lehetőségei a folyadékkromatográfiás elválasztásokban

BUDAPESTI MŰSZAKI ÉS GAZDASÁGTUDOMÁNYI EGYETEM

Nagyhatékonyságú és ultranagyhatékonyságú töltetek alkalmazási lehetőségei a folyadékkromatográfiás elválasztásokban Elmélet-gyakorlat

Készítette: Varga-Oláh Erzsébet Témavezető: Dr. Fekete Jenő

Köszönetnyilvánítás Ez úton szeretném kifejezni köszönetemet témavezetőmnek Dr. Fekete Jenőnek, hogy lehetőséget biztosított és hasznos tanácsaival segítette munkám sikeres elvégzését és a dolgozatom elkészítését. Szeretnék köszönetet mondani Dr. Fekete Szabolcsnak a publikációk elkészítésében nyújtott segítségéért. Köszönettel tartozom Nagy Katalinnak és Járási Andreának, hogy tapasztalatukkal és gyakorlati munkájukkal segítették a biológiai minták feldolgozását kísérleteimhez, továbbá Dr. Hársing Györgynek, aki támogatta munkámat az EGIS gyógyszergyárban. Köszönetet szeretnék mondani Berky Róbertnek, aki az éjszakai mérések során is segítségemre volt. Köszönöm továbbá Bacsói Gyöngyinek, hogy megtanított a vérminták kezelésére és feldolgozására. A kísérleteim statisztikai kiértékelésében Dr. Kemény Sándor volt nagy segítségemre, munkáját ez úton is köszönöm. Köszönöm volt munkatársaimnak Jenei Péternek, Kiss Kornéliának és Szoleczky Rékának, hogy mindig kaphatóak voltak az együtt gondolkodásra és baráti légkört teremtve segítették munkámat. Tiszta szívvel köszönöm szüleimnek a sok gondoskodást, ami elkísért a tanulmányaim során. Hálásan köszönöm férjem kitartó türelmét és a mindennapi feladatokban nyújtott segítségét.

2

Tartalomjegyzék 1. Bevezetés .................................................................................................. 5 2. Irodalmi áttekintés ........................................................................................ 7 2.1. Kinetikus görbék ................................................................................... 7 2.2. Nagyhatékonyságú és ultra-nagyhatékonyságú folyadékkromatográfia ...................................................................................................................... 9 2.2.1. Kis szemcseátmérőjű töltetek ......................................................... 9 2.2.2. Héjszerkezetű töltetek ................................................................... 13 2.2.3. Egyéb gyors folyadékkromatográfiás lehetőségek ....................... 19 2.3. Nagytérfogatú injektálás...................................................................... 23 2.4. Szerin ................................................................................................... 25 2.4.1. D-szerin szerepe az agyban .......................................................... 25 2.4.2. Aminosav enantiomerek meghatározási lehetőségei .................... 26 2.5. Keppra ................................................................................................. 28 2.5.1. Keppra meghatározás különböző analitikai módszerekkel .......... 28 2.5.2. Módszerátvitel HPLC-ról UHPLC-ra .......................................... 30 3. Kísérleti rész ............................................................................................... 32 3.1. Felhasznált anyagok, készülékek és eszközök .................................... 32 3.1.1. Alkalmazott készülékek ................................................................. 32 3.1.2. Felhasznált vegyszerek ................................................................. 32 3.1.3. Felhasznált eszközök, oszlopok .................................................... 34 3.2. Az ultra – nagyhatékonyságú töltetek elméleti alkalmazási lehetőségei .................................................................................................................... 36 3.2.1. Kinetikus görbék .......................................................................... 36 3.2.2. Eredmények, következtetések ...................................................... 40 3.3. Nagyhatékonyságú és ultra – nagyhatékonyságú töltetek gyakorlati alkalmazási lehetőségei, az injektált térfogat hatása .................................. 41 3.3.1. Nagyhatékonyságú töltetek gyakorlati alkalmazása: ................... 41 Szerin enantiomerek meghatározása patkányagyból .............................. 41 3.3.1.1. Folyadékkromatográfiás körülmények ...................................... 42 3.3.1.2. Származékképzési reakció OPA-Boc-L-cys reagenssel ............. 43 3.3.1.3. A diasztereomerek stabilitása.................................................... 44 3.3.1.4. A származékképző fölöslegének hatása ..................................... 45 3.3.1.5. A pH hatása a származékképzési reakcióra .............................. 47 3.3.1.6. Az injektált térfogat hatásának vizsgálata ................................ 48 3.3.1.7. Nagytérfogatú injektálás alkalmazása biológiai minták HPLC-s elemzésekor ............................................................................................ 50 3.3.1.8. Eredmények, következtetések ..................................................... 51 3.3.2. Ultra – nagyhatékonyságú töltetek gyakorlati .............................. 52 alkalmazhatósága I.:HPLC és HPLC mérések összevetése ................... 52 Keppra (levetiracetam) meghatározása vérszérumból ........................... 52 3.3.2.1. A mozgófázis összetételének optimálása ................................... 53 3

3.3.2.2. Állófázis optimálás HPLC-ban.................................................. 54 3.3.2.3. Módszerátvitel és a két módszer (HPLC és UPLC) összehasonlítása, injektált térfogat hatása............................................. 58 3.3.2.4. A minta-előkészítés optimálása során alkalmazott folyadékkromatográfiás körülmények .................................................... 61 3.3.2.5. Minta előkészítési módszerek .................................................... 61 3.3.2.6.UPLC módszer validálása .......................................................... 62 3.3.2.7. Levetiracetam terápiás gyógyszerszint monitorozása (TDM) ... 65 3.3.2.8. Eredmények, következtetések ..................................................... 66 3.3.3. Ultra – nagyhatékonyságú töltetek gyakorlati alkalmazhatósága II.: Nagytérfogatú injektálás lehetőségei ultra – nagyhatékonyságú folyadékkromatográfiában...................................................................... 67 3.3.3.1. Folyadékkromatográfiás körülmények ...................................... 67 3.3.3.2. Származékképzési reakció Marfey reagenssel ........................... 68 3.3.3.3. Az oszlopok térfogati terhelhetősége izokratikus elválasztás esetén ...................................................................................................... 69 3.3.3.4. Az oszlopok térfogati terhelhetősége pulzus gradiens alkalmazása esetén ................................................................................. 70 3.3.3.5. Az oszlopok térfogati terhelhetősége gradiens alkalmazása esetén ...................................................................................................... 72 3.3.3.6. Gyümölcslevek vizsgálata.......................................................... 73 3.3.3.7. Eredmények, következtetések ..................................................... 76 4. Összefoglaló ............................................................................................... 77 5. Tézispontok ................................................................................................ 79 6. Publikációk ................................................................................................. 81 7. Irodalomjegyzék ......................................................................................... 83

4

1. Bevezetés A folyadékkromatográfia az elmúlt évtizedben forradalmi változáson ment keresztül. Az új állófázisok, új morfológiájú töltetek megjelenése mellett a készüléktechnológia is fejlődött. A nagyhatékonyságú folyadékkromatográfia mellett egyre jobban elterjedt az ultra-nagyhatékonyságú folyadékkromatográfia is. Dolgozatomban elméleti és gyakorlati szempontok alapján hasonlítom össze az új és a hagyományos folyadékkromatográfiás módszereket. Példákat mutatok be mindkét módszerre és bizonyítom, hogy a két megközelítéssel hogyan lehet a leghatékonyabb elválasztást elérni. A szemcseátmérő csökkentését több tényező is indokolja: (i) az elméleti tányérszám fordítottan arányos a szemcseátmérővel, így növelhető az elválasztás hatékonysága, (ii) a csúcsfelbontás az elméleti tányérszám négyzetgyökével arányos, így a csúcsfelbontás is javítható a kisebb szemcseátmérőjű töltetek alkalmazásával, (iii) kisebb kolonnahossz biztosítani tudja a hagyományos töltetek által nyújtott hatékonyságot, csúcsfelbontást, így csökkenthető a mérés időtartama. Az irodalomban található hatékonysági adatok a 2 µm alatti szemcseátmérőjű porózus és 2 illetve 3 µm alatti szemcseátmérőjű héjszerkezetű oszlopokra széles tartományban mozognak és ellentmondásosak. Dolgozatom első részében összegyűjtöm az elmúlt években ezekre az oszlopokra közölt adatokat, amelyeket az elválasztási idő és kinetikai hatékonyság szempontjából hasonlítok össze. Az elméleti összehasonlítás mellett dolgozatomban gyakorlati példákon, biológiai minták elemzésén keresztül mutatom be a nagyhatékonyságú és az ultra – nagyhatékonyságú töltetek alkalmazhatóságát. Első gyakorlati példámnál célkitűzésem volt egy szerin enantiomerek közvetett elválasztására alkalmas nagyhatékonyságú folyadékkromatográfiás módszer fejlesztése. Az általam vizsgált D-szerin az agy különböző részein igen eltérő (nmol/g szövet) mennyiségben fordul elő, ami a vizsgált egyed korával változik. Ennek megfelelően célom volt egy szelektív, meglehetősen alacsony kimutatási határral rendelkező nagyhatékonyságú folyadékkromatográfiás módszer kidolgozása. A fejlesztés során nagy hangsúlyt fektettem a megnövelt injektált térfogat hatékonyságra és kimutatási határra gyakorolt hatásának vizsgálatára. Doktori munkám további célja volt a módszerátvitel lehetőségének tanulmányozása nagyhatékonyságú rendszerről ultra-nagyhatékonyságú folyadékkromatográfiás rendszerre.

5

Ennek vizsgálatához egy új generációs antiepileptikum, a levetiracetam vérszérumból történő meghatározására alkalmas nagyhatékonyságú folyadékkromatográfiás módszert dolgoztam ki, amit ultra-nagyhatékonyságú készülékre vittem át. Az ultra-nagyhatékonyságú oszlopok paramétereinek köszönhetően sokkal kisebb a térfogati és tömeg terhelhetőségük, mint a hagyományos nagyhatékonyságú oszlopoké. A megfelelő kimutatási (LOD) és mennyiségi meghatározási határ (LOQ) elérése érdekében növelni kell az injektált térfogatot, ami az oszlop hatékonyságát ronthatja. A kromatográfusnak kompromisszumot kell kötnie, meg kell határozni mekkora az a hatékonyságvesztés, ami még elfogadható mindamellett, hogy az injektált térfogat megnövelése megfelelő kimutatási határt biztosít. Az ultranagyhatékonyságú töltetek vizsgálata során is célom volt a nagytérfogatú injektálás lehetőségének vizsgálata. A kutatómunkám során vizsgált vérszérum minták összetétele betegenként változó, ezért további célkitűzésem volt egy olyan minta-előkészítési módszer kidolgozása és optimálása, amely növeli a folyadékkromatográfiás módszer szelektivitását. Dolgozatom utolsó példájában az ultra-nagyhatékonyságú héjszerkezetű töltetek térfogati terhelhetőségét vizsgálom meg. A nagytérfogatú adagolás lehetővé teszi a kimutatási határ csökkentését, mindamellett, hogy rontja az oszlop hatékonyságát. A hatékonyság romlás különösen a kis kolonnák (rövid, kis átmérőjű) és héjszerkezetű oszlopok alkalmazásánál jelentős, ezért ezen töltetek térfogati terhelhetőségét vizsgáltam meg izokratikus, pulzus gradiens és gradiens elúció során. Ebben a példában szerin enantiomereket határozok meg Marfey reagenssel történő származékképzést követően.

6

2. Irodalmi áttekintés 2.1. Kinetikus görbék A módszerek tervezésénél központi kérdés az állófázis kinetikai hatékonysága. A kolonnák összehasonlítására sok esetben a félempirikus van Deemter [1] vagy a dimeziómentes redukált elméleti tányérmagasság (h) – redukált áramlási sebesség (ν) görbéket alkalmazzák. A van Deemter egyenlet értelmében a kinetikai hatékonyságot alapvetően három zónaszélesítő hatás szabja meg (1. egyenlet).

d p2  u B  DM H  A d p  C (1) u DM ahol H az egy elméleti tányérra eső magasság, d p a szemcseátmérő, DM a komponens diffúziós együtthatója a mozgófázisban, u a lineáris áramlási sebesség, A-C konstansok. A görbe alapján meghatározható a minimális elméleti tányérmagasság és az optimális lineáris áramlási sebesség. Azonban azt, hogy az adott állófázis a kívánt elméleti tányérszámot milyen nyomásesés mellett vagy mennyi idő alatt biztosítja, vagyis az elválasztási ellenállást, ezekből a görbékből nem kapjuk meg. Ennek a megközelítésnek további hátránya, hogy a H – u görbe nem alkalmas különböző morfológiájú töltetek összehasonlítására, például az egyetlen polimertömbből álló tölteteket nem lehet összevetni a szemcsésekkel. A hatékonyság „árát”: az elméleti tányérszám – nyomásesés kapcsolatát, az időegység alatt elérhető tányérmagasságot, valamint a kolonnák, ezen paraméterek szerinti összehasonlíthatóságát elsőként az 1960-as években Horváth Csaba és munkatársai vizsgálták [2]. Az elméleti tányérszám függvényében ábrázolt mérési idő görbéket először Giddings alkalmazta folyadékkromatográfiás és gázkromatográfiás mérések teljesítmény korlátainak összehasonlítására [3]. Később Poppe továbbfejlesztve ezt a megoldást az egy elméleti tányér eléréséhez szükséges időt ábrázolta az elméleti tányérszám függvényében. Az így kapott görbét Poppe plot-nak nevezzük [4]. A fent említett elméletek alapján a különböző morfológiájú (monolit, héjszerkezetű, teljesen porózus) töltetek hatékonyságának összehasonlítására is alkalmas kinetikus görbe elméletet (Kinetic Plot Method, KPM) Desmet és munkatársai vezették be. Kezdetben a KPM modellt csak izokratikus 7

elválasztásokra alkalmazták [5]. A kinetikus görbék segítségével meghatározható például az adott elméleti tányérszám eléréséhez szükséges minimális elemzési idő, kolonnahoszz. A különböző típusú töltetek kinetikus görbéit felvéve eldönthető, hogy az adott állófázis típus alkalmas-e a kívánt elválasztásra. A H – u görbe kimérésével kapott adatokat felhasználva a következő egyenletek alkalmazásával juthatunk el a megfelelő kinetikus görbékhez:

 P   K v0    N       u  H 

(2)

 P   K v 0    2  t 0      u 

(3)

ahol ΔP az oszlopon megengedhető maximális nyomásesés, K v0 a kolonna permeabilitása, η a dinamikai viszkozitás, u a lineáris áramlási sebesség, t 0 a holtidő. A kolonna permeabilitása a következő egyenletből számítható: u   L (4) P ahol Kv0 a kolonna permeabilitása, u a lineáris áramlási sebesség, L a kolonna hossza, ΔP az oszlopon mért nyomásesés. K v0 

Ahhoz, hogy a kapott adatok teljes mértékben függetlenek legyenek a mérési körülményektől, készüléktől a mért értékeket korrigálni kell a kolonnán kívüli zónaszélesedéssel: (t kh  t ke ) 2  (t knh  t kne ) 2 H  L 5.545(t R ,k  t R ,kn )

(5)

ahol a (t kh  t ke ) az adott komponens csúcsának kolonnával mért félérték szélessége, (t knh  t kne ) az adott komponens csúcsának kolonna nélkül, holttérfogat nélküli összekötő elemmel mért félérték szélessége, tR,k és tR,kn a kolonnával és a kolonna nélkül mért retenciós ideje. Később a kinetikus görbe elméletet gradiens elúcióra is kiterjesztették [6]. A fent említett egyenleteken túl bevezették az úgynevezett kolonnahossz átszámítási tényezőt (column length rescaling factor) (6. egyenlet), amellyel

8

korrigálva a mért paraméterek (N, t 0, tR, csúcskapacitás) értékeit ugyanúgy megkaphatjuk a kinetikus görbéket, mint izokratikus esetben.



Pmax Pmért

(6)

ahol ΔPmax a maximálisan megengedhető nyomásesés, míg a ΔPmért a gradiens lefutása alatt mért legnagyobb nyomásesés az oszlopon. Gradiens elúciónál a legnagyobb szerepet a különböző állófázisok kinetikai hatékonyságának összehasonlításában a csúcskapacitások összevetése adja. A csúcskapacitás azt adja meg, hogy adott időablakon belül hány csúcsot tudunk elválasztani egységnyi felbontással. A csúcskapacitás a következő egyenlettel adható meg: t2 1 (7) Pc  1   dt 4 * t1 ahol Pc a csúcskapacitás, t1 és t2 az időablak, τ a zónaszélesedés (variancia) időben kifejezve. A kinetikus görbék alkalmazására az irodalomban számos példa van [710]. 2.2. Nagyhatékonyságú és ultra-nagyhatékonyságú folyadékkromatográfia 2.2.1. Kis szemcseátmérőjű töltetek A mai ultra-nagyhatékonyságú elválasztások elméleti alapjai az 1960-as [1], ’70-es évekre vezethetőek vissza [11]. Ezek az elméletek bizonyították, hogy a leggyorsabb elválasztás a legkisebb szemcseátmérőjű állófázis alkalmazásával érhető el. A szemcseátmérő csökkentésének további előnye, hogy csökken a vizsgálandó komponens diffúziós úthossza, ezáltal a van Deemter egyenlet értelmében nő az elválasztás hatékonysága [1]. Mindezek mellett a Darcy egyenlet alapján (8. egyenlet) a csökkenő szemcseátmérő négyzetével fordított arányban nő a tölteten mérhető nyomásesés.

9

p 

 Lu

(8)

d p2

ahol p a kolonnán mért nyomásesés, φ áramlási ellenállás, η a mozgófázis viszkozitása, L a kolonna hossza, u lineáris áramlási sebesség, dp szemcseátmérő. Ennek megfelelően elméletileg, ha 5 µm helyett 1,7 µm szemcseátmérőjű töltetet alkalmazunk, de minden más paraméter azonos, a kolonnán mért nyomásesés akár 9-szeresére is nőhet, tehát a nyomásesés határt szab a hatékonyság növelésének [12]. Ha a hagyományos folyadékkromatográfiás készülékekkel mérünk, akkor a minimálisan alkalmazható szemcseátmérőt a készülék nyomáshatára (általában 400 bar) szabja meg. A nyomásesés problémáját Jorgensen és munkatársai hidalták át egy új, kb. 5000 bar nyomesésig működő készülék megalkotásával [13-15]. Az első kereskedelmi forgalomban is kapható ultra – nagyhatékonyságú folyadékkromatográfiás készüléket (UHPLC) a Waters cég 2004-ben kezdte el forgalmazni UPLC (ultra performance liquid chromatography) néven. Később egyre több cég jelent meg a piacon nagy nyomáson működő készülékekkel, ezáltal elérhetővé vált a kisebb szemcseátmérőjű töltetek folyadékkromatográfiás alkalmazása. A 2 µm alatti szemcseátmérő által biztosított hatékonyság növekedés, egyben a csúcsfelbontást is javítja (9. egyenlet). RS ∝

N ∝

L dp

(9)

ahol RS a csúcsfelbontás két komponens között, N az elméleti tányérszám, L a kolonna hossza, dp a szemcseátmérő. Mindezek alapján elméletileg egy 5 cm-es, 1,7 µm-es szemcseátmérőjű oszloppal ugyanaz a hatékonyság érhető el, mint egy 15 cm-es 5 µm-es szemcsékkel töltött állófázissal. Az irodalomban több tanulmány is foglalkozik a szemcseátmérő csökkentéssel elérhető hatékonyság növekedéssel és mérési idő csökkenéssel. A pozitív példák mellett [16] azonban a 2 µm alatti szemcseátmérőjű töltetek nem minden esetben teljesítették az elméletileg várható hatékonyság növekedést [18]. Ennek oka többek között lehet a lassabb anyagátadás [19], nem megfelelő oszloptöltés [20] vagy a nagyobb nyomás miatti súrlódási hőből származó csúcsszélesedés [21]. A hagyományos készülékek nyomáshatára (400 bar) fölött, már a folyadékok fizikai tulajdonságainak nyomás hatására bekövetkező változása

10

is számottevő. A folyadékok viszkozitása nő, a kompresszibilitás és a diffúziós együttható csökken a nyomásesés növekedésével [22]. Az irodalomban a nyomásesés folyadékok kompresszibilitására [23], a kolonna holttérfogatára [24], valamint a C18-as lánc kompresszibilitására [25] gyakorolt hatását általában csak 400 bárig adják meg. Az 1. táblázatban foglaltam össze az elmúlt évek irodalmában megtalálható 2 µm alatti szemcseátmérőjű, teljesen porózus töltetekre megadott hatékonysági adatokat.

11

1. táblázat: A különböző szerzők által 2 µm alatti szemcseátmérőjű, teljesen porózus töltetekre közölt optimális áramlási sebességnél elért, minimális elméleti tányérmagasság és minimális redukált elméleti tányérmagasság valamint maximális elméleti tányérszám adatai. Állófázis

1,7 µm BEH C18

1,7 µm BEH Shield RP18 1,8 µm Zorbax Eclipse XDB C18 1,8 µm Zorbax Extend C18 1,8 µm Zorbax Stable Bond C18 1,9 µm Hypersil GOLD C18 1,5 µm Grace Vision HT C18 2,0 µm YMC UltraHT Pro C18 1,9 µm Restek Pinnacle DB C18

kolonna paraméterek 2,1x50 mm

2,6

Hmin (µm) 4,4

11364

butirofenon

[26]

2,1x50 mm

3,3

5,6

8990

acenaftén

[27]

2,1x50 mm

2,8

4,8

10500

butilparabén

[28]

2,1x50 mm

2,8

4,7

10638

etinilösztradiol

[18]

2,1x50 mm

2,8

4,8

10417

bikalutamid

[18]

2,1x50 mm

3,8

6,5

7692

ivermektin

[18]

2,1x100 mm

2,9

4,9

20408

fenol

[9]

2,1x100 mm

2,5

4,2

23810

[9]

2,1x150 mm

2

3,4

44118

propilparabén naftol[2,3a]pirén

[29]

2,1x50 mm

2,3

3,9

12800

butilparabén

[28]

2,1x50 mm

3

5,4

9300

butilparabén

hmin

Nmax

minta

hivatkozás

[28] 2,1x50 mm

2,5

4,5

11100

butilparabén

2,1x50 mm

3,2

5,8

8700

butilparabén

[28] [28]

2,1x50 mm

2,8

4,8

10417

etinilösztradiol

[18]

2,1x50 mm

2,72

4,9

10204

bikalutamid

[18]

2,1x50 mm

3,8

6,9

7246

ivermektin

2,1x50 mm

2,6

4,9

10100

butilparabén

[18] [28]

2,1x50 mm 2,0x50 mm 2,0x50 mm 2,0x50 mm 2,0x50 mm 2,0x50 mm 2,1x50 mm 2,1x50 mm 2,1x50 mm

3,7 3,1 3,1 4,6 2,5 2,5 2,9 2,6 3,2

7,1 4,6 4,6 6,9 5,0 5,0 4,9 4,9 6,1

7042 10870 10870 7246 10000 10000 10204 10204 8197

ivermektin etinilösztradiol bikalutamid ivermektin etinilösztradiol bikalutamid etinilösztradiol bikalutamid ivermektin

[18] [18] [18] [18] [18] [18] [18] [18] [18]

Az adatokból látható, hogy az eredmények igen széles skálán mozognak és elmaradnak az elméletileg elérhető értéktől (Hmin=2dp).

12

Az 1,7 µm-es BEH C18 szemcsékkel töltött 5 cm hosszúságú oszlopokkal elérhető hmin 2,6 és 3,8 között mozog, 10 cm-es kolonnák esetén ez az érték 2,5 - 2,9, míg 15 cm-es oszlop esetén már 2. Az 1,8 µm-es szemcsékkel töltött 5 cm-es oszlopokkal elérhető elméleti tányérszám 7-11000 közé esik. Az elméletileg elérhető hmin értékhez képesti legnagyobb eltérést a 1,5 µm-es szemcsékkel töltött Grace Vision HT C18 oszlop esetén tapasztalták, ebben az esetben a gyakorlatban mért h min másfélszerese (hmin =4,6) volt az elméletileg elérhetőnek (hmin =3). A szemcseátmérő csökkenésével egyre nagyobb különbség figyelhető meg az elméletileg elérhető és gyakorlatban mérhető hatékonyság között [18].

2.2.2. Héjszerkezetű töltetek

A héjszerkezetű töltetek alapgondolatát még az 1960-as években Horváth Csaba és munkatársai fogalmazták és valósították meg. Az általuk 50 µm-es üveggyöngyökre polimerizált sztirol-divinil-benzol alapú ioncserélő gyanta pellikuláris töltetként került a köztudatba [30]. Még ugyanebben az évtizedben Kirkland 30-40 µm-es héjszerkezetű állófázissal gyorsabb elválasztást tudott elérni, mint az akkoriban alkalmazott hagyományos töltetekkel lehetett [31].

H  A

B  Cs u  Cmu u

(10)

ahol: H az elméleti tányér magasság, A örvény (eddy) diffúziós tényező, B hosszirányú diffúziós tag, Cs és Cm az anyagátadási ellenállásból származó zónaszélesítő hatásra jellemző tag, u a lineáris áramlási sebesség. A héjszerkezetű töltetek előnyét a teljesen porózus töltetekhez képest a van Deemter egyenlet (10. egyenlet) tagjainak egyenkénti tárgyalásával mutatom be. Az A-tag a kolonnában kialakuló egyenetlen áramlási keresztmetszetek zónaszélesítő hatását írja le. Az örvénydiffúzió hozzájárulását a H értékéhez alapvetően a töltet sűrűsége és homogenitása határozza meg. A töltet sűrűsége a szemcseátmérőtől, míg a homogenitása 13

a szemcseátmérő eloszlástól függ. Az A-tag a következő egyenlettel adható meg: A  2d p

(11)

ahol A az örvény (eddy) diffúziós tényező, λ eltérő áramlási sajátságokat kifejező tényező, röviden töltési tényező, dp szemcseátmérő [32]. A héjszerkezetű töltetekre kapott A-tag értéke összevetve a más morfológiájú töltetekre kapott értékkel jelentősen kisebb. Gritti és munkatársai 15-20%-kal kisebb A-tagot mértek Halo oszlop esetén, mint hasonló szemcseátmérőjű (3 µm) teljesen porózus Silica-B tipusú tölteten [33]. Fekete és munkatársai 5 cm-es, kis átmérőjű oszlopokkal levonorgesztrelt vizsgálva 30 – 50 %-al kisebb A-tagot kaptak Ascentis Express oszlopra, a 2 µm alatti teljesen porózus illetve monolit oszlopokhoz képest [34]. Az örvénydiffúzióban (11. egyenlet) bekövetkező jelentős csökkenésre – a hasonló szemcseátmérőjű, teljesen porózus állófázisokhoz képest – több magyarázat is létezik. Az egyik lehetséges magyarázat, az hogy a 11. egyenlet alapján kisebb szemcseátmérővel és kisebb szemcseátmérő eloszlással az A-tag hozzájárulása a zónaszélesítő hatáshoz csökkenthető [33]. Ezt a feltételezést alátámasztja az is, hogy a különböző szerzők pásztázó elektronmikroszkópos felvételek alapján szűkebb szemcseátmérő eloszlást (5-7%) mértek 2,7 µm-es Halo oszlopokra [36] és az 1,7 és 2,6 µm-es szemcseátmérőjű Kinetex, valamint 2,7 µm-es Ascentis Express [37] állófázisokra, mint a hasonló szemcseátmérőjű, teljesen porózus töltetekre (15-20 %). Gritti és munkatársai 5 µm-es szemcseátmérőjű szemcsékhez különböző arányban 3 µm-es szemcseátmérőjű szemcséket kevertek. Az így kapott állófázisok hatékonyságát vizsgálva javulást tapasztaltak a kolonna teljesítményében a csak 5 µm-es szemcsékkel töltött oszlopokhoz képest. Kísérleteik alapján megállapították, hogy a szélesebb szemcseméret eloszlásnak mindaddig nincs negatív hatása az örvénydiffúzióra, míg az RSD 45% alatt marad. Az eredmények alapján elmondható, hogy az örvénydiffúziót első sorban a szemcseátmérő szabja meg. Továbbá megállapították, hogy a héjszerkezetű oszlopok esetén tapasztalt kisebb örvénydiffúzió a héjszerkezetű oszlopok, teljesen porózus töltetekhez képest homogénebb töltetágyának köszönhető. A héj

14

szerkezet kialakításakor, a polimerizációs eljárás végén kapott szemcsék érdesebb felületűek, mint a szol-gél eljárással kialakított teljesen porózus állófázisok, ennek köszönhetően a kolonna töltésénél fellépő nyíró erők is nagyobbak, mint a teljesen porózus töltetek esetén. Az ily módon kapott töltet ágy külső porozitása sokkal egyenletesebb a kolonna átmérője mentén, ami csökkenti az A-tag hozzájárulását a teljes elméleti tányérmagassághoz (HETP) [38]. A 10. egyenlet második tagja a longitudinális (hosszirányú) diffúzió zónaszélesítő hatását írja le. A hosszirányú diffúzió a dugószerűen injektált minta és a körülötte lévő mozgófázis között fellépő kémiai potenciál különbség hatására jön létre. A diffúziós hatást töltött oszlopok esetén a szemcsék csökkentik [32]. Az irodalomban több adatot találunk a héjszerkezetű töltetekre kapott B-tag teljesen porózus töltetekre kapott B-taggal történő összevetéséről. Fekete és munkatársai kis átmérőjű, rövid kolonnákat hasonlítottak össze. Az általuk vizsgált 2 µm alatti szemcseátmérőjű teljesen porózus töltetek, monolit oszlop és a héjszerkezetű Ascentis Express oszlop B-tagjai között nem tapasztaltak szignifikáns különbséget [34]. Ugyanezen szerzők 4,1 kDa moltömegű polipeptidet vizsgálva, a teljesen porózus BEH C18 oszloppal összehasonlítva 20, illetve 25 %-kal kisebb B-tagot mértek kis átmérőjű, 5 cm hosszúságú, héjszerkezetű Kinetex, illetve Ascentis Express oszlopokra [37]. Guiochon és munkatársai 20-30%-kal kisebb B-tagot mértek Kinetex és Ascentis Express oszlopokra teljesen porózus Atlantis-C18 oszlophoz képest [39]. A héjszerkezetű töltetekre a teljesen porózus töltetekhez képest mért kisebb B tag a héjszerkezetű szemcsében lévő nem porózus magnak köszönhető [39]. A van Deemter egyenlet utolsó tagja az anyagátadási ellenállás több részből tevődik össze: a pórusokban stagnáló folyadékon belüli diffúzióból, a film anyagátadási ellenállásból és a szemcsék közötti (transparticle) anyagátadási ellenállásból származó zónaszélesedés alkotja. Összehasonlítva egy 2,1x150 mm hosszú, 1,7 µm-es szemcseátmérőjű BEH C18 teljesen porózus töltetet egy ugyanilyen paraméterekkel rendelkező Kinetex C18 héjszerkezetű oszloppal hasonló redukált elméleti tányérmagasságot kaptak. Azonban a Kinetex oszlopnál a hmin-hoz tartozó redukált lineáris áramlási sebesség 8-10 között mozgott, szemben a BEH C18 oszlopra kapott 5-7 közötti értékkel, illetve a Kinetex oszlop C-tagja sokkal alacsonyabban futott, mint a teljesen porózus tölteté [29]. A nagyobb áramlási sebességeknél a kolonna teljesítményét erősen befolyásolja a nagyobb nyomás miatt kialakuló súrlódási hő hatására bekövetkező zónaszélesítő hatás. A héjszerkezetű töltetek a nem porózus magnak köszönhetően jobb hővezetéssel rendelkeznek, mint a

15

hagyományos teljesen porózus töltetek, így a héjszerkezetű oszlopok esetén kevésbé érvényesül a súrlódási hő hatása [29]. Az eddig általam tárgyalt irodalmak a héjszerkezetű töltetek teljesen porózus, hagyományos töltetekkel szembeni előnyét a kis molekulák elválasztása során kapott eredmények alapján tárgyalták. A továbbiakban nagy molekulatömegű anyagok héjszerkezetű töltetekkel történő elválasztásaira mutatok be példákat. A folyadékkromatográfiásan nagy molekulatömegű komponensek a hagyományos 90 – 100 Å pórusátmérőjű töltetek esetén vagy a pórusok egy részéből kizáródnak, vagy a zeg-zugos pórus alak miatt a diffúziós sebesség nagymértékben csökken a folyadékban mérthez képest. A fenti hatások csökkentésére az állófázis átlagos pórusátmérőjét növelni kell, ezért fehérjék, peptidek vizsgálatához nagy pórusátmérőjű ún. wide pore tölteteket alkalmazunk [32]. Egyre több, nagy molekulatömegű anyagok elválasztására is alkalmas héjszerkezetű töltet jelenik meg kereskedelmi forgalomban [40-46]. Összevetve a 90 Å pórusátmérőjű Halo C18 oszlop hatékonyságát a 160 Å pórusátmérőjű Halo peptide ES-C18 oszlop hatékonyságával 60%os hatékonyság javulást lehetett elérni β - lipotropin, inzulin és lizozim elválasztásakor [40]. A nagy pórusátmérőjű, héjszerkezetű töltetek nagymolekulák elválasztása esetén hatékonyabbak, mint a hagyományos, teljesen porózus, nagy pórusátmérőjű töltetek [33]. Aeris WIDEPORE héjszerkezetű (3,6 µm átmérőjű mag és 0,2 µm héj) állófázis más nagy pórusátmérőjű, teljesen porózus valamint héjszerkezetű állófázisokkal összehasonlítva, mind kis molekulák mind nagy intakt fehérjék elválasztásánál a legjobb hatékonyságot mutatta [42]. Ez az oszlop feltehetően az erős, másodlagos kölcsönhatásoknak (ioncserés kölcsönhatás) köszönhetően más retenciós viselkedést mutatott, mint a többi vizsgált oszlop [43]. A 2. táblázatban összegyűjtöttem az utóbbi időben héjszerkezetű töltetekre közölt adatokat. Az állófázis oszlopban, zárójelben feltüntettem a nem porózus mag és a szemcseátmérő arányát:



Ri Re

(12)

ahol ρ a nem porózus mag és a szemcseátmérő aránya, Ri a nem porózus mag átmérője, Re a szemcseátmérő.

16

2. táblázat: A különböző szerzők által héjszerkezetű töltetekre közölt optimális áramlási sebességnél elért, minimális elméleti tányérmagasság és redukált minimális elméleti tányérmagasság valamint maximális elméleti tányérszám adatai. Állófázis 2,7 µm Poroshell 120 (ρ=0,63)

2,7 µm Halo (ρ=0,63)

2,6 µm Kinetex (ρ=0,73)

Kolonna paraméterek 2,1 x 100 mm 2,1 x 50 mm 4,6 x 150 mm

Nmax

minta

hivatkozás

2,5 2,0 1,4

Hmin (µm) 6,8 5,4 3,8

14706 9259 39474

[47] [47] [47]

4,6 x 100 mm

1,6

4,3

23256

2,1 x 150 mm 4,6 x 150 mm 4,6 x 150 mm

1,8 1,6 1,7

4,9 4,3 4,6

30612 34883 32609

4,6 x 150 mm

2,0

5,4

27778

4,6 x 150 mm 4,6 x 150 mm 4,6 x 150 mm 4,6 x 150 mm 4,6 x 50 mm 4,6 x 50 mm

~2,0 ~2,0 ~4,0 1,8 1,7 2,0

~ 5,4 ~ 5,4 ~ 10,8 4,9 4,6 5,4

~ 28000 ~ 28000 ~ 13900 30612 10870 9259

2,1 x 50 mm

3,4

9,2

5435

2,1 x 50 mm

1,6

4,3

11628

4,6 x 100 mm

1,5

4,1

24390

2,1 x 100 mm 2,1 x 150 mm 4,6 x 150 mm 2,1 x 50 mm 2,1 x 100 mm 3,0 x 100 mm 4,6 x 100 mm 4,6 x 100 mm 2,1 x 100 mm

1,8 1,5 1,3 1,9 1,9 1,3 1,2 1,2 1,5

4,9 3,9 3,4 4,9 4,9 3,4 3,1 3,1 3,9

20408 38462 44118 10204 20408 29412 32258 32258 25641

4,6 x 100 mm

1,4

3,6

27778

naftalin naftalin naftalin 669 Da moltömegű komponens naftalin naftalin antracén bradikinin, lizbradikinin inzulin lizozim BSA β-lipotropin virginiamicin inzulin polipeptid 4,1 kDa levonorgesztrel 669 Da komponens butirofenon naftalin naftalin ösztradiol ösztradiol ösztradiol ösztradiol naftopirán naftopirán 669 Da moltömegű komponens

hmin

[48] [47] [47] [33] [33] [33] [33] [33] [40] [49] [49] [18] [50] [48] [26] [47] [47] [51] [51] [51] [51] [52] [52] [48]

17

2. táblázat folytatása: A különböző szerzők által héjszerkezetű töltetekre közölt optimális áramlási sebességnél elért, minimális elméleti tányérmagasság és redukált minimális elméleti tányérmagasság valamint maximális elméleti tányérszám adatai. Állófázis 1,7 µm Kinetex (ρ=0,74) 1,7 µm Eiroshell 150C18 (ρ=0,82) 1,7 µm Eiroshell 250C18 (ρ=0,71) 1,7 µm Eiroshell 350C18 (ρ=0,59) 2,7 µm HALO peptide ESC18 (ρ=0,63) 3,6 µm Aeris WIDEPORE (ρ=0,89)

Kolonna paraméterek 2,1 x 150 mm 4,6 x 100 mm

Nmax

minta

hivatkozás

2,9 2,1

Hmin (µm) 4,9 3,6

30612 27778

[47] [47]

2,1 x 50 mm

3,7

6,3

7937

2,1 x 50 mm 2,1 x 50 mm

1,5 2,5

2,6 4,3

19231 11628

naftalin naftalin polipeptid 4,1 kDa ösztradiol naftopirán

2,1 x 50 mm

1,9

3,2

15625

napftopirán

[53]

2,1 x 50 mm

2,2

3,7

13514

naftopirán

[53]

2,1 x 50 mm

2,5

4,3

11628

naftopirán

[53]

4,6 x 150 mm

1,4

3,8

39474

β-lipotropin

[40]

4,6 x 150 mm

~2

~5,4

~27780

inzulin

[40]

2,1 x 150 mm 4,6 x 150 mm

1,8 1,4

6,5 5,0

23076 30000

ösztradiol ösztradiol

[42] [42]

4,6 x 150 mm

~2

~7,2

~20833

inzulin

[42]

hmin

[18] [18] [53]

Az 5 cm-es, héjszerkezetű szemcsékkel töltött oszlopokkal az irodalomban elért méterre eső elméleti tányérszám 100 000 – 380 000 között mozgott, ez az érték 10 cm-es oszlopok esetén 140 000–320 000 közötti értéket adott. A 15 cm-es oszlopok esetén az elérhető N =200 000 – 293 000 között volt. A 3 µm alatti szemcseátmérőjű töltetek esetén a Kinetex oszlopokra kapott hmin érték 1,2 – 1,9 között mozgott [47, 48, 51, 52], ugyanez az érték Halo oszlopok esetén 1,5 – 4,0 között volt [18, 26, 33, 40, 47-50], míg Poroshell oszlopok esetén 1,4 – 2,5 közötti értéket adott [47, 48]. Az adatokból látható, hogy növelve a nem-porózus mag méretét,

18

csökkentve a héj vastagságát a hmin értéke csökken. Kinetex oszlop esetén ρ=0,73, míg Halo és Poroshell oszlopok esetén a nem-porózus mag : szemcseátmérő arány 0,63. A 2,7 µm Poroshell-120, 2,7 µm Halo C18, 2,6 µm Kinetex tölteteknél megfigyelhető, hogy a kolonna átmérőjének csökkenésével a hmin értéke nő. Ez minden esetben a töltés jóságának romlására utal. A 2 µm alatti szemcseátmérőjű töltetek esetén a Kinetex oszlopokra kapott hmin érték 1,5 – 3,7 között mozgott, Eiroshell oszlopokra kapott érték 1,9 – 2,5 között volt. Az 1,7 µm szemcseátmérőjű Eiroshell oszlopok esetén is megfigyelhető az a tendecia, ami a 3 µm alatti szemcseátmérőjű héjszerkezetű töltetek estén, hogy a növekvő ρ értékkel csökken a hmin értéke [53]. Összehasonlítva a 3 illetve 2 µm alatti szemcseátmérőjű tötetek hatékonyságát azt tapasztaljuk, hogy az 1,7 µm-es szemcsékkel töltött Kinetex oszlopok nagyobb hmin értéket adtak (1,5 – 3,7), mint a 2,6 µm-es szemcsékkel töltött Kinetex oszlopok (1,2 – 1,9), ennek oka feltehetően szintén oszlop tölthetőségi problémákra vezethető vissza [47]. A nagymolekulák elválasztására alkalmas nagy pórusméretű HALO peptide ES-C18 és Aeris WIDEPORE oszlopok hmin értéke 1,4 – 2,0 között volt [40, 42].

2.2.3. Egyéb gyors folyadékkromatográfiás lehetőségek Az eddig tárgyalt gyors folyadékkromatográfiás módszerek mellett több lehetőségünk van az elválasztási idő csökkentésére. Az egyik lehetőség monolit oszlopok alkalmazása. Ezek az állófázisok egyetlen, szivacsszerű vázból állnak. Az áramlás az 1 – 3 µm átmérőjű ún. átfolyó pórusokban történik. A visszatartás a 10 – 20 nm átmérőjű mezopórusoknak köszönhető [54]. A kolonna áramlási ellenállását a töltet porozitása szabja meg. A monolit oszlopok porozitása a töltetes oszlopokhoz képest sokkal nagyobb, aminek köszönhető áramlási ellenállása sokkal kisebb, mint a szemcsés tölteteké. A kisebb áramlási ellenállásnak következtében a monolit oszlopok nagyobb áramlási sebességgel alkalmazhatóak, mint a szemcsés töltetek, ezáltal csökkenthető az elemzési idő [54]. A fent leírtak alapján ugyanolyan áramlási sebesség mellett a monolit oszlopon kisebb nyomásesést tapasztalunk, mint a szemcsés töltetek esetén [54]. Mriziq és munkatársai 100 – 10 mm átmérőjű szilika alapú monolit oszlopot vizsgálva eltérést tapasztaltak az oszlop hatékonyságában a töltet

19

közepén és a fal mellett [59], feltehetően ennek a makroszkópikus heterogenitásnak köszönhetőek az irodalomban megadott nagyon eltérő hatékonyság adatok [60-62]. Az elválasztás hatékonysága függ a töltet morfológiájától. Skudas és munkatársai bizonyították, hogy a monolit kolonna hatékonysága növelhető a váz átmérőjének csökkentésével, azonban a növekedésnek határt szab az állófázis heterogenitása [63]. Minakuchi csoportja a monolit kolonnák átfolyó pórus és szilárd fázis vastagságának összegét, a karakterisztikus paramétert (domain size) 2,3 és 5,9 µm között változtatva azt tapasztalták, hogy nagyobb hatékonyság kisebb karakterisztikus paraméterrel (domain size) érhető el [60]. Gritti és Guiochon 150, 225 és 350 Å átlagos mezopórus mérettel rendelkező monolit oszlopok hatékonyságát vizsgálták kis (fenol, toluol, acenaftol) és nagy molekulák (inzulin) elválasztása során. Kis áramlási sebesség tartományban a B-tag hozzájárulása a teljes zónaszélesítő hatáshoz elhanyagolható volt az A-tag zónaszélesítő hatásához képest. A közepes áramlási sebesség tartományban (1 < ν <3) az A-tag hozzájárulása a HETP értékéhez csökkent a nagyobb mezopórus méretű kolonna alkalmazásával, illetve nagyobb diffúziós állandójú molekulák esetén. A magasabb áramlási sebesség tartományban a C-tagot alapvetően a film anyagátadási ellenállás határozta meg. A három vizsgált oszlop közül a 150 és 225 Å átlagos mezopórus mérettel rendelkező állófázis esetén a szerzők jelentős csúcstorzulást tapasztaltak (tailing faktor < 1), amit a mozgófázis kolonna átmérője mentén kialakuló heterogén sebesség eloszlásával magyaráztak [61]. A monolit oszlopokat összehasonlítva hagyományos teljesen porózus, héjszerkezetű illetve nem porózus töltetekkel az elválasztás sebessége és a csúcskapacitás szempontjából, azt tapasztalták, hogy a héjszerkezetű és monolit oszlopok a legmegfelelőbbek gyors kromatográfiás elválasztáshoz [64]. Eeltink rávilágított arra, hogy egy szilika alapú monolit kolonnával rövidebb idő alatt, nagyobb maximális elméleti tányérszámot lehet elérni, mint a hagyományos, teljesen porózus Hypersil oszloppal [65]. A kinetikus görbe elmélet (KPM) alapján számolt N - t0/N2 görbe segítségével összehasonlítva a 2 µm alatti szemcseátmérőjű teljesen porózus, 2,7 µm szemcseátmérőjű héjszerkezetű, valamint Chromolith Flash oszlopokat, azt tapasztalták, hogy a monolit oszlopokra megadott maximális 200 báros nyomáshatárt alkalmazva a monolit oszlop adta a legkisebb t0/N2 értéket. Az N - t0/N2 görbét a szerzők úgy is meghatározták, hogy a 2 µm alatti szemcseátmérőjű teljesen porózus és héjszerkezetű töltetekre a hagyományos folyadékkromatográfiás készülékek nyomáshatárát, 400 bárt, a monolit oszlopra 200 bárt adtak meg. Az így kapott eredmény 20

alapján összehasonlítva a vizsgált állófázisokat a monolit oszlop hasonló elméleti tányérszámra eső elemzési időt mutatott, mint a 2 µm alatti szemcseátmérőjű teljesen porózus illetve héjszerkezetű töltetek. A görbét az adott állófázis maximális nyomsesésén meghatározva a monolit oszlop már nem volt versenyképes a teljesen porózus illetve héjszerkezetű töltetekkel [34]. Az első generációs monolit oszlopok legnagyobb hátránya a töltet heterogenitása, ami határt szabott a váz átmérőjének csökkentésével elérhető hatékonyság növekedésnek is. Ezt a problémát a napjainkban megjelenő második generációs monolit töltetek hidalják át. A második generációs monolit oszlopok ugyanolyan felületi kémiával, fajlagos felülettel, porozitással (makro-, mezo- és teljes porozitás) rendelkeznek, mint az első generációs töltetek. Az újabb monolit oszlopok a sugár irányú heterogenitás megszűnésének, valamint a kisebb vázátmérőnek köszönhetően, azonban 66,5 %-al kisebb minimális elméleti tányérmagasságot adnak, 3,6-szor magasabb áramlási sebesség mellett, mint az első generációs állófázisok [66]. Az irodalomban több összefoglaló cikk jelent meg a monolit oszlopok alkalmazásáról folyadékkromatográfiában [67], mikro-elválasztásoknál [68], valamint királis elválasztásokban [69]. Ezért dolgozatomban csak a legújabb irányzatokat szeretném felvázolni a monolit oszlopok alkalmazására. A hagyományos fordított fázisú módosítás mellett ma már készülnek HILIC (hydrophilic interaction chromatography) típusú monolit oszlopok is [70]. Az elválasztási tényező a cirkóniummal bevont szilika alapú monolitok esetében nagyban függ a Si-OH és Zr-OH csoportok arányától [71]. Az úgynevezett „szemcsés monolitok” egyesítik a szemcsés töltetek és a monolitok tulajdonságait, elválasztási hatékonyságuk a két kombinált állófázis külön-külön vett hatékonysága között van [72]. Lv és csoportja kovalensen kötött β-ciklodextrint egy szerves polimer alapú monolit oszlopra. A töltetet sikeresen alkalmazták racém ibuprofén elválasztására [73]. Több szerves polimer alapú monolit oszlopot összekapcsolva és nagy hőmérsékleten alkalmazva fehérjék elválasztása pár perc alatt megoldható [74]. Gyors elválasztás megvalósításának egy másik lehetősége a nagy hőmérsékletű folyadékkromatográfia (HTLC) alkalmazása. HTLC esetén a kolonnatér hőmérsékletének növelésével a mozgófázis viszkozitása csökken, a viszkozitás csökkenésével a Darcy egyenlet értelmében (8. egyenlet) növelhető az áramlási sebesség anélkül, hogy a kolonnán mért nyomásesés jelentősen megnövekedne. A hőmérséklet növelésével ugyanakkor megnő a molekula diffúzivitása,

21

ezáltal gyorsul az anyagátadás is. Mindezek értelmében növelhető az elválasztás sebessége és csökkenthető az elemzési idő. A nagy hőmérsékletű folyadékkromatográfia (High Temperature Liquid Chromatography, HTLC) elnevezést 1969-ben vezették be [75]. Antia és Horváth bizonyították, hogy a magas hőmérséklet lehetővé teszi fehérjék hatékony elválasztását [76], később Chen és Horváth 120°C-on 10 másodperc alatt választott el négy fehérjét [77]. Nagy hőmérsékletű folyadékkromatográfia esetén, 60°C felett mindenképpen szükséges a mozgófázist előtermosztálni [78]. UV detektálás alkalmazásakor a kolonna utáni hűtést is meg kell oldani, az alapvonal zajának csökkentése érdekében [79]. Mindezen problémák mellett 80°C fölött számolnunk kell az állófázis és a minták instabilitásával, valamint megfelelő termosztát alkalmazásával kell biztosítanunk a kromatográfiás rendszer állandó hőmérsékletét. Az oszlopok hőmérséklet stabilitási problémáira az új generációs szilikagél [80, 81], valamint cirkónium alapú töltetek jelenthetik a megoldást [82, 83]. Egyes polimer alapú állófázisok 150°C-ig, míg grafitizált szén alapú állófázisok 200°C-ig is alkalmazhatóak [84]. Polimer alapú állófázis alkalmazásával a hmin érték a 25°C-on mért 3,4es értékről 2,4-re csökkent a kolonna hőmérsékletének 150°C-ra történő emelésével [85]. A nagy hőmérsékletnek köszönhetően csökken a kolonnán mérhető nyomásesés. Az alacsonyabb nyomás lehetővé teszi több oszlop egymás utáni összekötését, ami hatékonyabb elválasztást tesz lehetővé. Hat darab 25 cm hosszúságú kolonna összekötésével emelt hőmérsékleten több, mint 130 000 elméleti tányérszámot sikerült elérni [86]. A hagyományos állandó hőmérsékleten alkalmazott gradiens elúció helyett Gika és munkatársai ún. izobár nagy hőmérsékletű folyadékkromatográfiás eljárást fejlesztettek ki. A módszer lényege, hogy a gradiens programnak megfelelően változik a hőmérséklet, az áramlási sebesség és a nyomásesés állandó értéken tartása mellett [87]. Az irodalomban a hagyományos nagy hőmérsékletű, nagyhatékonyságú folyadékkromatográfiás módszerek mellett egyre elterjedtebben jelennek meg a nagy hőmérsékleten alkalmazott ultra – nagyhatékonyságú folyadékkromatográfiás módszerek is [87, 88]. Annak ellenére, hogy a minták hőmérséklet stabilitása problémát jelent, mégis vannak példák gyógyszeripari alkalmazásra is [89].

22

2.3. Nagytérfogatú injektálás A ma alkalmazott kromatográfiás technikák néhány kivételtől (preparatív kromatográfia, nyomelem analízis egyes esetei stb.) eltekintve lineáris kromatográfiás módszerek közé tartoznak. Ez azt jelenti, hogy a kolonnára adagolt minta koncentrációjával egyenes arányban nő az állófázison adszorbeált anyagmennyiség (1. ábra). A nem-lineáris kromatográfia adszorpciós mechanizmusairól, adszorpciós izoterma modelljeiről Gritti és Guiochon ad átfogó képet [90].

1. ábra: Két komponens adszorpciós izotermája [32]

Ahhoz, hogy hagyományos nagyhatékonyságú folyadékkromatográfiás oszlopokat alkalmazva (4 – 5 mm átmérővel) az adszorpciós izoterma lineáris szakaszán maradjunk általában 10 – 25 µl injektált térfogatot alkalmazhatunk és kevesebb, mint 10 µg anyagot vihetünk fel az állófázisra [91]. Ha az oszlop hossza vagy átmérője csökken, akkor az injektált térfogatot, ill. a minta koncentrációját az oszlop térfogatának megfelelően csökkenteni kell [92]. Vannak olyan esetek, amikor jelentősen meg kell növelni az injektált térfogatot, vagy az állófázisra felvitt anyag mennyiségét annak érdekében, hogy megfelelő érzékenységet, kimutatási és mennyiségi meghatározási határt érjünk el. Ennek tipikus esetei például a nyomelemanalízis, biokémiai, klinikai elemzések. A megnövelt injektált térfogat, anyagmennyiség

23

csúcstorzulást, hatékonyság és felbontás romlást okozhat [93, 94]. Attól függően, hogy az injektált térfogat vagy a koncentráció túl nagy, térfogativagy tömegtúlterhelésről beszélünk. A kolonna terhelhetőség tárgyalását a tömegtúlterheléssel kezdem. A kromatográfiás oszlopok tömegterhelhetőségének alapjait Poppe és Kraak tették le. Munkájukkal rávilágítottak arra, hogy a túlterhelés következtében létrejövő zónaszélesedés, csak az egy elméleti tányérnak megfelelő töltet tömegére (g) vonatkoztatott minta teljes tömegétől függ. Ebből kifolyólag a nagyon nagy hatékonyságú töltetek esetén a csúcstorzulás nélkül alkalmazható maximális elúciós koncentráció kisebb, mint a „normál” hatékonyságú oszlopok esetén [95]. A térfogati terhelhetőségnél figyelembe kell venni, hogy a kapott csúcs térfogata két tényezőből tevődik össze: V  (Vs2  Vc2 )1 / 2

(13)

ahol Vs az injektált térfogat, Vc az oszlop zónaszélesítő hatása. Amíg az injektált térfogat tizede az alapvonalon mért csúcstérfogatnak, addig nem történik csúcstorzulás. Ahogy az injektált térfogat nő, elkezd szélesedni a csúcs. A 13. egyenletből következik, hogy a kisebb retenciós idejű csúcsok alakját nagyobb mértékben befolyásolja a térfogati túlterhelés, mint az időben később eluálódókét [91]. A túlterhelés mennyiségi jellemzését az irodalomban többen is tárgyalták [96, 97]. A napjainkban alkalmazott héjszerkezetű állófázisok térfogati és tömeg terhelhetősége kisebb, mint a hagyományos 5 µm-es és 1,7 µm-es szemcseátmérőjű tölteteké [98]. A héjszerkezetű töltetek nagyobb hatékonyságának köszönhetően a csúcsmaximumhoz tartozó csúcsmagasság ugyanakkora koncentráció esetén nagyobb, mint a hagyományos, teljesen porózus töltetekkel elérhető csúcsmagasság. Ennek megfelelően hasonló LOD és LOQ értéket biztosítanak, mint a hagyományos töltetek. Ahhoz, hogy az injektált térfogat növelhető legyen jelentősebb zónaszélesedés nélkül a komponenseket fókuszálni kell a kolonna elején. Ehhez többféle technika áll rendelkezésre, a legegyszerűbb olyan oldószerből injektálni a mintát, aminek az eluenserőssége kisebb, mint a mozgófázis eluenserőssége [99], fordított fázisú folyadékkromatográfiás mérések során ez az oldószer akár víz is lehet [100], azonban ez a csúcsfókuszáló módszer egyes esetekben csúcstorzulást is okozhat [101]. A nem megfelelő oldószer mintakiváláshoz, valamint keresztszennyezéshez is vezethet [102], így ez a módszer nem alkalmazható minden esetben.

24

További lehetőség a kolonna eleji csúcsfókuszálásra az, ha a minta után közvetlenül egy vízdugót juttatunk az oszlopra. Ennek egyik módja, ha a vízdugót a minta után közvetlenül injektáljuk. Ebben az esetben Gritti és munkatársai azt tapasztalták, hogy a vízdugó még a kolonna elérése előtt keveredik a mintával és az oszlop elején fókuszálja a csúcsot. Ezzel a technikával jelentős hatékonyság és csúcsfelbontás növekedést tudtak elérni [103]. Li és csoportja a vízdugó oszlopra juttatásának másik módját, a pulzus gradiens alkalmazását választották, ezzel növelve a kolonna hatékonyságát [104]. A gradiens elúció általában akkor kerül előtérbe, ha különböző polaritású vegyületeket kell elválasztanunk. Shellinger rámutatott arra, hogy gradiens elúcióval akkor is rövidebb elemzési időt, keskenyebb csúcsokat és nagyobb hatékonyságot lehet elérni, amikor az elválasztás izokratikus módon is megoldható lenne [105]. Ez a hatás annak köszönhető, hogy az oldószer összetétele a gradiens elúció során folyamatosan változik és az adott komponensdugó előtt gyengébb, utána erősebb összetételű oldószer van jelen, ami kompresszálja a csúcsokat. Ezt a hatást a nyolcvanas évek elejétől [106] napjainkig [107, 108] többen vizsgálták. Munkám során megvizsgálom adott héjszerkezetű oszlopok térfogati terhelhetőségét izokratikus, pulzus gradiens és gradiens elúciós körülmények között. 2.4. Szerin

2.4.1. D-szerin szerepe az agyban A D-aminosavak természetben történő előfordulására az első példa 1969ben jelent meg [109]. Napjainkban bizonyított tény, hogy számtalan Daminosav fordul el a különböző élőlényekben, ezek közül a kutatások egyik fő célpontja a D-szerin, aminek jelentős szerepe van az agyi ingerület átvitelben. Több állatkísérlettel bizonyították, hogy a D-szerin L-szerinből az agyban keletkezik [110, 111] egy ún. szerin racemáz (SR) enzim segítségével [112, 113]. Az agyi D-aminosav szint szabályozásában a szerin racemáz enzim mellett a D-aminosav-oxidáz enzim (DAO, D-amino acid oxidase) is fontos szerepet játszik [114]. A D-szerin előfordulása az agy különböző területein erősen kötődik az Nmetil-D-aszpartát receptor (NMDA) előfordulásához.

25

Az N-metil-D-aszpartát receptor egy ioncsatorna jellegű receptor, melyet a glutaminsav és egy ko-agonista együttes kötődése aktivál. A tudományos életben a vélemények egyre inkább afelé tolódnak el, hogy a glutamát mellett inkább a D-szerin, mint a glicin szükséges az ioncsatorna nyitásához.

2. ábra: Ingerület átvitel két idegsejt között [115]. Az NMDA receptor valamint a D-szerin szerepét az ingerület átvitelben a 2. ábra [115] mutatja. Az ingerület átvitelhez az asztrocita által kibocsátott Dszerin, valamint az idegsejtek között lévő glutamát együttesen aktiválja az NMDA receptort. A receptor ioncsatorna kinyílik és beengedi a kálciumot a következő idegsejtbe. A D-szerin szintjét a szerin racemáz és D-aminosav oxidáz (DAO) enzimek szabályozzák [116, 117]. Az NMDA receptor alul- vagy túlműködése súlyos ideggyógyászati problémákhoz vezethet, mint például Alzheimer kór, epilepszia, skizofrénia, depresszió stb. [118, 119]. Egyre több vizsgálat irányul ezen idegrendszeri betegségek kezelésére az NMDA receptor működésének befolyásolásával [120, 121]. 2.4.2. Aminosav enantiomerek meghatározási lehetőségei Az optikai izomerek meghatározására számtalan analitikai módszer létezik, ezek közül a legelterjedtebben folyadékkromatográfiás módszereket alkalmaznak. A kromatográfiás elválasztások során enantiomerek meghatározása közvetlen és közvetett módon történhet. Közvetlen meghatározásnál az enantiomereket királis körülmények között (királis állófázis vagy királis mozgófázis additív), míg a közvetett megoldásnál egy származékképzést

26

követően akirális körülmények között választjuk el. Mindkét elválasztás alapja a diasztereomerpár képzés. Aminosav enantiomerek meghatározására közvetlen elválasztás során többféle állófázis közül választhatunk, a teljesség igénye nélkül alkalmazhatunk például: koronaéter [122], ciklodextrin [123] valamint ligandcserés [124] tölteteket is. A közvetett elválasztásnál alkalmazott származékképzők amellett, hogy diasztereomer képzéssel lehetővé teszik az akirális elválasztást, kromofór csoportot is tartalmaznak, ami segíti az aminosavak jobb detektálhatóságát. Ilisz és munkatársai egy összefoglaló cikkben mutatták be a folyadékkromatográfiában aminosav enantiomerek elválasztására legtöbbet alkalmazott kovalens kötést kialakító származékképzőket [125]. A továbbiakban csak a munkám során alkalmazott N-tercbutiloxikarbonil-L-cisztein (Boc-L-cisztein) és 1-fluoro-2,4-dinitrofenil-5-Lalaninamid (Marfey) reagenseket tárgyalom. Az aminosavak orto-ftáldialdehiddel (OPA) tiolok jelenlétében izoindol származékot alakítanak ki. Az alkalmazott tiolok lehetnek akirálisak [126, 127] és királisak. Ez utóbbiak közül elterjedten alkalmaznak N-tercbutiloxikarbonil-L-ciszteint, N-acetil-L-ciszteint, N-izobutiril-L-ciszteint és N-acetil-D-penicilamint. Buck és Krummen állítottak elő először Boc-L-ciszteint Boc-Sbenzilciszteinből, az így kapott származékképzővel előbb csak standard aminosavakat [128] később peptid hidrolizátumokat [129] is vizsgáltak. Később Hashimoto és munkatársai in-vivo mikrodialízis minták D-, L-szerin tartalmának meghatározásához használtak ortoftáldialdehid és N-tercbutiloxikarbonil-L-cisztein (OPA-Boc-L-cys) származékképzőt [130]. Az izoindol származék stabilitásáról csak kevés adat található az irodalomban. Buck és Krummen 10 %-os fluoreszcens jelcsökkenést tapasztalt OPA-Boc-L-cys származékképző alkalmazásakor [129]. Peter Marfey állított elő és alkalmazott először 1-fluoro-2,4-dinitrofenil-5L-alanin amidot (Marfey reagens, FDAA) D-aminosavak meghatározására [131]. A Marfey reagenst később peptid és fehérje hidrolizátumok aminosav abszolút konfigurációjának meghatározására is alkalmazták [132]. Napjainkban Harada és munkatársai tovább fejlesztették a Marfey által kidolgozott módszert és UV/VIS detektálás helyett tömegspektrométert alkalmaztak detektorként, az általunk fejlesztett módszer „advanced Marfey” módszerként terjedt el az irodalomban [133].

27

2.5. Keppra

Az epilepszia kezelésére az 1980-as évek végéig 8-9 antiepileptikum volt forgalomban, melyek erős mellékhatásokkal rendelkeztek. A levetiracetam ((S)--etil-2-oxo-1-pirrolidin acetamid), forgalomba hozatali nevén Keppra, az antiepileptikumok új generációjához tartozik. Egy aszimmetria centrumot tartalmaz (3. ábrán), ennek megfelelően két enantiomerje van, szerkezetét tekintve egyik eddig ismert epilepszia ellenes szerhez sem hasonlít. A szervezetben az enantiomerek között nem történik átizomerizáció [134].

3. ábra: A levetiracetam szerkezeti képlete. A levetiracetámot a korábbi antiepileptikumokhoz képest kedvezőbb famakokinetikai tulajdonságainak köszönhetően egyre szélesebb körben alkalmazzák epilepszia kezelésére [135]. Más epilepszia elleni szerekkel együtt is alkalmazható [136], és más gyógyszerekkel sem mutat kölcsönhatást [137, 138]. 2.5.1. Keppra meghatározás különböző analitikai módszerekkel Mivel egy újabb generációhoz tartozó antiepileptikumról van szó, így csak néhány meghatározási mód szerepel az irodalomban, ezek túlnyomó többsége folyadékkromatográfiás elemzés, de szerepel a módszerek között kapilláris elektroforézis [139] is. Levetiracetam enantiomerek meghatározására két királis elválasztást közöltek egy ciklodextrin állófázison történő GC-MS

28

módszert [140] valamint egy amilóz alapú állófázison történő HPLC elválasztást [141]. Saravanan és munkatársai a levetiracetam savas és bázisos hidrolíziséből, valamint az oxidatív bomlásából származó szennyezők főkomponenssel együtt történő meghatározására alkalmas módszert fejlesztettek ki [142]. A biológiai mintákból történő levetiracetam meghatározásához számos minta-előkészítési módszert alkalmaztak. Ezen módszerek között szerepel a fehérje kicsapás perklórsavval, amit egy ciklohexános folyadék-folyadék extrakció követ. Ebben az esetben állófázisként egy Thermo Hypercarb oszlopot alkalmaztak. Ezen módszer előnye, hogy a minta oldószerének erőssége és pH-ja megegyezik a mozgófázis eluenserősségével és pH-jával, ami csúcskompressziót eredményez, ezáltal jobb kimutatási határ érhető el. A visszanyerés 98,6 %-os volt [143]. A fehérje kicsapáshoz szerves oldószerek is alkalmazhatóak. A módszer előnye egyszerűségében rejlik, a mintákból egy lépésben el lehet távolítani a fehérjét, mivel a levetiracetam nem kötődik a szérum fehérjéhez, így jó visszanyerést lehet elérni. Contin és munkatársai 1:3 arányban adagoltak metanolt a vérszérum mintákhoz, az így kicsapott fehérjét centrifugálással távolították el az oldatból. Így 90% feletti visszanyerést sikerült elérniük [144]. Guo és társai 100 µl mintához 150 µl belső standardot tartalmazó acetonitrilt adtak. A visszanyerés értéke 103-108% között mozgott, a meghatározáshoz HPLC-MS módszert alkalmaztak [145]. Matar és munkatársai Oasis HLB (Hydrophilic-Lipophilic Balanced) szilárd fázisú extrakciós oszlopot használtak minta-előkészítéshez. Az oszlopról történő leoldást metanollal végezték. A visszanyerés 91,7-93,4 % közé esett [146]. A fehérje kicsapást szerves oldószerekkel (metanol és acetonitril), oldhatatlan só képzéssel (cink-szulfát, perklórsav) valamint a szilárd fázisú extrakciós minta-előkészítési módszereket Pucci és munkatársai hasonlították össze. Az általuk vizsgált mintatisztítási módszerek közül mindegyik alkalmas a terápiás monitorozásra (Terapeutic drug monitoring, TDM), mégis a szilárd fázisú extrakciós módszert találták a legmegfelelőbbnek [147]. Az irodalomban egyetlen ultra-nagyhatékonyságú folyadékkromatográf – tandem tömegspektrometriás (UPLC-MS/MS) módszer szerepel. A mintaelőkészítés során metanolos fehérje kicsapást alkalmaztak és 2 µl mintát injektáltak egy BEH C18 100x2,1 mm-es oszlopra [148]. A fent említett folyadékkromatográfiás módszerek néhány teljesítmény jellemzőjét a 3. táblázat tartalmazza.

29

3. táblázat: Az irodalomban található levetiracetam meghatározására alkalmas folyadékkromatográfiás módszerek teljesítmény jellemzői.

LOD (µg/mL) LOQ (µg/mL) Koncentráció tartomány (mg/mL)

LCLCLCLC- UPLCESIESIUV UV MS/MS MS/MS MS/MS [144] [147] [148] [145] [146]

LC királis elválasztás [141]

LCUV [143]

0,9

0,1

1,0

0,1

-

0,2

0,06

2,3

1,0

2,0

1,0

1,0

0,5

0,15

2,25-90

1 – 75

4-80

1 – 50

1-40

5100

0.5 150

Az irodalomban fellelhető adatok közül az UPLC-MS/MS módszer adta a legkisebb kimutatási és meghatározási határt, emellett ez a mérés ölelte fel a legnagyobb koncentráció tartományt is. 2.5.2. Módszerátvitel HPLC-ról UHPLC-ra

Ahhoz, hogy a meglévő nagyhatékonyságú folyadékkromatográfiás módszer (HPLC) ultra - nagyhatékonyságú (UHPLC) készülékre átvihető legyen első lépésben egy olyan állófázist kell találnunk, ami hasonló tulajdonságokkal bír, mint a HPLC-s oszlop. Ebben segítséget nyújthat az állófázisok hidrofóbicitását, sztérikus ellenállását, savas, bázikus valamint kation cserélő tulajdonságát is figyelembe vevő H-S modell [149]. Hangsúlyozni kell azonban, hogy csak abban az esetben kapjuk vissza teljesen a kromatográfiás képet a módszerátvitelnél, ha a HPLC és az UHPLC töltetek kémialiag azonosak és fizikai-kémiai tulajdonságai megegyeznek. Az állófázis kiválasztása után az elválasztás paramétereinek átszámolása következik az új kolonna átmérőjének és hosszának megfelelően. Gradiens elúció esetén a gradiens időt a kolonna hosszának megfelelően le kell rövidíteni:

30

L2 * t g1  t g 2 L1

(14)

ahol L2 és L1 rendre az UHPLC-s és a HPLC-s kolonna hossza, tg1 és tg2 a HPLC-s és az UHPLC-s gradiens idő. Az ultra – nagyhatékonyságú oszlop kisebb átmérőjének megfelelően csökkenteni kell a térfogati áramlási sebességet, ahhoz, hogy a lineáris áramlási sebességet állandó értéken tartsuk:  d2   d1

2

  * F1  F2 

(15)

ahol d2 és d1 az UHPLC-s illetve HPLC-s oszlop átmérője, F1 és F2 pedig a HPLC-s és UHPLC-s térfogatáramlási sebesség. Mivel az UHPLC-s oszlopok terhelhetősége a kisebb kolonna paramétereknek köszönhetően kisebb, ezért az injektált térfogat mennyiségét is csökkenteni kell: r22 * L2 (16) * V1  V2 r12 * L1 ahol r2 és L2 az UHPLC-s, míg az r1 és L1 a HPLC-s oszlop sugara és hossza, V1 és V2 a HPLC-s és UHPLC-s oszlopra injektálható térfogat [150].

31

3. Kísérleti rész

3.1. Felhasznált anyagok, készülékek és eszközök 3.1.1. Alkalmazott készülékek

A hagyományos folyadékkromatográfiás méréseket Merck Hitachi LaChrom HPLC készüléken végeztem, mely a következő részekből állt: nagynyomású szivattyú (L-7100), automata mintaadagoló (L-7250), fluoreszcens detektor (L-7480), UV detektor (L-7400), oszlop termosztát (L7350) és interface (D-7000). Az adatgyűjtést és az adatok feldolgozását a D7000 HSM System Manager Ver. 4.1. kromatográfiás szoftverrel végeztem. Az ultra – nagyhatékonyságú folyadékkromatográfiás mérésekhez Waters Acquity UPLC és Perkin Elmer Flexar FX-15 UHPLC rendszereket alkalmaztam. A Waters Acquity UPLC rendszer egy bináris nagynyomású szivattyúból, automata mintaadagolóból, oszlop termosztátból, diódasoros detektorból és interface-ből állt. A készüléket Empower Pro kromatográfiás szoftver vezérelte. A Flexar FX-15 rendszer bináris nagynyomású szivattyúból, automata mintaadagolóból, oszlop termosztátból és UV/VIS detektorból állt. A készüléket Chromera CDS szoftver vezérelte. A folyadékkromatográfiás körülményeket az egyes fejezetekben különkülön ismertetem.

3.1.2. Felhasznált vegyszerek A mérésekhez használt HPLC minőségű vizet naponta MilliQ gradient (Millipore, USA) víztisztítóval frissen készítettem. A felhasznált vegyszereket a következő táblázatban (1. táblázat) foglaltam össze.

32

1. táblázat: Felhasznált vegyszerek Anyag Ösztradiol L-szerin (L-Ser) D-szerin (D-Ser) L-alanin (L-Ala) D-alanin (D-Ala) L-aszparagin (L-Asn) D-aszparagin (D-Asn) L-glutamin (L-Gln) D-glutamin (D-Gln) N-terc-butiloxikarbonil-Lcisztein (Boc-L-Cys) 1-fluoro-2,4-dinitrofenil-5L-alaninamid (Marfey reagens) levetiracetam abs. etanol, nátriumhidroxid, káliumdihidrogén-foszfát, nátriumetilén-diamin-tetraacetát, diklór-metán, sósav, ecetsav, nátrium-hidrogén-karbonát nátrium-tetraborátot (10 kristályvizes), nátriumpiroszulfátot perklórsav trietil-amin (TEA) acetonitril metanol

Gyártó Richter Gedeon Nyrt. (Budapest, Magyarország) Fluka, Sigma-Aldrich (Budapest, Magyarország) Fluka, Sigma-Aldrich (Budapest, Magyarország) Fluka, Sigma-Aldrich (Budapest, Magyarország) Fluka, Sigma-Aldrich (Budapest, Magyarország) Fluka, Sigma-Aldrich (Budapest, Magyarország) Fluka, Sigma-Aldrich (Budapest, Magyarország) Fluka, Sigma-Aldrich (Budapest, Magyarország) Fluka, Sigma-Aldrich (Budapest, Magyarország) Fluka, Sigma-Aldrich (Budapest, Magyarország)

Tisztaság ≥99% BioUltra, 99,5% 98 % BioUltra, 99,5 % ≥98% 99% 99% ReagentPlus, ≥99% ≥98% ≥99%

Fluka, Sigma-Aldrich

≥99,0%

UCB Pharma (Brain-l’Alleud, Belgium)

≥99%

Merck (Darmstadt, Németország)

nagy tisztaságú

Reanal Kft. (Budapest, Magyarország)

nagy tisztaságú

Carlo Erba (Milánó, Olaszország) Riedel de Häen (Seelze, Németország) Merck (Darmstadt, Németország) Merck (Darmstadt, Németország)

70% ≥99,5% gradiens minőségű gradiens minőségű

33

3.1.3. Felhasznált eszközök, oszlopok Eszközök: Oasis HLB és Oasis MAX szilárd fázisú extrakciós oszlopok (Waters Kft., Budapest, Magyarország) 0,22 és 0,45 µm pórusméretű szűrők (ViaLab Magyarország Kft., Budapest, Magyarország) Extrelut töltetek (Merck, Millipore Kft., Budapest, Magyarország) mérlegek (analitikai, Mettler Toledo) pH mérők (Mettler Toledo, Methrom mikro üvegelektróddal) centrifugák ultrahangos rázató lombikok (5, 10, 50, 100, 250, 500 és 1000 ml) eluens tartók mérőhengerek (5, 50, 100, 500 és 1000 ml) főzőpoharak mintatartó üvegek centrifuga csövek eppendorf csövek Hamilton fecskendők automata pipetták

34

2. táblázat: Alkalmazott állófázisok Állófázis Acquity BEH C18

kolonna kolonna szemcsehossz átmérő átmérő (mm) (mm) (µm) 50 2,1 1,7

pórus átmérő (Å) 130

100

2,1

1,7

130

Chromolith FastGradient RP-18e

50

2,0

-

-

Kinetex C18

50 50 50 100 150

2,1 2,1 4,6 4,6 4,6

1,7 2,6 2,6 2,6 2,6

100 100 100 100 100

Grace Vision HT C18

50

2,1

1,5

100

125

4

5

80

250

4

5

80

BDS Hypersil C18

100

4,6

5

130

Supelco Suplex pKb100

150

4,6

5

120

YMC ODS AQ

250

4,6

5

120

Symmetry C18

150

3,9

5

100

Zorbax Extend C18

250

4,6

5

80

Purospher RP18e

gyártó/forgalmazó Waters/Waters Kft. (Budapest, Magyarország) Merck/Merck Kft. (Budapest, Magyarország) Phenomenex/ Gen – Lab Kft. (Budapest, Magyarország) Lab – Comp Kft. (Budapest, Magyarország) Merck Kft. (Budapest, Magyarország) Thermo Scientific/ Unicam Magyarország Kft. (Budapest, Magyarország) Supelco/ SigmaAldrich (Budapest, Magyarország) YMC/ Edison House Kft. (Dabas, Magyarország) Waters/Waters Kft. (Budapest, Magyarország) Agilent/ Kromat Kft. (Budapest, Magyarország)

35

3.2. Az ultra – nagyhatékonyságú töltetek elméleti alkalmazási lehetőségei 3.2.1. Kinetikus görbék Az ultra – nagyhatékonyságú töltetek alkalmazhatóságát a kinetikus görbék segítségével tárgyalom. A kinetikus görbék számolásához megmértem a különböző áramlási sebességekhez tartozó elméleti tányérszámot. Ennek kimérésére a különböző oszlopokon kétféle lehetőség van: i) a visszatartási tényező oszlopról – oszlopra történő állandó értéken tartása a mozgófázis összetételének változtatásával, ii) a mozgófázis összetételének oszlopról – oszlopra történő állandóan tartása, és ezzel a visszatartási tényező adott tartományban tartása. Abban az esetben, ha a mozgófázis összetételének változtatásával a visszatartási tényezőt minden vizsgált oszlop esetén állandó értéken akarjuk tartani, akkor a mozgófázis összetételének megfelelően változik a mozgófázis viszkozitása, a vizsgált komponens diffúziós együtthatója. A második esetben a visszatartási tényező értékétől függően kis mértékben változik a van Deemter egyenlet alakja, B- és C-tagja, azonban ezzel a módszerrel kisebb hibát okozunk, mint az első esetben. A fentiek értelmében a mozgófázis összetételét úgy állítottam be, hogy a vizsgált komponens visszatartási tényezője (k) 3,4 és 6,6 közé essen a különböző oszlopokon. A kinetikus görbéken feltüntetett pontok, minden esetben korrigált adatok: az elméleti tányér magasságot a folyadékkromatográfiás rendszer zónaszélesítő hatásával, a kolonna permeabilitás adatokat pedig a rendszer nyomásesésével korrigáltam. Ehhez holttérfogat nélküli összekötő elemet alkalmazva, különböző térfogatáramlási sebességek mellett regisztráltam a rendszer nyomásesését, valamint a komponens injektálásával meghatároztam a kolonnán kívüli zónaszélesedést. A kinetikus görbék számítását a Kinetic Method Plot Analyzer template (Gert Desmet, Vrije University Brussel, Belgium) segítségével végeztem el. A mérésekhez a 3.1.1. fejezetben leírt Waters Acquity UPLC készüléket használtam. A számolás menetét a 1. ábrán mutatom be.

36

1. ábra: Kinetikus görbék számításához alkalmazott Kinetic Method Plot Analyzer Template.

Az általam mért u0 és H értékeket bevittem a táblázatba, amiből az N és t0 értékeket az irodalmi részben található képletek alapján számoltam ki. Emellett a következő egyenleteket alkalmaztam még: (1) (2) Az 2. ábrán mutatom be az ösztradiol izokratikus körülmények között mért kinetikus görbéjét (N – N/t02). A számolásokat minden esetben az adott kolonnára megengedhető maximális nyomáseséssel végeztem.

37

2. ábra: Az ösztradiol különböző 5 cm hosszúságú, 2 illetve 2,1 mm átmérőjű oszlopokon mért kinetikus görbéje (N - t0/N2). A mozgófázis 48:52 ACN:víz, η = 0.85 cP, kolonna hőmérséklet: 35°C, az injektált térfogat 0,5 µl, detektálási hullámhossz: 240 nm. A megengedhető nyomásesés Chromolith oszlop esetén 200 bar, Kinetex oszlop esetén 600 bar, Grace Vision HT oszlopnál 830 bar, BEH C18 oszlopra 1000 bar. Az 2. ábrán a különböző oszlopok elméletileg, UHPLC rendszerben elérhető legjobb teljesítménye látható. A görbék alapján meghatározható az elérni kívánt elméleti tányérszámhoz tartozó elemzési idő. Az elméleti tányérszámra vonatkoztatott mérési idő függ az oszlopra jellemző maximálisan alkalmazható nyomáseséstől, minél nagyobb a megengedett nyomásesés, annál gyorsabb elválasztás érhető el. Az ilyen rövid oszlopok esetén a gyakorlatban alkalmazott elméleti tányérszám 5000 és 20000 között mozog. Ebben a tartományban a legkisebb elméleti tányérszámra eső elemzési időt a héjszerkezetű Kinetex oszlop biztosítja, amelyet az emelt hőmérsékleten (85°C) alkalmazott teljesen porózus hibrid töltet, az Acquity BEH követ. Ezt az oszlopot alacsonyabb hőmérsékleten (30°C) alkalmazva hasonló elválasztási sebességet biztosít, mint a szintén teljesen porózus Grace oszlop, illetve a 2,6 µm szemcseátmérőjű héjszerkezetű Kinetex oszlop. A legmagasabb t 0/N2 értéket a legkisebb mechanikai stabilitással rendelkező (max. nyomásesés 200 bar) monolit oszlop adja. Mindezek alapján elmondható, hogy 2,6 és 1,7 µm szemcseátmérőjű héjszerkezetű oszlopok közül a kisebb szemcseátmérőjű töltet alacsonyabb t0/N2 értéket adott.

38

Összehasonlítva a teljesen porózus Acquity BEH C18 oszlop teljesítményét a különböző hőmérsékleteken (30 és 85°C) megállapítható, hogy a hőmérséklet növelésével csökkenthető az adott hatékonyság eléréséhez szükséges elemzési idő. A 3 µm alatti szemcseátmérőjű héjszerkezetű töltet, az 1,7 µm hibrid (Acquity BEH) és 1,5 µm szemcseátmérőjű teljesen porózus állófázisok hasonló elválasztási sebességet biztosítottak a vizsgált tartományban. Egy másik kinetikus görbe típus (N – L) látható a 3. ábrán. A görbék segítségével meghatározható, hogy az elérni kívánt elméleti tányérszámhoz milyen hosszúságú oszlopra van szükség vagy adott hosszúságú oszlopok közül melyik nyújtja a legjobb hatékonyságot.

3. ábra: A különböző oszlopokra jellemző N – L görbék. Kromatográfiás paraméterek mint az 2. ábrán. A 3. ábra alapján megállapítható, hogy adott elméleti tányérszám eléréséhez a 2 µm alatti szemcseátmérőjű teljesen porózus illetve a 2,6 µm szemcseátmérőjű héjszerkezetű töltetek esetén szinte azonos hosszúságú oszlopra van szükség. Az általam alkalmazott 5 cm-es oszlopok közül az 1,7 µm szemcseátmérőjű Kinetex oszlop nyújtja a leghatékonyabb elválasztást 20 000-es elméleti tányérszámmal. A legkisebb hatékonyságot (N=5000) ebben a méretben a Chromolith FastGradient töltet adta.

39

A héjszerkezetű töltetek előnyét a teljesen porózus 2 µm alatti szemcseátmérőjű töltetekkel szemben egy 4,1 kDa molekula tömegű polipeptid példáján mutatom be (4. ábra).

4. ábra: Egy 4,1 kDa tömegű polipeptid különböző 5 cm hosszúságú oszlopokon mért kinetikus görbéje (N - t0/N2). Mozgófázis: 140:860:1 ACN:víz:TFA, η=0,99 cP, kolonna hőmérséklet: 35°C, injektált térfogat: 0,5 µl. A megengedhető nyomásesés Acquity BEH C18 oszlop esetén 1000 bar, Kinetex C18 és Ascentis Express oszlopok esetén 600 bar. Az elméleti tányérszámra eső elemzési idő a Kinetex oszlop (héjvastagság 0,23 µm) esetén volt a legalacsonyabb. Növelve a héj vastagságát, nő a t 0/N2 érték is (Ascentis Express oszlop héjvastagság: 0,5 µm). Legmagasabban a teljesen porózus BEH C18 oszlop görbéje fut.

3.2.2. Eredmények, következtetések Az általam vizsgált oszlopok N – t0/N2 görbéi alapján elmondható, hogy 2,6 és 1,7 µm szemcseátmérőjű héjszerkezetű oszlopok közül a kisebb szemcseátmérőjű töltet alacsonyabb t 0/N2 értéket adott.

40

Összehasonlítva a teljesen porózus Acquity BEH C18 oszlop teljesítményét a különböző hőmérsékleteken (30 és 85°C) megállapítható, hogy a hőmérséklet növelésével csökkenthető az adott hatékonyság eléréséhez szükséges elemzési idő. A 2,6 µm szemcseátmérőjű héjszerkezetű töltet, az 1,7 µm és 1,5 µm szemcseátmérőjű teljesen porózus állófázisok hasonló elválasztási sebességet biztosítottak a vizsgált tartományban. Az N – L görbék alapján megállapítható, hogy az általam vizsgált állófázisok közül a 2 µm szemcseátmérő alatti, héjszerkezetű Kinetex oszlop adta a leghatékonyabb elválasztást (N=20 000), míg a Chromolith Flash oszlop bizonyult a legkevésbé hatékonynak (N=5000). Polipeptid vizsgálata esetén a héjszerkezetű töltetek gyorsabb elválasztást biztosítanak, mint a 2 µm szemcseátmérő alatti, teljesen porózus töltet. A héj vastagságát csökkentve az elméleti tányérszámra eső elemzési idő is csökken. 3.3. Nagyhatékonyságú és ultra – nagyhatékonyságú töltetek gyakorlati alkalmazási lehetőségei, az injektált térfogat hatása Az általános kromatográfiás gyakorlatban lineáris izotermát alkalmazunk, ebben az esetben egyenes arány van a kolonnára felvitt és a felületen szorbeált minta koncentrációja között. A gyakorlatban vannak olyan esetek, mint az általam is vizsgált példák, amikor a megfelelően kis kimutatási határ elérése érdekében el kell térni a lineáris izotermától. Ilyen esetekben vagy a minta koncentrációját, vagy az injektált térfogatot növelhetjük meg. Dolgozatomban ez utóbbira mutatok be példákat nagyhatékonyságú és ultra – nagyhatékonyságú rendszerekben. A kolonna túlterhelése nélkül alkalmazható injektált térfogat nagyhatékonyságú folyadékkromatográfiás módszerek esetén 10 – 25 µl, míg ultra – nagyhatékonyságú töltetek esetén ez az érték 2 és 5 µl között van. Mindezekből következik, hogy a nagytérfogatú injektálásban nagyságrendi különbség van a nagyhatékonyságú és az ultra – nagyhatékonyságú rendszerek esetén.

3.3.1. Nagyhatékonyságú töltetek gyakorlati alkalmazása: Szerin enantiomerek meghatározása patkányagyból A munka az EGIS gyógyszergyár Nyrt-vel együttműködésben készült. A gyógyszergyár részéről felkérés érkezett egy szerin enantiomerek

41

patkányagyból történő meghatározására alkalmas folyadékkromatográfiás módszer fejlesztésére. Az elválasztást akirális oszlopon, királis származékképzők alkalmazásával valósítottam meg. A módszerfejlesztés során két problémára kellett megoldást találnom. Az első probléma az, hogy mivel a D-Ser koncentrációja a patkányagy különböző részein nmol/g szinten van, ezért olyan módszert kellett fejlesztenem, aminek megfelelő kimutatási (LOD) és mennyiségi meghatározási (LOQ) határa van. A második problémát a biológiai minták pH-ja okozta, ugyanis az EGIS gyógyszergyárban a patkányagyak minta-előkészítése során egy perklórsavas fehérje kicsapást alkalmaznak, aminek következtében a kapott minta erősen savas. Az aminosav enantiomerek meghatározására alkalmazott származékképzési reakciók általában semleges vagy lugos közegben mennek végbe, így a származékképzők egy része nem, vagy csak a minta semlegesítése után alkalmazható. Ezért a származékképzési reakció során meg kellett vizsgálnom a minta oldat pH-jának hatását a származékképzési reakció lejátszódására. A biológiai minták előkészítése az EGIS Gyógyszergyár Nyrt. Preklinikai Kutatási Főosztályán történt. Nagy Katalin végezte a patkányagyak eltávolítását, Járási Andrea segített a minták feldolgozásában (minták lemérése, homogenizáló oldat hozzáadása, centrifuga kezelése). Berky Róbert (BME) segített a minták kromatográfiás mérésében. 3.3.1.1. Folyadékkromatográfiás körülmények A gyorsabb mérésekhez egy Purospher RP18e (125-4 mm; 5µm) oszlopot alkalmaztam, míg a biológiai minták vizsgálatához egy Purospher RP18e (250-4 mm; 5 µm) állófázist használtam. A rövidebb oszlop esetén a metanol és foszfát puffer aránya 40:60, a hosszabb oszlopnál 45:55 volt a mozgófázisban. Az 50 mM koncentrációjú foszfát pufferhez 6,8 g kálium-dihidrogén-foszfátot mértem be egy 1 literes mérőlombikba, a sót feloldottam, jelre töltöttem a lombikot és homogenizáltam. Az így kapott oldat pH-ját foszforsavval 4,5-ösre állítottam, majd a puffert 0,45 µm pórusméretű szűrűn leszűrtem. Az áramlási sebesség a 125 mm hosszú oszlop esetén 0,5 ml/perc volt, míg a 250 mm-es oszlopnál 0,4 ml/perc. A fluoreszcens detektor gerjesztési hullámhosszát 339 nm, míg emissziós hullámhosszát 452 nm-re állítottam. Az injektált térfogat 10 µl, kivéve a biológiai minták vizsgálatánál, ahol 200 µl-t injektáltam.

42

3.3.1.2. Származékképzési reakció OPA-Boc-L-cys reagenssel A szerin enantiomerek orto-ftáldialdehid (OPA) jelenlétében az N-tercbutiloxikarbonil-L-ciszteinnel (Boc-L-cys) fluoreszcensen aktív származékot képeznek (5. ábra), amelyek akirális körülmények között elválaszthatóak. A továbbiakban az L-szerinből képződött származékra L,L* - származékként, míg a D-szerinből képződőre D,L* - származékként hivatkozom. SH CHO

H2N COOH

+

H3C +

CHO OH

CH3 O

H3C

COOH NH

O COOH N OH S COOH HN O O H3C

CH3 CH3

5. ábra: Szerin enantiomerek származékképzési reakciója OPA-Boc-L-cys reagenssel A származékképzési reakcióhoz 10 mg OPA-t és 10 mg Boc-L-cyst feloldunk 7,3 ml nátrium-tetraborát (0,0125 M, pH=10) puffer és 300 µl abs. etanol keverékében. Erre az oldatra a továbbiakban OPA-Boc-L-cys törzsoldatként hivatkozom. 1-1 mg L- és D-szerint feloldunk 15 ml homogenizáló pufferben, ami a következőképpen készül: egy 250 ml-es mérőlombikban összemérünk 7,2 ml 70 %-os perklórsavat, 1 ml 0,1 M Na2S2O5 és 1,25 ml 0,1 M EDTA oldatot. Az így kapott keveréket homogenizáljuk, és jelre töltjük. A vizsgált aminosav standardot vagy biológiai mintákat meglúgosítva, majd hozzáadva a szükséges mennyiségű származékképzőt (OPA-Boc-L-cys törzsoldatot), pontosan 3 percen belül injektáljuk a kromatográfiás rendszerbe.

43

3.3.1.3. A diasztereomerek stabilitása Az aminosav: OPA-Boc-L-cys molarány befolyásolja a keletkező izoindol származék mennyiségét, az ebben a fejezetben bemutatott kísérleteim során ennek megfelelően vizsgáltam az aminosav – származékképző arány hatását a keletkezett származék stabilitására. A Ser-1 jelölésű oldatokban szerin: OPABoc-L-cys 1:2, míg a Ser-2 jelölésű oldatokban 1:10 arányt alkalmaztam. A diasztereomerek stabilitását vizsgáltam az első órában, ehhez a Purospher RP18e (125-4 mm, 5 µm) oszlopot alkalmaztam, illetve a származékképzést követő 7 órában, ehhez Purospher RP18e (250-4 mm, 5 µm).

6. ábra: A szerin-OPA-Boc-L-cys diasztereomerek bomlása az első órában (A, B) és az első óra után (C, D). Az A) és B) ábrán az állófázis Purospher RP18e (125-4 mm, 5 µm), mozgófázis 40:60 metanol: foszfát puffer (50 mM, pH=4,5), térfogatáramlási sebesség 0,5 ml/perc. A C) és D) ábrán az állófázis Purospher RP18e (250-4 mm, 5 µm), a mozgófázis 45:55 metanol: foszfát puffer (50 mM, pH=4,5), térfogatáramlási sebesség 0,4 ml/perc. A kolonna hőmérséklet 25°C, az injektált térfogat 10 µl, gerjesztési hullámhossz 339 nm, míg emissziós hullámhossz 452 nm volt. A Ser-1 jelölésű oldatokban szerin: OPA-Boc-L-cys aránya 1:2, míg a Ser-2 jelölésű oldatokban 1:10.

44

Az 6. ábrán látható, hogy idővel a diasztereomerek csúcsterülete csökken, valamint, hogy a kisebb szerin:OPA-Boc-L-cys arány nagyobb csúcsterületeket eredményezett. A területek természetes alapú logaritmusát az idő függvényében ábrázolva meghatározható a diasztereomerek bomlásának felezési ideje (3. táblázat).

3. táblázat: Szerin enantiomerek különböző arányú OPA-Boc-L-cys származékképzővel kapott diasztereomerek bomlásának felezési ideje. Kromatográfiás körülmények, mint az 5. ábrán. szerin: OPA-Boc-L-cys 1:2 1:10 t ½ D,L*-származék (perc) t ½ L,L*-származék (perc)

92

89

64

63

A 1. táblázat alapján elmondható, hogy a származékképző szerinhez mért arányának nincs befolyása a diasztereomerek bomlására: 1:2 illetve 1:10 arány esetén nincs jelentős eltérés az adott enentiomerre kapott felezési időben. Továbbá megfigyelhető, hogy az L-szerin diasztereomerének bomlása gyorsabb, mint a D-szerinből keletkező diasztereomeré. Az irodalomban szerin-OPA-Boc-L-cys származék felezési ideje nem található. Molnár-Perl vizsgálta különböző aminosavak ortoftáldialdehid és akirális 3-merkaptoetanol (ME) származékának bomlását. Az általa vizsgált n-propilamin, GABA, β-alanin, glicin, 2-amino-vajsav és alanin származékok felezési ideje 20 és 90 perc között változott [127]. 3.3.1.4. A származékképző fölöslegének hatása A diasztereomerek kialakulását befolyásolja az aminosav: OPA-Boc-L-cys arány, ezért az aminosav:származékképző aányt 1:1; 1:1,5; 1:2 és 1:10 arányban állítottam be. Az eredményeket a 7. ábrán mutatom be.

45

7. ábra: Szerin: OPA-Boc-L-cys arány vizsgálata, A) D,L*-származék stabilitása, B) L,L*-származék csúcsterületeinek változása az első órában. Kromatográfiás körülmények: megegyeznek az 5. ábrán szereplőkkel, állófázis Purospher RP18e (125-4 mm, 5 µm). A legnagyobb csúcsterületeket szerin: OPA-Boc-L-cys 1:1,5 aránynál kaptam. Ha a szerin: származékképző arányt 1:2 fölé emeltem a keletkezett származék mennyisége csökkent. Mivel azonban a biológiai minták, mint például az általam vizsgált patkányagyak szerinen kívül sok más komponenst is tartalmaznak, amelyek reagálnak az OPA-Boc-L-cys származékképzővel, így ebben az esetben nagy feleslegben kell alkalmazni a reaktánsokat.

46

3.3.1.5. A pH hatása a származékképzési reakcióra Az általam vizsgált származékképzési reakció csak lúgos körülmények között megy végbe. Ennek megfelelően Hamase és Morikawa 9-es [114, 151], Grant 10-es pH-jú [152] borát puffert alkalmaz az OPA-Boc-L-cys származékképző elkészítéséhez. A származékképző oldat pH-ja mellett azonban fontos szerepe van a minta pH-jának is. A fent említett irodalmi példákban a biológiai minták feldolgozása során metanolt alkalmaztak a fehérje kicsapásához, ami nem befolyásolja a minta pH-ját. Az általunk alkalmazott homogenizáló puffer a perklórsav miatt erősen savas mintát eredményez, ami megakadályozza a származékképzési reakció lejátszódását. Ahhoz, hogy a pH hatását tanulmányozhassam homogenizáló pufferben oldott, 0,32 mM koncentrációjú standard D, L-szerin oldatot készítettem, aminek 1,5-ös a pH-ja. Ehhez különböző mennyiségű 5 M-os nátriumhidroxid oldatot adagoltam. A pH-t egy mikro üveg pH elektróddal felszerelt Metrohm 780-as pH mérővel követtem. A meglugosított mintához 1:1,5 molarányban adtam az OPA-Boc-L-cys származékképzőt. A pH csúcsterületre gyakorolt hatását a 8. ábrán mutatom be.

8. ábra: A minta pH-jának csúcsterületre gyakorolt hatása. Kromatográfiás körülmények: lásd 7. ábra. A pH-t 11 fölé növelve csökken a csúcsterület és a két enantiomer reakcióképessége megváltozik, 12,5-ös pH-n a D,L*-származék, míg 13-as pH-n az L,L*-származék ad nagyobb csúcsterületet. 47

Ezen tapasztalatok alapján, azért hogy a két enantiomer azonos mértékben reagáljon, az agyminták pH-ját 11-esre állítom, amit úgy értem el, hogy 500 µl homogenizátumhoz 31 µl 5 M-os nátrium-hidroxid oldatot adagoltam. Az aminosav enantiomerek OPA-Boc-L-cys reagenssel történő származékképzése során eltérő reakcióképességét már korábban Buck is leírta, 9-es pH-jú származékképzőt alkalmazva azonos koncentrációjú enantiomerek esetén a triptofán D-enantiomere nagyobb fluoreszcens jelet adott, mint az L-izomer, míg fenilalaninol esetén a D-fenilalaninol nagyobb jelet adott, mint az L-fenilalaninol. Az enantiomerek azonos koncentrációban voltak jelen mindkét esetben [129]. Mindezek alátámasztják az eredményeimet, miszerint adott pH-n azonos koncentrációban lévő enantiomerek különböző nagyságú fluoreszcens jelet adnak. 3.3.1.6. Az injektált térfogat hatásának vizsgálata A szerin enantiomerek az agy különböző részein nagyon eltérő mennyiségben fordulnak elő. Koncentrációjuk általában nmol/g vagy ng/g nedves szövet egységben mérhető. Ennek megfelelően olyan módszer kidolgozása volt szükséges, amelynek a kimutatási (LOD) és mennyiségi meghatározási határa (LOQ) is ebben a tartományban van. Ahhoz, hogy jelentősebb zónaszélesedés nélkül nagyobb térfogatot tudjunk injektálni a mintát fókuszálni kell. Erre, ahogy az irodalmi részben is utaltam több lehetőség áll rendelkezésre: i) mozgófázis eluenserősségéhez képest kisebb erősségű oldószer alkalmazása, ii) pulzus gradiens, iii) gradiens elúció. Ebben a fejezetben az oldószer megfelelő megválasztására mutatok példát. A patkányagy minták előkészítése egy vizes homogenizáló pufferes fehérje kicsapással kezdődik, amelyet egy centrifugálási lépés követ. A származékképzési reakció során a mintákhoz adott reagens kb. 3,9 % abs. etanolt tartalmaz. A kapott minta tehát elhanyagolható mennyiségű abs. etanolt tartalmazó vizes oldat, amelynek az elúciós erőssége sokkal kisebb, mint a mozgófázisként alkalmazott 45:55 metanol: foszfát puffer (50 mM, pH=4,5) elegynek. Az injektált térfogat hatását a LOD és LOQ értékeire 10, 50 és 200 µl minta injektálásával vizsgáltam (9.ábra).

48

9. ábra: Az injektált térfogat hatása a kimutatási és mennyiségi meghatározási határra. Kromatográfiás körülmények: állófázis Purospher RP18e (250-4 mm, 5 µm), mozgófázis 45:55 metanol: foszfát puffer (50 mM, pH=4,5), térfogatáramlási sebesség 0,4 ml/perc. A többi paraméter megegyezik a 7. ábrán szereplővel. Az injektált térfogatot 10 µl-ről 200 µl-re növelve az L,L*-származék LOQ értéke hatodára, míg a D,L*-származéké majdnem ötödére csökkent (4. táblázat). 4. táblázat: A kimutatási határ, mennyiségi meghatározási határ és az egységnyi hosszra eső elméleti tányérszám alakulása az injektált térfogat függvényében. injektált térfogat (µl) 10 50 200

L,L*-származék LOD (nmol/l) 0,016 0,017 0,002

LOQ (nmol/l) 0,052 0,056 0,009

D,L*-származék N (1/m) 6616 6464 6512

LOD (nmol/l) 0,012 0,013 0,003

LOQ (nmol/l) 0,041 0,049 0,008

N (1/m) 7864 6840 7304

A 4. táblázat alapján elmondható, hogy a méterre eső elméleti tányérszám ilyen hosszú oszlop esetén (250 mm) nem csökken az injektált térfogat növelésével. Az oldószer helyes megválasztásával (a mozgófázisnál kisebb eluenserősségű oldószer) hatékonyságvesztés nélkül 10 µl-ről 200 µl-re 49

növelve az injektált térfogatot nmol/l koncentráció szintre volt csökkenthető a LOD, LOQ értéke. Ezek a mérések egyben irányt mutattak, hogy UHPLC módszer alkalmazásakor milyen módszereket alkalmazzak a nagytérfogatú adagolás tanulmányozásakor. 3.3.1.7. Nagytérfogatú injektálás alkalmazása biológiai minták HPLC-s elemzésekor A biológiai mintákat az EGIS Gyógyszergyár biztosította. A hímnemű SPRD patkányokat (250-300 g) rendszeresen ismétlődő 12 órás fény-sötét ciklusokban tartották, szabad hozzáférésük volt a vízhez és élelemhez. Az agyszöveteket (striatum, cerebellum vagy kisagy, prefrontal cortex vagy prefrontális kéreg) jégen távolították el és -80°C-on voltak tárolva a feldolgozásig. A feldolgozás során a minták tömegét lemértem, majd homogenizáló puffert adtam hozzájuk. A striatum és prefrontális kéreg esetén 1 ml-t 10 mg szövethez, a kisagy esetén 1 ml-t 100 mg szövethez. Az így kapott homogenizált mintákat 20 000 fordulat/perc sebességgel 4°C-on 20 percig centrifugáltam. A felülúszó 0,5 ml-hez 31 µl 5 M-os nátrium-hidroxid oldatot adtam a pH beállítása érdekében. Az így kapott oldathoz adtam 100 µl OPA-Boc-L-cys törzsoldatot és pontosan három perc múlva a mintákat injektáltam a kromatográfiás rendszerbe. Az agyminták vizsgálatához Purospher RP18e (250-4 mm, 5 µm) oszlopot alkalmaztam, a kimutatási határ csökkentése érdekében az injektált térfogat 200 µl volt. A rendszer teljesítmény jellemzőit a 5. táblázatban foglaltam össze. 5. táblázat: A szerin enantiomerek elválasztására alkalmazott folyadékkromatográfiás rendszer teljesítmény jellemzői. L,L*-származék D,L*-származék k 4,02 4,77 LOD (nmol/l) (S/N=3) 0,002 0,003 LOQ (nmol/l) (S/N=10) 0,009 0,008

A jellemző kromatogramokat a 10. ábra mutatja.

50

10. ábra: A) standard oldat kromatogramja, B) patkány striatum, C) patkány kisagy. Kromatográfiás körülmények: lásd 8. ábra, azzal a különbséggel, hogy az injektált térfogat: 200 µl. A striatumban és a prefrontális kéregben detektáltam D-Ser-t, míg a kisagyban a kimutatási határ alatt maradt a D-szerin szintje. 3.3.1.8. Eredmények, következtetések Munkám során nagyhatékonyságú folyadékkromatográfiás módszert fejlesztettem szerin enantiomerek patkányagyból történő meghatározására. Elsőként vizsgáltam szerin enantiomerek OPA – Boc származékképzővel keletkező disztereomerjeinek stabilitását, megállapítottam, hogy az Lenantiomerből képződő származék kevésbé stabil (felezési idő: 64 perc), mint a D-enantiomerből képződő származék (felezési idő 91 perc). Munkám során bizonyítottam, hogy a minta pH-jának szignifikáns hatása van a származékképzési reakcióra és ennek megfelelően optimáltam a minta pH-ját (pH=11). A megfelelő kimutatási és mennyiségi meghatározási határ elérése érdekében nagytérfogatú injektálást alkalmaztam. Az oldószer megfelelő megválasztásával az injektált térfogat 200 µl-re volt növelhető

51

hatékonyságvesztés nélkül és ezzel nmol/l koncentráció tartományba eső LOD és LOQ volt biztosítható. 3.3.2. Ultra – nagyhatékonyságú töltetek gyakorlati alkalmazhatósága I.: HPLC és HPLC mérések összevetése Keppra (levetiracetam) meghatározása vérszérumból A munka az Országos Idegtudományi Intézettel együttműködésben készült. Az Intézetben alkalmazott minta-előkészítési (folyadék-folyadék extrakció) és nagyhatékonyságú folyadékkromatográfiás (HPLC-UV) módszer nem biztosított megfelelő szelektivitást levetiracetam vérszérumból történő monitorozásához (Therapeutic Drug Monitoring, TDM), ezért felkérés érkezett a kutató csoport részére a módszer átdolgozására, új módszerek fejlesztésére. A feladat megoldásakor több célom volt, először is egy nagyhatékonyságú folyadékkromatográfiás módszer kidolgozása, melynek első lépéseként az állófázist optimáltam, majd a minta-előkészítés megfelelő megválasztásával növeltem tovább a módszer szelektivitását. Továbbá célom volt, hogy a rendelkezésemre álló ultra–nagyhatékonyságú készüléken kihasználva a 2 µm alatti szemcseátmérőjű, teljesen porózus töltetek nyújtotta nagyobb hatékonyságot tovább növeljem az elválasztás hatékonyságát és tovább csökkentsem a kimutatási és meghatározási határt is. A munkám során felhasznált biológiai mintákat: vak (levetiracetam nélküli) és betegek terápiás monitorozásából (TDM) származó vérszérum mintákat az Országos Idegtudományi Intézet labóratóriumának egyik munkatársával, Bacsói Gyöngyivel készítettük elő. Az UHPLC méréseket Waters UPLC készülékkel, a HPLC méréseket Merck Hitachi készülékkel végeztem (3.1.1. fejezet). Az elválasztás hatékonyságát a készülék zónaszélesítő hatása is befolyásolja. Az általam alkalmazott Merck Hitachi HPLC készüléknek 100200 µl2, míg az Acquity UPLC készüléknek 6-7 µl2 a kolonnán kívüli zónaszélesítő hatása [153]. A munka során Bacsói Gyöngyi a szérum minták előkészítésében segített. Együtt készítettük elő a folyadék-folyadék extrakcióval és fehérje kicsapással készülő mintákat. Illetve az 5 beteg mintáinak mérésekor ő volt a másik analitikus.

52

3.3.2.1. A mozgófázis összetételének optimálása

A mozgófázis kiválasztásához szükséges a vizsgált vegyület néhány alapvető fizikai – kémiai tulajdonságának ismerete. Ilyen tulajdonság a vegyületek hidrofóbicitására jellemző oktanol – víz megoszlási hányados logaritmusa (lgP), vagy a lgP pH függését megadó lgD érték, a savi disszociációs állandó (pKa). Ezen paraméterek meghatározása történhet kísérleti úton, vagy a kromatográfiás elválasztások tervezéséhez egyre gyakrabban alkalmazott szakértői becslő szoftverek segítségével (pl.: Pallas ®, ChemDesk, Marwin stb.). A számomra rendelkezésre álló Pallas® szoftver által a levetiracetamra becsült lgP = -0,73, a pKa = 1,66. A becsült lgD – pH diagram a 11. ábrán látható.

11. ábra: Levetiracetam Pallas® program segítségével számított lgD – pH diagramja. Az ábra alapján látható, hogy a levetiracetam lgD görbéje 2,5 pH-ig folyamatos nő, majd függetlenné válik a pH-tól. Robusztus módszer fejlesztéséhez tehát pH kontroll szükséges. Ahhoz, hogy a vegyület pKa ± 2 tartományán kívül legyünk (egyféle molekuláris formában tartsuk a komponenst) a mozgófázis pH-ját ~3,5 fölött kell tartani. Erre alkalmas lehet a kálium-dihidrogén-foszfát puffer, aminek maximális puffer kapacitása van pH= 7 ± 1 tartományban. Ennek megfelelően a mozgófázishoz 10 mM-os koncentrációban adtam káliumdihidrogén foszfát puffert, melynek pH-ját foszforsavval állítottam 6,6-os értékre.

53

Gyakorlati tapasztalat alapján becsülhető a mozgófázis szerves oldószer tartalma: B% = (lgP + 2) * 10

(3)

A képlet alapján a mozgófázisban 10 % acetonitril alkalmazása célszerű. 3.3.2.2. Állófázis optimálás HPLC-ban A mozgófázis kiválasztása után hat különböző típusú állófázis szelektivitását vizsgáltam. Ehhez minden oszlopra injektáltam egy vak és egy levetiracetammal addícionált, 25 µg/ml koncentrációjú vérszérum mintát. A méréseket a 3.1.1. fejezetben leírt Merck Hitachi Lachrom HPLC készüléken végeztem. A mozgófázis 10:90 acetonitril:foszfát puffer (pH=6,6, 10 mM), áramlási sebesség 1 ml/perc volt. A kolonna termosztátot 30°C-ra állítottam, a detektálás 210 nm-en történt, az injektált térfogat minden esetben 10 µl volt. Az állófázisok fizikai tulajdonságait a 6. táblázat tartalmazza. A kromatográfiás állófázisok összehasonlítására alkalmas hidrofób – megoszlás (Hydrophobic – Subtraction model) modellt [149] alkalmazva képet kaphatunk a vizsgált oszlopok hasonlóságáról illetve különbözőségéről (ortogonalitásáról). A modell az állófázis által a komponenssel kialakítható kölcsönhatásokat (H: hidrofób kölcsönhatás, S*: sztérikus gátlás, A: az állófázis savas karaktere, B: az állófázis bázikus karaktere, C: a töltet ionizált szilanol csoportjainak köszönhető kation cserélő tulajdonsága) veszi figyelembe a besorolásnál. A modell, az állófázisok összehasonlításához a fent említett tényezőkből a 4. egyenlet segítségével határozza meg az összehasonlítás alapjául szolgáló F értéket.





2 2 2 * * 2  12,5H 2  H1   100(S 2  S1 )  30A 2  A1   143B 2  B1    Fs    2    83C 2  C1  

1/ 2

(4) ahol, H1 és H2 a két összehasonlítandó oszlop H értéke, S1* és S2* a két összehasonlítandó oszlop S* értéke, A1 és A2 a két összehasonlítandó oszlop A értéke, B1 és B2 a két összehasonlítandó oszlop B értéke, C1 és C2 a két összehasonlítandó oszlop C értéke.

54

6. táblázat: Levetiracetam vérszérumból történő HPLC-s módszer kidolgozása során vizsgált állófázisok fizikai tulajdonságai.

hossz/átmérő (mm) /szemcseátmérő [µm] Pórus átmérő [Ǻ] szemcse alak 2

Fajlagos felület [m /g]

Purospher RP18e (Merck)

BDS Hypersil C18 (Thermo)

SupelcosilTM SuplexTM pKb100 (Supelco)

YMC-Pack ODS-AQ (YMC)

Symmetry C18 (Waters)

Zorbax Extend C18 (Agilent)

BEH C18 (Waters)

250/4/5

100/4.6/3

150/4.6/5

250/4.6/5

150/3.9/5

250/4.6/5

100/2,1/1,7

120

130

120

120/200

100

80

124

gömb

gömb

gömb

gömb

gömb

gömb

gömb

350

170

170

330/175

335

180

181

Felületi borítottság [µmol/m2] Széntartalom [%]

3

n.a.

3.4

2.3

3.13

n.a.

3,07

18

11

12.5

14/10

19.1

12.5

17,19

pH stabilitás

2-7.5

2-9

2-7.5

2-7.5

2-8

1-12

Fémtartalom [ppm]

<5ppm

Mg 10ppm, Fe 88 ppm, K 10ppm, Na 1350 ppm, Ca 10 ppm, Ti 28ppm, Al 11ppm

n.a.

Al 3.7 ppm, Fe 12.1ppm, Ti 0.1ppm, Mg 0.5ppm, Ca 0.2ppm, Na 9.8 ppm

Na<1ppm, Al<1ppm, Fe 2ppm

Endcapped

igen

igen

nem

igen

igen

2-11.5 Na 10 ppm, K<3 ppm, Mg 4 ppm, Al 1.5 ppm, Ca 2ppm, Fe 3ppm, Zn 1 ppm, Zr, Cu, Cr,Ti below DL, DL:1ppm dupla

n.a. – nincs adat

Na 8 ppm, Al 3 ppm, Fe 7 ppm

igen

Ha az F érték kisebb vagy egyenlő hárommal, akkor a két állófázist hasonlónak, míg ha nagyobb, mint három, akkor a két oszlopot ortogonálisnak tekintjük. Az USP kolonna összehasonlító programja [154] az általam vizsgált oszlopok közül a Supelcosil TM SuplexTM pKb-100 oszlopot, ami egy utószilanizálás nélküli ún. „embedded” alkil-amid állófázist nem tartalmazza. Az Agilent Zorbax Extend C18 oszlopot véve az összehasonlítás alapjául, elmondható, hogy az általam vizsgált oszlopok közül a Symmetry C 18 hasonló az Agilent Zorbax Extend C18 oszlophoz, míg a többi állófázis nagyon eltérő szelektivitást ad (7. táblázat). 7. táblázat: A H-S (hydrophobic-subtraction model) modell alapján meghatározott kolonna – komponens kölcsönhatásokat jellemző tényezők (H, S, A, B, C) és a kolonnák összehasonlíthatóságát szolgáló paraméter (F). Oszlop H Agilent Zorbax Extend 1,098 C18 Symmetry C18 1,052 Hypersil BDS 0,993 C18 YMC - Pack 0,965 ODS - AQ Purospher 0,841 RP18e

S

A

B

0,05

0,012

-0,041

0,03

0,016

0

0,063

0,018

-0,029

-0,019

0,153

3,37

0,016

-0,095 -0,009

0,337

0,281

6,67

0,004

-0,068

0,1

11,73

0,3

-0,964

0,901

52,43

-0,036 -0,135 0,235

0,155

C (2,8)

C(7,0) F

A Hypersil BDS C18 oszlop Szilika-A típusú állófázis, amit a kationcserélő tulajdonságra jellemző magas C érték is mutat. Az Agilent Zorbax Extend C18, Symmetry C18 és Purospher RP18e oszlopok Szilika-B típusú nagy tisztaságú szilikagél alapú töltetek. Az első két oszlop hasonlóságát a háromhoz közeli (3,37) F érték is mutatja. Ezzel szemben a Purospher RP18e oszlop nagy szelektivitás különbséget mutat ezekhez az oszlopokhoz képest, ami magas sztérikus gátlásra jellemző S értékével, eltérő savas, bázikus karakterével valamint hidrofóbicitásbeli különbségével magyarázható. A vizsgált oszlopok közül a YMC-Pack ODS-AQ egy hidrofil-lipofil egyensúlyt biztosító állófázis, aminek a szilanol aktivitását szabadalom védett utószilanizálással csökkentették, ennek köszönhetően sokkal kisebb a savas karaktere (A= -0,135), mint a jól borított Szilika-B típusú Agilent Zorbax Extend C18 állófázisnak (A=0,012), ugyanakkor az oszlop hidrofóbicitása (H=0,965) nem tér el jelentősen a Zorbax oszlopétól (H=1,098). A különböző állófázisokkal kapott kromatogramok a 12. ábrán láthatóak.

56

12. ábra: Bal oldali ábrán a vak, a jobb oldali ábrán a levetiracetammal szpájkolt (25 µg/ml) vérszérum minta kromatogramja látható. Alkalmazott állófázisok: A) Agilent Zorbax Extend C18 B) SupelcosilTM SuplexTM pKb-100, C) YMC-Pack ODS-AQ, D) Hypersil BDS (C18), E) Purospher RP18e, F) Symmetry C18, mozgófázis: 10:90 ACN:foszfát puffer (pH=6,6, 10mM). Térfogatáramlási sebesség: 1 ml/min, kolonna hőmérséklet: 30°C, injektált térfogat: 10 µl, detektálási hullámhossz: 210 nm. A különböző oszlopok nagyon eltérő szelektivitást adtak, ahogy az, az F értékek alapján várható is volt. Megfelelő szelektivitást (Rs ≥ 1,5), csak az Agilent Zorbax Extend és a Hypersil BDS (C18) oszlopok biztosítottak. Az utóbbi Szilika-A típusú oszlop nagyobb szilanol aktivitással rendelkezik, így ennek megfelelően a csúcsok szélesebbek, kisebb a hatékonysága, mint az Agilent Zorbax Extend C18 oszlopnak. A HPLC-s elválasztásokhoz a továbbiakban az Agilent Zorbax Extend oszlopot alkalmaztam. Ez az oszlop nagy borítottságú utószilanizált és az ún. pH tűrő állófázisok közé

57

tartozik. A nagy borítottság és ezzel összefüggésben nagy hidrofobicitása miatt elsődlegesen a diszperziós kölcsönhatás szabja meg a vegyületek visszatartását. Ezt azért kívánom kiemelni, mert hasonlóan nagy hidrofóbicitású az UHPLC méréseknél használt Waters cég által forgalmazott BEH töltet is, amire szeretném adaptálni a módszert. 3.3.2.3. Módszerátvitel és a két módszer (HPLC és UPLC) összehasonlítása, injektált térfogat hatása A HPLC módszer UHPLC-ra történő átvitelénél a tölteteknek hasonló fizikai és kémiai tulajdonságokkal kell rendelkezniük. Az UHPLC módszernél használt töltetek kivétel nélkül a Szilika-B kategóriába tartoznak. Ezekre jellemző a kis fémion tartalom (<10 ppm), és a nem reagált szilanol csoportok kis aktivitása. A Waters cég által forgalmazott UHPLC oszlopok ún. BEH (Bridge Ethylene Hybride) technológiával készülnek. Ennek lényege, hogy minden negyedik sziloxán kötést etilén csoport helyettesít, ezáltal a felület hidrofóbicitása tovább nő. A Zorbax Extend C18 oszlop szintén egy jól borított, Szilika-B kategóriába tartozó állófázis. Ennél az állófázisnál is etilén híd található két szilícium atom között, de nem a szilikagél alapvázban, hanem a módosításra használt biszilánban. A Zorbax Extend C18 és BEH C18 állófázisok szerkezete a 13. ábrán látható az állófázisok különböző tulajdonságait a 6. táblázatban foglaltam össze. A fent elmondottak alapján, annak ellenére, hogy a Snyder-féle empirikus összehasonlító paraméterek nem állnak rendelkezésre a BEH C18 oszlopra, feltételezhető a két állófázis tulajdonságainak nagyfokú hasonlósága.

13. ábra: A) Zorbax Extend C18 oszlop felületi képe [155], B) BEH technológia [156]. A mozgófázis térfogatáramlási sebességét a 2.5.2-es fejezetben leírtak alapján számítottam át:

58

F2 

d 22 (2,1mm) 2 * F  *1ml / perc  0,2ml / perc 1 d12 (4,6mm) 2

(5)

A lineáris áramlási sebességet megtartva, a fenti egyenlet értelmében a 2,1 mm átmérőjű oszlopon 0,2 ml/perc térfogatáramlási sebességet kell alkalmazni. Mivel az UHPLC-s oszlopok terhelhetősége sokkal kisebb, mint a hagyományos HPLC-s oszlopoké, ezért az injektált térfogatot is át kell számolni:

r22 * L2 (2,1mm) 2 *100mm V2  2 * V1  * 20l  1,67 l r1 * L1 (4,6mm) 2 * 250mm

(6)

A kis átmérőjű oszlopra adagolható térfogat ennek megfelelően ~2 µl. A biológiai mintákból történő levetiracetam meghatározáshoz ez a mennyiség nem nyújt megfelelő kimutatási és mennyiségi meghatározási határt. A továbbiakban azt vizsgáltam meg, hogy hogyan változnak a mennyiségi meghatározásra jellemző adatok és a kinetikai hatékonyság az injektált térfogat változtatásával.

14. ábra: Az injektált térfogat hatása az elméleti tányérszámra. Állófázis: BEH C18 (100-2,1 mm; 1,7 µm), mozgófázis: 10:90 ACN:foszfát puffer (pH=6,6, 10 mM), térfogatáramlási sebesség: 0,2 ml/perc, kolonna hőmérséklet: 30°C, injektált térfogat 2, 5, 10, 15 és 20 µl, detektálási hullámhossz: 215 nm.

59

8. táblázat: A kimutatási határ, mennyiségi meghatározási határ és a méterre eső elméleti tányérszám alakulása az injektált térfogat függvényében.

injektált térfogat (µl) 2 5 10 15 20

Keppra LOD (ng/ml) 181 78 42 31 10

LOQ (ng/ml) 604 259 141 102 33

N (1/m) 51020 42110 34080 28670 24900

Az injektált térfogatot 2 µl-ről 20 µl-re növelve csökken az elméleti tányérszám, ami már 5 µl injektált térfogat esetén is túllépi a megengedhető 10 %-os csökkenést (8. táblázat), mindamellett, hogy az LOD, LOQ érték csökken (14. ábra). Az általam alkalmazott készülék esetén a maximális injektálható térfogat 20 µl, amivel 10 ng/ml-es LOD és 33 ng/ml-es LOQ értéket értem el. Az általam fejlesztett nagyhatékonyságú és az UHPLC készülékre átszámolt, megemelt injektált térfogattal (20 µl) alkalmazott ultra–nagyhatékonyságú elválasztás néhány kromatográfiás paraméterét a 9. táblázatban foglaltam össze. 9. táblázat: A nagyhatékonyságú (Merck Hitachi LaChrom készülék, Agilent Zorbax C18 5 µm, 250 - 4,6 mm oszloppal) és ultra – nagyhatékonyságú (Waters Acquity UPLC, BEH C18 1,7 µm, 100 – 2,1 mm állófázissal) elválasztások folyadékkromatográfiás paramétereinek összehasonlítása. Kromatográfiás paraméterek UPLC HPLC visszatartási tényező

2.2

1.5

aszimmetria faktor

1.36

1.52

elméleti tányérszám [1/m]

24900

12600

detektálási határ [ng/ml]

10

287

mennyiségi meghatározási határ [ng/ml]

33

959

A két kolonna formai hasonlósága ellenére eltérően tartotta vissza a vizsgált komponenst. A BEH kolonnán mért nagyobb visszatartás azt jelzi, hogy a felület hidrofób (apoláris) jellege nagyobb, mint a Zorbax Extend C-18 oszlopé. A kis szemcseátmérőnek köszönhetően, UPLC esetén majdnem kétszeresére nőtt a méterre eső elméleti tányérszám értéke a HPLC-s elválasztáshoz képest. Az ultra – nagyhatékonyságú elválasztásoknál nagy injektált térfogatnak számító 20 µl-es injektálással kapott kimutatási és mennyiségi meghatározási határ közel harmincad része volt a HPLC-val elérhető értéknek.

60

3.3.2.4. A minta-előkészítés optimálása során alkalmazott folyadékkromatográfiás körülmények Az UHPLC méréseket Waters UPLC készülékkel (BME), a HPLC méréseket Merck Hitachi (BME) és Waters HPLC készülékeken (Országos Idegtudományi Intézet végeztük (lásd 3.1.1. fejezet). A mozgófázis a 3.3.2.1. fejezetben leírtak szerint készült. Az állófázisok a 3.3.2.3. fejezetben vannak megadva. A kolonna hőmérsékletét 30°C-ra állítottuk be, a detektálási hullámhosszként HPLC-nál 210 nm-t, UPLC-nál 215 nm-t alkalmaztunk. Az áramlási sebesség HPLC esetén 1 ml/perc, UPLC esetén 0,2 ml/perc, az injektált térfogat minden esetben 20 µl volt. 3.3.2.5. Minta előkészítési módszerek A vérmintákat az Országos Idegtudományi Intézetben, epilepsziában szenvedő betegektől vették. A mintavételhez clot activatoros Sarstedt Monovette csöveket alkalmaztak. Minden betegtől 5 ml vénás vért vettek a rutin terápiás vérszint ellenőrzéséhez. Az így kapott mintákat 10 percen át, 25°C-on, 3500 fordulat/perc sebességgel lecentrifugálták. A szérumot Eppendorf csövekbe tették és vizsgálat előtt maximum egy hónapig -20°C-on, vagy maximum két hétig 4°C-on tárolták. Szilárd fázisú extrakció (SPE) Oasis HLB (hydrophilic-lipophilic-balanced) és Oasis MAX (mixed mode anion exchange) szilárd fázisú extrakciós oszlopokat három lépésben aktiváltam. Először 2 ml diklór-metánnal eltávolítottam a gyártásból származó apoláris szennyezőket, majd 2 ml metanollal aktiváltam végül 2 ml vízzel kondícionáltam az oszlopokat. Az így előkészített SPE töltetekre 500 µl keppra tartalmú szérumot vittem fel, amit aztán 2 ml vízzel mostam. Az elúció 1 ml metanollal történt. Folyadék-folyadék extrakció Extrelut állófázison Az Extrelut oszlopokat az Országos Idegtudományi Intézetben házilag töltötték. Ezeket 1 ml diklórmetán-metanol 30:70 arányú keverékével aktiváltuk, majd 500 µl kepprával addícionált szérum mintát vittünk fel az oszlopra. 10 perc várakozás után 6 ml diklórmetánnal eluáltuk a mintát. A kapott oldatot 60°C-os vízfürdőn szárazra pároltuk és a maradékot mozgófázisba visszaoldottuk. A mintát 0,22 µm pórusátmérőjű szűrőn való szűrés után a kromatográfiás rendszerbe injektáltam. Fehérje kicsapás szerves oldószerrel A fehérje kicsapáshoz szerves fázisként metanolt ill. acetonitrilt alkalmaztunk. A vérszérum mintákhoz 1:2 arányban adtuk hozzá a szerves oldószert. Miután a mintákat kémcsőrázatón összeráztuk, 10 perc állás után 5000 fordulat/perc sebességgel, 25°C-on centrifugáltuk. A felülúszót mozgófázissal duplájára hígítottuk és 0,22 µm pórusátmérőjű szűrőn szűrtük.

61

3.3.2.6.UPLC módszer validálása A validálás során vizsgáltam a módszer specifikusságát, pontosságát (intermediate precision), torzítatlanságát, detektálás alsó határát, mennyiségi meghatározási határt, valamint a módszer robusztusságát. A torzítatlanság vizsgálatánál mindhárom minta-előkészítési módszert megvizsgáltam, minden más esetben metanolos fehérje kicsapást alkalmaztam. A módszer specifikusságát vak és levetiracetammal szpájkolt vérszérum mintákkal ellenőriztem (15. ábra).

15. ábra: Levetiracetam UPLC-s szelektivitás vizsgálata: A) vak, B) 25 µg/ml koncentrációval szpájkolt vérszérum minta kromatogramja látható. Állófázis: BEH C18 (1,7 µm, 100-2,1 mm), mozgófázis: 10:90 ACN: foszfát puffer (pH=6,6, 10 mM). Térfogatáramlási sebesség: 0,2 ml/perc, kolonna hőmérséklet: 30°C, injektált térfogat: 20 µl, detektálási hullámhossz: 215 nm.

A pontosság meghatározásához három különböző alkalommal 2, 40 és 80 µg/ml koncentrációban levetiracetamot adtam vak szérum mintákhoz. A relatív standard szórás az ezekre az oldatokra kapott csúcsterületekre rendre 1,98 %, 1,15 %, 1,47% volt, ami teljesíti az RSD% ≤5 % követelményt. A torzítatlanság vizsgálatánál vak szérum mintákhoz öt különböző koncentrációban (2, 25, 50, 75, 100 µg/ml) adtam keppra standardot és három ismétléssel dolgoztam. Ezt a kísérlet sorozatot mindhárom minta-előkészítési módszerrel elvégeztem. Az eredményeket a 10. táblázatban foglaltam össze. Követelmények: egyedi visszanyerés 80-120%, RSD% ≤5 %.

62

10. táblázat: A különböző minta-előkészítési módszerekkel kapott átlagos visszanyerés értékek. Kromatográfiás körülmények, mint 15. ábrán. folyadék-folyadék extrakció átlagos visszanyerés (%) 2 8,22 25 22,82 50 34,51 75 41,85 100 50,05 *n.d. - nem detektált

c (µg/mL)

RSD (%) 123,18 58,24 38,04 38,07 31,11

fehérje kicsapás metanollal átlagos visszanyerés (%) 97,05 98,21 99,70 100,37 99,46

RSD (%) 4,39 3,37 1,2 1,32 1,43

SPE Oasis HLB oszlopon átlagos visszanyerés (%) n.d.* 13,36 14,25 21,54 3,52

RSD (%) 4,30 7,52 8,06 3,77

Az általam vizsgált Oasis HLB és Oasis MAX oszlopok közül az utóbbi nem kötötte meg a levetiracetamot, így nem végeztem vele további kísérleteket. Oasis HLB oszlopon a visszanyerés 3 és 22% között mozgott a különböző koncentrációk esetén, a relatív standard szórás (RSD%) minden esetben 10 % alatt volt. Folyadék-folyadék extrakciónál a visszanyerés erősen függött a koncentrációtól, az átlagos visszanyerés 8 és 50 % között mozgott 31 és 123% közötti relatív standard szórással. Ha acetonitrilt alkalmaztunk fehérje kicsapásra a folyadékkromatográfiás módszer nem volt szelektív. Metanol esetén azonban nem tapasztaltunk interferenciát, a visszanyerés is megfelelő volt (97-100,4%) és az RSD% minden koncentráció esetén 5% alatt maradt. Elmondható, hogy a három minta-előkészítési módszer közül a szilárd fázisú extrakció a legbonyolultabb és legidőigényesebb amellett, hogy nem ad megfelelő eredményt. A folyadék-folyadék extrakció esetén ugyan nem tapasztaltunk interferenciát, viszont a visszanyerés erősen függött a koncentrációtól. A legegyszerűbb a metanollal történő fehérje kicsapás volt, ahol magas visszanyerés értékeket kaptunk és a reprodukálhatóság is megfelelő volt. A továbbiakban a szérum minták előkészítéséhez ezt alkalmaztuk. A kimutatási határ és meghatározási határ kiméréséhez levetiracetammal szpájkolt vérszérum oldatokat használtam. A kimutatási határt (LOD) a jel/zaj 3:1, a meghatározási határt (LOQ) a jel/zaj 10:1 értékénél adtam meg. Ennek megfelelően az LOD 10 ng/ml-nek, az LOQ 33 ng/ml-nek adódott. A kalibrációs egyenest 2 és 80 µg/ml koncentráció tartományban öt koncentráció pontban szpájkolt vak szérum mintával, három ismétléssel határoztam meg. Az egyenes mért pontokra történő illeszkedésének jóságát Statistica szoftverrel értékeltem. Az egyenes egyenlete: 9765,514 x, illeszkedés jósága megfelelő volt (R 2 0,9997, Lack of fit teszt alapján p=0,17). Követelmény: R2 ≥0,99. A kalibrációs egyenes a 16. ábrán látható.

63

16. ábra: Levetiracetam kalibrációs egyenese, tartomány 2 – 80 µg/ml. Az egyenes egyenlete: y = 9765,514 x, az R2 értéke 0,9997, a Lack of fit teszt p értéke 0,17. A rendszer robusztusságának megállapításához 2 3 típusú kísérleti tervet állítottam fel, ahol a kolonna hőmérsékletét ±1°C-al, a mozgófázis szerves oldószer tartalmát ±1%-al, a mozgófázisban lévő puffer pH-ját ±0,5 egységgel változtattam. Az eredmények statisztikai kiértékeléséhez itt is a Statistica szoftvert használtam. Pareto diagramon (17. ábra) mutatom be a vizsgált paraméterek, valamint ezek kölcsönhatásának hatását a retenciós időre.

17. ábra: Pareto diagram, a kolonna hőmérséklet, a mozgófázis acetoniril tartalmának és a foszfát puffer pH-jának, valamint ezen paraméterek kölcsönhatásának retenciós időre gyakorolt hatásának vizsgálata. A Pareto diagram jól szemlélteti, hogy az általam vizsgált paraméterek közül, csak a mozgófázis acetonitril tartalmának van szignifikáns hatása, amit a statisztikai értékelés

64

számszerű eredménye p=0,004 is alátámaszt. A p érték azt mutatja meg, hogy mekkora annak a valószínűsége, hogy az adott paramétert akkor is szignifikánsnak találnánk, ha a retenciós időre gyakorolt hatás csak a véletlen ingadozásoknak lenne köszönhető. A vizsgált paraméterek közül azt tekintjük szignifikánsnak, amelyik p értéke 0,05 alatt van. Ezek alapján elmondható, hogy az általam fejlesztett módszer robusztus a hőmérséklet (± 1°C), a pH (± 0,5) kismértékű változásaival szemben, viszont a mozgófázis acetonitril tartalmát szoros ellenőrzés alatt kell tartani. A pH robusztusság a lgD-pH diagram (12. ábra) alapján várható volt. 3.3.2.7. Levetiracetam terápiás gyógyszerszint monitorozása (TDM) Az általam fejlesztett minta-előkészítési és nagyhatékonyságú folyadékkromatográfiás módszert az Országos Idegtudományi Intézetben levetiracetammal kezelt epilepsziában szenvedő betegek terápiás gyógyszer vérszint monitorozására gyakorlatban is alkalmazzák. Öt betegtől vett vérminta elemzésével összehasonlítottuk a nagyhatékonyságú és ultra – nagyhatékonyságú elválasztás eredményeit. A nagyhatékonyságú elválasztást ketten (Bacsói Gyöngyi és én), két különböző laboratóriumban (Országos Idegtudományi Intézet, BME HPLC laboratórium) párhuzamosan végeztük. Az UHPLC-s mérést ugyanakkor én végeztem. Az eredmények a 11. táblázatban láthatóak. 11. táblázat: Betegek terápiás gyógyszer vérszint ellenőrzéséből (TDM) származó eredmények. másik az utolsó analitikus/ HPLC UPLC gyógyszer beteg másik HPLC mg/nap (µg/ml) (µg/ml) bevételétől készülék eltelt idő (óra) (µg/ml) 1.

24,18

24,35

22,8

1500

6

2.

<0,959

<0,033

< 0,959

1000

bevétel előtt

3.

23,73

23,56

21,2

2500

5.45

4.

20,56

20,11

19,5

1000

3

5.

19,38

19,75

15,9

1500

3

A betegek terápiás monitorozása során UHPLC és HPLC rendszerrel kapott egy-egy kromatogramot a 18. ábrán mutatom be.

65

18. ábra: Betegek terápiás monitorozása során A) Waters Aquity UPLC készülékkel B) Merck Hitachi LaChrom HPLC készülék kapott kromatogramok. Kromatográfiás körülmények: 3.3.2.4. fejezet. A farmakokinetikai eredmények alapján a legmagasabb koncentráció a vérben a gyógyszer bevételét követő 1-2 órában érhető el, 6-8 óra alatt megfeleződik a koncentráció, majd 10-12 óra után a kimutatási határ alá csökken az értéke [135, 136]. A terápiás gyógyszer vérszint ellenőrzés (therapeutic drug monitoring, TDM) a felezési idő körül mérve (6-8 óra elteltével) ad megbízható eredményt a kezelés szempontjából. Az általunk vizsgált öt betegből négynél ebben az időintervallumban történt a vizsgálat, míg a 2. betegnél vérben mért levetiracetam koncentráció a kimutatási határ alatt volt, ami annak következménye, hogy az előző gyógyszer bevételétől 10-12 óra telt el. 3.3.2.8. Eredmények, következtetések Munkám során nagyhatékonyságú folyadékkromatográfiás módszert fejlesztettem levetiracetam vérszérumból történő meghatározására. A HPLC-s módszert sikeresen átvittem UHPLC rendszerre. Nagytérfogatú injektálást alkalmazva csökkentettem a módszer kimutatási határát. 20 µl-es injektált térfogatot alkalmazva átléptük a lineáris kromatográfia határait a cél megvalósítása érdekében. Gyakorlatban bizonyítottuk, hogy a nem-lineáris tartományban is lehet analitikai feladatot megoldani. Az általam fejlesztett UPLC-PDA módszert összevetve az irodalomban található UPLCMS-MS módszerrel, elmondható hogy a nagyobb injektált térfogatnak és a minta-előkészítés során alkalmazott kisebb hígulásnak köszönhetően az általam fejlesztett módszer tizenötször kisebb kimutatási határral bír, mint az UPLC-MS-MS módszer (Irodalmi rész 2.5.1. fejezet 3. táblázat). Az Országos Idegtudományi Intézetben eddig a vérszérum mintákat Extreluton történő folyadék-folyadék extrakciós eljárással készítették elő. Mérésekkel bizonyítottam, hogy ez a minta-előkészítési módszer nem alkalmas levetiracetam meghatározására vérszérumból, ezért a minta-előkészítési módszert is optimáltam. Együttműködésünk eredményeként az általam javasolt metanolos fehérjekicsapásos mintaelőkészítést, valamint HPLC-s módszert alkalmazzák betegek terápiás monitorozására. Az eredmények alapján elmondható, hogy az általam fejlesztett HPLC-s és UPLC-s módszer alkalmas a betegek véréből történő levetiracetam terápiás monitorozására.

66

3.3.3. Ultra – nagyhatékonyságú töltetek gyakorlati alkalmazhatósága II.: Nagytérfogatú injektálás lehetőségei ultra – nagyhatékonyságú folyadékkromatográfiában Az ún. 10%-os szabály értelmében az injektált térfogat maximálisan addig növelhető, míg a kolonna hatékonysága el nem éri a 10 %-os csökkenést. Az eddigi példákban a nagytérfogatú injektálás nagyhatékonyságú és ultra – nagyhatékonyságú rendszerben történő alkalmazhatóságára mutattam be példákat. Szerin enantiomerek patkányagyból történő HPLC-s meghatározása esetén a nagyobb injektált térfogat (200 µl) alkalmazásával az oszlop hatékonysága nem csökkent. Levetiracetam UHPLC-s mérése esetén az elemzési cél elérése érdekében megnövelve az oszlopra felvitt minta térfogatát a nagyobb mértékű hatékonyság romlást is el kellett fogadni. Ebben a fejezetben azt vizsgálom meg, hogy hogyan érhető el az elemzési cél a 10 %-os szabály betartásával az UHPLC méréseknél. A kísérleteim során vizsgáltam a különböző hosszúságú (5, 10 és 15 cm) héjszerkezetű Kinetex C18 oszlopok térfogati terhelhetőségét izokratikus, pulzus gradiens és gradiens körülmények között. Méréseimhez Flexar UHPLC rendszert alkalmaztam. Pulzus gradiens esetén kimértem a pulzus időtartamának hatását a kolonna hatékonyságára. A kísérletekhez szerin enantiomereket használtam Marfey származékképzővel történő származékolás után. A továbbiakban az L-szerinből képződő származékra L,L*-származékként, a D-szerinből képződő származékra D,L*-származékként hivatkozom. 3.3.3.1. Folyadékkromatográfiás körülmények

A térfogati terhelhetőség vizsgálatához az injektált térfogatot 5, 10, 20, 30, 40 és 50 µl-re állítottam és minden mérési pontot háromszor ismételtem. A kolonnát 30°C-ra termosztáltam, a detektálási hullámhossz 340 nm, a térfogatáramlási sebesség 1 ml/perc volt. A mintákat minden esetben a gyengébb eluenserősségű, mozgófázisban oldottam. A szerin enantiomerek koncentrációja µmol/l koncentráció tartományba esett. Izokratikus méréseknél a mozgófázis acetonitril : trietil-ammónium-acetát (TEAAC) puffer (pH=4, 3 g/l) 20:80 arányú keveréke volt. Pulzus gradiensnél az „A” mozgófázis megegyezik az izokratikus méréseknél alkalmazottal, a „B” mozgófázis víz volt. A minta injektálása után a 19. ábrán látható pulzus gradienst követtem. A pulzus idő hatásának vizsgálata során az injektált térfogat 5 µl volt, míg a pulzus időt 0,10; 0,20; 0,30; 0,50 és 1 percre állítottam be.

19. ábra: Pulzus gradiens.

67

Gradiens elúciónál az „A” mozgófázis acetonitril: trietil-ammónium-acetát (TEAAC) puffer (pH=4, 3g/l) 10:90 arányú keveréke, a „B” mozgófázis 100% acetonitril volt. A különböző hosszúságú oszlopokon lefuttatott gradiens profilokat a 12. táblázat tartalmazza. 12. táblázat: Az 5, 10 és 15 cm hosszúságú Kinetex oszlopokon alkalmazott lineáris gradiens profilok. Oszlophossz

t (perc)

A%

B%

5 cm

0

100

0

1,8

20

80

0

100

0

3,6

60

40

0

100

0

5,7

65

35

10 cm

15 cm

A gyümölcslevek aminosav enantiomer tartalmának meghatározásához a gradiens elúciónál leírt mozgófázisokat alkalmaztam. Az elválasztás 150-4,6 mm, 2,6 µm szemcseátmérőjű Kinetex C18 állófázison történt, mozgófázis A: 10:90 acetonitril:TEAAc puffer (pH=4; 3g/l), mozgófázis B: acetonitril volt. A térfogatáramlási sebesség 1 ml/perc volt, a kolonnát 30°C-on termosztáltam. Az injektált térfogat 50 µl volt, A detektálási hullámhossz: 340 nm volt. A gradiens 0% B mozgófázisról 25 % B mozgófázis összetételig lineárisan futott 30 perc alatt. 3.3.3.2. Származékképzési reakció Marfey reagenssel A kísérletsorozatban Marfey származékképzővel történő származékolást (20. ábra) követően szerin enantiomereket vizsgáltam. A továbbiakban az L-szerinből képződött származékra L,L* - származékként, míg a Dszerinből képződőre D,L* - származékként hivatkozom.

20. ábra: Szerin enantiomerek származékképzési reakciója Marfey reagenssel 1 mg aminosavat feloldottam 5 ml 0,5 M-os NaHCO3 oldatban. Az így kapott oldat 100 μl-éhez megfelelő mennyiségű (aminosav: Marfey 1:1,4) 1% Marfey acetonos oldatát adtam. Egy órán át 40°C-on termosztáltam. A reakció leállítására az elegyhez 25 μl 2 M-os

68

sósavat adtam. A mintákat mozgófázissal higítottam,majd az így kapott oldatokat 0,22 μm-es szűrőn szűrtem. 3.3.3.3. Az oszlopok térfogati terhelhetősége izokratikus elválasztás esetén

A különböző hosszúságú oszlopok hatékonyságának könnyebb összehasonlíthatósága érdekében az oszlopokra kapott elméleti tányérszámokat a kolonna hosszára normáltam. Az injektált térfogat hatását a 13. táblázat tartalmazza. 13. táblázat: Az injektált térfogat hatása a kolonna hatékonyságára izokratikus körülmények között. Állófázisok: Kinetex C18 (50 – 4,6 mm, 2,6 µm; 100 – 4,6 mm, 2,6 µm és 150 – 4,6 mm, 2,6 µm), mozgófázis: 20:80 acetonitril:trietil-ammónium-acetát (TEAAC) puffer (pH=4, 3g/l), térfogatáramlási sebesség: 1 ml/perc, kolonna hőmérséklet: 30°C, injektált térfogatok: 5, 10, 20, 30, 40 és 50 µl, detektálási hullámhossz: 340 nm. kolonna 5 cm 10 cm 15 cm hossza N (1/m) N (1/m) N (1/m) L,L*-

D,L*-

L,L*-

D,L*-

L,L*-

D,L*-

165327 156987 125653 100940 98907 69080

170793 164120 137573 119927 115380 91900

203350 203060 184210 196873 194714 191940

208243 207107 192270 202540 200639 198330

194442 188878 163882 147487 137636 116593

191538 192820 170173 156300 148938 132373

V injektált (μl) származék származék származék származék származék származék 5 10 20 30 40 50

A legkisebb elméleti tányérszámot az 5 cm-es oszlop adta, a 10 és 15 cm-es oszloppal kapott eredmények közötti, nem szignifikáns különbség a kolonnák töltési jóságának különbségével magyarázható. 75 65 55 45 35 25 15

5 -5 0

1

2

3

4

21. ábra: Az injektált térfogat hatás a kolonna hatékonyságára. Kromatográfiás körülmények: mint 10. táblázat

69

Az injektált térfogat növelésével minden esetben csökkent az elméleti tányérszám, a csúcsok szélesedtek és aszimmetrikusak lettek (21. ábra). A gyakorlati tapasztalat alapján az injektált térfogat addig növelhető, míg a hatékonyságvesztés nem haladja meg a 10 %-ot. Ezt a szabályt alkalmazva 5 cm és 15 cm-es oszlopok esetén legfeljebb 10 µl-t, míg 10 cm-es oszlop estén maximum 20 µl-t injektálhatunk az adott oszlopra.

3.3.3.4. Az oszlopok térfogati terhelhetősége pulzus gradiens alkalmazása esetén

Pulzus gradiensnél először a pulzus idő hatását vizsgáltam az oszlopok hatékonyságára. A kísérletek elvégzése során számtalan általunk nem befolyásolható tényező játszik szerepet. Folyadékkromatográfiában ilyen például a mozgófázis elkészítéséhez alkalmazott oldószerek tisztasága, a minta-előkészítés jósága, a detektorjel időbeli változása stb. Ahhoz, hogy ezeket a hatásokat kiszűrjük és a kísérleti hibákat függetlenné tegyük a kísérleteket randomizálva végezzük el. Ez az általam vizsgált esetben azt jelentette volna, hogy az oszlopokon a különböző pulzus idő kísérleteket random sorrendben hajtom végre, ami nagyon sok időt igényelt volna és az állandó oszlopszereléssel újabb hibát vihettem volna be. Ehelyett kísérleteimet split-plot terv alapján végeztem, ami azt jelenti, hogy egy adott oszlopon végigmértem az összes pulzus időt, majd áttértem a következő oszlopra, minden pontot háromszor ismételve. A kapott statisztikai eredményeket a 22. ábrán szemléltetem.

22. ábra: A látszólagos elméleti tányérszám alakulása a kolonnahossz és a pulzusidő függvényében. Kromatográfiás körülmények, mint 10. táblázat, kivéve mozgófázis B: víz, injektált térfogat: 5 µl. A pulzus idő rendre: 0; 0,1; 0,2; 0,3; 0,5 és 1 perc. A 22. ábra bal oldalán az 5, középen a 10, jobbra pedig a 15 cm-es oszlopokra kapott látszólagos elméleti tányérszámokat ábrázoltam a Statistica szoftver segítségével. A ser: 1 az időben korábban eluálódó L-szerinből származó diasztereomert, a ser: 2 a nagyobb retenciós idejű D-szerinből képződött diasztereomert jelöli. Az ábra jobb oldalán szereplő jelmagyarázatban a water 0 - water 10 jelöli a 0 - 1 perces pulzus időket.

70

Növelve az oszlop hosszát csökken a pulzus idő hatása (egyre kisebb lesz a távolság a kék és szürke vonalak között), viszont még a 15 cm-es oszlop esetén is szignifikáns marad a hatás (F érték: 317,44, p érték: 0,000000). A pulzus gradiensnek ellentétes hatása van az enantiomerek látszólagos elméleti tányérszámára (N’) az 5 illetve 10 és 15 cm-es oszlopok esetén. A legrövidebb oszlopnál nagyobb N’ értéket mértem a nagyobb retenciós idejű D-szerin származékra, míg a hosszabb oszlopok L-szerin származékra adtak nagyobb N’ értékeket (14. táblázat). 14. táblázat: A pulzus idő hatása a kolonna hatékonyságára a különböző hosszúságú oszlopok esetén. Kromatográfiás körülmények, mint 18. ábrán. kolonna hossza pulzus idő (perc) 0,0 0,1 0,2 0,3 0,5 1,0

5 cm

10 cm

15 cm

N (1/m) L,L*D,L*származék származék 182360 196467 170900 258560 231140 357080 283553 395253 360327 479627 575447 703560

N (1/m) L,L*D,L*származék származék 253300 255213 286993 280100 361753 336883 391883 367660 465623 414530 606000 532000

N (1/m) L,L*D,L*származék származék 198502 192236 221898 209178 280220 253522 302267 269631 346769 302747 436884 381331

Növelve a pulzusidőt, nő a látszólagos elméleti tányérszám. A legmagasabb értékek minden esetben az egy perces pulzusidő alkalmazásával voltak elérhetőek. Az 5 cm hosszú oszlop esetén körülbelül háromszoros, a 10 és 15 cm-es oszlopok esetén kétszeres hatékonyság javulás volt elérhető az egy perces pulzus idővel az izokratikus elválasztáshoz képest. Az injektált térfogat hatásának vizsgálatához ezért egy perces pulzus időt alkalmaztam. A pulzus gradiens alkalmazása befolyással volt a komponensek retenciós idejére. A vizes fókuszálás időtartamával (pulzus idő) nőtt meg a komponensek retenciós ideje is, ezt a 23. ábra szemlélteti.

9 7 5 3 1 -1 0

1

2

3

4

23. ábra: A pulzus idő hatása a komponensek retenciós idejére. Kromatográfiás paraméterek, mint 13. táblázat. 1.) pulzus idő: 0 perc (fekete kromatogram), 2.) pulzus idő 1 perc (kék kromatogram).

71

Az injektált térfogat növelésével ugyanúgy, mint az izokratikus elválasztás során csökkent az oszlopok hatékonysága (15. táblázat). 15. táblázat: Az injektált térfogat hatása a kolonna hatékonyságára pulzus gradiens elúció esetén. Kromatográfiás körülmények, mint a 18. ábrán, kivéve injektált térfogatok: 5, 10, 20, 30, 40 és 50 µl, pulzus idő: 1 perc. kolonna hossza V injektált (μl) 5 10 20 30 40 50

5 cm

10 cm

15 cm

N’ (1/m)

N’ (1/m)

N’ (1/m)

L,L*származék 575447 516993 416753 319007 280627 244120

D,L*származék 703560 657733 538627 428487 383007 328120

L,L*származék 606000 536763 412153 321100 274155 214620

D,L*származék 532000 489210 405927 337227 299000 242197

L,L*származék 436884 426047 366707 322764 300187 254778

D,L*származék 381331 362127 323378 292856 276004 238873

Ha figyelembe vesszük az elméleti tányérszám csökkenésére vonatkozó 10%-os szabályt, látható, hogy az injektált térfogat ebben az esetben sem haladhatja meg a 10 µl-t.

3.3.3.5. Az oszlopok térfogati terhelhetősége gradiens alkalmazása esetén

A különböző hosszúságú oszlopok hatékonyságának gradiens elúciós körülmények között történő összehasonlításának két módja lehetséges: i) a gradiens meredekség állandó értéken tartása, ii) a látszólagos visszatartási tényező állandó értéken tartása. Az első lehetőség, hogy a gradienst az oszlop hosszának megfelelően átszámolva ugyanazt a gradiens meredekséget alkalmazzuk a különböző hosszúságú oszlopok esetén. Ebben az esetben a látszólagos visszatartási tényező (k’) oszlophossztól függően változik. A második lehetőség, hogy a k’ értéket állandó értéken tartjuk, ebben az esetben azonban a gradiens meredeksége oszlopról oszlopra változik. A kísérleteim során ez utóbbit alkalmaztam és a látszólagos visszatartási tényezőt 2,1 illetve 2,2-es értéken tartottam az L- ill. D-szerin származékok esetén.

72

16. táblázat: Az injektált térfogat hatása a kolonna hatékonyságára gradiens elúció során. Állófázisok: Kinetex C18 (50-4,6 mm, 2,6 µm, 100-4,6 mm, 2,6 µm, 150-4,6 mm, 2,6 µm), mozgófázis A: 10:80 ACN : TEAAc (3 g/l, pH=4), mozgófázis B: ACN, kolonna hőmérséklet: 30°C, detektálási hullámhossz: 340 nm. Gradiens profil: kísérleti rész 3.3.3.1. fejezet 12. táblázat. kolonna hossza

V injektált (μl) 5 10 20 30 40 50

5 cm N’ (1/m) L,L*származék 2374347 2414980 2458007 2401493 2434660 2441413

D,L*származék 2547813 2502307 2527667 2502173 2490627 2570813

10 cm N’ (1/m) L,L*származék 1824737 1791333 1743720 1769163 1717567 1743483

D,L*származék 2004100 2006447 2003687 1970100 2019020 1997602

15 cm N’ (1/m) L,L*származék 1340764 1349204 1358278 1350831 1347604 1325538

D,L*származék 1497067 1529418 1517013 1533909 1552276 1499620

Az injektált térfogat növelésével gradiens elúció során nem volt hatékonyság csökkenés tapasztalható (13. táblázat). Az oszlop hosszának növekedésével csökkent a látszólagos elméleti tányérszám, ami a különböző gradiens meredekségeknek volt köszönhető. Az általam vizsgált három módszer közül izokratikus elúció esetén az elméleti tányérszám csökkenés, már 10 µl-es injektálás esetén is meghaladta a 10%-os határt. Pulzus gradiens alkalmazásával növelhető volt a N’ értéke, azonban az injektált térfogat növelésével itt is túlléptük az elfogadható hatékonyság csökkenést. Gradiens elúció esetén azonban a készülék által adagolható maximális térfogatot (50 µl) injektálva az oszlopokra a látszólagos elméleti tányérszám nem változott.

3.3.3.6. Gyümölcslevek vizsgálata A gyümölcslevek ízét, illatát a bennük lévő aminosavak minősége, mennyisége és az enantiomerek aránya is befolyásolja. Gránátalmalé és ananászlé L,D-alanin (Ala), L,D-aszparagin (Asn), L,D-glutamin (Gln) és L,D-szerin (Ser) tartalmának meghatározásához a 3.3.3.1. fejezetben leírt körülményeket alkalmaztam. A módszer pontosságát (intermediate precision), kimutatási határát, mennyiségi meghatározási határát, valamint linearitását vizsgáltam. A pontosságot 3 különböző koncentrációjú aminosav enantiomer oldattal, három különböző alkalommal vizsgáltam. A csúcsterületekre kapott relatív standard szórás minden esetben 5% alatt volt. A kimutatási határ és meghatározási határ kiméréséhez különböző koncentrációjú aminosav enantiomer oldatokat használtam. A kimutatási határt (LOD) a jel/zaj 3:1, a meghatározási határt (LOQ) a jel/zaj 10:1 értéknél adtam meg. Az LOD, LOQ, valamint linearitási adatokat a 17. táblázatban foglaltam össze. A linearitás adatok kiértékelése a Statistica szoftverrel történt.

73

17. táblázat: Aminosav enantiomerek kimutatási és mennyiségi meghatározási határai valamint a linearitás vizsgálatánál kapott regressziós egyenesek adatai. Állófázis: Kinetex C18 (150 – 4,6 mm, 2,6 µm), mozgófázis A: 10:90 ACN:TEAAc (3 g/l, pH=4), mozgófázis B: ACN, térfogatáramlási sebesség: 1 ml/perc, kolonna hőmérséklet: 30°C. Injektált térfogat: 50 µl, gradiens profil 100 % A-ról 25 % B-re, 30 perc alatt. aminosav

retenciós idő (min)

L-Ser L-Asn D-Ser L-Gln L-Ala D-Asn D-Gln D-Ala

9.998 11.388 12.347 12.606 14.089 14.380 16.255 19.338

lineáris regresszió adatai regressziós R2 egyenes y=4.8111*1010 x 0.9978 y=1.2345*1010 x 0.9967 y=4.6604*109 x 0.9982 y=4.8387*109 x 0.9987 y=3.6848*109 x 0.9952 y=8.5839*109 x 0.9995 y=4.8067*109 x 0.9971 y=5.6753*109 x 0.9995

LOD (nmol/l)

LOQ (nmol/l)

0.15 0.15 0.36 0.34 1.21 0.16 0.25 0.26

0.51 0.49 1.19 1.12 4.02 0.52 0.83 0.87

A kapott eredmények alapján elmondható, hogy a kimutatási és mennyiségi meghatározási határ minden esetben nmol/l tartományba esett. A regresszióra kapott R2 érték minden esetben teljesíti a R2≥0,99 feltételt. A gyümölcsleveket megvizsgálva az ananászlében D-aszparagint és D-alanint; a gránátalmalében D-szerint és D-glutamint detektáltam, amellett hogy a gyümölcslevekben mindegyik aminosav L-enantiomerje is előfordult. Az eredményeket a 15. táblázat foglalja össze. A gránátalmalére és ananászlére jellemző kromatogramot a 20. ábrán mutatom be. 18. táblázat: Ananászlé és gránátlmalé aminosav enantiomer tartalma. Kromatográfiás körülmények, mint a 14. táblázatnál. ananászlé gránátalmalé D-AA L-AA D-AA aminosav L-AA (AA) µmol/l µmol/l µmol/l µmol/l szerin 90 n.d. 5.9 2.3 aszparagin 72.3 1.7 11.9 n.d. glutamin 87.6 n.d. 8.9 4.3 alanin 116.9 4 18.9 n.d.

74

24. ábra: A) standard oldat, B) ananászlé jellemző kromatogramja, C) gránátalmalé jellemző kromatogramja. Kromatográfiás körülmények, mint a 17. táblázatban.

75

3.3.3.7. Eredmények, következtetések

Méréseimmel bizonyítottam, hogy a héjszerkezetű töltetek (Kinetex C18) térfogati terhelhetősége izokratikus körülmények között kicsi. Pulzus gradienst alkalmazva ez a terhelhetőség kismértékben növelhető, de ebben az esetben sem adagolható a készülék által biztosított maximális injektálási térfogat (Flexar UHPLC esetén 50 µl). Kihasználva a gradiens elúció nyújtotta csúcs kompressziós hatást az injektált térfogat tízszeresére volt növelhető anélkül, hogy a kolonna hatékonysága csökkent volna, ennek köszönhetően gyümölcslevekből aminosav enantiomereket nmol/l kimutatási határral sikerült meghatároznom. Munkám során bizonyítottam, hogy a pulzus gradiensnél a pulzus idejének szignifikáns hatása van a látszólagos elméleti tányérszámra. Növelve a pulzus idejét növekvő hatékonyságot sikerült elérni mindhárom (50, 100, 150 mm) oszlophossz esetén, növelve az oszlop hosszát a hatékonyság növelő hatás ugyan csökkent, de végig szignifikáns maradt. A pulzus gradiens vizsgálatánál, az 50 mm-es oszlopnál az időben korábban eluálódó csúcsra nagyobb, míg a másik két oszlop esetén kisebb látszólagos elméleti tányérszámot kaptam.

76

4. Összefoglaló Doktori munkám során vizsgáltam a nagyhatékonyságú és ultra–nagyhatékonyságú töltetek elméleti és gyakorlati alkalmazhatóságát. Az irodalmi részben összefoglaltam a napjainkban alkalmazott ultra–nagyhatékonyságú elválasztások lehetőségeit, a különböző ultra–nagyhatékonyságú töltetekre, a közelmúltban közölt hatékonysági adatokat. A töltetek elméleti alkalmazhatóságának vizsgálata során a különböző morfológiájú állófázisok (2 µm alatti szemcseátmérőjű teljesen porózus, 3 és 2 µm alatti szemcseátmérőjű héjszerkezetű, valamint monolit oszlopok) hatékonyságát kinetikus görbék segítségével hasonlítottam össze. Dolgozatomban több példát mutattam be nagyhatékonyság és ultra– nagyhatékonyságú töltetek gyakorlati alkalmazására, nagy hangsúlyt fektetve a nagytérfogatú injektálás lehetőségére ezen technikák esetén. Az általános kromatográfiás gyakorlatban lineáris izotermát alkalmazunk, ami azt jelenti, hogy egyenes arány van a kolonnára felvitt és az állófázis felületén szorbeálódott minta koncentrációja között. Azonban vannak olyan esetek, amikor az elemzési cél elérése érdekében (alacsonyabb kimutatási határ elérése, nyomelem analízis, preparatív kromatográfia) túl kell terhelni az oszlopot. Annak érdekében, hogy túlterhelés mellett se csökkenjen 10 %-nál nagyobb mértékben a kolonna hatékonysága különböző fókuszálási technikákat lehet/kell alkalmazni. A nagyhatékonyságú és ultra–nagyhatékonyságú töltetek eltérő paramétereinek köszönhetően a térfogati terhelhetőségük is nagymértékben különbözik. Munkám során nagyhatékonyságú folyadékkromatográfiás módszert fejlesztettem ki szerin enantiomerek patkányagyból történő meghatározására. A módszer fejlesztése során optimáltam a származékképzés körülményeit (származékképző mennyisége, minta pH-ja), meghatároztam a képzett származék stabilitását. A megfelelő kimutatási (LOD) és mennyiségi meghatározási határ (LOQ) elérése érdekében megvizsgáltam az injektált térfogat hatását a kolonna hatékonyságára. Az oldószer megfelelő megválasztásával nagytérfogatú injektálást (200 µl) alkalmazva, hatékonyságvesztés nélkül nmol/l szintre csökkentettem az LOD és LOQ értékét. A második gyakorlati példában levetiracetam vérszérumból történő terápiás monitorozására alkalmas nagyhatékonyságú és ultra–nagyhatékonyságú módszer fejlesztését és validálását mutattam be. Az állófázis kiválasztása után optimáltam a minta-előkészítési módszert és az így kapott nagyhatékonyságú folyadékkromatográfiás módszert átvittem ultra– nagyhatékonyságú rendszerre. Ultra – nagyhatékonyságú elválasztás esetén az injektált térfogat növelésével jelentős hatékonyságvesztés volt megfigyelhető, ami az elemzési cél elérése érdekében, a retenciós idők állandó értéken tartása mellett elfogadható volt. Dolgozatom utolsó részében megvizsgáltam a különböző csúcsfókuszálási lehetőségek alkalmazhatóságát, annak érdekében, hogy nagytérfogatú injektálás alkalmazása mellett a hatékonyságvesztés ne haladja meg a 10%-ot. Ehhez a kísérlethez kis térfogati terhelhetőségű, ultra – nagyhatékonyságot biztosító héjszerkezetű töltetet használtam. Az oldószer megfelelő megválasztása (izokratikus elválasztás), a pulzus gradiens és a gradiens elúciós technikák közül a legnagyobb csúcs kompressziós hatása a gradiens elúciónak volt. Pulzus gradiens esetén növelve a pulzus időt hatékonyság növekedés volt tapasztalható. Gradiens elúciót alkalmazva gyümölcslevekből aminosav enantiomereket nmol/l tartományba eső LOQ-val határoztam meg. Kísérleteim alapján elmondható, hogy a nagyhatékonyságú töltetek térfogati terhelhetősége nagyobb, mint az ultra – nagyhatékonyságú tölteteké (2 µm alatti szemcseátmérőjű teljesen porózus és 3 µm alatti szemcseátmérőjű héjszerkezetű tölteteké). Munkám során a 250-4,6 77

mm, 5 µm szemcseátmérőjű nagyhatékonyságú töltetre 200 µl-t adagolva sem volt hatékonyság vesztés, míg a 100-2,1 mm, 1,7 µm szemcseátmérőjű töltet esetén 20 µl-t adagolva jóval túlléptem az elfogadható 10%-os elméleti tányérszám csökkenést. Ahhoz, hogy ultra – nagyhatékonyságú töltetek esetén nagytérfogatú injektálást alkalmazva betarthassuk a 10%-os szabályt, a csúcsokat fókuszálni kell.

78

5. Tézispontok

1. A kinetikus görbék módszerével (N – t0/N2) bizonyítottam, hogy a 2,6 µm és 1,7 µm szemcseméretű héjszerkezetű töltetek közül, a kisebb szemcseátmérőjű héjszerkezetű állófázis gyorsabb elválasztást biztosít: alacsonyabb t0/N2 értéket ad a gyakorlatban alkalmazott 5 – 20 000 elméleti tányérszám tartományban, mint a 2,6 µm alatti szemcseátmérőjű héjszerkezetű oszlop. Kísérletileg igazoltam, hogy az általam vizsgált, kereskedelmi forgalomban kapható 5 cm hosszúságú, kis átmérőjű, különböző morfológiájú töltetek közül (2,6 és 1,7 µm héjszerkezetű, 1,7 µm-es teljesen porózus, monolit) a leghatékonyabb a 2 µm alatti szemcseátmérőjű héjszerkezetű oszlop 20 000-es elméleti tányérszámmal, míg a legkevésbé hatékony a monolit oszlop (N=5000). 2. Szerin enantiomerek meghatározásával származékképzést követően sokan foglalkoztak. Elsőként határoztam meg szerin enantiomerek ortoftáldialdehid – N-tercbutiloxikarbonil-L-cisztein származékképzővel keletkező diasztereomereinek stabilitását és elsőként bizonyítottam, hogy a közeg pH-jának hatása van a keletkező disztereomerek mennyiségére. 3. A nagytérfogatú adagolást sokan alkalmaztak különböző minták elemzésekor, de elsőként alkalmaztam nagytérfogatú injektálást szerin enantiomerek közvetett nagyhatékonyságú folyadékkromatográfiás meghatározására. A nagytérfogatú adagolásnak köszönhetően nmol/l koncentráció tartományba eső kimutatási és mennyiségi meghatározási határt értem el. 4. Nagyhatékonyságú folyadékkromatográfiás módszert fejlesztettem levetiracetam vérszérumból történő meghatározására, amit az Országos Idegtudományi Intézetben ma is alkalmaznak epilepsziában szenvedő betegek terápiás monitorozására. Több minta-előkészítési módszer paramétereit kimértem, s azt a következtetést vontam le, hogy az irodalomban használt szilárdfázisú extrakció helyett az egyszerű fehérje kicsapásos módszer, a nagytérfogatú adagolással együtt megfelelő kimutatást tesz lehetővé. A módszert sikeresen transzferáltam ultra-nagyhatékonyságú folyadékkromatográfiás rendszerre (UPLC). Az általam fejlesztett PDA detektálást alkalmazó UPLC módszer jobb kimutatási (LOD) és mennyiségi meghatározási határral (LOQ) rendelkezik, mint az irodalomban szereplő legalacsonyabb LOD, LOQ értékkel rendelkező LC-MS-MS módszer. 5. A szakirodalomban elsőnek vetettem össze a folyadékkromatográfiában alkalmazható különböző nagytérfogatú injektálásokat (oldószer megfelelő megválasztása, pulzus gradiens, gradiens elúció) amelynek során megállapítottam, hogy összetett biológiai mintáknál is alkalmazhatóak. Megállapítottam továbbá, hogy a különböző módszerek közül megfelelően megválasztott gradiens profil alkalmazásával érhető el a legnagyobb térfogatú adagolás csúcsszélesedés nélkül. 6. Először vizsgáltam a különböző hosszúságú (50, 100, 150 mm), héjszerkezetű Kinetex oszlopok (2,6 µm) térfogati terhelhetőségét. Kísérletileg bizonyítottam, hogy pulzus gradiens alkalmazásával nő a hatékonyság. Igazoltam, hogy a pulzusidőnek szignifikáns hatása van a látszólagos elméleti tányérszámra. Ez a hatás az oszlop

79

hosszának növelésével csökken. Igazoltam, hogy gradiens elúciót alkalmazva az injektált térfogat tízszeresére növelhető hatékonyságvesztés nélkül.

80

6. Publikációk Közlemények az értekezés témájában: 1. E. Oláh, Sz. Fekete, J. Fekete, K. Ganzler; Comparative study of new shell-type, sub-2 µm fully porous and monolith stationary phases, focusing on mass-transfer resistance J Chromatogr A 1217, (2010), 3642-3653 (IF: 4,194; idézettség: 72) 2. E.Oláh, R. Berky, J. Fekete; Analysis of the enantiomers of serine by reversed-phase high-performance liquid chromatography with OPA-Boc as pre-column derivatization agent. Critical evaluation of the analysis of D-serine in rat brain Acta Chromatogr 23, (2011), 59-68 (IF:0,760, idézettség:0) 3. E. Oláh, Gy. Bacsói, J. Feket, V. K. Sharma; Determination of ng/mL levetiracetam using ultra-high-performance liquid chromatography-photodiode absorbance J Chromatogr Sci 50, (2012), 253-258 (IF:0,884 (2011)) 4. E. Oláh, M. Tarnai, J. Fekete; Possibility of large volume injection and band focusing in UHPLC J Chromatogr Sci, 10.1093/chromsci/bms179 (IF: 0,884 (2011)) 5. Sz. Fekete, E. Oláh, J. Fekete; Fast liquid chromatography: The domination of coreshell and very fine particles J Chromatogr A 1228, (2012), 57-71 (IF:4,362 (elmúlt 5 év); idézettség:16) Előadások az értekezés témájában: 1. Oláh Erzsébet MKE Vegyészkonferencia (2008): A gyors folyadékkromatográfiás módszerek előnyei és hátrányai 2. Oláh Erzsébet; METT Elválasztástudományi Vándorgyűlés (2008):Szerin optikai izomerek elválasztása 3. Oláh Erzsébet; Oláh György Doktori Iskola konferenciája (2009): Szerin optikai izomerek elválasztása 4. Oláh Erzsébet; Elválasztástudományi Vándorgyűlés (2010): Szerin optikai izomerek elválasztása 5. Oláh Erzsébet, Berky Róbert, Dr. Fekete Jenő; MKE Fiatal Analitikusok előadóülése (2010): Szerin enantiomerek meghatározása orto-ftáldialdehid és N-tercbutiloxokarbonil-L-ciszteinnel történő származékképzés után folyadékkromatográfiával; A származékképzés kritikai értékelése 6. Varga-Oláh Erzsébet, Fekete Jenő; MKE Fiatal Analitikusok Előadóülése (2011): Nagy térfogatú adagolási lehetőségek ultra – nagyhatékonyságú folyadékkromatográfiában 7. Varga-Oláh Erzsébet, Tarnai Máté; METT Elválasztástudományi Vándorgyűlés (2012): Nagy térfogatú injektálás és csúcsfókuszálás lehetőségei ultra – nagyhatékonyságú folyadékkromatográfiában

81

Az értekezés témájához nem kapcsolódó publikációk Közlemények: 1. Cs. Hegyi, E. Oláh, J. Fekete, G. Szainik: Separation of cypermetrin diastereomers by normal phase liquid chromatography J Liq Chromatogr R T 29, (2006), 2835 - 2851 3. Dr. Fekete Jenő: A folyadékkromatográfia fejlesztési irányai Dr. Fekete Jenő, Oláh Erzsébet: pH mérés és hatása az elválasztásra Merck Kft. (2008) 4. J. Fekete, E. Oláh, F. Ritz: A pH szerepe a folyadékkromatográfiás elválasztásban Magyar Kémikusok Lapja 7-8, (2010), 237-241 5. A. Tóth, A. Törőcsik, E. Tombáncz, E. Oláh, M. Heggen, C. Li, E. Klumpp, E. Geissler, K. László: Interaction of phenol and dopamine with commercial MWCNTs J Colloid Interf Sci 15, (2011), 469-75 Poszterek 1. E. Oláh, K. Kiss, Sz. Fekete, J. Fekete, K. Ganzler, Balaton Szimpózium (2010): Application possibilities for fast chromatographic methods in UHPLC and HPLC systems 2. J. Orgoványi, E. Oláh, J. Horváth, M. Babják, HPLC 2011 konferencia (2011): Comparative study of different UHPLC systems by kinetic plot method

82

7. Irodalomjegyzék [1] J.J. van Deemter, F. J. Zuiderweg, A. Klinkenberg; Longitudinal diffusion and resistance to mass transfer as causes of nonideality in chromatography Chem Eng Sci 5, (1956), 271-289 [2] Cs. Horváth, S. R. Lipsky; Column Design in high pressure liquid chromatography J Chromatogr Sci 7, (1969), 109-116 [3] J. C. Giddings; Comparison of theoretical limit of separating speed in gas and liquid chromatography Anal Chem 37, (1965), 60-63 [4] H. Poppe; Some reflection on speed and efficiency of modern chromatographic methods J Chromatogr A 778, (1997), 3-21 [5] G. Desmet, D. Clicq, P. Gzil; Geometry-independent plate height representation methods for the direct comparison of the kinetic performance of LC supports with different size or morphology Anal Chem 77, (2005), 4058-4070 [6] K. Broeckhoven, D. Cabooter, F. Lynen, P. Sandra, G. Desmet; The kinetic plot method applied to the gradient chromatography: Theoretical framework and experimental validation J Chromatogr A 1217, (2010), 2787-2795 [7] A. Fanigliulo, D. Cabooter, G. Bellazzi, B. Allieri, A. Rottigni, G. Desmet; Kinetic performance of reversed-phase C18 high-performance liquid chromatography columns compared by means of the Kinetic Plot Method in pharmaceutically relevant applications J Chromatogr A 1218, (2011), 3351-3359 [8] K. J. Fountain, U. D. Neue, E. S. Grumbach, D. M. Diehl; Effects of extra-column band spreading, liquid chromatography system operating pressure, and column temperature on performance of sub-2-µm porous particles J Chromatogr A 1216, (2009), 5979-5988 [9] A. de Villiers, F. Lynen, P. Sandra; Effect of analyte properties on the kinetic performance of liquid chromatographic separations J Chromatogr A 1216, (2009), 3431-3442 [10] D. Cabooter, F. Lestremau, F. Lynen, P. Sandra, G. Desmet; Kinetic plot method as a tool to design coupled column systems producing 100 000 theoretical plates in the shortest possible time J Chromatogr A 1212, (2008), 23-34 [11] I. Halasz, R. Endele, J. Asshauer; Ultimate limits in high-pressure liquid chromatography J Chromatogr A 112, (1975), 37-60 [12] J. H. Knox, M. Saleem; Kinetic conditions for optimum speed and resolution in column chromatography J Chromatogr Sci 7, (1969), 614-622 [13] J.E. MacNair, K.C. Lewis, J.W. Jorgenson; Ultrahigh-pressure reversed-phase liquid chromatography in packed capillary columns Anal Chem 69, (1997), 983-989 [14] J. E. MacNair, K.D. Patel, J.W. Jorgenson; Ultrahigh-pressure reversed-phase capillary liquid chromatography: Isocratic and gradient elution using columns packed with 1.0-µm particles Anal Chem 71, (1999), 700-708 [15] L. Tolley, J. W. Jorgenson, M. A. Moseley; Very high pressure gradient LC/MS/MS Anal Chem 73, (2001), 2985-2991

83

[16] J. Wang, H. Li, C. Jin, Y. Qu, X. Xiao; Development and validation of a UPLC method for quality control of rhubarb-based medicine: fast simultaneous determination of five anthraquinone derivatives J Pharmaceut Biomed Anal 47, (2008), 765-770 [17] L. Nováková, L. Matysová, P. Solich; Advantages of application of UPLC in pharmaceutical analysis Talanta 68, (2006), 908-918 [18] Sz. Fekete, K. Ganzler, J. Fekete; Facts and myths about columns packed with sub-3 µm and sub-2 µm particles J Pharmaceut Biomed Anal 51, (2010), 56-64 [19] M. J. Wirth; Mass transport in sub-2µm high-performance liquid chromatography J Chromatogr A 1148, (2007), 128-130 [20] K. D. Patel, A. D. Jerkovich, J. C. Link, J. W. Jorgenson; In-depth characterization of slurry packed capillary columns with 1.0-µm nonporous particles using reversed-phase isocratic ultrahigh-pressure liquid chromatography Anal Chem 76, (2004), 5777-5786 [21] L. A. Colón, J. M. Cintrón, J. A. Anspach, A. M. Fermier, K. A. Swinney; Very high pressure HPLC with 1 mm id columns Analyst 129, (2004), 503-504 [22] M. Martin, G. Guiochon; Effects of high pressure in liquid chromatography J Chromatogr A 1090, (2005), 16-38 [23] F. Gritti, G. Guiochon; Influence of the pressure on the properties of chromatographic columns I. Measurement of the compressibility of methanol-water mixtures on a mesoporous silica adsorbent J Chromatogr A 1070, (2005), 1-12 [24] F. Gritti, M. Martin, G. Guiochon; Influence of the pressure on the properties of chromatographic columns. II. The column hold-up volume J Chromatogr A 1070, (2005), 1322 [25] F. Gritti, G. Guiochon; Influence of the pressure on the properties of chromatographic columns. III. Retention volume of thiourea, hold-up volume, and compressibility of the C18bonded layer J Chromatogr A 1075, (2005), 117-126 [26] Y. Zhang, X. Wang, P. Mukherjee, P. Petersson; Critical comparison of performances of superficially porous particles and sub-2 µm particles under optimized ultra-high pressure conditions J Chromatogr A 1216, (2009), 4597-4605 [27] K. J. Fountain, U. D. Neue, E. S. Grumbach, D. M. Diehl; Effects of extra-column band spreading, liquid chromatography system operating pressure, and column temperature on the performance of sub-2 µm porous particles J Chromatogr A 1216, (2009), 5979-5988 [28] D. T.-T. Nguyen; D. Guillarme; S. Rudaz; J.-L. Veuthey; Chromatographic behaviour and comparison of column packed with sub-2 µm stationary phases in liquid chromatography J Chromatogr A 1128, (2006), 105-113 [29] F. Gritti, G. Guiochon; Mass transfer resistance in narrow-bore columns packed with 1.7 µm particles in very high pressure liquid chromatography J Chromatogr A 1217, (2010), 5069-5083 [30] Cs. Horváth, B. A. Preiss, S. R. Lipsky; Fast liquid chromatography: An investigation of operating parameters and the separation of nucleotides on pellicular ion exchangers Anal Chem 39, (1967), 1422-1428 [31] J. J. Kirkland Controlled surface porosity supports for high-speed gas and liquid chromatography Anal Chem 41, (1969), 218-220

84

[32] Dr. Fekete Jenő A folyadékkromatográfia elmélete és gyakorlata 1. fejezet: A kromatográfiában használt alapösszefüggések és értelmezésük, 1-115, Edison House Kft. (2006) Budapest [33] F. Gritti, A. Cavazzini, N. Marchetti, G. Guiochon; Comparison between the efficiencies of columns packed with fully and partially porous C18-bonded silica materials J Chromatogr A 1157, (2007), 289-303 [34] Sz. Fekete, J. Fekete, K. Ganzler; Characterization of new types of stationary phases for fast liquid chromatographic applications J. Pharmaceut Biomed Anal 50, (2009), 703-709 [35] F. Gritti, I. Leonardis, D. Shock, P. Stevenson, A. Shalliker, G. Guiochon; Performance of columns packed with the new shell particles, Kinetex-C18 J Chromatogr A 1217, (2010), 1589-1603 [36] F. Gritti, G. Guiochon; Comparative study of the performance of columns packed with several new fine silica particles: Would the external roughness of the particles affect column properties? J Chromatogr A 1166, (2007), 30-46 [37] Sz. Fekete, K. Ganzler, J. Fekete; Efficiency of the new sub-2 µm core-shell (KinetexTM) column in practice, applied for small and large molecule separation J Pharmaceut Biomed Anal 54, (2011), 482-490 [38] F. Gritti, T. Farkas, J. Heng, G. Guiochon; On the relationship between band broadening and the particle-size distribution of the packing material in liquid chromatography: Theory and practice J Chromatogr A 1218, (2011) 8209-8221 [39] G. Guiochon, F. Gritti; Shell particles, trials, tribulations and triumphs J Chromatogr A 1218, (2011), 1915-1938 [40] F. Gritti, G. Guiochon; The mass transfer kinetics in columns packed with Halo-ES shell particles J Chromatogr A 1218, (2011), 907-921 [41] J. J. Kirkland, F. A. Truszkowski, C. H. Dilks, Jr. G. S. Engel Superficially porous silica microspheres for fast high-performance liquid chromatography of macromolecules J Chromatogr A 890, (2000), 3-13 [42] Sz. Fekete, R. Berky, J. Fekete, J.-L. Veuthey, D. Guillarme; Evaluation of a new wide pore core-shell material (AerisTM WIDEPORE) and comparison with other existing stationary phases for the analysis of intact proteins J Chromatogr A 1236, (2012), 177-188 [43] Sz. Fekete, R. Berky, J. Fekete, J.-L. Veuthey, D. Guillarme; Evaluation of recent very efficient wide-pore stationary phases for the reversed-phase separation of proteins J Chromatogr A 1252, (2012), 90-103 [44] B. M. Wagner, S. A. Schuster, B. E. Boyes, J. J. Kirkland; Superficially porous silica particles with wide pores for biomacromolecular separations J Chromatogr A 1264, (2012), 22-30 [45] J. J. Kirkland, S. A. Schuster, W. L. Johnson, B. E. Boyes; Fused-core particle technology in high-performance liquid chromatography: An Overview J Pharmaceut Anal http://dx.doi.org/10.1016/j.jpha.2013.02.005 [46] Sz. Fekete, J.-L. Veuthey, D. Guillarme; New trends in reversed-phase liquid chromatographic separations of therapeutic peptides and proteins: Theory and applications J Pharmaceut Biomed Anal 69, (2012), 9-27 [47] F. Gritti, G. Guiochon; Kinetic investigation of the relationship between the efficiency of columns and their diameter J Chromatogr A 1218, (2011), 1592-1602 85

[48] D. Cabooter, A. Fanigliulo, G. Bellazzi, B. Allieri, A. Rottigni, G. Desmet; Relationship between the particle size distribution of commercial fully porous and superficially porous high-performance liquid chromatography column packings and their chromatographic performance J Chromatogr A 1217, (2010), 7074-7081 [49] J. J. DeStefano, T. J. Langlois, J. J. Kirkland; Characteristics of Superficially-Porous silica particles for fast HPLC: Some performance comparisons with sub-2-µm particles J Chromatogr Sci 46, (2008), 254-260 [50] Sz. Fekete, J. Fekete, K. Ganzler; Shell and small particle; Evaluation of new column technology J Pharm Biomed Anal 49, (2009), 64-71 [51] E. Oláh, Sz. Fekete, J. Fekete, K. Ganzler; Comparative study of new shell-type, sub-2 µm fully porous and monolith stationary phases, focusing on mass-transfer resistance J Chromatogr A 1217, (2010), 3642-3653, [52] D. V. McCalley; Some practical comparisons of the efficiency and overloading behaviour of sub-2 µm porous and sub-3 µm shell particles in reversed-phase liquid chromatography J Chromatogr A 1218, (2011), 2887-2897, [53] J. O. Omamogho, J. D. Glennon; Comparison between the efficiencies of sub-2 µm C18 particles packed in narrow bore columns Anal Chem 83, (2011), 1547-1556 [54] Dr. Fekete Jenő: A folyadékkromatográfia fejlesztési irányai Merck Kft., Budapest (2008) 3. fejezet [55] N. Tanaka, H. Kobayashi, N. Ishizuka, H. Minakuchi, K. Nakanishi, K. Hosoya, T. Ikegami; Monolithic silica columns for high-efficiency chromatographic separations J Chromatogr A 965, (2002), 35-49 [56] N. Wu, J. Dempsey, P. M. Yehl, A. Dovletoglou, D. Ellison, J. Wyvratt; Practical aspects of fast HPLC separations for pharmaceutical process development using monolithic columns Anal Chim Acta 523, (2004) 149-156 [57] L. Nováková, L. Matysová, D. Solichová, M. A. Koupparis, P. Solich; Comparison of performance of C18 monolithic rod columns and conventional C18 particle-packed columns in liquid chromatographic determination of Estrogel and Ketoprofen gel J Chromatogr B 813, (2004), 191-197 [58] M. Cledara-Castro, A. Santos-Montes, R. Izquierdo-Hornillos; Comparison of the performance of conventional microparticulates and monolithic reversed-phase columns for liquid chromatography separation of eleven pollutant phenols J Chromatogr A 1087, (2005), 57-63 [59] K. S. Mriziq, J. A. Abia, Y. Lee, G. Guiochon; Structural radial heterogeneity of silicabased wide-bore monolithic column J Chromatogr A 1193, (2008), 97-103 [60] H. Minakuchi, K. Nakanishi, N. Soga, N. Ishizuka, N. Tanaka; Effect of domain size on the performance of octadecylsilylated continous porous silica columns in reversed-phase liquid chromatography J Chromatogr A 797, (1998), 121-131 [61] F. Gritti, G. Guiochon; Mass transfer kinetic mechanism in monolithic columns and application to the characterization of new research monolithic samples with different average pore size J Chromatogr A 1216, (2009), 4752-4767 [62] H. Minakuchi, K. Nakanishi, N. Soga, N. Ishizuka, N. Tanaka; Effect of skeleton size on the performance of octadecylsilylated continous porous silica columns in reversed-phase liquid chromatograpy J Chromatogr A 762, (1997), 135-146

86

[63] R. Skudas, B. A. Grimes, M. Thommes, K. K. Unger; Flow-through pore characteristics of monolithic silicas and their impact on column performance in high-performance liquid chromatogrphy J Chromatogr A 1216, (2009), 2625-2636 [64] K. Miyabe; Evaluation of chromatographic performance of various packing materials having different structural characteristics as stationary phase for fast high performance liquid chromatography by new moment equations J Chromatogr A 1183, (2008), 49-64 [65] S. Eeltink, P. Gzil, W. Th. Kok, P. J. Schoenmakers, G. Desmet; Selection of comparison criteria and experimental conditions to evaluate the kinetic performance of monolithic and packed-bed columns J Chromatogr A 1130, (2006), 108-114 [66] K. Hormann, T. Müllner, S. Bruns, A. Höltzel, U. Tallarek; Morphology and separation efficiency of a new generation of analytical silica monoliths J Chromatogr A 1222, (2012), 46-58 [67] G. Guiochon; Monolithic columns in high-performance liquid chromatography J Chromatogr A 1168, (2007), 101-168 [68] R. Wu, L. Hu, F. Wang, M. Ye, H. Zou; Recent developement of monolithic stationary phases with emphasis on microscale chromatographic separation J Chromatogr A 1184, (2008), 369-392 [69] D. Wistuba; Chiral silica-based monoliths in chromatography and capillary electrochromatography J Chromatogr A 1217, (2010), 941-952 [70] J. Randon, S. Huguet, A. Piram, G. Puy, C. Demesmay, J.-L. Rocca; Synthesis of zirconia monoliths for chromatographic separations J Chromatogr A 1109, (2006), 19-25 [71] J. Randon, S. Huguet, C. Demesmay, A. Berthod; Zirconia based monoliths used in hydrophilic-interaction chromatography for original selectivity of xanthines J Chromatogr A 1217, (2010), 1496-1500 [72] P. Jandera, J. Urban, V. Skeriková, P. Langmaier, R. Kubicková, J. Planeta; Polymethacrylate monolithic and hybrid particle-monolithic columns for reversed-phase and hydrophilic interaction capillary liquid chromatography J Chromatogr A 1217, (2010), 22-33 [73] Y. Lv, D. Mei, X. Pan, T. Tan; Preparation of novel β-cyclodextrin functionalized mnolith and its application in chiral separation J Chromatogr B 878, (2010), 2461-2464 [74] T. J. Causon, A. Nordborg, R. A. Shellie, E. F. Hilder; High temperature liquid chromatography of intact proteins using organic polymer monoliths and alternative solvent systems J Chromatogr A 1217, (2010), 3519-3524 [75] R.J. Maggs, in: A. Zlatkis (Ed.), Advances in Chromatgraphy, Preston, Evanston, IL, 1969, 303. [76] F. D. Antia, Cs. Horváth; High-performance liquid chromatography at elevated temperatures: examination of conditions for the rapid separation of large molecules J Chromatogr A 435, (1988), 1-15 [77] H. Chen, Cs. Horváth; High-speed high-performance liquid chromatography of peptides and proteins J Chromatogr A 705, (1995), 3-20 [78] T. Greibrokk, T. Andersen; High-temperature chromatography J Chromatogr A 1000, (2003), 743-755 [79] S. Heinisch, J.-L. Rocca; Sense and nonsense of high-temperature liquid chromatography J Chromatogr A 1216, (2009), 642-658

87

[80] C. Stella, S. Rudaz, J.-L. Veuthey, A. Tchapla; Silica and other materials as supports in liquid chromatography. Chromatographic tests and their importance for evaluating these supports. Part II. Chromatographia 53, (2001), S-132-S-140 [81] Y. Yang; Stationary Phases for high-temperature liquid chromatography LC GC Europe 6, (2003), 37-42 [82] J. Nawrocki, C. Dunlap, A. McCorrnick, P.W. Carr; Part I. Chromatography using ultrastable metal oxide-based stationary phases for HPLC J Chromatogr A 1028, (2004), 1-30 [83] J. Nawrocki, C. Dunlap, J. Li, J. Zhao, C.V. McNeff, A. McCormick, P. W. Carr; Part II. Chromatography using ultra-stable metal oxide-based stationary phases for HPLC J Chromatogr A 1028, (2004), 31-62 [84] C. McNeff, L. Zigan, K. Johnson, P.W. Carr, A. Wang, A. M.Weber-Main; Analytical advantages of highly stable stationary phases for reversed-phase LC LC GC North America 18, (2000), 514-529 [85] G. Vanhoenacker, A. D. S. Pereira, T. Kotsuka, D. Cabooter, G. Desmet, P. Sandra; Evaluation of new polymeric stationary phase with reversed-phase properties for high temperature liquid chromatpgraphy J Chromatogr A 1217, (2010), 3217-3222 [86] S. Louw, F. Lynen, M. Hanna-Brown, P. Sandra; High-efficiency hydrophilic interaction chromatography by coupling 25 cm x 4.6 mm ID x 5 µm silica columns and operation at 80°C J Chromatogr A 1217, (2010), 514-521 [87] H. G. Gika, G. Theodoridis, J. Extance, A. M. Edge, I. D. Wilson; High temperature-ultra performance liquid chromatography-mass spectrometry for the metabonomic analysis of Zucker rat urine J Chromatogr B 871, (2008), 279-287 [88] E. Grata, D. Guillarme, G. Glauser, J. Boccard, P.-A. Carrupt, J.-L. Veuthey, S. Rudaz, J.-L. Wolfender; Metabolite profiling of plant extracts by ultra-high-pressure liquid chromatography at elevated temperature coupled to time-of-flight mass spectrometry J Chromatogr A 1216, (2009), 5660-5668 [89] R. Berta, M. Babják, M. Gazdag; A study of some practical aspects of high temperature liquid chromatography in pharmaceutical applications J Pharmaceutical Biomed Anal 54, (2011), 458-462 [90] F. Gritti, G. Guiochon; Critical contribution of nonlinear chromatography to the understanding of retention mechanism in reversed-phase liquid chromatography J Chromatogr A 1099, (2005), 1-42 [91] L. R. Snyder, J. J. Kirkland, J. L. Glajch Practical HPLC method developement 2. fejezet, Wiley-Interscience publication, (1997), USA [92] D. Guillarme, J-L. Veuthey UHPLC in life sciences, 3. fejezet RSC 2012 [93] S. R. Bakalyar, C. Phipps, B. Spruce, K. Olsen; Choosing sample volume to achieve maximum detection sensitivity and resolution with high-performance liquid chromatography columns of 1.0, 2.1 and 4.6 mm I.D. J Chromatogr A 762, (1997), 167-185 [94] J. H. Knox, H. M. Pyper; Framework for maximizing throughput in preparative liquid chromatography J Chromatogr A 363, (1986), i [95] H. Poppe, J. C. Kraak; Mass loadability of chromatographic columns J Chromatogr A 255, (1983), 395-414

88

[96] J. Dai, P. W. Carr, D. V. McCalley; A new approach to the determination of column overload characteristics in reversed-phase liquid chromatography J Chromatogr A 1216, (2009), 2474-2482 [97] F. Gritti, G. Guiochon; Overload behavior and apparent efficiencies in chromatography J Chromatogr A 1254, (2012), 30-42 [98] D. V. McCalley; Some practical comparisons of the efficiency and overloading behaviour of sub-2 µm porous and sub-3 µm shell particles in reversed-phase liquid chromatography J Chromatogr A 1218, (2011), 2887-2897 [99] M. J. Mills, J. Maltas, W. J. Lough; Assessment of injection volume limits when using on-column focusing with microbore liquid chromatography J Chromatogr A 759, (1997), 1-11 [100] G. Kamperman, J. C. Kraak; Simple and fast analysis of adrenaline and noradrenaline in plasma on microbore high-performance liquid chromatography columns using fluorometric detection J Chromatogr Biomed 337, (1985), 384-390 [101] J. Layne, T. Farcas, I. Rustamov, F. Ahmed; Volume-load capacity in fast-gradient liquid chromatography: Effect of sample solvent composition and injection volume on chromatographic performance J Chromatogr A 913, (2001), 233-242 [102] W. J. Lough, M. J. Mills, J. Maltas; Analyte adsorption in liquid chromatography valve injectors for samples in non-eluting solvents J Chromatogr A 726, (1996), 67-75 [103] F. Gritti, C. A. Sanchez, T. Farkas, G. Guiochon; Achieving the full performance of highly efficient columns by optimizing conventional benchmark high-performance liquid chromatography instruments J Chromatogr A 1217, (2010), 3000-3012 [104] Y. Li, Y., Y. Sun, F. Du, K. Yuan, C. Li; Pulse gradient, large-volume injection, highthroughput ultra-performance liquid chromatographic/tandem mass spectrometry bioanalysis for measurement of plasma amrubicin and its metabolite amrubicinol J Chromatogr A 1193, (2008), 109-116 [105] A. P. Schellinger, P. W. Carr; Isocratic and gradient elution chromatography: A comparison in terms of speed, retention reproducibility and quantitation J Chromatogr A 1109, (2006), 253-266 [106] H. Poppe, J. Paanakker, M. Bronckhorst; Peak width in solvent programmed chromatography: I. General description of peak broadening in solvent programmed elution J Chromatogr A 204, (1981), 77-84 [107] F. Gritti, G. Guiochon; The ultimate band compression factor in gradient elution chromatography J Chromatogr A 1178, (2008), 79-91 [108] F. Gritti, G. Guiochon; Exact peak compression factor in linear gradient elution: I. Theory J Chromatogr A 1212, (2008), 35-40 [109] J. J. Corrigan; D-amino acids in animals Science 164, (1969), 142-149 [110] D. S. Dunlop, A. Neidle; The origin and turnover of D-serine in brain Biochem Bioph Res Co 235; (1997); 26-30 [111] K. Takahashi, F. Hayashi, T. Nishikawa; In Vivo evidence for the link between L- and D-serine metabolism in rat cerebral cortex J Neurochem 69; (1997), 1286-1290 [112] D.S. Dunlop, A. Neidle; Regulation of serine racemase activity by amino acids Mol Brain Res 133, (2005), 208-214

89

[113] P. M. Kim, H. Aizawa, P. S. Kim, A. S. Huang, S. R. Wickramasinghe, A. H. Kashani, R. K. Barrow, R. L. Huganir, A. Ghosh, S. H. Snyder; Serine racemase: Activation by glutamate neurotransmission via glutamate receptor interacting protein and mediation of neuronal migration P Natl Acad Sci USA 102, (2005), 2105-2110 [114] K. Hamase, R. Konno, A. Morikawa, K. Zaitsu; Sensitive determination of D-amino acids in mammals and the effect of D-amino-acid oxidase activity on their amounts Biol Pharm Bull 28, (2005), 1578-1584 [115] S. A. Fuchs, R. Berger, L. W. J. Klomp, T. J. de Koning; D-amino acids in the central nervous system in health and disease Mol Genet Metab 85, (2005), 168-180 [116] S. H. Oliet, J.-P. Mothet; Regulation of N-methyl-D-aspartate receptors by astrocytic Dserine Neuroscince 158, (2009), 275-283 [117] S. H. Snyder, P. M. Kim; D-amino acids as putative neurotransmitters: Focus on Dserine Neurochem Res 25, (2000), 553-560 [118] U. Heresco-Levy, D. C. Javitt The role of N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptormediated neurotransmission in the pathophysiology and therapeutics of psyhiatric syndromes Eur Neuropsychopharm 8, (1998), 141-152 [119] S. A. Fuchs, R. Berger, T. J. de Koning; D-serine: The right or wrong isoform? Brain Res 1401, (2011), 104-117 [120] M. Jansen, G. Dannhardt; Antagonists and agonists at the glycine site of the NMDA receptor for therapeutic interventions Eur J Med Chem 38, (2003), 661-670 [121] L. V. Kalia, S. K. Kalia, M. W. Salter; NMDA receptors in clinical neurology: excitatory times ahead Lancet Neurol 7, (2008), 742-755 [122] M. H. Hyun, S. C. Han, B. H. Lipshutz, Y.-J. Shin, C. J. Welch; New chiral crown ether stationary phase for the liquid chromatogrraphic resolution of α-amino acid enantiomers J Chromatogr A 910, (2001), 359-365 [123] T.-Y. Kim, H.-J. Kim; Chiral separation of 9-fluorenylmethyl chloroformate- and dansyl chloride-derivatized D,L-serine by γ-cyclodextrin-bonded high-performance liquid chromatography J Chromatogr A 933, (2001), 99-106 [124] N. Sanaie, C. A. Haynes; A multiple chemical equilibria approach to modeling and interpreting the separation of amino acid enantiomers by chiral ligand-exchange chromatography J Chromatogr A 1132, (2006), 39-50 [125] I. Ilisz, R. Berkecz, A. Péter; Application of chiral derivatizing agents in the highperformance liquid chromatographic separation of amino acid enantiomers: A review J Pharmaceut Biomed Anal 47, (2008), 1-15 [126] R. Hanczkó, A. Jámbor, A. Perl, I. Molnár-Perl; Advances in the o-phthalaldehyde derivatizations: Comeback to the o-phthalaldehyde-ethanethiol reagent J Chromatogr A 1163, (2007), 25-42 [127] I. Molnár-Perl; Derivatization and chromatographic behavior of the o-phthalaldehyde amino acid derivatives obtained with various SH-group-containing additives J Chromatogr A 913, (2001), 283-302 [128] R. H. Buck, K. Krummen; Resolution of amino acid enantiomers by high-performance liquid chromatography using automated pre-column derivatisation with a chiral reagent J Chromatogr A 315, (1984), 279-285

90

[129] R. H. Buck, K. Krummen, High-performance liquid chromatographic determination of enantiomeric amino acids and amino alcohols after derivatization with o-phthaldialdehyde and various chiral mercaptans: Application to peptide hydrolysates J Chromatogr A 387, (1987), 255-265 [130] A. Hashimoto, T. Nishikawa, T. Oka, K. Takahashi, T. Hayashi; Determination of free amino acid enantiomers in rat brain and serum by high-performance liquid chromatography after derivatization with N-tert.-butyloxycarbonyl-L-cysteine and o-phthaldialdehyde J Chromatogr B 582, (1992), 41-48 [131] P. Marfey; Determination of D-amino acids. II. Use of a bifunctional reagent, 1,5difluoro-2,4-dinitrobenzene Carlsberg Res Comm 49, (1984), 591-596 [132] Gy. Szókán, G. Mező, F. Hudecz; Application of Marfey’s reagent in racemization studies of amino acids and peptides J Chromatogr A 444, (1988), 115-122 [133] K. Harada, K. Fujii, T. Mayumi, Y. Hibino, M. Suzuki, Y. Ikai, H. Oka; A method using LC/MS determination of absolute configuration of constituent amino acids in peptide Advanced Marfey’s method Tetrahedron Lett 36, (1995), 1515-1518 [134] N. Isoherranen, B. Yagen, S. Soback, M. Roeder, V. Schurig, M. Bialer; Pharmacokinetics of levetiracetam and its enantiomer ( R)-α-ethyl-2-oxo-pyrrolidine acetamide in dogs Epilepsia 42, (2001), 825-830 [135] X. Tong, P. N. Patsalos; A microdialysis study of the novel antiepileptic drug levetiracetam: extracellular pharmacokinetics and effect on taurine in rat brain Brit J Pharmacol 133, (2001), 867-874 [136] A. Gambardella, A. Labate, E. Colosimo, R. Ambrosio, A. Quattrone, Monotherapy for partial epilepsy: focus on levetiracetam Neuropsychiatr Dis Treat 4, (2008), 33-38 [137] P. N. Patsalos; Clinical Pharmacokinetics of levetiracetam Clin Pharmacokinet 43, (2004), 707-724 [138] R. A. Radtke; Pharmacokinetics of levetiracetam Epilepsia 42, (2001), 24-27 [139] Z. K, Shihabi, K. Oles, M. Hinsdale; Analysis of antiepileptic drug keppra by capillary electrophoresis J Chromatogr A 1004, (2003), 9-12 [140] N. Isoherranen, M. Roeder, S. Soback, B. Yagen, V. Schurig, M. Bialer; Enantioselective analysis of levetiracetam and its enantiomer R-α-ethyl-2-oxo-pyrrolidine acetamide using gas chromatography and ion trap mass spectrometric detection J Chromatogr B 745, (2000), 325-332 [141] B.M. Rao, R. Ravi, B. S. S. Reddy, S. Sivakumar, I. G. Chand, K. P. Kumar, P.V.R. Acharyulu, G. O. Reddy, M.K. Srinivasu; A validated chiral LC method for the enantioselective analysis of Levetiracetam and its enantiomer R-α-ethyl-2-oxo-pyrrolidine acetamide on amylose-based stationary phase J Pharm Biomed Anal 35, (2004), 1017-1026 [142] G. Saravanan, G. Jyothi, A. Annerao, M. Ramakrishna, M. Y. Reddy, B. Ravibabu; LC method for determination of the stability of levetiracetam drug substance under stressing conditions Chromatographia 67, (2008), 173-177 [143] J. Martens-Lobenhoffer, S. M. Bode-Böger; Determination of levetiracetam in human plasma with minimal sample pretreatment J Chromatogr B 819, (2005), 197-200 [144] M. Contin, S. Mohamed, F. Albani, R. Riva, A. Baruzzi; Simple and validated HPLCUV analysis of levetiracetam in deproteinized plasma of patients with epilepsy J Chromatogr B 873, (2008), 129-132 91

[145] T. Guo, L. M. Oswald, D. R. Mendu, S. J. Soldin; Determination of levetiracetam in human plasma/serum/saliva by liquid chromatography-electrospray tandem mass spectrometry Clin Chim Acta 375, (2007), 115-118 [146] K. M. Matar; Quantification of levetiracetam in human plasma by liquid chromatography-tandem mass spectrometry: Application to therapeutic drug monitoring J Pharm Biomed 48, (2008), 822-830 [147] V. Pucci, F. Bugamelli, R. Mandrioli, A. Ferranti, E. Kenndler, M. A. Raggi; Highperformance liquid chromatographic determination of levetiracetam in human plasma: comparison of different sample clean-up procedures Biomed Chromatogr 18, (2004), 37-44 [148] M. I. Blonk, B. C. van der Nagel, L. S. Smit, R. A. A. Mathot Quantification of levetiracetam in plasma of neonates by ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry J Chromatogr B 878, (2010), 675-681 [149] L. R. Snyder, J. W. Dolan, P. W. Carr; The hydrophobic-substraction model of reversed-phase column selectivity J Chromatogr A 1060, (2004), 77-116 [150] M. E. Swartz, HPLC method development for pharmaceuticals, Vol. 8, 1st ed. S. Ahuja, H. Rasmussen, Elsevier, Italy (2007) 145-186 [151] A. Morikawa, K. Hamase, T. Inoue, R. Konno, A. Niwa, K. Zaitsu Determination of free D-aspartic acid, D-serine and D-alanine in the brain of mutant mice lacking D-aminoacid oxidase activity J Chromatogr B 757, (2001), 119-125 [152] S. L. Grant, Y. Shulman, P. Tibbo, D. R. Hampson, G. B. Baker Determination of Dserine and related neuroactive amino acids in human plasma by high-performance liquid chromatography with fluorometric detection J Chromatogr B 844, (2006), 278-282 [153] Sz. Fekete, J. Fekete; The impact of extra-column band broadening on the chromatographic efficiency of 5 cm long narrow-bore very efficient columns J Chromatogr A 1218, (2011), 5286-5291 [154] http://www.usp.org/app/USPNF/columnsDB.html 2013. 01. 05. [155]http://www.chem.agilent.com/Library/brochures/Zorbax%20Brochure.pdf 2013. 04. 06. [156] K. D. Wyndham, J. E. O’Gara, T. H. Walter, K. H. Glose, N. L. Lawrence, B. A. Alden, G. S. Izzo, C. J. Hudalla, P. C. Iraneta; Characterization and evaluation of C18 HPLC stationary phases based on ethyl-bridged hybrid organic/inorganic particles Anal Chem 75, (2003), 6781-6788

92

NYILATKOZAT

Alulírott Varga-Oláh Erzsébet kijelentem, hogy ezt a doktori értekezést magyam készítettem és abban csak a megadott forrásokat használtam fel. Minden olyan részt, amelyet szó szerint, vagy azonos tartalomban, de átfogalmazva más forrásból átvettem, egyértelműen, a forrás megadásával megjelöltem.

Budapest, 2013. 06.03.

…………………………………. Varga-Oláh Erzsébet

93