP) Az amplifikációt követően a keletkezett PCR terméket 5 U AluI (Promega) restrikciós endonukleázzal emésztettem. Az enzim különbséget tesz a két-két változat (L és V, illetve A és G) között azáltal, hogy az enzimre jellemző hasítási hely megléte vagy hiánya szerint hasítja, vagy nem hasítja a felszaporított DNS fragmentumokat.
3.3.5 Az elválasztó mátrix előkészítése az elektroforézishez A
szilárd
agaróz
és
a
gélkoncentrációnak
(4%)
megfelelő
TBE
puffermennyiség elegyítése után, a szuszpenziót forráspontig melegítettem, az agarózt keverés közben feloldottam. Az elpárolgott puffermennyiség pótlása, és ethidium-bromid festőanyag hozzáadása, majd pedig az agaróz hőmérsékletének 650C alá történő csökkentése után a gélt - a TBE puffert tartalmazó - Maxi H 3000 plexikádhoz tartozó tálcába öntöttem. Az elválasztómátrix kialakulása után a gélt a felhasználás pillanatáig 4 °C-os hőmérsékleten tároltam.
3.3.6 Elektroforézis A hasított DNS fragmentumokat ezután az előbb leírt módon elkészített gélre vittem fel. Az elektroforézist 2 x 8 perc időtartam alatt, 5 illetve 10 V/cm térerősségen végeztem, Power Pac 1000 (Bio Rad, Richmond, CA, USA) készülék segítségével, egyfázisú puffer rendszert (TBE) tartalmazó Maxi H 3000 plexikádakban (BRC, Szeged). Az ethidium-bromiddal festett gélen a DNS-sávok kiértékelését UV lámpa (Vilber Lourmat, France, 312 nm) segítségével, átvilágítással végeztem, a
51
Anyag és módszer kapott elválasztási minták fényképezéshez optikai szűrővel ellátott Olympus F1.8 típusú digitális fényképezőgépet használtam.
3.4 Adatbáziskezelés és statisztikai vizsgálatok A vizsgált polimorfizmusok feltételezett – többek között a laktációs teljesítményt növelő - hatásainak elemezéséhez az állatok laktációs adatait és néhány szaporodásbiológiai mutatót használtam fel. A laktációs adatbázis a tejelő napok számát, a törzskönyvi perzisztencia mutatószámát, a befejések átlag tejhozamát (kg), maximális tejhozamát (kg), a laktációs (305 napos) tejhozamot (kg), a laktációs (305 napos) tejzsír (kg és %), valamint a laktációs (305 napos) tejfehérje (kg és %), adatait foglalta magában. Ezek a teljesítményadatok 10 egymást követő laktációs periódusban kerültek rögzítésre. A statisztikai analízis során azonban mindössze a tehenek első négy laktációját vettem figyelembe. A további laktációk során ugyanis egyre több egyed esett ki a termelésből, így a statisztikailag megbízható érték alá csökkent az adatok száma. Az árutermelő tejelő tehenészetekben (holstein-fríz fajta) a gyakorlatban amúgy is csupán átlagosan 2,5 laktáció a hasznos élettartam. Az egyes laktációs adatok a 305 vagy több napig laktáló tehenek 305 napos teljesítményeit tartalmazzák. A befejési adatok esetében is kikötés volt, hogy az adatbázisba bekerült állat rendelkezzen minimum 60 napos tejtermeléssel. A szaporodásbiológiai adatbázis a következő adatmezőket tartalmazta: első elléskori életkor (nap), két ellés közötti idő (nap), ellések száma, szárazonállás ideje (nap). Összegezve az adatbázis összesen 365 genotipizált bikanevelő tehén 721 laktációs és szaporodásbiológiai eredményét tartalmazza. 52
Anyag és módszer
2. táblázat: A vizsgált termelési és reprodukciós adatok leíró statisztika tulajdonságok n minimum maximum átlag ellések száma 721 1 4 1,74 első ellsékori életkor 365 674 1100 791,42 két ellés közötti idő 357 311 697 431,70 tejelő napok száma 505 240 669 365,11 szárazonállás ideje 496 15 196 60,72 max. befejési tej kg 504 25,2 65,6 41,782 átlagos befejési tej kg 504 16,8 48,0 33,380 perzisztencia 510 51,8 94,6 80,453 305napos tejhozam (kg) 720 4140 15678 10044,4 305napos tejzsír% 717 2,40 5,89 3,4137 305napos tejzsírhozam (kg) 717 171 698 340,38 305napos tejfehérje% 708 2,20 5,79 3,1850 305napos fehérjehozam (kg) 708 137 686 318,69
SD 0,89 55,92 75,28 72,33 21,89 6,707 4,656 6,534 1492,2 0,4184 52,34 0,2265 44,80
A 2. táblázat a kísérletben vizsgált laktációs és szaporodásbiológiai tulajdonságok minimum, maximum és átlagértékeit mutatja. Az itt felsorolt adatok a populáció évek során elért nagy átlagát reprezentálják, nincsenek tenyészetek, sem laktációs szám szerint elkülönítve.
3.4.1 Statisztikai analízis 3.4.1.1 Populációegyensúly-vizsgálatok A genotipizálást követően mindkét lókusz esetében megvizsgáltam, hogy a mintapopuláció populációgenetikai szempontból egyensúlyi helyzetben vane. A kapott és a várható allélgyakorisági értékek felhasználásával a HardyWeinberg egyenlet alapján számoltam. A feltételezett populációegyensúlyt a χ2 értékének kiszámolásával lehet alátámasztani. Amennyiben χ2 értéke alacsony és p>0,05, akkor a vizsgált 53
Anyag és módszer hipotézis, vagyis hogy a mintapopulációban Hardy-Weinberg egyensúlyt feltételezünk, beigazolódik. Ha azonban az eredmény magas χ2 érték és p<0,05, abban az esetben az alaphipotézisünk elvethető.
3.4.1.2 Hatásvizsgálat A vizsgált lókuszok (GH-AluI és GHR-AluI), valamint a termelési és reprodukciós adatok közötti feltételezett kapcsolat statisztikai bizonyítására az egyváltozós, a többváltozós varianciaanalízis, valamint a becsült marginális átlag módszerét alkalmaztam. A statisztikai elemzéseket SPSS 11.0 for Windows szoftver segítségével végeztem.
3.4.1.2.1 GLM (általános lineáris modell) Az általános lineáris modell (GLM) analízis a növekedési hormon AluI lókusz esetében a következő képlet alapján történt: yijklm = μ + GHi+ ellések számaj+ GHi
*
ellések számaj + évk+ évszakl+
tenyészetm+ eijklm ahol y a vizsgált tulajdonság fenotípusos megnyilvánulása, μ az általános átlag, GH az állat növekedési hormon genotípusa (LL, LV, VV), az ellések száma a lezárt laktációk számára utal, az év képviseli az adott állat születési évét, az évszak az ellés évszakát jelenti (tél, tavasz, nyár, ősz) (n=4), a tenyészet az adott tenyészet, illetve az ott folyó menedzsment hatását képviseli, és végül e a maradék hiba.
54
Anyag és módszer Az általános lineáris modell (GLM) analízis a növekedési hormon receptor AluI lókusz esetében a következő képlet alapján történt: yijklm = μ + GHRi+ ellések számaj+ GHRi * ellések számaj + évk+ évszakl+ tenyészetm+ eijklm ahol y a vizsgált tulajdonság fenotípusos megnyilvánulása, μ az általános átlag, GHR az állat növekedési hormon receptor genotípusa (AA, AG, GG), az ellések száma a lezárt laktációk számára utal, az év képviseli az adott állat születési évét, az évszak az ellés évszakát jelenti (tél, tavasz, nyár, ősz) (n=4), a tenyészet az adott tenyészet, illetve az ott folyó menedzsment hatását képviseli, és végül e a maradék hiba.
3.4.1.2.2 Dominancia és additív hatás Az egyes allélok, illetve genotípusok dominancia hatását is kiszámítottam. A heterozigóta állatok tulajdonságainak átlagait kivontam a homozigóták által produkált átlagértékekből a legkisebb négyzetes átlagokat használva. Az additív hatás kiszámításánál a két homozigóta vizsgált tulajdonságai közötti különbség felével kalkuláltam. Végül, a fent említett statisztikai mutatószámok szignifikancia szintjének kiszámításánál a legkisebb négyzetes különbségek (least square differencies) módszerét használtam (Fisher–féle LSD teszt).
55
Eredmények és megbeszélésük
4 EREDMÉNYEK ÉS MEGBESZÉLÉSÜK 4.1 Allél- és genotípus-megoszlási értékek 4.1.1 GH gén, AluI polimorfizmus (L/V lókusz) 5. ábra: A szarvasmarha növekedési hormon gén AluI változatai 4%-os agaróz gélen
L
T
LL
LV
VV 264 bp 147 bp 96 bp 51 bp
L: molekulalétra (lépcsőfokok 100 bp-onként) T: termék: a PCR segítségével felszaporított 427 bp hosszúságú DNS fragmentum LL, LV, VV: a három GH genotípus/változat
56
Eredmények és megbeszélésük A PCR reakció segítségével amplifikált 427 bázispár hosszúságú DNS szakasz AluI restrikciós endonuklázzal való hasítása eredményeképpen az agaróz gélen UV fény segítségével 3 különböző mintázatot (genotípust) sikerült megkülönböztetnem: egy 4 sávos (LL), egy 5 sávos (LV) és egy 3 sávos (VV) mintázatot. Ez a három genotípus értelemszerűen két allél (L és V allél) kombinációjaként értelmezhető (5. ábra). A 363 vérminta genotipizálását követően a vizsgált holstein-fríz bikanevelő tehén populációban a következő allélgyakorisági értékeket találtam: L allél: 93%; V allél 7 %. A fentiekhez hasonló értékeket kaptak többek között SCHLEE és mtsai. (1994), akik német és bajor tájfajtákat vizsgálva 90 és 80%-os allélgyakoriságot állapítottak meg az L allélra nézve. MITRA és mtsai. (1995) indiai fajtát (Sahiwal) genotipizáltak és 96%-os L gyakorisági értéket kaptak. SARBOUR és LIN (1996) kanadai holstein-fríz mesterséges termékenyítő bikák között 9%-os V (tehát 91%-os L) allélgyakorisági értéket talált. Több fajtát bevonva a kísérletbe, ezt az eredményüket egy később született tanulmányban is megerősítették (SABOUR és mtsai, 1997). LOVENDAHL és mtsai. (1997) dán holstein-fríz borjakat tanulmányozva, az általam kapott értékekkel teljesen azonos módon 93%-os L allél gyakoriságot regisztráltak (és SORENSEN és mtsai, 2002). A dán jersey állomány azonban egy kissé más képet mutatott a csupán 53%-os L gyakorisággal. SHARIFLOU és mtsai. (2000) szintén magas, 83%-os L allélfrekvenciát mutattak ki ausztráliai holstein populációban. Keresztezett lengyel holstein állományban DYBUS (2002b) 82%-os L gyakoriságot kapott. LECHNIAK és mtsai. (1999) több fajtát vizsgálva megállapították, hogy tejelő fajtákban
57
Eredmények és megbeszélésük az L allél gyakorisága általában magasabb és jelen dolgozat eredményeihez közelít (86%), míg hústípusú fajtákban ez az arány mindössze 38%. Az itt tapasztaltakkal szemben azonban születtek ellentétes, vagy némileg eltérő eredmények is: ZHANG és mtsai. (1993b) szerint, akik amerikai mesterséges termékenyítésre használt bikákat genotipizáltak, a V allél gyakorisága 90%-os volt! ZWIERZCHOWSKI és mtsai. (1998) is az addig közölt értékeknél magasabb V allélgyakoriságot találtak (V: 39%). CHRENEK és mtsai. (1998a) szlovákiai holstein mintán vizsgálva 72%-os L allélgyakoriságot kaptak. Ugyanezen szerzők valamivel később borzderes fajtában állapítottak meg magasabb V allélgyakoriságot (V: 40%) (CHRENEK és mtsai, 1999). CITEK és mtsai. (1998) tejelő típusú cseh fajtákban szintén magas (30-49%) V gyakorisági értékeket mutattak ki. A 6. ábra bemutatja, hogy a sztenderd 48 mintát befogadni képes PCR készülék által limitált futtatási sor milyen átlagos képet mutatott a genotípusok megoszlása tekintetében. Jól látható, hogy a képen főleg az LL genotípus dominál, és ritkábban akad csak néhány LV genotípusú egyed, sőt VV genotípus ebben a sorozatban nem is szerepel.
58
Eredmények és megbeszélésük 6. ábra: A mintasokaságot jellemző genotípus-eloszlású gélkép
Az általam vizsgált populációban az allélok kombinációjaként létrejött genotípusok számszerű megoszlása a következő volt: LL: 87,05%; LV: 12,40% és VV: 0,55% (7. ábra). A 7. ábrán jól látható és az adatokból is kitűnik, hogy a VV genotípus aránya igen alacsony volt. A százalékos arányban kifejezett 0,55% számszerűleg csupán 2 egyedet jelentett! Mivel statisztikailag nem megbízható mennyiségről van szó, így természetesen az összehasonlító vizsgálatoknál (varianciaanalízis) ez a genotípust nem vettem figyelembe, vagy az eredményeket az előbb említetteknek megfelelően értelmeztem.
59
Eredmények és megbeszélésük 7. ábra: A növekedési hormon gén AluI genotípusainak százalékos eloszlása a vizsgált mintapopulációban GH LV lókusz
LV 12,4%
VV ,6%
LL 87,1%
4.1.1.1 Populációgenetikai számítások A kapott gyakorisági értékek felhasználásával, a genotípusok várható számát a Hardy-Weinberg egyenletnek megfelelően, az alábbi képletek segítségével határoztam meg: PL = 2 GH LL + GH LV 2N
ÉS
qV = 2 GH VV + GH LV 2N
ahol: pL és qV: az L és V allél várt gyakorisági értékei; GH LL, GH LV és GH VV: a különböző genotípusú tehenek száma N: az összes genotipizált állat
60
Eredmények és megbeszélésük GH LL = n x p2 GH VV = n x q2 GH LV = 2n x p x q ahol: GH LL, GH LV és GH VV: a három genotípus várt eloszlási gyakorisága A fenti Hardy-Weinberg képletek alapján az azonosított három GH genotípus várt megoszlási gyakorisága 86,5 % (LL), 13 % (LV), valamint 0,5 % (VV) volt. A populációegyensúly alapján várt gyakorisági értékeket összevetve a megfigyelt gyakorisági értékekkel (87, 05 % (LL), 12,40 % (LV) és 0,55 % (VV)) kiderül, hogy a várt és a megfigyelt eloszlás adatai igen közel vannak egymáshoz. A feltételezett populációegyensúlyt a χ2 értékének kiszámolásával lehet alátámasztani, mely jelen esetben χ2=0,138 volt. Ez az alacsony χ2 a magas szignifikancia szinttel párosulva azt jelenti, hogy a vizsgált hipotézis, vagyis hogy a mintapopulációban Hardy-Weinberg egyensúlyt feltételeztünk, beigazolódott (3. táblázat). Amennyiben egy populációban a Hardy-Weinberg aránytól való szignifikáns eltérés tapasztalható, akkor feltételezhetjük, hogy a vizsgált lókuszra nézve a populáció nem ideális, tehát pl. az utódok életbenmaradási esélye attól is függ, hogy a lókusz mely allélját hordozzák (szelekció). Ez a szelekciós nyomás ebben az esetben azonban nem érvényesült. Előfordulhat azonban az is, hogy az eltérés csak látszólagos, mert az arányokat torzítja a mintavétel, pl ha a viszonylag kisszámú minta több kisebb populációból származik, amelyek allélgyakorisága különbözik. Ebben 61
Eredmények és megbeszélésük az esetben, ha az egyes részpopulációkat a minta nem arányosan reprezentálja, a tapasztalt allélgyakoriság eltérhet a Hardy-Weinberg egyensúly alapján várt értéktől. A vizsgált mintapopuláció azonban valószínűleg jól jellemzi a hazai holstein-fríz bikanevelő tehén állományt. Az állatok az ország 6 különböző részében lévő tenyészetekből származnak és a magyar bikanevelő populáció döntő hányadát képviselik. 3. táblázat: A GH AluI genotípusok megoszlása és χ2 értéke a vizsgált holstein-fríz bikanevelő tehén populációban N
LL
LV
VV
363
316 (314)
45 (47,2)
2 (1,8)
100%
87,05% (86,5%)
12,40% (13%)
0,55% (0,5%)
χ2
p
0,138
0,934
(zárójelbe foglalva a várt, megvastagítva a megfigyelt értékek találhatók) (df=2, p=0,05) A kísérletben szereplő állatok nem voltak rokonságban egymással, különböző anyáktól és apáktól, valamint különböző tenyészetekből (6 tenyészet) származtak. A növekedési hormon genotípusok megoszlása az egyes tenyészetekben a 4. táblázat szerinti módon alakult. Látható, hogy az igen ritka VV genotípus mindössze két tenyészetben fordult elő!
62
Eredmények és megbeszélésük 4. táblázat: A három GH genotípus megoszlása tenyészetek szerinti bontásban tenyészet 1 tenyészet 2 tenyészet 3 tenyészet 4 tenyészet 5 tenyészet 6 összesen
N 63 (17,4%) 136 (37,5%) 76 (20,9%) 33 (9,1%) 25 (6,9%) 30 (8,3%) 363 (100%)
LL (%) LV (%) 88,9 11,1 92,6 7,4 77,6 21,1 84,8 12,1 80,0 20,0 90,0 10,0 87,1 12,4
63
VV (%) 1,3 3,0 0,6
Eredmények és megbeszélésük
4.1.2
GHR gén, AluI polimorfizmus (A/G lókusz)
A vizsgált 286 bázispár hosszúságú DNS szakasz AluI restrikciós endonuklázzal való hasítása után az agaróz gélen UV fény segítségével ebben az esetben is 3 különböző mintázatot (genotípust) sikerült megkülönböztetni: egy 3 sávos (AA), egy 4 sávos (AG) és egy 2 sávos (GG) mintázatot (8. ábra). 8. ábra: A szarvasmarha növekedési hormon receptor gén AluI változatai 4%os agaróz gélen
L
T
AA
AG
GG
155 bp 131 bp 81 bp 50 bp L: molekulalétra (lépcsőfokok 100 bp-onként) T: termék: a PCR segítségével felszaporított 286 bp hosszúságú DNS fragmentum AA, AG, GG: a három GHR genotípus/változat 64
Eredmények és megbeszélésük Valamennyi minta (365) genotipizálását követően a vizsgált holstein-fríz bikanevelő tehén populációban a következő allélgyakorisági értékeket találtam: A allél: 88%; G allél 12 %. Az allélok kombinációjaként létrejött genotípusok megoszlása e lókusz esetében a következő volt: AA: 77,8%; AG: 20,6% és GG: 1,6% (9. ábra). 9. ábra: A növekedési hormon receptor gén AluI genotípusainak százalékos eloszlása a vizsgált mintapopulációban GHR AG lókusz
AG 20,5%
GG 1,6%
AA 77,8%
GE és mtsai. (2000), akik az általam is vizsgált polimorfizmust először leírták, hasonló allélarányokat (A: 79%) mutattak ki angus borjaknál. DI STASIO és mtsai. (2005), szintén angus fajtát vizsgálva ugyancsak az itt találtakkal azonos eredményre jutottak, 79%-os A allélgyakorisági értékkel.
65
Eredmények és megbeszélésük 4.1.2.1 Populációgenetikai számítások Az előző alfejezetben részletesen ismertetett Hardy-Weinberg képletek (amelyek ebben az esetben a megfelelő genotípusok jeleivel módosítandók) alapján a GHR gén három genotípusának várt megoszlási gyakorisága 77,4 % (AA), 21,1 % (AG), valamint 1,5% (GG) volt. A populációegyensúly alapján várt gyakorisági értékeket összevetve a megfigyelt gyakorisági értékekkel (77,8 % (AA), 20,6 % (AG) és 1,6 % (GG)) látható, hogy a várt és a megfigyelt eloszlás adatai ez esetben is szinte teljesen azonosak voltak. A növekedési hormon receptor gén AluI polimorfizmusa esetében a χ2 értéke 0,157 volt. Ez az igen alacsony χ2 és a kapott szignifikancia szint pedig a Hardy-Weinberg egyensúly meglétére utal a vizsgált mintapopulációban (5. táblázat). 5. táblázat: A GHR AluI genotípusok megoszlása és χ2 értéke a vizsgált holstein-fríz bikanevelő tehén populációban N
AA
AG
GG
365
284 (282,6)
75 (77,1)
6 (5,3)
100%
77,8% (77,4%)
20,6% (21,1%)
1,6% (1,5%)
χ2
p
0,157
0,925
(zárójelben a várt, kiemelve a megfigyelt értékek találhatók) (df=2, p=0,05) A növekedési hormon genotípusok megoszlása az egyes tenyészetekben az 6. táblázatban leírt arányok szerint alakult. A legritkábban előforduló GG genotípus sajnos nem minden tenyészetben volt megtalálható, ezért az egyes tenyészetenkénti összehasonlító-vizsgálatok nem lehetnének teljesek.
66
Eredmények és megbeszélésük 6. táblázat: A három GHR genotípus megoszlása tenyészetek szerinti bontásban tenyészet 1 tenyészet 2 tenyészet 3 tenyészet 4 tenyészet 5 tenyészet 6 összesen
N 63 (17,3%) 136 (37,3%) 75 (20,5%) 33 (9,0%) 28 (7,7%) 30 (8,2%) 365 (100%)
AA (%) AG (%) GG (%) 74,6 23,8 1,6 79,4 19,9 0,7 73,3 21,3 5,4 85 15 71,4 28,6 86,7 13,3 77,8 20,6 1,6
67
Eredmények és megbeszélésük
4.2 Statisztikai analízis A GH és a GHR gén polimorfizmusainak feltételezett hatásait tanulmányozva az állatok laktációs és szaporodásbiológiai adatait hasonlítottam össze az anyag és módszer fejezetben említett statisztikai módszerek segítségével.
4.2.1 Leíró statisztika A vizsgált tulajdonságok adatszerű bemutatását (átlag és szórás értékét) genotípus szerinti bontásban a 7. és a 8. táblázat tartalmazza. 7.
táblázat:
A
vizsgált
bikanevelő
tehén
populáció
laktációs
és
szaporodásbiológiai tulajdonságainak leíró statisztikája az egyes GH-AluI genotípusok szerinti bontásban tulajdonságok első elléskori életkor (nap) két ellés közötti idő (nap) tejelő napok száma szárazonállás (nap) max. befejt tej kg átlagos befejt tej kg perzisztencia 305napos tejhozam (kg) 305napos tejzsír % 305napos tejzsír hozam kg 305 napos fehérje % 305 napos feh.hozam (kg)
LL átlag 790,37 431,69 362,97 59,67 41,5 33,09 80,27 10003 3,42 339,46 3,19 318,1
SD 54,05 75,77 70,23 22,11 6,68 4,59 6,5 1477 0,43 52,19 0,23 44,78
GH LV lókusz LV VV átlag SD átlag SD 800,4 68,3 756 7,07 427,3 69,08 528 110,31 373,98 81,87 454,5 87,23 68 19,48 56,25 15,5 43,83 6,7 39,42 4,87 35,32 4,75 33,28 4,3 81,36 6,56 84,83 8,86 10335 1592 10158 1309 3,37 0,33 3,47 0,6 346,62 54,33 346,75 20,52 3,14 0,2 3,18 0,29 322,72 45,86 320,75 20,55
Ezek az adatok az állatok teljesítményének számtani középértékeit és szórásait mutatják be genotípusonkénti csoportosításban. Önmagukban 68
Eredmények és megbeszélésük csupán tendenciákat jeleznek, a statisztikailag igazolható hatásokat a variancia-analízis módszere adja majd, amely figyelembe vesz több, a tejtermelést befolyásoló tényezőt is. 8.
táblázat:
A
vizsgált
bikanevelő
tehén
populáció
laktációs
és
szaporodásbiológiai tulajdonságainak leíró statisztikája a különböző GHRAluI genotípusok szerinti bontásban GHR AG lókusz AA AG átlag SD átlag SD első elléskori életkor (nap) 794,30 58,44 783,04 43,00 két ellés közötti idő (nap) 432,90 76,04 421,74 68,30 tejelő napok száma 363,84 69,04 364,02 80,96 szárazonállás (nap) 59,97 21,57 62,10 23,07 max. befejt tej kg 41,78 6,49 41,69 7,22 átlagos befejt tej kg 33,33 4,47 33,41 5,24 perzisztencia 80,37 6,74 80,59 5,76 305napos tejhozam (kg) 10001 1425 10125 1632 305napos tejzsír % 3,44 0,42 3,35 0,41 305napos tejzsír hozam (kg) 341,44 52,73 336,49 51,46 305 napos fehérje % 3,19 0,23 3,18 0,22 305 napos fehérje hozam (kg) 318,09 43,93 320,18 46,86 tulajdonságok
GG átlag SD 773,67 76,42 515,40103,02 401,09 79,97 70,45 22,03 43,00 8,96 34,50 5,12 81,19 7,68 10868 2410 3,12 0,34 332,91 49,47 3,00 0,11 324,00 63,57
Nyilvánvalóan az állatok tejtermelési és a szaporodásbiológiai teljesítménye nem kizárólagosan és nem elsősorban a növekedési hormon genotípus függvénye. Feltételezve, hogy a bikanevelő tehenek tartási és menedzsment körülményei sztenderdek és összehasonlíthatóak, a gyakorlati megvalósítás és a véletlen események torzító hatását matematikai módszerek segítségével kell kiküszöbölnünk. Az adatok nagy eltérést mutatnak az egyes gazdaságok (9. táblázat), évjáratok és természetesen a laktáció sorszámát illetően (10. táblázat). Ezek a különbségek néhol meglehetősen nagyok, statisztikailag is jelentős 69
Eredmények és megbeszélésük mértékűek. Akkor is, ha az esetenként magasabb szórásértékeket is figyelembe vesszük az összehasonlításkor. Ez is alátámasztja egy, a teljesítményt befolyásoló faktorokat kiegyenlíteni képes matematikai modell felállításának szükségességét. 9. táblázat: A vizsgált populáció laktációs és szaporodásbiológiai adatainak leíró statisztikája a különböző tenyészetekben tulajdonságok
tenyészetek A átlag SD
B
C
átlag SD
átlag SD
D átlag SD
E
F
átlag SD
átlag SD
1. elléskori kor 775,86 40,07 792,69 47,92 788,78 45,83 802,85 50,43 836,56 98,78 774,87 76,55 2 ellés közi idő 444,24 70,76 428,68 78,00 432,79 78,93 431,16 73,60 436,53 64,22 420,97 73,47 tejelő napok
383,49 69,35 364,99 74,35 354,50 75,23 369,20 63,39 368,98 68,99 366,77 74,96
szárazonállás
66,68 33,79 57,18 15,12 60,28 20,81 61,57 25,39 65,31 20,41 63,46 25,49
max. befejt tejkg 41,78 6,95 42,32 6,95 41,22 6,80 42,80 6,28 40,92 5,57 40,77 6,87 átlag befejt tejkg 32,71 5,41 33,68 4,39 33,97 5,12 33,29 4,83 32,60 3,46 32,56 4,38 perzisztencia
78,53 6,11 80,21 6,16 82,94 6,19 78,22 7,79 80,10 5,38 80,50 6,05
305 n tej kg
10001 1587 10041 1449 10240 1612 10077 1543 9859 1072 9795 1393
305 n zsír% 305 n zsírkg 305 n tejfeh.%
3,37 0,58
3,37 0,34
3,37 0,37
3,42 0,42
3,51 0,41
3,70 0,37
332,43 59,81 335,91 45,05 343,15 57,53 343,50 57,54 344,83 47,62 360,55 47,29 3,24 0,37
3,19 0,18
3,09 0,17
3,29 0,22
3,14 0,14
3,18 0,17
305 n tejfeh.kg 322,93 56,35 318,90 40,64 315,37 47,28 330,19 45,09 309,38 29,45 310,09 39,25
10. táblázat: A vizsgált populáció laktációs és szaporodásbiológiai adatainak laktációs sorszám szerinti bontásban bemutatott leíró statisztikája tulajdonságok
1 átlag
SD
70
ellések száma 2 3 átlag SD átlag SD
4 átlag
SD
Eredmények és megbeszélésük első elléskori életkor (nap) két ellés közötti idő (nap) tejelő napok száma szárazonállás (nap) max. befejt tej kg átlagos befejt tej kg perzisztencia 305n tejhozam (kg) 305n tejzsír % 305n tejzsír hozam (kg) 305n fehérje % 305n fehérje hozam (kg)
791,42 55,92 - 438,91 77,03 416,23 69,05 430,84 76,51 374,82 71,46 356,46 76,21 354,67 68,73 346,52 49,71 62,14 17,28 56,42 22,52 60,78 27,43 75,45 37,32 37,86 4,40 44,95 5,92 47,70 6,13 46,79 7,55 31,42 3,33 35,00 4,80 36,35 4,57 35,59 6,76 83,32 5,46 78,10 6,56 76,51 5,08 76,03 6,68 9419 1155 10447 1513 11028 1406 11111 1696 3,43 0,40 3,40 0,45 3,39 0,37 3,34 0,41 320,99 37,01 353,73 61,72 371,01 47,33 368,71 57,55 3,21 0,19 3,17 0,29 3,15 0,20 3,14 0,23 301,27 32,22 330,18 51,52 346,33 38,91 348,43 49,86
A vizsgálatba bevont paraméterek eloszlásának típusát mutatja be a következő táblázat (11. táblázat). A normalitás vizsgálathoz a KolmogorovSzmirnov tesztet használtam. A teszt azt a nullhipotézist teszteli, hogy vajon az adatok a normális eloszlást követik-e. A p<0,05 szignifikancia szint alatti értékek az adathalmaznak a normális eloszlástól való szignifikánsan eltérését jelzi. Az eredmények szerint az első elléskori életkor kivételével az összes többi tulajdonság normális eloszlású. Mivel a legtöbb statisztikai teszt az adatok normális eloszlását feltételezi, tehát a hatásvizsgálatok elvégzésének nincs akadálya. Példaként a 305 napos tej kg tulajdonságának normális eloszlásáról készült hisztogrammot mutatom be.
71
Eredmények és megbeszélésük 11. táblázat: A normalitás vizsgálat eredményei tulajdonságonként tulajdonságok első elléskori életkor két ellés közötti idő tejelő napok száma szárazonállás max. befejt tej kg átlag befejt tej kg perzisztencia 305 napos tejhozam 305 napos tejzsír % 305 napos tejzsír kg 305 napos tejfehérje % 305 napos tejfehérje kg
0,153 0,045 0,039 0,061 0,026 0,056 0,041 0,040 0,051 0,049 0,050 0,056
p 0,001 0,056 0,052 0,048 0,200 0,050 0,200 0,200 0,200 0,200 0,080 0,061
10. ábra: A 305 napos tejhozam adatainak eloszlása hisztogrammon ábrázolva 40
30
20
Frequency
10
Std. Dev = 1569,84 Mean = 10569,7 N = 241,00
0
0 0, 00 14 0 0, 00 13 0 0, 00 12 0 0, 00 11 0 0, 00 10
,0 00 90
,0 00 80
,0 00 70
,0 00 60
,0 00 50
,0 00 40
305 napos tejhozam
72
Eredmények és megbeszélésük
4.2.2 Hatásvizsgálat 4.2.2.1 A növekedési hormon gén AluI polimorfizmusa és a vizsgált tulajdonságok közötti összefüggés 4.2.2.1.1 Többváltozós variancianalízis eredményeinek összehasonlítása A különböző korú, laktációs sorszámú, különböző környezetben élő, stb. bikanevelő
tehenek
összehasonlíthatóságát
egy
matematikai
modell
felállításával lehet elérni. Az egyedek tejtermelését és a szaporodásbiológiai mutatókat befolyásoló tényezőket lehetőség szerint mind figyelembe véve a 3.4.1.2.1. fejezetben ismertetett modellt állítottam fel és alkalmaztam a továbbiakban. Az egyenlet felállításakor az állatmodell (animal model) felépítését is figyelembe vettem. Az apahatás elhagyásának, illetve figyelmen kívül hagyásának több oka is volt. Egyrészt, mert az apák lányainak teljesítménye (ITV) ismeretlen volt, másrészt a vizsgált 363 (illetve a GHR lókusz esetében 365 bikanevelő tehén) több mint 200 apától származott, lehetetlenné téve ezzel az egyes apák hatásainak megfelelő összehasonlítását. Harmadrészt, ha feltételezzük, hogy a vizsgált lókuszok markerei lehetnek a tejtermeléssel kapcsolatos tulajdonságoknak, tehát valamiféle kapcsoltságot feltételezünk a tejtermelést és a növekedési hormont és hormon receptort kódoló lókuszok között, abban az esetben tulajdonképpen a GH genotípus jelenléte a modellben az apahatást is magában foglalja. A modellben szereplő faktorok szignifikancia szintjét, vagyis az állatok teljesítményére gyakorolt hatások erősségét illetve, jelentősségét a 12. és a 13. táblázat mutatja be. A faktorok hatásainak mértékét a leggyakrabban 73
Eredmények és megbeszélésük használt többváltozós varianciaanalízis módszerével (U-próba, más néven Wilks’ Lambda módszer) számítottam ki. A vizsgált szaporodásbiológiai mutatókra csupán a születési év (évjárat) és főleg a tenyészetek hatása bizonyult erősen szignifikánsnak. (12. táblázat) A növekedési hormon genotípusa ezt a tulajdonságcsoportot a modell alapján számolva csupán tendenciaszinten befolyásolta. A laktációk száma, a GH genotípus és a laktációs sorszám interakciója, valamint az ellési hónap gyakorlatilag semmilyen hatással nem voltak a vizsgált szaporodásbiológiai mutatókra. 12. táblázat: A modellben használt faktorok szaporodásbiológiai mutatókra gyakorolt hatásai többváltozós varianciaanalízis módszerével számolva (Upróba) Faktor p GH genotípus 0,086 elléssorszám 0,196 GH genotípus x elléssorszám 0,352 születési év 0,017* ellési évszak 0,132 tenyészet 0,0001*** (*: p<0,05; **p<0,01, ***p<0,005) A tejtermelési tulajdonságok analízisénél azonban kiderült, hogy a GH genotípus és a laktációs sorszám interakciós hatását kivéve valamennyi faktor erősen befolyásolta (p<0,01) a tulajdonságcsoportot (13. táblázat). Külön ki kell emelni a növekedési hormon génváltozatok hatását, ami szintén erősen szignifikáns módon (p<0,01) hatott a tejtermelési teljesítményre.
74
Eredmények és megbeszélésük 13. táblázat: A modellben használt faktorok tejtermelési tulajdonságokra gyakorolt hatásai többváltozós varianciaanalízis módszerével számolva (Upróba) Faktor p GH genotípus 0,008** elléssorszám 0,0001*** GH genotípus x elléssorszám 0,905 születési év 0,0001*** ellési évszak 0,0001*** tenyészet 0,0001*** (*: p<0,05; **p<0,01, ***p<0,005) Az Anyag és Módszer c. fejezetben ismertetett modell alapján számolt többváltozós varianciaanalízis fent ismertetett eredményei arra engednek következtetni, hogy a modellbe beépített faktorok mellett valószínűleg létezik egy tenyészet x ellési évszak interakció is. yijklm = μ + GHi+ ellések számaj+ GHi
*
ellések számaj + évk+ évszakl+
tenyészetm+ évszakl * tenyészetm + eijklm Ezen továbbfejlesztett képlet segítségével ismét kiszámoltam a felsorolt hatások erősségét (lásd 14. ás 15. táblázat). A két modell alapján kiszámított hatásokat összehasonlítva kiderül, hogy a tenyészet x ellési évszak faktor beépítésével a növekedési hormon genotípus reproduktív mutatókra gyakorolt hatása szignifikáns (p<0,05) mértékűvé vált. A feltételezett ellési évszak x tenyészet interakció befolyása azonban csak tendenciaszinten igazolódott.
75
Eredmények és megbeszélésük
14. táblázat: A továbbfejlesztett modell faktorainak szaporodásbiológiai mutatókra gyakorolt hatásai (U-próba) Faktor p GH genotípus 0,045* elléssorszám 0,147 GH genotípus x elléssorszám 0,361 születési év 0,013* ellési évszak 0,068 tenyészet 0,0001*** ellési évszak x tenyészet 0,063 (*: p<0,05; **p<0,01, ***p<0,005) A tejtermelésre gyakorolt hatások tekintetében az új modell hasonló eredményeket hozott a régi modellel számolt értékekhez, itt azonban az ellési évszak x tenyészet interakció hatása p<0,005 szinten szignifikánsnak mutatkozott. 15.
táblázat:
A
továbbfejléesztett
modell
tényezőinek
tulajdonságokra gyakorolt hatásai (U-próba) Faktor p GH genotípus 0,019* elléssorszám 0,0001*** GH genotípus x elléssorszám 0,906 születési év 0,0001*** ellési évszak 0,0001*** tenyészet 0,0001*** ellési évszak x tenyészet 0,0001*** (*: p<0,05; **p<0,01, ***p<0,005)
76
tejtermelési
Eredmények és megbeszélésük
4.2.2.1.2 A független változók hatásai A
16.
táblázat
részletesen,
az
egyes
vizsgált
tejtermelési
és
szaporodásbiológiai tulajdonságok szerint lebontva és a továbbfejlesztett modell alapján mutatja be a független változóként meghatározott faktorok hatásait. 16. táblázat: A vizsgált hatótényezők hatásai, illetve a hatások erőssége (szignifikaszintje) tulajdonságok szerinti bontásban Független változók GH ellésGH születési ellési függő változók genotí sorszám gen. x év évszak pus elléssor. 1. ellésk. életkor 0,043* 0,912 0,222 0,235 0,054 2ellés közötti idő0,166 0,029* 0,500 0,008** 0,254 szárazonállás 0,350 0,996 0,545 0,005** 0,102 tejelő napok sz. 0,100 0,042* 0,756 0,001*** 0,036* max. befejt tejkg 0,133 0,0001*** 0,988 0,225 0,011* átl. befejt tej kg 0,095 0,0001*** 0,782 0,392 0,094 perzisztencia 0,704 0,0001*** 0,665 0,005** 0,125 305napos tej kg 0,580 0,004*** 0,820 0,249 0,028* 305napos zsír % 0,599 0,816 0,906 0,047* 0,018* 305napos zsír kg 0,949 0,004*** 0,970 0,664 0,836 305napos feh.% 0,027* 0,450 0,919 0,015* 0,179 305napos feh. kg 0,809 0,011* 0,523 0,309 0,054
teny. 0,0001*** 0,979 0,147 0,230 0,066 0,055 0,0001*** 0,083 0,0001*** 0,032* 0,0001*** 0,038
ellési évszak x teny. 0,052 0,269 0,506 0,324 0,149 0,164 0,009** 0,008** 0,096 0,656 0,416 0,011*
(*: p<0,05; **p<0,01, ***p<0,005) A közölt szignifikancia szintek alapján elmondható, hogy a növekedési hormon lókusza szignifikánsan befolyásolta a 305 napos laktációs tejfehérje százalék értékét, valamint az első elléskori életkort. Tendenciaszintű hatás látható még a befejt tej átlagos szintjét illetően. A többi tulajdonság vonatkozásában azonban úgy tűnik más faktorok meghatározóbb hatással rendelkeztek. 77
Eredmények és megbeszélésük
A bGH/AluI allélvariációk, valamint a tejtermelési tulajdonságok közötti összefüggések feltárását végezte el SABOUR és LIN (1996) is kanadai holstein-fríz bikákat használva. Eredményeik szerint szoros kapcsolat van a növekedési hormon AluI genotípusok és a tejtermelési tulajdonságok, de főleg a tej fehérje tartalma között. Az egyes genotípusok, valamint a tejtermelés és a tejfehérje százalék közötti összefüggést több szerző is megerősíti (DYBUS, 2002a; CHUNG és mtsai, 1996; SHARIFLOU és mtsai, 1998; CHRENEK és mtsai, 1999). Saját eredményeimben (16. táblázat) a szaporodásbiológiai tulajdonságok közül az elléssorszám befolyásolta szignifikánsan (p<0,05) a két ellés közötti idő tulajdonságát, a tejelő napok számát, valamint a 305 napos tejfehérje kgot. Igen erősen szignifikáns (p<0,005) hatása volt a befejési eredményekre, valamint a tejtermelés perzisztenciájára, a 305 napos tej-, tejzsír hozamokra. A laktációs, illetve az elléssorszám tejtermelésre gyakorolt hatása világos és nem szorul külön magyarázatra. Kiegészítésként megjegyzendő, hogy vizsgálataimban négy egymást követő laktáció adatait használtam fel (lásd: 10. táblázat). A növekedési hormon lókusz és az elléssorszám interakciós faktorának hatása
a
tanulmányozott
tulajdonságokra
statisztikailag
nem
volt
bizonyítható, nem befolyásolta az állatok fenotípusos teljesítményét. Ez azt jelenti, hogy a két faktor közötti feltételezett interakció esetünkben nem mutatható ki. A születési év, mint fix faktor szignifikáns hatással bírt a két ellés közötti idő, a szárazonállás, a tejelő napok száma, a laktációs perzisztencia, valamint a 305 napos tejzsír- és tejfehérje % vonatkozásában. 78
Eredmények és megbeszélésük Az ellési évszak – az eltérő takarmányozási és klimatikus kondíciók által – szignifikáns módon hatott a tejelő napok számára, illetve, valamint a befejések maximumára, és a 305 napos tejhozam és tejzsír százalék értékére. Magától értetődően a külső fix faktorok közül a laktációsorszám mellett a tenyészetek hatása okozta a legszignifikánsabb különbségeket az állatok teljesítményében. A különböző menedzsment és esetleg takarmányozási protokoll, vagy a takarmányminőség, valamint az egyes tenyészetek eltérő mikroklímája tehető felelőssé ezekért az igen alacsony szignifikancia szintekért (vagyis erősen szignifikáns hatásokért). A tenyészet faktora a szaporodásbiológiai tulajdonságok közül az első elléskori életkorra hatott szignifikáns módon. A tejtermelést illetően a laktációs perzisztencia, a 305 napos tejzsír százalék és –hozam, valamint a 305 napos tejfehérje százalék adataiban mutatkozott szignifikáns különbség a tenyészetek hatásának köszönhetően. Az ellési évszak és a tenyészetek interakciója a törzskönyvi perzisztencia, valamint a 305 napos laktációs tejhozam értékeit erősen szignifikánsan befolyásolta, de a 305 napos tejfehérje kg-ra is szignifikáns (p<0,05) mértékben hatott.
4.2.2.1.3 A genotípusátlagok összevetése A többváltozós, összes tulajdonságot figyelembe vevő modell összefoglaló értékelése után, a GH AluI lókusz esetleges hatásainak felderítéséhez a különböző genotípuscsoportok teljesítményének összevetését is elvégeztem a Fisher-féle LSD teszt (least square differences; legkisebb négyzetes különbségek), illetve nem homogén varianciák esetében a Tamhane-féle teszt segítségével. 79
Eredmények és megbeszélésük A homogenitás-vizsgálat eredményei a legtöbb esetben egyenlő varianciákat mutattak (lásd 17 és 19. táblázat), de a varianciaanalízis szerencsére nem túl érzékeny a varianciák heterogenitására. A homogenitás hiánya csak akkor okoz gondot, ha a Levene’s teszt azt p<0,001 szinten igazolja. Az így homogénnek
mutatkozó
varianciájú
pereméterek
esetén
tehát
az
engedékenyebb, ám de hatékonyabb Fisher-féle LSD módszert használtam. 17. táblázat: A varianciák homogenitását vizsgáló Levene-féle teszt eredményei a szaporodásbiológiai mutatók esetében tulajdonság első elléskori életkor két ellés közötti idő
F 1,487 0,727
p 0,004 0,983
A vizsgált szaporodásbiológiai és a tejtermelési adatok legkisebb négyzetes átlagait (LSM), illetve azok páronkénti összehasonlítását mutatja be a 18., 20. és a 21. táblázat. A szaporodásbiológiai mutatóknál (18. táblázat) csak a két ellés közötti idő tulajdonságának összehasonlításakor mutatkozott szignifikáns különbség az egyes genotípus-csoportok között. Az LL és az LV genotípusú állatok adatai szignifikáns módon eltértek a VV genotípusú tehenek adataitól. Az LL és az LV genotípus közötti különbség azonban nem volt szignifikáns. Ez az eredmény azt bizonyítja, hogy a VV állatoknál átlagosan sokkal hosszabb a két ellés közötti idő. Ezt a következtetés azonban mégsem vonható le a VV tehenek nagy sztenderd hibája és viszonylag alacsony (de több laktáció adatait figyelembe véve, statisztikailag már értékelhető) előfordulási gyakorisága miatt!
80
Eredmények és megbeszélésük 18. táblázat: A szaporodásbiológiai mutatók legkisebb négyzetes átlagai és a sztenderd hibák az egyes genotípusokban LSM±SE első elléskori életkor két ellés közötti idő 790,74±6,75 432,35±10,05a LL 812,27±11,98 413,89±14,84a LV 756,17±26,35 528,98±39,25b VV (a, b betűk: az eltérő betűk a genotípusok közötti szignifikáns különbségre utalnak) GH genotípus
A varianciák homogenitásának vizsgálatát a tejtermelési paraméterek esetében is elvégeztem. A 19. táblázat egyértelműen mutatja, hogy a szárazonállás, az átlag befejt tej, a 305 napos tejhozam, valamint a 305 napos tejzsír- és tejfehérje kg estében a varianciák nem tekinthetőek homogénnek. Az egyes genotípusok összehasonlítását ezeknél a tulajdonságoknál a Tamhane-féle teszt segítségével végeztem. 19. táblázat: A varianciák homogenitását vizsgáló Levene-féle teszt eredményei a tejtermelési mutatóknál tulajdonságok tejelő napok száma szárazonállás max. befejt tej kg átlag befejt tej kg perzisztencia 305 napos tejhozam 305 napos tejzsír % 305 napos tejzsír kg 305 napos tejfehérje % 305 napos tejfehérje kg
F 1,216 1,547 1,114 1,514 1,067 1,648 1,153 1,921 1,175 1,869
p 0,062 0,000 0,198 0,001 0,305 0,000 0,132 0,000 0,103 0,000
A tejtermelési mutatók összehasonlításánál (20. táblázat) már több szignifikáns különbség is mutatkozott. A tejelő napok száma esetében a VV 81
Eredmények és megbeszélésük genotípusú állatok magasabb értéke szignifikánsan különbözött az LL és az LV genotípusú tehenek hasonló értékeitől (10. ábra). Ez a különbség azonban ismét nem túl meggyőző a VV egyedek alacsony előfordulási gyakorisága miatt. A szárazonállási idő és a havi befejések maximális és átlagos értékei tekintetében viszont az 5 %-os hibahatárt jóval felülmúló szignifikáns különbség volt kimutatható az LL és az LV genotípus között. Mind a szárazonállási idő, mind a befejések esetében a heterozigóta tehenek szignifikánsan magasabb értéket produkáltak, mint homozigóta LL társaik. A VV genotípusú állatoknál azonban semmilyen különbség nem volt kimutatható. A laktációs perzisztencia egyöntetűnek volt mondható és a legkisebb négyzetes átlagok összehasonlításánál nem volt szignifikáns különbség a növekedési hormon genotípusok között. 20. táblázat: A tejtermelési mutatók legkisebb négyzetes átlagai és azok hibái genotípusonként GH genotípu s LL LV VV
tejelő napok 358,2±5,5a 354,4±14,7a 451,3±35,7b
LSM±SE szárazon- max. befejt átlag befejt perzisztencia állás tej tej 62,5±1,7a 44,3±0,4a 34,3±0,3a 77,8±0,4 68,6±4,4b 46,4±1,1b 36,15±0,8b 78,0±1,1 55,8±10,7ab 38,8±2,6ab 32,3±2,0ab 83,7±2,8
(a, b betűk: az eltérő betűk a genotípusok közötti szignifikáns különbségre utalnak, az ab jelzés pedig nem-szignifikáns kapcsolatot jelez p<0,05 szinten)
82
Eredmények és megbeszélésük 9. ábra: A tejelő napok száma és a szárazonállási idő legkisebb négyzetes átlagai genotípusonként 600
szárazonállás tejelő napok
napok száma
500 400
VV
LL
LV
LL
LV
LL
LV
VV
szárazonállás
62,5
68,6
55,8
tejelő napok
358,2
354,4
451,3
300 200
VV
100 0
A 305 napos laktációs termelés adatait vizsgálva (21. táblázat) három tulajdonság esetében szignifikáns különbség volt kimutatható az egyes genotípuscsoportok között. 21. táblázat: A 305 napos laktációs termelési mutatók legkisebb négyzetes átlagai és azok hibái az egyes genotípusokban GH genotí pus LL LV VV
305n tej kg
305n zsír % 10337,5±105,5a 3,43±0,03a 10634,6±282,4b 3,39±0,08b 9905±681,5ab 3,51±0,2ab
LSM±SE 305n zsír kg 352,0±3,7 357,5±9,8 340,7±23,7
305n fehérje % 3,18±0,01a 3,05±0,04b 3,18±0,09ab
305n fehérje kg 326,6±3,0 322,1±8,1 311,9±19,6
(a, b betűk: az eltérő betűk a genotípusok közötti szignifikáns különbségre utalnak, az ab jelzés pedig nem-szignifikáns kapcsolatot jelez p<0,05 szinten)
83
Eredmények és megbeszélésük 10. ábra: A 305 napos laktációs tejhozam legkisebb négyzetes átlagai GH genotípusonként 11000
305n tej kg
10800 10600
tej kg
10400 10200 10000 9800
LV LL
9600
VV
9400 9200 305n tej kg
LL
LV
VV
10337,5
10634,6
9905
A 305 napos tejhozamnál az LV tehenek szignifikánsan jobban teljesítettek, mint LL genotípusú társaik (10. ábra). Figyelmen kívül hagyva a VV egyedek statisztikailag nem megbízható átlagát, ez az eredmény arra enged következtetni, hogy a V allél jelenléte pozitívan befolyásolja a termelt tej mennyiségét. Ezt az összefüggést többen ellenkező előjellel publikálták, megállapítva, hogy az LL genotípusú állatok nagyobb tejhozammal rendelkeztek, vagy hogy az L allél jelenléte magasabb tejtermelést jelez (SHARIFLOU és mtsai, 1998; CHUNG és mtsai, 1996; CHRENEK és mtsai, 1999) SABOUR és mtsai. (1997) azonban a jelen dolgozat eredményeihez hasonlóan a V allélt találták előnyösebbnek a tejhozam szempontjából, holstein bikák tejhozamra becsült örökítőértékeit hasonlítva össze. 84
Eredmények és megbeszélésük 11. ábra: A 305 napos laktációs tejzsír- és tejfehérje százalék legkisebb négyzetes átlagai GH genotípusonként %
3,8 3,7
305n zsír % 305n fehérje %
3,6 3,5 3,4 3,3 VV 3,2
LL
LV
3,1 3
LL
VV LV
LL
LV
VV
305n zsír %
3,43
3,39
3,51
305n fehérje %
3,18
3,05
3,18
A 21. táblázat adatai azt mutatják, hogy statisztikailag értékelhető, vagyis újra csak szignifikáns eltérés volt az LL és a heterozigóta egyedek 305 napos tejzsír- és tejfehérje százalék értékeiben. E két esetben azonban az LL genotípusú állatok átlagértékei voltak magasabbak (11. ábra). A VV genotípusban tapasztalt különbségek egyik tulajdonság esetében sem voltak szignifikánsak. Ebben az esetben úgy tűnik hát, hogy az L allél jelenléte kedvezőbb tej beltartalmi értékekkel (tejzsír és tejfehérje százalék) jár együtt. Ezt az eredményt számos olyan irodalmi adat is megerősíti, ahol az LL genotípus bizonyult a legelőnyösebbnek a tejfehérje tartalom szempontjából. DYBUS (2002a.) ezt az összefüggést azonban csak az első laktáció esetében tudta bizonyítani. CHRENEK és mtsai. (1999) viszont a tehenek első három 85
Eredmények és megbeszélésük laktációját használva fel állapították meg, hogy a legmagasabb tejzsír (4,77%) és tejfehérje százalék (3,55%) az LL genotípusú tehenek esetében volt tapasztalható. A vizsgált lókusz, valamint a tej-, a tejfehérje- és a tejzsírtermelés közötti szignifikáns kapcsolat azonban nem igazolódott. SHARIFLOU és mtsai. (1998) azt is megállapították, hogy az L allél milyen mértékben emeli a tejzsír-, és tejfehérje értékeket (tejzsír%: LL: 11,2%, LV: 9,9%; tejfehérje: LL: 7,0%, LV: 6,3%). A GH gén szubsztitúció átlagos hatása 7 kg tejzsír és 3 kg tejfehérje volt (SHARIFLOU és mtsai, 2000). A következő táblázat (22. táblázat) az előbb elemzett 305 napos tejtermelési mutatók esetén mutatja be a vizsgált genotípusok additív hatását és dominancia értékét tulajdonságonkénti bontásban. 22. táblázat: A 305 napos laktációs termelési mutatók legkisebb négyzetes átlagai, valamint az additív hatás és a dominancia értékek GH genotípus tulajdonság LL 305n tej kg 305n zsír% 305n zsír kg 305n fehérje% 305n fehérje kg
LV
VV
10338±105,5a 10635±282,4b 9905±681,5n 3,43±0,03a 3,39±0,08b 3,51±0,20n 352,0±3,7 357,6±9,8 340,7±23,8 3,18±0,01a 3,05±0,04b 3,18±0,09n 326,6±3,0 322,1±8,1 311,9±19,7
additív domina hatás ncia 216,3 513,5* 0,04 -0,08* 5,65 11,25 0 -0,13* 7,35 2,85
(a, b betűk: az eltérő betűk a genotípusok közötti szignifikáns különbségre utalnak, az n jelzés pedig nem-szignifikáns kapcsolatot jelez) (* a becsült faktorok megbízhatósági szintjét jelzi (P<0.05)) A táblázatban látható, hogy a homozigóták közötti additív hatás egy tulajdonságnál sem volt szignifikáns, ellenben a homozigóták és a heterozigóták különbségét mutató dominancia értéke ugyanannál a három 86
Eredmények és megbeszélésük tulajdonságnál (305 napos tejhozam, tejzsír- és tejfehérje százalék) megbízhatónak bizonyult, ahol a varianciaanalízis is szignifikáns különbséget mutatott ki a legkisebb négyzetes átlagok alapján. Ez az eredmény alátámasztani látszik az LL és az LV genotípusok közötti kimutatott termelésbeli eltérést. A 305 napos tejhozam esetében tehát a heterozigóta genotípus javító hatása 514 kg tej volt. Az LL genotípus 0,08%-kal emelte a 305 napos tejzsír százalék és 0,13 százalékkal a 305 napos tejfehérje százalék értékét.
4.2.2.2 A növekedési hormon receptor gén AluI polimorfizmusa és a vizsgált tulajdonságok közötti összefüggés 4.2.2.2.1 A többváltozós variancianalízis eredményeinek összehasonlítása A növekedési hormon receptor lókusz a növekedési hormon lókuszánál használthoz hasonló matematikai modellt alkalmaztam (lásd: 3.4.1.2.1. fejezet) a térbeli, időbeli különbségek és az egyéb esetleges emberi tényezők kiküszöbölésére. Végsősoron természetesen az adatok összehasonlíthatóságát kívántam ezzel elérni. A modellben szereplő faktorok szignifikancia szintjét, vagyis az állatok teljesítményére gyakorolt hatások erősségét a 23. és a 24. táblázat mutatja be. A faktorok hatásainak mértékét, akárcsak a GH lókusz esetében, itt is Upróba más néven Wilks’ Lambda többváltozós varianciaanalízis módszer segítségével számítottam ki.
87
Eredmények és megbeszélésük 23. táblázat: A modellben használt faktorok szaporodásbiológiai mutatókra gyakorolt hatásai többváltozós varianciaanalízis módszerével számolva (U próba) Faktor p GHR genotípus 0,098 elléssorszám 0,330 GHR genotípus x elléssorszám 0,616 születési év 0,041* ellési évszak 0,136 tenyészet 0,0001*** (*: p<0,05; **p<0,01, ***p<0,005) A szaporodásbiológiai mutatókat bevonva a többváltozós varianciaanalízis módszerébe (23. táblázat), kiderül, hogy a növekedési hormon receptor genotípus nem vagy csak gyengén szignifikáns (p<0,1) módon hat a vizsgált tulajdonságokra. Meghatározó hatása csak a születési évnek (p<0,05), de főleg a tenyészeteknek (p<0,005), illetve az ott folyó menedzsmentnek volt. Amennyiben a tejtermelési adatokat együttesen vontam be a varianciaanalízis vizsgálatába, úgy a 24. táblázat szerinti eredményeket kaptam. Leolvasható, hogy a növekedési hormon receptor génváltozatai önmagukban nem voltak hatással a tejtermelésre. Ellenben a laktációs sorszám és a genotípus interakciója szignifikáns (p<0,5) hatást gyakorolt az állatok tejtermelési teljesítményére. A legerősebb hatása azonban (p<0,005) ebben az esetben is a laktációs sorszámnak, a születési évnek, avagy évjárathatásnak, az ellési évszaknak és a tenyészeteknek volt. Ezekhez a hatásokhoz képest szinte elhanyagolható a növekedési hormon receptor lókusz hatása.
88
Eredmények és megbeszélésük 24. táblázat: A modellben használt faktorok tejtermelési tulajdonságokra gyakorolt hatásai többváltozós varianciaanalízis módszerével számolva (U próba) Faktor p GHR genotípus 0,181 elléssorszám 0,0001*** GHR genotípus x elléssorszám 0,034* születési év 0,0001*** ellési évszak 0,0001*** tenyészet 0,0001*** (*: p<0,05; **p<0,01, ***p<0,005) A fenti eredmények alapján talán a növekedési hormon receptor lókusz vizsgálatánál is van értelme a modellbe beépíteni az ellési évszak x tenyészet interakciót is. Az így továbbfejlesztett modell tehát a következő: yijklm = μ + GHRi+ ellések számaj+ GHRi * ellések számaj + évk+ évszakl+ tenyészetm+ évszakl * tenyészetm + eijklm Az így felépített modellt alapul véve az egyes faktorok reprodukciós és termelési tulajdonságokra gyakorolt hatásait a 25. és a 26. táblázat mutatja be. 25. táblázat: A továbbfejlesztett modell tényezőinek szaporodásbiológiai mutatókra gyakorolt hatásai (U próba) Faktor p GHR genotípus 0,235 elléssorszám 0,220 GHR genotípus x elléssorszám 0,664 születési év 0,031* ellési évszak 0,282 tenyészet 0,0001*** ellési évszak x tenyészet 0,160 (*: p<0,05; **p<0,01, ***p<0,005) 89
Eredmények és megbeszélésük
A 25. táblázatból kiolvasható, hogy akárcsak az új faktor nélküli modell segítségével számolt hatások esetében, itt is mindössze a születési év és a tenyészet faktora hatott szignifikáns módon a vizsgált reprodukciós tulajdonságokra. Az ellési évszak x tenyészet iterakciós hatása nem igazolódott. 26.
táblázat:
A
továbbfejlesztett
modell
faktorainak
tejtermelési
tulajdonságokra gyakorolt hatásai (U próba) Faktor p GHR genotípus 0,144 elléssorszám 0,0001*** GHR genotípus x elléssorszám 0,037* születési év 0,0001*** ellési évszak 0,0001*** tenyészet 0,0001*** ellési évszak x tenyészet 0,0001*** (*: p<0,05; **p<0,01, ***p<0,005) Az új, az ellési évszak és a tenyészet együttes hatását is vizsgáló többváltozós varianciaanalízis eredményei majdnem teljesen megegyeztek a régi modell alapján számolt eredményekkel (lásd 24. táblázat), azzal a kiegészítéssel, hogy
az
új
interakciós
faktor
feltételezett
hatása
a
tejtermelési
tulajdonságokra erősen szignifikáns szinten (p<0,005) beigazolódott.
90
Eredmények és megbeszélésük
4.2.2.2.2 A független változók hatásai A több változóst varianciaanalízis után részletesen tanulmányoztam, az egyes vizsgált tejtermelési és szaporodásbiológiai tulajdonságok szerint lebontva is a független változóként meghatározott faktorok hatásait és azokat a 27. táblázatban foglaltam össze. A táblázatban bemutatott szignifikancia szintek alapján megállapítható, hogy a növekedési hormon receptor genotípus két ellés közötti idő és a 305 napos tejfehérje százalék értékére volt szignifikáns hatással. Nincsenek irodalmi adatok ezen SNP (single nucleotid polymorhism; vagyis egy nukleotidnyi eltérésre utal a homológ kromoszómán) és a tejtermelési tulajdonságok kapcsolatáról, de közeli tárgyban már született hasonló eredmény a növekedési hormon receptorról. Blott és mtsai. (2003) ismert QTL genotípusú egyedek genomját szekvenálva F-Y szubsztitúciókat azonosítottak a GH receptor gén transzmembrán alegységén belül. Ez az alegység pedig nagy hatással van a tejhozamra, valamint a tej beltartalmi mutatóira.
91
Eredmények és megbeszélésük 27. táblázat: A vizsgált faktorok hatásai, illetve a hatások erőssége (szignifikancia szintje) tulajdonságok szerinti bontásban független változók GHR ellésGHR születési ellési tenyészet ellési függő változók genotípus sorszám gen. x év évszak évszak elléssor. x teny. 1. ellésk. életkor 0,693 0,643 0,821 0,286 0,205 0,0001*** 0,187 2ellés közötti idő0,042* 0,092 0,375 0,020* 0,431 0,984 0,253 tejelő napok sz. 0,961 0,009** 0,650 0,0001*** 0,057 0,350 0,490 szárazonállás 0,092 0,056 0,007** 0,009** 0,195 0,011* 0,170 max. befejt tejkg 0,935 0,0001*** 0,770 0,246 0,025* 0,057 0,107 átl. befejt tej kg 0,572 0,0001*** 0,238 0,195 0,190 0,016* 0,082 perzisztencia 0,199 0,0001*** 0,609 0,005** 0,099 0,0001*** 0,004** 305napos tej kg 0,762 0,045* 0,293 0,092 0,063 0,148 0,012* 305napos zsír % 0,451 0,979 0,985 0,120 0,053 0,0001*** 0,082 305napos zsír kg 0,554 0,149 0,416 0,615 0,816 0,050 0,658 305napos feh.% 0,048* 0,082 0,938 0,017* 0,249 0,0001*** 0,439 305napos feh. kg 0,316 0,363 0,178 0,162 0,072 0,039* 0,006**
(*: p<0,05; **p<0,01, ***p<0,005) A laktációs sorszám p<0,05 szinten hatott a a 305 napos tejhozamra és p<0,01 szinten a tejelő napok számára, de a legerősebben (p<0,005) a befejt tej mennyiségére és a perzisztenciára. A GHR lókusz és az elléssorszám interakciója csak a szárazonállás idejét befolyásolta szignifikánsan. Az állatok születési éve a két ellés közötti időre, a 305 napos tejfehérje százalékra gyakorolt hatást (p<0,5), ennél erősebben befolyásolta viszont a szárazonállást, a perzisztencia értékét és a tejelő napok számát (p<0,01). A különböző ellési évszakok csupán a befejt tej maximális értékére hatottak szignifikánsan (p<0,05). A tenyészetek a szárazonállás idejére, az átlagos befejt tej, valamint a 305 napos fehérje hozam mutatójára gyakorolt szignifikáns hatást (p<0,05), de emellett igen erősen (p<0,005) befolyásolta még az első elléskori életkort, a perzisztencia értékét, valamint a 305 napos tejzsír- és tejfehérje százalékot is. Végül az ellési évszak és a tenyészet 92
Eredmények és megbeszélésük interakciója szignifikáns hatással volt a törzskönyvi perzisztencia értékére, valamint a 305 napos tejhozam és tejfehérje kg adataira is. 4.2.2.2.3 A genotípusátlagok összevetése A többváltozós, összes tulajdonságot figyelembe vevő modell kiértékelése után, a GHR AluI lókusz esetleges hatásait vizsgálva a különböző genotípuscsoportok teljesítményének összevetését ugyanúgy elvégeztem, mint a GH gén esetében. A vizsgált szaporodásbiológiai és a tejtermelési adatok legkisebb négyzetes átlagait, illetve azok páronkénti összehasonlításának eredményeként adódó összefüggéseket mutatja be a 28., 29. és a 30. táblázat. 28. táblázat: A szaporodásbiológiai mutatók legkisebb négyzetes átlagai és a sztenderd hibák az egyes genotípusokban LSM±SE első elléskori életkor két ellés közötti idő 794,1±6,9 434,5±10,1a AA 784,4±9,7 415,5±14,0a AG 786,6±30,8 513,4±44,7b GG (a, b betűk: az eltérő betűk a genotípusok közötti szignifikáns különbségre utalnak) GHR genotípus
A szaporodásbiológiai mutatóknál (28. táblázat) (akárcsak a GH lókusz esetében) csupán a két ellés közötti idő tulajdonságának összehasonlításakor mutatkozott szignifikáns különbség az egyes genotípus-csoportok között. Az AA és az AG állatok adatai szignifikáns módon eltértek a GG genotípusú tehenek adataitól. Világosan látható, hogy a GG genotípust hordozó egyedek két ellés közötti ideje sokkal hosszabb volt társaik hasonló adataihoz képest (12. ábra). Az AA és az AG genotípus közötti csekélyebb különbség azonban nem volt szignifikáns. 93
Eredmények és megbeszélésük 12. ábra: A két ellés közötti idő legkisebb négyzetes átlagai genotípusonként 600
nap
két ellés közötti idő 550
500
450
GG 400
350 két ellés közötti idő
AA
AG
AA
AG
GG
434,5
415,5
513,4
29. táblázat: A tejtermelési mutatók legkisebb négyzetes átlagai és a sztenderd hibák az egyes genotípusokban GHR genotí pus AA AG GG
tejelő napok 358,8±6,3 356,3±9,9 383,5±28,5
szárazonállás 61,7±1,9 67,3±3,0 77,4±8,6
LSM±SE max. befejt tej 44,5±0,5 44,3±0,7 45,0±2,1
átlag befejt tej 34,3±0,4 34,7±0,6 34,8±1,6
perzisztencia 77,4±0,5 78,6±0,8 78,5±2,2
A tejtermelési mutatók összehasonlításánál (29. táblázat) egyetlen vizsgált tulajdonság esetében sem mutatkozott statisztikailag értékelhető különbség a GHR genotípusok között. A tejelő napok száma és a szárazonállási idő ugyan átlagosan tendenciaszinten hosszabb volt a GG változatot hordozó állatoknál mindkét másik genotípushoz hasonlítva, de ezt a különbséget a sztenderd hiba is okozhatta, nem volt szignifikáns.
94
Eredmények és megbeszélésük A következő táblázat a 305 napos laktációs teljesítmény összehasonlítását mutatja be (30. táblázat). Akárcsak a fentiekben vizsgált GH lókusznál, itt a GHR génváltozatoknál is, ugyanazon három laktációs tulajdonság (305 napos tejhozam, tejzsír és tejfehérje százalék) esetében lehetett szignifikáns különbséget kimutatni az egyes genotípusok között. 30. táblázat: A 305 napos laktációs termelési mutatók legkisebb négyzetes átlagai és a sztenderd hibák az egyes genotípusokban GHR geno 305n tej kg típus AA 10329,4±122,6a AG 10343,7±190,6a GG 10662,7±549,7b
305n zsír % 3,44±0,03a 3,40±0,05a 3,18±0,15b
LSM±SE 305n zsír kg 352,4±4,3 348,8±6,6 335,4±19,0
305n fehérje % 3,16±0,02a 3,17±0,03a 2,99±0,07b
305n fehérje kg 325,1±3,5 326,7±5,5 318,7±15,8
A 305 napos laktációs tejhozamot vizsgálva kiderül, hogy a GG tehenek tejtermelése szignifikánsan magasabb volt AA és AG genotípusú társaik tejtermelési adatainál (13. ábra). A 305 napos laktációs tejzsír és tejfehérje százalék esetében szintén szignifikáns különbség mutatkozott a GG, valamint az AA és az AG genotípus között, itt azonban a GG tehenek szerepeltek a legalacsonyabb értékkel (14. ábra).
95
Eredmények és megbeszélésük 13. ábra: A 305 napos tejhozam legkisebb négyzetes átlagai genotípusonként 11200 11100
305n tej kg
11000 10900
tej kg
10800 10700 10600 10500
GG
10400 10300 10200
305n tej kg
AA
AG
AA
AG
GG
10329
10343
10662
14. ábra: A 305 napos tejzsír- és tejfehérje százalék legkisebb négyzetes átlagai GHR genotípusonként 3,5
305n zsír % 305n fehérje %
% 3,4
3,3
3,2
AA
AG
3,1
AG
AA
GG
3
GG 2,9
AA
AG
GG
305n zsír %
3,44
3,4
3,18
305n fehérje %
3,16
3,17
2,99
96
Eredmények és megbeszélésük Mind a GH és a GHR lókusz génváltozatai között egy érdekes párhuzamos tendencia figyelhető meg a laktációs tejtermelés vonatkozásában. Mind a két esetben ugyanis az alacsony gyakoriságú allél (GH esetében a V; itt pedig a G allél) jelenléte növelni látszik a 305 napos tejhozamot. A 31. táblázatban, amely az additív és a dominanciahatást mutatja be, látható, hogy a homozigóták közötti additív hatás, valamint a homozigóták és a heterozigóták különbségét mutató dominancia értéke ugyanannál a három tulajdonságnál (305 napos tejhozam, tejzsír- és tejfehérje százalék) bizonyult megbízhatónak, ahol a varianciaanalízis is szignifikáns különbséget mutatott ki a legkisebb négyzetes átlagok alapján. Ez az eredmény alátámasztani látszik az AA és az AG, valamint a GG genotípusok közötti kimutatott termelésbeli eltérést. 31. táblázat: A 305 napos laktációs termelési mutatók legkisebb négyzetes átlagai, valamint az additív hatás és a dominancia értékek tulajdonsá g 305n tej kg 305n zsír% 305n zsír kg 305n feh.% 305n feh. kg
GHR genotípus AA
AG
GG
10329,4±122,6a 3,44±0,03a 352,4±4,3 3,16±0,02a 325,1±3,5
10343,7±190,6a 3,40±0,05a 348,8±6,6 3,17±0,03a 326,7±5,5
10662,7±549,7b 3,18±0,15b 335,4±19,0 2,99±0,07b 318,7±15,8
additív dominan hatás cia 166,7* 0,13* 8,5 0,09* 3,2
-152,4* 0,09* 4,9 0,01* 4,8
(a, b betűk: az eltérő betűk a genotípusok közötti szignifikáns különbségre utalnak, az n jelzés pedig nem-szignifikáns kapcsolatot jelez) (* a becsült faktorok megbízhatósági szintjét jelzi (P<0.05))
97
Eredmények és megbeszélésük
Az eredmények alapján elmondható tehát, hogy a 305 napos tejhozam esetében a GG genotípus javító hatása 167 kg tej volt. Az AA genotípus 0,13%-kal emelte a 305 napos tejzsír százalék és 0,09 százalékkal a 305 napos tejfehérje százalék értékét a GG genotípussal összevetve. A homozigóták és a heterozigóták különbségét mutató dominancia értéke valamivel alacsonyabb értékekkel szerepelve szintén megmutatta a GG genotípus javító hatását a heterozigótákkal szemben.
98
Következtetések és javaslatok
5 KÖVETKEZTETÉSEK ÉS JAVASLATOK
A vérminták genotipizálását követően a vizsgált holstein-fríz bikanevelő tehén populációban mindkét lókusz esetében meglehetősen alacsony volt a V és a G allélok előfordulási aránya (V allél: 7 %; G allél: 12 %). Ez megerősíti a szakirodalmi adatokat, és egyben jelzi is, hogy a holstein-fríz fajta esetében a tenyésztési cél, illetve a gazdaságilag kívánatos tulajdonságok kifejlesztése az L, illetve az A allél elterjedésének kedveztek. Mind a növekedési hormon gén, mind a növekedési hormon receptor gén allélfrekvencia
értékeinek
kiszámításánál
kiderült,
hogy
a
vizsgált
nullhipotézis, vagyis hogy a mintapopuláció Hardy-Weinberg egyensúlyban van, beigazolódott. A két lókuszra vonatkozó szelekciós nyomás tehát nem kimutatható mértékű. Az egyensúly azonban arra is utalhat, hogy a vizsgált mintapopuláció reprezentatív, jól jellemzi a hazai holstein-fríz bikanevelő tehén állományt és az állatok a magyar bikanevelő populáció döntő hányadát képviselik. Ugyancsak mindkét vizsgált lókusz esetében szignifikáns összefüggés mutatkozott az adott gén változatai és a 305 napos tejhozam, a tejfehérje- és a tejzsír százalék között. A két lókusz génváltozatai között ráadásul párhuzamos
tendencia
volt
megfigyelhető
vonatkozásában.
99
a
laktációs
tejtermelés
Következtetések és javaslatok A növekedési hormon gén esetében a V, a növekedési hormon receptor gén esetében pedig a G allél (mindkét esetben a kis százalékban előforduló allél) jelenléte valószínűleg pozitívan befolyásolja a termelt tej mennyiségét. A GHR gén esetében ez a hatás leginkább a két G allélt tartalmazó homozigóta genotípusnál érvényesült. Ezt az összefüggést néhány azonos eredmény mellett (SABOUR és mtsai, 1997), többen ellenkező előjellel publikálták (SHARIFLOU és mtsai, 1998; CHRENEK és mtsai, 1999). A szakirodalomban közölt vizsgálatok (CHRENEK és mtsai, 1999; DYBUS 2002a; SHARIFLOU és mtsai, 2000) és saját eredményeim és igazolni látszanak azt, hogy az L allél jelenléte és a magasabb beltartalmi értékek (305 napos tejzsír- és tejfehérje százalék) között szoros összefüggés van. Ez a kapcsolat létezik a GHR gén esetében is, ahol az A allél jelenléte utal kedvezőbb tejzsír- és tejfehérje százalékra. A végkövetkeztetések levonásához azonban további vizsgálatok szükségesek ezen a téren, a hazai holstein-fríz tejtermelő állomány nagyobb arányú bevonásával. A ritkán előforduló genotípusok alacsony száma miatt is érdemes emelni a vizsgálati mintaszámot. A tejtermelés bonyolult fiziológiai háttere miatt a termelt tej mennyiségét és összetételét számos endogén és exogén tényező befolyásolhatja. Az eredményes tenyésztői munka titka mindkét faktorcsoport optimalizálása a hatékony tejtermelés érdekében. A genotípus fokozatos átalakítása, illetve a kedvező genotípusú állatok megtartására irányuló szelekció a hagyományos tenyésztési eljárások mellett, illetve azokat kiegészítve molekuláris genetikai módszerekkel is történhet. A jelen dolgozat eredményei alapján javasolható, hogy az egyre több tulajdonságra kiterjedő és mind több faktort tartalmazó tenyésztési indexekbe 100
Következtetések és javaslatok (lásd HGI) a növekedési hormon és a növekedési hormon receptor genotípus, mint a tejtermelés egyik markere, esetleg beépítésre kerüljön.
101
Új tudományos eredmények
6 ÚJ TUDOMÁNYOS EREDMÉNYEK
1. Sikeresen módosítottam a növekedési hormon és a növekedési hormon receptor gén AluI polimorfizmusának vizsgálati módszerét, az irodalomban közölt PCR-RFLP kondíciók alapján. 2. Hazánkban először meghatároztam a hazai holstein-fríz bikanevelő tehén populáció növekedési hormon (n=363) és növekedési hormon receptor gén (n=365) AluI lókuszainak allélgyakorisági és genotípus eloszlási értékeit egy reprezentatív minta segítségével. Ezek az eredmények
alapadatnak
tekinthetők
a
magyar
holstein-fríz
állományban. 3. Statisztikailag
bizonyítható
összefüggést
állapítottam
meg
a
növekedési hormon gén AluI genotípusai és a tejtermelési mutatók között. A szárazonállási idő és a havi befejések maximális és átlagos értékei esetében az LV tehenek szignifikánsan (p<0,05) magasabb értéket mutattak, mint LL genotípusú társaik. A befejt tej magasabb szintje és a V allél jelenléte között úgy tűnik összefüggés fedezhető fel. 4. A 305 napos laktációs termelés eredményeiben is szignifikáns eltéréseket mutattam ki a GH-AluI genotípusok között. A 305 napos tejhozamnál az LV egyedek szignifikánsan (p<0,05) jobban teljesítettek, mint LL genotípusú társaik. Figyelmen kívül hagyva a VV egyedek statisztikailag nem megbízható átlagát, ez az eredmény 102
Új tudományos eredmények arra enged következtetni, hogy a V allél jelenléte ismét csak pozitívan befolyásolja a termelt tej mennyiségét. Ennek a megerősítésére azonban még további vizsgálatok szükségesek. 5. Szignifikáns különbség nem volt megállapítható a növekedési hormon gén AluI genotípuscsoportjai között a vizsgált szaporodásbiológiai mutatók (első elléskori életkor, két ellés közötti idő) tekintetében. 6. Szignifikáns különbséget sikerült kimutatni a növekedési hormon receptor gén AluI genotípusai, valamint a 305 napos laktációs tejhozam, tejzsír- és tejfehérje százalék értékek között. A 305 napos tejhozamnál
a
GG
egyedek
szignifikánsan
(p<0,05)
jobban
teljesítettek, mint AA és AG genotípusú társaik. Ez az eredmény arra enged következtetni, hogy a G allél jelenléte –akárcsak a GH gén esetében a V allél - pozitívan befolyásolja a termelt tej mennyiségét. Ez a hatás leginkább a két G allélt tartalmazó homozigóta genotípusnál érvényesül. A 305 napos laktációs tejzsír és tejfehérje százalék
esetében
szintén
szignifikáns
(p<0,05)
különbség
mutatkozott a GG, valamint az AA és az AG genotípus között, itt azonban a GG tehenek szerepeltek a legalacsonyabb értékkel. 7. A szaporodásbiológiai mutatók legkisebb négyzetes átlagait a genotípusok között összehasonlítva megállapítottam, hogy a GG tehenek két ellés közötti ideje szignifikánsan (p<0,05) hosszabb volt, mint AA és AG genotípusú társaiké.
103
Összefoglalás
7 ÖSSZEFOGLALÁS A tejtermelés, tipikusan poligénes tulajdonság, amelyet számos genetikai lókusz szabályoz. Régóta folynak kutatások olyan genetikai markerek keresésére, melyek a tejtermelési teljesítmény előrejelzésére alkalmasak lehetnek. E dolgozat elsődleges célja, hogy a szarvasmarha növekedési hormon és növekedési hormon receptor gént, mint a tejtermelés lehetséges genetikai markereit vizsgálva kapcsolatot keressen a tejelválasztás, tejtermelés és a hormon, valamint a receptora, illetve az ezeket kódoló gének különböző változatai között. A kísérletben az ország 6 tenyészetéből származó 365 holstein-fríz bikanevelő tehén vett részt. Az állatoktól vérmintát gyűjtöttem, valamint termelési (laktációs tej-, zsír- és fehérjehozam, befejési eredmények, perzisztencia, tejelő napok száma, szárazonállási idő) és szaporodásbiológiai (első elléskori életkor, két ellés közötti napok száma) adataikat is rögzítettem. Az adatok 10 évet, 4 laktációt, minden évben 4 ellési évszakot ölelnek fel. A vérmintákból kivontam a genomikus DNS-t, majd PCR technika segítségével felszaporítottam a vizsgálni kívánt DNS szakaszokat. A felszaporított termékek hasítását, vagyis a polimorf hely azonosítását, AluI restrikciós
endonukleázzal
végeztem
mindkét
esetben.
A
DNS
fragmentumokat metafor agaróz gélen, áram segítségével választottam el egymástól, végül UV fény alatt értékeltem. A
genotipizálást
követően
allélgyakorisági
és
populációgenetikai
számításokat, valamint a vizsgált lókuszok (GH-AluI és GHR-AluI) és a 104
Összefoglalás termelési és reprodukciós adatok közötti összefügésvizsgálatot végeztem (SPSS 11.0 for Windows). Az amplifikált 427 bp hosszúságú (GH gén egy része), valamint a 286 bp hosszúságú (GHR gén, 10. exon) DNS szakasz AluI endonuklázzal való hasítása eredményeképpen mindkét esetben 3-3 különböző mintázatot sikerült megkülönböztetnem (GH gén: LL, LV, VV; GHR gén: AA, AG, GG). A vizsgált populációban a következő allélgyakorisági értékeket találtam: L: 93%, V: 7 %; A: 88%, G: 12 %. A genotípusok megoszlása a következő volt: LL: 87,05%; LV: 12,40% és VV: 0,55%; AA: 77,8%; AG: 20,6% és GG: 1,6% . A populációgenetikai vizsgálatoknál mindkét lókusz esetében a vizsgált hipotézis, vagyis hogy a mintapopulációban Hardy-Weinberg egyensúlyt feltételeztünk, beigazolódott (Χ2-próba). Ezután összefüggéseket kerestem a két lókusz, valamint a tejtermelés és néhány szaporodásbiológiai mutató között. GH gén AluI polimorfizmus: A többváltozós varianciaanalízis segítségével megállapítható volt, hogy a GH AluI lókusza a vizsgált szaporodásbiológiai mutatókat szignifikánsan (p<0,05) befolyásolta (első elléskori életkor, két ellés közötti idő). A termelési tulajdonságok (tejelő napok száma, szárazonállási idő, befejt tej átlaga és maximális értéke, perzisztencia, 305 napos tejhozam, tejzsírhozam és –százalék, tejfehérjehozam és –százalék) együttes értékelésénél kiderült, hogy a GH gén változatai p<0,05 szinten szignifikáns módon hatottak a tejtermelési teljesítményre. A tejtermelési mutatók genotípusonkénti összehasonlításánál kitűnt, hogy a tejelő napok számában, a szárazonállás idejében és a befejt tej 105
Összefoglalás mennyiségében is szignifikáns (p<0,05) eltérés volt a GH genotípusok között. A tejtermeléssel töltött napok esetében a VV genotípusú állatok a többi genotípushoz hasonlítva magasabb értékkel rendelkeztek. Itt azonban figyelembe kell venni a VV alacsony előfordulását. A szárazonállási idő és a havi befejések maximális és átlagos értékei esetében az LV tehenek szignifikánsan magasabb értéket produkáltak, mint LL genotípusú társaik. A befejt tej magasabb szintje és a V allél jelenléte között úgy tűnik összefüggés mutatható ki. A 305 napos laktációs termelés mutatói közül a tejhozam, a tejfehérje- és a tejzsír százalék esetében volt szignifikáns (p<0,05) különbség a GH genotípuscsoportok teljesítménye között. A 305 napos tejhozamnál az LV egyedek szignifikánsan jobban teljesítettek, mint LL genotípusú társaik. Figyelmen kívül hagyva a VV egyedek statisztikailag nem megbízható átlagát, ez az eredmény arra enged következtetni, hogy a V allél jelenléte ismét csak pozitívan befolyásolja a termelt tej mennyiségét. Az LL állatok 305 napos tejzsír- és tejfehérje százalék eredményei szignifikánsan magasabbak voltak az LV genotípus esetében tapasztalt értékeknél. A szakirodalomban közölt vizsgálatok és saját eredményeim is igazolni látszanak azt, hogy az L allél jelenléte és a magasabb beltartalmi értékek között szoros összefüggés van. A dominancia vizsgálatok kimutatták, hogy a 305 napos tejhozam esetében a heterozigóta genotípus javító hatása 514 kg tej volt. Az LL genotípus 0,08%kal emelte a 305 napos tejzsír százalék és 0,13 százalékkal a 305 napos tejfehérje százalék értékét. A különbségek p<0,05 szinten szignifikánsnak bizonyultak. GHR gén AluI polimorfizmus: 106
Összefoglalás A többváltozós varianciaanalízis alapján megállapítható volt, hogy a GHR AluI lókusz csak tendenciaszinten hat a vizsgált szaporodásbiológiai mutatókra (első elléskori életkor, két ellés közötti idő). A szaporodásbiológiai mutatók legkisebb négyzetes átlagait a genotípusok között összehasonlítva megállapítottam, hogy a két ellés közötti idő átlagai között mutatkozott szignifikáns (p<0,05) eltérés. A GG tehenek két ellés közötti ideje hosszabb volt, mint AA és AG genotípusú társaiké. A termelési tulajdonságok (tejelő napok száma, szárazonállási idő, befejt tej átlaga és maximális értéke, perzisztencia, 305 napos tejhozam, 305 napos tejzsírhozam és –százalék, 305 napos tejfehérjehozam és –százalék) együttes értékelésénél kiderült, hogy a növekedési hormon receptor genotípusainak önmagukban nem volt szignifikáns hatása. Ellenben a GHR genotípus és a laktációs sorszám interakciója p<0,05 szinten befolyásolta a tejtermelést. A
305
napos
laktációs
termelési
mutatók
genotípusonkénti
összehasonlításánál kitűnt, hogy a tejhozam, a tejzsír- és a tejfehérje százalék esetében volt szignifikáns (p<0,05) különbség a GHR genotípuscsoportok teljesítménye között. A 305 napos tejhozamnál a GG egyedek szignifikánsan jobban teljesítettek, mint AA és AG genotípusú társaik. Ez az eredmény arra enged következtetni, hogy a G allél jelenléte pozitívan befolyásolja a termelt tej mennyiségét. Ez a hatás leginkább a két G allélt tartalmazó homozigóta genotípusnál érvényesül. A 305 napos laktációs tejzsír és tejfehérje százalék esetében szintén szignifikáns különbség mutatkozott a GG, valamint az AA és az AG genotípus között, itt azonban a GG tehenek szerepeltek a legalacsonyabb értékkel. A homozigóták közötti additív hatást megvizsgálva, kiderült, hogy a 305 napos tejhozam esetében a GG genotípus javító hatása 167 kg tej volt. Az AA genotípus 0,13%-kal emelte a 305 napos tejzsír % és 0,09 százalékkal a 305 107
Összefoglalás napos tejfehérje % értékét a GG genotípussal összevetve. A dominancia vizsgálat eredménye valamivel alacsonyabb értékekkel szerepelve szintén megmutatta a GG genotípus javító hatását a heterozigótákkal szemben. A különbségek p<0,05 szinten szignifikánsnak bizonyultak. Mind a GH és a GHR lókusz génváltozatai között párhuzamos tendencia figyelhető meg a laktációs tejtermelés vonatkozásában. Mind a két esetben ugyanis a ritkábban előforduló allélok (GH esetében a V; GHR-nél a G allél) jelenléte növelni látszik a 305 napos tejhozamot, de jelenlétük ugyanakkor alacsonyabb tejzsír- és tejfehérje százalék értékekkel jár együtt. A végkövetkeztetések levonásához azonban további vizsgálatok szükségesek ezen a téren, a hazai holstein-fríz tejtermelő állomány nagyobb arányú bevonásával.
108
Summary
8 SUMMARY Milk production is such a poligenic trait which is controlled by many genetic loci. Researches for a long whil aim to search genetic markers which could be suitable for the forecast of milk production performance. Primary aim of this study is to examine growth hormone and growth hormone receptor gene whether they are appropiate markers for milk synthesis and production. I searched for associations between milk production and some reproductive traits and two loci of these genes. The question is whether genes coding for growth hormone (GH) and GH receptor (GHR) could be candidates for quantitative trait markers in dairy cattle. A representative sample of the Hungarian Holstein-Friesian bull dam population was used in this study. 365 dams from 6 herds throughout Hungary represent the whole Holstein-Friesian dam herd. Blood samples were collected from all animals and peripheral blood was saved in tubes stored on -20°C until DNA extraction. DNA was obtained from blood leucocytes. PCR-RFLP method was used to amplify the two desired DNA fragments. The fragments were spliced by AluI endonuclease, resolved in agarose gels stained with ethidium bromide and visualised under UV light. Lactation and some reproduction data were collected to analyse the potential differences in performance. Lactation data contained days in milking, persistency, mean and maximum milk kg of test milkings, lactation milk yield, lactation milk fat (kg and %) and lactation milk protein (kg and %). Reproduction data included age at first calving and calving interval as well. 109
Summary Data package involved 10 years, 4 consequent lactations and 4 seasons of calving. Population genetics calculi and association analyses were carried out between the two loci (GH-AluI és GHR-AluI) and quantitative traits (SPSS 11.0). 3-3 patterns were identified as the result of AluI digestion in case of both loci. (GH gene: LL, LV, VV; GHR gene: AA, AG, GG). The following allele frequencies were detected in the sample population: LL: 87,05%; LV: 12,40% és VV: 0,55%; AA: 77,8%; AG: 20,6% és GG: 1,6% . Population genetic studies (Χ2-test) proved Hardy-Weinberg equilibrium in case of both loci. Results of association analyses between loci and quantitative traits were as follows: GH gene, AluI polymorphism: According to the results of multivariate analysis of variance, it can be stated that GH AluI locus influenced reproductive traits significantly (p<0,05) (age at first calving, calving interval). When I analysed production traits (days in milking, dry period, average and maximum of test milkings, persistency, 305 days milk yield, 305 days milkfat kg and percent, 305 days milkprotein kg and percent) together, it was revealed that variants of GH gene again significantly (p<0,05) affected milk production performance. If the different GH-AluI genotypes were compared to each other, significant (p<0,05) differences were detected between genotypes in milking days, dry period and test milk kg. VV genotype had significantly more days in milking than the others. However the low incidence of VV genotype must be 110
Summary considered! LV cows, compared to LL ones, showed higher values in case of dry period and test milk kg. We shal then assume a relationship between the presence of V allele and higher test milk quantity. 305 days milk yield, milk protein- and milk fat percent were showed to have significant (p<0,05) differences between the performance of GH genotypes. LV individuals produced higher quantity of milk compared to LL genotype if 305 days milk yield was studied. Except that mean value of VV genotype was not reliable from statistical point of view, this result may lead to the conclusion that the presence of V allele positively affected milk yield. 305 days milk fat and milk protein percents of LL animals were significantly higher than in case of LV cows. These findings together with literature results seem to confirm the association between the presence of L allele and higher milk composition data. Analysis of dominance showed that correction effect of LV genotype was 514 kg milk in case of 305 days milk yield. LL genotype increased 305 days milk fat percent by 0.08% and 305 days milk protein percent by 0.13%. These effects were proved to be significant (p<0.05). GHR gene, AluI polymorphism: According to the results of multivariate analysis of variance, it can be stated that GHR AluI locus did not really influenced reproductive traits (age at first calving, calving interval) only a tendency could be observed. After comparing least square means of reproductive traits, significant difference (p<0.05) was found in calving interval between GHR genotypes. GG cows had longer calving interval than AA and AG genotypes. When production traits were analysed (milking days, dry period, average and maximum of test milkings, persistency, 305 days milk yield, 305 days milkfat 111
Summary kg and percent, 305 days milkprotein kg and percent) together, it was revealed that variants of GHR gene individually had no or only tendential significant effect on milk production performance. However the interaction of GHR genotype and number of calvings significantly (p<0.05) influenced milk production traits. 305 days milk yield, milk protein- and milk fat percent were showed to have significant (p<0,05) diferences between the performance of GHR genotypes. GG dams produced more milk compared to AA and AG genotypes if 305 days milk yield was studied. This result may lead to the conclusion that the presence of G allele positively affected milk yield. This effect mainly prevail in case of homozygotes, where G allele is presented in two copies. 305 days milk fat and milk protein percents of GG animals were significantly lower than in case of AA and AG cows. These findings seem to indicate an association between the presence of A allele and higher milk composition data. Results of additive effect confirmed that correction effect of GG genotype was 514 kg milk in case of 305 days milk yield. AA genotype increased 305 days milk fat percent by 0.13% and 305 days milk protein percent by 0.09%. Analysis of dominance also showed the enhancing effect of GG genotype in milk yield. These effects were proved to be significant (p<0.05). A paralel tendency could be noted in lactation milk production in case of both loci (GH-AluI and GHR-AluI). In both cases, the presence of alleles with low incidence (GH: Vallele; GHR: G allele) seems to increase 305 days milk yield.
112
Summary The total final conclusion however requires further investigations in this field, perhaps a general sample of the Hungarian Holstein-Friesian population used for production should be taken into the experiment. Namely, examination and GH and GHR genotyping of a large cow population kept under uniform circumstances shall further contribute to the use of these loci as markers for the improvement of milk production.
113
Irodalomjegyzék
9 IRODALOMJEGYZÉK 1.
Adashi E.Y., Resnick E.C., D’Ercole A.J., Svoboda M.E. and Van Wyk J.J. (1985): Insulin like growth factors as intraovarian regulators of granulosa cell growth and function. Endocrinol. Rev., 6. 400.
2.
Anderson M.J., Lamb R.C., Lallan R.J., Hatnell G.F., Hoffman R.G., Kung L., Jr. and Fransen S.E. (1989): Effect of sometribove (recombinant methionyl bovine somatotropin) on gestation length and on body measurements, growth and blood chemistries of calves whose dams were treated with sometribove. J. Dairy Sci., 72. (Suppl. 1) 327. (abstract)
3.
Arkins S., Danzter R. and Kelley K.W. (1993): Somatolactogens, Somatomedins and Immunity. J. Dairy Sci., 76: 2437.
4.
Arrenbrecht S. (1974): Specific binding of growth hormone to thymocytes. Nature, 252. 255-257.
5.
Asimov G.J. and Krouze N.K. (1937): The lactogenic preparations from the anterior pituary and the increase of milk yield in cows. J. Dairy Sci., 20. 289.
6.
Badinga L., Collier R.J., Thatcher W.W., Wilcox C.J., Head H.H. and Bazer F.W. (1991): Ontogeny of hepatic bovine growth hormone receptors in cattle. J. of Animal Science, 69. 1925-1934.
7.
Baile C.A. and Buonomo F.C. (1987): Growth hormone-releasing factor effects on pituitary function, growth, and lactation. J. of Dairy Science 70: 467-473
114
Irodalomjegyzék 8.
Barnes M.A., Kazmer G.W., Akers R.M. and Pearson R.E. (1985): Influence of selection for milk yield on endogenous hormones and metabolites in Holstein heifers and cows. J. Anim. Sci., 60. 271-283.
9.
Bauman D.E. and Currie W.B. (1980): Partitioning of nutrients during pregnancy and lactation: a review of mechanisms involving homeostasis and homeorhesis. J. Dairy Sci., 63. 1514.
10.
Bauman D.E. and McCutcheon S.N. (1986): The effects of growth hormone and prolactine on metabolism. in Milligan L.P., Grovum W.L., Dobson A., eds: Control of digestion and metabolism in ruminants. Prentince-Hall, Engelwood Cliffs, NJ. 436.
11.
Bauman D.E. and Vernon R.G. (1993): Effects of exogenous somatotropin on lactation . Ann. Rev. Nutr., 13. 437.
12.
Bauman D.E., DeGeeter M.J., Peel C.J., Lanza G.M., Gorewit R.C. and Hammond R.W. (1982): Effect of recombinantly derived bovine growth hormone (bGH) on lactational performance of high-yielding dairy cows. J. Dairy Sci. 65. (Suppl. 1), 121. (Abst.)
13.
Bauman D.E., Eppard P.J., DeGeeter M.J. and Lanza G.M. (1985): Responses of high-producing dairy cows to long term treatment with pituitary somatotropin and recombinant somatotropin. J. Dairy Sci., 68. 1352-1362.
14.
Bauman D.E., McBride B.W., Burton J.L. and Sejrsen K. (1994): Somatotropin (bST): International Dairy Federation Technical Report. Bulletin of the IDF. 293. 2.
15.
Baxter J.B., Blalock J.E. and Weigent D.A. (1991): Expression of immunoreactive growth hormone in leukocytes in vivo. J. Neuroimmunol., 33. 43.
115
Irodalomjegyzék 16.
Beckmann J.S., Kashi Y., Hallerman E.M., Nave A. and Soller M. (1986): Restriction fragment length polymorphism among Israeli Holstein-Friesian dairy bulls. Anim. Genet., 17. 25-38.
17.
Berczi I. and Nagy E. (1987): The effect of prolactin and GH on haemolymphopoetic tissue and immune function. 145. o. in I. Berczi and K. Kovács, eds. Hormones and Immunity. MTP Press. Lancaster, England
18.
Biswas T.K., Bhattacharya T.K., Narayan A.D., Badola S., Kumar P., Kumar S. and Sharma A. (2003): Effect of growth hormone gene polymorphism on milk quality traits in crossbred cattle. J. Appl. Anim. Res., 24. 145-151.
19.
Brown D.L., Taylor S.J., DePeters E.J. and Baldwin R.L. (1989): Influence of sometribove, USAN (recombinant methionyl bovine somatotropin) on the body composition of lactating cattle. J. Nutr., 119. 633.
20.
Burton J.H., MacLeod G.K., McBride B.W., Burton J.L., Bateman K., McMillan I. and Eggert R.J. (1990a): Overall efficacy of chronically administered recombinant bovine somatotropin to lactating dairy cows. J. Dairy Sci., 73. 2157.
21.
Burton J.L. and McBride B.W. (1989): Recombinant bovine somatotropin (rbST): is there a limit for biotechnology in applied animal agriculture? J. Agric. Ethics, 2. 129.
22.
Burton J.L., McBride B.W., Block E., Glimm D.R. and Kennelly J.J. (1994): A review of bovine growth hormone. Can. J. Anim. Sci., 74: 167-201.
23.
Burton J.L., McBride B.W., Kennedy B.W., Burton J.H., Elasser T.H. and Woodward B. (1991a): Influence of exogenous bovine 116
Irodalomjegyzék somatotropin on the responsiveness of peripherial blood lymphocytes to mitogen. J. Dairy Sci., 74. 916. 24.
Burton J.L., McBride B.W., Kennedy B.W., Burton J.H., Elasser T.H. and Woodward B. (1991b): Serum immunoglobulin profiles of dairy cows chronically treated with recombinant bovine somatotropin. J. Dairy Sci., 74. 1589.
25.
Burton J.L., McBride B.W., Kennedy B.W., Burton J.H., Elasser T.H. and Woodward B. (1992a): Hematological profiles in dairy cows treated with recombinant bovine somatotropin. J. Anim. Sci., 70. 1488.
26.
Burton J.L., McBride B.W., Kennedy B.W., Burton J.H., Elasser T.H. and Woodward B. (1992b): Contact sensitivity and systemic antibody responses
in
dairy
cows
treated
with
recombinant
bovine
somatotropin. J. Dairy Sci., 75. 747. 27.
Burvenich C., Massart-Leen A.M. and Vandeputte-Van Messom G. (1989a): Recombinant bST in blood and milk of healthy and mastitic cows. J. Dairy Sci., 72 (Suppl. 1). 7. (abstract)
28.
Carruthers T.D., Convey E.M., Kesner J.S., Hafs H.D. and Cheng K.W. (1980): The hypothalamo-pituitary gonadotrophic axis of suckled and non-suckled dairy cows postpartum. J. Anim. Sci., 51. 949.
29.
Chikuni K., Nagatsuma T., Tabata T., Monma M., Saito M., Ozawa S. and Ozutsumi K. (1994): Genetic variants of the GH gene in Japanese cattle. Anim. Sci. Technol. (Jpn.) 65. 340-346.
30.
Chilliard Y. (1989): Long term effects of rbST on dairy cow performances: A review. Page 61. in K. Srjsen, M. vesterggard and A. Nei-
117
Irodalomjegyzék mann-Soresen, eds. Use of somatotropin in livestock production. Elsevier Applied Science, New York, NY. 31.
Chrenek P., Huba J., Oravcová M. and Hetényi L. (1999): Genotypes of bGH and bPRL genes in relationships to milk production. Proceedings of the 50th Annual Meeting of the European Association for Animal Production, Ga4.15., 40.
32.
Chrenek P., Kmet J., Sakowski T., Vasicek D., Huba J. and Chrenek J. (1998b): Relationships of GH genotypes with meat production trait of Slovak Pied bulls. Czech J. Anim. Sci., 43. 541-544.
33.
Chrenek P., Vasicek D. , Bauerová and Bulla J. (1998a): Simultaneous analysis of bovine growth hormone and prolactine alleles by multiplex PCR and RFLP. Czech J. Anim. Sci., 43. 53-55.
34.
Chung E.R., Rhim T.J. and Han S.K. (1996): Associations between PCR-RFLP markers of GH and PRL genes and production traits. Korean J. Anim. Sci., 38. 321-336.
35.
Citek J., Panicke L., Freyer G., Rehout V. and Masková J. (1998): The polymorphism of growth hormone gene in some cattle breeds. Czech J. Anim. Sci., 43. 101-104.
36.
Clark R. (1997) The somatogenic hormones and insulin-like growth factor-1: stimulators of lymphopoiesis and immune function. Endocrine Reviews 18. 157-179.
37.
Cole W.J., Eppard P.J., Lanza E.M., Hintz R.L., Madsen S.E., Franson S.E., White T.C., Ribelin W.E., Hammond B.G., Bussen S.C., Ceak R.K. and Metzger L.E. (1988): Response of lactating dairy cows to multiple injections of sometribove USAN (recombinant methionyl bovine somatotropin) in a prolonged release system. Part II. Health and reproduction. J. Dairy Sci., 71. 184. (abstract) 118
Irodalomjegyzék 38.
Cosman D., Lyman S.D., Idzerda R.L., Beckmann M.P., Park L.S., Goodwin G. and March C.J. (1990): A new cytikine receptor superfamily. Trends Biochem. Sci., 15. 265.
39.
Craven N. (1991): Milk production and mastitis susceptibility: genetic relationships and influence of bovine somatotropin treatment. Page 55. in J. Espinasse, ed. Mammites des Vaches Laitieres. Societe Francaise de Buiatrie. 1991. december 18-19, Párizs, Franciaország
40.
Davidge S.T., Wiebold J.C., Senger P.C. and Hillers J.K. (1987): Influence of varying levels of blood progesterone upon estrus behaviour in cattle. J. Anim. Sci., 64. 126.
41.
De Boer G.G. and Kenelly J.J. (1989a): Effect of somatotropin injection and dietary protein concentration on milk yield and cinetics of hormones in dairy cows. J. Dairy Sci., 72. 419.
42.
De Boer G.G. and Kenelly J.J. (1989b): Effect of somatotropin and dietary protein concentration on hormone and metabolic responses to single injections of hormones and glucose. J. Dairy Sci., 72. 429.
43.
Di Stasio L., Destefanis G., Brugiapaglia A., Albera A. and Rolando A. (2005): Polymorphism of the GHR gene in cattle and relationships with meat production and quality. Animal Genetics, 36. 138-140.
44.
Dybus (2002a): Associations between Leu/Val polymorphism of growth hormone gene and milk production traits in Black-and-White cattle. Arch. Tierz., 45. (5) 421-428.
45.
Dybus (2002b): Associations of growth hormone (GH) and prolactin (PRL) genes polymorphisms with milk production traits in Polish Black-and-White cattle. Animal Science Papers and Reports, 20. (4) 203-212. 119
Irodalomjegyzék 46.
Early R.J., McBride B.W. and Ball R.O. (1990): Growth and metabolism in somatotropin-treated steers. I. Growth, serum chemistry and carcass weight. J. Anim. Sci., 68. 4134.
47.
Elvinger F., Hansen P.J., Head H.H. and Natzke R.P. (1989): Effect of
bovine
somatotropin
and
diet
on
activity
of
bovine
polymorphonuclear leukocytes and lymphocytes cultured at 38.5 and 42 °C. J. Dairy Sci. 72. (Suppl.1.) 9. (abstract) 48.
Elvinger F., Hansen P.J., Head H.H. and Natzke R.P. (1991): Actions of bovine somatotropin on polymorphonuclear leukocytes and lymphocytes in cattle. J.Dairy Sci., 74. 2145.
49.
Elvinger F., Head H.H., Wilcox C.J., Natzke R.P. and Eggert R.P. (1988): Effects of administration of bovine somatotropin on milk yield and composition. J. Dairy Sci., 71. 1515.
50.
Eppard P.J., Bauman D.E. and McCutcheon S.N. (1985): Effect of dose of bovine growth hormone on lactation of dairy cows. J. Dairy Sci., 68. 1109-1115.
51.
Eppard P.J., Bentle L.A., Violand B.N., Ganguli S., Hintz R.L., Kung Jr. L., Krivi G. and Lanza G.M. (1992): Comparison of the galactopoietic response to pituitary-derived and recombinant-derived variants of bovine growth hormone.J Endocrinol., 132. 47-56.
52.
Etherton T.D. and Bauman D.E. (1998): Biology of somatotropin in growth and lactation of domestic animals. Physiological Reviews, 78. 745-761.
53.
Etherton, T.D. and Bauman, D.E. (1998): Biology of somatotropin in growth and lactation of domestic animals. Physiological Reviews, 78. 745-761.
120
Irodalomjegyzék 54.
Falaki M., Gengler N., Sneyers M., Prandi A., Massart S., Formigoni A., Burny A., Portetelle D. and Renaville R. (1996a): Relationships of polymorphisms for GH and GH receptor genes with milk production traits for Italian Holstein-Friesian bulls. J.Dairy Sci., 79. 1446-1453.
55.
Falaki M., Prandi A., Corradini C., Sneyers M., Gengler N., Massart S., Fazzini U., Burny A., Portetelle D. and Renaville R. (1997): Relationships of GH gene and milk protein polymorphisms to milk production traits in Simmental cattle. J. Dairy Res., 64. 47-56.
56.
Falaki M., Sneyers M., Prandi A., Massart S., Corradini C., Formigoni A., Burny A., Portetelle D. and Renaville R. (1996b): TaqI GH gene polymorphism and milk production traits in HolsteinFriesian cattle. Anim. Sci., 63. 175-181.
57.
Ferguson J.D. (1990): Bovine somatotropin - reproduction and health. Page 65. in Bovine somatotropin. NIH Technology Assessment Conference Proceedings. 1990. december 5-7, Bethesda, MD, USA
58.
Fésüs L., Komlósi I., Varga L. és Zsolnai A. (2000): Molekuláris genetikai módszerek alkalmazása az állattenyésztésben. Budapest: Agroinform Kiadó és Nyomda Kft., 128-129.
59.
Freeman A.E., Vukasinovic N and DeNise S.K. (1998): Association of growth hormone loci with milk production traits in Holstein bulls. Proceedings of the 6th World Conference of Genetics and Applied Livestock Production, 23. 471.
60.
Gagnerault M.C., Postel-Vinay M.C. and Dardenne M. (1996): Expression of growth hormone receptors in murine lymphoid cells analyzed by flow cytofluorometry. Endocrinology, 137. 1719-1726.
61.
Gala R.R. (1991): Prolactin and growth hormone in the regulation of the immune system. Proc Soc Exp Biol Med., 198. 513-27. 121
Irodalomjegyzék 62.
Gallo G.F. and Block E. (1990b): Effects of recombinant bovine somatotropin on nutritional status of dairy cows and of their calves. J. Dairy Sci., 73. 3266.
63.
Gallo G.F. and Block E. (1991): Effects of recombinant bovine somatotropin on hypophyseal and ovarian functions of lactating dairy cows. Can. J. Anim. Sci., 71. 343.
64.
Gallo G.F., Léonard M., Gallo M. and Block E. (1988): Preliminary observations on the effect of a long-term administration of somatotropin on the apparent digestibility of rations by dairy cowsat two stages of lactation. MacDonald Research Report. Ste-Anne-deBellevue, PQ.
65.
Gatford K.L., Egan A.R., Clarke I.J. and Owens P.C. (1998): Sexual dimorphism of the somatotropic axis. Journal of Endocrinology 157. 373-389.
66.
Ge W., Davis M.E., Hines H.C. and Irvin K.M. (1999): Polymorphism in exon 10 of the bovine GHR gene detected by PCRDGGE. Anim. Genet. 30. (2) 167-168.
67.
Ge W., Davis M.E., Hines H.C. and Irvin K.M. (2000): Rapid communication: Single nucleotide polymorphisms detected in exon 10 of the bovine growth hormone receptor gene. J Anim Sci., 78. (8) 22292230.
68.
Gibson J.P., van der Meulen M., McBride B.W. and Burton J.H. (1990): The effect of rbST administration on fertility and culling rates of lactating dairy cattle. J. Dairy Sci., 73. 197. (abstract)
69.
Gitlin D., Kumate J. and Morales C. (1965): Metabolism and maternofetal transfer of human growth hormone in the pregnant women at term. J. Clin. Endocrinol. 25: 1599. 122
Irodalomjegyzék 70.
Giustina A. and Veldhuis J.D. (1998): Pathophysiology of the neuroregulation of growth hormone secretion in experimental animals and the human. Endocrine Reviews, 19. 717-797.
71.
Glimm D.R., Baracos V.E. and Kennelly J.J. (1990): Molecular evidence for the presence of growth hormone receptors in the bovine mammary gland. Journal of Endocrinology, 126. R5-8.
72.
Godowski P.J., Leung D.W., Meacham L.R., Galgani J.P., Helmiss R., Keret R., Rotwein P.S., Parks J.S., Laron Z. and Wood W.I. (1989): Characterization of the human growth hormone receptor gene and demonstration of a partial gene deletion in two patientswith Laron-type dwarfism. Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 86. 8083-8087.
73.
Gordon D.F., Quick D.P., ErwinC.R., Donelson J.E. and Maurer R.A. (1983): Nucleotid sequence of the bovine growth hormone chromosomal gene. Mol. Cell. Endocrinol., 33. 81-95.
74.
Goya R.G., Naylor P.H., Goldstein A.L. and Meites J. (1990): Changes in circulating levels of neuroendocrine and thymic hormones during aging in rats: a correlation study. Exp. Gerontol., 25. 149.
75.
Grochowska R., Snochowski M., Wolinska-Witort E. and Reklewski Z. (1999): Comparison of blood plasma growth hormone levels in young dairy and beef cattle. J. Anim. Feed Sci., 8. 81-88.
76.
Grochowska R., Snochowski M., Zwierzchowski L., Reklewski Z., Dymnicki E. and Oprzadek J. (1997): Association of GH gene polymorphism and GH release following injection of TRH in Friesian cattle. Proceedings of the 48th Annual meeting of the European Association for Animal Production, 244.
123
Irodalomjegyzék 77.
Grochowska R., Zwierzchowski L., Snochowski M. and Reklewski Z. (1999): Stimulated growth hormone (GH) release in Friesian cattle with respect to GH genotypes. Reprod. Nutr. Dev., 39. (2) 171-180.
78.
Grochowska R., Sorensen P., Zwierzchowski L., Snochowski M., Lovendahl P. (2001): Genetic variation in stimulated GH release and in IGF-I of young dairy cattle and their associations with leucin/valin polymorphism in the GH gene. J. Animal Sci., 79. 450-476.
79.
Hard D.L., Cole W.J., Franson S.E., Samuels W.A., Bauman D.E., Erb H.N., Huber T.J. and Lamb R.C. (1988): Effect of long-term sometribove, USAN (recombinant methionyl bovine somatotropin) treatment in a prolonged release system on milk yield, animal health and reproductive performance - pooled across four sites. J. Dairy Sci. 71. 210. (abstract)
80.
Hart I.C. (1983): Endocrine control of nutrient partitioning in lactating ruminants. Proc. Nutr. Soc., 42. 181.
81.
Hart I.C., Bines J.A. and Morant S.V. (1980): The secretion and metabolic clearance rates of growth hormone, insulin and prolactin in high- and low-yielding cattle at four stages of lactation. Life Sci., 27. 1839.
82.
Hartnell G.F., Franson S.E., Bauman D.E., Head H.H., Huber J.T., Lamb R.C., Madsen K.S., Cole W.J. and Hintz R.L. (1991): Evaluation of sometribove in a prolonged-release system in lactating dairy cows – production responses. J. Dairy Sci. 74: 2654.
83.
Hauser S.D., McGrath M.F., Collier R.J. and Krivi G.G. (1990): Cloning and in vivo expression of bovine growth hormone receptor mRNA. Mol. Cell. Endocrinol., 72. 187-200.
124
Irodalomjegyzék 84.
Hediger R., Johnson S.E., Barendse W., Drinkwater R.D., Moore S.S. and Hetzel J. (1990): Assignment of the growth hormone gene locus to 19q26-qter in cattle and to 11q25-qter in sheep by in situ hybridization. Genomics, 8. 171-174.
85.
Hoj S., Fredholm M., Larsen N.J. and Nielsen V.H. (1993): GH gene plymorphism associated with selection for milk fat production in lines of cattle. Anim. Genet., 24. 91-96.
86.
Horvainé Szabó M. (2003): Analysis of plasma IGF-I hormone level and its correlation with live weight and age in Holstein-Friesian heifers. Archive für Tierzucht, 46. 17-24.
87.
Huszenicza Gy., Fébel H., Gáspárdy A. és Gaál T. (2002): A nagy tejtermelésű
tehén
takarmányozásának,
tejtermelésének
és
szaporodóképességének kapcsolata. Irodalmi áttekintés. 1. Az ellés utáni időszak anyagforgalmi jellemzői. Magyar Állatorvosok Lapja, 124. 12. 719-725. 88. Huszenicza Gy., Kulcsár, M., Kátai, L., Balogh, O., Meikle, A., Fébel, H., Delavaud, C., Pécsi, A., Földi, J., Cavestany, D., Chilliard, Y. and Fekete, S. (2004): Metabolic factors influencing the onset of cyclic ovarian function and fertility in postpartum dairy cows. Proceedings of the 8th International Conference of European Society of Veterinary and Comparative Nutrition, 17-37. 89. Hutton J.B. (1957): The effect of growth hormone on the yield and composition of cow’s milk. J. Endocrinol., 16. 115. 90.
Isaksson O., Binder C., Hall K. and Hokfelt B. (1987): Growth hormone: Basic and clinical aspects. In "Excrepta Medica", Elsevier, Amsterdam
125
Irodalomjegyzék 91.
Isaksson O.G.F., Edén S. and Jansson J.O. (1985): Mode of action of pituitary growth hormone on target cells. Ann. Rev. Physiol., 47. 483.
92.
Isaksson O.G.P., Eden S. and Jansson J. (1985): Mode of action of pituitary growth hormone on target cells. Annu. Rev. Physiol., 47. 483-499.
93.
Jiang H. and Lucy M.C. (2001): Variants of the 5'-untranslated region of the bovine growth hormone receptor mRNA: isolation, expression and effects on translational efficiency. Gene., 265. (1-2) 45-53.
94.
Johnsson I.D. and Hart I.C. (1986): Manipulation of milk yield with growth hormone. 105. In: W. Haresign and D.J.A. Cole, eds. Recent advances in animal nutrition. Butterworths, London, UK.
95.
Kazmer G.W., Barnes M.A. and Pearson R.E. (1983): Growth hormone and prolactin response to sire selection and increased milking frequency. J. Dairy Sci., 66 Suppl. 1:263.
96.
Kelley K.W. (1988): Cross-talk between the immune and endocrine systems. J. Anim. Sci., 66. 2095.
97.
Keshet E., Rosner A., Bernstein Y., Gorecki M. and Aviv H. (1981): Cloning of bovine growth hormone gene and its expression in bacteria. Nucleic Acids Res., 9. 19-30.
98.
King A.P.J., Tseng M-J., Logsdon C.D., Billestrup N. and Carter-Su C. (1996): Distinct cytoplasmic domains of the growth hormone receptor are required for glucocorticoid- and phorbol ester-induced decreases in growth hormone (GH) binding. Journal of Biological Chemistry, 271. 18088-18094.
99.
Kölle S., Sinowatz F., Boie G., Lincoln D. and Waters M.J. (1997): Differential expression of the growth hormone receptor and its
126
Irodalomjegyzék transcript in bovine uterus and placenta. Molecular and Cellular Endocrinology, 131. 127-136. 100. Lacasse P., Petitclerc D., Pelletier G., Couture Y., Morisset J., Gaudreau P. and Brazeau P. (1991a): Effect of long-term administration of human growth hormone-releasing factor and (or) thyrotropin- releasing factor on milk production, insulin-like growth factor-I and plasma constituents in dairy cows. Canadian Journal of Animal Science, 71. 707-715. 101. Lacasse P., Petitclerc D., Pelletier G., Delorme L., Morisset J., Gaudreau P. and Brazeau P. (1991b): Effect of long-term administration of human growth hormone-releasing factor and (or) thyrotropin- releasing factor on hormone concentrations in lactating dairy cows. Domestic Animal Endocrinology, 8. 99-108. 102. Lagziel A., Lipkin E., Ezra E., Soller M. and Weller J.I. (1999): An MspI polymorphism at the bovine growth hormone (bGH) gene is linked to locus affecting milk protein percentage. Anim. Genet., 30., 296-299 103. Le Roith D., Bondy C., Yakar S., Liu J.L. and Butler A. (2001): The somatomedin hypothesis: 2001. Endocr Rev., 22. (1) 53-74. 104. Lechniak D., Machnik G., Szydlowski and Switonski M. (1999): Growth hormone gene polymorphism and reproductive performance of AI bulls. Theriogenology, 52. 1145-1152. 105. Lee B.K., Crooker B.A., Hansen L.B. and Chester-Jones H. (1994a): Polymorphism in the third intron of somatotropin (bST) gene and its association with selection for milk yield in Holstein cows. J.Anim.Sci., 72. Suppl.1. 316.
127
Irodalomjegyzék 106. Lee B.K., Foster D.N. and Crooker B.A. (1994b): Detection of mutations in the bovine somatotropin (bST) gene by single strand conformation polymorphism (SSCP) analyses. J.Anim.Sci., 72. Suppl.1. 316. 107. Lee B.K., Foster D.N.and Crooker B.A. (1994b): Detection of mutations in the bovine somatotropin (bST) gene by single strand conformation polymorphism (SSCP) analyses. J.Anim.Sci., 72. Suppl.1. 316. 108. Lefebvre D.M., Robinson M. and Block E. (1991): Non-esterified fatty acid response to an epinephrine challange in the dry period in cows administered recombinant bovine somatotropin during lactation. Macdonald Research report. Ste-Anne-de-Bellevue, PQ. 109. Léonard. M., Gallo M., Gallo G. and Block E. (1990): Effects of a 28day
sustained-release
formulation
of
recombinant
bovine
somatotropin (rbST) administered to cows over two consecutive lactations. Can. J. Anim. Sci., 70. 795. 110. Lovendhal P., Holm L.E. and Sorensen P. (1997): Possible effect of growth hormone gene polymorphism on GH-release in dairy calves. Proceedings of the 48th Annual meeting of the European Association for Animal Production, GPPh, 425. 111. Lucy M.C., Boyd C.K., Koenigsfeld A.T. and Okamura C.S. (1998a): Expression of somatotropin receptor messenger ribonucleic acid in bovine tissues. Journal of Dairy Science, 81. 1889-1895. 112. Lucy M.C., Hauser S.D., Eppard P.J., Krivi G.G., Clark J.H., Bauman D.E. and Collier R.J. (1993): Variants of somatotropin in cattle: gene frequencies in mayor dairy breeds and associated milk production. Domestic Animal Endocrinology, 10. 325-333. 128
Irodalomjegyzék 113. Lucy M.C., Johnson G.S., Shibuya H., Boyd C.K. and Herring W.O. (1998b): Rapid communication: polymorphic (GT)n microsatellite in the bovine somatotropin receptor gene promoter. J Anim Sci., 76. (8) 2209-2210. 114. Martial J.A., Seeburg P.H., Guenzi D., Goodman H.M. and Baxter J.D. (1977): Regulation of GH gene expression: synergistic effects of thyroid and glucocorticoid hormones. Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.), 74. 4293-4295. 115. Martial J.A., Seeburg P.H., Guenzi D., Goodman H.M. and Baxter J.D. (1977): Regulation of GH gene expression: synergistic effects of thyroid and glucocorticoid hormones.Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.), 74. 4293-4295. 116. McBride B.W., Burton J.L. and Burton J.H. (1988): Review: the influence of bovine growth hormone (somatotropin) on animals and their products. Res. Dev. Agric., 5. 1. 117. McBride B.W., Burton J.L., Gibson J.P., Burton J.H. and Eggert R.G. (1990): Use of recombinant bovine somatotropin for up to two consecutive lactations on dairy production traits. J. Dairy Sci., 73. 3248. 118. McGuffey R.K., Basson R.P.Snyder D.L., Block E., Harrison J.H., Rakes A.K., Emery R.S. and Muller L.D. (1991): Effect of somidobove sustained release administration on the lactation performance of dairy cows. J. Dairy Sci., 74. 1263. 119. McGuffey R.K., Spike T.E. and Basson R.P. (1989): Partitioning of energy in the lactating dairy cowreceiving bST. J. Dairy Sci., 72. (Suppl. 1) 535. (abstract) 120. McGuire M.A., Bauman D.E., Dwyer D.A. and Cohick W.S. (1995a): Nutritional modulation of the somatotropin/insulin-like growth factor 129
Irodalomjegyzék system: response to feed deprivation in lactating cows. Journal of Nutrition, 125. 493-502. 121. Michel A., McCutcheon S.N., Mackenzie D.D.S., Tait R.M. and Wickham B.W. (1990): Effects of exogenous bovine somatotropin in milk yield and pasture intake in dairy cows of low or high genetic merit. Animal Production, 51. 229-234. 122. Miller W.L. and Eberhardt N.L. (1983): Structure and evolution of the growth hormone gene family. Endocr. Rev. 4. 97. 123. Min S.H., MacKenzie D.D., Brier B.H., McCutcheon S.N. and Gluckman P.D. (1996): Responses of young energy-restricted sheep to chronically administered insulin-like growth factor I (IGF-I): evidence that IGF-I suppresses the hepatic growth hormone receptor. Endocrinology, 137. 1129- 1137. 124. Moore D.A. and Hutchinson L.J. (1992): BST and animal health. Page 99. in M.C. Hallberg, ed. Bovine somatotropin and emerging issues: An assessment. Westview Press, Boulder, CO, USA 125. Morton N.E. (1955): Sequential tests for the detection of linkage. American Journal of Human Genetics, 7. 277-318. 126. Muller L.D. (1992): BST and dairy cow performance. Page 53. in M.C. Hallberg, ed. Bovine somatotropin and emerging issues: An assessment. Westview Press, Boulder, CO. 127. Muyzer G. (1999): DGGE/TGGE a method for identifying genes from natural ecosystems. Curr. Opin. Microbiol., 3. 317-322. 128. Niall H.D., Hogan M.L., Tregear G.W., Segre G.V., Hwang P., Friesen H. (1973): The chemistry of GH and the lactogenic hormones. Rec. Prog. in Hormone Res., 29. 387-404. 130
Irodalomjegyzék 129. Oprzadek J., Dymnicki E., Zwierzchowski L., Lukaszewicz M. (1999): The effect of growth hormone (GH), κ-casein (CASK) and βlactoglobuli (BLG) genotypes on carcass traits in Friesian bulls.Anim. Sci. Paper Rep., 17. 85-92. 130. Parkes M.J., Hill D.J. and Dawes G.S. (1984): Lack of growth hormone dependent somatomedin-like activity in fetal sheep. 7th International Conference of Endocrinology, 1138. (abstract). 131. Parsons J.M., Webb G.C. and Bottema C.D. (1998): Assignment of the growth hormone receptor gene to band q17 of the homeologous sheep 16 and cattle 20 chromosomes. Mamm Genome., 9. (7) 599600. 132. Peel C.J. and Bauman D.E. (1987): Somatotropin and lactation. J. Dairy Sci., 70. 474. 133. Peel C.J., Fronk T.J., Bauman D.E. and Gorewit R.C. (1983): Effect of exogenous growth hormone in early and late lactation on lactational performance of dairy cows. J. Dairy Sci., 66. 776. 134. Phipps R.H. (1989): A review of the influence of somatotropin on health, reproduction, and welfare in lactating dairy cows. Page 88. in K. Sejrsen, M. Vestergaard and A. Neimann-Sorensen, eds. Use of somatotropin in livestock production. Elsevier Applied Science, New York, NY., USA 135. Pombo M., Pombo C.M., Astorga R., Cordido F., Popovic V., GarciaMayor R.V., Dieguez C. and Casanueva F.F. (1999): Regulation of growth hormone secretion by signals produced by the adipose tissue. J. Endocrinol., Invest 22. (5 Suppl) 22-26.
131
Irodalomjegyzék 136. Putnam D.E., Varga G.A. and Dann H.M. (1999): Metabolic and production responses to dietary protein and exogenous somatotropin in late gestation dairy cows. Journal of Dairy Science, 82. 982-995. 137. Renaville R., Sneyer M., Falaki M., Prandi A., Massart S., Devolder A., Boonen F., Marchand E., Burny A. and Portetelle D. (1994): TaqI RFLP for bovine GH in breed selected for milk and/or meat. J.Anim. Sci., 72. Supl. 1. 316. 138. Richard A.L., McCutcheon S.N. and Bauman D.E. (1985): Response of dairy cows to exogenous bovine growth hormone administered during early lactation. J. Dairy Sci., 68. 2385. 139. Rocha J.L., Baker J.F., Womack J.E., Sanders J.O. and Taylor J.F. (1992): Statistical associations between RFLPs and quantitative traits in beef cattle. J.Anim.Sci., 70. 3360-3370. 140. Rocha J.L., Womack J.E. and Backer J.F. (1992): New allelic fragment for the growth hormone – TaqI marker in cattle. Anim. Genet., 23. 480. 141. Rodrigues C.V., Guimaraes S.E.F., Neto E.D., and Pinherio L.E.L. (1998): Identification of a novel polymorphism in the promoter region of the bovine growth hormone gene. Anim. Genet., 29. 65-66. 142. Rodrigues C.V., Guimaraes S.E.F.,Neto E.D. and Pinherio L.E.L. (1998): Identification of a novel polymorphism in the promoter region of the bovine growth hormone gene. Anim. Genet., 29. 65-66. 143. Rudman D., Feller A.G., Nagraj H.S., Gergans G.A., Lalitha P.Y., Goldberg A.F., Cshlenker R., Chon L., Rudman I.W. and Mattson D.E. (1990): Effects of human growth hormone in men over 60 years old. New England J. Med., 323. 1.
132
Irodalomjegyzék 144. Sabour M.P. and Lin C.Y. (1996): Association of bGH genetic variants with milk production traits in Holstein cattle. Anim. Genet., 27. (Suppl.2.) 105. 145. Sabour M.P., Lin C.Y. and Smith C. (1997): Association of genetic variants of bGH with milk production traits in Holstein cattle. J.Anim.Breed.Genet., 114. 435-442. 146. Savion N., Lui G.M., Laherty R. and Gospodarowicz D. (1981): Factors controlling proliferation and progesterone production by bovine granulosa cells in serum free medium. Endocrinol., 109. 409. 147. Schlee P., Graml R., Schallenberger E., Scams D., Rottmann O., Olbrich-Bludau A. and Pirchner F. (1994): GH and IGF-1 concentrations in bulls of various GH genotypes. Theor. Appl. Genet., 88. 497-500. 148. Seavey B.K., Singh R.N., Lewis V.J.and Geschwind I.I. (1971): Bovine growth hormone: evidence for two allelic forms. Biochem. Biophys. Res. Commun., 43. 189-195. 149. Shariflou M.R., Moran C. and Nicholas F.W. (1998): Candidate genes for production traits in dairy cattle. Proceedings of the 6th World Conf. Genet. Appl. Lives. Prod., 25. 043. 150. Shariflou M.R., Moran C. and Nicholas F.W. (2000): Association of Leu127 variant of the bovine growth hormone (bGH) gene with increased yield of milk, fat, and protein in Australian Holstein Friesians. Aust. J. Agric. Res., 51. 515-522. 151. Shemm S.R., Deaver D.R., Griel L.C., Jr. and Muller L.D. (1990): Effects of recombinant bovine somatotropin on luteinizing hormon and ovarian function in lactating dairy cows. Biol. Reprod., 42. 815.
133
Irodalomjegyzék 152. Soderholm C.G., Oterby D.L., Linn J.G., Ehle F.R., Wheaton J.E., Hansen W.P. and Annexstad J.R. (1988): Effects of recombinant bovine somatotropin on milk production, body composition and physiological parameters. J. Dairy Sci., 71. 355. 153. Sorensen P., Grochowska R., Holm L., Henryon M. and Lovendahl P. (2002): Polymorphism int he bovine growth hormone gene affects endocrine release in dairy calves. J. dairy Sci., 85. 1887. 154. Spicer L.J., Tucker W.B. and Adams G.D. (1990): Insulin-like growth factor I in dairy cows: relationships among energy balance, body condition, ovarian activity and estrous behaviour. J. Dairy Sci., 73. 929. 155. Spindler S.R., Mellon S.H. and Baxter J.D. (1982): GH gene transcription is regulated by thyroid and glucocorticoid hormones in cultured rat pituitary tumor cells. J. Biol. Chem., 257. 11627-11632. 156. Spindler S.R., Mellon S.H. and Baxter J.D. (1982): GH gene transcription is regulated by thyroid and glucocorticoid hormones in cultured rat pituitary tumor cells. J. Biol. Chem., 257. 11627-11632. 157. Taylor V.J. (2001): The growth hormone (GH) and insulinlike growth factor (IGF) axis in relation to fertility in high yielding dairy cows. Ph.D. Thesis, Royal Veterinary College, Hertfordshire, United Kingdom 158. Theill L.E. and Karin M. (1993): Transcriptional control of GH expression and anterior pituitary development. Endocr. Rev., 14. 670689. 159. Theilmann J.L., Skow L.C., Baker J.F. and Womack J.E. (1989): RFLP for growth hormone, prolactin, ostenectin, -crystallin, -
134
Irodalomjegyzék crystallin, fibronectin and 21-steroid hydroxylase in cattle. Anim. Genet., 20. 257-266. 160. Thomas C., Johnsson I.D., Fisher W.J., Bloomfield G.A., Morant S.W. and Wilkinson J.M. (1987): Effect of somatotropin on milk production, reproduction, and health of dairy cows. J.Dairy Sci., 70. 174. (abstract) 161. Thomas M.J. (1998): The molecular basis of growth hormone action. Growth Hormone and IGF Research 8. 3-11. 162. Toutain P.L., Schams D., Laurentie M.P. and Thomson T.D. (1993): Pharmacokinetics of a recombinant bovine growth hormone and pituitary growth hormone in lactating dairy cows. J. Anim. Sci., 71. 1219-25. 163. Tyrrell H.F., Brown A.C.G., Reynolds P.J., Haaland G.C., Bauman J.E., Peel C.J. and Steinhour W.D. (1988): Effects of bovine somatotropin on metabolism of lactating dairy cows: energy and nitrogen utilization as determined by respiration calirometry. J. Nutr. 118. 1024. 164. Vernon R.G. (1989): Influence of somatotropin on metabolism. In: Use of Somatotropin in Livestock Production. Edited by K. Sejrsen, M. Vestergaard & A Neimann-Ssrensen, 31-50., Elsevier Applied Science, London, UK. 165. Vernon R.G., Arana A. and Fleming I.M. (1998): GH signalling in ruminant adipose tissue. ADSA - ASAS Joint Meeting, Abstract Book, p. 112., abstr. 429. 166. Vestergaard M., Purup S., Henckel P., Tonner E., Flint D.J., Jensen L.R. and Sejrsen K. (1995): Effects of growth hormone and ovariectomy on performance, serum hormones, insulin-like growth 135
Irodalomjegyzék factor-binding proteins, and muscle fiber properties of prepubertal Friesian heifers. Journal of Animal Science, 73. 3574-3584. 167. Vicini J.L., Buonomo F.C., Veenhuizen J.J., Miller M.A., Clemmons D.R. and Collier Z.J. (1991): Nutrient balance and stage of lactation affect responses of insulin, insulin-like growth factors I and II, and insulin-like growth factor-binding protein 2 to somatotropin administration in dairy cows. Journal of Nutrition, 121. 1656-1664. 168. Vukasinovic N., Denise S.K. and Freeman A.E. (1999): Association of growth hormone loci with milk yield traits in Holstein bulls. J. Dairy Sci., 82. 788-794. 169. Wallis M. (1973): The primary structure of bovine growth hormone. FEBS Lett 35: 11-14. 170. Wallis M. (1992): The expanding growth hormone/prolactin family. J. MoI. Endocrinol. 21: 185-188 171. Weaver D.L. (1987): Effect of nutrition on reproduction in dairy cows. Veterinary Clinics of North America: Food Animal Practice, 3. 513. 172. Wegnez M., Schachter B.S., Baxter J.D. and Martial J.A. (1982): Hormonal regulation of GH mRNA. DNA, 1. 145-153. 173. Wegnez M., Schachter B.S., Baxter J.D. and Martial J.A. (1982): Hormonal regulation of GH mRNA. DNA, 1. 145-153. 174. Weigent D.A. and Blalock J.E. (1990): Review: growth hormone and the immune system. Progress in Neuroendocrinimmunol. 3. 231. 175. Wingfield P.T., Graber P., Buell G., Rose K., Simona M.G. and Burleigh B.D. (1987): Preparation and characterization of bovine growth hormones produced in recombinant Escherichia coli. Biochem. J., 243. 829. 136
Irodalomjegyzék 176. Wood D.C., Salsgiver W.J., Kasser T.R., Lange G.W., Rowold E., Violand B.N., Johnson A., Leimgruber R.M., Parr G.R. and Siegel N.R. (1989): Purification and characterization of pituitary bovine somatotropin. J. Biol. Chem., 264(25). 14741-7. 177. Woychik R.P., Camper S.A., Lyons R.H., Horowitz S., Goodwin E.C. and Rottman F.M. (1982): Cloning and nucleotide sequencing of the bovine growth hormone gene. Nucleic Acid Research, 10. 7197-7220. 178. Zhang H.M, Brown D.R., DeNise S.K. and Ax R.L. (1993a): Rapid communication: polymerase chain reaction fragment length polymorphism analysis of the bovine somatotropin gene. J. Anim. Sci., 71. 2276. 179. Zhang H.M, Maddock K.C., Brown D.R., DeNise S.K. and Ax R.L. (1993b): bGH gene frequencies in samples of U.S. AI bulls. J.Anim.Sci., 71. Suppl.1. 93. 180. Zhang H.M., Brown D.R., DeNise S.K. and Ax R.L. (1992): Nucleotide sequence determination of a bovine somatotropin allele. Anim. Genet., 23. 578. 181. Zomborszkyné Kovács M., Szabó I. és Sótonyi L. (1994): A hormonális szabályozás. In A háziállatok élettana és anatómiája, szerk: Húsvéth Ferenc, Mezőgazda Kiadó, 96-97. 182. Zwierzchowski L., Lukaszewicz M., Dymnicki E. and Oprzadek J. (1998): Polymorhism of GH, Κ-casein and ß-lactoglobulin genes in growing Friesian cattle. Animal Science Papers and Reports, 16. 6168. 183. Zwierzchowski L., Oprzadek J., Dymnicki E. and Dzierzbicki P. (2001): An association of growth hormone, -casein, -lactoglobulin,
137
Irodalomjegyzék leptin and Pit-1 loci polimorphism with growth rate and carcass traits in beef cattle. Animal Science Papers and Reports, 19. (1) 65-77.
138
Köszönetnyilvánítás
10 KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS Hálás köszönettel tartozom témavezetőmnek, dr. prof. Fésüs Lászlónak, aki a doktori folyamat során értékes tanácsokkal látott el mind a téma előkészítésében, a vizsgálatok elindításában, mind pedig a dolgozat összeállításakor. Fésüs professzor Úr főigazgatóként is támogatta munkámat és segítségemre volt a disszertáció megírása során. Köszönettel tartozom dr. Zsolnai Attilának, az Állattenyésztési és Takarmányozási
Kutatóintézet
tudományos
főmunkatársának,
aki
a
laboratórium kísérletek tervezésében és végrehajtásában értékes tanácsokkal látott el és mindvégig figyelemmel kísérte munkámat. Köszönöm dr. Anton István tudományos főmunkatárs segítségét és előrevivő tanácsait is. Hálásan köszönöm Völgyi-Csík József áldozatkész segítségét, amelyet a statisztikai vizsgálatok kivitelezésében nyújtott és tanácsait a módszerek megválasztásában. Köszönöm továbbá az Állattenyésztési és Takarmányozási Kutatóintézet Molekuláris genetikai kutatócsoportjának munkatársai – Szabó Gizella, Pimpli Józsefné, Rákóczi Györgyné és Horogh Gergely - által nyújtott önzetlen és odaadó segítséget, amely nélkül ez a dolgozat nem készülhetett volna el.
139
Köszönetnyilvánítás Köszönetemet fejezem ki Prof. Huszenicza Gyulának, a Szent István Egyetem Állatorvostudományi Kara tanszékvezető egyetemi tanárának, aki előremutató tanácsokkal látott el, ezzel segítve dolgozatom megírását. Köszönet illeti dr. Györkös Istvánt is munkám támogatásáért. Végül, de semmiképpen sem utolsó sorban, köszönettel és hálával tartozom Szüleimnek azért, hogy megteremtették azt a biztos hátteret, ami nélkül lehetetlen lett volna életem e pontjáig eljutni.
140
Rövidítések jegyzéke
11 RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE acetilkolin-CoA: acetil koenzim-A Ala: alanin CAMP: ciklikus adenil-monofoszfát (cyclic adenile monophosphate) DGGE módszer: denaturáló grádiens gélelektroforézis módszere ETA: becsült örökítő képesség (estimated transmitting ability) F: fenilalanin FCM: 4% tejzsírra korrigált tejhozam (fat corrected milk) GH: növekedési hormone (growth hormone) GHR: növekedési hormon receptor (growth hormone receptor) GHRF: növekedési hormon elválasztó faktor (GH-releasing factor) GLM: általános lineáris modell (general linear model) Gly: glicin GnRH: gonadotropikus elválasztó faktor (gonadotropic releasing hormone) GRF: növekedési hormon elválasztó faktor (growth hormone releasing factor) HBP: a kettős hélixet „becsomagoló” fehérjék (helix bundle peptid) IGF: inzulinszerű növekedési faktor (insulinlike growth factor) IGFBP: IGF kötő fehérje (IGF binding protein) KDa: kilo Dalton Leu: leucin LH: luteinizáló hormon LOD szám: valószínűségi pontszám (likelihood of odds) LSD: legkisebb négyzetes különbségek módszere (least square differences) Met: metionin 141
Rövidítések jegyzéke mRNS: messenger RNS NEFA: nem-észterezett szabad zsírsav (non-esterified fatty acid) PKC: proteinkináz–C PRL: prolaktin QTL: értékmérő tulajdonságok génhelye (quantitative trait loci) RACE: cDNS végek gyors sokszorosítása (rapid amplification of cDNA ends) RbGH: rekombináns szarvasmarha növekedési hormon (recombinant bovine growth hormone) RFLP:
restrikciós
hosszpolimorfizmus
(restriction
fragment
length
polymorphism) RPA: ribonukleáz protection assay Ser: szerin SNP: egy nukleotidnyi eltérésre utal a homológ kromoszómán (single nucleotid polymorhism) SST: szomatosztatin; növekedési hormon elválasztást gátló faktor (GHrelease inhibiting factor) STH: szomatotropin = növekedési hormon (somatotrphic hormone) Thr: treonin TRH: tireotróp hormon UTR: nem transzlálódó régió (untranslated region) Val: valin Y: tirozin
142
