Majalah Obstetri & Ginekologi, Vol. 20 No. 1 Januari - April 2012 :
Comparation of P16INK4a Expression between Low Grade Squamous Intraepithelial Lesion and High Grade Squamous Intraepithelial Lesion From Leep/Biopsy Specimens Rianto1, Brahmana Askandar T1, Diah Fauziah2 1 Departemen Obstetri dan Ginekologi 2 Departemen Patologi Anatomi Fakultas Kedokteran Universitas Airlangga RSUD Dr Soetomo, Surabaya ABSTRAK Tujuan penelitian ini adalah untuk menyelidiki diferensiasi p16INK4a ekspresi antara HSIL dan LSIL histologis. Penelitian ini merupakan penelitian observasional dengan rancangan potong melintang pendekatan dalam Gynecologi Onkologi Klinik dan Patologi Anatomi Departemen Dr Soetomo Rumah Sakit Umum, Surabaya. Sampel adalah spescimens histologis dikumpulkan dari penyimpanan Patologi Anatomi Departemen Dr Soetomo, Surabaya Mei 1st, 2011 untuk 31 Agustus 2011. 16 sampel dikumpulkan berturut-turut untuk setiap kelompok (HSIL, LSIL), sehingga 32 sampel total. semua Sampel diolah oleh immunocitochemistry menggunakan mouse monoklonal anti-manusia JC8, oleh Dako, Glostrup Denmark dan p16INK4a ekspresi dievaluasi oleh citopatologist. p16INK4a ekspresi dihitung semiquantitavely dengan kriteria Klaes. itu diferensiasi ekspresi p16INK4a antara HSIL dan LSIL dianalisis dengan Mann Whitney tes. Didapatkan ekspresi p16INK4a di LSIL; 12,5% adalah negatif dan 31,25% adalah 1, 25% adalah 2 dan 31,25% adalah 3 skor dari kriteria Klaes. Ekspresi p16INK4a di Pap HSIL; 6,25% adalah negatif, 93,75% adalah 3. Diferensiasi p16INK4a ekspresi antara HSIL dan LSIL Pap adalah p = 0,001 signifikan (p <0,05). Kesimpulan: ekspresi p16INK4a lebih tinggi pada HSIL dan itu signifikan secara statistik. ABSTRACT The purpose of this study was to investigate the differentiation of p16INK4a expression between HSIL and LSIL histological specimen. This was an observational study with cross sectional approach in Gynecologi Oncology Clinic and Pathology Anatomy Department of Dr Soetomo General Hospital, Surabaya. The samples are histological spescimens collected from storage of Pathology Anatomy Departement of Dr. Soetomo General Hospital, Surabaya Mei 1st, 2011 to August 31st, 2011. Samples were collected consecutively for each group (HSIL,LSIL), thus 32 samples totally. All samples were processed by immunocitochemistry using monoclonal mouse anti-human JC8, by Dako, Glostrup Denmark and p16INK4a expression were evaluated by citopatologist. p16INK4a expression were counted semiquantitavely with Klaes criteria. The differentiation of p16INK4a expression between HSIL and LSIL was analysed by Mann Whitney test. It was found that the p16INK4a expression in LSIL ; 12,5% were negative and 31.25% were 1, 25% were 2 and 31,25% were 3 score from Klaes criteria. The p16INK4a expression in HSIL smear; 6.25% were negative, 93.75% were 3. The differentiation of p16INK4a expression between HSIL and LSIL smear were significant p=0.001( p<0,05 ). In conclusion, p16INK4a expression is higher in HSIL and it was statistically significant. Keywords: p16INK4a expression, LSIL, HSIL, Precancerous cervical lession, LEEP/Biopsy. Korespondensi: PENDAHULUAN Penyakit perjalanan skuamosa serviks karsinoma sel adalah salah satu model karsinogenesis adalah melalui tahapan atau tahapan, mulai dari mulai proses karsinogenesis morfologi perubahan untuk tumbuh menjadi invasif cancer.1 CIN terminologi pertama kali diperkenalkan oleh Richart. Untuk menghubungkan antara sitologi dan histologi temuan, dibuat dari The Bethesda Sistem siap untuk menjadi internasional standar. Sistem Bethesda lebih berperan melengkapi apa yang telah dijelaskan oleh sistem CIN. Dalam epidemiologi dan laboratorium telah menunjukkan bahwa HPV infeksi adalah pramaligna penyebab utama dan ganas lesi epitel serviks, yaitu penemuan DNA HPVpada 95% sampai
Rianto et al. : Comparation of P16INK4a Expression
100% dari cases.2, 3HPV adalah inisiator dari faktor-faktor yang menyebabkan sel kanker leher rahim gangguan serviks. Integrasi DNA HPV pada genom sel tubuh adalah awal dari proses yang mengarah ke transformasi. Onkoprotein early6 dan 7 (E6, E7) dari HPV adalah penyebab dari terjadinya degenerasi ganas. Onkoprotein E6 untuk mengikat Supressor p53 Tumor Gene jadi (TSG) p53 akan kehilangan fungsinya. Sementara onkoprotein E7 untuk mengikat TSG Protein retinoblastoma (PRB), obligasi ini akan menyebabkan pelepasan E2f dari PRB, dan E2f merupakan faktor transkripsi yang berlangsung tanpa sel kontrol siklus, perbaikan DNA tidak terjadi, dan apoptosis tidak terjadi.1,4 Protein p16INK4a, penekan tumor protein yang menghambat cyclin D1 workphosphorylate kompleks CDK4 dan cdk6 dalam PRB, sehingga PRB akan terlepas dari ikatan PRBE2F. Akumulasi E2f akan mendorong kegiatan dari p16INK4a. Ekspresi dari p16INK4a di kanker leher rahim yang terjadi sebagai akibat dari fungsional inaktivasi PRB oleh HPV E7 protein. Banyak penelitian menunjukkan hubungan linear antara ekspresi p16INK4a dengan derajat displasia.5,6 Dalam epidemiologi, adalah terbukti bahwa infeksi HPV merupakan faktor yang memainkan peran penting dalam kejadian serviks kanker, tetapi itu tidak berarti bahwa kehadiran Infeksi HPV akan berkembang menjadi kanker serviks. Dari penelitian tersebut menyebutkan bahwa hanya 30-40% pasien yang RiskPapillomavirus infeksi Tinggi (HR HPV) yang akan berkembang menjadi serviks kanker7,8,9 P16INK4a protein yang terkait dengan perkembangan lesi prakanker, seperti yang ditunjukkan oleh studi yang dilakukan oleh Negri dkk, yang menunjukkan bahwa lesi pra-kanker LSIL dengan difus ekspresi p16INK4a (tinggi) akan lebih kemajuan untuk HSIL dibandingkan dengan LSIL yang memiliki ekspresi rendah p16INK4a. Hariri Oster dan melaporkan nilai prediksi negatif (NPV) dari p16INK4a oleh 96%. Rendah Risiko Manusia Infeksi papillomavirus memiliki kemampuan untuk mengintegrasikan dengan DNA inang rendah, sehingga PRB host tidak terganggu, hal itu menyebabkan ekspresi p16INK4a di risiko rendah infeksi HPV adalah low10, 11 Branca dkk. dan Ozgul dkk. melaporkan bahwa ekspresi p16INK4a berhubungan langsung dengan peningkatan derajat dysplasia.12 Peran p16INK4a penting karena dapat menggambarkan seberapa besar DNA HPV yang memiliki telah diintegrasikan ke dalam DNA inang dan memiliki merusak fungsi PRB. Jadi pemeriksaan p16INK4a menjadi penting sebagai tambahan pemeriksaan pada lesi pra-kanker karena dapat menilai perkembangan prakanker lesi seberapa besar bahwa DNA HPV telah diintegrasikan ke dalam DNA host dengan melihatderajat intensitas warna yang dihasilkan oleh imunohistokimia pewarnaan. 10,13 BAHAN DAN METODE Rancangan penelitian yang digunakan adalah double blind cross sectional, itu dilakukan pada Mei sampai Juli 2011. Subyek penelitian diambil dari persiapan LEEP / Biopsi yang disimpan di laboratorium histopatologi dan membaca dengan hasil LSIL dan HSIL. mereka dievaluasi kembali oleh citopatologist untuk melihatnya yang tepat dan kemudian dibaca dan 32-persiapan diambil, maka mereka dilakukan perubahan warna dan kemudian mereka diberi baru pewarnaan oleh imunositokimia p16 oleh antibodi monoklonal JC8, yang diproduksi oleh DAKO, Glostrup, Denmark, dan kemudian mereka p16INK4a ekspresi dievaluasi. Para LEEP / Biopsi persiapan adalah dilakukan perubahan warna dengan cara direndam dalam asam alkohol 1% selama 30 menit, dibilas dengan aquades, dan didinginkan selama 20 menit. Kami perrformed prosedur pewarnaan imunohistokimia, dengan primer antibodi JC8 sekitar satu malam suhu serendah 4 ° C dan sekunder antibodi berlabel biotin (Anti Kelinci IgG biotin berlabel) sekitar satu jam dalam suhu kamar, coklat pewarna oleh Cromogen DAB (3,3 diaminobenzidine tetratetrahydrochloride) tentang 10-20 menit dalam suhu kamar, dan Counterstain oleh Hematoxylen Eosin sekitar 5 menit dalam suhu kamar. p16INK4a ekspresi ditandai oleh penyerapan warna coklat pada positif sel, baik di inti dan sitoplasma. Ekspresi P16INK4a dinilai oleh ahli Patologi menggunakan kriteria Klaes untuk melihat gambar coklat pada nukleus dan sitoplasma, yang terbagi menjadi semikuantitatif: Skor 0 (Negatif): <1% dari semua sel positif, Skor 1 (sporadis): hanya beberapa sel yang positif tetapi tidak lebih dari 5% dari semua sel. Skor 2 (Focal): sebuah kelompok kecil sel positif tapi kurang dari 25% dari semua sel, dengan peningkatan intensitas warna cokelat.Skor 3 (membaur):> sel positif 25%, dengan intensitas warna coklat sangat meningkat. Untuk melihat perbandingan dari p16INK4a antara LSIL dan HSIL menggunakan Mann Whitney tes.
Majalah Obstetri & Ginekologi, Vol. 20 No. 1 Januari - April 2012 :
Hasil yang kita punya itu ditabulasi sebagai tabel 1 dan itu tahu pada Gambar 3. pada LSIL, kami menemukan 2 sampel (12,5%) dari negatif p16INK4aexpression / skor 0, 5 sampel ekspresi dengan skor 1, 4 sampel dengan skor 2 dan 5 sampel dengan skor 3 dari sampel dievaluasi. Sedangkan pada HSIL, kami mendapat hanya (6,25%) dari p16INK4aexpression / skor sampel (93,75%) dari ekspresi dengan skor 5 sampel (31,5%) dari skor 2 dari total 16 HSIL sampel diperiksa.Untuk positive result, LSIL kelompok sementara sebagian besar HSIL kelompok telah mencapai skor Meskipun hasil tersebut menunjukkan bahwa nilai ekspresi p16INK4a pada pap smear HSIL adalah lebih tinggi dari LSIL, tetapi analisis statistik dengan Mann-Whitney menunjukkan berbeda nyata hasil (p = 0,001). Kita bisa melihat fitur yang dihasilkan dari prosedur imunositokimia pewarnaan proc. (Gambar 4-10) Gambar 1. Hematoxilin eosin counterstain pada pewarnaan itu dimaksudkan untuk menjaga epitel morfologi sel seperti yang terlihat pada Papaniculaou pewarnaan. Fitur integrasi antara HPV DNA dan DNA sel inang dapat dievaluasi oleh melihat p16INK4aexpression yang mengakibatkan oleh reaksi antara JC8 antibodi primer dan DAB cromogen, ditunjukkan oleh intensitas kecoklatan pada sitoplasma dan nukleus HASIL DAN PEMBAHASAN Kanker serviks tetap kedua peringkat penyebab kematian kanker di kalangan perempuan dinegara-negara berkembang. Seperti telah diketahui bahwa Infeksi HPV terdeteksi pada 99,7% pasien dengan kanker serviks, infeksi HPV adalah infeksi yang sangat penting dalam serviks kanker perjalanan. Dalam kasus-kontrol studi, prevalensi infeksi HPV pada kanker serviks jenis karsinoma sel skuamosa mengalami jumlah 78,4-98,1%.1 Selain infeksi sederhana, HPV partikel interaksi dengan sel host tertentu juga diperlukan untuk inisiasi dan perkembangan HPV yang menyebabkan displasia. Virus ini akan menginfeksi induk epitel sel di tempat itu secara struktural dan anatomis mudah diakses, yaitu skuamosa kolumnar persimpangan di transformasi zona. Virus ini akan menggunakan tuan sel DNA replikasi mesin untuk replicateepisomalgenome.8 Integrasi DNA HPV pada genom sel tubuh adalah awal dari proses yang mengarah ke transformasi. HR Infeksi HPV sering ditemukan pada wanita muda dan crosssectional beberapa penelitian menyebutkan prevalensi tertinggi ditemukan pada usia rata-rata 20-35 tahun, yaitu lebih dari 30%. Dalam studi kohort longitudinal yang disebutkan bahwa masa infeksi primer sekitar 8-10 bulan. Dan hanya beberapa ini infeksi persisten dan menyebabkan epitel displasia pada serviks. Dengan mengacu pada ini epidemiologi penelitian, penggunaan virologi pemeriksaan sebagai skrening parameter utama masih diperdebatkan karena tingginya prevalensi perempuan terinfeksi tanpa perubahan patologis pada yang serviksnya epitel, sehingga penemuan HR HPV infeksi memiliki prediksi positif yang rendah nilai terjadinya displasia dan SDM HPV negatif memiliki nilai prediksi negatif adalah sangat tinggi karena hubungan dekat antara infeksi persisten dengan HPV SDM displasia serviks dan kanker.3,7,8,9,15 Meskipun epidemiologi dikatakan jelas bahwa infeksi HPV adalah penting dalam kejadian kanker serviks tetapi tidak harus dalam adanya infeksi HPV akan berkembang menjadi kanker leher rahim. Ia mengatakan hanya 30-40% pasien yang terinfeksi Papillomavirus Risiko Tinggi (SDM HPV) yang akan berkembang menjadi kanker serviks.8,9,10 metaplasia dan perubahan reaktif tidak terkait dengan infeksi HPV dapat memberikan sebuah LSIL atau CIN I. Protein p16INK4a, penekan tumor protein yang menghambat cyclin D1 workphosphorylate kompleks CDK4 dan cdk6 dalam PRB, sehingga PRB akan terlepas dari ikatan PRBE2F. Akumulasi E2f akan mendorong kegiatan dari p16INK4a. Ekspresi dari p16INK4a dikanker leher rahim yang terjadi sebagai akibat dari fungsional inaktivasi PRB oleh HPV E7 protein. Dalam studi ini, hasil yang diperoleh dalam LSIL kelompok: 12,5% sampel tidak memberikan ekspresi p16INK4a, 31,25% dari sampel memberikan ekspresi sporadis, sampel 25% fokus dan 31,25% dari sampel berdifusi. Hal tersebut sesuai dengan yang dilaporkan oleh Doeberitz yang diperoleh 60% kasus LSIL menunjukkan peningkatan ekspresi dari p16INK4a, sedangkan 40% lainnya belum meningkat meskipun infeksi HPV diperoleh dan memberikan gambaran koilositosis, jadi 12,5% dari sampel yang tidak memberikan p16INK4a ekspresi dapat berasal dari sampel LSIL disebabkan oleh infeksi HPV E7 LR dengan lebih rendah afinitas SDM HPV. Selain itu, metaplasia dan reaktif perubahan tidak terkait dengan infeksi HPV dapat memberikan sebuah LSIL atau CIN I. Beberapa temuan histologis yang bisa juga memberikan gambaran LSIL meliputi: skuamosa metaplasia, hyperplasia sel basal, hiperplasia mikroglanduler, dan inflammation.10. Dalam 5 kasus LSIL atau 31,25% dari hasil diperoleh adalah menyebar, hal ini
Rianto et al. : Comparation of P16INK4a Expression
menunjukkan bahwa HPV DNA telah terintegrasi dengan sel inang DNA, tetapi gambar masih sel LSIL karena sifat dari perubahan morfologi Tentu saja penyakit kanker serviks melalui tahapan itu sendiri dan membutuhkan waktu sekitar 5 tahun, sehingga sampel diperiksa LSIL mungkin berasal dari pasien LSIL yang sedang dikembangkan ke HSIL. Negri dkk, melaporkan bahwa prakanker lesi LSIL dengan p16INK4a difus ekspresi (tinggi) akan lebih banyak kemajuan untuk HSIL dibandingkan dengan LSIL yang memiliki ekspresi yang rendah dari p16INK4a. Dengan melihat hasil ini, adalah untuk pasien dengan LSIL dengan gambar ini peningkatan ekspresi p16INK4a harus mempertimbangkan terapi yang lebih agresif, mengingat kemungkinan berkembang menjadi lesi yang lebih tinggi adalah sangat besar. Sementara dalam persiapan biopsi atau LEEP dengan membaca hasil yang diperoleh HSIL 93,75% Persiapan HSIL memiliki skor 3 berarti bahwa sangat kuat ekspresi protein p16INK4a di HSIL dan persiapan konsisten dengan penelitian yang dilakukan oleh Nieh dkk. yang menemukan bahwa mayoritas LSIL hanya lemah positif dan mayoritas HSIL adalah positif yang kuat. Branca et al. dan Ozgul dkk. melaporkan bahwa ekspresi p16INK4a berhubungan langsung dengan meningkatnya tingkat dysplasia.16 Penelitian oleh Bibbo dan Klaes menemukan bahwa positif p16INK4a di semua sampel karsinoma skuamosa dan HSIL. Pientong et.al menemukan bahwa dalam semua kasus diperiksa HR HPV positif dengan PCR juga memperoleh positif Hasil pada pemeriksaan dan menyimpulkan bahwa p16INK4a p16INK4a dapat digunakan sebagai metode diagnostik untuk memeriksa HPVinfectedcells HR. Secara statistik p16INK4a ekspresi perbedaan diperoleh dari kedua kelompok. Dari perbedaan analisis statistik signifikan adalah ditemukan, dengan p = 0,001. (P <0,05). Perbedaan ini Hasil ini memperkuat hipotesis bahwa ekspresi protein p16INK4a di persiapan lebih tinggi dari LSIL HSIL. Karena DNA HPV lebih HSIL telah terintegrasi dengan genom sel inang. Semakin protein E7 virus HPV SDM yang inactivates fungsi PRB, semakin independen E2f oleh PRB ikatan dan bebas, sehingga akan menyebabkan tidak terkendali transformasi sel-sel serviks dan menginduksi p16INK4a protein sebagai inhibitor untuk menghambat pelepasan E2f dari PRB, sehingga bahwa dosis tampak bahwa peningkatan ekspresi dari p16INK4a. KESIMPULAN Ekspresi p16INK4a lebih tinggi pada HSILand signifikan secara statistik DAFTAR PUSTAKA 1.
Andriyono. Kanker Serviks, Divisi Onkologi Departemen Obstetri-Ginekologi Fakultas Kedokteran Universitas Indonesia, 2009;2:1-10. 2. Agoff,S.N., Lin,P., Morihara,J., Mao,C., Kiviat,N.B.,Koutsky,L.A.P16INK4a expression correlates with degree if cervicalneoplasia: a comparison with Ki-67 expression and detection of high-risk HPV types. Mod Pathol, 2003;16(7):665-673. 3. 3.Dehn,D., Torkko,K., Shroyer,K., 2006. Human Papillomavirus Testing and Molecular Markers of Cervical Dysplasia and Carcinoma. Cancer cytopath;111(1):1-9 4. Omori,M., Hashi,A., Nakazawa,K., Yuminamochi,T.,Yamane,T., Hirata,S., Katoh,R., Hoshi,K. Estimation of prognoses for cervical intraepithelial neoplasia 2 by p16INK4a immunoexpression and high-risk HPV in situ hybridization signal types. Am J Clin Pathol, 2007;128:208-217. 5. Murphy,N., et.al. P16INK4a as a marker for cervical dyskaryosis: CIN and cGIN in cervical biopsies and ThinPrep TM smears. J clinm Pathol, 2003;56:56-63. www.jcp.bmj.com 6. Tan,G.C., Norlatiffah,S., Sharifah,N.A., Razmin,G., Shiran,M.S., Hatta,A.Z., Paul-Ng,H.O.Immunohistochemical study of p16INK4a and surviving expressions in cervical squamous neoplasm. Ind J Pathol Microbiol,2010;53(1):1-6 7. Lytwyn,A., et al. Comparison of human papillomavirus DNA testing and repeat Papaniculaou test in women with low grade cervical cytologic abnormalities:a randomized trial. CMAJ, 2000;163(6):701-7 8. Doeberitz,M. Review. New markers for cervical dysplasia to visualise the genomic chaos created by aberrant oncogenic papillomavirus infections. Eur J Cancer, 2002; 38:2229–2242. 9. Stanley,A.M. Review Prognostic factors and new therapeutic approaches to cervical cancer. Virus Research, 2002;89:241-248 10. Redman,R., Ruffony,I., Liu,C., Wilkinson,E.J., Massol,N.A. The utility of p16INK4a in discriminating between cervical intraepithelial neoplasia 1 and non neoplastic equivocal lesions of the cervix. Arch Pathol Lab Med, 2008;132:795-99.
Majalah Obstetri & Ginekologi, Vol. 20 No. 1 Januari - April 2012 :
11. Del Pino,M., Garcia,S., Fuste,V.,et al.,2009. Value of p16INK4a as a marker of progression/regression in cervical intraepithelial neoplasia grade 1. Am J Obstet Gynecol;201:488.e1-7 12. Ozgul,N.,Bozdayi,G.,Usubutun,A.,Bulbul,D., Rota,S.,Kose,MF.,Biri,A.,Haberal,A. Staining characteristics of p16INK4a: is there a correlation with lesion grade or high-risk human papilloma virus positivity? J Obstet Gynaecol Res,2008;34(5):865-71. 13. Carozzi,F. Combined Analysis of HPV DNA and p16INK4a Expression to Predict Prognosis in ASCUS and LSIL LEEP/Biopsys. Coll. Antropol, 2007; 31 Suppl.2: 103–106 14. Volgareva, G., Zavalishina, L., Golovina, D., Blief, A., Andreeva Y., Frank, G., Krutikova, E., 2004. Protein p16 as a Marker of Dysplastic and Neoplastic Alterations in Cervical Epithelial Cells. BioMed Central Cancer: 4:58 15. Garner,E. Cervical Cancer:Disparities in Screening, Treatment, and Survival. Cancer Epidemiol, 2003;12 Supl March:242s-247s 16. Ozgul,N.,Bozdayi,G.,Usubutun,A.,Bulbul,D., Rota,S.,Kose,MF.,Biri,A.,Haberal,A.,2008. Staining characteristics of p16INK4a: is there a correlation with lesion grade or high-risk human papilloma virus positivity? J Obstet Gynaecol Res;34(5):865-71.
