Maturatie van mineralisatie van polyester nanofibers voor botregeneratie

Maturatie van mineralisatie van polyester nanofibers voor botregeneratie D’Oosterlinck Willem

Verhandeling ingediend tot het verkrijgen van de graad van Master in de Biomedische Wetenschappen

Promotor: Prof. Dr. R.M.H. Verbeeck Vakgroep: Medische Basiswetenschappen

Academiejaar 2011-2012

Maturatie van mineralisatie van polyester nanofibers voor botregeneratie D’Oosterlinck Willem

Verhandeling ingediend tot het verkrijgen van de graad van Master in de Biomedische Wetenschappen

Promotor: Prof. Dr. R.M.H. Verbeeck Vakgroep: Medische Basiswetenschappen

Academiejaar 2011-2012

“De auteur en de promotor geven de toelating deze masterproef voor consultatie beschikbaar te stellen en delen ervan te kopiëren voor persoonlijk gebruik. Elk ander gebruik valt onder de beperkingen van het auteursrecht, in het bijzonder met betrekking tot de verplichting uitdrukkelijk de bron te vermelden bij het aanhalen van resultaten uit deze masterproef.”

Datum

(handtekening student)

(Naam student)

(handtekening promotor)

(Naam promotor)

Voorwoord

Toen ik na de bachelorjaren een lange lijst met mogelijke thesisonderwerpen kreeg, was ik ervan overtuigd dat mijn interesse zou uitgaan naar een onderwerp dat te maken had met genetica. Mijn oog viel echter onmiddellijk op de onderwerpen van het labo Biomaterialen. De combinatie van kennis van biologie en materiaalkunde om lichaamsvreemde materialen in het lichaam te integreren en er een gewenste functie te laten uitvoeren boeide me zeer. Het gaf me dan ook een enorme voldoening om bij te leren over deze tak van de medische wetenschappen en theorie naar praktijk te kunnen omzetten onder de vorm van deze masterproef.

Graag wil ik mijn promotor Prof. Dr. R.M.H. Verbeeck bedanken om me de mogelijkheid te bieden om in het labo Biomaterialen deze masterproef tot een goed einde te brengen. Niet enkel als promotor, maar ook als docent is zijn grote inzet voor de biomedische student duidelijk.

Mijn dank gaat ook uit naar mijn begeleidster Natasja Van den Vreken. Zij was er altijd om me te helpen en ik kon me geen betere begeleiding wensen. Ook bedank ik haar voor het begrip dat ze toonde wanneer ik het druk had met mijn extracurriculaire activiteiten bij het Faculteiten Konvent.

Mijn ouders wens ik hierbij te bedanken om me de kans te geven deze studie aan te vangen. Ook voor de vrijheid die ze me de voorbije jaren gaven om mijn eigen keuzes te maken ben ik hen dankbaar.

Als laatste, maar zéker niet minst belangrijk, wens ik mijn vrienden en mijn broer Hendrik te bedanken. Door hen is mijn studententijd een onvergetelijke periode geweest waar we in de toekomst nog veel zullen aan terugdenken.

Willem

Inhoudsopgave Samenvatting .................................................................................................................................... 1 1 Inleiding ......................................................................................................................................... 2 1.1 Botweefsel ............................................................................................................................... 2 1.2 Botherstel ................................................................................................................................. 4 1.3 Een polyester draagstructuur voor botweefselengineering ......................................................... 6 1.3.1 Electrospinning ................................................................................................................ 6 1.3.2 Eigenschappen van de polyester nanofibers ...................................................................... 8 1.3.3 Calciumfosfaat coating ................................................................................................... 10 1.4 Eerder onderzoek ................................................................................................................... 10 2 Materialen en methoden .............................................................................................................. 12 2.1 PCL nanofibers ...................................................................................................................... 12 2.2 Primaire coating van de nanofibers ......................................................................................... 12 2.3 Preliminaire testen.................................................................................................................. 13 2.4 Experimentele opzet ............................................................................................................... 14 2.5 Optimalisatie van aangroei en vorming van apatiet met inbouw van carbonaat ........................ 15 2.6 Celstudie ................................................................................................................................ 16 2.7 Statistische analyse................................................................................................................. 18 3 Resultaten ..................................................................................................................................... 19 3.1 Zuivere en calcium en fosfaat voorbehandelde PCL nanofibers............................................... 19 3.2 Preliminaire testen.................................................................................................................. 20 3.3 Optimalisatie van maturatie van polyester nanofibers met NaHCO3 als carbonaatbron ............ 20 3.3.1 CP bedekking van de nanofiber stalen............................................................................. 22 3.3.2 Microstructuur van de nanofiber stalen ........................................................................... 23 3.3.3 Identificatie van het gevormde CP .................................................................................. 25 3.4 Optimalisatie van maturatie van polyester nanofibers met Na2CO3 als carbonaatbron.............. 26 3.4.1 CP bedekking van de nanofiber stalen............................................................................. 29 3.4.2 Microstructuur van de nanofiber stalen ........................................................................... 31

3.4.3 Identificatie van het gevormde CP .................................................................................. 31 3.5 Carbonaat inbouw in ACP afgezet op stalen van experiment S10 ............................................ 33 3.5.1 CP bedekking van de nanofiber stalen............................................................................. 35 3.5.2 Microstructuur van de nanofiber stalen ........................................................................... 35 3.5.3 Identificatie van het gevormde CP .................................................................................. 36 3.6 Bepaling van het carbonaatgehalte in CP afgezet op PCL nanofibers ...................................... 37 3.7 Celstudie ................................................................................................................................ 38 3.7.1 Calceïne AM/PI kleuring ................................................................................................ 38 3.7.2 PrestoBlue™ celviabiliteitsassay ................................................................................... 41 4 Discussie ....................................................................................................................................... 42 4.1 Preliminaire testen.................................................................................................................. 43 4.2 Optimalisatie van maturatie .................................................................................................... 43 4.3 Celstudie ................................................................................................................................ 47 4.4 Conclusie ............................................................................................................................... 48 Referentielijst .................................................................................................................................. 49

Samenvatting Botdefecten kunnen een belangrijk probleem vormen voor de werking en langdurige instandhouding

van

het

skeletaal

systeem.

Een

bioactief

en

osteoconductief

botsubstitutiemateriaal dat een geconnecteerde poriënstructuur vertoont en bovendien biodegradeerbaar is kan het lichaam helpen botweefsel te regenereren. Poly(ε-caprolacton) (PCL) is een polymeer dat goedgekeurd is door de FDA en reeds gebruikt wordt voor onder andere langdurige afgifte van medicatie in het lichaam en het vervaardigen van resorbeerbare hechtingsdraden. Een draagstructuur van nanofibers met geconnecteerde poriënstructuur voor cellen werd vervaardigd uit PCL door middel van electrospinning. Verschillende studies hebben aangetoond dat een laagje carbonaatbevattend hydroxyapatiet (HAp), een calciumfosfaat dat een sterke gelijkenis vertoont met het apatiet dat botweefsel zijn sterkte geeft, op deze nanofiber draagstructuur de bioactiviteit verbetert. In deze studie werd een primair HAp laagje op de nanofibers geprecipiteerd door middel van alternerende behandelingen met oplossingen rijk aan calciumionen en oplossingen rijk aan fosfaationen. Om dit primair laagje verder te laten aangroeien (matureren) werden de draagstructuren behandeld met varianten van een Simulated Body Fluid (SBF) oplossing. In het bijzonder werd getracht om een optimale bedekking van nanofibers te bekomen zonder verlies van de geconnecteerde poriënstructuur en om hoge concentraties carbonaat in te bouwen in het kristalrooster. Naargelang de samenstelling van SBF oplossingen en de tijdsduur van de behandeling varieerde, werden verschillende soorten calciumfosfaat op de nanofibers afgezet. Naast HAp werden ook amorf calciumfosfaat (ACP) en dicalcium fosfaat dihydraat (DCPD) gevormd, die alle als precursoren voor het botapatiet kunnen optreden. Bij enkele experimenten werden aanzienlijke hoeveelheden (tot 4gew%) carbonaat in het apatietrooster ingebouwd. MC3T3-E1 cellen werden uitgezaaid op PCL nanofiber draagstructuren die bedekt waren met verschillende types calciumfosfaat en celviabiliteit werd op verschillende tijdsstippen geëvalueerd. Een significante toename van celviabiliteit werd waargenomen voor stalen die bedekt waren met calciumfosfaat ten opzichte van stalen van zuiver PCL. Sommige stalen die bedekt waren met gematureerd calciumfosfaat vertoonden na 7 dagen een hogere celviabiliteit dan stalen die bedekt waren met een primair laagje HAp. Maturatie van mineralisatie van een draagstructuur vervaardigd uit PCL nanofibers kan bijgevolg de bioactiviteit verbeteren.

1

1 Inleiding

1.1 Botweefsel

Botweefsel is het belangrijkste structurele en ondersteunende bindweefsel van het menselijk lichaam; het geeft vorm en sterkte aan het skelet, maakt beweging mogelijk door aanhechting van spieren en pezen, beschermt de vitale organen, dient als opslagplaats voor mineralen zoals calcium, magnesium, fosfaat, kalium en ijzer en in het beenmerg vindt de hematopoiese plaats (1). Ongeacht de grootte en vorm bestaat elk bot uit zowel compact als spongieus bot. Compact bot vormt de buitenste laag van alle beenderen en het grootste deel van de structuur van de lange beenderen zoals de femur. Compact bot is glad, dens en vangt het grootste deel van de mechanische spanning op. De kleinste structurele eenheid van compact bot is het osteon, of het Havers systeem (figuur 1) (1). Centraal in het osteon loopt een Havers kanaal dat bloedvaten en zenuwen bevat, nodig voor aanvoer en afvoer van respectievelijk nutriënten en afvalstoffen, alsook bezenuwing van het weefsel. De Haverse kanalen worden onderling verbonden door de kanalen van Volkmann zodat een netwerk van bloedvaten wordt verkregen. Rond het Havers kanaal bevinden zich concentrische lamellen bestaande uit de sterke gemineraliseerde collageenmatrix. Tussen de lamellen zijn talrijke lacunes aanwezig waarin de osteocyten zich bevinden. Deze lacunes worden onderling verbonden door talrijke kleine kanaaltjes (canaliculi) zodat een netwerk voor aan- en afvoer van nutriënten en afvalstoffen wordt gevormd (1).

Figuur 1 Opbouw van botweefsel

(2)

.

2

Spongieus bot bestaat uit een onregelmatig netwerk van trabekels. Dit zijn kleine stukjes botweefsel waarin osteocyten, lamellen van gemineraliseerde collageenmatrix, lacunes en canaliculi worden teruggevonden. De grote holtes van het spongieus bot worden opgevuld met rood beenmerg dat instaat voor de hematopoiese (1). Chemisch gezien is het botweefsel een gemineraliseerd weefsel bestaande uit een organische en een anorganische fase. Botcellen zoals osteoblasten, osteoclasten en osteocyten en talrijke extracellulaire eiwitten zoals collageen type I, osteocalcine en proteoglycanen zijn de hoofdcomponenten van de organische fase. Deze fase maakt ongeveer 35% uit van de botmassa en zorgt voor de flexibiliteit van het bot. De overige 65% van de botmassa vormt de anorganische fase en bepaalt de mechanische sterkte van het bot

(1)

. De anorganische fase

bestaat uit apatiet met een hexagonaal kristalrooster dat sterk lijkt op stoichiometrisch hydroxyapatiet (HAp; Ca5(PO4)3OH). Het kristalrooster van apatiet laat gemakkelijk substituties door vreemde ionen toe. Deze substituties hebben invloed op onder andere de oplosbaarheid, hardheid, broosheid en thermische stabiliteit van het kristal door verandering van de roosterenergie. Belangrijke substituties zijn deze waarbij OH - wordt vervangen door Cl- of F- met vorming van respectievelijk chloorapatiet en fluoroapatiet. Fluor inbouw in het apatietrooster in het glazuur van tanden gebeurt deels artificieel door

het gebruik van

tandpasta of mondwater met een hoge concentratie aan F - ionen. Deze F- ionen maken het apatiet minder oplosbaar en dus resistenter tegen het zure milieu in de mond na elke maaltijd (3)

. Een veel voorkomende substitutie in het apatietrooster van bot is deze waarbij ofwel OH --

ionen (A-type substitutie), ofwel PO43--ionen (B-type substitutie) worden vervangen door CO32--ionen. In het apatietrooster kan PO43- ook gedeeltelijk vervangen worden door HPO42-. Het tekort aan negatieve lading dat ontstaat door de vervanging van PO43- door HPO42- kan gecompenseerd worden door OH- en een positieve lading, zoals Ca2+, uit het kristalrooster te verwijderen. Hierdoor wordt een HPO42--bevattend apatiet bekomen dat gekend is als een calcium-deficiënt HAp. Ook Ca2+-ionen kunnen vervangen worden door metaalkationen zoals Mg2+, Zn2+, Fe2+ en Na+ die talrijk aanwezig zijn in bloed en lichaamsvloeistoffen. Het apatiet in bot is dus geen zuiver HAp maar een carbonaatbevattend calcium-deficiënt HAp met tal van andere onzuiverheden. Door al deze substituenten is het bot apatiet meer oplosbaar zodat een continue hermodellering van het botweefsel mogelijk is

(3,4)

. De combinatie van

organische vezels met een keramisch materiaal laat botweefsel dus toe om duurzaam, sterk en flexibel te zijn. Botweefsel lijkt vrij levenloos vergeleken met andere organen. Het is echter een dynamisch en actief weefsel met een constante turnover van cellen en botmatrix en een 3

constant veranderende mico-architectuur (osteonen en trabekels) (1). Het spongieus bot in het skelet wordt elke 3,5 jaar vervangen en het compact bot elke 10 jaar. Resorptie van botweefsel wordt uitgevoerd door osteoclasten. Deze zijn verwant aan macrofagen en ontstaan in het beenmerg uit hematopoietische stamcellen. Osteoclasten kruipen als het ware over het botoppervlak, vormen een hechte binding met het botweefsel en lossen de anorganische fase op door secretie van HCl. De organische fase wordt vernietigd door secretie van lysosomale enzymen en de osteoclasten nemen collageen en dode osteocyten op door fagocytose. Osteoblasten zijn verantwoordelijk voor nieuwe botvorming. Deze onstaan uit mesenchymale stamcellen in het periost (een membraan die het botweefsel omringt en contact maakt met omliggend bindweefsel), het endost (een membraan die het binnenoppervlak van het bot aflijnt) en het bindweefsel van het beenmerg en verplaatsen zich vervolgens naar het botoppervlak. Osteoblasten secreteren de organische componenten van de extracellulaire matrix (ECM) waarin na een week apatietkristallen groeien. Wanneer de osteoblasten volledig omgeven zijn door ECM matureren ze tot osteocyten. Deze vertonen minder synthetische activiteit dan osteoblasten maar spelen een belangrijke rol in de continue turnover van bot (1). Continue hermodellering van het botweefsel helpt de concentraties van calcium en fosfaat in het lichaam constant te houden. Wanneer de plasmaconcentratie van calcium te laag wordt secreteert de bijschildklier het bijschildklierhormoon. Dit hormoon stimuleert osteoclasten tot botresorptie zodat de plasmaconcentratie van calcium stijgt. Een voordeel van continue hermodellering van botweefsel is de mogelijkheid van het bot om zich aan te passen aan mechanische spanning. Zo zullen nieuw gevormde osteonen en trabekels beter gealigneerd zijn met nieuw ervaren trek- en drukkrachten. Het bot wordt dikker als respons op spanning terwijl bij afwezigheid van mechanische spanning het bot atrofie vertoont (1).

1.2 Botherstel

Botdefecten kunnen een belangrijk probleem vormen voor de werking en langdurige instandhouding van het skeletaal systeem. De meeste defecten worden veroorzaakt door een acuut trauma als gevolg van externe factoren zoals bij een ongeval of sportblessures. Dergelijke defecten zijn meestal eenvoudig te behandelen als het een eenvoudige breuk betreft waarbij het omliggende weefsel onbeschadigd blijft. Het bot wordt opnieuw correct uitgelijnd en gestabiliseerd door gebruik van een gips of verband. Complexe fracturen zoals een open breuk en pathologische fracturen als gevolg van misvorming, osteoporose en bottumoren worden momenteel vooral behandeld door gebruik te maken van metallische 4

botschroeven, -platen en -pinnen. Het bot wordt met behulp van deze materialen correct uitgelijnd

en

gestabiliseerd

zodat

het

botweefsel

spontaan

kan

herstellen

(1)

.

Het herstelproces kan worden opgedeeld in vier fasen (figuur 2) (1).

1. Hematoomvorming: door de fractuur zullen bloedvaten in het periost en in het bot scheuren. Het bloed komt terecht in het bot en het omliggende weefsel, zal coaguleren en een hematoom vormen. Inflammatie treedt op in en rond het hematoom. 2. Vorming van een fibrocartilagineuze callus: na een paar dagen volgt ingroei van nieuwe bloedvaten in de bloedklonter. Prolifererende osteoblasten in het botweefsel invaderen de bloedklonter vanuit de breukgrens en maken een herstelweefsel aan: de zachte callus. Naarmate het collageengehalte in de callus stijgt, zal deze verharden met vorming van de fibrocartilagineuze callus. 3. Vorming van een botcallus: na een week zorgen de osteoblasten en osteoclasten voor de vorming van nieuwe trabekels in de callus die beide breukvlakken opnieuw verenigen. 4. Hermodellering: na verloop van enkele maanden wordt het teveel aan nieuw gevormd bot geresorbeerd en compact bot wordt gevormd aan de buitenwand van het bot.

Figuur 2 De verschillende fasen van botherstel (1).

Wanneer het botdefect een kritische grootte overschrijdt zal geen spontaan herstel meer optreden

(5)

. In de meest complexe gevallen (zoals een verbrijzeling) kan het defecte bot

volledig vervangen worden door een prothese vervaardigd uit metaal, een keramisch materiaal, kunststof of combinaties van deze materialen. Een bekend voorbeeld hiervan is de heupprothese. Deze technieken vertonen belangrijke nadelen zoals stijfheid van het materiaal, 5

infecties, chronische pijn en “stress shielding”. Bij dit laatste neemt de botdensiteit rond het botdefect af omdat het implantaat de meeste mechanische stress opvangt. In de meeste gevallen waar het grootste deel van het bot nog intact is, worden bottransplantaten verkozen. Het belangrijkste probleem hierbij is immuunafstoting bij allogene transplantaten en donor site morbiditeit bij autologe transplantaten (5).

1.3 Een polyester draagstructuur voor botweefselengineering

Botweefselengineering kan een oplossing bieden om problemen die gepaard gaan met de hierboven vermelde behandelingen te vermijden. Een synthetisch botsubstitutiemateriaal moet bij voorkeur bioactief en osteoconductief zijn en een geconnecteerde porositeit vertonen vergelijkbaar met de ECM van bot. Zo kan een biomimetische draagstructuur ontwikkeld worden die de verankering aan het eigen botweefsel en de ingroei van eigen botcellen bevordert. Ook de sterkte van het materiaal moet aangepast kunnen worden aan de sterkte van het omliggend botweefsel zodat “stress shielding” wordt vermeden. Na verloop van tijd moet het implantaat bioresorptie ondergaan zodat het defect door eigen botweefsel kan opgevuld worden

(6)

. De snelheid van degradatie dient hierbij vergelijkbaar te zijn met deze van

botregeneratie. In dit opzicht bieden polyesters zoals poly(glycolide), poly(lactide), poly(ε-caprolacton) (figuur 4) en hun copolymeren interessante mogelijkheden. De polyesters zijn biocompatibel, bioresorbeerbaar, goedgekeurd door de FDA en worden reeds gebruikt voor onder andere afgifte van medicatie in het lichaam

(7)

, botfixatie systemen

(8)

, tissue engineering van de

(9)

zachte weefsels en als resorbeerbare hechtingsdraden . Door middel van electrospinning kan met deze polyesters een polymere 3D structuur gesynthetiseerd worden vergelijkbaar met de extracellulaire botmatrix.

1.3.1 Electrospinning

Het electrospinningsproces wordt weergegeven in figuur 3. Het polymeer wordt eerst opgelost in een bepaald solvent. De polymeeroplossing wordt vervolgens door middel van een pomp met een constant debiet door een metallische naald naar buiten gepompt. Een spanningsgenerator zorgt voor een potentiaalverschil (1 tot 30 kV) tussen de metallische naald en de geaarde collector. De zich vormende druppel zal sterk geladen worden (figuur 3) en deze ladingen zullen zich over het hele oppervlak van de druppel verdelen. Als gevolg hiervan 6

zullen twee elektrostatische krachten op de druppel inwerken: de elektrostatische repulsie tussen de oppervlakteladingen en de Coulombse kracht richting de collector als gevolg van

Figuur 3 Schematische weergave van het electrospinningsproces (11).

het elektrisch veld. Door inwerking van deze krachten zal de druppel een konische vorm krijgen: de Taylor kegel. Wanneer de sterkte van het elektrisch veld een bepaalde waarde overschrijdt

kunnen

de

elektrostatische

krachten

belangrijker

worden

dan

de

oppervlaktespanning die de druppel samenhoudt. Een fijne geladen stroom polymeeroplossing van enkele honderden µm in diameter zal de druppel verlaten richting de collector. Door het zeer chaotische verloop van de stroom zal de polymeeroplossing constant trekkrachten ondergaan waardoor deze wordt uitgerekt. Gecombineerd met verdamping van het solvent zal dit resulteren in collectie van vezels waarvan de diameter kan variëren van enkele tientallen nm tot enkele µm (10). De morfologie en diameter van de fibers wordt beïnvloed door a) de intrinsieke eigenschappen van de oplossing zoals het type polymeer, de conformatie van de keten, moleculaire massa, viscositeit/concentratie, elasticiteit, elektrische geleidbaarheid en polariteit en oppervlaktespanning van het gebruikte solvent; en b) opstellingsgebonden parameters zoals de sterkte van het elektrisch veld, de afstand tussen naald en collector, het debiet van de oplossing doorheen de naald, luchtvochtigheid en temperatuur (10).

7

1.3.2 Eigenschappen van de polyester nanofibers

Een groot voordeel van de polyester nanofibermatten is dat hun degradatiesnelheid, poriëngrootte en mechanische sterkte kunnen aangepast worden door variatie van de morfologie en diameter van de fiber, de moleculaire massa van het polymeer, het gebruik van verschillende types monomeren of het gebruik van combinaties van verschillende monomeren (copolymeren)

(12)

. Het fijn afstellen van deze parameters maakt de synthese van een

draagstructuur voor nagenoeg elke situatie mogelijk.

Dong et al.

(12)

onderzochten de degradatiesnelheid van nanofibers van polyesters zoals

poly(glycolide), poly(lactide) en poly(ε-caprolacton) (figuur 4) waarbij enkele belangrijke verschillen werden gevonden:

Poly(glycolide) (PGA) is het meest eenvoudige alifatische polyester. Het is kristallijn, hydrofieler dan de meeste polyesters, zeer sterk met een trekweerstand van ongeveer 2,5MPa en heeft een smeltpunt tussen 225 en 230°C (13). Een in vitro studie waarbij gladde spiercellen van een varken werden uitgezaaid op PGA nanofiber matten toonde aan dat de matten proliferatie van de spiercellen ondersteunden na één week incubatie. Bij langere incubatie degradeerde het materiaal echter snel

(12)

. Omwille van deze snelle degradatie wordt dit

polymeer zelden gebruikt als nanofiber matten voor weefselengineering. Poly(lactide) (PLA) degradeert trager en is hydrofober dan PGA

(14)

met een

trekweerstand van minder dan 2MPa. Aangezien deze molecule chiraal is, bestaan twee stereoisomeren: L-LA en D-LA. Als gevolg hiervan kunnen poly(L-lactide), poly(D-lactide) en poly(D,L-lactide) gevormd worden. De eigenschappen van het polyester zullen hierbij variëren: poly(L-lactide) en poly(D-lactide) zijn bijvoorbeeld semikristallijne polymeren met een smeltpunt tussen 173°C en 178°C. Poly(D,L-lactide) is een semikristallijn tot amorf polymeer waarvan de kristalliniteit en het smeltpunt afhankelijk zijn van de exacte verhouding tussen L-LA en D-LA

(15)

. Nanofibreuze PLA scaffolds werden reeds gebruikt

voor onder andere zenuwweefsel- (16), bot- (5), vasculair- (17) en stamcelweefselengineering (18). Poly(ε-caprolacton) (PCL) is een semikristallijn polyester dat trager degradeert en aanzienlijk hydrofober is dan de andere polyesters. De trekweerstand bedraagt ongeveer 1MPa (19) en het smeltpunt bevindt zich rond 60°C (20). De trage degradatiesnelheid en hoge permeabiliteit voor biologische componenten maken dit een aantrekkelijk polymeer voor gebruik in systemen voor langdurige afgifte van medicatie in het lichaam (20,7). Nanofibreuze 8

scaffolds

uit

PCL

werden

ook

reeds

gebruikt

bij

huid-

(21)

,

bot-

(22,23)

en

hartweefselengineering (24).

Poly(glycolide)

Poly(lactide)

Poly(ε-caprolacton)

Figuur 4 Structuurformules van polyesters.

De esterbindingen van deze polyesters zullen in een waterige omgeving spontaan hydrolyse ondergaan. Als gevolg hiervan worden polymeerfragmenten van verschillende lengten met terminale hydroxyl- en carboxylgroepen gevormd. De carboxylgroepen geven aanleiding tot zure autokatalyse: ze zullen hydrolyse van esterbindingen katalyseren, wat op zijn beurt aanleiding geeft tot vorming van nieuwe carboxylgroepen en steeds kleinere ketenfragmenten. GA en LA zullen na hydrolyse worden vrijgesteld uit respectievelijk PGA en PLA. GA (dat eerst wordt omgezet tot pyruvaat) en LA worden via de Krebs cyclus omgezet tot CO 2 en H2O en verlaten het lichaam via de longen (12). Hollinger (25) stelde echter een ander mechanisme van metabolisatie van GA voor: GA zou worden omgezet tot glyoxylaat door het glycolaat oxidase. Dit wordt hierna omgezet tot glycine door glycine transaminase. Het gevormde glycine kan hierna gebruikt worden bij de eiwitsynthese. PCL ondergaat hydrolyse tot laagmoleculair-gewicht PCL en wordt finaal uitgescheiden via de urine en stoelgang. Met uitzondering van PGA ondersteunen scaffolds van zuivere polyester nanofibers celadhesie en -proliferatie echter in beperkte mate. Dit gebrek aan bio-activiteit is het resultaat van hoge hydrofobiciteit en weinig adhesieplaatsen voor eiwitten. Verschillende studies hebben bovendien aangetoond dat de zure degradatieproducten inflammatoire reacties kunnen uitlokken in de omliggende weefsels (26). Deze reacties zijn meestal te wijten aan een lokale verzuring van het weefsel door onvoldoende metabolisatie en verwijdering van de zure afbraakproducten via de bloedbaan.

9

1.3.3 Calciumfosfaat coating

Verschillende studies hebben aangetoond dat een laagje hydroxyapatiet (HAp) op deze nanofiber draagstructuur voor botcellen de bio-activiteit verbetert

(23,27)

. Dit door de sterke

structurele gelijkenis van HAp met biologisch apatiet. Daarbij zal het gedeeltelijk oplossen van het weinig oplosbare apatiet de pH daling als gevolg van polymeerdegradatie deels neutraliseren

(28,29)

. Calciumionen uit het apatiet zullen reageren met de terminale

carboxylgroepen die gevormd worden bij degradatie van het polymeer met vorming van calcium carboxylaatgroepen. In de literatuur worden verschillende methoden beschreven om een goede mineralisatie van het oppervlak van de polyester nanofibers te bekomen

(27,30,22)

. De behandeling is

afhankelijk van het gebruikte (co)polymeer en bestaat meestal uit drie opeenvolgende stappen. Vooreerst dienen de nanofibers behandeld te worden met een NaOH-oplossing. Deze voorbehandeling of activering zorgt voor het ontstaan van reactieve carboxylaatgroepen op de polyesterfibers. Vervolgens wordt de scaffold alternerend ondergedompeld in een oplossing met Ca2+-ionen en een oplossing met PO43--ionen: de Ca2+-ionen binden aan de carboxylaatgroepen en de PO43--ionen binden aan de Ca2+-ionen. Door deze calcium en fosfaat voorbehandeling wordt een primair calciumfosfaat (CP)laagje gevormd. Als laatste volgt een maturatiestap waarbij de scaffold wordt behandeld met Simulated Body Fluid (SBF), ook rijk aan deze ionen. De calcium- en fosfaationen zullen uitkristalliseren op de fibers, met als resultaat een laagje hydroxyapatiet dat proliferatie en adhesie van osteoblasten zal bevorderen. Aldus zou een composiet bestaande uit degradeerbare polyester nanofibers gecoat met hydroxyapatiet (HAp), en dus vergelijkbaar met de natuurlijke apatiet-gecoatte collageenvezels, een goed botsubstitutiemateriaal kunnen zijn.

1.4 Eerder onderzoek

De afdeling Biomaterialen van de vakgroep Medische Basiswetenschappen (Universiteit Gent) heeft gedurende een dertigtal jaren een uitgebreide expertise opgebouwd op het gebied van de mineralisatie en demineralisatie van calciumfosfaten en harde weefsels. Hier worden experimenten uitgevoerd om de afzetting van apatiet op polyester nanofibers te optimaliseren. Uit de literatuur en de bevindingen van de onderzoeksgroep Biomaterialen is gebleken dat het HAp dat gevormd wordt kleine hoeveelheden carbonaat kan bevatten

(22)

. Aangezien

biologisch apatiet als onzuiverheid vooral carbonaat bevat kan aangenomen worden dat 10

incorporatie hiervan in het apatietlaagje de celproliferatie en aanhechting zal bevorderen

(4)

.

Pieters et al. (31) hebben inderdaad aangetoond dat apatiet met een carbonaatgehalte hoger dan 11% een drastische verhoging van de celadhesie en celproliferatie vertoont. Een hoog carbonaatgehalte resulteert in een meer oplosbaar apatiet met kleinere kristalkorrels, meer gelijkend op de biologische apatiet kristallen van groeiend botweefsel (30,4,31). Incorporatie van carbonaationen in het zich vormende apatiet laagje kan gebeuren tijdens de maturatiestap van de mineralisatiebehandeling. Yang et al. (22) toonden aan dat een laagje apatiet en dicalcium fosfaat dihydraat (DCPD) werd gevormd op PCL nanofiber matten na twee uur onderdompelen in tienmaal geconcentreerd SBF (10SBF). De samenstelling van dit laagje veranderde na zeven dagen immersie in gewoon SBF waarbij een calciumdeficiënt carbonaatbevattend apatiet werd gevormd, gelijkaardig aan biologisch apatiet. In een vergelijkbare studie van Mavis et al.

(32)

werd uitgegaan van een 10SBF oplossing waarbij

verschillende fosfaatconcentraties en verschillende bronnen van carbonaat gebruikt werden. Er volgde precipitatie van verschillende fasen van CP zoals het verwachtte calciumdeficiënt HAp, maar ook fasen zoals amorf calciumfosfaat (ACP), octacalciumfosfaat (OCP), DCPD en dicalciumfosfaat (DCP). Deze fasen zijn goed resorbeerbaar en worden tevens algemeen beschouwd als precursoren van de minerale fase van bot en glazuur structuur van de scaffold bleef behouden bij immersietijden tot 6h

(4,33,34,35)

(32)

. De poreuze

. Oliveira et al.

(36)

toonden aan dat het variëren van de concentratie van SBF en de tijdsduur van onderdompeling een invloed hebben op de inbouw van ionen uit de SBF en het type apatiet dat gevormd wordt. Hierbij werd gebruik gemaakt van zowel een compact als een poreus scaffold van zetmeel-gebaseerde degradeerbare polymeren. Door het verhogen van de SBF-concentratie tijdens de behandeling van eenzelfde scaffold ontstond een apatietlaagje met een andere morfologie bovenop het eerste afgezette CP laagje. Op de afdeling Biomaterialen werd de afzetting van een primair apatietlaagje op PCL nanofibers geoptimaliseerd. In dit onderzoek werd getracht de maturatie van dit apatietlaagje te optimaliseren. Hiervoor werd getracht om carbonaationen te incorporeren in het zich vormende apatiet door de ionaire concentraties in het SBF te variëren. Het effect van de constitutie van de oppervlaktelaag op de mate van adhesie en proliferentiatie van MC3T3-E1 cellen werd onderzocht om de optimale samenstelling van de oppervlaktelaag te bepalen.

11

2 Materialen en methoden Bij bereiding van alle oplossingen werd gebruik gemaakt van pro analyse reagentia en ultra zuiver water bekomen met een Milli-Q-Academic van Millipore.

2.1 PCL nanofibers

De PCL nanofibers in dit onderzoek werden vervaardigd in samenwerking met de vakgroep Textielkunde van de Universiteit Gent. De electrogesponnen PCL nanofiber matten hadden een continue porositeit en een willekeurige oriëntatie van de fibers. De morfologie van de nanofibers werd geëvalueerd met een laagvacuüm scanning elektronenmicroscoop (SEM) (FEI Quanta 200 FEG, Hillboro, OR, V.S.). Hiervoor werden de scaffolds bedekt met een goudfilm. SEM opnames werden gebruikt om de diameter van de vezels te meten met behulp van een digitale beeldanalyse (SigmaScan® Pro 5.0). De dikte van de matten werd gemeten met een elektronische micrometer (Mitutoyo 293-521-30, Nederland).

2.2 Primaire coating van de nanofibers De nanofiber matten werden 24h gewassen in Ringer’s oplossing (0,9gew% NaCl (UCB, 8605)) en vervolgens 1min gespoeld met gedemineraliseerd water. Hierna volgde activatie door de stalen 1,5min met ethanol (VWR, 20827.365, België) te behandelen en 30s te wassen met gedemineraliseerd water. Vervolgens werden de stalen in een container gebracht met 10ml NaOH oplossing (VWR 31627.368) per cm² staal en 40min in een ultrasoon bad (Transsonic T700/H, Elma Ultrasonic, Ruiselede, België) geplaatst. Na deze activatie werden de stalen 60s gewassen met gedemineraliseerd water.

Bij de calcium en fosfaat voorbehandeling werden oplossingen van 32,30mM CaCl2.2H2O (J.T. Baker, 0504, Nederland) en 35,98mM Na2 HPO4 (Merck, 1.06586, Duitsland) gebruikt en de behandeling ging als volgt: 70s in 20ml CaCl2.2H2O per cm²



30s in H2 O

45s in 20ml  Na2HPO4 per cm²



30s in H2O



Herhaal zevenmaal

Hierbij werden de oplossingen regelmatig geschud. 12

2.3 Preliminaire testen

SBF oplossingen met verschillende ionenconcentraties werden uitgeprobeerd om een idee te krijgen over de invloed van de samenstelling op de aangroei van het primair CP laagje op de PCL nanofibers. De samenstellingen van de SBF oplossingen worden weergegeven in tabel 1. De ionenconcentraties van de 1xSBF oplossing werden overgenomen van de SBF oplossing gebruikt door Kawashita et al

(37)

. De SBF oplossing werd gebufferd met een 0,1M

tris(hydroxymethyl)aminomethaan (TRIS)/HCl oplossing tot pH = 7,4. De 1xSBF oplossing werd ook bereid gebufferd met een 0,025M natriumtetraboraat (Borax)/HCl oplossing tot pH = 8,5 (1xSBFB). Voor de 5xSBF oplossing werden dezelfde ingrediënten gebruikt als bij de 1xSBF oplossing, maar alle ionenconcentraties werden vervijfvoudigd ten opzichte van de 1xSBF oplossing. Bij bereiding van de 5xSBF oplossing werd een CP neerslag gevormd die ook na buffering van de oplossing met TRIS/HCl tot pH = 7,4 niet kon opgelost worden. De ionenconcentraties en samenstelling van de 10xSBF oplossing werd overgenomen van de oplossing gebruikt door Yang et al. (22). Enkel de concentraties van CaCl2.2H2O en Na2HPO4 werden effectief vertienvoudigd ten opzichte van de 1xSBF oplossing. Deze oplossing werd niet gebufferd zodat de pH tot 4,13 kon gebracht worden om CP neerslag te vermijden.

Tabel 1 Samenstellingen van SBF oplossingen.

KCl

J.T. Baker, 0208

Conc. (mM) 1xSBF 1xSBFB 3 3

NaCl

UCB, 8605

136,8

136,8

684

1000

NaHCO3

Merck, 6329

4,2

4,2

21

25

MgCl2.6H2O

Merck, 5833

1,5

1,5

7,5

5

Na2SO4

Suprapur Merck, 6647

0,5

0,5

2,5

-

CaCl2.2H2O

J.T. Baker, 0504

2,5

2,5

12,5

25

TRIS/HCl

VWR, 103154M

50

-

250

-

Borax/HCl

Merck, 6308

-

12,5

-

-

K2HPO4

Merck, 5104

1

1

5

-

Na2HPO4

Merck, 1.06586

-

-

-

10

Reagens

5xSBF 15

10xSBF 5

13

De geactiveerde en voorbehandelde nanofiber matten met een oppervlakte van 1cm² werden ondergedompeld in 10ml SBF oplossing en continu geschud aan 60T/min gedurende een bepaalde tijd bij kamertemperatuur. De experimenten werden in tweevoud uitgevoerd. Na SBF behandeling werden de stalen één minuut gewassen met gedemineraliseerd water. De homogeniteit van de CP bedekking op de gemineraliseerde nanofibers werd kwalitatief bestudeerd

volgens

Madurantakam et al.

een (38)

licht

aangepast

protocol

van

. Hierbij werden de stalen gedurende

30min behandeld met 4% formaldehyde (VWR, 9713) en

Figuur 5 Alizarine.

vervolgens gedurende tien minuten gekleurd met een 0,04M alizarine rood S-oplossing (ARS) (pH 4,1) (Sigma-Aldrich, A5533, België). Het ongebonden ARS werd weggespoeld door de stalen grondig te wassen met gedemineraliseerd water. Alizarine (ofwel 1,2-dihydroxy-9,10anthracenedione, figuur 5) is een donkerrood/paars pigment dat vooral gebruikt wordt bij medische studies om de aanwezigheid van calcium aan te tonen. De aanwezige Ca2+-ionen vormen rode/paarse precipitaten met alizarine bij pH 4,1 (39). Hoe meer Ca2+ aanwezig is, hoe intenser de kleur. Het wordt klinisch gebruikt om ondermeer aanwezigheid van CP kristallen in synoviaal vocht (40) en op de vaatwanden (39) te detecteren.

2.4 Experimentele opzet

In deze studie werd getracht om het primaire CP laagje op de nanofibers te laten aangroeien met vorming van een carbonaatbevattend hydroxapatietlaagje

(4)

. Hiervoor werden

voorbehandelde PCL stalen ondergedompeld in verschillende SBF oplossingen waarvan de ionenconcentraties varieerden. Uit de resultaten van de preliminaire testen bleek dat enkel op de stalen behandeld met de Borax/HCl gebufferde SBF oplossing een CP laagje aanwezig was. Bovendien werd een neerslag gevormd tijdens de bereiding van de verschillende SBF oplossingen telkens alle ionconcentraties werden verhoogd. Daarom werd geopteerd om de SBF oplossingen te bufferen met Borax/HCl en enkel de calcium, fosfaat en carbonaatconcentraties te variëren

in de SBF oplossingen om neerslag vorming te

minimaliseren. Om de vorming van het carbonaatbevattend HAp laagje te optimaliseren werden drie parameters gevarieerd: de calcium- en fosfaatconcentratie waarbij de calcium/fosfaat verhouding steeds 2,5 was (ci), de carbonaatconcentratie (cCO3) en de tijdsduur van SBF behandeling (tSBF).

14

Deze drie parameters werden bepaald door middel van een sequentiële simplex optimalisatiemethode

(41)

. Deze methode liet toe om de parameters tegelijk te optimaliseren

met een minimum aantal experimenten. Een optimale procedure was deze waarbij een uniforme carbonaatbevattend HAp bedekking van de nanofibers werd bekomen waarbij de geconnecteerde poriënstructuur van de nanofiber matten behouden bleef. Twee verschillende reeksen experimenten werden parallel uitgevoerd om de invloed van twee carbonaatbronnen op de inbouw van carbonaat in het apatietrooster te onderzoeken. In de ene reeks werd NaHCO3 als carbonaatbron gebruikt en in de andere Na2CO3 (Merck, 6392).

2.5 Optimalisatie van aangroei en vorming van apatiet met inbouw van carbonaat

Na activatie werden het gewicht en de dimensies van de PCL stalen gemeten. Het gewicht werd bepaald met een analytische balans en de dikte werd gemeten met een elektronische micrometer. Vervolgens werden de stalen voorbehandeld volgens de procedure beschreven in §2.2. Voor elk experiment werden 1x1cm stalen elk apart in een container met 20ml van de corresponderende SBF oplossing (met ci en cCO3) gebracht en continu geschud aan 60 T/min gedurende een bepaalde tijd (tSBF). Na behandeling met SBF werden de stalen gedurende één minuut gewassen met gedemineraliseerd water en één uur aan de lucht gedroogd. De dimensies en het gewicht van elk staal werden opnieuw bepaald zodat de gewichtstoename per volume-eenheid kon berekend worden. De homogeniteit van de CP bedekking werd geëvalueerd door de stalen te kleuren met alizarine rood S zoals beschreven in §2.3. De experimenten werden uitgevoerd in viervoud. Het type afgezet CP werd geïdentificeerd door middel van infrarood (FT-IR) spectroscopie. Een FT-IR-spectrum werd opgenomen in het gebied van 400-4000cm-1 met een resolutie van 1cm-1 met een Spectrum One Fourier Transform IR Spectrofotometer (Perkin Elmer Instruments, V.S.). Hiervoor werd het polymeer eerst opgelost met een mengsel van chloroform (Merck, 2445) en aceton (VWR, 20063.296) en verwijderd volgens volgend protocol:

15

1)

250µl chloroform per cm² staal toevoegen, 10s vortexen, 10min wachten

2)

750µl aceton per cm² staal toevoegen, 10s vortexen, 5min wachten

3)

2 min centrifugeren (Eppendorf, 5804R, Duitsland) op 7000T/min

Wasstap

4)

Vloeistof boven de pellet verwijderen

tweemaal

5)

1ml aceton toevoegen, 10s vortexen, 5min wachten

herhalen

6)

2 min centrifugeren op 7000T/min

7)

Vloeistof boven de pellet verwijderen en laten uitdampen

0,65-0,80 mg van het overblijvende CP werd gedispergeerd in 250mg KBr (Spectrapur, Merck, 1.04907). Dit mengsel werd met behulp van een hydraulische pers samengedrukt tot een schijfje waarvan vervolgens een spectrum opgenomen werd. Een zuiver KBr schijfje werd gebruikt als referentie. SEM opnames werden gemaakt om de morfologie van de CP bedekking te evalueren. Het carbonaatgehalte in het gevormde CP werd bepaald met gaschromatografie met head-space bemonstering en thermische conductiviteitsdetector (Perkin-Elmer, 8500). De relatieve onzekerheid voor bepaling van de hoeveelheid carbonaat is 2%

(42)

. Het CP werd geïsoleerd

uit de geselecteerde stalen volgens dezelfde procedure als bij CP isolatie voor IRspectroscopie. Een nauwkeurig afgewogen hoeveelheid CP werd opgelost in 10% H 3PO4 in een gesloten vial. Hierbij kwam het carbonaat vrij onder de vorm van CO 2 en dit werd geïnjecteerd in de gaschromatograaf. Via de ijklijnmethode en gebruik van een Florida rock standaard (3,81% carbonaat) werd de hoeveelheid carbonaat in elk staal bepaald. 2.6 Celstudie

Dit deel van het onderzoek werd uitgevoerd in samenwerking met de afdeling Histologie van de vakgroep Medische Basiswetenschappen. MC3T3-E1 pre-osteoblastcellen werden in monolaag gecultiveerd onder 5% CO2/95% lucht bij 37°C in α-minimum essentieel medium (MEM) glutaMAX-1TM (Cat. No. 32561-029, Gibco BRL, België) dat 10vol% foetaal bovine serum (warmte-geïnactiveerd en EC-goedgekeurd), 1mM natriumpyruvaat (Cat. No. 11360039, Invitrogen) en antibiotica (penicilline/streptavidine) bevat. Het cultuurmedium werd tweemaal per week ververst. 16

Voor de celstudie werden stalen van drie experimenten weerhouden waarbij de CP bedekking van de nanofibers optimaal tot overvloedig was. De CP laag bekomen met deze drie experimenten bevatte verschillende concentraties carbonaat en/of een verschillend type CP. Ter controle werden voorbehandelde stalen met een primaire CP bedekking van de fibers en zuivere, onbehandelde PCL stalen meegenomen. De stalen werden eerst gesteriliseerd door ze gedurende 30min onder een UV-lamp te plaatsen. De stalen werden in 24-well weefsel cultuurplaten geplaatst (Greiner Bio-One, Frickenhausen, Wemmel, België) waaraan 40.10³ MC3T3-E1 cellen in 500µl cultuur medium werden toegevoegd. Als positieve controle werden 40.10³ MC3T3-E1 cellen in 500µl cultuur medium uitgezaaid op een adhesieplaat (Nunc, Life Technologies, Merelbeke, België). Als negatieve controle werd van elk type staal één staal in cultuurmedium geplaatst zonder cellen. Celviabiliteit van de vastgehechte cellen op de stalen werd na 1, 7 en 14 dagen incubatie bepaald met een PrestoBlue™-assay (Invitrogen A13261) en een calceïne acetoxymethyl (AM) ester (Tebu-Bio, Boechout, België)/propidium iodide (PI) (Sigma-Aldrich) kleuring. Het PrestoBlue™ reagens is een blauw gekleurde en niet-fluorescente oplossing op basis van resazurine. Dit laatste dringt de cellen binnen waar het in de mitochondriën wordt omgezet tot het rood gekleurde en fluorescente resorufine (43). Na 1, 7 en 14 dagen incubatie werden de stalen en positieve controles eerst gespoeld met cultuurmedium. Vervolgens werd 50µl van het PrestoBlue™ reagens en 450µl van het cultuurmedium toegevoegd. Na 2h incubatie in een donkere ruimte onder 5% CO2/95% lucht atmosfeer werd het medium overgebracht in een nieuwe 24-wellplaat. Deze plaat werd uitgelezen met een multilabel plaatlezer (Victor³, Perkin-Elmer). De kleurintensiteit is rechtstreeks gecorreleerd met het aantal levende cellen. De celviabiliteit werd uitgedrukt als een percentage van de positieve controle. De calceïne AM/PI kleuring is een dubbele kleuring die levende en dode cellen kleurt. Calceïne AM is een niet-fluorescente hydrofobe stof die gemakkelijk levende cellen binnendringt. Intracellulair wordt het door esterasen gehydrolyseerd tot het groen-fluorescente en hydrofiele calceïne dat zich in het cytoplasma opstapelt. Fluorescentie wordt gemeten met een fluorescentiemicroscoop (type U-RFL-T, Olympus, Aartselaar, België) met een 490nm excitatie- en een 520nm emissiefilter en correleert met het aantal viabele cellen (44). PI is een weinig fluorescente hydrofiele stof die viabele cellen niet kan binnendringen. Wanneer de celwand beschadigd is (en de cellen dood zijn) zal PI de cel binnendringen en intercalleren met DNA. Hierdoor zal de fluorescentie met factor 20 tot 30 toenemen en zal het PI rood fluoresceren. Fluorescentie wordt gemeten met een 488nm excitatie- en een 617nm 17

emissiefilter (45). Voor deze viabiliteitskleuring werden na 1, 7 en 14 dagen incubatie de stalen en positieve controle gespoeld met een fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) en in een well overgebracht met 500µl PBS waaraan 1µl calceïne AM en 1µl PI was toegevoegd. Na 10min incubatie werd de celviabiliteit geëvalueerd met de fluorescentiemicroscoop.

2.7 Statistische analyse

Een 1-factor Analysis of Variance (ANOVA) werd toegepast op de resultaten van de carbonaat bepaling met de fase samenstelling van de CP laag als onafhankelijke variabele. Beduidende verschillen tussen de gemiddelde carbonaat concentraties werden bepaald met een Bonferroni multipele vergelijkingstest op de 95% betrouwbaarheidsdrempel. Celviabiliteit werd geëvalueerd met een 2-factor ANOVA met behulp van een general linear model met de fase samenstelling van de CP laag en incubatietijd als onafhankelijke variabelen. Beduidende verschillen tussen de gemiddelde celviabiliteit werden bepaald met een Holm-Sidak multipele vergelijkingstest op de 95% betrouwbaarheidsdrempel.

18

3 Resultaten

3.1 Zuivere en calcium en fosfaat voorbehandelde PCL nanofibers

PCL matten, vervaardigd door electrospinning, hadden een dikte van (57,52µm

±

18,22)µm en een gemiddelde fiberdiameter van (0,455µm ± 0,211)µm. De foto’s van de PCL stalen voorbehandeld volgens de methode beschreven in §2.2 en vervolgens gekleurd met ARS worden weergegeven in figuur 6a. De stalen kleurden rood tot licht paars wat wees op de aanwezigheid van calcium op de stalen. De gemiddelde massatoename bedroeg hierbij (0,013mg/mm³ ± 0,004)mg/mm3. De gemiddelde massatoename per mm³ werd gebruikt als kwantitatieve uitdrukking voor de aangroei van CP op de vezels. Hiervoor werd de massatoename van de stalen als gevolg van de calcium en fosfaat voorbehandeling en behandeling met een SBF oplossing gedeeld door het volume van het staal vóór de voorbehandeling. Op de SEM opnames van de voorbehandelde PCL stalen konden echter geen CP kristallen waargenomen worden op de fibers (figuur 6c). De morfologie van de voorbehandelde PCL nanofibers was vergelijkbaar met de morfologie van de zuiver PCL fibers (figuur 6b,c).

a

b

c

Figuur 6a: ARS kleuringen van voorbehandelde stalen, b: SEM opname van zuiver PCL, c: SEM opname van voorbehandeld PCL.

19

3.2 Preliminaire testen De parameters van de uitgevoerde preliminaire experimenten, samen met de foto’s van de ARS gekleurde stalen behandeld volgens het overeenkomstige experiment worden weergegeven in tabel 2.

Tabel 2 Parameters van de uitgevoerde preliminaire experimenten samen met de ARS gekleurd stalen.

Type SBF

Tijdsduur

1xSBF

24h

De voorbehandelde stalen waren voor het

Staal

grootste deel wit na onderdompeling in 1xSBF gebufferd met TRIS/HCl gedurende 24h en na

pH = 7,4 1xSBFB

onderdompeling

3h

in

5xSBF

en

10xSBF

gedurende 3h. De afwezigheid van een rode

pH = 8,5

kleur toonde aan dat op deze stalen geen

16h

calcium aanwezig was. Een behandeling met 5xSBF

5xSBF gedurende 24h gaf geen reproduceerbare

3h

resultaten. Eén staal was volledig wit terwijl het

(neerslag) pH = 7,4

andere staal een egaal intense rode kleur had,

24h

wat wees op de aanwezigheid van veel calcium 10xSBF

3h

op het staal. De stalen ondergedompeld in de

pH = 4,13

Borax/HCl

gebufferde

1xSBFB

oplossing

gedurende 3h en 24h vertoonden een egale rode tot licht paarse kleuring vergelijkbaar met de kleuring van de voorbehandelde stalen (figuur 6a).

3.3 Optimalisatie

van

maturatie

van

polyester nanofibers

met

NaHCO3

als

carbonaatbron

In tabel 3 worden de parameters van de experimenten op basis van de Sequentiële Simplex methode weergegeven samen met de gemiddelde massatoename van de stalen per mm3. Experimenten S6 en S8 werden niet uitgevoerd omdat negatieve waarde werden berekend voor de ionenconcentraties in de SBF oplossing. De concentraties van calcium , fosfaat en carbonaat zijn vermenigvuldigd met een bepaalde factor ten opzichte van de concentraties in de 1xSBF oplossing (zie tabel 1). De naam van de SBF oplossing werd afgeleid uit de ionsterkten van calcium, fosfaat en carbonaat in de oplossing en kon algemeen voorgesteld 20

worden als AxSBFBxCO3 waarbij A de factor voorstelde waarmee de ionconcentratie van calcium en fosfaat werd vermenigvuldigd en B de factor waarmee ionconcentratie van carbonaat werd vermenigvuldigd. Tabel 3 Parameters van de verschillende experimenten met NaHCO3 als carbonaatbron en de gemiddelde massatoename van de behandelde stalen per mm3 met de standaard deviatie tussen haakjes.

Exp.

Tijd in Rel. conc. calcium/ SBF opl. (h) fosfaat in SBF opl.

Naam SBF opl. Rel. conc. CO3 in SBF opl.

Gem. massa toename (mg/mm³)

S1

24

1x

1x

1xSBF1xCO3

0,015

S2

1,5

1x

1x

1xSBF1xCO3

0,005

S3

24

5x

1x

5xSBF1xCO3

0,085 (0,001)

S4

24

1x

10x

1xSBF10xCO3

0,009 (0,001)

S5

46,5

3,7x

7x

3,7xSBF7xCO3

0,535 (0,064)

S7

27,75

3,45x

3,5x

3,45xSBF3,5xCO3

0,031 (0,005)

S9

33

2,76x

5,92x

2,76xSBF5,92xCO3

0,038 (0,001)

S10

33

3,81x

11,94x

3,81xSBF11,94xCO3 0,106 (0,013)

De verschillende SBF oplossingen werden bereid met NaCl, KCl, MgCl2.6H2O, Na2SO4, CaCl2.2H2O, K2HPO4 en met NaHCO3 als carbonaatbron. De ionenconcentraties en de pH van de SBF oplossingen worden weergegeven in tabel 4. Alle SBF oplossingen werden gebufferd met Borax/HCl (pH = 8,5). Bij de bereiding van de oplossingen werd getracht de pH zo hoog mogelijk te brengen zonder neerslag van CP of calciumcarbonaat in de oplossing te veroorzaken. Een zeer lage pH van de SBF oplossing zou spontane neerslag vermijden maar zou niet bevorderlijk zijn voor de aangroei van CP op de fibers. SO 42--en K+concentraties werden constant gehouden. De Mg2+-concentratie werd vanaf een 2x calcium en fosfaat bevattende SBF oplossing verdubbeld om eventuele CP neerslag te minimaliseren. Aangezien steeds wijzigende hoeveelheden van NaHCO3, CaCl2.2H2O en Na2HPO4 werden gebruikt variëerden de Na+- en Cl--concentraties ook steeds.

21

Tabel 4 Ionenconcentraties (mM) en pH-waarden van de verschillende SBF oplossingen met NaHCO3 als carbonaatbron.

SBF opl. 1xSBF1xCO3 1xSBF10xCO3 2,76xSBF5,92xCO3 3,45xSBF3,5xCO3 3,7xSBF7xCO3 3,81xSBF11,94xCO3 5xSBF1xCO3

Na+ 142 179,80 166,18 157,40 168,90 193,57 150

SO420,50 0,50 0,50 0,50 0,50 0,50 0,50

HCO34,20 42 24,86 14,70 29,40 50,15 4,20

Cl147,80 147,80 159,60 163,06 164,30 164,86 170,80

Ca2+ 2,50 2,50 6,90 8,63 9,25 9,53 12,5

Mg2+ 1,50 1,50 3 3 3 3 3

K+ 5 5 5 5 5 5 5

HPO421 1 2,76 3,45 3,70 3,81 5

3.3.1 CP bedekking van de nanofiber stalen In figuur 7 worden foto’s weergegeven van de gekleurde stalen behandeld volgens experimenten S1, S3, S5, S7, S9 en S10. De gemiddelde massatoename van de stalen na behandeling met een 1xSBF1xCO3 oplossing gedurende 1,5h of 24h (respectievelijk S2 en S1) of een 1xSBF10xCO3 oplossing gedurende 24h (S4) bedroeg 0,005 tot 0,015mg/mm³ (tabel 3). Na kleuring met ARS waren deze stalen egaal rood tot licht paars gekleurd, duidend op een homogene bedekking met CP. De foto’s van de gekleurde stalen behandeld volgens experiment S1 zijn representatief voor de stalen behandeld volgens experimenten S2 en S4 (figuur 7a). Zowel de massatoename als de kleuring van de stalen bij experiment S1, S2 en S4 waren vergelijkbaar met deze van de calcium en fosfaat voorbehandelde stalen (§ 3.1; figuur 6a). Iets hogere gemiddelde massatoenames van 0,031 tot 0,038mg/mm3 werden gemeten voor de stalen behandeld met een 3,45xSBF3,5xCO3 oplossing gedurende 27,75h (S7) en met een 2,76xSBF5,92xCO3 oplossing gedurende 33h (S9). Twee stalen van experiment S7 kleurden rood en twee stalen kleurden overwegend rood met paarse vlekken (figuur 7d). Bij experiment S9 kleurden twee stalen rood met paarse vlekken terwijl de twee andere stalen rood tot donker paars kleurden naast enkele witte gebieden (figuur 7e). Experimenten S7 en S9 gaven dus geen reproduceerbare resultaten zodat de morfologie van de nanofibers en het type CP op deze stalen niet werd onderzocht. Aanzienlijk hogere gemiddelde massatoenames van 0,085 tot 0,106mg/mm³ werden geobserveerd voor stalen behandeld met een 5xSBF1xCO3 oplossing gedurende 24h (S3) of met een 3,81xSBF11,94xCO3 oplossing gedurende 33h (S10). De kleuringen toonden echter aan dat de CP bedekking op de stalen behandeld volgens experiment S3 niet homogeen was.

22

pH 8,50 8,00 7,18 6,75 6,66 6,65 6,60

Ongeveer de helft van het oppervlak was rood gekleurd terwijl de andere helft paars kleurde (figuur 7b). Bij experiment S10 zijn alle stalen egaal paars gekleurd, duidend op een homogene en reproduceerbare CP bedekking (figuur 7f). Een extreme massatoename van gemiddeld 0,535mg/mm³ werd geobserveerd wanneer stalen behandeld werden met een 3,7xSBF7xCO3 oplossing gedurende 46,5h (S5). De stalen kleurden egaal donkerrood (figuur 7c).

Figuur 7 ARS kleuringen van stalen na behandeling volgens experimenten S1 (a), S3 (b), S5 (c), S7 (d), S9 (e) en S10 (f). De zwarte kaders wijzen het gebied aan waarvan SEM opnames genomen werden.

3.3.2 Microstructuur van de nanofiber stalen

In figuur 8 worden SEM opnames weergegeven van stalen behandeld volgens experimenten S2, S3, S5, en S10. SEM opnames van stalen behandeld volgens experiment S2 zijn De

representatief stalen

van

voor

stalen

experiment

behandeld S2

behouden

volgens hun

experimenten

oorspronkelijke

S1

en

S4.

geconnecteerde

poriënstructuur. De fibers zijn bedekt met een heel dun en glad laagje CP dat moeilijk te zien is op de SEM opnames (figuur 8-S2). Een heterogene CP bedekking van de stalen uit experiment S3 werd aangetoond met een ARS kleuring en bevestigd op de SEM opnames. In rood gekleurde gebieden was een CP laagje moeilijk te onderscheiden op de fibers, terwijl in de paars gekleurde gebieden de fibers bedekt waren met een homogene CP laag. In zowel de rood als paars gekleurde delen bleef de geconnecteerde poriënstructuur behouden. De fibers van de stalen van experiment S10 vertoonden een homogene en reproduceerbare CP bedekking waarbij de geconnecteerde poriënstructuur goed behouden bleef (figuur 8).

23

S2

S3 rood

S3 paars

S5

S10 Figuur 8 SEM opnames van stalen behandeld volgens experimenten S2, S3, S5 en S10.

De extreme massatoename van de stalen bij experiment S5 was duidelijk te zien op de SEM opnames: de PCL fibermat was volledig overgroeid met CP. Enkel de vezels aan het oppervlak van de PCL mat konden onderscheiden worden en de geconnecteerde poriënstructuur was volledig verdwenen (figuur 8).

24

3.3.3 Identificatie van het gevormde CP Aan de hand van FT-IR-spectra werd het type CP op elk staal bepaald. Op basis van het type CP konden de stalen van de verschillende experimenten onderverdeeld worden in 4 groepen zoals weergegeven in tabel 5.

Tabel 5 Type CP op de stalen van de verschillende experimenten uitgevoerd met NaHCO3 als carbonaatbron. CDHAp: calciumdeficiënt hydroxyapatiet, HAp: hydroxyapatiet, DCPD: dicalcium fosfaat dihydraat, ACP: amorf CP.

Type CP Carbonaat bevattend CDHAp Carbonaat bevattend ACP DCPD Carbonaat bevattend HAp/DCPD

Stalen van experimenten Voorbehandeld staal, S1 en S2 S5 en S10 S3 S4

De FT-IR-spectra van het CP op een met calcium en fosfaat voorbehandeld staal en het CP op de stalen behandeld volgens experimenten S1, S2 en S4 wezen op de vorming van een apatietfase. Het FT-IR-spectrum van het staal behandeld volgens experiment S2 (figuur 9) is representatief voor dat van het voorbehandelde staal en voor het staal behandeld volgens experiment S1. In de FT-IR-spectra van de stalen werden typische absorptiebanden van PO 434-vibratie waargenomen in de regio’s van 500 tot 700cm-1. De pieken bij 970cm-1, 1045cm-1 en 1100cm-1 waren afkomstig van de PO43- 1- en 3-strekking. De band bij 1662cm-1 was afkomstig van de 2-buiging van H2O. Kleine absorptiebanden werden waargenomen rond 870cm-1, 1425cm-1 en 1470cm-1 wat wees op de aanwezigheid van CO32- dat gedeeltelijk PO43substitueerde (B-type substitutie). Ook kleine absorptiebanden werden gezien rond 890cm-1 en 1545cm-1, hetgeen wees op partiële inbouw van CO32- op de OH- plaats in het apatiet rooster. De intensiteit van de pieken in het gebied tussen 1400 en 1500cm-1 was echter heel laag ten opzichte van deze rond 870cm-1. De absorptieband rond 870cm-1 kwam voornamelijk van de P-O(H) vervorming van HPO42-. De schouder bij 600cm-1 en de band rond 900cm-1 zijn afkomstig van HPO42-. Het gevormde apatiet op deze stalen is bijgevolg een carbonaatbevattend calciumdeficiënt HAp (CDHAp). Het FT-IR spectrum van het staal van experiment S4 vertoonden de typische absorptiebanden van carbonaat bevattend CDHAp. Bovendien werden schouders bij 528cm -1 en 576 cm-1 waargenomen afkomstig van de typische O-P-O buigingsvibraties van DCPD. In het FT-IR spectrum van het CP op het staal van experiment S4 konden pieken waargenomen 25

worden van PCL tussen 1000 en 1500 cm-1 en rond 1740, 2900 en 2980 cm-1. Deze pieken konden in meer of mindere mate waargenomen worden in alle spectra. In het FT-IR-spectrum van een staal behandeld volgens experiment S3 werden typische absorptiebanden teruggevonden van DCPD (figuur 10). Typische absorptiebanden van O-P-O buigingsvibraties werden waargenomen in de regio’s van 500 tot 600cm-1. De pieken rond 984cm-1, 1063cm-1 en 1139cm-1 waren afkomstig van de PO4 strekkingsvibraties. De piek bij 1653cm-1 en de pieken in de absorptiebanden tussen 3150cm-1 en 3600cm-1 waren afkomstig van de 1-, 2- en 3-strekking van H2O. De absorptiebanden van de P-O(H) vervorming van HPO42- groepen werden teruggevonden rond 798cm-1, 870cm-1 en 1215cm-1. Het FT-IR-spectrum van het staal van experiment S5 is representatief voor dat van het staal behandeld volgens experiment S10. De FT-IR-spectra van deze stalen wezen op de vorming van ACP. Brede absorptiebanden van de PO43- 4-vibratie en de PO43- 1- en 3-strekking werden waargenomen in de regio’s van 500 tot 700cm-1 en 950 tot 1150cm-1. Naast de band bij 1662 cm-1, afkomstig van de 2-buiging van H2O, werden kleine absorptiebanden waargenomen rond 870 cm-1, 1425cm-1 en 1470cm-1 wat wees op de aanwezigheid van CO32dat gedeeltelijk PO43- substitueerde.

3.4 Optimalisatie van maturatie van polyester nanofibers met Na 2CO3 als carbonaatbron

In tabel 6 worden de parameters van de experimenten op basis van de Sequentiële Simplex methode weergegeven samen met de gemiddelde massatoename van de stalen per mm3. Experiment SC6 werd niet uitgevoerd omdat een negatieve waarde werd berekend voor de concentraties van calcium en fosfaat in de SBF oplossing. Ook bij deze experimenten werden de concentraties van calcium, fosfaat en carbonaat vermenigvuldigd met een bepaalde factor ten opzichte van hun concentraties in de 1xSBF oplossing. De naam van de SBF oplossing werd algemeen voorgesteld door AxSBFBxCO3 zoals beschreven in § 3.3.

26

Figuur 9 FT-IR-spectra van CP op stalen van experiment S2 en S4. FT-IR-spectra van carbonaat bevattend HAp en PCL worden als referentie weergegeven.

Figuur 10 FT-IR-spectra van CP op stalen van experiment S3 en S5. FT-IR-spectra van zuiver DCPD en zuiver ACP worden als referentie weergegeven.

27

Tabel 6 Parameters van de verschillende experimenten met Na 2CO3 als carbonaatbron en de gemiddelde massatoename van de behandelde stalen per mm3 met de standaard deviatie tussen haakjes.

Exp.

Tijd in Rel. conc. SBF calcium/ opl. (h) fosfaat in SBF opl.

Naam SBF opl. Rel. conc. CO3 in SBF opl.

Gem. massa toename (mg/mm³)

SC1 SC2 SC3 SC4 SC5 SC7 SC8 SC9 SC10 SC11

24 3 24 24 45 27,5 40,33 16,22 23,42 31

1x 1x 1x 10x 7x 3,5x 12,67x 10,45x 9,59x 18,01x

0,014 (0,020) 0,009 (0,011) 0,245 (0,073) 0,005 (0,001) 0,062 (0,022) 0,059 (0,009) 0,395 (0,073) 0,006 (0,008) 0,071 (0,010) 0,059 (0,017)

1x 1x 5x 1x 3,7x 3,45x 4,41x 2,22x 2,59x 1,9x

1xSBF1xCO3 1xSBF1xCO3 5xSBF1xCO3 1xSBF10xCO3 3,7xSBF7xCO3 3,45xSBF3,5xCO3 4,41xSBF12,67xCO3 2,22xSBF10,45xCO3 2,59xSBF9,59xCO3 1,9xSBF18,01xCO3

Alle SBF oplossingen werden gebufferd met Borax/HCl (pH = 8,5) en bereid volgens het recept gebruikt door Müller en Müller (46) met NaCl, KCl, MgCl2.6H2O, Na2SO4, CaCl2.2H2O, KH2PO4 (J.T. Baker, 0240) en Na2CO3 als carbonaatbron. Na+-, SO42--, Mg2+- en K+concentraties werden constant gehouden. De ionenconcentraties en de pH van de SBF oplossingen worden weergegeven in tabel 7. Bij de bereiding van de oplossingen werd getracht de pH zo hoog mogelijk te brengen zonder neerslag van CP of calciumcarbonaat in de oplossing te veroorzaken.

Tabel 7 Ionenconcentraties (mM) en pH-waarden van de verschillende SBF oplossingen met Na2CO3 als carbonaatbron.

SBF opl. 1xSBF1xCO3 1xSBF10xCO3 1,9xSBF18,01xCO3 2,22xSBF10,45xCO3 2,59xSBF9,59xCO3 3,45xSBF3,5xCO3 3,7xSBF7xCO3 4,41xSBF12,67xCO3 5xSBF1xCO3

Na+ 142 142 142 142 142 142 142 142 142

SO420,50 0,50 0,50 0,50 0,50 0,50 0,50 0,50 0,50

CO324,20 42 75,64 43,89 40,28 14,70 29,40 53,21 4,20

Cl144,60 69 15,60 70,10 78,80 133,40 105 60,21 164,60

Ca2+ 2,50 2,50 4,75 5,55 6,48 8,63 9,25 11,03 12,50

Mg2+ 1,50 1,50 1,50 1,50 1,50 1,50 1,50 1,50 1,50

K+ 5 5 5 5 5 5 5 5 5

H2PO41 1 1,90 2,22 2,59 3,45 3,70 4,41 5

pH 8,50 8,30 7,50 7,40 7,20 6,93 6,90 6,82 6,60

28

3.4.1 CP bedekking van de nanofiber stalen In figuur 11 worden foto’s weergegeven van de gekleurde stalen van de SC reeks. De gemiddelde massatoename van stalen na behandeling met een 1xSBF1xCO3 oplossing gedurende 3h of 24h (respectievelijk SC2 en SC1), een 1xSBF10xCO3 oplossing gedurende 24h (SC4) of een 2,22xSBF10,45xCO3 oplossing gedurende 16,22h (SC9) bedroeg 0,005 tot 0,014mg/mm³. De foto’s van experiment SC1 zijn representatief voor deze van experimenten SC2 en SC9. Hierbij werden rode en paarse gebieden waargenomen met nog enkele witte vlekken ertussen (figuur 11a). De stalen van experiment SC4 kleurden roze tot rood met meer witte vlekken (figuur 11b). Deze stalen vertoonden geen homogene kleuring en dus geen homogene afzetting van CP. De gemiddelde massatoename van stalen na behandeling met een 3,7xSBF7xCO 3 oplossing gedurende 45h (SC5), een 3,45xSBF3,5xCO3 oplossing gedurende 27,5h (SC7), een 2,59xSBF9,59xCO3 gedurende 23,42h (SC10) of een 1,9xSBF18,01xCO3 oplossing gedurende 31h (SC11) bedroeg 0,059 tot 0,071mg/mm³. De stalen van experiment SC5 kleurden egaal donkerrood (figuur 11c) en zijn representatief voor de stalen behandeld volgens experimenten SC7 en SC10. De stalen van experiment SC11 vertoonden roze over rode tot paarse gebieden na ARS kleuring (figuur 11d). Dit experiment gaf dus geen reproduceerbare resultaten zodat de morfologie van de nanofibers en het type CP op het staal niet werd onderzocht. Behandeling met een 5xSBF1xCO3 oplossing gedurende 24h (SC3) resulteerde in een aanzienlijk hogere gemiddelde massatoename van 0,245mg/mm³. De stalen kleurden rood tot donkerrood met enkele roze vlekjes (figuur 11e).

a

b

c

d

e

f

Figuur 11 ARS kleuringen van stalen na behandeling volgens experimenten SC1 (a), SC4 (b), SC5 (c), SC11 (d), SC3 (e) en SC8 (f).

29

SC1

SC3

SC4

SC5

SC8

SC10

Figuur 12 SEM opnames van stalen behandeld volgens experimenten SC1, SC3, SC4, SC5, SC8 en SC10.

De hoogste gemiddelde massatoename werd gemeten op de stalen behandeld volgens experiment SC8. Behandeling met een 4,41xSBF12,67xCO3 gedurende 40,33h resulteerde in een gemiddelde massatoename van 0,395mg/mm³. De stalen kleurden hierbij egaal donkerrood (figuur 11f). 30

3.4.2 Microstructuur van de nanofiber stalen

In figuur 12 worden SEM opnames van stalen behandeld volgens experimenten SC1, SC3, SC4, SC5, SC7, SC8 en SC10 weergegeven. SEM opnames van stalen behandeld volgens experiment SC1 zijn representatief voor stalen behandeld volgens experimenten SC2 en SC9. Op de SEM opnames van het staal van experiment SC1 was te zien dat de PCL fibermatten hun geconnecteerde poriënstructuur goed behouden hadden. De fibers waren bedekt met een heel dun CP laagje en verspreid op de fibers waren sferische CP deeltjes te zien. Ondanks de vergelijkbare massatoename met het staal van experiment SC4 was het oppervlak van dit laatste gedeeltelijk bedekt met vlokken CP. Onder het oppervlak van de PCL mat waren de vezels slechts in beperkte mate bedekt met CP. Een hoge massatoename werd geobserveerd bij experimenten SC5, SC7 en SC10. Bij experiment SC5 was te zien dat het oppervlak van de PCL mat gedeeltelijk overgroeid was met CP. De geconnecteerde poriënstructuur ging hierbij deels verloren. Het oppervlak van de vezels was bedekt met een homogeen laagje CP. SEM opnames van het staal behandeld volgens experiment SC10 zijn representatief voor het staal behandeld volgens SC7. Bij deze experimenten waren alle vezels bedekt met een homogeen laagje CP. De geconnecteerde poriënstructuur bleef behouden ondanks de af en toe aanwezige grotere CP korrels op en tussen de fibers (figuur 12). Bij experimenten SC3 en SC8 werd de hoogste massatoename geobserveerd. Bij experiment SC3 bleef de geconnecteerde poriënstructuur van de stalen goed behouden en was een CP laagje moeilijk te onderscheiden op de vezels. De PCL mat was echter bezaaid met zeer grote CP kristallen. Bij experiment SC8 waren alle vezels bedekt met een homogeen dun laagje CP. De geconnecteerde poriënstructuur bleef behouden ondanks de sporadisch? grotere CP korrels die zich op het oppervlak bevonden. 3.4.3 Identificatie van het gevormde CP

Op basis van het type CP konden de stalen van de verschillende experimenten onderverdeeld worden in 4 groepen zoals weergegeven in tabel 8. De FT-IR-spectra van de stalen behandeld volgens experimenten SC4, SC5 en SC7 wezen op de vorming van een apatietfase. Het FT-IR-spectrum van het staal behandeld volgens experiment SC4 (figuur 13) is representatief voor dat van de stalen behandeld volgens

31

Tabel 8 Type CP op de stalen van de verschillende experimenten uitgevoerd met Na 2CO3 als carbonaatbron. HAp: hydroxyapatiet, DCPD: dicalcium fosfaat dihydraat, ACP: amorf CP.

Type CP Carbonaat bevattend HAp/DCPD DCPD Carbonaat bevattend ACP ACP/CaCO3

Stalen van experimenten SC4, SC5 en SC7 SC3 SC1, SC2, SC8 en SC10 SC9

Figuur 13 FT-IR-spectra van CP op stalen van experimenten SC1, SC4, SC8 en SC9. Het spectrum van carbonaat bevattend HAp werd als referentie weergegeven.

experimenten SC5 en SC7. In de FT-IR-spectra van deze stalen werden typische absorptiebanden waargenomen die duiden op de aanwezigheid van apatiet zoals beschreven in §3.3.3. Kleine absorptiebanden werden waargenomen rond 870cm-1, 1425cm-1 en 1470cm-1 wat wees op de aanwezigheid van CO32- dat gedeeltelijk PO43- substitueerde (B-type substitutie). Het gevormde apatiet is bijgevolg niet een zuiver HAp maar een carbonaatbevattend HAp. Schouders rond 576 cm-1, 1063cm-1 en 823cm-1 werden waargenomen in de FT-IR-spectra van de stalen van experimenten SC4, SC5 en SC7 die afkomstig waren van de typische O-P-O buigingsvibraties van DCPD. Het FT-IR-spectrum van een staal behandeld volgens experiment SC3 was vergelijkbaar met het FT-IR spectrum het staal van experiment S3 waar typische absorptiebanden werden

32

teruggevonden die duiden op de aanwezigheid van DCPD zoals beschreven in §3.3.3 (figuur 10). De FT-IR-spectra van de stalen van experimenten SC1, SC2, SC8, SC9 en SC10 wezen op de vorming van ACP zoals beschreven in §3.3.3. In de spectra van de stalen van experimenten SC1, SC2, SC8 en SC10 werden absorptiebanden waargenomen rond 870 cm-1, 1425cm-1 en 1470cm-1, wat wees op de aanwezigheid van CO 32- dat gedeeltelijk PO43- substitueerde (Btype substitutie). Het ACP op deze stalen is dus een carbonaatbevattend ACP. Als representatief voorbeeld voor het staal van experiment SC2 werd het FT-IR spectrum van het staal van experiment SC1 weergegeven in figuur 13. De absorptiebanden bij 870 cm-1, 1425cm-1 en 1470cm-1 waren in de spectra van de stalen van experimenten SC1 en SC2 heel klein wat wees op een heel lage carbonaat concentratie in het ACP. In de spectra van de stalen van experimenten SC8 en SC10 waren de absorptiebanden van carbonaat heel duidelijk zichtbaar. Als representatief voorbeeld van deze spectra wordt het FT-IR spectrum van het staal van experiment SC8 weergegeven in figuur 13. In het spectrum van het staal van experiment SC9 werd een absorptieband waargenomen tussen 1380cm-1 en 1500cm-1 en kleine pieken op 711cm-1, 873cm-1 en 1796cm-1, allen duidend op de aanwezigheid van calciumcarbonaat (CaCO3). Ook werd een kleine piek waargenomen rond 1548cm-1, duidend op de aanwezigheid van een kleine hoeveelheid CO32--ionen die OH--ionen in het kristalrooster van het apatiet substitueerden (A-type substitutie, figuur 13).

3.5 Carbonaat inbouw in ACP afgezet op stalen van experiment S10

Extra experimenten werden uitgevoerd waarbij de stalen gedurende een bepaalde tijd ondergedompeld werden in SBF oplossingen waarvan het recept lichtjes was aangepast ten opzichte van het recept van experiment S10 (tabel 9). In de SBF oplossingen werd als carbonaatbron en fosfaatbron respectievelijk Na2CO3 en KH2PO4 gebruikt. Drie SBF oplossingen werden aangemaakt; de ionenconcentraties en de pH van de SBF oplossingen worden weergegeven in tabel 10.

- De S10BisTRIS oplossing bevatte dezelfde ionenconcentraties als de SBF oplossing gebruikt voor het experiment S10 maar werd gebufferd met TRIS/HCl. - De S10BisTRIS/const. oplossing werd gebufferd met TRIS/HCl en de concentraties van Na+-, SO42--, Mg2+- en K+-ionen werden gelijkgesteld aan de ionenconcentraties in 1xSBF (46).

33

- In de S10BisBorax/const. oplossing werden de concentraties van de Na+-, SO42--, Mg2+- en K+- ionen gelijkgesteld aan de ionenconcentraties in 1xSBF en de oplossing werd gebufferd met Borax/HCl.

Tabel 9 Parameters van de verschillende experimenten en de gemiddelde massatoename van de behandelde stalen per mm3 met de standaard deviatie tussen haakjes. Ook het type CP op de stalen van de verschillende experimenten wordt weergegeven.

Exp.

Tijd in Rel. conc. SBF calcium/ opl. (h) fosfaat in SBF opl.

Rel. conc. CO3 in SBF opl.

Naam SBF opl. Gem. massa toename (mg/mm³)

S10

33

3,81x

11,94x

E1

33

3,81x

11,94x

E2

33

3,81x

11,94x

E3

33

3,81x

11,94x

E4

20

3,81x

11,94x

E5

15

3,81x

11,94x

E6

6

3,81x

11,94x

0,106 (0,013) 0,087 (0,019) 0,800 (0,194) 0,852 (0,009) 0,693 (0,225) 0,213 (0,113) 0,082 (0,010)

Type CP

3,81xSBF11,94 Carbonaat bevattend xCO3 ACP S10Borax/const. Carbonaat bevattend ACP/DCPD S10TRIS/const. Carbonaat bevattend HAp/DCPD S10TRIS Carbonaat bevattend HAp Carbonaat bevattend HAp Carbonaat bevattend HAp/ACP Carbonaat bevattend HAp/DCPD

Tabel 10 Ionenconcentraties (mM) en de pH-waarden van de verschillende SBF oplossingen.

SBF opl.

Na+

SO42- CO32- Cl-

Ca2+ Mg2+ K+

H2PO42- pH

S10TRIS

255,30 0,50

59,75

161,85 9,53

1,50

8,81 3,81

6,60

S10TRIS/const.

142

0,50

50,15

63,95

9,53

1,50

5

3,81

6,93

S10Borax/const.

142

0,50

50,15

63,95

9,53

1,50

5

3,81

6,62

34

3.5.1 CP bedekking van de nanofiber stalen In figuur 14 worden foto’s weergegeven van de gekleurde stalen behandeld volgens experimenten E2 en E5. De gekleurde stalen van experiment S10 worden ter vergelijking weergegeven. a

b

c

Figuur 14 ARS kleuringen van stalen na behandeling volgens experimenten S10 (a), E2 (b) en E5 (c).

De stalen behandeld met een S10Borax/const. oplossing gedurende 33h (E1) en S10TRIS oplossing gedurende 6h (E6) waren egaal paars gekleurd en vergelijkbaar met de gekleurde stalen van experiment S10 (figuur 14a). Deze kleuring duidde op een homogene en reproduceerbare CP bedekking. De gemiddelde massatoename op deze stalen bedroeg 0,08 tot 0,09mg/mm³. De gekleurde stalen van experiment E2 zijn representatief voor deze van E3 en E4. Bij een behandeling met S10TRIS en S10TRIS/const. oplossing gedurende 33h (respectievelijk E3 en E2) werden hoge gemiddelde massatoenames geobserveerd op de stalen van 0,69 tot 0,85mg/mm³ (figuur 14b). De stalen kleurden egaal donker rood. Stalen behandeld met S10BisTRIS oplossing gedurende 15h (E5) kleurden minder intens rood tot donkerrood dan de stalen na 33h. Eén van de vier stalen vertoonde echter ook roze gebieden.

3.5.2 Microstructuur van de nanofiber stalen

In figuur 16 worden SEM opnames weergegeven van stalen behandeld volgens experimenten E3 en E5. Ter vergelijking worden SEM opnames van het staal van experiment S10 weergegeven. Bij experimenten E1 en E6 waren de fibers bedekt met een homogene CP laag waarbij de geconnecteerde poriënstructuur behouden bleef. De morfologie van deze stalen was vergelijkbaar met de morfologie van het staal van experiment S10 (figuur 16). De SEM opnames van experiment E3 zijn representatief voor deze van experimenten E2 en E4. De stalen behandeld volgens experimenten E2, E3 en E4 vertoonden een extreme

35

massatoename hetgeen bevestigd werd met de SEM opnames. Het oppervlak van de PCL mat is volledig overgroeid met CP, de geconnecteerde poriënstructuur is volledig verdwenen en vezels zijn onderling niet meer te onderscheiden (figuur 16-E3). Het staal van experiment E5 vertoonde aangroei van een vrij dikke laag CP langs de nanofibers. Hierdoor was de geconnecteerde poriënstructuur nog aanwezig maar begonnen de poriën toch te verkleinen.

S10

E3

Figuur 15 SEM opnames van stalen behandeld volgens experimenten S10, E3 en E5.

E5

3.5.3 Identificatie van het gevormde CP Het type CP afgezet op de nanofibers van de experimenten E1-E6 wordt weergegeven in tabel 9. In figuur 16 worden FT-IR-spectra van CP van stalen van experimenten S10, E1 en E2 weergegeven. Het FT-IR-spectrum van het staal van experiment E1 wees op de vorming van ACP zoals beschreven in §3.3.3. De FT-IR-spectra van de overige stalen wezen op de vorming van HAp zoals beschreven in §3.3.3. De aanwezigheid van absorptiebanden in de regio van 3300 tot 3600cm-1 en rond 530cm-1, 576cm-1 en 785cm-1 (aangeduid met pijlen in figuur 16) in de FT36

IR-spectra van de stalen van experimenten E1, E2 en E6 wezen op de aanwezigheid van DCPD (zie ook §3.3.3). In de spectra van alle stalen werden absorptiebanden waargenomen rond 870cm-1, 1425cm-1 en 1470cm-1 wat wees op de aanwezigheid van CO32- dat gedeeltelijk PO43- substitueerde (B-type substitutie). Behalve voor het staal van experiment E1 waren deze absorptiebanden duidelijk zichtbaar (Figuur 16-E2). Ook werd in het spectrum van het staal van E1 een kleine piek waargenomen rond 1548cm-1, duidend op de aanwezigheid van een kleine hoeveelheid CO32--ionen die OH--ionen in het kristalrooster van het apatiet substitueerden (A-type substitutie).

Figuur 16 FT-IR-spectra van CP afgezet bij experimenten S10, E1 en E2. Pijlen duiden typische absorptiebanen van DCPD aan.

3.6 Bepaling van het carbonaatgehalte in CP afgezet op PCL nanofibers

Het carbonaatgehalte in het CP van het PCL staal werd enkel bepaald als de absorptiebanden van carbonaat duidelijk zichtbaar waren in het FT-IR spectrum. De stalen van experimenten E4-E6 werden niet meegenomen omdat de relatieve absorbanties van de carbonaat pieken t.o.v. de fosfaat pieken constant bleven. In figuur 17 wordt het CO32--gehalte in verschillende stalen weergegeven; de foutenbalken geven één standaarafwijking weer. Er is te zien dat het carbonaatgehalte in het CP van stalen 37

behandeld volgens experimenten E2 en E3 (respectievelijk 3,96 en 3,70gew%) onderling niet significant verschillend was (p = 1,000) maar significant hoger bleek te zijn dan het carbonaatgehalte in het CP van stalen behandeld volgens experimenten SC8 en SC10 (respectievelijk 2,45 en 2,52gew%; p ≤ 0,024). Het carbonaatgehalte in het CP van stalen behandeld volgens experimenten SC8 en SC10 verschilde onderling niet significant (p = 1,000).

3.7 Celstudie 3.7.1 Calceïne AM/PI kleuring

MC3T3-E1 cellen werden uitgezaaid op een staal van zuiver PCL, een met calcium en fosfaat

voorbehandeld

staal

en

stalen

behandeld volgens experimenten S3, E4 en SC10. Op de positieve controle was een confluente cellaag vastgehecht na 1 dag 2incubatie en de cellen vertoonden een mooi Figuur 17 CO3 -gehalte in gew% van stalen

behandeld volgens experimenten E2, E3, SC8

uitgespreide morfologie wat wees op adhesie (figuur en SC10. 18). Dode cellen werden

niet

teruggevonden. Na 1 dag incubatie was het aantal levende cellen op het staal van zuiver PCL veel minder in vergelijking met de positieve controle. Zowel ronde, niet vastgehechte cellen als niet goed vastgehechte langerekte spoelvormige cellen werden waargenomen (figuur 19a). Na 7 dagen incubatie was er bij het staal van zuiver PCL weinig verschil te zien

Figuur 18 Positieve controle voor

met de opnames na 1 dag incubatie. Spoelvormige cellen

de celcultuur.

met uitlopers werden waargenomen, alsook enkele dode cellen (figuur 19b). Na 14 dagen incubatie werden gebieden van hoge celdensiteit waargenomen met stervormige cellen met veel uitlopers. Het aantal dode cellen was duidelijk toegenomen na 14 dagen incubatie (figuur 19c).

38

De celdensiteit van levende en dode cellen op het voorbehandelde staal en het staal behandeld volgens experiment S3 na 1 dag incubatie was vergelijkbaar met de celdensiteit op het zuiver PCL staal na 1 dag incubatie. De cellen op het voorbehandelde staal waren spoelvormig en vertoonden uitlopers terwijl op het staal van experiment S3 zowel ronde als spoelvormige cellen met uitlopers aanwezig waren (figuur 19d en g). Op beide stalen was het aantal levende cellen toegenomen na 7 dagen incubatie. Op de plaatsen met de meest dense celpopulatie bevonden zich cellen met een uitgespreide morfologie en ster- en spoelvormige cellen. Gebieden met een minder dense celpopulatie waren overgroeid met ster- en

1 dag

14 dagen

7 dagen

a

b

c

d

e

f

g

h

i

Figuur 19 Calceïne AM/PI-kleuring van MC3T3-E1 cellen uitgezaaid op stalen van zuiver PCL (a, b, c), stalen die voorbehandeld zijn (d, e, f) en stalen behandeld volgens experiment S3 (g, h, i).

39

spoelvormige cellen. Een kleine hoeveelheid dode cellen werden waargenomen verspreid over het staal (figuur 19e en h). Na 14 dagen incubatie waren meer cellen aanwezig op de stalen t.o.v. het aantal cellen na 7 dagen incubatie. Celgrenzen waren moeilijk te bepalen en hier en daar konden uitlopers onderscheiden worden. De celdensiteit was iets hoger bij het staal van experiment S3 dan bij het voorbehandeld staal. Dode cellen werden in zeer beperkte mate waargenomen. Na 1 dag incubatie was de celdensiteit op de stalen behandeld volgens experimenten E4 en SC10 (figuur 20a, d) vergelijkbaar met de celdensiteit op het zuiver PCL staal. Op het staal van experiment E4 waren evenveel dode als levende cellen aanwezig. De levende cellen hadden overwegend een ronde morfologie wat wees op cellen die niet vastgehecht waren aan het oppervlak van het staal. Weinig niet goed vastgehechte cellen met uitlopers werden waargenomen. De weinige levende cellen op het staal van experiment SC10 hadden een morfologie vergelijkbaar met de cellen op de positieve controle. Op het staal van experiment E4 was de celdensiteit na 7 dagen incubatie niet noemenswaardig toegenomen ten opzichte van de situatie na 1 dag. De morfologie verschilde echter wel aanzienlijk: na 7 dagen waren de meeste cellen ster- en spoelvormig (figuur 20b) geworden en er waren zeer weinig dode 1 dag

14 dagen

7 dagen

a

b

c

d

e

f

Figuur 20 Calceïne AM/PI-kleuring van MC3T3-E1 cellen uitgezaaid op stalen behandeld volgens experimenten E4 (a, b, c) en SC10 (d, e, f)

40

cellen te zien. Bij het staal behandeld volgens experiment SC10 had zich een dense en bijna confluente cellaag ontwikkeld. De cellen hadden voornamelijk een uitgespreide morfologie. Een klein aantal cellen waren ster- of spoelvormig met uitlopers en er waren zeer weinig dode cellen te zien. Na 14 dagen bleken er bij zowel het staal behandeld volgens experiment E4 als het staal behandeld volgens experiment SC10 langgerekte cellen met uitlopers aanwezig te zijn (figuur 20c, f). Alleen is de celdensiteit ten opzichte van incubatie gedurende 7 dagen hoger bij het staal behandeld volgens experiment E4 en aanzienlijk lager bij het staal behandeld volgens experiment SC10. Celgrenzen zijn zeer moeilijk te onderscheiden vanwege het diffuus karakter van de opnames en er zijn zeer weinig dode cellen.

3.7.2 Celviabiliteitsassay

In figuur 21 wordt de celviabiliteit van MC3T3-E1 cellen op verschillende stalen na incubatie voor een bepaalde tijdsduur weergegeven. De foutenbalken geven één standaarafwijking weer. De celviabiliteit op zuiver PCL na 1 dag incubatie was 1,9% ten opzichte van de positieve controle na 14 dagen. Na 7 dagen bleek de celviabiliteit niet significant toe te nemen (p = 0,592). Na 14 dagen nam de celviabiliteit significant toe tot 6,5% (p = 0,017). Na 1 dag was er geen significant verschil in celviabiliteit tussen de stalen van de voorbehandeling en experiment S3 enerzijds en het staal van zuiver PCL anderzijds. Na 7 en na 14 dagen was de celviabiliteit echter significant hoger ten opzichte van het zuiver PCL staal (p = 0) terwijl de celviabiliteit van het voorbehandeld staal en het staal van experiment S3 op beide momenten onderling niet significant verschilde (p ≥ 0,738). De celviabiliteit van de stalen van experimenten E4 en SC10 was reeds na 1 dag significant hoger dan deze van het zuiver PCL (p ≤ 0,03). Na 7 dagen was de celviabiliteit van de stalen van experimenten E4 en SC10 significant hoger dan deze van het voorbehandelde staal en het staal van S3 (p ≤ 0,002), maar na 14 dagen verschilde de celviabiliteit tussen het voorbehandeld staal en de stalen van experimenten S3, E4 en SC10 onderling niet significant (p ≥ 0,4). De celviabiliteit van de stalen van experimenten E4 en SC10 onderling verschilde nooit significant (p ≥ 0,567).

41

Figuur 21 Celviabiliteit uitgedrukt in percentage van de viabiliteit van de positieve controle na 14 dagen.

4 Discussie Complexe

botdefecten

kunnen

behandeld

worden

met

een

synthetisch

botsubstitutiemateriaal om herstel te versnellen. Deze studie had tot doel een draagstructuur te ontwikkelen die bioactief, osteoconductief en biodegradeerbaar is en een geconnecteerde porositeit vertoont vergelijkbaar met de ECM van bot. Een dergelijke draagstructuur kan de verankering aan het eigen botweefsel en de ingroei van eigen botcellen bevorderen waarbij na verloop van tijd het implantaat volledig wordt vervangen door eigen botweefsel (6). Als draagstructuur werd een electrogesponnen PCL gekozen. Dit polymeer wordt reeds gebruikt voor onder andere langdurige afgifte van medicatie in het lichaam (7), resorbeerbare hechtingsdraden (9) en botfixatiesystemen (8). Om een structuur te bekomen vergelijkbaar met de ECM van bot, worden de PCL nanofibers bedekt met een calciumfosfaatlaagje waarvan de samenstelling en microstructuur vergelijkbaar is met botapatiet. Om dit te bereiken wordt het PCL eerst geactiveerd waardoor het hydrofieler wordt, daarna volgt een calcium en fosfaat voorbehandeling om er een primair calciumfosfaatlaagje op af te zetten en tenslotte wordt het behandeld met een SBF oplossing om dit primair laagje te laten aangroeien (22,23,30). In het labo Biomaterialen van de vakgroep Medische Basiswetenschappen (Universiteit Gent) werd reeds een optimale activatie en calcium en fosfaat voorbehandeling ontwikkeld om een primair CDHAp laagje met een lage concentratie carbonaat af te zetten op de nanofibers (tabel 5). Het primair carbonaatbevattend CDHAp laagje is zeer dun en glad waardoor het op SEM opnames bijna nooit waargenomen kan worden (figuur 6c). De aanwezigheid van CO32- en HPO42- (dat verantwoordelijk is voor de calciumdeficiëntie van 42

het CDHAp) in het kristalrooster resulteert in een minder stabiel en dus meer oplosbaar apatiet dat beter lijkt op botapatiet dan stoichiometrisch HAp. Het gewichtspercentage CO32in het primair laagje is heel laag, terwijl Pieters et al.(31) aantoonden dat gewichtspercentages van 11% of hoger nodig zijn om goede bioactiviteit van het CDHAp te bekomen. Het doel van dit onderzoek was het primaire carbonaatbevattend CDHAp laagje op de nanofibers homogeen te laten aangroeien en de inbouw van CO32--ionen in het kristalrooster te verhogen. Gezien het groot belang van de geconnecteerde poriënstructuur mag het CP niet te sterk aangroeien; dit zou immers het transport van nutriënten, metabole afbraakproducten en de ingroei van botcellen bemoeilijken. 4.1 Preliminaire testen

Verschillende onderzoeksgroepen gebruikten SBF oplossingen om een CP op nanofibers te laten aangroeien

(22,23,29,32)

. Zo bijvoorbeeld gebruikten Yang et al.(22) een niet gebufferde

10xSBF oplossing om HAp en DCPD op PCL nanofibers te precipiteren. De nanofibers werden hierna voor een langere periode in een TRIS/HCl gebufferde1xSBF oplossing (pH 7,4) ondergedompeld om de HAp en DCPD laag te transformeren tot carbonaatbevattend CDHAp. Mavis et al.

(32)

gebruikten 10xSBF oplossingen met verschillende combinaties van

concentraties van fosfaat en carbonaat om onder andere CDHAp, ACP en DCPD op de nanofibers te precipiteren. In deze studie werden de hierboven beschreven SBF recepten overgenomen of lichtjes aangepast om de eerste oriënterende experimenten uit te voeren met de voorbehandelde PCL stalen. Na behandeling met deze SBF oplossingen waren de meeste stalen bijna volledig wit na ARS kleuring (tabel 2). Het carbonaatbevattend CDHAp laagje aanwezig op de nanofibers was dus onverwacht zo goed als volledig opgelost in de SBF oplossing. Omdat apatiet het meest stabiele CP is bij pH > 4,3 werd verwacht dat bij gebruik van de 10xSBF oplossing met pH 4,13 het CDHAp zou oplossen en dat DCPD, het meest stabiele CP bij pH < 4,3 zou neerslaan op de nanofibers

(47)

. Bij het gebruik van de 1x en

5xSBF oplossingen beiden met pH = 7,4 werd verwacht dat het primaire CDHAp laagje zou aangroeien. Blijkbaar is de aanwezigheid van kleine concentraties HPO 43-- en CO32-- ionen in het kristalrooster voldoende om het apatiet oplosbaar te maken bij pH = 7,4 in de ionenrijke SBF oplossing. Wanneer voorbehandelde stalen behandeld werden met een 1xSBF oplossing die gebufferd werd met Borax/HCl tot pH = 8,5 bleek het carbonaatbevattend CDHAp op de stalen niet in oplossing te gaan. De kristalstructuur bij pH = 8,5 was wél stabiel. Om de pH zo

43

hoog mogelijk te houden bij de optimalisatie van de maturatiestap werden de SBF oplossingen gebufferd met Borax/HCl.

4.2 Optimalisatie van maturatie

Behandelingen met SBF oplossingen met verschillende samenstellingen werden getest om de fibers te bedekken met een optimaal laagje carbonaatbevattend apatiet. Ongeacht de carbonaat- en fosfaatbron en de ionenconcentraties werd bij de behandeling van de stalen met een 1xSBF1xCO3 (pH 8,5) of 1xSBF10xCO3 (pH 8) oplossing gedurende max. 24h (experimenten S1, S2, S4, SC1, SC2 en SC4) geen aangroei van het CDHAp laagje waargenomen (tabel 3, figuur 8-S2, tabel 6, figuur 11a, b, figuur 12-SC1, SC4). Hierdoor kon ook geen carbonaat in het apatiet rooster ingebouwd worden. De zo goed als afwezige maturatie van het carbonaat bevattend CDHAp laagje kan te wijten zijn aan de lage concentratie van calcium en fosfaat in deze SBF oplossingen. Op de stalen van experimenten SC1 en SC2 werd echter carbonaatbevattend ACP gedetecteerd. Het gebruik van Na2CO3 en het constant houden van de ionenconcentraties in de SBF oplossing zorgde blijkbaar voor dissolutie van het CDHAp en precipitatie van ACP. Hoewel carbonaatbevattend CDHAp de fase is die het meest lijkt op het botapatiet is de vorming van ACP ook wenselijk omdat dit CP een precursor is voor het botapatiet. Verder werd aangetoond dat ACP zelfs een betere osteoconductiviteit in vivo vertoont dan HAp

(48)(49)

. Omdat ACP zoals het botapatiet in vivo

gemakkelijker degradeert dan het meer kristallijne HAp zal dit bevorderlijk zijn voor de osteointegratie van implantaten die bedekt zijn met een laagje ACP

(49)

en het verdwijnen van

degradeerbare botsubstitutiematerialen na verloop van tijd. Indien duurzame coatings van implantaten vereist zijn, zou geopteerd moeten worden voor het gebruik van HAp. Op de stalen van experimenten S4 en SC4 behandeld met 1xSBF10xCO3 (pH 8) oplossing werd naast carbonaatbevattend HAp ook een klein beetje DCPD gevonden (tabel 5, 8). Dit kan verklaard worden door de iets lagere pH van de SBF oiplossing tov de 1xSBF1xCO3 (pH 8,5) oplossing waarbij HAp minder stabiel en DCPD stabieler wordt. De pH van de 1xSBF10xCO3 oplossing werd immers verlaagd om neerslag van CaCO3 als gevolg van de hoge concentratie CO32- (10x) te vermijden. De carbonaat- en fosfaatbron en de ionenconcentraties verschilden in de 5xSBF1xCO3 oplossing gebruikt voor experimenten S3 en SC3 (tabel 4, 7). Deze verschillen hadden geen invloed op het type CP dat werd gevormd na behandeling van de stalen maar wel op de aangroei van het CP. Bij experiment S3 was er een aanzienlijke massatoename met een 44

heterogene maar aanvaardbare bedekking van de nanofibers (tabel 3, figuur 8-S3), terwijl er bij experiment SC3 geen goede bedekking van de nanofibers was maar er veel enorm grote kristallen werden gevormd die resulteerden in een hoge massatoename (tabel 6, figuur 12SC3). Op de stalen van beide experimenten werd na 24h behandeling DCPD gevormd, een precursor voor botapatiet

(4,33,34,35)

. De aanwezigheid van DCPD werd verwacht aangezien de

pH van de 5xSBF1xCO3 oplossing diende verlaagd te worden tot 6,6 om neerslag van CP in de SBF oplossing als gevolg van de hoge concentratie van calcium en fosfaat (5x) te vermijden. Ook in de 3,7xSBF7xCO3 oplossing gebruikt bij experimenten S5 en SC5 verschilden de carbonaat- en fosfaatbron en de ionenconcentraties. Hierbij werden er naast een verschil in massatoename (tabel 3, 6), ditmaal veel hoger bij de S-reeks, ook verschillende types CP geobserveerd (5, 8) bij de verschillende experimenten hoewel de gebruikte SBF oplossingen ongeveer dezelfde pH hadden (tabel 4, 7). Ondanks de hoge concentratie CO 32- (7x) in de SBF oplossing werd dit in geringe mate ingebouwd in het kristalrooster. Bij zowel experiment S5 als experiment S10 werd carbonaatbevattend CDHAp gevormd. De massatoename bij experiment S5 was ongeveer vijfmaal hoger dan bij experiment S10, ondanks de vergelijkbare ionenconcentraties in beide SBF oplossingen. De langere tijdsduur van de behandeling bij experiment S5 speelt hier waarschijnlijk een rol bij. Ook bij experiment S10 werd er ondanks de hoge concentratie (11,94x) weinig CO 32- ingebouwd in het kristalrooster. In tegenstelling tot de resultaten van een andere studie

(46)

blijkt NaHCO3 niet geschikt om

hoge gewichtspercentages carbonaat in het kristalrooster in te bouwen bij de parameters gebruikt in deze studie. Het zout NaHCO3 zal in waterige oplossing volledig dissociëren tot Na+ en HCO3-. Verdere dissociatie van HCO3 - tot H- en CO32- wordt bepaald door de pKa2 van het overeenkomstige zuur H2CO3. Deze pKa2 = 10,329 is groot waardoor HCO3- niet geneigd is om een proton te verliezen. Aangezien CO32- en niet HCO3- ingebouwd wordt in het CP kristalrooster is het niet verwonderlijk dat gebruik van NaHCO3 als carbonaatbron geen of heel weinig inbouw van carbonaat in het kristalrooster geeft. Bij de experimenten SC5-SC10, waarbij Na2CO3 werd gebruikt als carbonaatbron, werd een positieve correlatie gezien tussen de carbonaat/fosfaat concentratieverhouding in de SBF oplossingen en het gewichtspercentage carbonaat ingebouwd in het gevormde CP (tabel 7). Bij carbonaat/fosfaat verhoudingen < 11 werd op de stalen ongeveer evenveel carbonaat bevattend HAp samen met kleine hoeveelheden DCPD gevormd, maar zonder extra inbouw van carbonaat in het HAp rooster (experimenten SC5 en SC7). Wanneer de carbonaat/fosfaat 45

verhouding steeg tot tussen 11 en 16 was op de stalen ACP gevormd dat 2,45 – 2,52gew% carbonaat bevatte (experimenten SC8 en SC10). Indien de carbonaat/fosfaat verhouding in de SBF oplossing steeg tot hoger dan 16 werd naast ACP ook CaCO3 gevormd. Het carbonaat substitueerde voornamelijk PO43--ionen (B-type substitutie) in het CP kristalrooster volgens het mechanisme (50):

Ca2+ + PO43- + OH- ↔ VCa + CO32- + VOH Ca2+ + PO43- ↔ Na+ + CO32Hierbij verdwijnt een Ca2+- en een OH--ion uit het kristalrooster (Vx = vrije plaats in het kristalrooster waar zich normaal ion x bevindt) om elektroneutraliteit te behouden. Soms werden ook OH--ionen gesubstitueerd door carbonaat (A-type substitutie) volgens volgend mechanisme (50): 2OH- ↔ CO32- + VOH Van de experimenten van de SC-reeks bleek experiment SC10 aanleiding te geven tot de beste CP coating: de bedekking van de nanofibers was zeer homogeen met behoud van de geconnecteerde poriënstructuur en het hoogste gewichtspercentage CO32- werd ingebouwd in het kristalrooster. Behandeling volgens experiment S10 resulteerde in een homogene en reproduceerbare ACP bedekking waarbij de geconnecteerde poriënstructuur goed behouden bleef. De concentratie carbonaat ingebouwd in het ACP rooster was echter laag. Daarom werd geopteerd om NaHCO3 en K2HPO4, aanwezig in de SBF oplossing van experiment S10, te vervangen door Na2CO3 en KH2PO4. Door verder de buffer te veranderen en de inonenconcentraties al dan niet constant te houden (tabel 10) werd getracht om hogere concentraties aan carbonaat in te bouwen. Stalen behandeld met een SBF oplossing gebufferd met Borax/HCl vertoonden een vergelijkbare aangroei van het CP laagje met vorming van ACP, een goed zichtbare homogene fiberbedekking zonder verlies van de geconnecteerde poriënstructuur en een laag CO32--gehalte (experimenten S10 en E1, tabel 9, figuur 15, 16). DCPD werd gedetecteerd wanneer de concentraties van Na+-, SO42--, Mg2+- en K+-ionen werden gelijkgesteld aan de ionenconcentraties in 1xSBF (tabel 9, figuur 14, 17). Wanneer SBF oplossingen gebufferd 46

werden met TRIS/HCl resulteerde dit in de vorming van HAp, een overvloedige afzetting hiervan op de stalen met verlies van de geconnecteerde poriënstructuur en een CO 32-- gehalte van 4gew%. Ook hier werd DCPD gedetecteerd wanneer de concentraties van Na+-, SO42--, Mg2+- en K+-ionen werden gelijkgesteld aan de ionenconcentraties in 1xSBF (tabel 9, figuur 14, 17). Om de overvloedige 3,7gew% carbonaatbevattend HAp bedekking op de stalen van experiment E3 te verminderen werd de onderdompelingstijd in de S10TRIS oplossing verlaagd (experimenten E4 – E6). De bedekking van de nanofibers werd inderdaad optimaler met beter behoud van de geconnecteerde poriënstructuur maar er werd nu naast carbonaatbevattend HAp ook DCPD en ACP gevormd

4.3 Celstudie

Celviabiliteitsassays werden uitgevoerd op vijf verschillende stalen. Zuiver PCL werd geselecteerd om de meerwaarde van een bedekking met CP aan te tonen. Een staal dat enkel een calcium en fosfaat voorbehandeling onderging en een staal behandeld volgens S3 werden geselecteerd omdat de fibers van deze stalen beide bedekt waren met een dun laagje maar met een verschillend type CP (respectievelijk carbonaat bevattende CDHAp en DCPD). Stalen van experimenten E4 en SC10 werden geselecteerd om het effect van een dikkere gematureerde bedekking van de nanofibers met respectievelijk HAp (3,5gew% CO 32-) en ACP (2,5gew% CO32-) te achterhalen. Celviabiliteit werd gedetecteerd met een calceïne AM/PI kleuring (figuren 19 en 20) en een PrestoBlue™ assay (figuur 21). Na 1 dag incubatie was er zoals verwacht op geen van de stalen duidelijke toename van celviabiliteit van de MC3T3-E1 cellen te zien. Bij het staal van zuiver PCL was er slechts na 14 dagen incubatie een significante toename van de celviabiliteit te zien die zeer laag was in vergelijking met de andere stalen, duidend op een gebrekkige ondersteuning van celproliferatie van dit scaffold. De dunne, lange uitlopers en weinig langgerekte cellen duiden op slechte adhesie aan het zuiver PCL. Bij het voorbehandeld staal en het staal behandeld volgens experiment S3 nam de celviabiliteit over de 14 dagen toe met een duidelijke trend. Gebieden van dense celpopulaties met langgerekte cellen werden reeds vanaf dag 7 waargenomen. Stalen bedekt met HAp of DCPD bieden dus een aanzienlijk voordeel betreffende celadhesie, morfologie en proliferatie ten opzichte van zuiver PCL. Bij de calceïne AM/PI kleuring en een PrestoBlue™ assay van experimenten E4 en SC10 was er moeilijk een duidelijke trend te zien. De PrestoBlue™ assay detecteerde een extreme gemiddelde toename van de celviabiliteit na 7 dagen, weliswaar met een zeer grote standaardafwijking. Op de foto’s van de kleuringen was er na 7 dagen op het 47

staal van experiment SC10 inderdaad een dense populatie van goed uitgespreide cellen te zien (figuur 20e) maar op het staal van experiment E4 was maar een kleine toename in celdensiteit ten opzichte van de situatie na 1 dag te zien (figuur 20b). Op de foto’s van deze experimenten is er na 14 dagen moeilijk een dense celpopulatie te onderscheiden. Na 14 dagen was de gemiddelde celviabiliteit, bepaald met PrestoBlue™, vergelijkbaar met deze van de voorbehandeling en experiment S3, hier ook met een zeer grote standaardafwijking. Uit de resulaten van de calceïne AM/PI kleuring en de PrestoBlue™ assay kan men besluiten dat de viabiliteit en morfologie van de cellen bij experiment SC10 na 7 dagen superieur was ten opzichte van andere experimenten. Een coating van carbonaatbevattend ACP is dus bruikbaar om de bioactiviteit van een polymeer draagstructuur te verbeteren. Omdat de standaardafwijking van de resultaten van de PrestoBlue™ assay bij dit experiment zo hoog was, zou in de toekomst nog een celstudie moeten uitgevoerd worden ter bevestiging. 4.4 Conclusie

Maturatie van het primair laagje CDHAp op PCL nanofibers kan bereikt worden door deze te behandelen met een SBF oplossing. Naargelang de samenstelling van deze oplossing kunnen andere fasen van CP neerslaan op de nanofibers en/of kan het primair laagje worden omgezet tot een andere fase. Verschillen in de pH, de gebruikte carbonaatbron, de gebruikte fosfaatbron en de ionsterkte van de SBF oplossing, alsook de tijdsduur van de behandeling, gaven aanleiding tot precipitatie van (combinaties van) HAp, DCPD of ACP op de draagstructuur. Deze drie fasen van CP zijn precursoren van het natuurlijk botapatiet en zijn dus bruikbaar bij het vervaardigen van een draagstructuur die in het lichaam wordt geïmplanteerd. In het bijzonder werd getracht een optimale bedekking van de nanofibers te bekomen en carbonaat in te bouwen in het kristalrooster van het CP. Wanneer Na 2CO3 als carbonaatbron en KH2PO4 als fosfaatbron werd gebruikt, werd consistent meer carbonaat in het kristalrooster ingebouwd met concentraties van 2,5 tot 4gew%. In deze groep experimenten resulteerde behandeling van een calcium en fosfaat voorbehandeld staal met een Borax/HCl-gebufferde 2,59xSBF9,59xCO3 oplossing gedurende 24h in de meest optimale vezelbedekking, bestaande uit ACP met 2,5gew% carbonaat. MC3T3-E1 cellen werden uitgezaaid op een staal van zuiver PCL, een staal bedekt met een primair laagje CP en enkele stalen bedekt met gematureerde lagen CP. Alle stalen waarop CP geprecipiteerd was vertoonden een significante verbetering van celviabiliteit en dus bioactiviteit ten opzichte van het staal van zuiver PCL. Stalen met carbonaatbevattend 48

(3,5gew%) HAp of carbonaatbevattend ACP (2,5gew%) vertoonden na 7 dagen incubatie een significant betere celviabiliteit dan het voorbehandeld staal. Maturatie van het primair CDHAp laagje en inbouw van carbonaat bevordert dus celproliferatie.

Referentielijst 1. Marieb, EN, Mallatt, J en Wilhelm, PB. Human Anatomy. San Francisco, CA : Pearson, 2008. 2. SEER Training Modules - Structure of Bone Tissue. National Cancer Institute. [Online] [Citaat van: 10 04 2012.] http://training.seer.cancer.gov/anatomy/skeletal/tissue.html. 3. B Wopenka, JD Pasteris. A mineralogical perspective on the apatite in bone. 2005, Materials Science and Engineering C25, pp. 131-143. 4. Driessens, FCM en Verbeeck, RMH. Biominerals. sl : CRC Press, 1990. 5. Holzwarth, JM en Ma, PX. Biomimetic nanofibrous scaffolds for bone tissue engineering. 2011, Biomaterials 32, pp. 9622-9629. 6. Brandt, J, et al. Nanostructured materials for skeletal repair. 2010, Macromolecular Symposia 294-I, pp. 109-119. 7. Xia, W, Jiang, GH en Chen, WX. Synthesis and drug-release properties of hyperbranched polyesters grafted with biocompatible poly(epsilon-caprolactone). 2008, Journal of applied polymer science 109-4, pp. 2089-2094. 8. Paivarinta, U, et al. Intraosseous cellular response to biodegradable fracture fixation screws made of polyglycolide or polylactide. 1993, Archives of orthopaedic and trauma surgery 112-2, pp. 71-74. 9. Hu, W, Huang, ZM en Liu, XY. Development of braided drug-loaded nanofiber sutures. 2010, Nanotechnology 21, pp. 1-11. 10. Li, D en Xia, Y. Electrospinning of nanofibers: reinventing the wheel? 2004, Advanced Materials 16-14, pp. 1151-1170. 11. Centropede. [Online] [Citaat van: 10 04 2012.] http://www.centropede.com/UKSB2006/ePoster/background.html. 12. Dong, Y, et al. Degradation behaviors of electrospun resorbable polyester nanofibers. 2009, Tissue Engineering 15-3, pp. 333-351. 13. Park, K, et al. Surface modification of biodegradable electrospun nanofiber scaffolds and their interaction with fibroblasts. 2007, Journal of Biomaterials Science - Polymer Edition 18-4, pp. 369-382. 14. Middleton, JC en Tipton, AJ. Synthetic biodegradable polymers as orthopedic devices. 2000, Biomaterials 21, p. 2335. 15. Reed, AM en Gilding, DK.Biodegradable polymers for use in surgery - poly(glycolic)-poly(lactic acid) homo and copolymers. 1981, Polymer 22, p. 494. 16. Yang, F, et al. Electrospinning of nano/micro scale poly(L-lactic acid) aligned fibers and their potential in neural tissue engineering. 2005, Biomaterials 26, p. 2603. 17. Xu, CY, et al. In vitro study of human vascular endothelial cell function on materials with various surface roughness. 2004, Journal of Biomedical Materials Research Part A 71A, p. 154. 18. Boudriot, U, et al. Role of electrospun nanofibers in stem cell technologies and tissue engineering. 2005, Symposium On Macromolecules 225, p. 9. 19. Powell, HM en Boyce, ST. Engineered human skin fabricated using electrospun collagen–PCL blends: morphogenesis and mechanical properties. 2009, Tissue Engineering: Part A 15-8, pp. 2177-2187. 20. Jackers, G. Ontwikkeling van biodegradeerbare implantaten voor botweefselregeneratie. 2002, Doctoraatsproefschrift. 21. Venugopal, J en Ramakrishna, S. Biocompatible nanofiber matrices for the engineering of a dermal substitute for skin regeneration. 2005, Tissue Engineering 11, p. 847. 22. Yang, F, Wolke, JG en Jansen, JA. Biomimetic calcium phosphate coating on electrospun poly(εcaprolactone) scaffolds for bone tissue engineering. 2008, Chemical Engineering Journal 137, pp. 154-161. 23. Araujo, JV, et al. Surface controlled biomimetic coating of polycaprolactone nanofiber meshes to be used as bone extracellular matrix analogues. 2008, Journal of Biomaterials Science, Polymer Edition 19-10, pp. 1261-1278. 24. Shin, M, et al. Contractile cardiac grafts using a novel nanofibrous mesh. 2004, Biomaterials 25, p. 3717. 25. Hollinger, JO. Preliminary-report on the osteogenic potential of a biodegradable co-polymer of polyactide (Pla) and polyglycolide (Pga) 17. 1983, Journal of Biomedical Materials Research, p. 71. 26. Ishii, D, et al. In vivo tissue response and degradation behavior of PLLA and stereocomplexed PLA nanofibers. 2009, Biomacromolecules 10-2, pp. 237-242.

49

27. Ngiam, M, et al. The fabrication of nano-hydroxyapatite on PLGA and PLGA/collagen nanofibrous composite scaffolds and their effects in osteoblastic behavior for bone tissue engineering. 2009, Bone 45, pp. 416. 28. Agrawal, CM en Athanasiou, K. Technique to control pH in vicinity of biodegrading PLA-PGA implants. 1997, Journal of Biomedical Materials Research 38, pp. 105-114. 29. Zou, B, et al. Degradation behaviors of electrospun fibrous composites of hydroxyapatite and chemically modified poly(DL-lactide). 2011, Polymer Degradation and Stability 96, pp. 114-122. 30. Chen, J, Chu, B en Hsiao, BS.Mineralization of hydroxyapatite in electrospun nanofibrous poly(L-lactic acid) scaffolds. 2006, Journal of Biomedical Materials Research Part A 97A-2, pp. 307-317. 31. Pieters, IY, et al. Carbonated apatites obtained by the hydrolysis of monetite: influence of carbonate content on adhesion and proliferation of MC3T3-E1 osteoblastic cells. 2010, Acta Biomaterialia 6, pp. 1561-1568. 32. Mavis, B, et al. Synthesis, characterization and osteoblastic activity of polycaprolactone nanofibers coated with biomimetic calcium phosphate. 2009, Acta Biomaterialia 5, pp. 3098–3111. 33. Stulajterová, R en Medvecký, L. Effect of calcium ions on transformation brushite to hydroxyapatite in aqueous solutions. 2008, Colloids and surfaces A 316, pp. 104-109. 34. Spanos, N, et al. Seeded growth of hydroxyapatite in simulated body fluid. 2006, Journal of Materials Science 41, pp. 1805-1812. 35. Arcos, D, Izquierdo-Barba, I en Vallet-Regí, M. Promising trends of bioceramics in the biomaterials field. 2009, Journal of Materials Science Mater M 20, pp. 447-455. 36. Oliveira, AL, Malafaya, PB en Reis, RL. Sodium silicate gel as a precursor for the in vitro nucleation and growth of a bone-like apatite coating in compact and porous polymeric structures. 2003, Biomaterials 24, pp. 2575-2584. 37. Kawashita, M, et al. Apatite-forming ability of carboxyl group-containing polymer gels in a simulated body fluid. 2003, Biomaterials 24, pp. 2477–2484. 38. Madurantakam, PA, et al. Multiple factor interactions in biomimetic mineralization of electrospun scaffolds. 2009, Biomaterials 30, pp. 5456-5464. 39. Puchtler, H, Meloan, SN en Terry, MS. On the history and mechanism of alizarin red s stains for calcium. 1969, The Journal of Histochemistry and Cytochemistry 17, pp. 110-124. 40. Paul, H, Reginato, AJ en Schumacher, HR. Alizarin red S staining as a screening test to detect calcium compounds in synovial fluid. 1983, Arthritis and rheumatism 26-2, pp. 191-200. 41. Walters, FH, et al. Sequential Simplex Optimization. Boca Raton : CRC Press LLC, 1991. 42. Godinot, C, et al. Chromatographic assay of carbonates in the submilligram range – application to carbonate assay in calcified tissue. 1984, Microchemical Journal 29-1, pp. 92–105. 43. PrestoBlue™ Cell Viability Reagent. Life Technologies. [Online] [Citaat van: 11 04 2012.] http://www.invitrogen.com/site/us/en/home/brands/Molecular-Probes/Key-Molecular-ProbesProducts/PrestoBlue-Cell-Viability-Reagent.html. 44. R&D Systems, Inc. Calcein AM - Cell Viability Assay. [Online] [Citaat van: 27 04 2012.] http://www.rndsystems.com/pdf/4892-010-k.pdf. 45. Molecular Probes, Inc. Propidium Iodide Nucleic Acid Stain. [Online] [Citaat van: 26 04 2012.] http://www.cbm.uam.es/confocal/Manuales/Ioduro%20propidio.pdf. 46. Müller, L en Müller, FA. Preparation of SBF with different HCO3- content and its influence on the composition of biomimetic apatites. 2006, Acta Biomaterialia 2, pp. 181-189. 47. Fernández, FJ et al. Calcium phosphate bone cements for clinical applications. 1999, Journal of Materials Science 10, pp. 169-176. 48. Li, YB et al. Amorphous calcium phosphates and its biomedical application. 2007, J Inorgan Mater 22, pp. 775-782. 49. Nafanoi, M et al. Differences of bone bonding ability and degradation behaviour in vivo between amorphous calcium phosphate and highly crystalline hydroxyapatite coating. 1996, Biomaterials 17, pp. 17711777. 50. De Maeyer, EAP en Verbeeck, RMH.Possible substitution mechanisms for sodium and carbonate in calciumhydroxyapatite. 1993, Bull Soc Chim Belg vol 102, pp. 601-609.

50