MATERI DAN METODA Penelitian dilaksanakan di Laboratorium Nutrisi Temak Perah dan Laboratorium Mikrobiologi Nutrisi, Fakultas Petemakan, Institut Pertanian Bogor, selama 10 bulan (Agustus 1996-April 1997). Penelitian dilakukan dalam dua tahap percobaan yang meliputi: 1) percobaan in viiro selama 1 bulan, yaitu penelusuran kadar urea ransum penelitian, 2) percobaan in vivo selama 9 bulan yaitu penelusuran taraf suplementasi minyak lernuru dan seng (ZnS04) pada ransum penelitian dalam memacu pertumbuhan. Percobaan 1. Penelusuran kadar urea ransum penelitian
Percobaan ini merupakan pra percobaan untuk menelusuri taraf penggunaan urea yang tepat pada pakan silase pod kakao, sehingga lebih mudah difermentasi dan sekaligus dapat memasok amonia
(m')untuk sintesis protein mikroba.
Materi yang digunakan dalam percobaan ini adalah silase pod kakao yang sudah
megalami proses ensiling (fermentasi anaerob) selama 3 minggu sebagai pakan, cairan rumen sapi dicampur dengan larutan penyangga sebagai sumber media dan urea sebagai suplemen. Rancangan percobaan yang digunakan adalah rancangan acak lengkap (RAL) dengan perlakuan 4 taraf dosis urea yaitu 0,O. 5, 1.0 dan 1.5 % .kg-' bahan kering silase pod kakao dan 5 ulangan. Parameter yang diamati adalah kecernaan bahan kering dan 'r
bahan organik silase pod kakao. Data yang diperoleh dianalisis menggunakan sidik ragam dan dilanjutkan dengan uji kontras orthogonal polinomial untuk mengetahui respons terbaik yang akan
digunakan sebagai dasar pemberian urea dalam ransum yang mengandung silase pod kakao pada percobaan 2. Percobaan 2: Penelusuran taraf suplementasi minyak lemuru dan seng (ZnS04) pada ransum penelitian dalam memacu pertumbuhan sapi
Tujuan utama percobaan ini adalah untuk rnenelusuri taraf suplementasi minyak lemuru dan seng yang dapat mengoptimalkan absorpsi seng dan aktivitas enzim yang berperan dalam memanfaatkan zat-zat nutrisi ransurn yang mengandung silase pod kakao untuk rnamacu pertumbuhan sapi. Percobaan menggunakan anak sapi Holstein jantan umur 6-7 bulan ber- bobot 91
+ 11.7 kg. Ransum basal yang digunakan terdiri atas 25% silase pod kakao dan 75% konsentrat. Ke dalarn ransum tersebut ditambahkan 1% urea (hasil percobaan 1 yaitu yang menghasilkan kecernaan tertinggi). Konsentrat disusun dari onggok, polar dan bunglul kedele, sehingga ransum rnengandung TDN 70% dan PK 16% (NRC, 1988). Konsentrat yang disediakan sesuai kebutuhan diberikan dua kali sehari, sedangkan silase pod kakao diberikan secara ad libitum. Air minurn disediakan sepanjang hari. Rancangan percobaan yang digunakan adalah rancangan acak kelompok
(RAK) pola faktorial 4 x 3. Faktor A adalah suplementasi seng (ZnS04) sebanyak 0, 25, 50 dan 75 mg.kg-' bahan kering ransum dan faktor B adalah suplementasi rninyak lemuru sebanyak 0, 1.5 dan 3% dari bahan kering ransurn. Ternak dibagi dalam tiga kelompok sebagai ulangan dan pengelornpokannya didasarkan pada bobot badan. Peubah yang diukur selain parameter yang lazirn digunakan untuk mengevaluasi ransum, juga dilakukan pengukuran jumlah koloni bakteri (pernbiakan dalam media non
selektif),jumlah sel protozoa (preparat natif), konsentrasi VFA ( khromatografi gas) dan konsentrasi N-arnonia cairan rumen frnikrodufbsi Conway). Selain itu juga diukur konsentrasi prostaglandin E2 (PGE2) (kit Amersham's PGE2assay system No. RPA 530 serapan atom), absorpsi dengan tracer '25~), kadar seng dalam serum (~~pektrofotometri seng (balans trial), aktivitas alkalin fosfatase (Sigma Diagnostics kit No. 104), kadar asam lemak daging dan kadar alantoin urin (ipektrofotometri)dan pendugaan komposisi tubuh menggunakan teknik ruang urea (Rule et al., 1986). Pengambilan sarnpel darah sebanyak 10 ml dilakukan 3-4 jam sesudah makan melalui vena jugularis menggunakan tabung venoject berheparin yang steril untuk analisa komposisi tubuh, sedangkan untuk analisa prostaglandin, aktivitas enzim alkalin fosfatase dan kadar seng menggunakan tabung biasa. Pengambilan sampel cairan rumen dilakukan menggunakan stomach tube 3 jam sesudah makan. METODE ANALISIS 1. Prosedur Pengukuran Pertambahan Bobot Sapi
Pertambahan bobot sapi harian diperoleh dari selisih bobot awal dan bobot akhir (kg) dibagi dengan jumlah hari dalam masa koleksi data. Penimbangan bobot sapi dilakukan dua rninggu sekali untuk menentukan jumlah ransum yang disediakan. 2. Prosedur Pengukuran Kecernaan Zat-zat Makanan
Kecernaan zat-zat makanan diukur dengan metode trial). Periode koleksi dilaksanakan selama 7 hari
koleksi total (balans
berturut-turut sebelum akhir
pengamatan. Selarna periode koleksi tersebut, setiap hari konsumsi
ransum
dan
jumlah bahan kering feses serta volume urin yang dikeluarkan selama 24 jam diukur. Ke dalam tempat penampung urin ditambahkan 10 tetes &So4 10%. Sampel feses dan urin diambil sebanyak 5% setelah masing-masing dihomogenkan terlebih dahulu. Setelah 7 hari koleksi, sampel ransum dan feses dikompositkan, kemudian diambil sampel untuk
analisis zat-zat makanan yang terkandung di dalamnya.
Selanjutnya kecemaan zat-zat makanan dihitung menggunakan rumus berikut : Kecernaan (%) = (Zat yang dikonsumsi - zat dalam feses)/zat yang dikonsumsi x 100%
3. Prosedur Pengukuran Retensi Nitrogen
Sampel urin yang diambil selama periode koleksi, dianalisis kadar nitrogen totalnya. Jumlah retensi nitrogen dihitung:
-
-
Retensi N = Konsumsi N N feses N urin 4. Prosedur Pencacahan Jumlah Koioni Bakteri Rumen
Jumlah koloni bakteri rumen dicacah dengan menggunakan metoda pencacahan koloni bakteri yaitu kira-kira 15 menit setelah cairan rumen diambil melalui stomach tube langsung diinokulasikan. Bakteri yang dicacah hanya yang hidup (viable count).
Prinsip perhitungannya adalah: mula-mula cairan rumen diencerkan secara serial lalu dilakukan pembiakan (kultivasi) bakteri dalam tabung Hungate selama 7 hari dalarn suasana anaerob dan pada suhu 39' C. Media kultivasi yang digunakan adalah "nonselective media". Prosedur yang dilakukan mengikuti petunjuk Suryahadi (1990). Bahan-bahan yang digunakan untuk 100 media adalah 16.5 ml larutan A, 16.5 ml larutan B, 16.5 ml cairan rumen steril, 0.1 g pepton, 0.1 g ekstrak ragi (yeast extract), 0.5 g
NaHC03, 0.2 g glukosa, 0.1 ml resazurin 0.1% dan 50 ml H20. Larutan A terbuat dari campuran (per liter): 3.0 g KH2P04, 6.0 g NaCI, 3.0 g (r\TI-I4)2SO4,0.3 g CaC12 dan 0.3 g MgS04. Larutan B adalah (per liter): 3.0 g K21-p04 Bahan-bahan tersebut dicampur dalam botol yang dapat distcrilisasi dalaln autoclave. Campuran tersebut pertama dipanaskan perlahan-lahan sambil terus dialirkan gas CO2 sampai tejadi perubahan warna dari merah ke coklat muda. Sesudah itu scgera didinginkan dengan meletakkan botol tersebut di dalam air es.
Kemudian media
dipindahkan ke tabung Hungate masing-masing sebanyak 5 ml di mana tabung tersebut sebelurnnya sudah diisi dengan agar sebanyak 0.075 g (sekitar 1.5% dari jurnlah mcdia), lalu tabung ditutup untuk selanjutnya disterilisasikan dalam autoclave pada suhu 110' C selama 45 menit. Sebelum inokulasi, media tersebut diletakkan dalam penangas air pada suhu 4 7 ' ~ (pada suhu tersebut agar belum memadat dan dalam waktu singkat tidak mematikan bakteri waktu diinokulasi). Untuk kultivasi setiap sampel cairan rumen dimasukkan kc dalam 5 tabung Hungate yang berisi media yang tidak mengandung agar sebagai pengencer. Dengan menggunakan syring steril (satu ml), dilakukan inokulasi dan pengenceran serial dengan cara sebagai berikut:
0.5 ml cairan rumen sampel
dimasukkan ke dalarn tabung nomor 1, lalu kocok sampai homogen. Kemudian dari tabung nomor 1 tersebut diarnbil 0.5 rnl dan dimasukkan ke tabung nomor berikutnya dan demikian seterusnya sampai tabung nomor 5. Sesudah itu dari tabung nomor 5 dikocok dan diambi10.5 rnl dan dimasukkan ke dalam tabung media agar nomor 3, dari tabung pengencer nomor 4 dimasukkan 0.5 rnl ke dalam tabung media agar nornor 2
dan terakhir dari tabung pengencer nomor 3 ke tabung media agar nomor 1 (masingmasing untuk populasi bakteri lo6 , 10' dan 10'' ). Apabila pada tabung media agar nomor 3 terdapat n koloni, maka jumlah koloni bakteri dari cairan rumen sampel tersebut adalah: (n/0.5)(10'~) bakteri per ml cairan rumen. Jumlah koloni bakteri tersebut merupakan rataan dari perhitungan pada tabung media agar nomor 1 , 2 dan 3.
5. Prosedur Pencacahan Jumlah Sel Protozoa Rumen
Jumlah sel protozoa rumen dihitung berdasarkan teknik pewarnaan dengan menggunakan larutan methylgreen formalin salin (MFS) dalam larutan NaCl fisiologis dan kemudian difiksasi dengan formalin (Ogimoto dan Imai (198 1). Larutan MFS terdiri atas 100 ml formaldehid 35%, 0.6 g methylgreen, 8 g NaCl dan 900 ml air steril. Tahapan pencacahannya adalah: sampel cairan rumen yang baru diambil (menggunakan stomach tube) diencerkan 5 kali dengan larutan MFS dengan perbandigan 1: 1:3 (cairan rumen:MFS:aquades). Kemudian campuran tersebut diambil dengan pipet 1-2 tetes, .
kemudian ditempatkan dalam ruang hitung (counting chamber) secara hati-hati dengan ketebalan 0.1-0.2 rnrn, luas kotak yang diukur 1 mm2. Perhitungan jumlah sel protozoa dilakukan pada lima (5) buah kotak yang masing-masing bervolume 0.1 mm3 dengan rnikroskop pada pembesaran 40-100 kali. Cacahan sel protozoa per ml cairan rumen (P) dihitung dengan rumus berikut: P = (nI5 x lo4x FP); Keterangan: n =jumlah protozoa hidup yang terhitung dalam 5 kotak counting chamber 5 = jumlah kotak yang terhitung dalam counting chamber (Vol. 0. I mm3/kotak) FP = Faktor pengenceran
6. Prosedur Analisis VFA Individual
Konsentrasi
asam lemak terbang
(VFA)
individual dilakukan dengan
menggunakan khromatografi gas. Cairan rumen yang diambil melalui stomach tube disentrifise pada kecepatan 10 000 rpm selama 15 menit pada temperatur 4 ' ~agar diperoleh supernatan. Dua ml supernatan dipipet dan dimasukkan ke dalam tabung plastik bertutup. Lalu ke dalam tabung tersebut ditambahkan sebanyak 30 mg 5 sulphosalicylic acid (C&13(0H)S03H . 2Hz0), lalu dikocok dan disentrihse lagi dengan kecepatan 3000 rpm selama 10 menit
pada suhu
~ O C ,
kemudian disaring
dengan milipore untuk memperoleh supernatan yang jernih yang siap diinjeksikan ke dalam khromatografi gas. Perhitungan konsentrasi asam lemak terbang (VFA) dalam sampel (c) menggunakan nunus berikut : Konsentrasi VFA (mM) = (Tinggi sampeY Tinggi standrat) X Konsentrasi standart
7. Prosedur Pengukuran Konsentrasi N-Amonia Konsentrasi N-Arnonia dalam cairan rumen ditentukan dengan metode mikrodihsi Conway. Sebanyak 1 ml supernatan cairan rumen diletakkan dalam salah satu sisi cawan Conway dan pada sisi yang lainnya 1 ml larutan natrium karbonat (Na2C03) jenuh, kemudian cawan diletakkan pada posisi miring. Pada bagian tengah -
cawan diisi dengan 1 ml asam borat berindikator merah methil dan brom kresol hijau. Selanjutnya cawan ditutup rapat dengan tutup yang bervaselin, lalu digoyang agar supernatan dan larutan Na2C03 jenuh tercarnpur merata. Arnonia yang dibebaskan akan ditangkap oleh asam borat yang dapat terlihat dari perubahan warna yang tejadi. Sctclah 24 jam amonia borat dititrasi dengan larutan H2S04 0.005N sampai terjadi
perubahan warna dari biru menjadi kemarah-merahan. Konsentrasi N-amonia dalam cairan rumen dapat dihitung menggunakan rumus berikut : N-Amonia = (ml H 2 S 0 4 x N H 2SO 4 x 1000) mM 8. Prosedur Pengukuran Konsentrasi Prostaglandin Ez
Konsentrasi prostaglandin E2 (PGE2) ditentukan dengan menggunakan kit Arnersham's PGE2 assay system No. Kode RPA 530 dengan tracer ''9. Sebelum dilakukan pengukuran, terlebih dahulu dilakukan pemurnian terhadap sampel serum sapi, agar non esensial fatty acid tidak mengganggu pengujian PGE2. Pemurnian dilakukan menggunakan Amprep CIS(100 mg) yang telah disiapkan dengan 2 kolom EtOH 10%. Caranya ke dalam tabung polipropilen (PP)
1.5 ml
dimasukkan 0.5 ml serum, lalu ditambahkan 0.5 (air:EtOH = 1:4) dan 10 ul HAc glasial. Kemudian campuran diaduk hati-hati, dan dibiarkan pada suhu kamar selama 5 menit. Selanjutnya larutan disentrihse pada 2500 x g selama 2 menit dan setelah disentrihse campuran tersebut dimasukkan ke dalarn supernatan Amprep C18 yang telah disiapkan dengan 2 kolom EtOH 10% (4 rnl). Cuci dengan 2 ml air dan 2 ml heksan. Selanjuutnya PGEz dielusi dengan 3 x 1 ml EtOH lalu kumpukan residu dan keringkan dengan N2. Residu tersebut ditambah 100 ul bufer PBSG pH 7.4. Sesudah residu diberi bufer, baru ditambahkan reagen oximasi, divorteks lalu diinkubasikan pada 60' C selama 1jam atau semalam pada suhu kamar. Terakhir ditambahkan lagi bufer PBSG sampai menjadi 500 ul dan selanjutnya dilakukan pemeriksaan konsentrasi PGE2. Reagen yang digunakan dalam penentuan konsentrasi PGE2 serum adalah
125
I
PGE2, standar PGE2, antiserum, HCI bufer, Arnerlex-M antibody, methyl oximate.
I
Caranya: bufer diencerkan dengan aquades atau deionisasi 5- 10 menit, diaduk hati-hati
.
pada suhu 30°c, lalu ditambahkan tracer dengan 11 ml bufer dan diaduk kembali. Pada standar ditambahkan 2.5 ml bufer, lalu divorteks sebentar (3200 pg.mfl) (stok). Kemudian dibuat pengenceran dalam 8 tabung PP yang sudah diisi dengan 500 ul bufer. Pada masing-masing tabung berturut-turut: tabung I ditambahkan 500 ul stok (160 pg), lalu divorteks, tabung 2 ditambahkan 500 ul isi tabung 1 (80 pg) lalu divorteks dan seterusnya pada tabung 3 - 8 ditambahkan 40, 20, 10, 5, 2.5, 1.25 pg, kemudian setelah siap reagennya dilakukan pengujian. Dalam pengujian digunakan tabung PP duplikat sesuai keperluan dan anti serum (As) diaduk baik-baik. Lalu ke dalam tabung 1 dan 2 (TC) diisi dengan 100 ul tracer dan 200 ul bufer. Tabung 3 d m 4 (NSB) diisi 100 ul traser dan 200 ul bufer. Tabung 5 dan 6 (Bo) diisi 100 ul tracer, 100 ul As dan 100 ul bufer. Tabung 7-22 (std) diisi 100 ul std, 100 ul tracer dan 100 ul As dan tabung 23 dan seterusnya diisi 100 ul sampel, 100 ul tracer dan 100 ul As. Seluruh tabung divorteks lalu inkubasikan 2 jam pada suhu 25 OC atau semalam pada suhu kamar selama 15 menit. Kemudian semua tabung disentrifkse pada suhu 40 OC selama 10 menit pada 1500 x g atau lebih. Setelah terjadi pernisahan, semua tabung tetap berada di rak lalu supernatannya dibuang. Kemudian tabung bersama raknya dibalik, selanjutnya diletakkan diatas tissue dan dibiarkan kering. Setelah kering dibaca radio aktivitas dari setiap tabung pada gamma counter. Perhitungan % PGEz (%B/Bo) yang terikat menggunakan rumus:
-
%BIB0 = (cpm std atau sampel cpm NSB)/(cpm Bo - cpm NSB) x 100.
9. Prosedur Pengukuran Absorpsi Seng
Besarnya absorpsi seng dilakukan dengan menghitung selisih antara seng yang dikonsumsi dengan seng yang keluar melalui feses.
10. Prosedur Pengukuran Konsentrasi Seng dalam Serum
Pengukuran konsentrasi seng dalam serum darah diiakukan dengan metode HCl
0.1 M. Sebanyak 1 rnl serum darah dimasukkan ke dalam tabung, lalu
ditambahkan dengan 4 ml larutan HCl 0.1 M. Setelah campuran dikocok merata diperiksa dengan Spektrofotometer Serapan Atom (SSA) pada panjang gelombang 324.2 nrn. Konsentrasi seng dapat diitung dengan rumus berikut :
Seng (ppm) = (Abss-Absb) x fp x l/slope Keterangan: Abss = Absorbance sampel tj, = faktor pengenceran
Absb = Absorbance blangko slope = Y/X
11. Prosedur Pengukuran Aktivitas Alkalin Fosfatase
Penentuan aktivitas alkalin fosfatase dilakukan menurut petunjuk Sigma Diagnostics kit No. 104 yang dilampirkan bersama kit alkalin fosfatase yang ditentukan dengan menggunakan p-nitrofenil fosfat sebagai substrat. Enzim alkalin fosfatase akan memisahkan p-nitrofenil fosfat menjadi p-nitrofenol dan fosfat. Pembebasan p-nitrofenol yang berwarna kuning dapat diarnati dengan mengpnakan alat spektrofotometer. Jumlah p-nitrofenol yang dibebaskan persatuan waktu proporsional dengan aktivitas alkalinfosfatase. Dalam analisisnya digunakan larutan pereaksi berikut: larutan penyangga: 1.5 mol.~"2-amino-2 methyl- 1 propanol (AMP), pH 10.3, 57
10 m10.05 N NaOH, HCI dan substrat p-nitrofenilfosfat 10.2~ M . L - ' .
Ke dalam tabung blanko dan sampel masing-masing dipipet 0.5ml larutan AMP, pH 10.3 pada 25OC dan kedua tabung tersebut diletakkan di dalam water bath 37' C. Ke dalam tabung blanko dan sampel yang akan diuji masing-masing ditambahkan 0.1 ml aquades dan 0.1 ml serum. Sesudah dicampur tabung blanko dan sampel tersebut diletakkan pada water bath selama 15 menit, lalu tambahkan 10 m10.05N NaOH, dicampur dengan baik. Setelah perubahan warna yang terjadi stabil, absorban awal dapat dibaca pada panjang gelombang 420 nrn dan dibandingkan dengan blanko. Kemudian unit &din fosfatase sesuai ditentukan dengan kurva kalibrasi. Setelah absorban awal dibaca lalu ditambahkan 0.2ml HCI pada masing-masing tabung dan dicampur dengan baik, lalu absorbansnya dibaca dan besar unit alkalin fosfatase ditentukan berdasarkan kurva kalibrasi. Selisih aktivitas alkalin fosfatase sebelum dan sesudah ditambahkan
HCl sebanding dengan aktivitas alkalin fosfatase dalam serum (Sigma unit.^''). Bila dikonversi menjadi IU.L-' hams dikalikan dengan 16.7. 12. Prosedur Pengukuran Komposisi Tubuh dengan Teknik Ruang Urea
Pengukuran komposisi tubuh dengan teknik ruang urea dilakukan mengikuti prosedur Rule et al. (1986). Setiap awal dan akhir periode penelitian, setiap ekor sapi diinfusikan 130 mg urea.kgV'bobot hidup atau setara dengan larutan urea 20% dalam 0.9 NaCl melalui vena jugularis dalam waktu tepat dua menit. Urea yang diinfbsikan
akan segera menyebar mengikuti air tubuh sampai ke dalam sel.
Sampel darah diambil pada waktu sebelum dan 12 menit
sesudah diihsikan
larutan urea masing-masing untuk penentuan kadar urea darah pada waktu t menit dan t
=
=
0
12 menit. Pengambilan sampel darah dilakukan dengan menggunakan
tabung venoject (10 ml) berheparin yang steril. Sampel tersebut dimasukkan ke dalam termos berisi es dan segera dibawa ke laboratorium untuk disentrifuse pada kecepatan 3000 rpm selama 10 menit. Plasmanya diambil untuk analisis kadar urea plasma. Ruang urea dapat dihitung menggunakan rumus berikut :
RU (%) = (mg urea yang diifusikan)/(perubahan kadar urea plasma x bobot sapi x 10). Pendugaan komposisi tubuh (lemak dan air tubuh kosong) dapat dihitung berdasarkan rumus berikut :
-
Air tubuh kosong (%) = 59.1 + 0.22 x RU (%) 0.04 x bobot sapi
-
Lemak tubuh kosong (%) = 19.5 0.31 x RU (%) + 0.05 x bobot sapi Kadar karbohidrat tubuh sangat kecil sehingga diabaikan, sedangkan protein dan mineral tubuh dihitung menggunakan angka nisbah proteinlmineral tubuh 4: 1 (Sutardi, 1980).
13. Prosedur Pengukuran Alantoin Urin. Pengukuran alantoin urin dilakukan dengan spektrofotometer. Pertama alantoin dihidrolisis dalam larutan natrium hidroksida (suhu lo°C) menjadi alantoic acid yang selanjutnya didegradasi menjadi urea dan glyoxylic dalam larutan asam khforida (HCI). Glyoxylic acid akan bereaksi dengan fenilhidrazin hidroksida membentuk fenilhidrazon. Produk tersebut bersama kalium ferrisinida dapat membentuk khomosfer yang tidak 59
stabil yang warnanya dapat dibaca pada panjang gelombang 520 nm. Untuk membuat kurva linier standar, disiapkan larutan alantoin standar dengan konsentrasi 10; 20; 30; 40; 50 dan 60 m g ~ Lalu ! ke dalah tabung tersebut dimasukkan 1 ml sampel, larutan standar atau aquades dan 1 ml NaOH 0.5 M, Ialu dikocok dengan
vortex. Selanjutnya tabung tersebut direndam dalam air mendidih selama 7 menit. Setelah 7 menit diangkat dan didinginkan, Ialu ke dalam setiap tabung ditambahkan 1 ml HCI 0.5 M dan 1 ml larutan fenilhidrazin. Setelah dikocok, tabung segera direndam lagi dalam air mendidih selama 7 menit, kemudian didingnkan dalarn alkohol bath. Ke dalam setiap tabung ditambahkan sebanyak 3 ml HCl pekat (1 1.4 N) dan 1 ml kalium ferrisianida. Setelah dicampur sempurna, sebagian dimasukkan ke dalam cuvet dan dibaca nilai optical density (OD) pada spektrofotometer. Perhitungan konsentrasi alantoin sampel didasarkan pada hubungan linier antara konsentrasi alantoin standar dengan OD.
ANALISIS DATA Data yang diperoleh dianalisis dengan sidik ragam dan dilanjutkan dengan uji kontras menggunakan paket program SAS 608 Win.
