III.
METODE PENELITIAN
A. Waktu dan Tempat Penelitian Penelitian ini dilaksanakan pada bulan Desember 2014 – Mei 2015 di UPT Laboratorium Terpadu dan Sentra Inovasi Teknologi Universitas Lampung, analisis FTIR dilaksanakan di UGM Yogyakarta, dan analisis LC/MS dilaksanakan di LIPI Serpong.
B. Alat dan bahan 1.
Alat
Alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah culture flash, gelas kimia, labu ukur, gelas ukur, pipet ukur, erlenmeyer, corong kaca, tabung reaksi, rak tabung reaksi, spatula, akuarium, lampu, selang, pompa aerator, lampu UV, kain saring 400 mesh, pinset, sentrifuse, kaca preparat, mikroskop (Axioo 10 Carl-Zeiss), oven, neraca analitik, botol sampel, desikator, lemari pendingin, lampu UV (kohler/SN402006), Prominence),
chamber,
MPLC
pinset,
(Medium
kolom, Pressure
HPLC
(Shimadzu/LC-20A
Liquid
Chromatography)
(Buchi/Sepacoterm), microplate reader (Hospitex Diagnostics), spektrofotometer UV-Vis (Varian/Cary 50 Probe), spektrofotometer FTIR (Shimadzu Prestige-21), spektrofotometer LC/MS Mariner.
30
2.
Bahan
Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah Spirulina sp. dari BBPBL Lampung, akuades, alkohol 70%, air laut, limbah POME, kertas saring, indikator pH universal, natrium karbonat, natrium hidroksida, asam klorida, asam sulfat, glukosa, natrium dihidrogen fosfat.monohidrat, dinatrium hidrogen fosfat tujuh hidrat, ammonium sulfat, tembaga sulfat lima hidrat, natrium klorida, media Conway/Walne, pupuk (Urea, ZA, TSP), Amberlite XAD 16 (Sigma), Cosmosil 75C18 - OPN, silika, plat KLT C18, plat KLT silika, alumunium foil, plastik wrap, kapas, kasa, pereaksi ninhidrin, pereaksi dragendorf, pereaksi serium sulfat, isopropanol, etanol, diklorometana, metanol, asam askorbat dan DPPH.
C. Metode Penelitian 1.
Kultivasi Spirulina sp.
Spirulina sp. dikultivasi pada media POME 5%. Pembuatan media kultivasi diawali dengan mengatur derajat keasaman dari nilai pH 4 menjadi nilai pH 8 – 10 yang sesuai untuk pertumbuhan Spirulina sp., dengan cara menambahkan 4 gram Na2CO3 ke dalam 1 Liter POME. Kemudian membuat media pupuk (0,03 gram ZA, 0,03 gram Urea, 0,01 gram TSP untuk 1 Liter air laut, Anindiastuti et al., 2007) yang di dalamnya mengandung POME. Untuk kultivasi awal dilakukan adaptasi pada media POME 5%, 10% dan 15% dengan skala 250 mL. Setelah itu, bibit Spirulina sp. dikultivasi yang dilengkapi dengan sistem aerasi udara, sistem pencahayaan dengan sinar matahari dan berlangsung selama 10 – 14 hari, serta dilakukan pengamatan secara mikroskopik.
31
Kultivasi Spirulina sp. dilakukan menggunakan akuarium skala 80 L menggunakan media POME 5% yang dilengkapi dengan sistem aerasi udara, sistem pencahayaan dengan sinar matahari dan berlangsung selama 10 – 14 hari.
2.
Pemanenan Spirulina sp.
Spirulina sp. yang telah dikultivasi selama 2 minggu dilakukan pemanenan menggunakan kain saring berukuran 400 mesh (Vonshak, 2002). Biomassa dan filtrat Spirulina sp. ditampung di wadah terpisah.
3.
Isolasi Senyawa Peptida
Sebanyak 50 gram biomassa Spirulina sp. ditambah dengan 100 mL air, kemudian diultrasonifikasi selama 30 menit. Setelah itu, disentrifugasi dengan kecepatan 12000 rpm selama 10 menit pada suhu 4 oC, kemudian dilakukan pemisahan antara filtrat dan padatan. Selanjutnya padatan diekstraksi menggunakan pelarut metanol : air (7 : 3), kemudian diultrasonifikasi selama 30 menit. Setelah itu, disentrifugasi dengan kecepatan 12000 rpm selama 10 menit pada suhu 4 oC, kemudian dilakukan pemisahan antara filtrat dan padatan. Filtrat yang didapat, dikeringkan menggunakan rotary evaporator.
Sebanyak 5 L filtrat Spirulina sp. dilakukan isolasi metode kromatografi kolom secara ionik berdasarkan pertukaran ion menggunakan resin XAD 16 (Visscher et al., 2008), kemudian dielusi dengan etanol 30%, isopropanol 20%, isopropanol 40% dan isopropanol 70% pH 2. Fraksi isopropanol 70% pH 2 adalah fraksi yang positif, fraksi tersebut dikeringkan menggunakan rotary evaporator. Ekstrak yang
32
didapat diidentifikasi menggunakan kromatografi lapis tipis dengan C18 sebagai fase diam dan metanol : air + TFA 0,1% (8 : 1) sebagai fase gerak, kemudian dilakukan pemisahan menggunakan kromatografi kolom sesuai dengan kondisi tersebut. Fraksi yang positif mengandung senyawa peptida diidentifikasi menggunakan MPLC, menggunakan kolom C18 dielusi secara gradien dengan eluen MeOH : H2O.
4.
Uji Antioksidan
Uji aktivitas antioksidan juga dilakukan secara kuantitatif menggunakan microplate reader (Anggraini, 2012). Ekstrak kasar (± 2 mg) dilarutkan dalam metanol sehingga diperoleh kadar 2000 ppm. Sampel dimasukkan ke dalam plate 96-well sebanyak 100 l dan ditambah dengan 100 l larutan DPPH 0,2 mM dalam metanol. Blanko yang digunakan adalah metanol. Sampel dan blanko yang sudah ditambahkan larutan DPPH diinkubasi di ruang gelap pada suhu kamar selama 30 menit lalu diukur pada panjang gelombang 492 nm menggunakan microplate reader. Reaksi positif akan memberikan perubahan warna DPPH dari ungu menjadi kuning. Persentasi peredaman radikal DPPH oleh senyawa antioksidan dihitung berdasarkan persamaan :
Dimana Ablank merupakan absorbansi balnko dan Atest merupakan absorbansi ekstrak sampel.
33
5.
Identifikasi Menggunakan Spektrofotometer UV – Vis
Sampel senyawa peptida yang telah dimurnikan dilakukan analisis menggunakan spektrofotometer UV – Vis dengan pelarut metanol pada panjang gelombang 200 – 400 nm.
6.
Identifikasi Menggunakan Spektrofotometer FTIR
Sampel senyawa peptida yang telah dimurnikan kemudian di pres pada pelet KBr dengan perbandingan sampel dan KBr 1 : 100. Background yang digunakan adalah pelet KBr murni. Spektrum direkam pada mode transmitan pada bilangan gelombang 4000–400 cm-1.
7.
Identifikasi
Menggunakan
Spektrofotometer
LC/MS
(Liquid
Chromatography/Mass Spectroscopy) Sampel senyawa peptida yang telah dimurnikan kemudian dilakukan analisis LC/MS Mariner dengan metode flow rate 0,05 mL/min, volume injeksi 2 L, eluen metanol.
