LINEAR ARRAY HPV Genotyping Test

LINEAR ARRAY HPV Genotyping Test IN VITRO DIAGNOSZTIKAI CÉLRA. AmpliLute Liquid Media Extraction Kit

EXTRN

50 Tests

P/N: 03750540 190

LINEAR ARRAY HPV Genotyping Test

LA HPV GT

48 Tests

P/N: 04391853 190

LA DK

96 Tests

P/N: 03378179 190

1 Each

P/N: 03140725 001

LINEAR ARRAY Detection Kit 24-Well Tray with Lid FELHASZNÁLÁS MÓDJA

Az LINEAR ARRAY HPV (humán papillomavírus) Genotyping Test egy kvalitatív in vitro vizsgálat a humán papillomavírus kimutatására klinikai mintákban. A harminchét anogenitalis HPV DNS genotípusainak [6, 11, 16, 18, 26, 31, 33, 35, 39, 40, 42, 45, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 58, 59, 61, 62, 64, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73 (MM9), 81, 82 (MM4), 83 (MM7), 84 (MM8), IS39 és CP6108] cobas® PCR sejtminta-tápközegbe vagy PreservCyt® oldatba levett cervicalis sejtekből való kimutatására a vizsgálat a következő lépéseket valósítja meg: a target DNS amplifikálása polimeráz láncreakcióval (PCR), majd nukleinsav-hibridizáció. A vizsgálat összegzése és magyarázata A méhnyakrák, valamint annak megelőző állapota, a cervicalis intraepithelialis neoplasia (CIN) legfontosabb oka a humán papillomavírus (HPV) okozta perzisztáló fertőzés1-3. Világszerte a méhnyakrák esetek több, mint 99%-ában kimutatták a HPV jelenlétét3. A HPV egy kicsi, burokkal nem rendelkező, kettős szálú DNS-t tartalmazó vírus, amelynek genomja megközelítően 8000 nukleotidból áll. Több, mint 100 különböző HPV-genotípus ismeretes, és mintegy 40 különböző HPV-genotípus képes megfertőzni a humán genitális nyálkahártyát. Ugyanakkor ezeknek a szexuális úton átvihető vírus genotípusoknak csak egy kisebb csoportja társul magas fokozatú cervicalis displasiaval és méhnyakrákkal3-5. Ezeket magas kockázatú HPV-genotípusoknak nevezik, míg az alacsony kockázatú HPV-genotípusok gyakran jóindulatú alacsony fokozatú intraepithelialis laesiókkal, illetve condylomákkal fordulnak elő együtt. A szexuális úton átvitt HPV-fertőzés rendkívül általános, becslések szerint a nők mintegy 75%-a kerül élete során kapcsolatba HPV-expozícióval6. A HPV-fertőzések túlnyomó többsége spontán megszűnik, ugyanakkor a magas kockázatú HPV perzisztálása szignifikáns kockázati tényezőt jelent méhnyakrák kialakulására. A fejlett országokban a méhnyakrákszűrés során az 50-es évek közepétől a Pap-kenetet (Dr. George Papanicolaou után) használják, mint elsődleges eszközt a méhnyakrák korai megelőző állapotainak kimutatására. Bár ennek folytán a méhnyakrák halálozási mutatói drámaian csökkentek ezekben az országokban, a Pap-kenet egy relatíve pontatlan vizsgálat, az álnegatív eredmények nagy arányával, amelynek értékeléséhez magasan képzett citopatológus szükséges. A Pap-kenetben megfigyelt citológiai abnormalitások elsősorban a HPV-fertőzés következtében alakulnak ki; ugyanakkor a különböző gyulladásos, illetve a kenetkészítéssel kapcsolatba hozható eltérések álpozitív Pap-eredményeket okozhatnak. Az abnormális Pap-kenet triászba tartozik a vizsgálat megismétlése, a kolposzkópia és a biopszia. A szövettanilag alátámasztott magas fokozatú laesiókat az invazív méhnyakrák kialakulását megelőzendő sebészileg el kell távolítani. A papillomavírust rendkívül nehéz in vitro tenyészteni, továbbá nem minden HPV-fertőzött betegnek van kimutatható antitestes válasza. A PCR segítségével történő nukleinsav- (DNS) vizsgálat egy érzékeny és non-invazív módszer az aktív cervicalis HPV-fertőzés jelenlétének igazolására. HPVtipizálási teszt alkalmazásairól szóló beszámolók tartalmazzák specifikus HPV-típusok7 megszerzésének és clearance-ének kiértékelését; genotípusok típusspecifikus jelenlétének megfigyelését magas kockázatú méhnyak-megbetegedés és méhnyakrák kialakulásával kapcsolatban8; kimetszéses terápia9, sugárterápia10 vagy kemoterápia11 hatékonyságát HPV-vel összefüggő laesiók esetén (gyógyulási teszt); genotípus meghatározását választott szűrőprogramok esetén, oltás előtti vagy utáni bemutatást12; epidemiológiai vizsgálatok elősegítését tekintettel a HPVfertőzések természetes előfordulására.

A Dokumentum verzióinformációi rész a dokumentum végén található. 04700627001-11HU 1

Doc Rev. 11.0

AZ ELJÁRÁS ALAPELVEI A LINEAR ARRAY HPV Genotyping Test négy fő lépésből épül fel: minta előkészítése; a target DNS amplifikálása HPV primerek felhasználásával PCR során13; az amplifikált termékek hibridizációja oligonukleotid próbákhoz és a kötődött amplifikált termékek kolorimetriás kimutatása. A minta előkészítés során AmpliLute Liquid Media Extraction Kit segítségével állítja elő a PCRamplifikációhoz szükséges HPV target DNS-t és human genomikus DNS-t. A master mix reagens 37 HPVgenotípusból származó DNS-hez és a humán ß-globin génhez tartalmaz primereket az amplifikációhoz. A kimutatás és a genotípus meghatározása a denaturált amplifikált DNS és egy oligonukleotid próba array felhasználásával végzendő el, mely lehetővé teszi az egyedi HPV-genotípusok független azonosítását. A minta előkészítése A HPV DNS-t a cervicalis sejtminták roncsolásával teszik szabaddá magas hőmérsékleten denaturáló körülmények között. A roncsolást egy chaotrop ágens, a proteináz K, valamint detergens jelenlétében végzik, majd az oszlopon lévő DNS izolálása és tisztítása, és eluáló reagenssel való elúció következik. A ß-globin gén izolálása párhuzamosan történik, így az, mint extrahálási és amplifikálási, valamint sejtkontroll szerepel minden egyes feldolgozott minta esetén. PCR-amplifikáció A targetszekvencia kiválasztása A LINEAR ARRAY HPV Genotyping Test biotinilált primereket használ a HPV-genom polimorf L1 szakaszán lévő mintegy 450 bázispár hosszúságú nukleotidszekvencia meghatározásához. A master mixben lévő HPV-primereket 13 magas kockázatú genotípusból* (16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59 és 68)3-5 származó 37 HPV DNS amplifikálására tervezték14. A capture próbaszekvenciák az ezen primerek által kötött L1 polimorf szakaszokon helyezkednek el. Egy további primer pár a humán ß-globin génhez target, így az mint extrahálási és amplifikálási, valamint sejtkontroll szerepel. Targetamplifikáció AmpliTaq Gold DNS-polimeráz van alkalmazva a HPV target DNS és a ß-globin kontroll „hot start” amplifikációjához. Az AmpliTaq Gold DNS-polimeráz aktiválása, a vírus DNS és a humán genom DNS denaturálása valamint primer targetszekvenciák szabaddá tétele végett a PCR-reakcióelegyet először fel kell hevíteni. Az elegy kihűlésével a primerek (mind az upstream, mind a downstream) a target DNS-hez kapcsolódnak. Az AmpliTaq Gold DNS-polimeráz Mg2+ és feleslegben lévő dNTP-k jelenléte mellett meghosszabbítja a kapcsolódott primereket a target templát mentén egy körülbelül 450 bázispárból álló kétszálú HPV target DNS-molekulát, vagy egy amplikonnak nevezett 268 bázispárból álló ß-globin DNS molekulát-létrehozva. Ez a folyamat számos cikluson keresztül ismétlődik, az amplikon DNS-mennyisége ciklusonként megduplázódik. Az amplifikálás a HPV-genomnak, illetve a ß-globin génnek csak a megfelelő primer párok közötti régiójában zajlik. A teljes genom nem amplifikálódik. Szelektív amplifikálás A LINEAR ARRAY HPV Genotyping Test a mintából származó target-nukleinsav szelektív amplifikálását az AmpErase (uracil-N-glikoziláz) enzim és dezoxiuridin-trifoszfát (dUTP) használatával éri el. Az AmpErase enzim felismeri és katalizálja az olyan DNS-szálak megsemmisítését, amelyek dezoxiuridint tartalmaznak15, a dezoxitimidint tartalmazókét viszont nem. A dezoxiuridin a természetes DNS-ben nincs jelen, ugyanakkor az amplikonban mindig megtalálható, miután a master mix reagensben lévő dezoxiuridin-trifoszfát mellett dezoxitimidin-trifoszfátot is használ; így tehát csak az amplikon tartalmaz dezoxiuridint. A dezoxiuridinnak köszönhetően a szennyező amplikont az AmpErase enzim még a target DNS amplifikálását megelőzően lebontja. A master mix reagensben lévő AmpErase enzim katalizálja a dezoxiuridint tartalmazó DNS hasítását a dezoxiuridin csoportoknál úgy, hogy a dezoxiribóz lánc felnyílását okozza a C1 helyen. Az első hevítési lépésben a master mix reagens bázikus pH-ján az amplikon DNS-lánc eltörik a dezoxiuridin helyén, tehát a DNS nem lesz amplifikálható. Az AmpErase enzim 55 °C felett, azaz a hevítési lépések során inaktív, azaz nem bontja le a target amplikont. Az amplifikálást követően a maradék enzim a denaturáló oldat hozzáadásakor denaturálódik, megelőzve ezáltal a targetamplikonok lebontását. *

A LINEAR ARRAY HPV Genotyping Test a HPV 66-ot detektálja, melyre nézve a rizikócsoportba való sorolhatóság nem egyértelmű. A szakirodalomban nincs megegyezés arra vonatkozólag, hogyan lehetne ezt a típust klasszifikálni, mivel a közleménytől függően alacsony, mérsékelt vagy magas rizikójú csoportba sorolják. A HPV DNS-érzékelésén alapuló, méhnyakrák-szűréshez használatos vizsgálati módszerek esetén a tipizálás eredménye szintén eltérő, mivel bizonyos módszerek a HPV 66-ot magas rizikójú csoportba sorolják, mások ugyanakkor nem.

04700627001-11HU

2

Doc Rev. 11.0

Hibridizáció A PCR-amplifikálást követően a denaturáló oldat hozzáadásával a HPV és ß-globin amplikon kémiai denaturálást szenved, és egyszálú DNS lesz. A denaturált amplikonok kis részletei azután a tipizáló tálca megfelelő üregeibe kerülnek, amely üregek hibridizációs puffert és egyszálú LINEAR ARRAY HPV genotipizáló csíkot tartalmaznak, amely különböző HPV és ß-globin próbák sorozatával van fedve. A biotinilált amplikon csak abban az esetben hibridizál az oligonukleotid próbákkal, ha az amplikon tartalmazza a komplementer próba megfelelő szekvenciáját. Továbbá, a LINEAR ARRAY HPV Genotyping Strip egy keresztreaktív oligonukleotid próbával van fedve, mely hibridizál a HPV 33, 35, 52 és 58 genotípusaival. Az amplikon, mely a próbával komplementer, szorosan egyező szekvenciákat tartalmaz (csupán 1–3 mismatch), hibridizálni fog ezzel a próba vonallal. Kimutatási reakció A hibridizációs reakciót követően a LINEAR ARRAY HPV genotipizáló csík erőteljesen lemosódik, eltávolítva bármely nem kötődött anyagot. Azután sztreptavidin-tormaperoxidáz konjugátum adódik a csíkhoz. A sztreptavidin-tormaperoxidáz konjugátum a csíkon lévő oligonukleotid próbákhoz hibridizált biotinilált amplikonhoz kötődik. A csík mosása során eltávozik a nem kötött sztreptavidin-tormaperoxidáz konjugátum, és a csíkokhoz hidrogén-peroxidot és 3,3',5,5'-tetrametil-benzidint (TMB) tartalmazó szubsztrátoldat adódik. Hidrogén-peroxid jelenlétében a kötődött sztreptavidin-tormaperoxidáz katalizálja a TMB kék színű komplexszé történő oxidációját, amely a hibridizációkor kicsapódik a megfelelő próbák helyén. A LINEAR ARRAY HPV genotipizáló csíkot azután szemmel lehet leolvasni a kék sávok mintázatának a LINEAR ARRAY HPV Genotyping Test referenciamutatóval való összehasonlítása révén.

EXTRN

50 teszt 1 × 310 μg

1 × 1,25 ml

+

REAGENSEK AmpliLute Liquid Media Extraction Kit AmpliLute folyékony táptalaj extraháló készlet P/N: 03750540 190 CAR (Hordozó RNS) Szintetikus RNS, liofilizált (Adjon hozzá AVE-t.) PK (Proteináz K) Proteináz K, szerinproteáz, tritirachium album Xn Proteinase K

Ártalmas R: 36/37/38-42/43 S: 23-24-26-36/37

Szem- és bőrizgató hatású, izgatja a légutakat. Belélegezve és bőrrel érintkezve túlérzékenységet okozhat (szenzibilizáló hatású lehet). A keletkező permetet nem szabad belélegezni. A bőrrel való érintkezés kerülendő. Ha szembe jut, bő vízzel azonnal ki kell mosni és orvoshoz kell fordulni. Megfelelő védőruházatot és védőkesztyűt kell viselni.

AVE (Eluáló puffer) RNáz-mentes víz < 0,09% nátrium-azid AW2 (Mosópuffer 2) Trisz-HCl puffer < 0,09% nátrium-azid (Adjon hozzá abszolút etanolt.) ATL (Szövetroncsoló puffer) EDTA ≤ 10% nátrium-dodecil-szulfát

04700627001-11HU

4 × 2 ml

1 × 13 ml

1 × 10 ml

3

Doc Rev. 11.0

1 × 33 ml

+

AL (Roncsoló puffer) ≤ 50% guanidin HCl Xn 25–50% guanidin HCl

Ártalmas R: 22-36/38 S: 13-26-36-46

Lenyelve ártalmas. Szem- és bőrizgató hatású. Élelmiszertől, italtól és állati takarmánytól távol tartandó. Ha szembe jut, bő vízzel azonnal ki kell mosni és orvoshoz kell fordulni. Megfelelő védőruházatot kell viselni. Lenyelése esetén azonnal orvoshoz kell fordulni, az edényt/csomagolóburkolatot és a címkét az orvosnak meg kell mutatni.

EXT (Oszloptöltet, 3 ml)

50 db

VC (Vákuumcsatlakozók)

50 db

ELT (Elúciós csövek, 1,5 ml)

50 db

CLM (QIAamp® MinElute® oszlopok) Kvarcmembrán

50 db

LINEAR ARRAY HPV Genotyping Test LINEAR ARRAY HPV genotipizáló teszt (P/N: 04391853 190)

LA HPV GT

HPV MMX (LINEAR ARRAY HPV master mix) Trisz-puffer kálium-klorid < 0,02% AmpliTaq Gold DNS-polimeráz (mikrobiális) < 0,1% AmpErase (uracil-N-glikoziláz) enzim (mikrobiális) < 0,001% dATP, dCTP, dUTP, dGTP, dTTP < 0,001% upstream és downstream primerek (biotinilált) 0,06% nátrium-azid HPV Mg2+ (LINEAR ARRAY HPV magnéziumoldat) < 1% magnézium-klorid amarántvörös festék 0,05% nátrium-azid

48 teszt

4 × 0,58 ml

4 x 0,125 ml

HPV (+) C 4 × 0,5 ml (LINEAR ARRAY HPV pozitív kontroll) Trisz-HCl puffer EDTA < 0,002% poli rA RNS (szintetikus) < 0,001% nem fertőző plazmid DNS (mikrobiális), amely HPV-szekvenciát tartalmaz < 0,001% nem fertőző plazmid DNS (mikrobiális), amely human ß-globin-szekvenciákat tartalmaz 0,05% nátrium-azid HPV (–) C (LINEAR ARRAY HPV negatív kontroll) Trisz-HCl puffer EDTA < 0,002% poli rA RNS (szintetikus) 0,05% nátrium-azid

04700627001-11HU

4 × 0,5 ml

4

Doc Rev. 11.0

HPV Strip (LINEAR ARRAY HPV genotipizáló csík) HPV DNS próbákkal és 1 humán ß-globin DNS próbával fedett nylon csík (magas és alacsony próba koncentrációk) LINEAR ARRAY Detection Kit LINEAR ARRAY kimutatási készlet (P/N: 03378179 190)

LA DK

DN (Denaturáló oldat) 1,6% nátrium-hidroxid EDTA Timolkék

96 teszt

2 × 12 ml

1,6% (w/w) nátrium-hidroxid

+

Xi

4 × 12 teszt

Irritatív SDS (SDS-koncentrátum) 20% nátrium-lauril-szulfát (SDS) 1% ProClin® 150 konzerváló

4 × 27 ml

SSPE (SSPE-koncentrátum) Nátrium-foszfát oldat Nátrium-klorid EDTA 1% ProClin® 150 konzerváló

2 × 160 ml

SA-HRP (Sztreptavidin-tormaperoxidáz konjugátum) Sztreptavidin-tormaperoxidáz konjugátum ACES puffer Nátrium-klorid 1% ProClin® 150 konzerváló

2 × 2 ml

CIT (Citrátkoncentrátum) citrátoldat

2 × 36 ml

SUB A (Szubsztrát A) citrátoldat 0,01% hidrogén-peroxid 0,1% ProClin® 150 konzerváló

3 × 160 ml

SUB B (Szubsztrát B) 0,1% 3,3',5,5'-tetrametil-benzidin (TMB) 40% dimetil-formamid (DMF) T

3 × 40 ml

40% (w/w) dimetil-formamid (DMF)

Mérgező R: 61-20/21-36 S: 53-45

04700627001-11HU

A születendő gyermekre ártalmas lehet. Belélegezve és bőrrel érintkezve ártalmas. Szemizgató hatású. Kerülni kell az expozíciót – használata előtt szerezze be a külön használati utasítást. Baleset vagy rosszullét esetén azonnal orvoshoz kell fordulni. Ha lehetséges, a címkét meg kell mutatni. 5

Doc Rev. 11.0

FIGYELMEZTETÉSEK ÉS ÓVINTÉZKEDÉSEK A.

IN VITRO DIAGNOSZTIKAI CÉLRA.

B.

A vizsgálatot cobas® PCR sejtminta-tápközeg vagy PreservCyt folyadék segítségével gyűjtött cervicalis mintákkal kell végezni.

C.

Ne pipettázzon szájjal.

D.

Ne egyen, igyon, vagy dohányozzon laboratóriumi munkaterületeken. Viseljen egyszer használatos védőkesztyűt, védőruhát és szemvédőt a minták és a készlet reagensei kezelése közben. Alaposan mosson kezet minták és tesztreagensek kezelése után.

E.

A reagensflakonokból való anyagkivétel során kerülje el a reagensek mikrobiális és DNSszennyezését Steril eldobható pipetták, DNS-mentes és DNáz-mentes pipetta hegyek használata ajánlott.

F.

Ne öntsön össze különböző tételekből, vagy azonos tételből, de különböző flakonokból származó reagenseket.

G.

A fel nem használt reagensek és a hulladék kezelésének összhangban kell lennie a megfelelő országos, szövetségi, állami és helyi szabályozásokkal.

H.

Ne használja a készletet a lejárati idő után.

I.

Biztonsági adatlapok (SDS) igény esetén hozzáférhetők a helyi Roche-irodában.

J.

A laboratóriumi munkafolyamatnak egyirányú módon kell zajlania, kezdve a preamplifikálási területtől a posztamplifikálási (amplifikálási/kimutatási) területig haladva. A preamplifikálási műveleteket a reagens-előkészítéssel kell kezdeni, és a minta-előkészítéssel folytatni. Valamennyi preamplifikálási művelethez tartozó felszerelést és eszközt jelölni kell, és tilos használni más művelethez vagy más munkaterületre átvinni. Valamennyi munka területen kesztyűt kell viselni, és a terület elhagyása előtt le kell venni. A reagens-előkészítéshez használt felszerelést és eszközöket tilos használni mintaelőkészítési műveletekhez, amplifikált DNS vagy más target DNS forrás pipettázásához vagy feldolgozásához. A posztamplifikálási műveletekhez tartozó felszerelést és eszközöket mindenkor a posztamplifikálási munkaterületen kell tartani.

K.

A mintákat fertőzőnek kell tekinteni, tehát kezelésüket a Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories16 című dokumentumban, illetve az M-29-A3 jelű CLSI-dokumentumban17 ismertetett biztonságos laboratóriumi eljárásokat alkalmazva kell végezni. Gondosan tisztítson meg, és ioncserélt vagy desztillált vízzel frissen készített 0,5% nátrium-hipoklorit oldattal fertőtlenítsen minden munkaterületet.

MEGJEGYZÉS: A kereskedelemben kapható háztartási fehérítő rendszerint 5,25%-ban tartalmaz nátrium-hipokloritot. 1:10 arányban hígított háztartási fehérítő megfelel 0,5% nátrium-hipoklorit oldatnak. L.

M.

N.

O.

P.

AW2, AVE, HPV MMX, HPV Mg2+, HPV (–) C és HPV (+) C nátrium-azidot tartalmaz. A nátriumazid ólom- és rézcsövekkel erősen robbanékony fém-azidokat képezve reakcióba léphet. Amikor nátrium-azid tartalmú oldatokat önt ki a laboratóriumi mosogatóba, az azidlerakódás megakadályozására nagy mennyiségű vízzel öblítse ki a lefolyót. Viseljen szemvédőt, laboratóriumi védőruhát és egyszer használatos védőkesztyűt a következő anyagok kezelése során: AL, PK, HPV MMX, HPV Mg2+, DN, SA-HRP, SUB A, SUB B és szubsztrát munkareagens (kevert SUB A és SUB B reagens). Ezen anyagok bőrrel, szemmel és nyálkahártyákkal való érintkezése kerülendő. Ha mégis előfordul érintkezés, azonnal mossa le nagy mennyiségű vízzel. Ellenkező esetben égő érzés előfordulhat. Ezen reagensek kiömlése esetén szárazra törlés előtt vízzel hígítsa. A SUB B és a szubsztrát munkareagens dimetil-formamidot tartalmaz, amelyről ismert, hogy nagy orális adagban mérgező, továbbá a születendő gyermekre nézve ártalmas hatású lehet. A bőrrel való érintkezést, a gőzök belégzését és az anyag lenyelését el kell kerülni. Ha mégis előfordul a bőrrel érintkezés, gondosan mossa le szappanos vízzel, és azonnal forduljon orvoshoz. Az AL guanidin hidrokloridot tartalmaz, amelyből fehérítővel való vegyülés során erősen reaktív vegyületek képződhetnek. Ha ezt a puffert tartalmazó folyadék kiömlik, a takarításhoz megfelelő laboratóriumi tisztítószert és vizet használjon. Ha a kiömlött folyadék potenciálisan fertőző ágenst tartalmaz, az érintett területet először laboratóriumi tisztítószerrel és vízzel takarítsa le, azután használjon 0,5% nátrium-hipokloritot. AL tartalmú hulladékhoz ne adjon közvetlenül fehérítőt vagy savas oldatot. Negatív nyomás alatt lévő üveg vagy műanyag tartályok használat során berobbanhatnak, mely személyi sérüléshez vezethet. Szemvédelem erősen ajánlott, valahányszor részleges negatív nyomás alatt lévő üveg vagy műanyag tartályokat használunk, hogy védjen a sérülések ellen. Csak speciálisan erre az alkalmazásra tervezett tartályokat szabad használni. Ne használjunk azt

04700627001-11HU

6

Doc Rev. 11.0

Q.

a tartályt vákuum alatt való alkalmazás során, amelyet nem arra terveztek, hogy bírják a vákuumot; ha a tartály karcos, csorbult vagy megrepedt; ha a tartály úgy van rögzítve, hogy ezáltal fokozza a nyomást; vagy ha a tartály kézben van tartva. A LINEAR ARRAY HPV Genotyping Test vizsgálathoz csak LINEAR ARRAY HPV master mix használható. Az AMPLICOR® HPV master mix nem használható a LINEAR ARRAY HPV Genotyping Test vizsgálattal.

TÁROLÁSI ÉS KEZELÉSI KÖVETELMÉNYEK A. B.

C.

D. E. F. G.

H.

I. J.

K.

Ne fagyassza le a reagenseket, hacsak másképp nincs említve. Tárolja az Amplilute folyékony táptalaj extraháló készletből származó CLM-et és PK-t 2–8 °C-on. A többi AmpliLute folyékony táptalaj extraháló készletből származó reagenst tárolja 2–25 °C-on. Felbontás után a PK fel nem használt része legfeljebb 2 hónapig tárolható 2–8 °C-on, az ATL és az AL legfeljebb 2 hónapig tárolható 2–25 °C-on, vagy a lejárati dátumig, amelyik előbb következik. A CAR az AVE-ban való oldást követoen 2–8 °C-on legfeljebb 24 óra hosszat tárolható, vagy kis részletekben –20 °C-ra fagyasztva tárolható legfeljebb 2 hónapig, vagy a lejárati dátumig, amelyik elobb következik. Az etanol hozzáadását követoen az AW2 fel nem használt részei tárolhatók 2–25 °C-on legfeljebb 2 hónapig, vagy a lejárati dátumig, amelyik elobb következik. Ha az oldott CAR-t az AL-hez adjuk, az AL munkareagens 2–8 °C-on legfeljebb 48 óráig tárolható. Tárolja a HPV MMX-t és a HPV Mg2+-t 2–8 °C-on. Felbontás nélkül ezek a reagensek a jelölt lejárati dátumig stabilak. Felbontást követően a fel nem használt részt ki kell dobni. A master mix munkareagenst (HPV Mg2+-t HPV MMX-hez hozzáadva készül) 2–8 °C-on kell tárolni, és az elkészítést követően 6 órán belül fel kell használni. Tárolja a HPV (–) C-t és HPV (+) C-t 2–8 °C-on. Felbontás nélkül ezek a reagensek a jelölt lejárati dátumig stabilak. Felbontás után a fel nem használt részt ki kell dobni. Tárolja a HPV Strip 2–8 °C-on. Felbontás nélkül ez a reagensek a jelölt lejárati dátumig stabil. Felbontást követően a fel nem használt csíkokat ki kell dobni. Tárolja a DN-t 2–25 °C-on. Felbontás nélkül, a DN a jelölt lejárati dátumig stabil. Felbontást követően a DN 2–25 °C-on 3 hónapig stabil(vagy a lejárati dátumig, amelyik előbb következik.) Tárolja a CIT, SA-HRP, SUB A és SUB B reagenseket 2–8 °C-on. Felbontás nélkül ezek a reagensek a jelölt lejárati dátumig stabilak. Felbontást követően ezek a reagensek 2–8 °C-on 1 hónapig stabilak (vagy a lejárati dátumig, amelyik előbb következik). Tárolja az SDS és SSPE reagenseket 2–8 °C-on. Felbontás nélkül ezek a reagensek a jelölt lejárati dátumig stabilak. Felbontást követően ezek a reagensek 2–8 °C-on 1 hónapig stabilak (vagy a lejárati dátumig, amelyik előbb következik). 2–8 °C-on való tárolás során az SDS és SSPE reagensekben csapadék képződik. Felhasználást megelőzően melegítse 53 °C ± 2 °C-ra maximum 30 percig, és a csapadék feloldása céljából erőteljesen keverje az oldatot. Az SDS és SSPE desztillált vagy ioncserélt vízzel való hígítással készített hibridizációs és mosó munkapufferek tiszta, zárt műanyag tartályban tárolandók, és az elkészítéstől számított 30 napig stabilak. Konjugátum munkaoldat frissen kell elkészíteni minden nap SA-HRP és a szobahőmérsékletű mosó munkapuffer összekeverésével és 3 óráig stabil szobahőmérsékleten. Szubsztrát munkareagenst frissen kell elkészíteni minden nap SUB A és SUB B összekeverésével, és 3 óráig stabil szobahőmérsékleten, fénytől védve. A SUB A-t, SUB B-t vagy a szubsztrát munkareagenst ne tegye ki fémeknek, oxidáló anyagoknak vagy direkt fénynek. CIT desztillált vagy ioncserélt vízzel való hígításával készített citrát munkapuffer szobahőmérsékleten tiszta, zárt tartályban tárolandók, és az elkészítéstől számított 30 napig stabilak.

A KÉSZLET TARTALMA A.

AmpliLute Liquid Media Extraction Kit AmpliLute folyékony táptalaj extraháló készlet (P/N: 03750540 190)

EXTRN

CAR (Hordozó RNS) PK (Proteináz K) AVE (Eluáló puffer) AW2 (Mosópuffer 2) ATL (Szövetroncsoló puffer) 04700627001-11HU

7

Doc Rev. 11.0

AL (Roncsoló puffer) EXT (Oszloptöltet, 3 ml) VC (Vákuumcsatlakozók) ELT (Elúciós csövek, 1,5 ml) CLM (QIAamp® MinElute® oszlopok) B.

LINEAR ARRAY HPV Genotyping Test LINEAR ARRAY HPV genotipizáló teszt (P/N: 04391853 190)

LA HPV GT

HPV MMX (LINEAR ARRAY HPV master mix) HPV Mg2+ (LINEAR ARRAY HPV magnéziumoldat) HPV (+) C (LINEAR ARRAY HPV pozitív kontroll) HPV (–) C (LINEAR ARRAY HPV negatív kontroll) HPV Strip (LINEAR ARRAY HPV genotipizáló csík) Referenciamutató (LINEAR ARRAY HPV Genotyping Test referenciamutató) C.

LINEAR ARRAY Detection Kit LINEAR ARRAY kimutatási készlet (P/N: 03378179 190)

LA DK

DN (Denaturáló oldat) SDS (SDS-koncentrátum) SSPE (SSPE-koncentrátum) SA-HRP (Sztreptavidin-tormaperoxidáz konjugátum) CIT (Citrátkoncentrátum) SUB A (Szubsztrát A) SUB B (Szubsztrát B) D.

24-Well Tray with Lid 24 üreges tálca fedéllel (P/N: 03140725 001)

SZÜKSÉGES, DE NEM BIZTOSÍTOTT ANYAGOK Preamplifikálás – Reagens-előkészítő terület •

• • •

Applied Biosystems Gold-plated 96-Well GeneAmp® PCR System 9700-hez használja a következőket: MicroAmp® reakciócsövek (AB# N801-0533), kupakok (AB# N801-0535 vagy AB# N801-0534), tartó/rögzítők (AB# 403081) vagy Ready-Pak MicroAmp szerelvény (AB# 403083) és aljzat (AB# N801-0531) Műanyag újrazárható tasak Eppendorf Multipette® pipetta* 1,0 ml vagy 1,25 ml Eppendorf Combitip® plusz (steril, egyenként csomagolt)*

04700627001-11HU

8

Doc Rev. 11.0

• •

Pipettahegyek (50 μl-től 125 μl-ig)* aeroszolbarrierrel vagy pozitív kiszorításos DNS és DNáz-mentes hegyek Egyszer használatos kesztyűk, púdermentes

Preamplifikálás – Minta- és kontroll-előkészítő terület • • • • • • • • • • • • • •

• • •

Eppendorf Multipette pipetta* 1,0 ml és 5,0 ml Eppendorf Combitip plusz (steril, egyenként csomagolt)* Pipettahegyek (20 μl, 200 μl és 1000 μl)* aeroszolbarrierrel vagy pozitív kiszorításos DNS és DNáz-mentes hegyek Steril 2,0 ml-es csavaros tetejű csövek (Sarstedt 72.693.005 vagy ennek megfelelő) Csőállvány (Sarstedt 93.1428 vagy ennek megfelelő) Abszolút ethanol – ACS követelményeinek megfelelően Steril polipropilén kúpos csövek; 15 ml és 50 ml: (Corning 430052 és 430290 vagy ennek megfelelő) Steril, egyszer használatos, szerológiai pipetták (5 ml, 10 ml és 25 ml) Pipet-Aid® (Drummond 4-000-100 vagy ennek megfelelő) Mikrocentrifuga (max. RCF 12 500 × g); Eppendorf 5415C, HERMLE Z230M vagy ennek megfelelő Vortex keverő 56 °C ± 2 °C és 70 °C ± 2 °C szárazfűtőblokkok Vákuumberendezés (pl. QIAvac 24, katalógusszám 19403; QIAvac 24 Plus, katalógusszám 19413 QIAvac csatlakozórendszerrel, katalógusszám 19419) Vákuumforrás [pl., -800 – -900 mbar vákuum előállítására képes szivattyú, KNF Neuberger LABOPORT® típusa: UN840.3FTP (115 V, 60 Hz) vagy típusa: N840.3FT.18 (230 V, 50 Hz) vagy QIAGEN vákuumpumpa P/N: 84000 (110 V, 60 Hz), 84010 (115 V, 60 Hz) vagy 84020 (230 V, 50 Hz)] a berendezéshez csatlakoztatva Vákuumszabályzó (QIAGEN katalógusszám 19530), opcionális Gyűjtőcsövek (2 ml, QIAGEN katalógusszám 19201), opcionális Egyszer használatos kesztyűk, púdermentes

Posztamplifikálás – Amplifikálási/Kimutatási terület •

Gold-plated 96-Well GeneAmp PCR System 9700 (Applied Biosystems, P/N: 4314878)

•

Steril, egyszer használatos, polisztirol szerológiai pipetták (5 ml, 10 ml és 25 ml)

•

Többcsatornás pipetta (kapacitás 100 μl)*

•

Pipettahegyek (20 μl, 200 μl és 1000 μl)* aeroszolbarrierrel vagy pozitív kiszorításos DNS és DNáz-mentes hegyek

•

Vortex keverő

•

Desztillált vagy ioncserélt víz

•

53 °C ± 2 °C 60 RPM fordulatszámra képes rázó vízfürdő (Bellco Hotshaker Plus, P/N: 774622110 (115 V, 60 Hz) vagy P/N: 774622220 (230 V, 50 Hz) vagy ennek megfelelő)

•

53 °C ± 2 °C vízfürdő

•

Megközelítőleg 60 RPM fordulatszámra képes orbitális rázó

•

Csipesz, rozsdamentes acél (VWR #: 30033-042 vagy ennek megfelelő)

•

Víz-, vegyszer- és hőálló permanens tintájú toll (Sharpie® Industrial Super Permanent Marker, P/N: 13801 vagy ennek megfelelő)

•

Vákuumszívó készülék megfelelő folyadékgyűjtő tárolóval (PYREX® márkájú nehéz falú szűrő palack, Corning P/N: 5340-2L vagy ennek megfelelő)

•

12 csatornás tű áramláselosztó/szívó (Art Robbins Instruments, P/N: 102-5020-12)

•

Ólomgyűrűsúly (~0,5 kg) (VWR #: 29700-004 vagy ennek megfelelő)

•

1 l, 2 l, 3 l tároló flakonok vagy palackok

•

100 ml, 250 ml, 500 ml főzőpoharak

•

100 ml, 250 ml, 500 ml, 1 l mérőhengerek

•

Eppendorf Multipette pipetta*

•

50 ml Eppendorf Combitip plus (steril, egyenként csomagolt)*

04700627001-11HU

9

Doc Rev. 11.0

•

50 ml adapter Eppendorf Biopur® (P/N: 0030 069.480)

•

RBS35 Tálcatisztító oldat (VWR #: PI27952 / Lyukasztás #: 27952)

•

Egyszer használatos kesztyűk, púdermentes

* A pipetták pontossága a névleges térfogat 3%-án belül legyen. Aeroszolbarrieres vagy pozitív kiszorításos DNS és DNáz-mentes pipettahegyeket kell használni ott, ahol alapvető megelőzni a minta és az amplikon keresztszennyeződését.

A MINTA LEVÉTELE, TRANSZPORTJA ÉS TÁROLÁSA

MEGJEGYZÉS: Valamennyi mintát fertőzések átvitelére alkalmasként kell kezelni. A. A minta levétele Csak a cobas® PCR sejtminta-tápközegbe vagy PreservCyt folyadékba levett cervicalis mintákat validálták a LINEAR ARRAY HPV Genotyping Testtel való használatra. A cervicalis sejtmintáknak a cobas® PCR sejtminta-tápközegbe vagy PreservCyt folyadékba való levételéhez kövesse a gyártó utasítását. B. A minta transzportja A cobas® PCR sejtminta-tápközegbe vagy PreservCyt folyadékba levett cervicalis sejtminták 2–30 °C-on transzportálhatók. A cervicalis sejtminták transzportja meg kell feleljen a kóroki ágensek transzportjára vonatkozó országos, szövetségi, állami és helyi szabályozásoknak18. C. A minta tárolása A cobas® PCR sejtminta-tápközegben vagy PreservCyt oldatban gyűjtött cervicalis sejtminták 2–30 °C között, legfeljebb 6 hónapig tárolhatók. HASZNÁLATI UTASÍTÁS

MEGJEGYZÉS: Hagyja a reagenseket, hogy felvegyék a szobahőmérsékletet (15–30 °C) használat előtt, hacsak másképp nem említik. A vizsgálati eljárás megkezdése előtt valamennyi reagenst vizsgáljon meg, hogy elégséges térfogat áll-e rendelkezésre. MEGJEGYZÉS: A cervicalis sejtmintáknak szobahőmérsékletűnek kell lenniük (15–30 °C) használat előtt. MEGJEGYZÉS: Használjon aeroszolbarrieres pipettákat vagy pozitív kiszorításos hegyeket, ahol indokolt. A szelektív amplifikálás érdekében rendkívüli gondossággal járjon el. Futtatási mennyiség: Minden egyes AmpliLute folyékony táptalaj extraháló készlet 50 vizsgálatra elegendő reagenst tartalmaz. Minden egyes LINEAR ARRAY Detection Kit 96 vizsgálatra elegendő reagenst tartalmaz. Minden egyes LINEAR ARRAY HPV Genotyping Test elegendő reagenst tartalmaz négy darab 12 mintás futtatáshoz, amelyek kivitelezhetőek külön-külön vagy párhuzamosan. Valamennyi futtatásnak legalább egy LINEAR ARRAY HPV negatív kontrollt és egy LINEAR ARRAY HPV pozitív kontrollt kell tartalmaznia minden egyes teszt futtatáshoz 22 minta esetén (lásd „Minőség-ellenőrzés”). Az amplifikálási reagensek 12 tesztre elegendő egyszer használatos üvegekben vannak. LINEAR ARRAY HPV negatív kontroll és a LINEAR ARRAY HPV pozitív kontroll egyszer használatos üvegekben vannak. A LINEAR ARRAY HPV genotipizáló csíkok 12 tesztre elegendő egyszer használatos tasakokban vannak. A reagensek leghatékonyabb felhasználása céljából a mintákat és a kontrollokat 12 többszörösének megfelelő tételekben kell feldolgozni. Munkafolyamat: Az LINEAR ARRAY HPV Genotyping Test egy vagy két nap alatt végezhető el. Ha a vizsgálatot egyetlen munkanap alatt kell elvégezni, kövesse sorban az utasításokat A-tól D-ig. Ha a vizsgálatot 2 nap alatt kell elvégezni, a műveletsor megszakítható a Minta és kontroll előkészítése (B pont) vagy az Amplifikálás (C pont) után. Ha a minta és kontroll előkészítését az 1. napon, az amplifikálást és kimutatást pedig a 2. napon kívánja elvégezni akkor kövesse a B pont lépéseit 1-től 29-ig, és tárolja a feldolgozott mintákat és kontrollokat a B.29. lépésben leírtaknak megfelelően. A 2. napon kezdje az A ponttal (Reagens előkészítése), azután olvassza fel a mintákat és kontrollokat szobahőmérsékleten, majd folytassa a B.30. lépéssel.

MEGJEGYZÉS: Ne tegye ki a feldolgozott mintákat és kontrollokat több, mint 1 fagyasztás/olvasztás ciklusnak. Ha a minta- és kontroll-előkészítést és amplifikálást az 1. napon, a kimutatást pedig a 2. napon kívánja elvégezni, akkor kövesse az A pont (Reagens előkészítése), B pont (Minta és kontroll előkészítése) és C pont (Amplifikálás) lépéseit az 1. napon, és tárolja a denaturált amplikonokat 2–8 °C-on a C.6. lépésben leírtaknak megfelelően. A 2. napon folytassa a D ponttal (Genotípus kimutatása LINEAR ARRAY HPV csíkkal). 04700627001-11HU

10

Doc Rev. 11.0

A.

Reagens előkészítéshez Munkaterület: Preamplifikálás – Reagens-előkészítő terület 1. Határozza meg a minta- és a kontrollvizsgálatokhoz szükséges reakciócsövek számát. Helyezze a csöveket a MicroAmp tartóba és rögzítse őket. 2. Készítse el a master mix munkareagenst 125 μl HPV Mg2+, egy ampulla HPV MMX reagenshez való hozzáadásával. A master mix térfogatát nem szükséges megmérnie. Mérjen 125 μl HPV Mg2+ oldatot egy teljes üveg HPV MMX reagenshez. Csavarja rá a kupakot, majd a cső 10–15-szöri fordítgatásával keverje jól össze az oldatokat. A master mix munkareagenst ne vortexelje. A HPV Mg2+ rózsaszín színe alkalmas, hogy meggyőződjön arról, hogy a HPV Mg2+ oldatot a HPV MMX reagenshez ada. A maradék HPV Mg2+ oldatot dobja ki. 3. Mérjen valamennyi reakciócsőbe 50 μl master mix munkareagenst Multipette pipettával, illetve aeroszolbarrierrel vagy pozitív kiszorításos heggyel ellátott pipettával. Ezután ne tegye a csövekre a kupakokat. 4. Helyezze a master mix munkareagenst és a megfelelő számú reakciócső kupakot tartalmazó tartót egy újrazárható műanyag tasakba, és gondosan zárja le a műanyag tasakot. Menjen át a Preamplifikálás – Minta- és kontroll-előkészítő területre. A minta és kontroll előkészítése befejezéséig tárolja a master mix munkareagenst tartalmazó tartó(ka)t 2–8 °C-on a Preamplifikálás – Minta- és kontroll-előkészítő területen. A master mix munkareagens a reakció csövekben lezárt műanyag tasakban 2–8 °C-on 6 óra hosszat stabil.

B.

Minta és kontroll előkészítéshez Munkaterület: Preamplifikálás – Minta- és kontroll-előkészítő terület 1. Állítsa be a hőmérsékletét egy szárazfűtőblokknak 56 °C ± 2 °C-ra. 2. Állítsa be a hőmérsékletét egy másik szárazfűtőblokknak 70 °C ± 2 °C-ra. 3. Hagyja, hogy a reagensek, minták és kontrollok felvegyék a szobahőmérsékletet (legalább 15 perc). Ha csapadék képződött az ATL-ben vagy AL-ben, oldja fel 70 °C-ra melegítve és finoman kavargassa. MEGJEGYZÉS: A B.4.–B.6. lépéseket a minták/kontrollok PK és ATL reagensekkel való inkubálása (B.10. lépés) alatt elvégezheti. 4. 310 μl AVE hozzáadásával oldja fel a liofilizált CAR-t. Vortexelje 10 másodpercig. Feliratozza és dátumozza meg az ampullát.

MEGJEGYZÉS: A feloldott CAR 2–8 °C-on 24 óráig stabil, vagy kis részletekben –20 °C-ra fagyasztva 2 hónapig tárolható, vagy a lejárati dátumig, amelyik előbb következik. Ne fagyassza-olvassza a feloldott CAR-t 3-nál többször. 5. Mérjen 30 ml abszolút etanolt az AW2-höz. Feliratozza és dátumozza meg a palackot. Keverje a feloldott AW2-t rázással.

MEGJEGYZÉS: A feloldott AW2 szobahőmérsékleten 2 hónapig tárolható, vagy a lejárati dátumig, amelyik előbb következik. 6. Készítse elő az AL munkaoldat megfelelő térfogatú AL-ban oldott CAR-t ahogy az 1. táblázat mutatja. Óvatosan keverje, 10-szer felforgatva a csövet. Habzás elkerülése miatt ne vortexelje.

1. táblázat AL munkaoldat készítése Elvégzendő minta/kontroll vizsgálatok száma Reagensek

12

24

36

48

60

72

96

CAR (ml)

0,04

0,07

0,10

0,13

0,16

0,20

0,25

AL (ml)

4,0

7,0

10,0

13,0

16,0

20,0

25,0

MEGJEGYZÉS: Az AL munkaoldat 2–8 °C-on 48 óráig stabil. 7. Minden egyes feldolgozandó mintához és kontrollhoz címkézzen meg egy-egy 2 ml-es csavarókupakos csövet. MEGJEGYZÉS: NE használjon 1,5 ml-es csavarókupakos csövet vagy bármely kúpalakú csövet, mivel az zavarja az inkubálás alatti hőátadást, és inkomplett roncsolást eredményezhet. 8. Mérjen be 80 μl ATL-t mindegyik csőbe.

04700627001-11HU

11

Doc Rev. 11.0

9. Minden mintát és kontrollt 10 másodpercig vortexeljen. Adjon minden mintából és kontrollból 250 μl-t a megfelelően címkézett csőbe. 10. Mérjen be 20 μl PK-t mindegyik csőbe. Csavarja a csövekre a kupakokat, és vortexelje őket 10 másodpercig. Inkubálja a csöveket 56 °C ± 2 °C-on 30 percig szárazfűtőblokkban. 11. A minták és kontrollok inkubálása alatt szerelje össze a QIAvac 24 (vagy QIAvac 24 Plus) vákuumberendezést a QIAGEN vákuumberendezés kézikönyve szerint. Vegyen ki egy-egy CLM-et minden egyes minta és kontroll számára a buborék csomagolásból, és címkézze fel őket. Őrizze meg a hulladékgyűjtő csöveket a B.23. lépésben való használathoz. Nyissa ki a CLM tetejét és tegye be a VC-be. Helyezze bele az EXT-et a CLM-be. 12. Az 56 °C ± 2 °C-on való inkubálást követően mérjen 250 μl AL munkaoldatot minden egyes csőbe. Csavarja a csövekre a kupakokat, és vortexelje őket maximum sebességen 10 másodpercig. MEGJEGYZÉS: Az AL munkaoldat hozzáadásakor egy fehér csapadék képződhet. A csapadék nem zavarja a minta- és kontroll-előkészítő eljárást, és a következő inkubálás alatt fel fog oldódni. 13. Inkubálja a csöveket 70 °C ± 2 °C-on 15 percig szárazfűtőblokkban. Az inkubálás ideje alatt időnként vortexelje a mintákat és kontrollokat. 14. A minták és kontrollok 70 °C ± 2 °C-on való inkubálását követően mérjen 300 μl abszolút etanolt minden egyes csőbe. Csavarja a csövekre a kupakokat, és vortexelje őket maximum sebességen 15 másodpercig. 15. Inkubálja a csöveket 5 percig szobahőmérsékleten. Impulzuscentrifugázza le a csöveket egy asztali centrifugán maximum RPM mellett. 16. Vigye át a lizátumot minden egyes csőből a megfelelő CLM-re. Hagyja inkubálódni legalább 1 percig. 17. Kapcsolja be a vákuumszivattyút. Az összes lizátum eltávolításához csatlakoztassa a vákuumot a berendezésre, és folytassa a szívást legalább még 1 percig. Engedje ki a vákuumot a berendezésből a QIAGEN vákuumberendezés kézikönyvében leírtak szerint.

MEGJEGYZÉS: Ha egy minta vagy kontroll lizátuma nem ment át maradéktalanul a membránon, helyezze a CLM-et egy 2 ml-es gyűjtő csőbe, csavarja rá a kupakot, és centrifugálja teljes sebességen 1 percig, illetve amíg a lizátum maradéktalanul át nem megy. További 2 ml-es gyűjtőcsövek külön megvásárolhatóak (lásd „SZÜKSÉGES, DE NEM BIZTOSÍTOTT ANYAGOK”). 18. Mérjen 750 μl AW2-t mindegyik CLM-re. Hagyja inkubálódni legalább 1 percig. 19. Kapcsolja be a vákuumszivattyút. Az összes folyadék eltávolításához csatlakoztassa a vákuumot a berendezésre, és folytassa a szívást legalább még 1 percig. Engedje ki a vákuumot a berendezésből a QIAGEN vákuumberendezés kézikönyvében leírtak szerint. 20. Mérjen 750 μl abszolút etanolt mindegyik CLM-re. Hagyja inkubálódni legalább 1 percig. 21. Kapcsolja be a vákuumszivattyút. Az összes folyadék eltávolításához csatlakoztassa a vákuumot a berendezésre, és folytassa a szívást legalább még 1 percig. Engedje ki a vákuumot a berendezésből a QIAGEN vákuumberendezés kézikönyvében leírtak szerint. 22. Óvatosan vegye ki az EXT-et a CLM-ből. Dobja ki az EXT-et.

MEGJEGYZÉS: A keresztszennyeződés elkerülése végett gondosan ügyeljen az EXT eltávolításakor, hogy ne érjen a szomszédos CLM-hez. 23. Helyezzen minden egyes CLM-et a hulladék gyűjtő csőbe (a B.11. lépésből), és zárja le a fedőt. Centrifugálja őket maximum RPM mellett 3 percig. 24. Címkézzen fel egy ELT-et minden egyes mintához és kontrollhoz. 25. Dobja ki a hulladékgyűjtő csöveket, és helyezzen minden egyes CLM-et a megfelelően címkézett ELT-be. 26. Nyissa ki a fedőt minden egyes CLM-en, és inkubáljon szobahőmérsékleten 15 percig. 27. Mérjen 120 μl AVE-t mindegyik CLM-re. Zárjon le minden egyes fedelet.

MEGJEGYZÉS: Minden egyes CLM-re való mérést megelőzően győződjön meg arról, hogy az AVE szobahőmérsékletű. 28. Inkubáljon szobahőmérsékleten 5 percig, majd centrifugálja őket maximum RPM mellett 1 percig. 29. Vegye ki a CLM-et a csövekből, dobja ki, a csövekre pedig csavarja rá a kupakokat. Amplifikálja a feldolgozott mintákat és kontrollokat azonnal, vagy tárolja 2–8 °C-on, illetve ≤ -20 °C-on lefagyasztva. A feldolgozott minták és kontrollok szobahőmérsékleten 6 óra hosszat, 2–8 °C-on 04700627001-11HU

12

Doc Rev. 11.0

7 napig, illetve -20 °C-on vagy az alatt 8 hétig tárolhatók, legfeljebb egy fagyasztás/olvasztási ciklust végezve. Több, mint egy fagyasztás/olvasztás ciklus jelveszteséget eredményezhet. 30. Mérjen minden egyes feldolgozott mintából és kontrollból 50 μl-t a megfelelő master mix munkareagenst tartalmazó amplifikációs csövekbe. Használjon új aeroszolbarrieres vagy pozitív kiszorításos hegyet minden egyes mintához és kontrollhoz. Csavarja az amplifikációs csövekre a kupakokat.

MEGJEGYZÉS: Fagyasztva tárolt feldolgozott minták és kontrollok használatakor hagyja a fagyasztott feldolgozott mintákat és kontrollokat szobahőmérsékletre felolvadni. Felolvadás után vortexeljen minden mintát és kontrollt erőteljesen 10 másodpercig. Ha a feldolgozott minták és kontrollok 2–8 °C-on vannak tárolva, vortexeljen minden feldolgozott mintát és kontrollt erőteljesen 10 másodpercig, mielőtt a master mix munkaoldathoz adja. MEGJEGYZÉS: Az Applied Biosystems Gold-plated 96-Well GeneAmp PCR System 9700-en az amplifikációt 45 percen belül meg kell kezdeni, miután a feldolgozott mintát és kontrollt a master mix munkaoldathoz adtuk. 31. Vigye át az amplifikációs tartóban lévő előkészített mintákat és kontrollokat az Amplifikálási/ Kimutatási területre. A feldolgozott minták és kontrollok maradéka a B.29. lépéseknek megfelelően kell tárolni. C.

Amplifikáláshoz Munkaterület: Posztamplifikálás – Amplifikálási/Kimutatási terület 1. Helyezze a tartó/rögzítő szerelvényt a PCR-készülékblokkba. 2. Az LINEAR ARRAY HPV Genotyping Test kivitelezéséhez az Applied Biosystems Gold-plated 96-Well GeneAmp PCR System 9700 berendezést az alábbiak szerint programozza: HOLD program: HOLD program: CYCLE program (40 ciklus): HOLD program: HOLD program:

2 perc 50 °C 9 perc 95 °C 30 másodperc 95 °C, 1 perc 55 °C, 1 perc 72 °C (Hőmérsékletváltás sebessége = 50%) 5 perc 72 °C 72 °C időkorlát nélkül

A ciklus (CYCLE) programokban állítsa a hőmérséklet-váltási időtartamot 50%-ra. Kívánság szerint írja be a módszer (Method name) és a felhasználó nevét (User name). A PCRkészülék programozásával és működtetésével kapcsolatos további információkat illetően forduljon az Applied Biosystems Gold-plated 96-Well GeneAmp PCR System 9700 felhasználói kézikönyvéhez. 3. Indítsa a METHOD programot. A „Method Option” menüben állítsa a „Ramp Speed”-et „Max”-ra és a „Reaction Volume”-t „100 μL”-re. Nyomja meg ismét a START-ot. A program mintegy 3 óra 15 percig fut. 4. Vegye ki a tartót a PCR-készülékből az utolsó HOLD program alatt 4 órán belül, helyezze a MicroAmp aljzatba, és folytassa azonnal az 5. lépéssel. Ne hagyja a reakciócsöveket a PCRkészülékben 4 óránál tovább. NE VIGYEN AMPLIFIKÁLT MINTÁKAT A PREAMPLIFIKÁLÁSI TERÜLETRE. AZ AMPLIFIKÁLT KONTROLLOK ÉS MINTÁK A POTENCIÁLIS SZENNYEZŐDÉS FŐ FORRÁSAINAK TEKINTENDŐK. 5. Az amplifikálási termékek aeroszolképződését elkerülendő, óvatosan vegye le a kupakokat a reakciócsövekről. Mérjen azonnal a reakciócsövek első oszlopába (vagy sorába) 100 μl DN-t aeroszolbarrierrel ellátott többcsatornás pipettával, és keverje össze ötszöri fel-le pipettázással. Ismételje meg az eljárást új hegysorral minden egyes oszlop (vagy sor) esetén. 6. A denaturált amplikonok szobahőmérsékleten legfeljebb 5 óra hosszat tarthatóak a kimutatást (D pont) megelőzően. Ha a kimutatásra 5 órán belül nem kerülhet sor, akkor csavarjon új kupakokat a csövekre, és tárolja a denaturált amplikonokat 2–8 °C-on legfeljebb 7 napig. D.

Genotípus kimutatása LINEAR ARRAY HPV csíkkal Munkaterület: Posztamplifikálás – Amplifikálási/Kimutatási terület

MEGJEGYZÉS: A kimutatás alatt ne hagyja a mintákat egyik tálcából a másikba fröccsenni. Ne engedje, hogy a vízfürdőből a víz a tálcákba fröccsenjen. Ne rakja egymásra a 24 üreges tálcákat. 1. Valamennyi kimutatási reagenst melegítsen szobahőmérsékletre. 2. Melegítse elő a vízfürdőt 53 °C ± 2 °C-ra. 04700627001-11HU

13

Doc Rev. 11.0

3. Melegítse elő a rázó vízfürdőt 53 °C ± 2 °C -ra megközelítőleg 60 RPM rázási sebesség mellett. Győződjön meg róla, hogy a 24 üreges tálca hevítéséhez elegendő víz van a fürdőben, de nem annyira sok, hogy belefröccsenjen a 24 tálcába. A víznek a külső üregmélység 1/4-éig vagy a 24 üreges tálcán 0,5 cm-ig kell érnie.

MEGJEGYZÉS: Álpozitív eredményeket adhat, ha a vízfürdő vize nem megfelelően érintkezik a 24 üreges tálcával. 4. Készítse el a hibridizációs munkapuffert a következők szerint: Az SSPE és SDS oldatokat vizsgálja meg, és szükség esetén a csapadék visszaoldására a vízfürdőben melegítse 53 °C ± 2 °C-ra. Adjon 100 ml SSPE oldatot 388 ml ioncserélt vagy desztillált vízhez. Keverje jól össze. Mérjen hozzá 12,5 ml SDS oldatot, és keverje jól össze. A hibridizációs munkapuffer elegendő 100 LINEAR ARRAY HPV genotipizáló csíkhoz. A hibridizációs munkapuffer szobahőmérsékleten tiszta tartályban tárolandó, és 30 napig stabil. 5. Készítse el a szobahőmérsékletű mosó munkapuffert a következők szerint: Az SSPE és SDS oldatokat vizsgálja meg, és szükség esetén a csapadék visszaoldására a vízfürdőben melegítse 53 °C ± 2 °C-ra. Adjon 133 ml SSPE oldatot 2520 ml ioncserélt vagy desztillált vízhez. Keverje jól össze. Mérjen hozzá 13,3 ml SDS oldatot, és keverje jól össze. A szobahőmérsékletű mosó munkapuffer elegendő 100 LINEAR ARRAY HPV genotipizáló csíkhoz. A szobahőmérsékletű mosó munkapuffer szobahőmérsékleten tiszta tartályban tárolandó, és 30 napig stabil. 6. Készítse el a magas hőmérsékletű mosó munkapuffert a következők szerint: Minden csík számára különítsen el 5 ml szobahőmérsékletű mosó munkapuffert (az előző lépésben előkészítve) és öntse bele egy megfelelő méretű tiszta média üvegbe. (pl. 24 csík futtatásához különítsen el 120 ml szobahőmérsékletű mosó munkapuffert és öntse bele a médiapalackba.) A magas hőmérsékletű mosó munkapuffert minden egyes futtatás előtt frissen kell készíteni. 7. Melegítse a hibridizációs munkapuffert és magas hőmérsékletű mosó munkapuffert 53 °C ± 2 °C-os vízfürdőben legalább 15 percig. Hagyja a hibridizációs munkapuffert és magas hőmérsékletű mosó munkapuffert a vízfürdőben használatig. 8. Készítse el a citrát munkapuffert a következők szerint: A CIT oldatot vizsgálja meg, és szükség esetén a csapadék visszaoldására vízfürdőben melegítse 53 °C ± 2 °C-ra. Adjon 25 ml CIT oldatot 475 ml ioncserélt vagy desztillált vízhez. Keverje jól össze. A citrát munkapuffer elegendő 100 LINEAR ARRAY HPV genotipizáló csíkhoz. A citrát munkapuffer szobahőmérsékleten tiszta tartályban tárolandó, és 30 napig stabil. 9. Vegye ki a szükséges számú LINEAR ARRAY HPV genotipizáló csíkot a HPV Strip tasakból tiszta csipesz segítségével. 10. Víz-, vegyszer- és hőálló permanens tintájú toll segítségével jelöljön meg minden egyes HPV Strip-et a megfelelő minta-, illetve kontrollazonosítóval. 11. Helyezzen minden egyes csíkot próbasorozatokkal felfelé a 24 üreges tálca megfelelő üregébe. 12. Mérjen 4 ml előmelegített hibridizációs munkapuffert minden egyes jelölt csíkot tartalmazó üregbe. 13. Aeroszolbarrierrel vagy pozitív kiszorításos heggyel ellátott pipettával gondosan mérjen be 75 μl denaturált amplikont a megfelelő jelölt csíkot tartalmazó üregbe. Hintáztassa a tálcát óvatosan minden egyes bemérés között. Használjon új hegyet minden egyes amplikon hozzáadásához. 14. Fedje le a 24 üreges tálcát a fedéllel, és helyezze az 53 °C ± 2 °C -os rázó vízfürdőbe. Helyezzen egy kb. 0,5 kg-os ólomgyűrűsúlyt a tálcafedélre, hogy a 24 üreges tálca a rázó vízfürdőben a helyén maradjon. Hibridizáljon 30 percig megközelítőleg 60 RPM rázási sebesség mellett. 15. Hibridizáció alatt (14. lépés) készítse el a konjugátum munkaoldatot a következők szerint: Mérjen 15 μl SA-HRP oldatot 5 ml szobahőmérsékletű mosó munkapufferhez csíkonként. Keverje jól össze. A konjugátum munkaoldat szobahőmérsékleten tiszta tartályban tárolandó, és 3 óráig stabil. 16. Vegye ki a 24 üreges tálcát a rázó vízfürdőből, és vákuumleszívással távolítsa el a hibridizációs munkapuffert az üregekből. 17. Mérjen 4 ml szobahőmérsékletű mosó munkapuffert minden egyes üregbe, mely csíkot tartalmaz. Óvatosan hintáztassa a 24 üreges 3–4-szer, hogy leöblítse a csíkokat, majd vákuumleszívással azonnal távolítsa el a szobahőmérsékletű mosó munkapuffert az üregekből. 18. Mérjen 4 ml előmelegített magas hőmérsékletű mosópuffert minden egyes üregbe, mely csíkot tartalmaz. Töröljön le bármilyen lecsapódott folyadékot a tálca fedeléről tiszta papírtörlővel, helyezze a fedelet a 24 üreges tálcára, és tegye vissza a 24 üreges tálcát az 53 °C ± 2 °C -os rázó vízfürdőbe. Helyezzen egy kb. 0,5 kg-os ólomgyűrűsúlyt a tálcafedélre, hogy a 24 üreges 04700627001-11HU

14

Doc Rev. 11.0

tálca a rázó vízfürdőben a helyén maradjon. Inkubáljon 15 percig megközelítőleg 60 RPM rázási sebesség mellett. 19. Vegye ki a 24 üreges tálcát a rázó vízfürdőből, és vákuumleszívással távolítsa el a magas hőmérsékletű mosó munkapuffert az üregekből. 20. Mérjen 4 ml konjugátum munkaoldatot minden egyes üregbe, mely csíkot tartalmaz. Töröljön le bármilyen lecsapódott folyadékot a tálca fedeléről tiszta papírtörlővel, helyezze a fedelet a 24 üreges tálcára, és tegye a 24 üreges tálcát a szobahőmérsékletű orbitális rázóra. Inkubáljon 30 percig szobahőmérsékleten (15–30 °C) megközelítőleg 60 RPM rázási sebesség mellett. 21. Vegye le a 24 üreges tálcát az orbitális rázóról, és vákuumleszívással távolítsa el a konjugátum munkaoldatot az üregekből. 22. Mérjen 4 ml szobahőmérsékletű mosó munkapuffert minden egyes üregbe, mely csíkot tartalmaz. Óvatosan hintáztassa a 24 üreges 3–4-szer, hogy leöblítse a csíkokat, majd vákuumleszívással azonnal távolítsa el a szobahőmérsékletű mosó munkapuffert az üregekből. 23. Mérjen 4 ml szobahőmérsékletű mosó munkapuffert minden egyes üregbe, mely csíkot tartalmaz. Töröljön le bármilyen lecsapódott folyadékot a tálca fedeléről tiszta papírtörlővel, helyezze a fedelet a 24 üreges tálcára, és tegye a 24 üreges tálcát a szobahőmérsékletű orbitális rázóra 10 percre megközelítőleg 60 RPM rázási sebesség mellett. 24. Vegye le a 24 üreges tálcát az orbitális rázóról, és vákuumleszívással távolítsa el a szobahőmérsékletű mosó munkapuffert az üregekből. 25. Mérjen 4 ml szobahőmérsékletű mosó munkapuffert minden egyes üregbe, mely csíkot tartalmaz. Helyezze a fedelet a 24 üreges tálcára, és helyezze a 24 üreges tálcát a szobahőmérsékletű orbitális rázóra 10 percre megközelítőleg 60 RPM rázási sebesség mellett. 26. Vegye le a 24 üreges tálcát az orbitális rázóról, és vákuumleszívással távolítsa el a szobahőmérsékletű mosó munkapuffert az üregekből. 27. Mérjen 4 ml citrát munkapuffert minden egyes üregbe, mely csíkot tartalmaz. Helyezze a fedelet a 24 üreges tálcára, és helyezze a 24 üreges tálcát a szobahőmérsékletű orbitális rázóra 5 percre megközelítőleg 60 RPM rázási sebesség mellett. 28. Készítse el a szubsztrát munkareagenst a következők szerint: Mérjen 4 ml SUB A reagenst 1 ml SUB B reagenshez csíkonként. Keverje jól össze. A szubsztrát munkareagens szobahőmérsékleten, közvetlen fénytől védve tiszta tartályban tárolandó, és 3 óráig stabil. 29. Vegye le a 24 üreges tálcát az orbitális rázóról, és vákuumleszívással távolítsa el a citrát munkapuffert az üregekből. 30. Mérjen 4 ml szubsztrát munkareagenst minden egyes üregbe, mely csíkot tartalmaz. Helyezze a fedelet a 24 üreges tálcára, és helyezze a 24 üreges tálcát a szobahőmérsékletű orbitális rázóra 5 percre megközelítőleg 60 RPM rázási sebesség mellett. 31. Vegye le a 24 üreges tálcát az orbitális rázóról, és vákuumleszívással távolítsa el a szubsztrát munkareagenst az üregekből. 32. Mérjen 4 ml desztillált vagy ioncserélt vízhez minden egyes üregbe, mely csíkot tartalmaz. 33. Távolítsa el a csíkokat a 24 üreges tálcáról egy tiszta csipesz segítségével, helyezze tiszta és száraz felületre, és az értékelés előtt hagyja, hogy a csíkok legalább egy óráig, legfeljebb 72 óráig száradjanak a levegőn, szobahőmérsékleten. 24 üreges tálca tisztítása Munkaterület: Posztamplifikálás – Amplifikálási/Kimutatási terület MEGJEGYZÉS: A 24 üreges tálcák eldobhatók vagy újrahasznosíthatók. A tálcák újrahasznosításához a következõ tisztítási eljárást kell követni minden használat után. 1. Készítsen 10%-os RBS35 oldatot úgy, hogy adjon 1 térfogatrész RBS35 oldatot 9 térfogatrész ioncserélt vagy desztillált vízhez. 2. Töltsön meg minden egyes tálcát a 10%-os oldattal, és hagyja ázni egy éjszakán át szobahőmérsékleten. 3. Öblítse le a tálcát alaposan desztillált vagy ioncserélt vízzel. 4. Használat előtt teljesen szárítsa meg a tálcát.

04700627001-11HU

15

Doc Rev. 11.0

EREDMÉNYEK Győződjön meg róla, hogy a futtatás kontrollértékei érvényesek (validak) legyenek. (lásd Minőségellenőrzés). Ha a futtatás érvénytelen (invalid), ismételje meg a teljes eljárást (minta-előkészítés, amplifikálás és genotípus kimutatása LINEAR ARRAY HPV csíkkal). Az érvényes futtatás érdekében a LINEAR ARRAY HPV genotipizáló csík értelmezéséhez a LINEAR ARRAY HPV Genotyping Test referenciamutatót helyezze a csíkra a kivágott területen, hogy a HPVgenotípus referenciavonalak a csík mindkét oldalán látsszanak. Ellenőrizze, hogy hogy a referenciamutató fekete tintával jelölt referenciavonala (REF) egyvonalban legyen a HPV-csíkon levő folytonos fekete vonallal. Jegyezze fel a pozitív látható sávokat és értékelje a HPV és ß–globin (BG) eredményeket minden egyes csík esetén az alábbiak szerint: BG LowBG HighHPVÉrtékelés eredmények eredmények eredmények

–

–

–

Érvénytelen eredmény. HPV DNS, ha jelen is van, nem kimutatható. BG High és BG Low eredmények hiánya nem megfelelő mintagyűjtésre, előkészítésre, vagy gátlóanyagok jelenlétére utalhat. Az eredeti minta egy másik részletével ismételje meg a vizsgálatot. Ha az eredeti minta nem elérhető, új mintát kell venni.

–

–

+

Érvénytelen eredmény. HPV DNS, ha jelen is van, nem volt kimutatható. BG Low inhibitor hiánya nem megfelelő mintagyűjtésre, előkészítésre, vagy gátlóanyagok jelenlétére utalhat. Az eredeti minta egy másik részletével ismételje meg a vizsgálatot. Ha az eredeti minta nem elérhető, új mintát kell venni.

–

+

+

HPV DNS nem kimutatható. A negatív eredmény nem zárja ki a HPV-fertőzés jelenlétét, mivel az eredmény a megfelelő mintavételen, előkészítésen, gátlóanyagok hiányán, és az elegendő mennyiségű kimutatható HPV DNS jelenlétén is múlik.

+

–

–

HPV DNS kimutatva (genotípus megadása). A minta HPV jelenlétére nézve pozitív. BG Low és BG High hiánya nem megfelelő mintagyűjtésre, előkészítésre, gátlóanyagok jelenlétére utalhat, vagy kompetícióra magas titerű HPV targettel. További nem kimutatható HPV-genotípusok lehetnek jelen.

+

–

+

HPV DNS kimutatva (genotípus megadása). A minta HPV jelenlétére nézve pozitív. BG Low hiánya nem megfelelő mintagyűjtésre, előkészítésre, gátlóanyagok jelenlétére utalhat, vagy kompetícióra magas titerű HPV targettel. További nem kimutatható HPV-genotípusok lehetnek jelen.

+

+

+

HPV DNS kimutatva (genotípus megadása). A minta HPV jelenlétére nézve pozitív. További HPV-genotípusok jelenléte a mintában nem zárható ki teljes mértékben.

Keresztreaktív próba értékelése A LINEAR ARRAY HPV genotipizáló csík keresztreaktív próbákat tartalmaz, melyek hibridizálnak a 33, 35, 52 és 58 genotípusú HPV-vel. A próba pozitív sávjait az alábbiak szerint kell értékelni: Sáv eredmény Értékelés 33, 52/33/35/58 HPV 33* 35, 52/33/35/58 HPV 35* 58, 52/33/35/58 HPV 58* 52/33/35/58 HPV 52 * HPV 52 genotípus koinfekció nem zárható ki ezen teszteredményekkel.

MINŐSÉG-ELLENŐRZÉS Valamennyi futtatásnak legalább egy LINEAR ARRAY HPV negatív kontrollt és egy LINEAR ARRAY HPV pozitív kontrollt kell feldolgozni legfeljebb 22 mintáig. Mint minden új laboratóriumi eljárás esetében a vizsgálatot végző használjon további pozitív és negatív kontrollokat minden alkalommal, amíg az eljárás kivitelezését nagyfokú megbízhatósággal nem képes elvégezni. Nincsenek követelmények a kontrolloknak a MicroAmp tartóban való elhelyezését illetően. Különböző minta-előkészítés futtatásából származó minták és kontrollok amplifikálása és kimutatása egyszerre végezhető. Ugyanakkor minden egyes minta-előkészítés futtatása saját kontrollok futtatásával külön-külön validálandó. Emiatt elképzelhető egy közös amplifikálási és/vagy kimutatási futtatásból az egyik 04700627001-11HU

16

Doc Rev. 11.0

mintafuttatás visszautasítása a másik futtatás elfogadása mellett az adott kontrollok eredményei alapján. Az azonos futtatásba tartozó valamennyi mintát és kontrollt a PCR-készülék és a kimutatási tálca szomszédos helyein kell amplifikálni, illetve kimutatni. A minták és kontrollok elhelyezésének pontos sorrendje a PCR-készülékben, illetve a kimutatási tálcán nem kritikus. Negatív kontroll A LINEAR ARRAY HPV negatív kontroll vizsgálati eredményében nem lehet pozitív sáv. Ha pozitív sávok láthatók, az egész futtatás érvénytelen (invalid). A teljes eljárást (minta és kontroll előkészítése, amplifikálás és genotípus kimutatása LINEAR ARRAY HPV csíkkal) meg kell ismételni. Ha a LINEAR ARRAY HPV negatív kontroll következetesen pozitív sávokat eredményez, vegye fel a kapcsolatot a Roche helyi technikai tanácsadásával. Pozitív kontroll A LINEAR ARRAY HPV pozitív kontroll vizsgálat eredménye pozitív eredményt kell adjon a HPV 16-nál, alsó és felső ß-globinnál. A ß-globin alsó sáv gyengébb lehet a ß-globin felső sávval összehasonlítva, de szemmel látható. Ha a LINEAR ARRAY HPV pozitív kontroll esetén nem pontosan ez az eredmény, az egész futtatás érvénytelen. A teljes eljárást (minta és kontroll előkészítése, amplifikálás és genotípus kimutatása LINEAR ARRAY HPV csíkkal) meg kell ismételni. Ha a LINEAR ARRAY HPV pozitív kontroll következetesen eltérő mintázatú pozitív sávokat eredményez, vegye fel a kapcsolatot a Roche helyi technikai tanácsadásával. ELJÁRÁSSAL KAPCSOLATOS ÓVINTÉZKEDÉSEK Mint minden vizsgálati eljárásnál, a helyes laboratóriumi technika alapvető a vizsgálat megfelelő kivitelezéséhez. A vizsgálat magas érzékenysége miatt rendkívüli gondossággal kell ügyelni a reagensek, illetve az amplifikálási elegyek tisztaságának megőrzésére. Minden reagens tisztaságát szorosan figyelemmel kell kísérni. Dobjon ki bármilyen gyanús reagenst. ELJÁRÁSSAL KAPCSOLATOS KORLÁTOZÁSOK 1. A vizsgálatot cobas® PCR sejtminta-tápközeg vagy PreservCyt folyadék segítségével gyűjtött cervicalis mintákkal kell végezni. Más típusú minták vizsgálata álnegatív vagy álpozitív eredményhez vezethet. 2. A vizsgálatot csak az AmpliLute Liquid Media Extraction kit használatára validálták. Más minta extrahálási eljárások használata a vizsgálat során hamis eredményekhez vezethet. 3. A megbízható eredmény a megfelelő mintalevételen, transzporton, tároláson és feldolgozáson múlik. 4. A HPV kimutatása a mintában jelen lévő vírusgenomok jelenlététől függ, ezért befolyásolhatják a mintalevételi módszerek, betegfaktorok (azaz kor, tünetek megléte) és/vagy a fertőzés stádiuma. 5. Álnegatív eredmények előfordulhatnak polimerázgátlás vagy nem megfelelő sejtes anyag miatt. Az LINEAR ARRAY HPV Genotyping Testhez ß-globin amplifikálás lett hozzáadva, hogy lehetővé váljon az olyan feldolgozott minták azonosítása, amelyekben a PCR-amplifikációt esetleg zavaró anyagok vannak jelen. 6. A LINEAR ARRAY HPV master mixben jelen lévő AmpErase enzim csökkenti az amplikonszennyezés kockázatát. Ugyanakkor a HPV-pozitív kontrollokból vagy mintákból származó szennyeződés csak helyes laboratóriumi gyakorlattal és a tájékoztatóban meghatározott eljárások gondos betartásával kerülhető el. 7. A terméket csak a PCR-technikák terén képzett személy használhatja. 8. A termék használatához csak az Applied Biosystems Gold-plated 96-Well GeneAmp PCR System 9700 berendezést validálták. Csak az GeneAmp PCR System 2400, GeneAmp PCR System 9600 vagy GeneAmp PCR System 9700 alumínium blokkos PCR-készülékek használhatóak együtt a termékkel. 9. Advantage-S® Bioadhezív fogamzásgátló gélt tartalmazó minták zavarhatják a LINEAR ARRAY HPV Genotyping Test kivitelezését álnegatív vagy érvénytelen eredményt adva. 10. 3,5% (v/v) vért tartalmazó mintákról kimutatták, hogy gátolják a PCR-amplifikációt, és álnegatív eredményeket adhatnak. 11. A 64-es és 69-es HPV-genotípusok azonosítása a 64-es és 69-es HPV-genotípusok plazmid DNSének LINEAR ARRAY HPV Genotyping Testtel való kimutatásának eredményein alapul. 64-es és 69-es genotípusú HPV-t nem észleltek a klinikai mintákban a klinikai értékelés során. 12. Ritkán bár, de előfordulhat, hogy a LINEAR ARRAY HPV Genotyping Test primerei és/vagy próbái által lefedett virális genom nagyfokban konzervált régiójában lévő mutációk következtében az adott genotípus kimutatása sikertelen lesz. 13. A technológiák különbözősége miatt javasolt, hogy az egyik technológiáról a másikra való áttéréskor a felhasználók végezzenek korrelációs laboratóriumi vizsgálatokat, hogy a technológiák közötti különbség minősíthető legyen.

04700627001-11HU

17

Doc Rev. 11.0

ZAVARÁST OKOZÓ ANYAGOK Az alábbi általános női intim higiénés termékek, síkosítók, gombaellenes krémek és fogamzásgátló zselék a vizsgálatok során nem zavarták a LINEAR ARRAY HPV Genotyping Test kivitelezését.

2. táblázat Termék név Ortho Options™ Delfen® hüvelyi fogamzásgátló hab Mycelex® 3 gombaellenes krém Clotrimazole 3 hüvelyi krém

Vagi-Gard® gyógykrém

Gyne-Lotrimin® 3 hüvelyi krém

Vagisil® viszketésellenes krém

Gynecort® 1% hidrokortizon viszketésellenes krém

Yeast Gard™ homeopátiás hüvelykúp

Vaginex® hidrokortizon formula

Norforms® szagtalanító kúpok

Betadine® gyógyöblítő koncentrátum

K-Y Brand® zselés síkosító

Miconazole külső vulvaris krém

Vagisil® intim síkosító

Monistat® 3 hüvelyi gombaellenes kombinált csomag

Álnegatív és/vagy érvénytelen eredmények észleltek Advantage-S Bioadhezív fogamzásgátló gélt 0,11 g/20 ml vagy nagyobb koncentrációban tartalmazó HPV-pozitív mintákban. Álnegatív eredményeket észleltek 3,5% (v/v)-nál több vért tartalmazó HPV pozitív minták esetén. Nem észleltek álnegatív vagy érvénytelen eredményt az endocervicalisvagy exocervicalis nyákot tartalmazó HPV-pozitív minták esetén. HPV-GENOTÍPUSOK PREVALENCIÁJA HPV-genotípusok prevalenciája és eloszlása a földrajzi régiónak megfelelő változatosságot mutatott világszerte.19–21 Továbbá számos genotípus, pl. 55, 64 és 69 beszámolók alapján újfajta genotípusnak tűnnek alacsony prevalenciával, és nem hozhatók kapcsolatba a méhnyakrákkal.20,22 A leggyakoribb, méhnyakrákkal kapcsolatba hozható HPV-genotípusok csökkenő prevalencia vagy gyakorisági sorrendben: 16, 18, 45, 31; a gyakoriság földrajzi megoszlás szerinti változását találták a legtöbb genotípusnál beleértve a 33, 35, 39, 51, 52, 56, 58, 59 és 68-ast.

04700627001-11HU

18

Doc Rev. 11.0

3. táblázat Mutatja a HPV-genotípusok prevalenciáját kontroll és méhnyakrákos esetekben19–21 HPV-genotípus 16 18 45 58 53 33 31 52 62 54 39 61 35 56 66 84 6 81 70 59 CP6108 83 72 68 42 43 55 73 11 40 82 67 44 69 71 IS39 26 64 57

04700627001-11HU

Prevalencia (%) 7,5–56,0 2,3–22,1 2,4–7,9 0,2–5,4 0,0–5,2 1,0–4,4 2,0–4,2 0,5–4,2 4 0,0–3,6 0,0–3,3 0,0–3,2 0,4–2,7 0,2–2,5 0,0–2,4 2,3 0,3–2,3 0,1–2,3 0,0–2,3 0,0–2,1 0,0–1,8 1,6 0,0–1,5 0,1–1,2 0,0–1,2 0,0–1,2 1,1 0,1–1,0 0,1–0,8 0,0–0,8 0,0–0,6 0,5 0,0–0,4 0,2 0,2 0,2 0,0–0,2 0,1 0

19

Doc Rev. 11.0

NEM KLINIKAI TELJESÍTMÉNYÉRTÉKELÉS A.

Kimutatási határ

A kimutatási határt 18 HPV-genotípusra határozták meg (6, 16, 18, 26, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 53, 56, 58, 59, 66, 68, 73 és 82). A plazmid DNS [spektrofotometriával meghatározva (260 nm abszorpció)] minden egyes genotípus esetében fel volt hígítva 5 koncentrációszintre 250 ng/ml humán genomikus DNS-t tartalmazó PreservCyt oldatban. Két vizsgáló fejenként legalább 4 futtatást végzett. Minden futtatás esetén koncentrációszintenként legalább 3 ismétlést, szintenként tehát összesen legalább 24 ismétlést vizsgáltak. A 18 HPV-genotípus mindegyikénél Probit analízist hajtottak végre. A 95%-os pozitív találati arányt előrejelző koncentrációk az egyes genotípusokhoz a 4. táblázatban találhatók. Ezen felül a 4. táblázatban megtalálható a legalacsonyabb koncentrációszint, amelynél ≥ 95% pozitív találati arányt észleltek, és amelyek esetén minden magasabb koncentrációszintnél ≥ 95% pozitív találati arányt észleltek.

4. táblázat LINEAR ARRAY HPV Genotyping Test kimutatási határának eredményei HPV-genotípus

Probit 95% találati arány koncentrációt jelez előre (kópia/ml)

Megfigyelt LOD (kimutatási határ) (koncentráció ≥ 95% pozitív találati arány) (kópia/ml)

6 16# 18# 26 31# 33# 35# 39# 45# 51# 53 56# 58# 59# 66 68# 73 82

2319 195 580 2935 1863 4000 466 1367 401 181 256 6915 185 53 250 848 165 8089

2000 200 1300 6000 6600* 20 000** 600 1500 900 260 400 12 000 250 76 300 900 300 20 000

#

Magas fokozatú cervicalis displasiaval és méhnyakrákkal kapcsolatba hozható, magas kockázatú genotípusként azonosítva3-5.

*

A 31-es genotípus esetén > 95% találati arányt észleltek 2000, 1300, 900 és 660 c/ml, valamint 92%-os találati arányt észleltek 3300 és 3000 c/ml koncentrációknál.

**

A 33-as genotípus esetén >95% találati arányt észleltek 4000 és 2700 c/ml, 92%-os találati arányt észleltek 6700 c/ml, valamint 94%-os találati arányt észleltek 13 000 c/ml koncentrációknál.

B.

Genotípus-inkluzivitás: Plazmid DNS

A genotípus-inkluzivitást 36 HPV-genotípus plazmidanalízisével határozták meg (6, 11, 16, 18, 26, 31, 33, 35, 39, 40, 42, 45, 51, 53, 54, 55, 56, 58, 59, 61, 62, 64, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 81, 82, 83, 84, IS39 és CP6108). Az 52-es HPV-genotípus plazmid DNS-e nem állt rendelkezésre a teszteléshez. Az 52-es genotípusú HPV inkluzivitását vizsgálatok során igazolták klinikai minták segítségével (C szakasz). 6, 16, 18, 26, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 53, 56, 58, 59, 66, 68, 73 és 82-ös HPV-genotípusok inkluzivitását a kimutatási határ vizsgálatai során igazolták. A maradék 18 rendelkezésre álló HPV-genotípus plazmid DNS-törzsének mennyiségi meghatározása spektrofotometriával történt (260 nm abszorpció) 900 kópia/ml koncentrációjú PreservCyt oldatban, majd tesztelték hat ismétlés során két reagenstétellel. Azon HPVgenotípusok számára, melyeket nem észleltek 100% pozitivitással 900 kópia/ml koncentrációban, további tesztelést végeztek beleértve a plazmid DNS-koncentrációkat egészen a 100% inkluzivitási szintig (n=6) a meghatározott genotípusok esetén. Az eredmények azt igazolták, hogy a LINEAR ARRAY HPV Genotyping Test 36 HPV genotípust képes észlelni a HPV plazmid DNS-ből a HPV genotípustól függően különböző koncentrációszinteknél (5. táblázat). 04700627001-11HU

20

Doc Rev. 11.0

5. táblázat A LINEAR ARRAY HPV Genotyping Test genotípus-inkluzivitása

* #

HPVgenotípus

Inkluzivitási szint* (kópia/ml)

HPVgenotípus

Inkluzivitási szint* (kópia/ml)

6 11 16# 18# 26 31# 33# 35# 39# 40 42 45# 51# 53 54 55 56# 58#

2319 900 195 580 2935 1863 4000 466 1367 70 000 30 000 401 181 256 900 900 6915 185

59# 61 62 64 66 67 68# 69 70 71 72 73 81 82 83 84 CP6108 IS39

53 900 900 300 000 250 30 000 848 900 900 900 900 165 900 8089 900 900 900 1500

Az inkluzivitási szint megegyezik az alább felsorolt koncentrációknál észlelt 100% pozitív találati aránnyal (n=6), kivéve a 6, 16, 18, 26, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 53, 56, 58, 59, 66, 68, 73 és 82-es HPV-genotípusok esetén, ahol a felsorolt koncentrációk a Probit analízissel 95%-os találati arányt előrejelző koncentrációknak felelnek meg. Magas fokozatú cervicalis displasiaval és méhnyakrákkal kapcsolatba hozható, magas kockázatú genotípusként azonosítva3-5.

C. Genotípus-inkluzivitás: Klinikai minták A klinikai értékelés során összesen 451 klinikai mintát teszteltek HPV-pozitívnak LINEAR ARRAY HPV Genotyping Test segítségével. A 37 HPV genotípus közül 35-öt (6, 11, 16, 18, 26, 31, 33, 35, 39, 40, 42, 45, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 58, 59, 61, 62, 66, 67, 68, 70, 71, 72, 73, 81, 82, 83, 84, IS39 és CP6108) észleltek klinikai mintákban LINEAR ARRAY HPV Genotyping Test segítségével, ezáltal igazolva az inkluzivitást. Ezen HPV-genotípusok megoszlása az 1. ábra mutatja. A klinikai kiértékelésen belül a 64 és 69-es HPV genotípusokat nem észlelték klinikai mintákban.

1. ábra HPV-genotípusok megoszlása LINEAR ARRAY HPV-pozitív klinikai minták esetében (n=451) a klinikai kiértékelés során 80

76

70

50

50

47

47 42

39 33 29

30

23

29

26

22

40 37

35 35

32 25

25

21 21

19 19

20

15 15

84

CP6108

83

IS39

82

81

73

2 72

71

67

66

62

61

59

56

55

58*

54

53

52

51

45

2 42

40

39

31

7

3 35*

26

33*

18

16

6

6

4

3 11

0

11

9

10

70

40

48

68

Pozitívok száma

60

Alacsony és magas kockázatú HPV-genotípusok

* HPV 33, HPV 35 és/vagy HPV 58 DNS-re pozitívnak talált 58 klinikai minta esetén, 52 genotípusú HPV-koinfekció nem volt kizárható.

04700627001-11HU

21

Doc Rev. 11.0

D.

Reprodukálhatóság

A reprodukálhatóságot 3 reagenstétel segítségével értékelték, 5 készülék kombinációjával (PCRkészülékek és vízfürdők) 3 vizsgáló segítségével összesen 15 futtatás során. Minden vizsgáló összesen 5 futtatást végzett a három reagenstétel mindegyikével, és egy futtatást hajtottak végre az 5 eszköz minden kombinációjával. A négy paneltag négy HPV-genotípusból készült (16, 18, 31 és 45) PreservCyt oldatban, mely 250 ng/ml humán genomikus DNS-t tartalmaz. A paneltagokat minden egyes genotípussal 2000 kópia/ml koncentrációban, valamint alacsony (a kimutatási határ ~3-4-szerese), közepes (a kimutatási határ ~10-15-szöröse) és magas (a kimutatási határ ~100-150-szerese) koncentrációban készítették. Minden egyes tagot három-három párhuzamos mintaként vizsgáltak minden futtatás során. A 16, 18, 31 és 45-ös HPV-genotípusok esetén 99%-os pozitív találati arány mutatkozott 2000 c/ml-nél és az alacsony koncentrációnál. A 16, 18, 31 és 45-ös HPV-genotípusok esetén 100%-os pozitív találati arány mutatkozott közepes és magas koncentrációknál (6. táblázat). Nem észleltek szignifikáns eltérést futtatás és futtatás, vizsgáló és vizsgáló, eszköz és eszköz között.

6. táblázat A LINEAR ARRAY HPV Genotyping Test reprodukálhatósága

Paneltag

HPV 16 DNS (kópia/ml)

HPV 18 DNS (kópia/ml)

HPV 31 DNS (kópia/ml)

HPV 45 Vizsgált DNS darabszám (kópia/ml)

LINEAR ARRAY HPV Genotyping Test eredményei HPV-pozitív Pozitív eredmények

%

95% CI

Magas

12 000

81 500

192 000

25 100

135

135

100%

98–100%

Közepes

1200

8150

19 200

2510

135

135

100%

98–100%

Alacsony

360

2445

5760

753

135

133

99%

95–100%

2000 (c/ml)

2000

2000

2000

2000

135

133

99%

95–100%

E.

Analitikai specificitás: Nem HPV mikroorganizmusok

A teszt nem HPV mikroorganizmusok kizárása vonatkozó specificitásának megállapítására a 7. táblázatban felsorolt baktériumkultúrákat, vírusokat, állati egysejtűeket és élesztőgombákat adtak a 250 ng/ml humán genomikus DNS-t tartalmazó PreservCyt oldatba, és megvizsgálták a LINEAR ARRAY HPV Genotyping Testtel. A vizsgált mikroorganizmusok koncentrációi 3,5e2 és 2,0e3 IFU/ml között voltak C. trachomatis esetén, 1e6 PFU/ml herpes vírusok esetén, 8e5 sejt/ml T. vaginalis esetén, 2e2 – 2e3 CFU/ml C. neoformans esetén, és 1,5e4 – 9,8e9 CFU/ml a fennmaradó mikroorganizmusoknál kivéve a H. ducreyi-t, M. hominis-t és N. gonorrhoeae-t, melyek koncentrációi ismeretlenek voltak. Az eredmények azt mutatták, hogy a LINEAR ARRAY HPV Genotyping Test nem keresztreagál a különböző vírusokkal, baktériumokkal, állati egysejtűekkel és élesztőgombákkal, melyek cervicalis mintákban potenciálisan jelen lehetnek.

04700627001-11HU

22

Doc Rev. 11.0

7. táblázat Vizsgált nem HPV mikroorganizmusok Achromobacter xerosis

Eikenella corrodens

Mycobacterium avium

Acinetobacter sp. genospecies 3

Enterobacter cloacae

Mycoplasma hominis

Actinomyces israelii

Enterococcus faecalis

Neisseria gonorrhoeae

Aerococcus viridans

Erysipelothrix rhusiopathiae

Pasteurella maltocida

Aeromonas hydrophila

Escherichia coli

Pediococcus acidilactica

Agrobacterium radiobacter

Ewingella americana

Peptostreptococcus productus

Alcaligenes faecalis

Flavobacterium meningosepticum

Prevotella corporis

Bacteriodes fragilis

Gamella morbillorum

Proteus mirabilis

Bifidobacillus longum

Gardnerella vaginalis

Providencia stuartii

Bifidobacterium adolescentis

Haemophilus ducreyi

Pseudomonas aeruginosa

Branhamella catarrhalis

Herpes simplex virus 1

Rahnella aquatilis

Brevibacterium linens

Herpes simplex virus 2

Salmonella minnesota

Candida albicans

Kingella kingae

Serratia denitrificans

Chlamydia trachomatis D-típus

Klebsiella pneumoniae ss ozaenae Staphylococcus aureus

Chlamydia trachomatis F-típus

Lactobacillus vaginalis

Streptococcus anginosus

Chromobacter violaceum

Lactococcus lactis cremoris

Streptococcus epidermidis

Clostridium perfringens

Legionella pneumophila

Treponema phagedenis

Corynebacterium genitalium

Leuconostoc paramesenteroides

Trichomonas vaginalis

Cryptococcus neoformans

Micrococcus luteus

Vibrio parahaemolyticus

Deinococcus radiopugnans

Moraxella osloensis

Yersinia enterocolitica

Derxia gummosa

Morganella morganii

F.

Analitikai specificitás: HPV-genotípusok

A HPV-csíkon lévő minden egyes HPV-próbavonal HPV-genotípus-specificitását a magas koncentrációjú HPV plazmid DNS vizsgálatával értékelték ki 36 HPV genotípusnál (6, 11, 16, 18, 26, 31, 33, 35, 39, 40, 42, 45, 51, 53, 54, 55, 56, 58, 59, 61, 62, 64, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 81, 82, 83, 84, IS39 és CP6108). 52-es HPV genotípus plazmid DNS-e nem állt rendelkezésre a teszteléshez. A rendelkezésre álló HPV DNS plazmid törzs meghatározását spektrofotométeren végezték 260 nm abszorbanciával és 500 000 kópia/ml koncentrációra hígították TE pufferben (10 mM Tris, 0,1 mM EDTA, pH 8,0). Minden HPV plazmid genotípust két párhuzamos mérésben amplifikáltak és észleltek LINEAR ARRAY HPV Genotyping Test használatával. Az eredmények a HPV-genotípus-specificitást csak a várt próbavonalnál igazolták a plazmid DNS-sel értékelt 36 HPV genotípus esetén. Továbbá az 52 genotípusú HPV specificitását a várt próbavonalnál klinikai minta vizsgálatával igazolták (a genotípust szekvenálással erősítették meg) ismeretlen HPV-titernél. G.

Szenzitivitás és specificitás a klinikai mintákból származó HPV kimutatásában

A LINEAR ARRAY HPV Genotyping Test szenzitivitását és specificitását a magas kockázatú klinikai mintákból származó HPV DNS kimutatásában, 698 PreservCyt oldatban gyűjtött cervicalis minta segítségével értékelték. A vizsgálatban a 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59 és 68 HPVgenotípusokat osztályozták magas kockázatúnak. Ezen mintákból 487 negatív és 211 pozitív volt magas kockázatú HPV-re nézve Hybrid Capture® 2 magas kockázatú HPV DNS teszt (HC2 HPV teszt) segítségével. A magas kockázatú HPV DNS jelenléte vagy hiánya a mintákban meghatározta a két teszt közötti konkordanciát. A nem egyező eredményeket a minták további analízisével oldották meg az AMPLICOR HPV teszt használatával. A 3 vizsgálat közül 2 megegyező eredménye alapján a minden egyes klinikai minta valódi természetét határozták meg (azaz valódi pozitív magas kockázatú HPV DNSre nézve vagy valódi negatív magas kockázatú HPV DNS-re nézve). A LINEAR ARRAY HPV Genotyping 04700627001-11HU

23

Doc Rev. 11.0

Test eredményeit a 8. táblázat mutatja. A 485 klinikai mintán kívül, melyek valódi negatívak voltak magas kockázatú HPV DNS-re nézve, 118 mintát találtak pozitívnak alacsony kockázatú HPV DNS-re nézve LINEAR ARRAY HPV Genotyping Test segítségével. A 118 klinikai minta között észlelt alacsony kockázatú HPV-genotípusok megoszlását a 2. ábra mutatja. A magas kockázatú HPV DNS jelenlétének szenzitivitása és specificitása PreservCyt oldatban gyűjtött cervicalis mintákban 96% és 99% volt, egyenként, LINEAR ARRAY HPV Genotyping Testtel (9. táblázat).

8. táblázat Klinikai minta eredményei LINEAR ARRAY HPV Genotyping Test segítségével LINEAR ARRAY HPV Genotyping Test eredményei*

Klinikai minták száma

Valódi pozitív

197

Valódi negatív

485

Álnegatív

9

Álpozitív

3

Érvénytelen

4

Összesen

698

* A pozitív eredmény pozitivitást jelent magas kockázatú HPV DNS-re nézve; a minták pozitivitása a csak alacsony kockázatú HPV DNS-re negatívnak minősült ebben az analízisben.

9. táblázat LINEAR ARRAY HPV Genotyping Test specificitása és szenzitivitása magas kockázatú HPV DNS-re nézve Paraméter

Érték

Érzékenység

96%

95% CI* 92–98%

Specificitás

99%

98–100%

* 95% Wald-konfidenciaintervallum

04700627001-11HU

24

Doc Rev. 11.0

2. ábra Alacsony kockázatú HPV-genotípusok megoszlása klinikai mintákban, melyek negatívak voltak magas kockázatú HPV DNS-re nézve (n=118) a specificitás és szenzitivitás értékelésében 20 18

18 16

Pozitívok száma

14 12

11

11

10

10

9 8

8 6

6

6

6

6 5

5 4

4

3 2

2

2

2

2 1

1

84

CP6108

83

82

81

73

72

70

67

66

62

61

55

54

53

42

40

26

6

11

0

Alacsony kockázatú HPV-genotípusok

H.

Teljes rendszerhiba

A LINEAR ARRAY HPV Genotyping Test teljes rendszerhiba-arányát négy HPV-genotípus (16, 18, 31 és 45) egyenként 135 teszteredményének kiértékelésével végezték, a kimutatási határnál háromszor nagyobb koncentrációk mellett (kimutatási határ definíció szerint a Probit analízissel 95%-os pozitív találati arány előrejelzésénél volt). A tesztoldatok a négy HPV-genotípus PreservCyt oldatban előkészített plazmid DNS-ét tartalmazták, és még 250 ng/ml humán genomikus DNS-t is tartalmaztak. A négy HPV-genotípus összesen 540 vizsgálatából mindössze két rendszerhiba-eseményt észleltek (HPV-negatív és ß-globinpozitív), így a teljes rendszerhiba aránya 0,4% volt.

04700627001-11HU

25

Doc Rev. 11.0

HIVATKOZÁSOK 1.

Burd, Eileen M. 2003. Human Papillomavirus and Cervical Cancer. Clinical Microbiology Reviews. 16:1-17.

2.

zur Hausen, H. 2002. Papillomaviruses and Cancer: From Basic Studies to Clinical Application. Nat Rev Cancer. 2(5):342-50.

3.

Walboomers, Jan M. M., Marcel V. Jacobs, M. Michele Manos, et al. 1999. Human Papillomavirus is a Necessary Cause of Invasive Cervical Cancer Worldwide. Journal of Pathology. 189:12-19.

4.

Bosch, F. Xavier, M. Michele Manos, Nubia Munoz, et. al. International Biological Study on Cervical Cancer (IBSCC) Study Group. 1995. Prevalence of Human Papillomavirus in Cervical Cancer: a Worldwide Perspective. Journal of the National Cancer Institute, Vol. 87, No. 11:796-802.

5.

Davies, Philip, Janet Kornegay, and Thomas Iftner. 2001. Current methods of testing for human papillomavirus. Best Practice and Research Clinical Obstetrics and Gynaecology. Vol. 15, No. 5:677-700.

6.

Koutsky, L. 1997. Epidemiology of genital human Papillomavirus infection. American Journal of Medicine. 102(5A):3-8.

7.

Richardson, H., et al. 2003. The Natural History of Type-Specific Human Papillomavirus Infections in Female University Students. Cancer Epidemiology Biomarkers & Prevention, Vol. 12:485-490.

8.

Kjaer, S., et al. 2002. Type specific persistence of high risk human papillomavirus (HPV) as indicator of high grade cervical squamous intraepithelial lesions in young women: population based prospective follow up study. BMJ. Vol. 325:572.

9.

Costa, S., et al. 2003. Factors predicting human papillomavirus clearance in cervical intraepithelial neoplasia lesions treated by conization. Gynecologic Oncology, 2003, August; 90(2):358-365.

10.

Yutaka, N., et al. 2004. Persistence of human papillomavirus infection as a predictor for recurrence in carcinoma of the cervix after radiotherapy. American Journal of Obstetrics and Gynecology, 2004, 191, 1907-1913.

11.

Nobeyama, H., et al. 2004. Association of HPV infection with prognosis after neoadjuvant chemotherapy in advanced uterine cervical cancer. International Journal of Molecular Medicine, 2004, July; 14(1):101-105.

12.

Koutsky, L., et al. 2002. A Controlled Trial of a Human Papillomavirus Type 16 Vaccine, NEJM, Vol. 347(21):1645-1651.

13.

Myers, T.W. and Gelfand, D.H. 1991. Reverse transcription and DNA amplification by a Thermus thermophilus DNA polymerase. Biochemistry 30:7661-7666.

14.

Gravitt P.E., C. L. Peyton, T. Q. Alessi, C.M.Wheeler, F. Coutlée, A. Hildesheim, M.H. Schiffman, D.R. Scott, and R.J. Apple. 2000. Improved Amplification of Genital Human Papillomaviruses. Journal of Clinical Microbiology 38:357-361.

15.

Longo, M.C., Berninger, M.S. and Hartley, J.L. 1990. Use of uracil DNA glycosylase to control carry-over contamination in polymerase chain reactions. Gene 93:125-128.

16.

Richmond, J.Y. and McKinney, R.W. eds. 1999. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. HHS Publication Number (CDC) 93-8395.

17.

Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI). Statistical Quality Control for Quantitative Measurement Procedures: Principles and Definitions; Approved Guideline-Third Edition. CLSI document C24-A3 (ISBN 1-56238-613-1). Clinical and Laboratory Standards Institute, 940 West Valley Road, Suite 1400, Wayne, Pennsylvania 19087-1898 USA, 2006.

18.

International Air Transport Association. Dangerous Goods Regulations, 41st Edition. 2000. 704 pp.

19.

Clifford, et al., Human papillomavirus types in invasive cervical cancer worldwide: a meta analysis, British Journal of Cancer, (2003) 88, 63-73.

20.

Peyton, et al., Determinants of Genital Human Papillomavirus Detection in a US Population, The Journal of Infectious Diseases, 2001; 183:1554-1564.

21.

Muñoz, et al., Epidemiologic Classification of Human Papillomavirus Types Associated with Cervical Cancer, New England Journal of Medicine, 2003: 348:518-527.

22.

Bernard, et al., Identification and Assessment of Known and Novel Human Papillomaviruses by Polymerase Chain Reaction Amplification, Restriction Fragment Length Polymorphisms, Nucleotide Sequence, and Phylogenetic Algorithms, The Journal of Infectious Diseases, 1994; 170:1077-1085.

04700627001-11HU

26

Doc Rev. 11.0

Dokumentum verzióinformációi Doc Rev. 11.0 07/2013

A „Minden jog fenntartva” felirat eltávolítva a szerzői jogi nyilatkozatból. A technikai tanácsadás telefonszáma 1-800-428-2336-ról 1-800-526-1247-re módosult. Kérdés esetén lépjen kapcsolatba a Roche helyi képviselőjével.

" Distributed by

Roche Molecular Systems, Inc. 1080 US Highway 202 South Branchburg, NJ, 08876 USA

Roche Diagnostics (Schweiz) AG Industriestrasse 7 6343 Rotkreuz, Switzerland

Roche Diagnostics 201, boulevard Armand-Frappier H7V 4A2 Laval, Quebec (For Technical Assistance call: Pour toute assistance technique, appeler le: 1-877 273-3433)

Roche Diagnostics GmbH Sandhofer Straße 116 68305 Mannheim, Germany

Roche Diagnostics 2, Avenue du Vercors 38240 Meylan, France

Roche Diagnostics, SL Avda. Generalitat, 171-173 E-08174 Sant Cugat del Vallès Barcelona, Spain

Distributore in Italia: Roche Diagnostics S.p.A. Viale G. B. Stucchi 110 20052 Monza, Milano, Italy

Roche Diagnostica Brasil Ltda. Av. Engenheiro Billings, 1729 Jaguaré, Building 10 05321-010 São Paulo, SP Brazil

04700627001-11HU

Distribuidor em Portugal: Roche Sistemas de Diagnósticos Lda. Estrada Nacional, 249-1 2720-413 Amadora, Portugal

27

Doc Rev. 11.0

A COBAS, az AMPERASE, az AMPLICOR, az AMPLILUTE, az AMPLITAQ, az AMPLITAQ GOLD és a LINEAR ARRAY a Roche védjegye. A ROCHE RESPONSE CENTER a Roche szolgáltatási védjegye. Az AmpErase enzim átvitelt meggátló technológiája a következő USA-szabadalmak védelme alá esik: 5,035,996, 5,683,896, 5,945,313, 6,287,823, 6,518,026, valamint ezek külföldi megfelelői, melyek mind az Invitrogen Corporation tulajdonában vannak, és a Roche Molecular Systems, Inc. licenceli ezeket. Az ADVANTAGE-S a Columbia Laboratories, Inc. védjegye. A BETADINE a Purdue Pharma L.P. védjegye. A DELFEN, a K-Y, a MONISTAT és az ORTHO OPTIONS a Johnson and Johnson védjegyei. Az EPPENDORF MULTIPETTE, az EPPENDORF COMBITIP és a BIOPUR az Eppendorf-Netheler-Hinz GmbH, Hamburg, Németország, védjegyei. A GENEAMP és a MICROAMP az Applera Corporation vagy leányvállalatainak védjegyei az Egyesült Államokban és bizonyos más országokban. A GYNECORT és a VAGISIL a Combe Incorporated védjegyei. A GYNE-LOTRIMIN a Schering-Plough Healthcare Products védjegye. A HYBRID CAPTURE, a QIAAMP, a MINELUTE és a QIAGEN a QIAGEN Inc. védjegyei. A LABOPORT a KNF Neuberger GmbH. védjegye. A MYCELEX a Bayer és leányvállalatainak, alvállalatainak vagy azok licencet adóinak, illetve vegyesvállalati partnereinek védjegye. A NORFORMS a C.B. Fleet Company, Inc. védjegye. A PIPET-AID a Drummond Scientific Company védjegye. A PRESERVCYT Cytyc Corporation védjegye. A PROCLIN a Rohm and Haas Company védjegye. A PYREX a Corning Incorporated védjegye. A SHARPIE a Sanford és leányvállalatai védjegye. A VAGI-GARD és a YEAST GARD a Lake Consumer Products, Inc. védjegyei. A VAGINEX a Quality Health, Inc. védjegye. © 2013 Roche Molecular Systems, Inc. 07/2013

(04392116001-11ENGL) 04700627001-11

Doc Rev. 11.0

04700627001-11HU

28

Doc Rev. 11.0

A következĘ szimbólumok használatosak a Roche PCR diagnosztikai termékek jelölésére.

Segédszoftver

In vitro diagnosztikai felhasználásra

Meghatalmazott képviselĘ az Európai Közösségben

Megadott tartomány alsó határa

Vonalkód adatlap

Gyártó

Lotszám

Sötétben tárolandó

Biológiai veszély

Vizsgálatszám

Katalógusszám

Tárolási hĘmérséklet

SW

Olvassa el a használati útmutatót

Vizsgálatdefiníciós fájl TDF

Készlet összetevĘi

Megadott tartomány felsĘ határa

TerjesztĘ

Lejárati dátum

Csak IVD teljesítmény értékelésre

Ez a termék teljesíti az in vitro orvosi diagnosztikai eszközökrĘl szóló 98/79/EK irányelv elĘírásait. Felhasználói technikai segítségnyújtás az Egyesült Államokban 1-800-526-1247

04700627001-11HU

29

Doc Rev. 11.0