Mez Gábor
Peptidkémia
Tartalom
TÖRTÉNETI IRODALMI ÁTTEKINTÉS ........................................................................ 3 TÁRGYALT TÉMAKÖRÖK ............................................................................................ 6 AMINOSAVAK EL FORDULÁSA ÉS SZINTÉZISE.................................................... 7 AZ AMINOSAVAK RÖVID BEMUTATÁSA................................................................. 8 VÉD CSOPORTOK........................................................................................................ 19 NEM URETÁN TÍPUSÚ NH VÉD CSOPORTOK....................................................... 21 ARILSZULFENIL VÉD CSOPORTOK:....................................................................... 27 URETÁN TÍPUSÚ VÉD CSOPORTOK ....................................................................... 28 PÉLDÁK........................................................................................................................... 34 KARBOXIL VÉD CSOPORTOK .................................................................................. 37 OLDALLÁNC VÉD CSOPORTOK .............................................................................. 41 PEPTIDKÖTÉS KIALAKÍTÁSA .................................................................................... 48 KAPCSOLÁSI ELJÁRÁSOK .......................................................................................... 50
2
TÖRTÉNETI IRODALMI ÁTTEKINTÉS 1. E. Fischer: Berichte 39, 530 (1906) Peptidek, polipeptidek fogalma, elmélete, szintézise
2. J.S. Fruton: Advances in Protein Chemistry Vol.5. (Academic Press, New York 1949) Felöleli az addigi peptidkémiát. 3. J.P. Greenstein, M. Winitz: Chemistry of Amino Acids (J. Wiley, New York, 1961) Lexikális gyüjtemény kismolekulatömeg peptidszármazékokról.
aminosav-
és
4. E. Schröder, K. Lübke: The Peptides I-II. (Academic Press, New York 1965-1966) Peptidkémikusok bibliája.
5. M. Bodánszky, M.A. Ondetti: Peptide Synthesis (J. Wiley and Sons, New York, 1966) 6. Medzihradszky Kálmán: A természetes peptidek szintézise. A kémia újabb eredményei 3 (1970) 7. Bajusz Sándor: Peptidszintézis. A kémia újabb eredményei 47 (1980)
8. R. B. Merrifield: J. Am. Chem. Soc. 85, 2149 (1963) Szilárdfázisú peptidszintézis elve
9. J.M. Stewart, J.D. Young: Solid phase peptide synthesis (Freeman and Co., San Francisco, 1969), (Pierce Chemical Company, Rockford, Illinois, 1984) Boc-technika 10.E. Atherton, R.C. Sheppard: Solid phase peptide synthesis: a practical approach (IRL Press, Oxford, England, 1989) Fmoc-technika 11.G.A. Grant: Synthetic peptides, a user´s guide (Freeman and Co., New York, 1992)
3
AMINOSAVAK H2N CH COOH R
Monoamino-monokarbonsavak: Gly (G):
H
Trp (W):
CH2 NH
Ala (A):
CH3
Ser (S):
CH3
Val (V):
CH
Leu (L):
CH2 CH
Ile (I):
CH
*
Thr (T):
CH3 CH3 CH3
CH3 CH2 CH3
CH2 OH *
CH
CH3 OH
Tyr (Y):
CH2
Cys (C):
CH2 SH
OH
Nle :
CH2 CH2 CH2 CH3
Hcy :
CH2 CH2 SH
Phe (F):
CH2
Met (M):
CH2 CH2 S CH3
Pro (P):
H2C H2C
NH
CH2
Hyp :
CH COOH
HO CH CH2 H2C
nem csak R
NH
CH COOH
nem csak R
Monoamino-dikarbonsavak (savas): Asp (D):
CH2 COOH
Asn (N):
(pK: 2,98)
Glu (E):
CH2 CH2 COOH (pK: 3,22)
CH2 CONH2 (pK: 5,41)
Gln (Q):
CH2 CH2 CONH2 (pK: 5,65)
4
Diamino-monokarbonsavak: Lys (K):
CH2 CH2 CH2 CH2 NH2
Orn :
(pK: 9,74)
Arg (R): CH2 CH2
CH2 CH2 NH2
(pK: 9,70)
CH2 NH C NH2 NH
(pK: 10,76)
CH2
His (H):
CH2 C CH N NH CH (pK: 7,58)
5
TÁRGYALT TÉMAKÖRÖK oldallánc védôcsoportok
amino védôcsoportok R1 Z NH CH
C
R2
O
+
OX karboxilcsoport aktiválás kapcsolási eljárások
H2N
CH
C
O OY karboxil védôcsoportok (szilárdfázisú szintézisnél gyanta tölti be ezt a szerepet)
- HOX
R1 Z NH CH
O
R2
C NH CH
C
O OY
védôcsoportok hasítása
Oldatfázisú és szilárdfázisú peptidszintetikus eljárások
6
AMINOSAVAK EL FORDULÁSA ÉS SZINTÉZISE Bruckner Gy z : Szerves kémia I/2 Pl.
H R C
R C O
O
C
+ NH 4CN
-H 2O
R CH C N NH 2
O OH
O + NH 3
α-ketokarbonsav (R=CH3, pirosz l sav)
Racém termék
R
C NH
C
OH
α-iminosav
H2O, H + hidrolízis
+ H 2O
R CH C
H2/kat.
NH2
O OH
R CH C NH 2
O OH
α-aminosav (alanin)
rezolválás
- N-acetil származék enzimes hidrolízise: L-konfigurációjú hasad, D nem - N-védett származék brucin sójának szétkristályosítása
7
AZ AMINOSAVAK RÖVID BEMUTATÁSA Glicin (G): nincs aszimmetria centrum nincs oldallánc mellékreakciók nagy flexibilitás 1.
könny reakcióba vinni konformációs változatosság O
O
R CH HN
C C
nincs racemizáció
NHCH2 COOR' OH- R CH HN
OBzl
C N CH2 COOH
H2O
NH CH2 COOH O
C NH CH2 COOH
C O
O Z-Aaa-Gly-OR´
hidantoin származék
karbamid származék
Megoldás: Gly-NH2 kiindulás, hidrolízis nem dipeptid fázisban (Z-Aaa-Gly-Gly-OR´) ! 2. Szukcinimid gyûrûzárás: Asp(OR)-Gly, Asn-Gly H2C COOH
H2C C
H2C COOH NH CH CO NH CH2 CO α-aszpartil-glicin
1
N CH2 CO NH CH C 2 O
NH CH CO NH CH2 CO ~30%
O
1
2
~70%
NH CH2 CO H2C CO NH CH COOH β-aszpartil-glicin
8
3. Diacetilezôdés: α-C atomon nincs térgátlás - önacilezés Z N CH2 COOH
(Z-Gly) 2O
Z NH CH2 C O
4. Diketopiperazin képzôdés: Gly-Pro, Gly-Gly
O2N
O CH2 O C NH CH2 C O O C CH2 N O
O CH2 O C NH CH2 O C C O CH2 N
5. Reakció DCC-vel: H2N CH2 C
O OEt
+
N C N
N C NH
NH C N HN CH2 COOEt
O
C
CH2
N
1-ciklohexil-2-ciklohexil-amino4,5-dihidroimidazolin-5-on
6. Gly-NCA (Leuchs-anhidrid) CH2 HN C O C O O
B-BH
O H2C C ON C O izocianát-származék
Alanin (A): aszimmetria centrum
NH-R
H2C C
O OH
HN C NHR O hidantoinsav-származék
racemizáció (kis mérték ) 9
gyors reakció, nincs nagy térgátlás apoláros karakter oldékonyság csökkenés
sok Ala
Valin (V):
α
C-atomon izopropilcsoport térgátlás lassú reakciók mellékreakciók fokozódása — Z-Val-OH > Boc-Val-OH, H-Val-OtBu > H-Val-OEt — karboxilcsoport reaktivitását jobban gátolja, mint az aminocsoportét — aminosav analízis 48 óra
1. Azidos kapcsolás: 1
R C
O
-N2
N3
azid
2. O
1
R N C O
H2N-R 2
izocianát-származék
1
R NH C NH R2 O karbamid-származék
N acilvándorlás (migráció)
O R C N O C HN
O NH R C O CH NH
Gyenge nukleofilek (pl. o,p-nitrofenol) esetén ! Piridin oldószer növeli a nukleofilitást. 3. Savkloridos kapcsolás: X-Val-Cl + NH2-R + OH
-
X-Val-OH + NH2-R + Cl
-
10
4. Észter hidrolízis, hidrazinolízis: X-Val-OMe + NH2-NH2 (NaOH)
lassú
racemizáció
5. Acilezés Tyr jelenlétében: Tyr OH-csoportja is acilez dhet
6. Vegyes anhidrides kapcsolás: H3C
H3C H3C
CH
H3C
CH3
Z CH2 CH C CH CH2 O C
O O
+
O
Z CH2 CH C H2N-R H3C H3C
Z-Val-OH + klórszénsav izobutil észter vegyes anhidridje
CH
CH3 O NH R NH R
CH CH2 O C
O
5-8% fordítottan acilezett származék normális esetben <1%
Izoleucin (I): a valinra leírtak fokozottan igazak még egy aszimmetria centrum
alloizoleucin
Leucin (L): az alaninhoz hasonló, de nagyobb oldallánc (térgátlás) lassabb reakciók Norleucin (Nle): nor egyenes lánc, metionin helyettesítése peptidekben CH2 CH2 S CH3
CH2 CH2 CH2 CH3
Met oldallánc
Nle oldallánc
Fenilalanin (F): benzilcsoport az oldalláncban 11
— katalitikus hidrogénezés benzolgy r telít dése — hosszú hidrogénezést kerülni kell ( His(Bzl), Arg(NO2) ) — Z-Phe-O Na+ Op.: 133-134°C, Z-Phe-OH Op.: 88-89°C megfelel en végzett savanyítással elkerülhet (Z-Gly-OH, Z-Ala-OH, Z-Lys(Z)-OH, Z-Val-OH, Z-Ser-OH) Prolin (P): iminosav, nem racemizálódik, merev struktúrában törés
β-turn szerkezetben
1. Prolin körüli kötések labilitása: Z-Pro-Gly-OMe + 1M NaOH
Z-Pro-OH (0,1M NaOH jó)
Tyr-Pro, Thr-Pro, Ser-Pro, Lys-Pro (Na/NH3) közeli proton katalizálja a hasadást Asp-Pro híg savakra hasad 2. Diketopiperazin képz dés: lásd Gly Gly-Pro, Pro-Gly, Pro-Pro, D-Aaa és nagy oldallánc el segíti SPPS (szilárdfázisú peptidszintézis), aktivált származékok tárolása 3. Szekunder amin alkilez dése: könnyebben N-alkilez dik, mint a primer amin SPPS lánc letörés: R R
CH2
CH2 Cl bázis
O C CH2 NH O
-HCl
R
CH2
O C
CH2 N CH2
R
O
12
4. DCC-s kapcsolás: O
N acilvándorlás
DMF > DCM
5. Prolin kapcsolása prolinhoz: O
O
CH3
H3C C O C HN CH C O N CH3
O
O
O
HN CH C OH
térgátolt
Triptofán (W): savas, oxidatív rendszereket nem bírja fémionok, napfény katalizál kinoidális átrendez dés 1. Aminosav analízis: enzimes hasítás, vagy metánszulfonsavas hidrolízis Tyr:Trp (UV meghatározás) Tyr (aminosav analízis) 2. Indolgy r alkilez dése: terc-butil kation (különösen veszélyes) x
CH2 x
NH x
x
HF hasítás el tt Boc-csoport eltávolítása! Irreverzibilis gyökfogók (scavanger) 3. Azidos kapcsolás: R-NH2NH2 +HNO2 közben az indolgy r nitrozálódhat 13
4. UV hatása hidrolízis közben:
OH
COOH CH CH2 NH2
HOOC
NH
NH
H
NH
5. N-terminális Trp viselkedése fragmenskondenzáció során:
NH
H2C H H
R
dimer vegyület keletkezik
NH
R CH2
Metionin (M): oxidáció, alkilez dés 1. Oxidáció: savas közegben leveg hatására szulfoxid keletkezik. er s oxidálószer (pl. H2O2) hatására szulfon keletkezik R
S
ox.
R’
R
S
R’
ox.
O
R
O
S
R’
O
szulfoxid (védelem is)
szulfon
2. Alkilez dés: CH3
CH3
S
O
CH2 CH2 NH CH CO
+
CH3 MSA
+S CH3 CH2
+
OH
CH2 NH CH CO 14
— tioanizol gyökfogó alkalmazása szükséges (hard-soft, pull-push) — ha benzil kation megy rá, metil fog lehasadni, S-benzil- homocisztein keletkezése közben 3. Katalizátor méreg: S atom miatt (cisztein is) BF3 adalék segít vagy pótolni a katalizátort Szerin (S): hidrofil OH-csoport funkciós csoport alternatív védelem (SPPS!) 1. OH acilez dése: acilez szer nagy feleslege esetén NH > OH nukleofilitás 2. Acilvándorlás: Gly-Ser N O, O N fenolok gátolják, HOBt, imidazol segíti az acilez dést 3. Intramolekulris acilezés: Trt NH CH C H2C OH
O
-HX
Trt NH CH C
X
O
H2C O
ez általában nem gond, mert tovább acilez 4. Curtius átrendez dés: Z NH CH C H2C OH
O
-N 2
N3
azid
Z NH CH N C O H2C
OH
izocianát származék
H2C Z NH CH
O C O NH
2-oxazolidon származék
5. Leuchs anhidrid:
15
CH2 OH HN O
C
O
CH C
HN
O
O
C
O
CH COOH CH2
az OH-csoportot védeni kell 6. SPPS: HF hasítás
N
R NH CH CO NH CH CO HO CH2
7. Szerin észterek (Thr vízvisszavétel
O migráció
láncszakadás
H+ HCO3
R -
+
H3N CH CO
NH CH CO O CH2
lúgos hidrolízis racemizáció
dehidroalanin allotreonin)
Treonin (T): C-- C két aszimmetria centrum treo Thr Na sója nem oldódik alkoholban, az allotreoniné igen. Szerinhez hasonló viselkedés, de térgátlás miatt lassabb reakciók. Tirozin (Y): vízben oldódik a fenolos OH miatt (lúgos kirázás!) 1. Alkilez dés: OH segíti a gy r intramolekuláris alkilez dés)
alkilez dését (Bzl védelem
2. Acilez dés: Tyr » Ser > Thr ( Z-Cl Z-Tyr(Z)-OH ) átacilezés is könnyebb O N migráció 3. Azidképzés: NaNO2
gy r nitrozálódása
4. OH nukleofilitása összehasonlítható az NH-éval hosszú reakció vagy acilez szer felesleg O-acilezés de bázissal bontható Cisztein (C): cisztein ---- cisztin (oxidáció)
16
H2C
SH
NH CH CO
HS
ox.
CH2
NH CH CO
H2C
red.
S
NH CH CO
S
CH2
NH CH CO
Cys Cys Cys dipeptid
Cys Cys
Cys diszulfidhíd
ciklocisztin
1. Könnyen oxidálódik, pH 7, leveg jelenlétében. Redukálása merkapto vegyületekkel (DTT, merkaptoetanol)
2. Oxidatív hasítás
ciszteinsav (pl. aminosav analízis) H2C
SO3H
NH2 CH COOH
3. Acilezésben versenyez az NH-csoporttal, N pl. Npys-csoport
S migráció
4. Alkilez dés: véd csoportok hasításánál (gyökfogók használata) 5. Katalizátor méreg, H2/kat. 6. Diszproporcionálódás: szimmetrikussá alakulása.
aszimmetrikus
diszulfidhidak
Aszparagin (N), Glutamin (Q): oldallánc amid (CONH2) 1. Dehidratáció: karboxamid-csoport vízvesztéssel nitrillé alakul ( C N ). DCC, foszgén, Tos-Cl/piridin, POCl3 Asn és Gln kapcsolása aktív észteres vagy in situ aktív észteres eljárással. Beépült Asn, Gln már nem módosul. 2. Gy r zárás: Asn: szukcinimidgy r (ezt követ transzpeptidáció), ld. Gly. Gln esetén a megfelel glutárimid kialakulása ritka. 17
Gln: piroglutaminsav képz dés a peptid N-terminálisán. O H2N
C CH2 CH2
H2N CH CO
-NH3
CH2
CH2 O C HN CH CO
Gln > Glu(OX) > Glu, HCl/ecetsav > HCl/dioxán, TFA/DCM Közeli His katalizál! Asn esetén a négytagú gy r miatt nem alakul ki.
Aszparaginsav (D), Glutaminsav (E): Oldallánc karboxilcsoportot védeni kell! E nélkül az aktiválás ciklikus anhidridhez vezet (α és γ-peptidkötés alakul ki). Oldalláncban védett Asp és Glu hasonló gy r zárási mellékreakciót mutatnak, mint az Asn és Gln, bár kisebb mértékben (véd csporttol függ ). Hisztidin (H): alkil- és acilátviv tulajdonsága okoz sok gondot. Nincs igazán jó véd csoportja (ld. véd csoportoknál). Lizin (K): Oldallánc NH2-csoport védelme elengedhetetlen. Arginin (R): Arg Orn átalakulás bizonyos véd csoportok hasításánál. Szulfonsav-típusú véd csoportjainak hasításakor inkább más aminosavak (pl . Tyr sérül).
18
VÉD CSOPORTOK R1
R2
+
H2N CH COOH
R1
+
X NH CH COOH
sokféle termék
H2N CH COOH
R2
R1
-H 2O
H2N CH COOY
R2
X NH CH CO NH CH COOY
Amino véd csoportok (X): nem uretán típusúak, uretán típusúak R´ O
O
O
R C NH CH C OH
R´ O
R O C NH CH C OH
amid
uretán
Racemizáció: H
R
C
N
C
H R´
O C AktO O
B:
R C
-AktOH
O
Acil-Aaa-OAkt
C O
N HO
C
-H +
R´ C C
H O
H C
R´
H-Aaa-OY
LL és DL dipeptid
O
oxazol-5-on
H R
N
H 2O
R
C O
+H+
N
R´
R
-
C: C
C
N
O
O
R´ C C
O:-
Acil-DL-Aaa-OH
R pszeudo aromás rendszer
C
N
R´ C
O CH
O:19
- amidokban (R-CO-NH-R´) O a f nukleofil - uretánokban (R-O-CO-NH-R´) N a f nukleofil - Pro, Pht, Tos nincs racemizació - direkt protonelvonás, rövid ideig dolgozni bázisos közegben
20
NEM URETÁN TÍPUSÚ NH VÉD CSOPORTOK Tozil (Tos):
Du Vigneud
O H3C
S
NH R
O
Bevitel:
Tos
Tos-Cl formában
Racemizáció: Tos-Aaa-OH kapcsolásakor nincs, S a f nukleofil Hasítás: Na/NH3 redukció ( Cys(Bzl), His(Bzl) ) Problémák: Lys-Pro, Thr-Pro kötés hasadása Arg(Tos) Orn Orn(Tos) laktámgy r (Lys(Tos) kevésbé) O H2N CH C NH H2C CH2 CH2 -
Elektrolitikus redukció: Pb (Tos-Peptid, 20%MeOH, pH 11), + C (20% HCl) Er s sav: HF, TFMSA Kapcsolás: nem kapcsolható vegyes anhidrides módszerrel, mert jelent s mennyiségben fordítottan acilezett termék. Savkloriddal csak MgO szuszpenzióban (azidoknál hasonlóan):
21
O Tos NH CH C R
OH -
Tos
Cl
N
CH C R
Tos NH CH
H2O
R
O Cl O
R C
H
- Cl - CO
+
Tos NH2
Aktív észteres kapcsolás: (Pro és pGlu kivételével) O
O
Tos NH CH C NH CH C R
R´
R O CH C Tos N NH C CH O R´
Ftalil (Pht):
O
+
NO2
HO
piridin vagy vizes alkohol
NO2
O C N R C O
Bevitel: ftálsavanhidrid + Aaa (Gly esetén ömlesztés 150°C)
22
O
O
C OH
C SOCl 2 + hô
O C NH CH C O
R
OH
O R´
O N CH C
-
C
R
O R´
O
O C
HCl
O N CH C
hô
C
R
OH
O
Trp, Asn, Gln, Met, Asp-Pro!
Nefkens: O
O
C N C OC2H 5 C
+
H2N R
pH 7-8
O
C N R C
O
O
+
N-karboxi-etil-ftálimid
H2N CO OC2H 5
Hasítás: hidrazinolízis (bár ez sem kvantitatív) CO
NH
+ CO
etil-uretán
0,1M hidrazin/EtOH, 1óra reflux ftálhidrazid HCl hozzáadására kikristályosodik alkilészterek!
H2N R
NH
Formil (For): vízoldékonnyá teszi a peptidet (ioncserés tisztítás) O H C NH R For
Bevitel: hangyasav + ecetsavanhidrid + Aaa, For-OTcp 23
Hasítás: hidrogén-peroxid O H C NH R
Cys, Trp, Met
H 2O 2
O HO C NH R
-CO 2
NH2 R
oxidálódik!
0,5M HCl (alkohol-víz elegy) melegítve
Gly-Lys(For) kötéshasadás Hidrazin vagy hidroxilamin (enyhén savas közegben) Rezisztens: HBr/jégecet, híg lúg, Na/NH3 Trifluoracetil (Tfa): Lys(Tfa) O F3C C NH R Tfa
Bevitel: Tfa-anhidrid (felesleg racemizáció) Tfa-anhidrid/TFA ( Tfa-Lys-OH ) Tfa-OEt ( H-Lys(Tfa)-OH ) Tfa-OPh, CF3-CO-CCl3 Hasítás:
híg NaOH, Ba(OH)2, NaBH4 redukció HCl/EtOH Tfa-OEt + peptid-észter HCl-sója (más savakkal szemben stabil)
Tfa-peptid-észter magas g ztenzió 19 F NMR
gázkromatográfia
Klóracetil (ClAc): szelektív hasíthatóság, ciklizálás
24
O ClH2C C NH R ClAc
Bevitel: klórecetsav-anhidrid, ClAc-OPcp Hasítás: tiovegyületekkel 1. 2-merkapto-3-nitro-piridin NO2 N H
NO2
O +
ClH2C C NH R
S
NaHCO3 40°C
+ -
N+
S
OC
CH
S CH2 CO NH R
TFA, 1-4 óra 20°C
NO2 NH2 R
N
2. 1-piperidin-tiokarboxamid N C NH2 S
Racemizáció: utólagos bevitel Ciklizálás: klóracetilezett aminocsoport + Cys SH-csoportja O ClH2C C
PEPTID
Cys SH
B:
O H2C C
PEPTID
Cys S
Konjugálás: BrAc-származék jobb Fehérje vagy polipeptid NH-csoportjainak módosítása BrAccsoporttal és ezt reagáltatni Cys tartalmú peptiddel. 25
Alkil-típusú véd csoportok: CH2 NH R
CH
benzhidril (Bha)
NH R
benzil (Bzl)
CH3
C NH R tritil (Trt)
CH3
O
C
C
NH R 4-metil-tritil (Mtt)
NH R 4-metoxi-tritil (Mmt)
Hasítás: savas hasítás, savérzékenység: Mmt>Mtt>Trt»Bha»Bzl Mmt és Mtt 1% TFA/DCM, Trt 5% TFA/DCM Bzl inkább H2/kat Savlabilitás fokozása: metoxi > metil Savstabilitás fokozása: nitro > klór Alkalmazásuk a nagy térgátlás miatt f leg oldallánc védelem. Racemizáció: Bzl - racemizálódik, Trt-Aaa-OX térgátlás miatt nem.
26
ARILSZULFENIL VÉD CSOPORTOK: NO2
NO2
S NH R 2-nitrofenil-szulfenil (NPS)
N
S NH R
3-nitro-2-piridinszulfenil (Npys)
Hasítás:
1. savas (HCl/éter, EtOAc, MeOH) (NPS) 2. nukleofil: tiovegyületek (NPS, Npys) Cl és OMe szubsztituált NPS származékok a savstabilitás változtatása érdekében. Trp indolrésze , ill. Tyr szubsztituálódhat. N S átmenet Cys esetében, HOBt, His katalizálja. Racemizáció: van 1-(4,4-dimetil-2,6-dioxo-ciklohexililidén)-etil (Dde): O
O H3C
NH R
H3C
CH3 O
H2N NH2
H3C
C
H3C NH
CH3
N
Hasítás: Speciális hasíthatóság miatt f leg oldallánc védelem. 2% hidrazin/DMF 2x3 perc Rezisztens: TFA hatására 0,1% hasad 20% piperidin 3% hasad 2 óra alatt 6,5% hasad 4 óra alatt.
27
URETÁN TÍPUSÚ VÉD CSOPORTOK Aktivált aminosavszármazék nem racemizálódik. Nagy variációs lehet ség (különböz hasítások). Kiszorították a nem uretán típusú véd csoportokat, els sorban az α-aminocsoportok védelmében. Benzil-oxi-karbonil (Z): O CH2 O C NH R Z
Bevitel: Z-Cl (klórhangyasav benzilészter: C6H5-CH2-O-CO-Cl) foszgén + benzilalkohol (foszgén feleslegben) Z-Cl Termikus bomlással CO2-t veszthet + C6H5-CH2-Cl Nem tisztítják desztillálással (esetleg vacuum desztillálás)! Hasítás: 1. H2/kat. (Pd/C) (Cys, Met +TEA Z-PEPTID
karbamilát+ CO2)
C6H5-CH3 + HO-CO-NH-R
Nincs térfogatváltozás! H2
CO2 (Ba(OH)2
CO2+ NH2-R BaCO3 követés)
2. Savas hasítás: HBr/jégecet, HF, TFMSA, TMSOTf TFA/DCM ( 1%)
28
CH2 O CO NH R
CH2 O CO NH R H
X
CH2 X
CH2
+ HO CO NH R
+ NH2 R HBr/THF v. dioxán éterkötés hasadás észterezés 2N HCl/hangyasav (Met) alkilez dés visszaszorítása CO2
3. Na/NH3: már nem használják Problémák: 1. Z-véd csoport nem érzékeny bázisra, de R
NH CH2 CO NH CH2 CO NH R CH2 O CO
+ OH - BzlOH
Z-Aaa-Gly- ... R CH HN O
C O
C NH CH2 CO NH R hidantoin-származék
2. Savklorid képzés:
29
R NH CH2 CH2 O CO
O
C
hô
R
Cl
O CH C HN
C
O +
O Leuchs-anhidrid
CH2 Cl Bzl-Cl
Tionil-klorid helyett PCl5 a savklorid kialakításához. 3. Savas hasítás: Bzl-észter is hasad a Z-csoport hasításakor < 20 perc és < 20°C szelektív Z-csoport hasítás Szubsztituált származékok: H3C O
CH2 O CO NH R
híg HCl/etanol
p-metoxi-benzil-oxi-karbonil ( Z(OMe) ) O2N
CH2 O CO NH R
HBr/jégecet, igen erôs savak
p-nitro-benzil-oxi-karbonil ( Z(NO2) ) Cl CH2 O CO NH R
erôs savak, HF
2-klór-benzil-oxi-karbonil ( ClZ ) N N
CH2 O CO NH R
szines , de hasadás után szintelen katalitikus H2 ! Ne!
p-azofenil-benzil-oxi-karbonil )
30
NO2 H3C O H3C
CH2 O CO NH R
hυ (350nm)
O
terc-butil-oxi-karbonil (Boc): CH3
O
H3C C O C NH R CH3 terc-butil-oxi-karbonil (Boc)
Bevitel: Boc-N3, di-terc-butil-dikarbonát ( (Boc)2O ) CH3
O
H3C C O C CH3
CH3 N3
O
H3C C O C CH3
CH3 O
C CH3 CH3
Hasítás: híg savakra; 25% TFA/DCM, 2N HCl/dioxán, EtOAc, hangyasav, 0,1N HCl/hangyasav Stabil: H2/kat. bázis, hidrazin, Na/NH3 t
Probléma: Bu kation alkilezi a Trp,Met, védett Cys aminosavakat
31
Származékok: H3C O
CH3 C
H3C O
O O
C
80% AcOH, 3 óra 5% TFA/DCM 9 perc, hυ -1400x savlabilabb, mint a Boc
NH R
CH3
α,α−dimetil-3,5-dimetoxi-benzil-oxi-karbonil (Ddz)
CH3 C
O O
C
80% AcOH, <1 óra 0,5% TFA/DCM 9 perc, -3000x savlabilabb, mint a Boc
NH R
CH3 bifenil-izopropil-oxi-karbonil (Bpoc)
9-fluorenil-metoxi-karbonil (Fmoc):
H
CH2 O C NH R O
9-fluorenil-metoxi-karbonil (Fmoc) gyenge szerves bázisra hasad
H3C
O
C NH R O
9-metil-9-fluorenil-oxi-karbonil erôs savakra hasad
Bevitel: Fmoc-Cl, Fmoc-OSu
32
O C H
CH2 O C Cl
H
CH2 O C O O
O Fmoc-Cl
Fmoc-OSu
N O
C
CH2 CH2
Hasítás: gyenge szerves bázisok (szekunder aminok); piperidin, morfolin, DEA (dietil-amin), DBU: 1,8-diazabiciklo[5.4.0]undec-7-én TBAF: tetra-butil-ammonium fluorid Rezisztens savakra, H2/kat. (ellenvélemények is) Probléma: Hosszú hasítás esetén diketopiperazin képz dés a kritikus szekvenciáknál. A keletkez dibenzofulvén okozhat mellékreakciókat.
Allil-oxi-karbonil (Aloc):
CH2
O CH2 CH CH2 CH2 C NH R allil-oxi-karbonil (Aloc)
Bevitel: Aloc-Cl Hasítás: Pd(O)/(Ph)3P Rezisztens: sav, bázis (szelektív, ortogonális) véd csoport kombináció. Ciklohexil-oxi-karbonil (Choc, Hoc): 33
O O C NH R ciklohexil-oxi-karbonil (Choc)
Bevitel: Choc-Cl, Choc-OSu Hasítás: HF, TMSOTf (25°C), 0°C-on 1-2%
PÉLDÁK 1. Tuftsin-származékok szintézise: Thr-Lys-Pro-Arg Boc-Lys(Z)-Pro-Arg(NO2)-ONBzl
Z-Lys(Boc)-Pro-Arg(NO2)-ONBzl
1. HCl/EtOAc 2. Boc-Thr-OPcp
1. HCl/EtOc 2. Boc-Thr-OPcp
Boc-Thr-Lys(Z)-Pro-Arg(NO2)-ONBzl Z-Lys(Boc-Thr)-Pro-Arg(NO2)-ONBzl
1
1. HCl/EtOAc 1. HCl/EtOAc 2. H2/kat 2. For-OTcp 3. H2/kat
H2/kat u.a.
2
3
4
Boc-Lys(Boc)-Pro-Arg(NO2)-ONBzl
5
6
1. HCl/EtOAc 2. Boc-Thr-OPcp
Boc-Thr-Lys(Boc-Thr)-Pro-Arg(NO2)-ONBzl
7
8
9 34
1. Thr-Lys-Pro-Arg 4. Lys(Thr)-Pro-Arg 2. For-Thr-Lys-Pro-Arg 5. Lys(For-Thr)-Pro-Arg 3. Boc-Thr-Lys-Pro-Arg 6. Lys(Boc-Thr)-Pro-Arg 7. Thr-Lys-Pro-Arg 8. For-Thr-Lys(For-Thr)-Pro-Arg 9. Boc-Thr-Lys(Boc-Thr)-Pro-Arg 2.
Choc-Lys(Boc)-Gly-R 1. 33% TFA/DCM 2. 10% DIEA/DCM 3. Z-Gly-OH + DCC +HOBt
Choc-Lys(Z-Gly)-Gly-R 1M TMSOTf-tioanizol/TFA
Choc-Lys(H-Gly)-Gly-OH BOP-HOBt-DIEA (3:3:6)
Choc-Lys( Gly)-Gly HF-p-krezol (9:1)
H-Lys( Gly)-Gly
3. Template Assembled Synthetic Protein (TASP): (Mutter et al.) Fmoc szintézis:
35
Boc Aloc K P G K P K K G Dde ClZ
4. Lysine-tree (lizin fa), Multiple Antigen Protein (MAP): (Tam et al.) Boc
K Fmoc Boc K K Fmoc K βA R Boc K K Fmoc Boc K Fmoc
Szelektív hasítás után két különböz epitóp kapcsolható (esetleg további módosítás után pl. klór-acetilezés).
36
KARBOXIL VÉD CSOPORTOK - észterek (kevesebb fajta) - olcsó, veszélytelenebb Szintézisek oldatban: R Boc NH CH C
O X
R´
R
O
+ NH2 CH C
Y
O
R´
O
Boc NH CH C NH CH C
Y
X és Y is lehet észter. Minden észter aktiválás, de... t O Bu < OEt < OBzl < OMe < OAll < OPh < ONp < OPcp < OPfp Szilárdfázisú szintézis: C-terminális karboxil védelem = gyanta R Boc NH CH C
O X
R´
+ NH2 CH C
R
O R
O
R´
Boc NH CH C NH CH C
O R
Metil-, etil-észter (OMe, OEt): Észter képzés: Aaa + alkohol (vízmentes) + HCl (gáz) Met, Trp, Tyr: kíméletesebb módszer tionilkloriddal Aaa alkoholos szuszpenzió + fölös tionilklorid: O Cl S Cl
MeOH
O 2 HCl + H3C O S O CH3
ez a metil átvivô
Az észter HCl sója éterrel kicsapható. Hasítás: enyhe alkalikus közeg; 0,1-1,5N NaOH-aceton ( 1:1) < RT, minimális bázis felesleg, < 1 óra Problémák: racemizáció (magasabb h mérséklet, bázis felesleg, hosszú id ) NH3 vesztés (Gln, Asn) el fordulhat ciklizáció
37
Pht véd csoport
urea hidantoin gy r felnyílása miatt nem!
Ammonolízis: peptid-amid Hidrazinolízis: peptid-hidrazid
peptid-azid
Benzil-észter (OBzl): Észteresítés: HCl katalízis nem jó, mert Bzl-Cl Bzl-Aaa (aminosav függ ) p-toluol-szulfonátos katalízis (Fp csökkenés) azeotropos desztilláció (kristályvíz!) Hasítás: er s savak; HF, TFMSA, TMSOTf 2N HBr/jégecet (hosszabb id , magasabb h mérséklet) H2/kat. (PdC); nincs CO2 fejl dés H2 fogyás mérhet (alkoholban (ekv. HCl) vagy ecetsavban) Szubsztituált benzil-észterek: p-nitro-benzil-észter (ONBzl): Bevitel: X-Aaa-OH + DCC + p-nitro-benzil-alkohol Hasítás: H2/kat. (Pd/C), (HBr/jégecetre rezisztens) p-klór-benzil-észter (OClBzl): savstabilitást növeli Bevitel: X-Aaa-OH + DCC + p-klór-benzil-alkohol Hasítás: er s savakra; HF, TFMSA p-metoxi-benzil-észter: savlabilitás növelése Bevitel: X-Aaa-OH + DCC + p-metoxi-benzil-alkohol Hasítás: gyenge savakra; TFA benzhidril-észter (OBh):
38
O CH O C R
-
+
Bevitel: X-Aaa-O Ag + benzil-klorid Hasítás: sokféle; H2/kat. (Pd/C), TFA, bázis, hidrazin 2,2-dinitro-benzhidril-észter: Hasítás: fotolitikus hasítás Ciklo-alkil-észterek (pentil, hexil, heptil) (OcPen, OcHex, OcHep): Bevitel: X-Aaa-OH + DCC + megfelel alkohol Hasítás: er s savak; HF (ciklopentil kicsit savérzékenyebb, míg a cikloheptil kissé bázis érzékeny, ciklohexil a legjobb) Allil-észter (OAll):
CH2 CH CH2 O CO R
Hasítás: Pd(0) hasítható, savra, bázisra rezisztens t
terc-Butil-észter (O Bu):
CH3 O H3C C O C R CH3
Bevitel: nem lehet savkatal ízissel el állítani, mert hasad savra Z Aaa C
O OH
+ H2C C
CH3 CH3
DCM kat. cc.H2SO 4
CH3 R C O C CH3 O CH3
39
Vastag falú lombikban, zárt térben, óránként rázogatni. Végén fölös izobutilént a lombik kinyitásával elpárologtatni. Z hasítás katalitikus hidrogénezéssel. t Szabad N-terminálissal is eláll, mert a Bu nem aktív észter. Hasítás: sok elektronküld csoport miatt híg savakra; TFA, HBr/jégecet, HCl/hangyasav (lassabban, mint a Boc). Bázisnak ellenáll (40% KOH !, terc-butil-éter nem). 9-Fluorenil-metil-észter (OFm):
H
CH2 O C R O
Bevitel: X-Aaa-OH + DCC + 9-fluorenil-metanol Hasítás: mint az Fmoc-csoportot (szerves szekunder aminok; piperidin, morfolin, DEA, valamint TBAF, DBU)
40
OLDALLÁNC VÉD CSOPORTOK Szintézis oldatban: nem szükséges az oldalláncok védelme kivétel: COOH, NH2, (SH) Szilárdfázisú szintézisek: acilez szer feleslege miatt kell! OH funkciós csoport: Tyr > Ser > Thr (reaktivitási sorrend) Acil védelem (Thr, Ser): lúgos hasítás dehidratálás racemizáció O---N acilvándorlás Éter védelem: Me, Et nehezen leszedhet , ezért nem jó. t Bzl, Bu alkalmas Benzil-éter (Bzl): Bevitel: kialakítása nagyon nehéz, rossz kitermelés (totál szintézis) Boc-Ser-OH
NaH DMF
Boc-Ser(Na)-OH
BzlBr
Boc-Ser(Bzl)-OH
Hasítás: H2/kat. (Pd/C), er s savak; HF, TFMSA, TMSOTf, TMSBr, HBr/jégecet t
terc-Butil-éter ( Bu): Bevitel: X-Aaa-OY + izobutilén + kat. cc. H2SO4 X és Y olyan véd csoportok, amelyek más módon is hasíthatók, mint savas hidrolízis (Z, Fmoc, Bpoc, Nps, Alloc, ONBzl, OMe, OEt, OFm, OAll) Hasítás: enyhe savakkal; TFA, HCl/jégecet, HBr/jégecet Ser és Thr esetén e két véd csoport elégséges és megfelel .
41
Szabad OH acilez dése (oldat fázis) megakadályozható pentaklórfenol (PcpOH) vagy pentafluor-fenol (PfpOH) jelenlétével (aktív észteres kapcsolás), de HOBt, illetve imidazol (His) jelenléte/közelsége el segíti. Acilezett OH elbontása: NH3/metanol. Tirozin: külön probléma Bzl: nem elég stabil savakra (50% TFA/DCM 1-2% hasadás) intramolekuláris átrendez dés, mert gyökfogókkal (anizol, krezolok, tioanizol, DTT, etil-metil-szulfid) sem gátolható. O CH2
OH CH2
CH2 NH CH CO
CH2 NH CH CO
Elektronszívó szubsztituensek segítenek: 2,6-diklór-benzil (2,6-Cl2Bzl) vagy p-bróm-benzil (p-BrBzl) csoportok hasításkor stabilabb karbokation jön létre, ezért scavangerekkel jobban befoghatók (de nem teljesen, kb. 5% melléktermék, míg a Bzl esetén általában > 20%) Bevitel: X-Aaa-OH + (Hlg)BzlBr + bázis 2-Bróm-benzil-oxi-karbonil (2-BrZ):
42
2-BrZ O
Br
O C O CH2
CH2 NH CH CO
SH-véd csoportok (Cys): p-Metoxi-benzil (Mob):
CH3 O
CH2 S R
p-metoxi-benzil (Mob)
4-Metil-benzil (Meb): H3C
CH2 S R
4-metil-benzil (Meb)
Hasítás: er s savakra hasadnak (HF), de a Meb hasadása TFMSA szobah n nem tökéletes és 0°C-on minimális, hasonlóan a TMSOTf hasító reagenshez. A Mob azonban TFA-ban nem elég stabil, tehát utána már ne túl sok kapcsolás. Meb hasítás Tl(tfa)3 majnem teljes Acetamido-metil (Acm):
O H3C C NH CH2 S R
Acetamido-metil (Acm)
43
Bevitel: Cys HCl (HOCH2NHCOCH3) +TFA
sója
N-hidroxi-metil-acetamid
Hasítás: Hg(II)-sók, Tl(tfa)3 , I2, Ag-triflát stabil savakra és piperidinre. 3-Nitro-2-piridin-szulfenil (Npys): NO2 N
S S R
3-nitro-2-piridin-szulfenil (Npys)
Hasítás: tiolokkal, bázisra (pH < 6), HOBt ?, piperidin, low-high HF. Stabil savakra; HF, TFA. Diszulfidhíd kialakítására alkalmas! Tritil (Trt): Bevitel: Cys HCl só + Trt-OH Hasítás: HOAc, TFA, Hg(II)-sók, I2 stabil piperidinre (Fmoc-szintézis) 9-Fluorenil-metil (Fm): Hasítás: piperidin, stabil szervetlen bázis, savak t
S-terc-butil (S Bu):
CH3 H3C C S S R CH3 S-terc-butil
t
Bevitel: Bu-SCN
44
Hasítás: tiolok, foszfinok stabil: savakra, piperidin Histidin (imidazol oldallánc): τ
CH C NH CH
Nπ
Szabad imidazol acilez dhet és/vagy enantioizomerizáció játszódhat le rajta. Acilez dés meggátolható átmeneti védelemmel is oldatfázisban (pl. Boc-His(Boc)-OH), de fragmens kondenzáció és SPPS esetén végig védeni kell. Az enantioizomerizáció elkerülésére a N-t kell védeni, de a legtöbb véd csoport a N-t védi. Benzil (Bzl): Na/NH3 redukcióra hasítható (már nem használják). Dinitrofenil (Dnp): Bevitel: 1-fluor-2,4-dinitrobenzol + bázis + X-His-OH Hasítás: tiolok, tiofenol (DMF, DIEA), hidrazinra is (Dde!) Az utolsó aminovéd csoport hasítása el tt hasítani, mert alkilez (1. Dnp, 2. Boc, 3. többi véd csoport + gyanta) Ez talán a legbiztonságosabb véd csoport. Dinitrofenol eltávolítása gélsz réssel. Stabil: savakra, bázisokra. Tozil (Tos): Bevitel: Tos-Cl + bázis + X-His-OH Hasítás: er s savak (HF, TFMSA, TMSOTf), Ac2O-piridin, részben hasad HOBt-re (DCC/HOBt !) 45
TFA-ban sem elég stabil, ugyanakkor er s savas hasítása sem 100%-os.
Benzil-oxi-metil (Bom): τ
CH C N
π
N CH2 O CH2
CH
benzil-oxi-metil (Bom)
Bevitel: Bzl-O-CH2-Cl + bázis + X-His-OH Hasítás: er s savakra (HF, TFMSA, TMSOTf) terc-Butil-oxi-metil (Bum): τ
CH C N
CH3
π
N CH2 O CH
C CH3 CH3
terc-butil-oxi-metil (Bum) t
Bevitel: Bu-O-CH2-Cl + bázis + X-His-OH Hasítás: híg savakra (TFA) Probléma mindkett nél: formaldehid keletkezik (azonnal eltávolítani, mert számos mellékreakciót okoz). Különös gond az N-terminális cisztein: SH
CH2
NH2 CH CO R
HCOH - H 2O
H2C
S
CH2
NH CH CO R
tiazolidin-karbonsav 46
Tritil (Trt): Bevitel: TrtOH + Ac2O/H
+
Hasítás: TFA (Fmoc-eljárás) , talán a legjobb erre, bár
védelem.
terc-Butil-oxi-karbonil (Boc): Kevésbé hatékony, mint a Trt. Allil-oxi-karbonil (Aloc):
τ
CH C N
π
N CH2 O CH2 CH CH2 CH allil-oxi-metil
Bevitel: Boc-His(Boc)-OMe + CH2=CH-CH2-O-CH2Cl Hasítás: Pd(0)/PPh3 Triptofán (indol-oldallánc): Formil (For): Bevitel: hangyasav + ecetsav anhidrid + védett Trp Hasítás: piperidin tioanizol/TFA
,
low-high
HF,
TFMSA(TMSOTf)-
Ciklohexil-oxi-karbonil (Hoc): Bevitel: Hoc-Cl + X-Trp-OH Hasítás: HF
47
PEPTIDKÖTÉS KIALAKÍTÁSA -aminocsoport aktiválás -karboxilcsoport aktiválás (egyszer bb, kíméletesebb)
a) Step wise (lépésenkénti) szintézis: Z-NH-CHR2-CO-X
+
NH2-CHR1-CO-OY(NH2) - HX
Z-NH-CHR2-CO-NH-CHR1-CO-OY amino-véd csoport eltávolítása Z-NH-CHR3-CO-X
+
NH2-CHR2-CO-NH-CHR1-CO-OY - HX
Z-NH-CHR3-CO-NH-CHR2-CO-NH-CHR1-CO-OY véd csoportok eltávolítása 1 vagy 2 lépésben NH2-CHR3-CO-NH-CHR2-CO-NH-CHR1-CO-OH Z véd csoport uretán típusú vagy Tos, Pht: nincs racemizációveszély a lépésenkénti kapcsolások esetén
48
b) Fragmenskondenzáció:
Z-NH-CHR3-CO-NH-CHR2-CO-NH-CHR1-CO-OY -YOH Z-NH-CHR3-CO-NH-CHR2-CO-NH-CHR1-CO-OH
-Z
NH2-CHR3-CO-NH-CHR2-CO-NH-CHR1-CO-OY 1+2 - H2O Z-NH-CHR3-CO-NH-CHR2-CO-NH-CHR1-CO-OY 2 véd csoportok eltávolítása 1 vagy 2 lépésben H-NH-CHR3-CO-NH-CHR2-CO-NH-CHR1-CO-OY 2 Fragmenskondenzáció mindig racemizáció veszéllyel jár! Kiküszöbölés, csökkentés: - Gly, Pro (Ala) C-terminálisú fragmensek alkalmazása - azidos kapcsolás - racemizációt csökkent adalékok (CuCl2, HOBt)
49
KAPCSOLÁSI ELJÁRÁSOK A. AZIDOS KAPCSOLÁS (Curtius, 1902) H2N-NH2* HNO2 Φ-CO-NH-CHR-COOCH3 Φ-CO-NH-CHR-CONHNH2 H2N-CHR'-COONa Φ-CO-NH-CHR-CON3 Φ-CO-NH-CHR-CO-NH-CHR'COONa + HN3 *98 % hidrazin-hidrát metanolos oldata, 2 nap alatt kiválik az alkoholos oldatból. X-AAA-COCl + NaN3
X-AAA-CON3 + NaCl, ha X=Pht, Tfa
Az eljárás lassú acilezést és ezáltal sok mellékreakciót eredményez. De oxazolonon át nincs racemizáció, csak direkt protonelvonással (aminoterminális semlegesítése, bázisfelesleg ne!) 1-dietil-amino-2-propanol
Alkalmazás: lépésenkénti szintéziseknél nagyon ritkán (His), fragmenskondenzációnál néha.
HN δ+ R
Védett hidrazidok: véd csoportként m ködnek a szintézis alatt Boc-Aaa1-Aaa2-NH-NH-Z, Z-Aaa1-Aaa2-NH-NH-Boc (ellentétes, szelektíven hasítható véd csoportok alkalmazása) Mellékreakciók: 1. Curtius-féle átrendez dés: -N2 R-CO-N3 (karbamid)
R-N=C=O HOR (Ser)
R-NH-CO-OR Azidok használata feldolgozás nélkül!
-
δ
O N δ-
CH δ+ C O N N +δ δ
H2N-R' R-NH-CO-NH-R' AA hiányzik majd!
50
2. Amidképz dés: Z-NH-CHR-CO-NH-NH-NO
-H2O -N2O
Z-NH-CHR-CON3 Z-NH-CHR-CONH2
3. Diacil-hidrazin képz dés: Z-NH-CHR-CON3 + H2N-NH-CO-CHR-NH-Z Z-NH-CHR-CO-NH-NH-CO-CHR-NH-Z 4. Arg guanidino-csoport: Arg(NH2), Arg(X) Arg(NO2)
Orn, Arg(Tos)
Arg
5. HNO2: Trp, Tyr NO2 szubsztitúció; Met, cys(SAlk) szulfoxid savlabilis véd csoportok (Boc, Trt) hasadása (<-25°C) Megoldás: RCCOH + Φ2P
51
B. SAVKLORIDOS KAPCSOLÁS E. Fischer (oktapeptid), Fodor G. (nonapeptid) NaOH
1. C2H5-O-CO-NH-CHR-COCl + H2N-CHR'-COONa C2H5-O-CO-NH-CHR-CO-NH-CHR'-COONa + NaCl 2. C2H5-O-CO-NH-CHR-COCl + 2 H2N-CHR'-COOC2H5 C2H5-O-CO-NH-CHR-CO-NH-CHR'-COOC2H5 + Cl-•NH3+-CHRCOOC2H5 Igen reaktív racemizáció (oxazolon), diketopiperazin. F leg addig alkalmazták, amíg csak az azidos kapcsolás volt a versenytárs. Újabban Carpino Fmoc-AA-Cl(F) alkalmazását javasolja (SPPS). El állítás: Acil-Aaa-OH + PCl5, POCl3, SOCl2 (magas h mérséklet) Problémák: foszfor-szennyezés a peptidekben SOCl2 + alkoxikarbonil-Aaa
Φ-CH2-O-CO-NH-CHR-COCl
Φ-CH2-Cl +
R CH
HN O
O
O
Leuchs-anhidrid Tos és Pht védelem esetén ez nem történik.
52
C. VEGYES ANHIDRIDES KAPCSOLÁS R R'
O O
+ H2N-Q
R-CO-NH-Q + R'-COOH
O
R'= C2H5-O-; (CH3)2=CH-CH2-O-; (CH3)3CR-O-COCl + X-NH-CHR'-COOH klórhangyasav észter klórszénsav észter
+1
δ
X-NH-CHR'
O O
(CH3)2=CH-CH2-O +2 δ
NH2-Q
O
- d31>> d+2 - gyors jó termelés, egyszer feldolgozás - racemizáció (TEA>>NMM>>N-metil-piperidin) Vegyes anhidrid képzés: THF, dioxán oldat, -15°C, 2-4 15 perc, izolálás nélkül használni. H mérséklet!!! 0°C-on diszproporció történik R-CO-O-CO-OC2H5 R-CO-O-CO-R + C2H5-CO-O-CO-OC2H5 NH2-Q
NH2-Q
R-CO-NH-Q + RCOOH C2H5-CO-NH-Q + CO2 + EtOH láncletörés, hiányos szekvenciák alakulhatnak ki ennek következtében. Kapcsolás: -15°C -5°C-ra melegítés közben kb. fél óra, majd RT CO2 eltávolítására (NMM•HCl kiválik) Feldolgozás: egyszer extrakcióval
Aminosavak hatása a vegyes anhidrides kapcsolásra: 1. X-Arg(Y)-OH laktámgy r kialakulás, X-Arg(Y)2-OH!! 2. Asn imid 3. X-Aaa1 + Pro-Aaa3... fordított acilezés 4. Boc-His-OH + 2 ekv. savklorid egy az imidazol védelmére 5. Val, Ile, Thr (nagy oldallánc, β-elágazás) fordított acilezés
53
Más típusú vegyes anhidridek: 1. Difenil-foszfinsav számos egyéb foszforsavszármazékkal készítettek O vegyes anhidridet. Kén- és arzénsavszármazékok Z-NH-CHR kuriózumok. O O P
O
O
REMA (repetitive excess mixed anhydride) módszer. 1-2 AA/nap 1,5 mol savkomponens; 1,5 mol NMM; 1,4 mol izobutil-oxi-karbonil-klorid -15°C, 1 perc 1 mol aminokomponens (THF v. DMF); -15°C, 2 óra KHCO3, peptid kicsapódik 2. EEDQ (1-etoxi-karbonil-2-etoxi-1,2-dihidrokinolin) + Z-NH-CHR-COOH N
ClCOOEt TEA EtOH
N
OC2H5
C2H5O
O OC2H5
O O
CHR-NH-Z
(nem kell savmegköt ágens nincs racemizáció)
O
+ N
Z-NH-CHR C2H5-O
O O
izobutanol származék is használatos
O
54
