Marcela Vlková Jana Nechvátalová
FN u sv. Anny v Brně LF MU Brno
SS
Leukocytární subpopulace
SS
CD45
CD45
Lymfocytární subpopulace Fenotypizace základní subpopulace T a B lymfocytů a NK buněk subpopulace základních populací – vývojové a aktivační markery Sledování regulačních buněk Funkční testy: proliferace např. CSFE, produkce cytokinů, cytotoxicita, …..
Bazofily
Bazotest
SS
CD14
Monocyty
CD45
SS
Funkční testy: Stanovení exprese HLA‐DR Fagocytární testy Produkce cytokinů Exprese aktivačních molekul
CD14
Změny exprese HLA ‐ DR na monocytech u septických pacientů
HLA‐DR FITC
CD14
SS
HLA‐DR PerCP ‐Cy5.5
SS
HLA‐DR FITC
CD16,56
FS
SS
Eozinofily
CD45
SS
CD45
Neutrofily Jméno neutrofil pochází z histologických
nebo cytologických preparátů, při barvení hematoxylinem nebo eosinem Basofily‐ tmavě modré Eosinofily – jasně červené Neutrofily – neutrálně růžové Charakteristické svými výraznými jádry,
které jsou segmentovány do 2‐5 laloků
Vývoj neutrofilů
Nature Clinical Practice Rheumatology (2006) 2, 500‐510
Cytologie neutrofilů Zralé neutrofily měří v průměru v nátěru 12‐15 m Jsou charakteristické výraznými jádry, které jsou
segmentovány do 2‐5 laloků Méně zralé neutrofily nazýváme tyčkami – mají nesegmentované jádra tvarované právě do tvaru tyček Ranější formy neutrofilů – metamyelocyty můžeme také nalézt v periferní krvi
Vývoj netrofilů
Neutrofily Vysoký počet neutrofilů a jejich krátký život může být
výsledkem evolučního vývoje Buňky rychlého nasazení Minimalizace množení parazitů Neutrofilní antimikrobiální produkty poškozují okolní
tkáně
Neutrofily bývají často fagocytovány makrofágy po
digesci patogenů
CD16,56
FS
SS
Neutrofily stanovení v PK CD45 a CD16
CD45
SS
CD45
CD45
FS
SS CD45
CD45
SS
CD16,56
SS
FS
CD16,56
Neutrofily
SS
CD45
CD16,56
Vývojová stádia neutrofilů v PK
CD16,56
CD45
CD45
SS
FS
FS
SS
SS
CD16,56
CD16,56
CD16,56
FS
Subpopulace neutrofilů? Absence monoklonální protilátky?
CD45
CD45
CD45
FS
CD16
CD16
Absence monoklonální protilátky? NE!!!
SS
CD45
CD3
FS
Maturované x nematurované neutrofily
CD16,56
SS
CD45
CD16 CD16
CD19
FS
SS
CD3
CD45
CD15
CD16
CD45
CD16,56
SS
CD19
FS
CD16,56
Další fenotypizace ukázala…
CD3
CD16
CD15
CD16 je nízkoafinitní receptor pro Fc IgG. Vyskytuje se ve dvou izoformách: FCRIIIA (NK buňky, DC, monocyty, makrofágy) a FcRIIIB (na neutrofilech a eozinofilech). FCRIIIA (CD16a) existuje ve třech polymorfizmech: • FcRIIIa – 48L/H/R • FcRIIIa – 158V/F • FcRIIIa – 66H/L FcRIIIB (CD16b) – 2 alelické formy • NA1 a NA2 Různé alelické varianty CD16 vedou k: ‐ rozdílné aktivitě ADCC ‐ snížení léčebné odezvy (léčba rituximabem) ‐ ovlivnění účinnosti fagocytózy bakterií opsonizovaných IgG ‐ ochotněji s homozygotní variantou NA1 než NA2) ‐ popsán i deficit CD16 – další Fc receptory pro IgG (CD32 a CD64) zřejmě kompenzují ztrátu CD16 (Wagner C. et al., Eur J Clin Invest. 2004)
Exprese CD16b na neutrofilech 100‐135x103 vazebných míst (při použití klonu 3G8) Intenzita exprese CD16b na neutrofilech: ↑při manipulaci in vitro (hustotní gradientová
centrifugace) ↓u pacientů podstupujících hemodialýzu ↓u těhotných žen ↓u novorozenců ↓u pacientů léčených G‐CSF ↓u pacientů během sepse ↓během apoptózy neutrofilů
Ne všechny klony monoklonálních protilátek CD16 se chovají stejně…. A proto Jana dále bádá, a příště Vám řekne víc
Děkuji Spolupracovníkům: Janě Nechvátalové Zitě Chovancové Jiřímu Litzmanovi
Neutrofily stimulace nebo suprese?
Pieter H.C. Leifelder, Front Immunol, 2015
Subpopulace neutrofilů
Janesh Pillay, J Clin Invest, 2012
Neutrofily‐ změny po separaci a inkubaci CD62L
Periferní krev
PD‐L1
CD16
CD16
Granulocyty – 1hodina po separaci
Inkubace PBMC + granulocytů 24 hod.
Inkubace PBMC + granulo 24 hod. + stim.anti CD3, CD28
Monocyty – změny po separaci a inkubaci
CD62L
Periferní krev
PD‐1
CD16
PD‐L1
Čerstvě izol. PBMC
Inkubace PBMC 24 hod.
Inkubace PBMC 24 hod. + stimulace anti CD3, CD28
Low density granulocytes
Jitka Y. Sagiv, Cell Reports, 2015
Low Density Neutrophiles Čerstvě izol. PBMC
SS
CD62L
LDN v PBMC pacienta s CVID
CD16
PD‐L1
CD15
CD16
Inkubace PBMC 24 hod.
Inkubace PBMC 24 hod. + stimulace anti CD3, CD28
Fenotypizace LDN
Carmelo Carmon Rivera, Seminar Immunophatol, 2013
