LAPORAN TAHUNAN HIBAH BERSAING
JUDUL: PENGEMBANGAN APLIKASI SENYAWA DERIVAT KALKON BERSUBSTITUEN BROMO PADA KANKER LEHER RAHIM DAN KANKER PAYUDARA MELALUI PENDEKATAN KOMBINASI DENGAN AGEN KEMOTERAPI
Tahun ke 1 dari rencana 2 tahun Dibiayai oleh DIPA Direktorat Penelitian Pengabdian kepada Masyarakat Nomor DIPA-023.04.1.673453/2015, tanggal 14 Nopember 2014, DIPA revisi 01 tanggal 03 Maret 2015. Skim : Penelitian Hibah Bersaing Tahun Anggaran 2015 Nomor : 062/SP2H/PL/DIT.LITABMAS/II/2015 Tanggal 5 Pebruari 2015
Ketua/Anggota Tim Dra. Retno Arianingrum, M.Si Prof. Dr. Indyah Sulistyo Arty, MS
0015126803 0006045104
UNIVERSITAS NEGERI YOGYAKARTA OKTOBER 2015
2
Pengembangan Aplikasi Senyawa Derivat Kalkon Bersubstituen Bromo Pada Kanker Leher Rahim dan Kanker Payudara Melalui Pendekatan Kombinasi dengan Agen Kemoterapi RINGKASAN Kanker leher rahim dan kanker payudara merupakan neoplasma malignan dengan insiden tinggi dan banyak menyebabkan kematian bagi penderitanya. Upaya untuk menemukan obat kanker yang bertarget molekuler spesifik perlu terus dilakukan untuk meningkatkan efektivitasnya, mengurangi efek samping dan resistensi terhadap agen kemoterapi seperti Doksorubisin. Perkembangan terapi kanker dewasa ini mengarah pada kombinasi agen kemoterapi dan agen kemopreventif. Kalkon (1,3-difenilpropen-1-on) telah banyak di teliti sebagai senyawa terapetika, khususnya sebagai obat antitumor. Pada umumnya kalkon dan derivatnya beraksi sebagai agen kemopreventif dengan menghambat proliferasi sel, menghambat siklus sel dan induksi apoptosis. Senyawa 1-(4’bromofenil)-3-(4-hidroksi-3-metoksifenil)-2-propen-1-on merupakan senyawa derivat kalkon bersubtituen bromo, yang telah terbukti memiliki aktivitas sitotoksik pada sel kanker leher rahim, namun belum dikaji lebih lanjut aplikasinya pada sel lain dan potensinya sebagai agen ko-kemoterapi. Tujuan jangka panjang dari penelitian ini adalah mengkaji aplikasi senyawa 1-(4’bromofenil)-3-(4-hidroksi-3-metoksifenil)-2-propen-1-on sebagai agen kokemoterapi dengan Doksorubisin pada sel kanker leher rahim HeLa dan sel kanker payudara T47D. Pada tahun pertama dilakukan: (1) investigasi aktivitas sitotoksik senyawa 1-(4’-bromofenil)-3-(4-hidroksi-3-metoksifenil)-2-propen-1on, dokso-rubisin, dan kombinasinya dengan metode MTT [3-(4,5dimethylthiazol-2-yl)-2.5-dipheniltetrazolium bromide] assay; (2) pengamatan morfologi sel menggunakan mikroskop fase kontras dan pengamatan apoptosis dengan metode flowcytometri; serta (3) pengamatan ekspresi protein yang berperan dalam mekanisme apoptosis (Bcl-2 dan Bax) dengan teknik immunositochemical analysis. Hasil penelitian menunjukkan bahwa senyawa 1-(4’-bromofenil)-3-(4hidroksi-3-metoksifenil)-2-propen-1-on bersifat sitotoksik pada sel HeLa dan sel T47D dengan IC50 berturut-turut sebesar 50 M dan 45 M. Nilai IC50 Doksorubisin diperoleh sebesar 6 M pada sel HeLa dan 185 nM pada sel T47D. Kombinasi senyawa tersebut dengan Doksorubisin di bawah nilai IC50 pada umumnya memberikan efek sinergi hingga sinergi kuat pada sel HeLa, dan mendekati aditif hingga sinergi pada sel T47D. Senyawa 1-(4’-bromofenil)-3-(4hidroksi-3-metoksifenil)-2-propen-1-on pada pemakaian tunggal dan kombinasinya dengan Doksorubisin dapat memacu terjadinya apoptosis baik pada sel HeLa maupun sel T47D. Jalur pemacuan apoptosis adalah dengan dengan menurunkan ekspresi Bcl-2 dan meningkatkan ekspresi Bax pada sel HeLa dan T47D.
Kata kunci : Senyawa 1-(4’-bromofenil)-3-(4-hidroksi-3-metoksifenil)-2-propen1-on, ko-kemoterapi, doksorubisin, HeLa, dan T47D, apoptosis, Bcl-2, dan Bax. 3
PRAKATA Puji Syukur Alhamdulillaah, kami panjatkan kehadirat Allah S.W.T, atas segala Rahmat dan Hidayah-Nya sehingga kegiatan penelitian berjudul “Pengembangan Aplikasi Senyawa Derivat Kalkon Bersubstituen Bromo Pada Kanker Leher Rahim dan Kanker Payudara Melalui Pendekatan Kombinasi dengan Agen Kemoterapi” pada Tahun pertama ini dapat terlaksana dengan baik. Kegiatan ini terselenggaran atas bantuan dana DIKTI melalui program Penelitian Hibah Bersaing tahun 2015. Terlaksananya kegiatan ini juga tidak terlepas dari bantuan berbagai pihak. Oleh karena itu pada kesempatan ini kami mengucapkan terima kasih kepada : 1. Rektor UNY yang telah memberi kesempatan kepada kami untuk melaksanakan kegiatan penelitian ini 2. Ketua Lembaga Penelitian dan Pengabdian kepada Masyarakat (LPPM) UNY atas kepercayaan dan kesempatan yang diberikan untuk kegiatan penelitian ini. 3. Dekan FMIPA UNY atas ijin yang telah diberikan. 4. Kepala Laboratorium Parasit Fakultas Kedokteran Universitas Gadjah Mada atas ijin dan perkenannya. 5. Teknisi di laboratorium laboratorium Parasit Fakultas Kedokteran UGM atas bantuannya dalam pelaksanaan penelitian ini 6. Berbagai pihak yang tidak dapat kami sebutkan satu per satu “Tiada gading yang tak retak”, kami pun menyadari masih terdapat kekurangan-kekurangan baik dalam pelaksanaan kegiatan maupun penulisan laporan kemajuan ini, untuk itu kami mengharapkan saran dan kritik dari berbagai pihak.
Yogyakarta, Nopember 2015 Tim Peneliti
4
DAFTAR ISI Hal HALAMAN SAMPUL………….……………………………………….
1
HALAMAN PENGESAHAN .………………………………………….
2
RINGKASAN ……………………………………………………………
3
PRAKATA………………..………………………………………………
4
DAFTAR ISI……………………………………………………………..
5
DAFTAR TABEL………………………………………………………..
6
DAFTAR GAMBAR…………………………………………………….
7
DAFTAR LAMPIRAN…………………………………………………..
10
PENDAHULUAN……………………………………………. A. Latar Belakang…………………………………………… B. Batasan dan Rumusan Masalah…………………………
11 11 13
BAB I.
BAB II. TINJAUAN PUSTAKA……………………………………….. A. Kanker, Daur Sel, dan Apoptosis …….………………… B. Pengobatan Kanker dan Masalah Resistensi……………….. C. Potensi Senyawa Kalkon dan Derivatnya Sebagai Antikanker ……………………………………. D. Roadmap Penelitian ………………………..……………..
15 15 17
BAB III. TUJUAN DAN MANFAAT PENELITIAN .……………….. A. Tujuan Penelitian ………………………………………… B. Manfaat Penelitian………………………………………..
22 22 22
BAB IV. METODE PENELITIAN…………………………………….. A. Lokasi Penelitian ………….………………………… B. Rancangan Penelitian ………………………….…………. C. Subyek dan Obyek Penelitian ………………………….. D. Penelitian Tahun Pertama………………………………..
24 24 24 24 24
BAB V. HASIL DAN PEMBAHASAN…………………………….. A. Hasil Penelitian……………….………………………… B. Pembahasan ………………….…………………………
29 29 47
BAB VI. RENCANA TAHAPAN BERIKUTNYA…………………..
53
BAB VII.KESIMPULAN DAN SARAN …………………………….. A. Kesimpulan…….……………….………………………. B. Saran…………………………….………………………
56 56 56
DAFTAR PUSTAKA………………………………………………….. LAMPIRAN…………………………………………………………….
57 61
5
19 19
DAFTAR TABEL
Halaman Tabel 1.
Rancangan penelitian tahun pertama………………………..
25
Tabel 2.
Persen viabilitas sel HeLa pada perlakuan kombinasi senyawa 1-(4’-bromofenil) -3-(4-hidroksi-3-metoksifenil)-2propen-1-on dan Doksorubisin pada berbagai variasi konsentrasi…………………………………………………….
32
Tabel 3.
Interpretasi nilai indeks kombinasi (CI) ………………………
34
Tabel 4.
Hasil perhitungan nilai CI pada perlakuan kombinasi senyawa 1-(4’-bromofenil) -3-(4-hidroksi-3-metoksifenil)-2-propen-1-on dan Doksorubisin pada berbagai variasi konsentrasi terhadap sel HeLa………………………………………………………… 34 Persen viabilitas sel T47D perlakuan kombinasi senyawa 1-(4’-bromo-fenil) -3-(4-hidroksi-3-metoksifenil)-2-propen-1-on dan Doksorubisin pada berbagai variasi konsentrasi. ………… 38
Tabel 5.
Tabel 6.
Hasil perhitungan nilai CI pada perlakuan kombinasi senyawa 1-(4’-bromofenil) -3-(4-hidroksi-3-metoksifenil)-2-propen-1-on dan Doksorubisin pada berbagai variasi konsentrasi…………
40
Tabel 7.
Pengaruh perlakuan senyawa 1-(4’-bromofenil) -3-(4-hidroksi-3-metoksifenil)-2-propen-1-on terhadap kematian sel HeLa menggunakan Annexin dengan pembacaan Flowcytometer……. 41
Tabel 8.
Pengaruh perlakuan senyawa 1-(4’-bromofenil) -3-(4-hidroksi-3-metoksifenil)-2-propen-1-on, Doksorubisin dan kombinasi keduanya terhadap kematian sel HeLa menggunakan Annexin dengan pembacaan Flowcytometer…………………………….
42
Pengaruh perlakuan senyawa 1-(4’-bromofenil) -3-(4-hidroksi-3-metoksifenil)-2-propen-1-on terhadap kematian sel T47D menggunakan Annexin dengan pembacaan Flowcytometer……
43
Tabel 9.
Tabel 10.
Pengaruh perlakuan senyawa 1-(4’-bromofenil) -3-(4-hidroksi-3-metoksifenil)-2-propen-1-on, Doksorubisin dan kombinasi keduanya terhadap kematian sel T47D menggunakan Annexin dengan pembacaan Flowcytometer……………………………… 44
6
DAFTAR GAMBAR Halaman Gambar 1.
Struktur senyawa 1-(4’-bromofenil)-3-(4-hidroksi -3-metoksifenil)-2-propen-1-on………………………………
21
Gambar 2.
Bagan alir penelitian pada tahun pertama……………………
28
Gambar 3.
Hubungan konsentrasi senyawa 1-(4’-bromofenil) -3(4-hidroksi-3-metoksifenil)-2-propen-1-on dengan viabilitas sel HeLa …………………………………………………….
29
Morfologi sel HeLa: (a) tanpa perlakuan (kontrol sel) dan dengan perlakuan senyawa1-(4’-bromofenil) -3-(4-hidroksi-3-metoksifenil)-2-propen-1-on konsentrasi : (b) 5 M, (c) 10 M, (d) 20 M, (e) 40 M, dan (f) 60 M. Tanda panah putih menunjukkan sel hidup, dan panah merah menunjukkan sel yang mati…………………………..
30
Efek penghambatan proliferasi sel HeLa karena perlakuan senyawa1-(4’-bromofenil) -3-(4-hidroksi-3-metoksifenil)-2propen-1-on (BHM) pada konsentrasi 12, 5; 25; 50; dan 75 M dengan waktu inkubasi 0, 24,48, dan 72 jam ……..
31
Hubungan konsentrasi Doksorubisin dengan viabilitas sel HeLa ……………………………………………………….
31
Gambar 4.
Gambar 5.
Gambar 6. Gambar 7.
Morfologi sel HeLa : (a) tanpa Perlakuan (kontrol sel) dan dengan perlakuan Doksorubisin konsentrasi : (b) 0,625 M, (c) 1,25 M, (d) 2,5 M, (e) 5 M, (f) dan 10 M. Tanda panah putih menunjukkan sel hidup, dan panah merah menunjukkan sel yang mati……………………………… 32
Gambar 8.
Profil viabilitas sel HeLa perlakuan kombinasi senyawa 1-(4’-bromofenil)-3-(4-hidroksi-3-metoksifenil)-2-propen-1-on (konsentrasi 3,125; 6,25; 12,5; dan 25 M) dan Doksorubisin (konsentrasi 0,375; 0,75; 1,5; dan 3 M). ………..
33
Morfologi sel HeLa: (a) tanpa perlakuan (kontrol sel); (b) perlakuan senyawa1-(4’-bromofenil) -3-(4-hidroksi-3-metoksifenil)-2-propen-1-on konsentrasi 25 M, (c) perlakuan Doksorubisin 3 M, (d) perlakuan kombinasi senyawa1-(4’-bromofenil) -3-(4-hidroksi-3metoksifenil)-2-propen-1-on 25 M dan Doksorubisin 3 M….
34
Gambar 9.
Gambar 10. Nilai CI perlakuan kombinasi senyawa 1-(4’-bromofenil) -3-(4-hidroksi-3-metoksifenil)-2-propen-1-on (konsentrasi 3,125; 6,25; 12,5; dan 25 M) dan Doksorubisin (konsentrasi 0,375; 0,75; 1,5; dan 3 M) pada kultur sel HeLa……………… Gambar 11. Hubungan konsentrasi senyawa 1-(4’-bromofenil) -3(4-hidroksi-3-metoksifenil)-2-propen-1-on dengan viabilitas 7
35
sel T47D ……………………………………………………….
35
Gambar 12. Morfologi sel T47D: (a) tanpa perlakuan (kontrol sel) dan dengan perlakuan senyawa 1-(4’-bromofenil) -3-(4-hidroksi-3-metoksifenil)-2-propen-1-on, konsentrasi : (b) 5 M, (c) 10 M, (d) 20 M, (e) 40 M,(f) dan 60 M……………
36
Gambar 13. Efek penghambatan proliferasi sel T47D karena perlakuan senyawa1-(4’-bromofenil) -3-(4-hidroksi-3-metoksifenil)-2-propen-1-on (BHM) pada konsentrasi 11,25; 22,5; 45; dan 67,5 M dengan waktu inkubasi 0, 24,48, dan 72 jam …….
37
Gambar 14. Hubungan konsentrasi Doksorubisin dengan viabilitas sel T47D. 38 Gambar 15. Morfologi sel T47D : (a) tanpa perlakuan (kontrol sel) dan dengan perlakuan Doksorubisin konsentrasi : (b) 50 nM, (c) 100 nM, (d) 150 nM, (e) 200 nM, (f) dan 250 nM……….
38
Gambar 16. Profil viabilitas sel T47D perlakuan kombinasi senyawa 1-(4’-bromofenil) -3-(4-hidroksi-3-metoksifenil)-2-propen1-on (konsen-trasi 2,8125; 5,625; 11,25; dan 22,5 M) dan Doksorubisin (konsentrasi 11,5625; 23,125; 46,25; dan 92,65 nM)…………………………………………………..
39
Gambar 17. Morfologi sel T47D: (a) tanpa perlakuan (kontrol sel); (b) perlakuan senyawa1-(4’-bromofenil) -3-(4-hidroksi -3-metoksifenil)-2-propen-1-on konsentrasi 22,5 M, (c) perlakuan Doksorubisin 92,5 nM, (d) perlakuan kombinasi senyawa1-(4’-bromofenil) -3-(4-hidroksi-3-metoksifenil)-2-propen-1-on 22,5 M dan Doksorubisin 92,5 M….
40
Gambar 18. Nilai CI perlakuan kombinasi senyawa 1-(4’-bromofenil) -3-(4-hidroksi-3-metoksifenil)-2-propen-1-on (konsentrasi 2,8125; 5,625; 11,25; dan 22,5 M) dan Doksorubisin (konsentrasi 11,5625; 23,125; 46,25; dan 92,65 nM) pada Sel T47D………………………………………………..
41
Gambar 19. Pengaruh perlakuan senyawa 1-(4’-bromofenil) -3-(4-hidroksi-3-metoksifenil)-2-propen-1-on terhadap proses apoptosis pada sel HeLa……………………………..
42
Gambar 20. Pengaruh perlakuan senyawa 1-(4’-bromofenil) -3-(4hidroksi-3-metoksifenil)-2-propen-1-on terhadap proses apoptosis pada sel T47D………………………………………
43
Gambar 21. Efek perlakuan senyawa 1-(4’-bromofenil) -3-(4-hidroksi -3-metoksifenil)-2-propen-1-on, doksorubisin, dan kombinasi keduanya terhadap ekspresi Bcl-2 pada sel HeLa. (a). Kontrol sel tanpa perlakuan sampel yang tidak dicat dengan antibodi, (b) Kontrol sel (tanpa perlakuan sampel yang dicat dengan antibodi), (c) Perlakuan tunggal 1-(4’bromofenil) -3-(4-hidroksi-3-metoksifenil)-2-propen-1-on 12,5 M, (d) Perlakuan tunggal doksorubisin 1,5 M, 8
dan (e) Perlakuan kombinasi keduanya. Pengamatan dibawah mikroskop cahaya perbesaran 400x (Bcl-2 positif panah penuh , negatif panah putus-putus ---> )………..
45
Gambar 22. Efek perlakuan senyawa 1-(4’-bromofenil) -3-(4-hidroksi-3-metoksifenil)-2-propen-1-on, doksorubisin, dan kombinasi keduanya terhadap ekspresi Bax pada sel HeLa. (a). Kontrol sel tanpa perlakuan sampel yang tidak dicat dengan antibodi, (b) Kontrol sel (tanpa perlakuan sampel yang dicat dengan antibodi), (c) Perlakuan tunggal 1-(4’-bromofenil) -3-(4-hidroksi-3-metoksifenil)-2-propen-1-on 12,5 M, (d) Perlakuan tunggal doksorubisin 1,5 M, dan (e) Perlakuan kombinasi keduanya. Pengamatan dibawah mikroskop cahaya perbesaran 400x (Bax positif panah penuh , negatif panah putus-putus --->…………………….. 46 Gambar 23. Efek perlakuan senyawa 1-(4’-bromofenil) -3-(4-hidroksi-3-metoksifenil)-2-propen-1-on, doksorubisin, dan kombinasi keduanya terhadap ekspresi Bcl-2 pada sel T47D. (a). Kontrol sel tanpa perlakuan sampel yang tidak dicat dengan antibodi, (b) Kontrol sel (tanpa perlakuan sampel yang dicat dengan antibodi), (c) Perlakuan tunggal 1-(4’-bromofenil) -3-(4-hidroksi-3-metoksifenil)-2-propen-1-on 11,25 M, (d) Perlakuan tunggal doksorubisin 46,25 nM, dan (e) Perlakuan kombinasi keduanya. Pengamatan dibawah mikroskop cahaya perbesaran 400x (Bcl-2 positif panah penuh , negatif panah putus-putus ---> ) ………………….. 47 Gambar 24. Efek perlakuan senyawa 1-(4’-bromofenil) -3-(4-hidroksi-3-metoksifenil)-2-propen-1-on, doksorubisin, dan kombinasi keduanya terhadap ekspresi Bax pada sel T47D. (a). Kontrol sel tanpa perlakuan sampel yang tidak dicat dengan antibodi, (b) Kontrol sel (tanpa perlakuan sampel yang dicat dengan antibodi), (c) Perlakuan tunggal 1-(4’-bromofenil) -3-(4-hidroksi-3-metoksifenil)-2-propen-1-on 11,25 M, (d) Perlakuan tunggal doksorubisin 46,25 nM, dan (e) Perlakuan kombinasi keduanya. Pengamatan dibawah mikroskop cahaya perbesaran 400x (Bax positif panah penuh, negatif panah putus-putus --->……………....... 48
9
DAFTAR LAMPIRAN Halaman
Lampiran 1.
Lampiran 2.
Lampiran 3. Lampiran 4.
Lampiran 5.
Lampiran 6.
Lampiran 7. Lampiran 8.
Lampiran 9
Data Perhitungan Viabilitas Sel HeLA Perlakuan Senyawa 1-(4’-bromofenil) -3-(4-hidroksi-3-metoksifenil)-2-propen-1-on……………………………………
61
Data Perhitungan Efek Penghambatan Proliferasi Sel HeLa Perlakuan Senyawa 1-(4’-bromofenil) -3-(4-hidroksi3-metoksifenil)-2-propen-1-on ………………………
62
Data Perhitungan Viabilitas Sel HeLa Perlakuan Doksorubisin …………………………………………..
64
Uji Sitotoksik Kombinasi Senyawa 1-(4’-bromofenil) -3(4-hidroksi-3-metoksifenil)-2-propen-1-on dan Doksorubisin pada Sel HeLa ………………………….
.65
Data Perhitungan Viabilitas Sel T47D Perlakuan Senyawa 1-(4’-bromofenil) -3-(4-hidroksi-3-metoksifenil)-2-propen-1-on……………………………………
66
Data Perhitungan Efek Penghambatan Proliferasi Sel T47D Perlakuan Senyawa 1-(4’-bromofenil) -3-(4-hidroksi3-metoksifenil)-2-propen-1-on ………………………
67
Data Perhitungan Viabilitas Sel T47D Perlakuan Doksorubisin …………………………………………..
69
Uji Sitotoksik Kombinasi Senyawa 1-(4’-bromofenil) -3(4-hidroksi-3-metoksifenil)-2-propen-1-on dan Doksorubisin pada Sel T47D ………………………….
70
Personalia Tenaga Peneliti
Lampiran 10. Publikasi pada “International Conference ICB Pharma II “Current Breakthrough in Pharmacy Material and Analyses” Lampiran 11. Draf HKI dan Publikasi Lampiran 12. Surat Perjanjian Internal Pelaksanaan Penelitian Desentralisasi SKIM: Penelitian Hibah Bersaing Lampiran 13. Berita Acara Pelaksanaan Seminar Proposal dan Instrumen Penelitian Lampiran 14. Berita Acara Seminar Hasil Penelitian
10
BAB 1 PENDAHULUAN A. Latar Belakang Kanker merupakan penyakit yang ditandai dengan pertumbuhan yang tidak terkontrol dan penyebaran dari sel yang abnormal (American Cancer Society, 2012). Menurut WHO, angka kematian yang disebabkan oleh penyakit kanker semakin meningkat dari tahun ke tahun. Dilaporkan terdapat lebih dari 10 juta kasus kanker per tahun di dunia, bahkan International Agency for Research on Cancer (IARC) memperkirakan pada tahun 2030 akan ada sekitar 21,4 juta penderita kanker tersebar di seluruh dunia. Kanker payudara dan kanker leher rahim merupakan kelompok kanker penyebab kematian pertama dan kedua di dunia pada wanita (WHO, 2009).
Berdasarkan sepuluh kanker primer pada
wanita di Indonesia, kanker leher rahim menempati posisi pertama mencapai 28,66%,
diikuti
kanker
payudara
mencapai
17,77%
(Tjindarbumi
dan
Mangunkusumo, 2002). Beberapa metode untuk pengobatan kanker telah dilakukan, diantaranya pembedahan, kemoterapi dan penyinaran (radiasi). Namun, masing-masing metode mempunyai kelemahan, sehingga tingkat keberhasilannya masih rendah (King, 2000). Kegagalan yang sering terjadi pada pengobatan melalui kemoterapi disebabkan karena rendahnya selektivitas obat anti kanker dan adanya fenomena resistensi sel kanker terhadap agen kemoterapi (drug-resistence) (Wong et al., 2006). Resistensi terhadap obat anti kanker payudara, leher rahim, kolon, prostat dan leukemia banyak ditemukan (Davis et al., 2003). Oleh karena itu, pengembangan dan penemuan pengobatan kanker yang spesifik, khususnya kanker payudara dan kanker leher rahim perlu terus diupayakan. Salah satu agen kemoterapi kanker yang telah diketahui menimbulkan resistensi adalah Doksorubisin. Senyawa golongan antrasiklin ini diberikan pada berbagai jenis kanker. Selain menimbulkan resistensi, Doksorubisin dapat menyebabkan kardiotoksisitas pada penggunaan jangka panjang (Ferreira et al., 2008). Salah satu alternatif untuk mengatasi resistensi adalah melalui kombinasi
11
agen kemoterapi dengan agen kemopreventif sehingga dapat meningkatkan keberhasilan terapi. Kalkon (1,3-difenilpropen-1-on) adalah jenis keton dengan ikatan tidak jenuh yang telah banyak di teliti sebagai senyawa terapetika, khususnya sebagai obat antitumor. Bahkan disebutkan oleh karena aktivitasnya sebagai ”high therapeutic index”, kalkon di anggap sebagai ”the new era of medicines” dalam kapasitasnya sebagai antitumor, antibakterial, dan anti-inflamatory (Afzal et al., 2008). Disebutkan pula bahwa sebagian besar target utama dari senyawasenyawa kalkon adalah mempengaruhi daur sel (Boumendjel et al., 2009). Shen et al., (2007) telah membuktikan bahwa struktur dasar kalkon (1,3difenilpropen-1-on) menghambat aktivasi nuclear factor kappa (NF-B). NF-B merupakan faktor transkripsi yang sangat berperan dalam pengembangan dan progresi kanker, karena NF-B mengatur banyak gen yang terlibat dalam inflamasi, cell survival, proliferasi sel, invasi, angionegenis, dan metastasis (Sen et al., 1986). Penghambatan aktivasi NF-B tersebut menyebabkan adanya induksi apoptosis, penghambatan siklus sel, dan menurunkan ekspresi Bcl-XL sebagai downstream target dari NF-B pada kultur sel kanker kandung kemih T24 dan HT-1376, serta sel payudara MCF-7 dan MDA-MB-231 (Hsu et al., 2006). Penggunaan agen yang mampu menghambat NF-κB seperti senyawa kalkon akan memberikan keuntungan ganda pada terapi antikanker, yaitu dapat meminimalkan resistansi dan sekaligus sebagai agen antikanker. Arty, Arianingrum dan Atun (2012), berhasil mensintesis senyawa derivat kalkon yang mengandung substituen gugus bromo, yaitu senyawa 1-(4’bromofenil)-3-(4-hidroksi-3-metoksifenil)-2-propen-1-on. Hasil uji sitotoksik terhadap kultur sel leher rahim HeLa menunjukkan bahwa senyawa ini berpotensi sebagai antikanker dengan
IC50 sebesar 9,6 g/mL (kategori sangat aktif).
Senyawa ini juga terbukti memiliki aktivitas sebagai antioksidan yang sangat kuat (Arty et al., 2013). Kedua aktivitas tersebut diduga merupakan kontribusi adanya gugus hidroksil dan bromo yang bersifat elektronegatif. Sejauh ini penelitian yang dilakukan masih terbatas pada uji sitotoksik pada sel HeLa dan uji antioksidan.
12
Penelitian-penelitian tersebut menjadi dasar awal pemikiran untuk mengembangkan aplikasi senyawa derivat kalkon bersubstituen bromo ini sebagai sebagai obat antikanker pada kultur sel kanker yang lain, khususnya pada sel T47D yang banyak digunakan sebagai model sel kanker payudara. Demikian juga perlu dikembangkan aplikasinya sebagai agen ko-kemoterapi obat antikanker seperti Doksorubisin yang sering menimbulkan resistensi. Penelitian yang akan dilakukan meliputi penelusuran mekanisme aksi dan target molekuler dari senyawa ini baik pada pemakaian tunggal maupun kombinasinya dengan Doksorubisin, akan diarahkan pada bagaimana pengaruhnya terhadap pemacuan apoptosis, penghambatan daur sel (cell cycle arrest), ekspresi protein yang berpengaruh pada mekanisme apoptosis (Bcl-2 dan Bax) dan proses daur sel (cyclin).
B. Batasan dan Rumusan Masalah Berdasarkan latar belakang permasalahan di atas, maka ruang lingkup penelitian ini dibatasi pada mempelajari potensi senyawa derivat kalkon bersubstituen bromo, yaitu 1-(4’-bromofenil)-3-(4-hidroksi-3-metoksifenil)-2propen-1-on sebagai agen antikanker dan agen ko-kemoterapi Doksorubisin pada kultur sel kanker leher rahim HeLa dan sel payudara T47D. Fokus penelitian yang diamati adalah hal-hal yang berkaitan dengan faktor penghambatan sel kanker, yaitu aktivitas sitotoksik, kemampuan dalam memacu apoptosis, menghambat daur sel, dan mempengaruhi ekspresi protein yang terlibat dalam apoptosis (Bcl-2 dan Bax), dan proses daur sel (cyclin), baik pada penggunaan secara tunggal maupun bila dikombinasikan dengan Doksorubisin. Dengan demikian rumusan masalah dalam penelitian ini adalah : Pada tahun pertama : 1. Bagaimana aktivitas sitotoksik senyawa 1-(4’-bromofenil)-3-(4-hidroksi-3metoksifenil)-2-propen-1-on, Doksorubisin, dan kombinasi keduanya pada sel HeLa dan sel T47D? 2. Bagaimana
efek
perlakuan
senyawa
1-(4’-bromofenil)-3-(4-hidroksi-3-
metoksifenil)-2-propen-1-on, Doksorubisin, dan kombinasi keduanya terhadap pemacuan apoptosis pada sel HeLa dan sel T47D ? 13
3. Bagaimana perubahan ekspresi protein yang mempengaruhi apoptosis (Bcl-2 dan Bax) pada sel HeLa sel T47D karena perlakuan senyawa 1-(4’bromofenil)-3-(4-hidroksi-3-metoksifenil)-2-propen-1-on, Doksorubisin, dan kombinasi keduanya ? Pada tahun kedua : 1. Bagaimana
efek
perlakuan
senyawa
1-(4’-bromofenil)-3-(4-hidroksi-3-
metoksifenil)-2-propen-1-on, Doksorubisin, dan kombinasi keduanya terhadap daur sel HeLa dan sel T47D ? 2. Bagaimana perubahan ekspresi protein regulator daur sel (cyclin D/cyclin E/ cyclin B) pada sel HeLa sel T47D akibat perlakuan
senyawa 1-(4’-
bromofenil)-3-(4-hidroksi-3-metoksifenil)-2-propen-1-on, Doksorubisin, dan kombinasi keduanya ?
14
BAB 2 TINJAUAN PUSTAKA A. Kanker, Daur Sel, dan Apoptosis Penyakit kanker masih merupakan masalah kesehatan utama di dunia. World Health Organization (WHO) melaporkan bahwa pada tahun 1997, dari 50 juta kematian yang terjadi, sebanyak 12% disebabkan oleh kanker dan dua pertiganya terjadi di negara berkembang (WHO, 1998). Di Indonesia kanker merupakan penyebab kematian utama disamping penyakit menular. Jumlah penderita kanker di Indonesia terus bertambah, dari 3,8% pada tahun 1990 menjadi 4,1% pada tahun 1995 (Depkes, 1997). Kanker adalah penyakit hasil mutasi gen atau kesalahan jalur transduksi sinyal yang memungkinkan terjadinya kerusakan sel (Petak et al., 2005). Pada sel kanker gangguan transduksi sinyal akan menyebabkan pembelahan yang berlebihan, penghambatan deferensiasi sel, dan penurunan kematian sel (apoptosis). Adanya perubahan ini, maka sel kanker akan berkembang dan menyebar ke jaringan lain sekaligus akan mengalami perubahan kromosom dan mutasi genetik. Perubahan genetik pada gen-gen yang mengatur pertumbuhan, yaitu onkogen dan gen tumor supressor merupakan perubahan yang sering terjadi (Meiyanto, 1999). Akibatnya sel akan berproliferasi terus menerus dan menimbulkan pertumbuhan jaringan yang abnormal (Lodish et al., 2000). Setiap sel baik sel normal maupun sel kanker mengalami perkembangan melalui suatu siklus yang disebut daur sel (cell cycle). Daur sel meliputi beberapa fase, yaitu : membelah (fase proliferatif), dalam keadaan istirahat (tidak membelah, G-0) dan secara permanen tidak membelah. (Foster et al., 2001). Daur sel diawali dari masuknya sel pada fase G-1, pada fase ini sel melakukan persiapan untuk sintesis DNA (Wyllie et al., 2000). Selanjutnya pada fase S terjadi replikasi DNA sel. Di akhir fase ini sel siap memasuki fase G-2 untuk melakukan pertumbuhan dan sintesis protein yang memadai untuk dua sel. Setelah fase mitosis, sel dapat kembali ke fase G-1 untuk melanjutkan cell cycle atau memasuki fase G-0. Fase G-0 adalah fase istirahat (cell cycle arrest), dimana sel mengalami kelelahan dan berhenti membelah (quiescent cells) (Meiyanto, 2002). Sel dapat keluar dari fase G-0 dan memasuki fase G-1 kembali jika melewati 15
restriction point (R) (Pines, 1997). Untuk melewati restriction point (R) dibutuhkan CDK4/6 (cyclin dependent kinase 4/6) yang diaktivasi oleh cyclin D (CycD) (Foster et al., 2001). CycD bersama CDK4/6 akan mengaktifkan faktor transkripsi E2F dengan cara melepaskannya dari protein pRb (Lodish et al., 2000). E2F akan memacu ekspresi CycE, CycA, dan E2F yang lain. Kompleks CycE-CDK2 dan CycA-CDK2 berperan dalam fosforilasi pRb. E2F memacu ekspresi protein lain yang diperlukan dalam replikasi DNA, misalnya dihidrofolat reduktase, timidin kinase, timidilat sintase, dan DNA polimerase sehingga sel memasuki fase S (Teich, 1997). Pada fase S, terjadi aktivasi synthesis promoting factor (SPF) yaitu kompleks CycA-CDK2, yang pada akhir fase ini mengalami degradasi. Pada fase G2 akan terjadi kenaikan jumlah kompleks CycB-CDC2 yang disebut mitosis promoting factor (Gondhowiardjo, 2004). Regulasi daur sel dihambat oleh Cyclin–dependent kinase inhibitor (CKI). Protein CKI meliputi CDK inhibitory protein/Kinase inhibitory protein (Cip/Kip) yaitu p21, p27 dan p57 yang membentuk kompleks trimerik dengan CDK2CycE/CycA dan Inhibitor of cyclin–dependent kinase 4 (INK4) yaitu p15, p16, p18, dan p19 yang membentuk dimer dengan protein CDK4/6 (Foster et al., 2001). Tumor suppressor gene pRb dan p53 menghambat siklus sel (Teich, 1997) dan memberi kesempatan sel untuk melakukan perbaikan DNA atau apoptosis (Hanahan and Weinberg, 2000). Gangguan pada regulator daur sel akan menyebabkan terganggunya program daur seperti halnya pada sel kanker. Pada sel kanker, daur sel sudah tidak dapat diatur lagi sehingga mengalami pembelahan terus menerus (Meiyanto, 2002). Oleh karena itu, pada perkembangan penelitian mengenai kanker, regulator-regulator cell cycle ini potensial untuk dijadikan target obat antikanker. Penghambatan terhadap CDK4/CDK6 menjadi target pengobatan kanker untuk menghambat proliferasi sel dengan menghentikan cell cycle pada fase G0 atau G1 arrested. Sel kanker juga mampu menghindari mekanisme apotosis (program kematian sel). Apoptosis merupakan kematian sel yang terjadi akibat induksi dari sel itu sendiri. Apoptosis dapat terjadi akibat faktor intrinsik ketika sel mengalami kerusakan yang irreversibel pada DNA. Apoptosis yang terjadi akibat pemicuan 16
faktor ekstrinsik melibatkan peran reseptor tumor necrosis factor tertentu yang disebut reseptor kematian, yaitu TNF-2, reseptor CD95 (Fas/APO-1), dan reseptor TRAIL (Lodish et al., 2000). Protein yang berperan dalam regulasi apoptosis diantaranya p53, keluarga protein Bcl-2, Apaf, Caspase, inhibitor protein proapoptosis (serta reseptor yang merespon sinyal kematian. Sel yang mengalami apoptosis memiliki beberapa karakteristik antara lain peningkatan ekspresi protein proapoptosis (Bax, Bid dan Bak) dan penekanan ekspresi protein antiapoptosis (Bcl-2 dan Bcl-xL), peningkatan level sitokrom C sitosolik, aktivasi caspase, aktivasi PARP1, fragmentasi DNA, dan kerusakan membran sel. Akumulasi dari berbagai karakteristik tersebut menyebabkan munculnya badan-badan apoptosis yang terjadi akibat fragmentasi sel (Gerl and Vaux, 2005). Salah satu penyebab resistensi terhadap proapoptosis karena adanya mutasi pada protein p53 atau peningkatan aktivitas antiapoptosis misalnya pada upregulasi jalur PI3 kinase Akt/PKB.
B. Pengobatan Kanker dan Masalah Resistensi Pengobatan kanker pada umumnya didasarkan pada upaya pengambilan jaringan kanker atau dengan mematikan sel kanker dan meminimalkan efek pengobatan terhadap sel normal disekitarnya. Saat ini pengambilan kanker yang paling utama adalah operasi, radioterapi dan kemoterapi, namun ketiga jenis pengobatan tersebut memiliki kekurangan. Operasi akan berhasil pada beberapa tumor yang telah berkembang, tetapi sulit mengobati pada stadium awal metastasis (Lodish et al, 2000). Pengobatan dengan radiasi mampu membunuh tumor lokal namun radiasi juga akan membunuh sel normal disekitarnya. Sebagian besar obat kemoterapi seperti taxol, 5-fluorourasil (5-FU) dan adriamisin memiliki target pada pembelahan sel (Boyer and Tannock, 2005), tetapi kemoterapi ini dapat menyebabkan diare dan kerontokan rambut. Agen kemoterapi ini juga tidak efektif untuk sel yang mengalami mutasi p53, sehingga perlu dikembangkan agen-agen baru untuk pengobatan kanker yang aman (Lodish et al., 2000). Salah satu permasalahan yang sering timbul dalam terapi kanker adalah resistensi obat kemoterapi (drug-resistence) (Wong et al., 2006). Berbagai obat 17
kemoterapi yang digunakan dalam terapi kanker menjadi kurang berefek karena disebabkan oleh resistensi obat kemoterapi yang timbul di dalam sel. Doksorubisin merupakan obat kemoterapi dari golongan antrasiklin yang diberikan pada berbagai jenis kanker, seperti kanker payudara dan leukimia. Doksorubisin dapat berinterkalasi dengan DNA sehingga fungsi DNA sebagai template dan pertukaran sister chromatid terganggu dan pita DNA terputus. Obat ini juga dapat bereaksi dengan sitokrom P450 reduktase dengan adanya NADPH membentuk zat perantara. Zat perantara tersebut akan bereaksi dengan oksigen menghasilkan radikal bebas yang dapat menghancurkan sel. Aktivitas sitotoksik Doksorubisin tersebut dapat dihasilkan setelah masuk ke dalam sel kanker. Namun, penggunaannya dibatasi karena menyebabkan efek samping seperti mual, myelosuppression, aritmia, dan cardiomyopathy diikuti gagal jantung (Singal and Iliskovic, 1998). Selain itu, seringkali ditemukan kasus toleransi dan resistensi sel kanker terhadap Doksorubisin. Resistensi obat ini disebabkan oleh pompa efflux Pglycoprotein (P-gp). P-gp merupakan salah satu jenis protein transport sel yang diekspresikan oleh gen MDR-1 (Valeria, 2005). Dalam kondisi normal, P-gp berperan dalam absorbsi, distribusi dan eliminasi obat di dalam tubuh (Matheny et al., 2001). P-gp dapat menurunkan konsentrasi zat sitotoksik di dalam sel (Valeria, 2005). Pada kasus kanker payudara, seperti pada sel MCF-7, ekspresi berlebih dari P-gp akan menurunkan konsentrasi agen kemoterapi seperti Doksorubisin, paclitaxel, dan vincristin di dalam sel melalui mekanisme pengeluaran obat (efflux) dari dalam sel, sehingga potensi sitotoksik Doksorubisin pada sel kanker akan berkurang (Wong et al., 2006). Sampai saat ini, belum ditemukan agen kombinasi yang efektif dengan efek samping yang rendah. Agen kemoterapi tambahan yang diberikan justru menambah efek samping, seperti cardiotoxicity. Peningkatan aksi obat kemoterapi seperti Doksorubisin dapat dibantu oleh adanya senyawa lain yang mampu menghambat CDK4 sebagai protein yang memacu proliferasi sel. CDK4 merupakan protein kinase yang berperan penting dalam transduksi proliferasi sel kanker. Penghambatan protein ini dapat mencegah sel berproliferasi sehingga jumlah sel kanker tidak bertambah. Perkembangan sel yang terhenti ini akan meningkatkan potensi aksi dari 18
Doksorubisin sebagai agen kemoterapi. Oleh karena itu, perlu dikembangkan senyawa yang potensial sebagai agen kombinasi dan memiliki resiko toksisitas rendah.
C. Potensi Senyawa Kalkon dan Derivatnya Sebagai Antikanker Berdasarkan studi penelusuran literatur menunjukkan bahwa beberapa senyawa golongan flavonoid dan terpenoid telah diketahui memiliki aktivitas antitumor (Mathivadhani et. al., 2007, Kampa et al., 2004). Senyawa kalkon merupakan senyawa yang termasuk dalam famili flavonoid dan banyak di teliti sebagai therapeutic, khususnya sebagai obat antitumor. Upaya-upaya untuk melakukan eksplorasi senyawa kalkon sebagai antikanker telah dilakukan, baik dengan isolasi senyawa dari bahan alam maupun sintesis. Diantaranya senyawa flavon dan kalkon glikosida yang diisolasi dari ekstrak metanol bunga Helichrysum
arenarium,
senyawa-senyawa
tersebut
memiliki
aktivitas
menghambat tumor necrosis faktor- (TNF- )-induced citotoxixity pada sel L929. TNF- sangat berperan dalam pengaturan mekanisme apoptosis (Toshio, et al., 2009). Beberapa senyawa kalkon hasil sintesis diantaranya : Trans-4-lodo,4boranyl-chalcone memiliki aktivitas antitumor terhadap malignant glioma cell lines secara in vitro dan in vivo (Sasayama, et al., 2007); senyawa 4-dihydroxy-6methoxy-3, 5-dimethylchalcone bersifat antitumor terhadap enam cancer cell lines secara invitro (Ye, et al., 2004); senyawa 2, 4-dihydroxy-6-methoxy-3, 5dimethylchalcone memiliki aktivitas antitumor terhadap ”solid human carcinoma xenograft model”. secara invivo (Ye, et al., 2005). Tidak kalah menariknya adalah senyawa 2-hydroxy-4- methoxychalcone yang memiliki aktivitas antiangiogenic dan antitumor (Lee, et al, 2006).
D. Roadmap Penelitian Arty, et al., (2000), berhasil mensintesis beberapa derivat kalkon, yaitu senyawa mono para-hidroksi kalkon yaitu : (a) 3-(4’-hidroksi-3’-metoksifenil)-1fenil-2-propen-1-on atau MPHK A ; (b) 3-(4’-hidroksi-3’-metoksifenil)-1-(4”metoksifenil)-2-propen-1-on atau MPHK B; (c) 1-(4”-fluorofenil)-3-(4’-hidroksi19
3’-metoksifenil)-2-propen-1-on atau MPHK C; (d) 3-(3’, 5’-ditersierbutil-4’hidroksifenil)-1-(4”-fluorofenil)-2-propen-1-on atau MPHK D, dan (e) 3-(3’,5’ditersierbutil-4’-hidroksifenil)-1-(4”-kloro-fenil)-2-propen-1-on atau MPHK E. Berdasarkan uji aktivitas penghambatan lipid peroksidasi non enzimatis, dan aktivitas penghambatan siklooksigenase, senyawa-senyawa ini menunjukkan sangat poten sebagai antioksidan. Hasil uji sitotoksisitas dari senyawa tersebut terhadap sel HeLa dan sel Raji menunjukkan bahwa senyawa MPHK A dan MPHK C atau 1-(4”fluorofenil)-3-(4’-hidroksi-3’-metoksifenil)-2-propen-1-on
memiliki
aktivitas
sitotoksik dalam menghambat pertumbuhan sel HeLa dan sel Raji (Arty, 2009). Penelitian lebih lanjut terhadap senyawa MPHK A menunjukkan bahwa senyawa ini bersifat sitotoksik pada sel kanker payudara T47D, serta tidak bersifat sitotoksik terhadap sel normal Vero (Arianingrum, et al.,2010). Pada sel T47D, senyawa MPHK A bersifat antiproliferasi dengan menekan viabilitas sel, dan mempengaruhi daur sel dengan menginduksi sel pada fase G1 (Arianingrum, et al, 2012). Penelitian lebih lanjut pada senyawa MPHK C, yaitu senyawa derivat kalkon bersubstituen fluoro 1-(4”-fluorofenil)-3-(4’-hidroksi-3’-metoksifenil)-2propen-1-on menunjukkan bahwa senyawa ini bersifat sitotoksik pada sel HeLa dengan IC50 sebesar sebesar 34 M yang termasuk kategori aktif. Demikian juga pada penggunaan senyawa ini dengan kombinasi Doksorubisin terbukti memberikan efek sinergi kuat. Senyawa ini baik tunggal maupun kombinasinya dengan Doksorubisin juga terbukti mampu memacu terjadinya apoptosis pada sel HeLa, sehingga mengakibatkan menurunkan viabilitas sel (Arianingrum et al., 2013). Hasil penelitian ini telah didaftarkan patennya dengan nomor P00201304740. Arty et al (2012, dan 2013) juga telah berhasil mensintesis senyawa derivat kalkon bersubstituen bromo, yaitu 1-(4’-bromofenil)-3-(4-hidroksi-3metoksifenil)-2-propen-1-on (Gambar 1), dengan mereaksikan 4-bromoasetofenon dan vanilin melalui kodensasi aldol silang dengan katalis asam. Senyawa ini yang berbentuk kristal berwarna kuning dengan rendemen 69,83% dan titik lebur 103106oC. Senyawa ini memiliki sifat antioksidan yang sangat kuat terhadap DPPH dengan IC50 sebesar 10,14 g/mL, dan bersifat sitotoksik yang sangat kuat 20
terhadap cancer cell lines sel HeLa dengan IC50 sebesar 9,6 g/mL sehingga berpotensi sebagai antikanker. Sejauh ini belum dilakukan penelitian lebih lanjut dan mendalam tentang aplikasi pada sel kanker yang lain dan penggunanaanya bila di kombinasikan dengan agen kemoterapi yang lain.
FBr
HO
CH3OHO O
Gambar 1. Struktur senyawa 1-(4’-bromofenil)-3-(4-hidroksi-3-metoksifenil)-2propen-1-on
21
BAB 3 TUJUAN DAN MANFAAT PENELITIAN A. Tujuan Penelitian Pada tahun pertama : 1. Menginvestigasi aktivitas sitotoksik senyawa 1-(4’-bromofenil)-3-(4-hidroksi3-metoksifenil)-2-propen-1-on, Doksorubisin, dan kombinasi keduanya pada sel HeLa dan sel T47D. 2. Mengkaji
efek
perlakuan
senyawa
1-(4’-bromofenil)-3-(4-hidroksi-3-
metoksifenil)-2-propen-1-on, Doksorubisin, dan kombinasi keduanya terhadap pemacuan apoptosis pada sel HeLa dan sel T47D. 3. Mengamati perubahan ekspresi protein yang mempengaruhi apoptosis (Bcl-2 dan Bax) pada sel HeLa sel T47D akibat perlakuan
senyawa 1-(4’-
bromofenil)-3-(4-hidroksi-3-metoksifenil)-2-propen-1-on, Doksorubisin, dan kombinasi keduanya Pada Tahun kedua : 1. Mengkaji
efek
perlakuan
senyawa
1-(4’-bromofenil)-3-(4-hidroksi-3-
metoksifenil)-2-propen-1-on, Doksorubisin, dan kombinasi keduanya terhadap daur sel HeLa dan sel T47D. 2. Mengamati perubahan ekspresi protein regulator daur sel (cyclin D/cyclin E/ cyclin B) pada sel HeLa sel T47D akibat perlakuan
senyawa 1-(4’-
bromofenil)-3-(4-hidroksi-3-metoksifenil)-2-propen-1-on, , Doksorubisin, dan kombinasi keduanya
B. Manfaat Penelitian Penelitian ini penting dilakukan mengingat obat antikanker yang selektif dan murah masih sangat diperlukan. Terlebih insiden kanker leher rahim dan kanker payudara di Indonesia menduduki peringkat pertama dan kedua, dan seringkali terjadi toleransi dan resistensi obat. Dengan pengembangan aplikasi senyawa ini melalui pendekatan kombinasi dengan agen kemoterpi diharapkan dapat meningkatkan efektivitas kemoterapi, mengatasi masalah resistensi dan menurunkan resiko toksisitas akibat kemoterapi. Penelitian ini akan memberikan sumbangan informasi mengenai aktivitas derivat kalkon bersubstitusi bromo, baik 22
tunggal maupun kombinasi dengan agen kemoterapi Doksorubisin dalam pengobatan kanker. Hasil penelitian ini, dapat dijadikan dasar aplikasi klinik kokemoterapi pengobatan kanker leher rahim dan kanker payudara. Selain itu penelitian ini juga mengembangkan sistem analisis untuk ko-kemoterapi pada level molekuler.
23
BAB 4 METODE PENELITIAN A. Lokasi Penelitian Penelitian dilakukan di laboratorium Kimia Organik dan Biokimia Universitas
Negeri
Yogyakarta
dan
laboratorium
Parasitologi
Fakultas
Kedokteran Universitas Gadjah Mada.
B. Rancangan Penelitian Rancangan dan indikator capaian terukur dari penelitian ini disajikan pada Tabel 1.
C. Subyek dan Obyek Penelitian Subyek penelitian ini adalah senyawa derivat kalkon bersubstituen bromo, 1-(4’-bromofenil)-3-(4-hidroksi-3-metoksifenil)-2-propen-1-on.
Objek
peneli-
tiannya adalah aplikasinya sebagai agen ko-kemoterapi Doksorubisin pada sel HeLa dan sel T47D, pada tahun pertama meliputi : (1) uji sitotoksik, (2) uji aktivitas pemacuan apoptosis, dan (3) uji pengamatan protein yang terlibat dalam apoptosis apoptosis (Bcl-2 dan Bax). Pada tahun kedua : (1) uji penghambatan daur sel, dan (2) uji pengamatan protein yang mempengaruhi daur sel (cyclin D/cyclin E/ cyclin B).
D. Penelitian Tahun Pertama 1.
Uji Sitotoksik dengan MTT assay
a.
Alat yang digunakan
: tangki nitrogen cair, mikroskop fluoresensi,
mikroskop fase kontras,mikroskop fluoresensi, penangas air, sentrifuge, inkubator CO2 , incubator, ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) reader, hemocytometer (New Bauer), tabung conical steril, scraper, tissue culture flask, ampul, plate, laminar airflow, pH meter, mikroplate 96 sumuran, mikropipet, vorteks, timbangan elektrik, eppendorft, pipet, dan tip.
24
Tabel 1. Rancangan penelitian tahun pertama Tahun Pertama No 1.
2.
3.
4.
Kegiatan Penelitian Metode Uji sitotoksik tunggal : MTT assay a. Senyawa1-(4’-bromofenil)-3(4-hidroksi-3-metoksifenil)-2propen-1-on pada sel HeLa & sel T47D b. Doksorubisin pada sel HeLa & sel T47D Uji sitotoksik kombinasi : MTT assay Senyawa 1-(4’-bromofenil)-3(4-hidroksi-3-metoksifenil)-2propen-1-on + Doksorubisin pada sel HeLa & sel T47D Pengamatan pemacuan Flowcytometry apoptosis perlakuan: a. Senyawa 1-(4’-bromofenil)-3(4-hidroksi-3-metoksifenil)-2propen-1-on pada sel HeLa & sel T47D b. Doksorubisin pada sel HeLa & T47D c. Kombinasi 1-(4’-bromofenil)3-(4-hidroksi-3-metoksifenil)2-propen-1-on +Doksorubisin pada sel HeLa & T47D*) Analisis ekspresi protein regulator apoptosis Bcl-2 dan Bax karena perlakuan: a. Senyawa 1-(4’-bromofenil)-3(4-hidroksi-3-metoksifenil)-2propen-1-on pada sel HeLa & sel T47D b. Doksorubisin pada sel T47D c. Kombinasi 1-(4’-bromofenil)3-(4-hidroksi-3-metoksifenil)2-propen-1-on +Doksorubisin pada sel HeLa & sel T47D*)
ICC
Indikator Target Luaran a. IC50 1-(4’-bromofenil)-3-(4hidroksi-3-metoksifenil)-2propen-1-on pada sel HeLa & sel T47D b. IC50 Doksorubisin pada sel HeLa & sel T47D CI senyawa 1-(4’-bromofenil)-3-(4hidroksi-3-metoksifenil)-2-propen-1on + Doksorubisin pada sel HeLa & sel T47D Persentase sel yang apoptosis karena perlakuan : a. Senyawa 1-(4’-bromofenil)-3-(4hidroksi-3-metoksifenil)-2propen-1-on pada sel HeLa & sel T47D. b. Doksorubisin pada sel HeLa & sel T47D c. Kombinasi senyawa 1-(4’bromofenil)-3-(4-hidroksi-3metoksifenil)-2-propen-1-on + Doksorubisin pada sel sel HeLa & T47D Level ekspresi protein Bcl-2 dan Bax karena perlakuan: a. Senyawa 1-(4’-bromofenil)-3-(4hidroksi-3-metoksifenil)-2propen-1-on pada sel HeLa & sel T47D b. Doksorubisin pada sel T47D c. Kombinasi senyawa 1-(4’bromofenil)-3-(4-hidroksi-3metoksifenil)-2-propen-1-on + Doksorubisin pada sel HeLa & sel T47D
tanda *) dilakukan bila uji sitotoksisik kombinasi memberikan hasil sinergi positif b.
Bahan yang digunakan: Cell line cancer Sel HeLa dan T47D, Medium Rosewell Park Memorial Institut (RPMI) 1640 (GIBCO BRL) untuk sel HeLa, medium penumbuh mengandung growth factor 10% dan 20% FBS (Fetal Bovine Serum) (Sigma Chem. CO. St. Louis. USA),
DMEM
(Dulbecco’s modified Eagle’s Medium) (Invitrogen) ntuk sel T47D, etidium 25
bromid, RNA-se, DMSO (Dimetil Sulfoksida), natrium karbonat (E.Merck), kertas saring 0,2 m, akuades, fungison dan antibiotik penisilin dan streptromisin (Sigma Chem. CO. St. Louis. USA), hepes dan tripsin (Sigma Chem. CO. St. Louis. USA). PBS (Phospat Buffer Saline), MTT (3-(4,5dimetil tiazol-2-yl)-2,5-difenil tetra-zolium bromida), SDS (Sodium duodecyl sulphate)10% dalam HCl 0,01 N.
c.
Prosedur Kerja Sel dengan konsentrasi 1 x 104 sel/sumuran didistribusikan ke dalam plate
96 sumuran dan diinkubasi selama 24 jam untuk beradaptasi dan menempel di sumuran. Keesokannya media diambil kemudian ditambahkan 100 μl media kultur yang mengandung DMSO 0,2% (kontrol) atau sampel, inkubasi selama 24 atau 48 jam. Pada akhir inkubasi, media kultur yang mengandung sampel dibuang, dicuci dengan 100 l PBS. Kemudian ke dalam masing-masing sumuran ditambahkan 100 l media kultur yang mengandung MTT 5 mg/ml, inkubasi lagi selama 4 jam pada suhu 37°C. Sel yang hidup akan bereaksi dengan MTT membentuk kristal formazan berwarna ungu. Setelah 4 jam, media yang mengandung MTT dibuang, kemudian ditambahkan larutan SDS untuk melarutkan kristal formazan. Digoyang di atas shaker selama 10 menit kemudian dibaca dengan dengan ELISA reader pada panjang gelombang 595 nm. Data absorbansi perlakuan tunggal dikonversi ke dalam persen sel. Potensi aplikasi dalam terapi kombinasi dianalisis dengan membandingkan viabilitas sel perlakuan tunggal dengan kombinasi. Data absorbansi perlakuan tunggal dikonversi ke dalam persen sel hidup dan digunakan untuk menghitung IC50. Potensi aplikasi dalam terapi kombinasi dianalisis dengan menggunakan metode indeks kombinasi (combinatorial index method/CI) berdasarkan Chou (Reynolds and Maurer, 2005).
2.
Uji Pengamatan Apoptosis dengan Flowcytometri
a.
Alat yang digunakan : plate 6 well, flowcytometer, eppendorft, pipet, dan tip.
26
b.
Bahan yang digunakan : 1X Working Solution (1 mL 100X Stock Solution diencerkan menjadi 1/100 dalam Phosphat Buffer Saline (PBS) dan Annexin- V-Fluos Staining Kit Roche.
c.
Prosedur Kerja Sel (kepadatan 5 X 105 sel/sumuran) ditanam dalam plate 6 well sampai
50-60 % konfluen. Setelah itu diinkubasi dengan senyawa uji selama 24 jam. Medium diambil dan dimasukkan dalam tabung sentrifus. Sel di cuci dengan tripsin 0,25% untuk melepas sel dari plate dan dilakukan inkubasi selama 3 menit dalam inkubator CO2. Kemudian ditambahkan media kultur 1 mL. Sel beserta media kultur tersebut dipindahkan juga dalam tabung sentrifus. Selanjutnya sel yang masih tersisa dalam plate dicuci dengan PBS 2X masing-masing sebanyak 1 mL dan PBS ditambahkan dalam tabung sentrifus. Kemudian disentrifus pada 600 g selama 5 menit. Media dibuang dan sel dicuci dengan PBS 1 mL dan disentrifus pada 200 g selama 5 menit. Larutan PBS dibuang dan sel diresuspensi dengan 100 mL Annexin-V-Fluos-labelling solution yang terdiri dari (2 L Annexin-V-Fluos, 100 L buffer, dan 2 L propidium iodide ) untuk 1 kali reaksi. Inkubasi selama 10 menit pada ruang gelap dan dianalis dengan flowcytometer.
3.
Uji Penghambatan Ekspresi Protein dengan Imunositokimia
a.
Alat yang digunakan : coverslips, plate 24 well, incubator, mikroskop cahaya.
b.
Bahan yang digunakan : Metanol (Merck), Etanol (Merck), PBS, akuades, hydrogen peroksida (H2O2), antibodi primer terhadap Bcl-2 (Biocare) dan Bax, Starr Trek Universal HRP Detection Kit (Biocare), mayerhemaktoksilin (Dako), xylol, enteler.
c.
Prosedur Kerja 4
Sel (kepadatan 5 X 10 sel/sumuran) ditanam pada coverslips dalam plate 24 sampai 80 % konfluen. Setelah itu diinkubasi dengan senyawa uji selama 24 jam. Medium diambil, dicuci dengan PBS 2 kali. Selanjutnya sel dalam coverslips difiksasi dengan metanol dingin dan dicuci PBS 2 kali, kemudian dicuci dengan akuades 2 kali. Coverslips dipindahkan dalam slide kemudian ditambahkan 300 L H2O2 (1: 9 dalam akuades), kemudian diinkubasi selama 10 menit, dibuang 27
dan dicuci dengan PBS 2 kali. Selanjutnya di tambahkan 100 L Blocking (Background Snipper), inkubasi selama 15 menit pada suhu kamar, dibuang dan ditambahkan 50 L antibodi primer (Bcl-2 atau Bax) inkubasi selama 60 menit. Setelah dibuang dicuci dengan PBS 2 kali, kemudian tambahkan 100 L antibody sekunder (Trekkie Universal) inkubasi selama 20 menit pada suhu kamar. Setelah dibuang, dicuci dengan PBS 2 kali dan ditambahkan Trek Avidin-HRP, diinkubasi selama 10 menit pada suhu kamar, dibuang dan dicuci dengan PBS 2 x. Dilanjutkan dengan penambahan 100 L DAB, diinkubasi 5 menit, dibuang, dan dicuci dengan akuades. Setelah dibuang dan dibersihkan dengan tissue ditambahkan dengan 300 L mayer-hemaktoksilin dan diinkubasi 5 menit. Kemudian dicuci dengan akuades hingga bersih. Slide (preparat) dicelup dalam etanol, kemudian dicelup dalam xylol. Setelah kering ditutup dengan cover glass dan ditambahkan enteler. Ekspresi protein diamati menggunakan mikroskop. Sel yang mengekspresikan protein tertentu akan memberikan warna coklat/gelap, sedangkan yang tidak mengekspresikan protein tertentu memberikan warna ungu. Bagan alir penelitian tahun pertama disajikan pada Gambar 2. Senyawa Derivat Kalkon Bersubstitusi Bromo
1-(4’-bromofenil) -3-(4-hidroksi-3-metoksifenil)-2-propen-1on
Doksorubisin
TAHUN I Uji aktivitas sitotoksik senyawa derivat kalkon bersubstitusi bromo dan Doksoribisin tunggal pada sel HeLa & sel T47D
IC 50
Uji aktivitas sitotoksik kombinasi senyawa derivat kalkon bersubstutisi bromo dan Doksorubisin pada sel HeLa & sel T47D
% viabilitas sel & nilai CI
Uji induksi apoptosis perlakuan senyawa derivate kalkon bersubstitusi bromo, Doksorubisin, dan kombinasi keduanya pada sel HeLa & sel T47D
% sel yang mengalami apoptosis
Uji efek senyawa derivat kalkon bersubstutisi bromo, Doksorubisin, dan kombinasi keduanya terhadap ekspresi protein yang berperan dalam apoptosis : Bcl-2 dan Bax.
Ekspresi protein Bcl-2 dan Bax
Gambar 2. Bagan alir penelitian pada tahun pertama 28
BAB V HASIL DAN PEMBAHASAN A. HASIL PENELITIAN 1. Uji Sitotoksik Uji sitotoksik dilakukan untuk mengetahui sifat sitotoksik dari senyawa 1(4’-bromofenil)
-3-(4-hidroksi-3-metoksifenil)-2-propen-1-on,
baik
pada
penggunaan tunggal maupun kombinasinya dengan doksorubisin terhadap sel HeLa dan T47D. Pada penelitian ini uji sitotoksisitas dilakukan menggunakan metode MTT. a. Uji Sitotoksik Terhadap Sel HeLa 1) Uji sitotoksik senyawa 1-(4’-bromofenil) -3-(4-hidroksi-3-metoksifenil)-2propen-1-on terhadap sel HeLa Potensi
ketoksikan
senyawa
1-(4’-bromofenil)
-3-(4-hidroksi-3-
metoksifenil)-2-propen-1-on terhadap sel HeLa dinyatakan dalam bentuk grafik hubungan antara konsentrasi dengan prosentase viabilitas sel (Gambar 3), dan data selengkapnya disajikan pada Lampiran 1. Berdasarkan hasil pengamatan tersebut menunjukkan bahwa
semakin tinggi konsentrasi senyawa yang
diberikan, semakin renah viabilitas sel Hela atau semakin banyak jumlah sel HeLa yang mengalami kematian. Berdasarkan hasil perhitungan (Lampiran 1) diperoleh nilai IC50 dari senyawa ini terhadap sel HeLa sebesar 50 M. IC50 = 50 M
Gambar 3.
Hubungan konsentrasi senyawa 1-(4’-bromofenil) -3-(4-hidroksi-3metoksifenil)-2-propen-1-on dengan viabilitas sel HeLa
Morfologi sel HeLa karena perlakuan senyawa 1-(4’-bromofenil) -3-(4hidroksi-3-metoksifenil)-2-propen-1-on
disajikan 29
pada
Gambar
4.
Bila
dibandingkan dengan kontrol sel, nampak bahwa semakin besar konsentrasi penambahan senyawa tersebut, semakin banyak sel yang mengalamai kematian.
a
b
c
d
e
f
Gambar 4. Morfologi sel HeLa: (a) tanpa perlakuan (kontrol sel) dan dengan perlakuan senyawa1-(4’-bromofenil) -3-(4-hidroksi-3-metoksifenil)2-propen-1-on konsentrasi : (b) 5 M, (c) 10 M, (d) 20 M, (e) 40 M, dan (f) 60 M. Tanda panah putih menunjukkan sel hidup, dan panah merah menunjukkan sel yang mati. Uji doubling time untuk menunjukkan sifat proliferasi (Gambar 5) menunjukkan bahwa senyawa1-(4’-bromofenil) -3-(4-hidroksi-3-metoksifenil)-2propen-1-on mampu menekan laju pertumbuhan sel. Data selengkapnya disajikan pada Lampiran 2. 2) Uji sitotoksik Doksorubisin terhadap sel HeLa Hasil uji sitotoksik Doksorubisin terhadap sel HeLa disajikan pada Gambar 6 dan data selengkapnya disajikan pada Lampiran 3. Viabilitas sel HeLa semakin menurun dengan meningkatnya konsentrasi Doksorubisin, dari hasil perhitungan, nilai IC50 Doksorubisin terhadap sel HeLa sebesar 6 M. Perubahan
morfologi
sel
HeLa
karena
penambahan
senyawa
Doksorubisin disajikan pada Gambar 7. Bila dibandingkan dengan kontrol sel,
30
nampak bahwa semakin besar konsentrasi penambahan Doksorubisin, semakin banyak sel yang mengalami kematian.
Gambar 5.
Efek penghambatan proliferasi sel HeLa karena perlakuan senyawa1-(4’-bromofenil) -3-(4-hidroksi-3-metoksifenil)-2-propen1-on (BHM) pada konsentrasi 12, 5; 25; 50; dan 75 M dengan waktu inkubasi 0, 24,48, dan 72 jam . IC50 = 6 M
Gambar 6.
Hubungan konsentrasi Doksorubisin dengan viabilitas sel HeLa
3) Uji sitotoksik kombinasi senyawa 1-(4’-bromofenil) -3-(4-hidroksi-3metoksifenil)-2-propen-1-on dan Doksorubisin terhadap sel HeLa Uji sitotoksik kombinasi Doksorubisin dan senyawa 1-(4’-bromofenil) -3(4-hidroksi-3-metoksifenil)-2-propen-1-on terhadap sel HeLa dilakukan pada konsentrasi (1/16; 1/8; 1/4; dan 1/2 ) dari nilai IC50 atau dibawah nilai IC50. Senyawa 1-(4’-bromofenil) -3-(4-hidroksi-3-metoksifenil)-2-propen-1-on yang digunakan sebesar 3,125; 6,25; 12,5; dan 25 M, sedangkan konsentrasi Doksorubisin sebesar 0,375; 0,75; 1,5; dan 3 M. Kombinasi kedua senyawa ini 31
mampu menurunkan viabilitas sel lebih rendah daripada penggunaan masingmasing senyawa secara tunggal sebagaimana ditunjukkan pada Tabel 2 .
a
b
c
d
e
f
Gambar 7.
Morfologi sel HeLa : (a) tanpa Perlakuan (kontrol sel) dan dengan perlakuan Doksorubisin konsentrasi : (b) 0,625 M, (c) 1,25 M, (d) 2,5 M, (e) 5 M, (f) dan 10 M. Tanda panah putih menunjukkan sel hidup, dan panah merah menunjukkan sel yang mati.
Tabel 2. Persen viabilitas sel HeLa pada perlakuan kombinasi senyawa 1-(4’bromofenil) -3-(4-hidroksi-3-metoksifenil)-2-propen-1-on dan Doksorubisin pada berbagai variasi konsentrasi. Viabilitas Sel (%) Doksorubisin (M) 0 0,375 0,75 1,5 3 1-(4’0 100 72,39 69,05 58,55 50,09 bromofenil) -3(4-hidroksi-33,125 95,80 67,39 63,87 58,12 51,20 metoksi-fenil)6,25 96,85 64,73 67,14 57,07 47,87 2-propen-1-on 12,5 80,54 53,55 53,86 26,87 11,12 (M) 25 50,71 9,20 5,93 5,99 5,44
Penurunan viabilitas sel tersebut juga nampak pada Gambar 8. Pada penelitian ini viabilitas sel terendah diperoleh pada kombinasi konsentrasi Doksorubisin sebesar 3 M. dan senyawa 1-(4’-bromofenil) -3-(4-hidroksi-3metoksifenil)-2-propen-1-on sebesar 25 M.
32
Gambar 8.
Profil viabilitas sel HeLa perlakuan kombinasi senyawa 1-(4’bromofenil)-3-(4-hidroksi-3-metoksifenil)-2-propen-1-on (konsentrasi 3,125; 6,25; 12,5; dan 25 M) dan Doksorubisin (konsentrasi 0,375; 0,75; 1,5; dan 3 M).
Morfologi sel karena pengaruh perlakuan 1-(4’-bromofenil) -3-(4hidroksi-3-metoksifenil)-2-propen-1-on
tunggal,
Doksorubisin
tunggal
dan
kombinasinya disajikan pada Gambar 9.
a
b
c
d
Gambar 9. Morfologi sel HeLa: (a) tanpa perlakuan (kontrol sel); (b) perlakuan senyawa1-(4’-bromofenil) -3-(4-hidroksi-3-metoksifenil)-2-propen-1on konsentrasi 25 M, (c) perlakuan Doksorubisin 3 M, (d) perlakuan kombinasi senyawa1-(4’-bromofenil) -3-(4-hidroksi-3metoksifenil)-2-propen-1-on 25 M dan Doksorubisin 3 M. 33
Selain itu sitotoksik kombinasi juga ditetapkan dengan menghitung indeks interaksi antara agen kemoterapi dengan 1-(4’-bromofenil) -3-(4-hidroksi3-metoksifenil)-2-propen-1-on menggunakan persamaan : Combination Index/CI = (D)1/(Dx)1 + (D)2/(Dx)2 D1 dan D2 adalah konsentrasi sampel yang digunakan dalam perlakuan kombinasi. (Dx)1 dan (Dx)2 adalah konsentrasi tunggal yang dapat menghasilkan efek sebesar yang ditimbulkan perlakuan kombinasi (Reynols and Maurer,2005). Angka CI yang diperoleh diinterpretasikan sebagaimana Tabel 3, sedangkan hasil perhitungannya disajikan pada Tabel 4 dan Gambar 10, sedangkan data selengkapnya di sajikan pada Lampiran 4.
Tabel 3. Interpretasi nilai indeks kombinasi (CI) Nilai CI < 0,1 0,1 - 0,3 0,3 - 0,7 0,7 - 0,9 0,9 - 1,1 1,1 - 1,45 1,45 - 3,3 > 3,3
Interpretasi sinergi sangat kuat sinergis kuat sinergis sinergis ringan-sedang mendekati aditif antagonis ringan-sedang antagonis antagonis kuat-sangat kuat
Tabel 4. Hasil perhitungan nilai CI pada perlakuan kombinasi senyawa 1-(4’bromofenil) -3-(4-hidroksi-3-metoksifenil)-2-propen-1-on dan Doksorubisin pada berbagai variasi konsentrasi terhadap sel HeLa.
1-(4’-bromofenil) 3-(4-hidroksi-3metoksi-fenil)-2propen-1-on (M)
3,125 6,25 12,5 25
Nilai CI Doksorubisin (M) 0,375 0,75 1,5 0,364 0,495 0,583 0,384 0,716 0,608 0,350 0,443 0,201 0,244 0,232 0,235
3 0,633 0,549 0,144 0,239
Berdasarkan perhitungan nilai CI, terlihat bahwa pada kombinasi senyawa 1-(4’-bromofenil) -3-(4-hidroksi-3-metoksifenil)-2-propen-1-on dan 34
Doksorubisin, memberikan interprestasi sinergi (nilai CI
0,3 – 0,7) hingga
sinergi kuat (nilai CI antara 0,1-0,3). Hasil ini membuktikan bahwa senyawa 1(4’-bromofenil) -3-(4-hidroksi-3-metoksifenil)-2-propen-1-on berpotensi untuk digunakan sebagai agen ko-kemoterapi Doksorubisin pada sel HeLa.
b. Uji Sitotoksik Terhadap Sel T47D 1) Uji sitotoksik senyawa 1-(4’-bromofenil) -3-(4-hidroksi-3-metoksifenil)-2propen-1-on terhadap sel T47D Hasil
uji
sitotoksik
senyawa
1-(4’-bromofenil)
-3-(4-hidroksi-3-
metoksifenil)-2-propen-1-on terhadap sel T47D disajikan pada Gambar 11 yang menggambarkan grafik hubungan antara konsentrasi dengan prosentase viabilitas sel.
Gambar 10. Nilai CI perlakuan kombinasi senyawa 1-(4’-bromofenil) -3-(4hidroksi-3-metoksifenil)-2-propen-1-on (konsentrasi 3,125; 6,25; 12,5; dan 25 M) dan Doksorubisin (konsentrasi 0,375; 0,75; 1,5; dan 3 M) pada kultur sel HeLa.
IC50 = 45 M
Gambar 11. Hubungan konsentrasi senyawa 1-(4’-bromofenil) -3-(4-hidroksi-3metoksifenil)-2-propen-1-on dengan viabilitas sel T47D 35
Hasil pengamatan menunjukkan bahwa terdapat hubungan langsung antara perubahan konsentrasi senyawa 1-(4’-bromofenil) -3-(4-hidroksi-3-metoksifenil)2-propen-1-on dengan tingkat kematian sel T47D. Semakin tinggi konsentrasi senyawa
1-(4’-bromofenil)
-3-(4-hidroksi-3-metoksifenil)-2-propen-1-on,
semakin rendah viabilitas sel T47D. Berdasarkan hasil perhitungan, diperoleh nilai IC50 dari senyawa ini terhadap sel T47D sebesar 45 M (Lampiran 5). Perlakuan senyawa 1-(4’-bromofenil) -3-(4-hidroksi-3-metoksifenil)-2propen-1-on jug menyebabkan perubahan morfologi sel T47D sebagaimana disajikan pada Gambar 12. Semakin besar konsentrasi senyawa 1-(4’-bromofenil) -3-(4-hidroksi-3-metoksifenil)-2-propen-1-on, semakin banyak sel yang mati.
a
b
c
d
e
f
Gambar 12. Morfologi sel T47D: (a) tanpa perlakuan (kontrol sel) dan dengan perlakuan senyawa 1-(4’-bromofenil) -3-(4-hidroksi-3-metoksifenil)2-propen-1-on, konsentrasi : (b) 5 M, (c) 10 M, (d) 20 M, (e) 40 M,(f) dan 60 M.
Efek penghambatan prolifaerasi (Gambar 13) menunjukkan bahwa senyawa1-(4’-bromofenil) -3-(4-hidroksi-3-metoksifenil)-2-propen-1-on mampu menekan laju pertumbuhan sel T47D. Data selengkapnya disajikan pada Lampiran 6. 2) Uji sitotoksik Doksorubisin pada sel T47D Hasil pengamatan uji sitotoksik Doksorubisin terhadap sel T47D (Gambar 14) menunjukkan bahwa semakin tinggi perlakuan konsentrasi 36
Doksorubisin, semakin rendah vibilitas sel T47D. Nilai IC50 Doksorubisin terhadap sel T47D sebesar 185 nM (Lampiran 7).
Gambar 13. Efek penghambatan proliferasi sel T47D karena perlakuan senyawa1-(4’-bromofenil) -3-(4-hidroksi-3-metoksifenil)-2-propen1-on (BHM) pada konsentrasi 11,25; 22,5; 45; dan 67,5 M dengan waktu inkubasi 0, 24,48, dan 72 jam . IC50 = 185 nM
Gambar 14.
Hubungan konsentrasi Doksorubisin dengan viabilitas sel T47D.
Morfologi sel T47D karena penambahan Doksorubisin (Gambar 15) menunjukkan bahwa semakin besar konsentrasi penambahan Doksorubisin, semakin banyak sel yang mengalami kematian.
37
a
b
c
d
e
f
Gambar 15.
Morfologi sel T47D : (a) tanpa perlakuan (kontrol sel) dan dengan perlakuan Doksorubisin konsentrasi : (b) 50 nM, (c) 100 nM, (d) 150 nM, (e) 200 nM, (f) dan 250 nM.
3) Uji sitotoksik kombinasi senyawa 1-(4’-bromofenil) -3-(4-hidroksi-3metoksifenil)-2-propen-1-on dan Doksorubisin pada sel T47D Uji sitotoksik kombinasi Doksorubisin dan senyawa 1-(4’-bromofenil) 3-(4-hidroksi-3-metoksifenil)-2-propen-1-on terhadap sel T47D pada konsentrasi (1/16; 1/8; 1/4; dan 1/2 ) dari nilai IC50. Senyawa 1-(4’-bromofenil) -3-(4hidroksi-3-metoksifenil)-2-propen-1-on yang digunakan sebesar 2,8125; 5,625; 11,25; dan 22,5 M, sedangkan konsentrasi Doksorubisin sebesar 11,5625; 23,125; 46,25; dan 92,65 nM. Kombinasi kedua senyawa ini mampu menurunkan viabilitas
sel lebih rendah daripada penggunaan masing-masing senyawa secara tunggal sebagaimana ditunjukkan pada Tabel 5 . Tabel 5. Persen viabilitas sel T47D perlakuan kombinasi senyawa 1-(4’-bromofenil) -3-(4-hidroksi-3-metoksifenil)-2-propen-1-on dan Doksorubisin pada berbagai variasi konsentrasi.
1-(4’bromofenil) 3-(4-hidroksi3-metoksifenil)-2propen-1-on (M)
0 0 2,8125 5,625 11,25
100 96,6 93,3 81,1
22,5
49,7
Viabilitas sel (%) Doksorubisin (nM) 11,5625 23,125 99,34 96,01 98,38 87,18 84,25 85,31 71,33 61,33 46,74 38
26,35
46,25 70,67 67,95 63,15 36,65
92,65 49,12 33,87 28,37 5,50
9,39
5,15
Penurunan viabilitas sel pada perlakuan kombinasi juga nampak pada Gambar 16. Pada penelitian ini viabilitas sel terendah diperoleh pada kombinasi konsentrasi Doksorubisin sebesar 93 nM dan senyawa 1-(4’-bromofenil) -3-(4hidroksi-3-metoksifenil)-2-propen-1-on sebesar 23 M.
Gambar 16. Profil viabilitas sel T47D perlakuan kombinasi senyawa 1-(4’bromofenil) -3-(4-hidroksi-3-metoksifenil)-2-propen-1-on (konsentrasi 2,8125; 5,625; 11,25; dan 22,5 M) dan Doksorubisin (konsentrasi 11,5625; 23,125; 46,25; dan 92,65 nM). Morfologi sel karena pengaruh perlakuan 1-(4’-bromofenil) -3-(4hidroksi-3-metoksifenil)-2-propen-1-on
tunggal,
Doksorubisin
tunggal
dan
kombinasinya terhadap sel T47D disajikan pada Gambar 17. Hasil pengamatan morfologi menunjukkan bahwa perlakuan kombinasi 1-(4’-bromofenil) -3-(4hidroksi-3-metoksifenil)-2-propen-1-on tunggal dan Doksorubisin meningkatkan kematian sel T47D dibandingkan dengan perlakuan tunggalnya. Berdasarkan perhitungan nilai CI (Tabel 6 dan Gambar 18), menunjukkan bahwa pada kombinasi senyawa 1-(4’-bromofenil) -3-(4-hidroksi-3metoksifenil)-2-propen-1-on
dan
Doksorubisin,
memberikan
interprestasi
mendekati aditif ( nilai CI antara 0,9-1,1 ) pada konsentrasi kombinasi rendah dan sinergi (( nilai CI antara 0,3-0,7 pada konsentrasi kombinasi tinggi. Dari hasil ini
membuktikan
bahwa
senyawa
1-(4’-bromofenil)
-3-(4-hidroksi-3-
metoksifenil)-2-propen-1-on juga berpotensi untuk digunakan sebagai agen kokemoterapi Doksorubisin pada sel T47D. 39
a
b
c
d
Gambar 17. Morfologi sel T47D: (a) tanpa perlakuan (kontrol sel); (b) perlakuan senyawa1-(4’-bromofenil) -3-(4-hidroksi-3-metoksifenil)-2-propen-1on konsentrasi 22,5 M, (c) perlakuan Doksorubisin 92,5 nM, (d) perlakuan kombinasi senyawa1-(4’-bromofenil) -3-(4-hidroksi-3metoksifenil)-2-propen-1-on 22,5 M dan Doksorubisin 92,5 M. Tabel 6. Hasil perhitungan nilai CI pada perlakuan kombinasi senyawa 1-(4’bromofenil) -3-(4-hidroksi-3-metoksifenil)-2-propen-1-on dan Doksorubisin pada berbagai variasi konsentrasi.
1-(4’-bromofenil) 2,8125 3-(4-hidroksi-3metoksi-fenil)-25,625 propen-1-on 11,25 (M) 22,5
Nilai CI Doksorubisin (nM) 11,5625 23,125 46,25 1,043 0,997 0,517 0,668 1,028 0,526 0,559 0,494 0,392 0,533 0,425 0,410
92,65 0,416 0,426 0,385 0,517
2. Uji Pengamatan Apoptosis dengan Flowcytometer a. Uji apoptosis pada sel HeLa Pengamatan apoptosis dilakukan
pada sel HeLa tanpa perlakukan,
dengan perlakukan 1-(4’-bromofenil) -3-(4-hidroksi-3-metoksifenil)-2-propen-1on, dengan perlakuan Doksorubisin, dan kombinasi keduanya pada inkubasi 24 40
jam. Hasil pengamatan apoptosis dengan perlakuan senyawa 1-(4’-bromofenil) -3(4-hidroksi-3-metoksifenil)-2-propen-1-on selama inkubasi 24 jam pada sel HeLa disajikan pada Tabel 7 dan Gambar 19. Hasil tersebut menunjukkan bahwa semakin tinggi konsentrasi 1-(4’-bromofenil)-3-(4-hidroksi-3-metoksifenil)-2propen-1-on semakin banyak sel HeLa yang mengalami apoptosis.
Gambar 18. Nilai CI perlakuan kombinasi senyawa 1-(4’-bromofenil) -3-(4hidroksi-3-metoksifenil)-2-propen-1-on (konsen-trasi 2,8125; 5,625; 11,25; dan 22,5 M) dan Doksorubisin (konsentrasi 11,5625; 23,125; 46,25; dan 92,65 nM) pada Sel T47D. Pada perlakuan kombinasi, konsentrasi senyawa 1-(4’-bromofenil) -3-(4hidroksi-3-metoksifenil)-2-propen-1-on digunakan sebesar 12,5 M (¼ IC50) dan Doksorubisin sebesar 1,5 M (¼ IC50). Hasil pengamatan apoptosis dengan flowcytometer pada sel HeLa disajikan pada Tabel 8. Tabel 7.
Pengaruh perlakuan senyawa 1-(4’-bromofenil) -3-(4-hidroksi-3metoksifenil)-2-propen-1-on terhadap kematian sel HeLa menggunakan Annexin dengan pembacaan Flowcytometer. Perlakuan
senyawa 1-(4’-bromofenil) -3(4-hidroksi-3-metoksifenil)-2propen-1-on (M)
Prosentase (%) Sel HeLa Sel Hidup
Early Late Apoptosis Apoptosis
Nekrosis
0
94,64
1,32
2,08
2,01
12,5
85,06
8,34
2,73
3,95
25
54,01
27,47
12,34
6,35
50
14,49
25,25
47,17
13,48
41
Gambar 19. Pengaruh perlakuan senyawa 1-(4’-bromofenil) -3-(4-hidroksi-3metoksifenil)-2-propen-1-on terhadap proses apoptosis pada sel HeLa. Tabel 8. Pengaruh perlakuan senyawa 1-(4’-bromofenil) -3-(4-hidroksi-3metoksifenil)-2-propen-1-on, Doksorubisin dan kombinasi keduanya terhadap kematian sel HeLa menggunakan Annexin dengan pembacaan Flowcytometer. Prosentase (%) Sel HeLa
Perlakuan Sel Hidup
Early Apoptosis
Late Nekrosis Apoptosis
Tanpa Perlakuan
94,64
1,32
2,08
2,01
BHM 12,5 M
85,06
8,34
2,73
3,95
Doksorubisin 1,5 M
58,70
21,61
9,52
10,63
12,5 M BHM + Doksorubisin 1,5 M
56,22
16,32
7,02
21,09
Keterangan : BHM = senyawa 1-(4’-bromofenil) -3-(4-hidroksi-3-metoksifenil)-2-propen-1-on
Dari hasil tersebut menunjukkan bahwa senyawa 1-(4’-bromofenil) -3(4-hidroksi-3-metoksifenil)-2-propen-1-on
baik
senyawa
tunggal
maupun
kombinasi dengan Doksorubisin mampu memacu apoptosis sel Hela dibandingkan tanpa perlakuan. Perlakuan senyawa kombinasi lebih dapat memacu apoptosis dibanding perlakuan secara tunggal. Namun bila dibandingkan dengan perlakuan
42
dengan Doksorubisin tunggal, penambahan senyawa 1-(4’-bromofenil) -3-(4hidroksi-3-metoksifenil)-2-propen-1-on memacu terjadinya nekrosis.
b. Uji apoptosis pada sel T47D Hasil pengamatan apoptosis dengan perlakuan senyawa 1-(4’bromofenil) -3-(4-hidroksi-3-metoksifenil)-2-propen-1-on selama inkubasi 24 jam pada sel HeLa disajikan
pada Tabel 9 dan Gambar 20. Hasil tersebut
menunjukkan bahwa semakin tinggi konsentrasi 1-(4’-bromofenil)-3-(4-hidroksi3-metoksifenil)-2-propen-1-on semakin banyak sel
T47D yang mengalami
apoptosis. Tabel 9.
Pengaruh perlakuan senyawa 1-(4’-bromofenil) -3-(4-hidroksi-3metoksifenil)-2-propen-1-on terhadap kematian sel T47D menggunakan Annexin dengan pembacaan Flowcytometer.
Perlakuan senyawa 1-(4’-bromofenil) -3(4-hidroksi-3-metoksifenil)-2propen-1-on (M)
Prosentase (%) Sel T47D Sel Hidup
Early Apoptosis
Late Apoptosis
Nekrosis
0
90,72
2,18
4,49
2,65
11,25
90,55
2,24
3,93
3,32
22,5
86,10
4,84
6,59
2,25
45
15,13
25,79
42,14
17,12
Gambar 20. Pengaruh perlakuan senyawa 1-(4’-bromofenil) -3-(4-hidroksi-3metoksifenil)-2-propen-1-on terhadap proses apoptosis pada sel T47D. 43
Pada perlakuan kombinasi, konsentrasi senyawa 1-(4’-bromofenil) -3-(4hidroksi-3-metoksifenil)-2-propen-1-on yang digunakan sebesar 11,25 M (¼ IC50) dan Doksorubisin sebesar 46,25 nM (¼ IC50). Hasil pengamatan apoptosis dengan flowcytometer pada sel HeLa disajikan pada Tabel 10.
Tabel 10. Pengaruh perlakuan senyawa 1-(4’-bromofenil) -3-(4-hidroksi-3metoksifenil)-2-propen-1-on, Doksorubisin dan kombinasi keduanya terhadap kematian sel T47D menggunakan Annexin dengan pembacaan Flowcytometer. Perlakuan
Prosentase (%) Sel T47D Sel Hidup
Early Apoptosis
Late Apoptosis
Nekrosis
Tanpa Perlakuan
90,72
2,18
4,49
2,65
BHM 11,25 M
90,55
2,24
3,93
3,32
Doksorubisin 46,25 nM
90,45
2,46
4,71
2,43
12,5 M BHM + Doksorubisin 46,25 nM
82,93
5,09
6,31
5,90
Keterangan : BHM = senyawa 1-(4’-bromofenil) -3-(4-hidroksi-3-metoksifenil)-2-propen-1-on
Dari hasil tersebut menunjukkan bahwa senyawa 1-(4’-bromofenil) -3(4-hidroksi-3-metoksifenil)-2-propen-1-on kombinasi
baik
senyawa
tunggal
dengan Doksorubisin mampu memacu apoptosis
sel
maupun T47D
dibandingkan tanpa perlakuan. Perlakuan senyawa kombinasi lebih dapat memacu apoptosis dibanding perlakuan secara tunggal. Demikian juga bila dibandingkan dengan perlakuan dengan Doksorubisin tunggal.
3. Uji Pengamatan Ekspresi Protein Bcl-2 dan Bax dengan Imunokimia Protein Bcl-2 dan protein Bax merupakan protein yang berperan dalam mekanisme terjadinya apaptosis. Sel yang mengalami apoptosis memiliki beberapa karakteristik antara lain
terjadi
peningkatan ekspresi protein
proapoptosis diantaranya Bax, dan penekanan ekspresi protein antiapoptosis, diantarnya Bcl-2. 44
a. Uji Pengamatan Ekspresi Protein Bcl-2 dan Bax pada sel HeLa Hasil uji pengamatan ekspresi Bcl-2 pada sel HeLa (Gambar 21) menunjukkan bahwa senyawa 1-(4’-bromofenil) -3-(4-hidroksi-3-metoksifenil)-2propen-1-on dapat menurunkan ekspresi Bcl-2 yang terlihat dari menurunnya sel yang berwarna coklat dengan perlakuan senyawa ini, baik pada pemakaian tunggal maupun kombinasinya dengan Doksorubisin.
a
b
c Gambar 21.
d
e
Efek perlakuan senyawa 1-(4’-bromofenil) -3-(4-hidroksi-3metoksifenil)-2-propen-1-on, doksorubisin, dan kombinasi keduanya terhadap ekspresi Bcl-2 pada sel HeLa. (a). Kontrol sel tanpa perlakuan sampel yang tidak dicat dengan antibodi, (b) Kontrol sel (tanpa perlakuan sampel yang dicat dengan antibodi), (c) Perlakuan tunggal 1-(4’-bromofenil) -3-(4-hidroksi-3metoksifenil)-2-propen-1-on 12,5 M, (d) Perlakuan tunggal doksorubisin 1,5 M, dan (e) Perlakuan kombinasi keduanya. Pengamatan dibawah mikroskop cahaya perbesaran 400x (Bcl-2 positif panah penuh , negatif panah putus-putus ---> ) .
Hasil uji pengamatan ekspresi Bax (Gambar 22) pada sel HeLa menunjukkan bahwa senyawa 1-(4’-bromofenil) -3-(4-hidroksi-3-metoksifenil)-2propen-1-on dapat meningkatkan ekspresi Bax yang terlihat dari meningkatnya sel yang berwarna coklat dengan perlakuan senyawa ini, baik pada pemakaian tunggal maupun kombinasinya dengan Doksorubisin.
45
a
b
c
d
Gambar 22.
e
Efek perlakuan senyawa 1-(4’-bromofenil) -3-(4-hidroksi-3metoksifenil)-2-propen-1-on, doksorubisin, dan kombinasi keduanya terhadap ekspresi Bax pada sel HeLa. (a). Kontrol sel tanpa perlakuan sampel yang tidak dicat dengan antibodi, (b) Kontrol sel (tanpa perlakuan sampel yang dicat dengan antibodi), (c) Perlakuan tunggal 1-(4’-bromofenil) -3-(4-hidroksi-3metoksifenil)-2-propen-1-on 12,5 M, (d) Perlakuan tunggal doksorubisin 1,5 M, dan (e) Perlakuan kombinasi keduanya. Pengamatan dibawah mikroskop cahaya perbesaran 400x (Bax positif panah penuh , negatif panah putus-putus --->
b. Uji Pengamatan Ekspresi Protein Bcl-2 dan Bax pada sel T47D Hasil uji ICC ekspresi Bcl-2 pada sel T47D (Gambar 23) menunjukkan bahwa senyawa 1-(4’-bromofenil) -3-(4-hidroksi-3-metoksifenil)-2-propen-1-on, Doksorubisin, dan kombinasi keduanya dapat menurunkan ekspresi Bcl-2. Hal ini nampak dari menurunnya jumlah sel yang berwarna coklat dengan perlakuan senyawa-senyawa tersebut. Pemakaian kombinasi lebih menurunkan ekspresi Bcl2 dibandingkan dengan pemakaian tunggal. Perlakuan dengan senyawa baik tunggal maupun kombinasinya dengan Doksorubisin ini juga mampu meningkatkan ekspresi Bax pada sel T47D (Gambar
24).
Pemakaian
kombinasi
1-(4’-bromofenil)
-3-(4-hidroksi-3-
metoksifenil)-2-propen-1-on dengan Doksorubisin lebih meningkatkan ekspresi Bax dibandingkan dengan pemakaiannya secara tunggal.
46
a
c
b
d
Gambar 23.
e
Efek perlakuan senyawa 1-(4’-bromofenil) -3-(4-hidroksi-3metoksifenil)-2-propen-1-on, doksorubisin, dan kombinasi keduanya terhadap ekspresi Bcl-2 pada sel T47D. (a). Kontrol sel tanpa perlakuan sampel yang tidak dicat dengan antibodi, (b) Kontrol sel (tanpa perlakuan sampel yang dicat dengan antibodi), (c) Perlakuan tunggal 1-(4’-bromofenil) -3-(4-hidroksi-3metoksifenil)-2-propen-1-on 11,25 M, (d) Perlakuan tunggal doksorubisin 46,25 nM, dan (e) Perlakuan kombinasi keduanya. Pengamatan dibawah mikroskop cahaya perbesaran 400x (Bcl-2 positif panah penuh , negatif panah putus-putus ---> ) .
B. PEMBAHASAN Senyawa 1-(4’-bromofenil)-3-(4-hidroksi-3-metoksifenil)-2-propen-1-on (BHM) merupakan senyawa derivat kalkon yang mengandung gugus bromo pada cincin nomor 4’; gugus hidroksil pada cincin nomor 4 atau posisi para; gugus metoksi pada cincin nomor 3 (meta); serta memiliki gugus karbonil dengan ikatan tidak jenuh Senyawa dengan rumus molekul C16H13O3Br ini memiliki titik lebur 103-106oC (Arty dkk., 2012). Senyawa dasar kalkon (1,3-difenilpropen-1on) telah banyak diteliti aktivitasnya sebagai antitumor, antibakterial, dan antiinflamatory (Afzal et al., 2008). Penelitian tentang sifat sitotoksik dari senyawa 1-(4’-bromofenil)-3-(4-hidroksi-3-metoksifenil)-2-propen-1-on secara in vitro masih terbatas pada kultur sel kanker HeLa. Hasil uji sitotoksik pada sel HeLa menunjukkan senyawa ini bersifat toksis dengan nilai IC50 sebesar 9,6 g/mL Senyawa
1-(4’-bromofenil)-3-(4-hidroksi-3-metoksifenil)-2-propen-1-on
juga
memiliki sifat antioksidan yang sangat kuat, yaitu 10,14 g/mL. Bila ditinjau dari 47
struktur senyawanya, aktivitas antioksidan dan antikanker ini kemungkinan besar berasal dari adanya kontribusi gugus hidroksil dan bromide yang bersifat elektronegatif. (Arty dkk, 2012). a
b
c
d
Gambar 24.
e
Efek perlakuan senyawa 1-(4’-bromofenil) -3-(4-hidroksi-3metoksifenil)-2-propen-1-on, doksorubisin, dan kombinasi keduanya terhadap ekspresi Bax pada sel T47D. (a). Kontrol sel tanpa perlakuan sampel yang tidak dicat dengan antibodi, (b) Kontrol sel (tanpa perlakuan sampel yang dicat dengan antibodi), (c) Perlakuan tunggal 1-(4’-bromofenil) -3-(4-hidroksi-3metoksifenil)-2-propen-1-on 11,25 M, (d) Perlakuan tunggal doksorubisin 46,25 nM, dan (e) Perlakuan kombinasi keduanya. Pengamatan dibawah mikroskop cahaya perbesaran 400x (Bax positif panah penuh , negatif panah putus-putus ---> ) .
Hasil penelitian ini menunjukkan senyawa 1-(4’-bromofenil)-3-(4hidroksi-3-metoksifenil)-2-propen-1-on mempunyai aktivitas sitotoksik terhadap sel kanker leher rahim HeLa dan sel payudara T47D. Perlakuan senyawa ini memberikan efek sitotoksik cukup tinggi yaitu IC50 = 50 M ( 16,65 g/mL) pada sel HeLa dan IC50 =
45 M (14,98 g/mL pada sel T47D. Ueda (2002)
menyatakan bahwa senyawa dapat dinyatakan poten jika memiliki nilai IC 50 kurang dari 100 g/mL. Dengan demikian penelitian ini menunjukkan bahwa 1(4’-bromofenil)-3-(4-hidroksi-3-metoksifenil)-2-propen-1-on merupakan senyawa yang poten sebagai antikanker.
48
Adanya gugus OH pada posisi para dari senyawa 1-(4’-bromofenil)-3(4-hidroksi-3-metoksifenil)-2-propen-1-on diperkirakan memberikan kontribusi pada sifat toksisitas senyawa terhadap sel HeLa dan T47D. Pada beberapa hasil penelitian tentang aktivitas senyawa derivat kalkon, adanya substitusi gugus metoksi pada cincin A dan substitusi fluoro, kloro, bromo dan cincin B mampu meningkatkan penghambatan aktivitas NF-B, suatu faktor transkripsi yang berperan dalam pengembangan dan progresi kanker (Folmer, et.al., 2006, dan Kim, et. al., 2007). Selain itu adanya gugus karbonil tak jenuh unsaturated carbonylyang terdapat pada kalkon juga memberikan kontribusi pada aktivitas sitotoksik pada sel HeLa dan T47D. Menurut Srinivasan, et al, (2009) adanya
ikatan tak jenuh yang bersifat sangat elektrofilik dapat
menimbulkan radikal thiyl yang mengarah ke pengurangan alkena melalui adisi Michaelis kovalen dari nukleofil, seperti SH dari cystin dari DNA, yang mengikat NF-B. Perlakuan senyawa 1-(4’-bromofenil)-3-(4-hidroksi-3-metoksifenil)-2propen-1-on juga menunjukkan perubahan morfologi sel yang signifikan seiring meningkatnya konsentrasi senyawa yang diberikan. Perubahan morfologi sel tersebut menyebabkan menurunnya viabilitas sel HeLa dan T47D. Hasil uji doubling time menunjukkan bahwa senyawa 1-(4’-bromofenil)3-(4-hidroksi-3-metoksifenil)-2-propen-1-on bersifat antiproliferasi, baik pada sel HeLa maupun sel T47D. Perlakuan senyawa 1-(4’-bromofenil)-3-(4-hidroksi-3metoksifenil)-2-propen-1-on sebesar 12,5 M pada sel HeLa mampu menghambat laju pertumbuhan sel tersebut, namun sel masih dapat berkembang hingga 72 jam. Perlakuan di atas konsentrasi tersebut, yaitu 25, 50 dan 75 M menyebabkan sel tidak dapat berkembang. Pada sel T47D, perlakuan senyawa dengan konsentrasi 11,25 dan 22,5 M menghambat laju pertumbuhan sel, dimana sel masih dapat berkembang hingga jam ke 48, kemudian mengalami penurunan jumlah sel dan akhirnya mati. Pada konsentrasi senyawa 45 dan 67,5 M menyebabkan sel tidak dapat berkembang. Bila dibandingkan dengan nilai IC50 doksorubisin, senyawa 1-(4’bromofenil)-3-(4-hidroksi-3-metoksifenil)-2-propen-1-on memiliki aktivitas lebih rendah. Doksorubisin merupakan agen kemoterapi yang banyak digunakan dalam 49
terapi berbagai kanker epitel. Doksorubisin dapat berinterkelasi dengan DNA sehingga fungsi DNA sebagai template dan pertukaran sister chromatid terganggu pada pita DNA terputus. Obat ini juga dapat bereaksi dengan sitokrom P450 reduktase dengan adanya NADPH membentuk zat perantara yang akan bereaksi dengan oksigen menghasilkan radikal bebas yang dapat menghancurkan sel. Pada penelitian ini diperoleh nilai IC50 doksorubisin terhadap sel HeLa sebesar 6 M dan 185 nM pada sel T47D. Hasil penelitian menunjukkan bahwa kombinasi senyawa 1-(4’bromofenil)-3-(4-hidroksi-3-metoksifenil)-2-propen-1-on
dengan
doksorubisin
mampu meningkatkan aktivitas sitotoksik baik pada sel HeLa maupun sel T47D, dibandingkan dengan perlakuan tunggal. Perlakuan kombinasi pada sel HeLa dibawah konsentrasi IC50 menghasilkan efek dari sinergi (saling menguatkan) hingga sinergi kuat. Viabilitas sel terendah terjadi pada kombinasi senyawa 1-(4’bromofenil)-3-(4-hidroksi-3-metoksifenil)-2-propen-1-on 25 M dan doksorubisin 3 M. Pada sel T47D perlakuan kombinasi dibawah konsentrasi IC50 menghasilkan efek mendekati aditif pada konsentrasi terendah, dan efek sinergi pada konsentrasi yang lebih tinggi. Viabilitas sel terendah pada sel T47D terjadi pada
kombinasi
senyawa
1-(4’-bromofenil)-3-(4-hidroksi-3-metoksifenil)-2-
propen-1-on konsentrasi 22,5 M dan doksorubisin 92,65 nM. Hasil ini membuktikan bahwa senyawa 1-(4’-bromofenil)-3-(4-hidroksi-3-metoksifenil)-2propen-1-on berpotensi untuk digunakan sebagai agen ko-kemoterapi doksorubisin. Hasil pengamatan apoptosis menggunakan flowcytometer menunjukkan bahwa perlakuan senyawa 1-(4’-bromofenil)-3-(4-hidroksi-3-metoksifenil)-2propen-1-on sebesar 12,5 M (1/4 IC50) dengan waktu inkubasi 24 jam menyebabkan 11,07% sel HeLa mengalami apoptosis. Jumlah ini lebih tinggi dibandingkan dengan sel HeLa tanpa perlakuan (3,4%). Pada perlakuan senyawa dengan konsentrasi lebih tinggi, yaitu 25 M (1/2IC50) dan 50 M (IC50) menyebabkan lebih banyak sel yang mengalami apoptosis, yaitu berturut-turut sebesar 39,81% dan 72,42%. Hasil ini menunjukkan bahwa senyawa 1-(4’bromofenil)-3-(4-hidroksi-3-metoksifenil)-2-propen-1-on mampu menginduksi terjadinya apoptosis pada sel HeLa. Perlakuan kombinasi 12, 5 M senyawa ini 50
dengan 1,5 M doksorubisn menyebabkan 23,34% sel HeLa mengalami apoptosis. Jumlah ini lebih tinggi dari perlakuan tunggal senyawa (11,07%), namun lebih rendah dari perlakuan tunggal doksorubisin (31,13%). Perlakuan kombinasi mengarahkan sel HeLa ke arah nekrosis. Hal ini dapat dipahami karena penelitian ini dilakukan secara invitro, sehingga sangat dimungkinkan sel yang mengalami apoptosis selanjutnya akan mengalami nekrosis, karena tidak ada mekanisme keterlibatan makrofag. Demikian juga pada sel T47D, perlakuan senyawa 1-(4’-bromofenil)-3(4-hidroksi-3-metoksifenil)-2-propen-1-on sebesar 11,25 M (1/4 IC50) dengan waktu inkubasi 24 jam menyebabkan 6,17% sel T47D mengalami apoptosis. Jumlah ini lebih tinggi dibandingkan dengan sel T47D tanpa perlakuan (2,18%). Pada perlakuan senyawa dengan konsentrasi lebih tinggi, yaitu 22,5 M (1/2IC50) dan 45 M (IC50) menyebabkan lebih banyak sel yang mengalami apoptosis, yaitu berturut-turut sebesar 11,44% dan 67,93%. Hasil ini menunjukkan bahwa senyawa 1-(4’-bromofenil)-3-(4-hidroksi-3-metoksifenil)-2-propen-1-on mampu menginduksi terjadinya apoptosis pada sel T47D. Perlakuan kombinasi senyawa ini pada konsentrasi 11,25 M dan doksorubisn 46,25 nM menyebabkan 11,4% sel T47D mengalami apoptosis. Jumlah ini lebih tinggi dari perlakuan tunggal senyawa (6,17%), dan perlakuan tunggal doksorubisin (7,17%). Data ini menunjukkan bahwa kombinasi senyawa ini dengan doksorubisin meningkatkan kemampuan doksorubisin dalam memacu terjadinya apoptosis. Kemampuan senyawa ini dalam memacu apoptosis menyebabkan viabilitas sel HeLa dan T47D menurun. Hasil penelitian ini sejalan dengan penelitian Hsu et al., (2006) yang menunjukkan bahwa struktur inti dari kalkon mampu menghambat proliferasi sel pada sel kanker payudara dengan menginduksi apoptosis. Hasil pengamatan ekspresi protein Bcl-2 baik pada sel HeLa maupun sel T47D
menunjukkan
bahwa
metoksifenil)-2-propen-1-on
baik
senyawa tunggal
1-(4’-bromofenil)-3-(4-hidroksi-3maupun
kombinasinya
dengan
doksorubisin mampu menurunkan level ekspresi Bcl-2. Dalam kaitannya dengan proses apoptosis, hal ini menunjukkan bahwa senyawa ini mampu memacu terjadinya apoptosis dengan menurunkan ekspresi Bcl-2.
51
Senyawa ini, baik pemakaian tunggal maupun kombinasi dengan doksorubisin juga mampu meningkatkan level ekspresi Bax pada sel HeLa dan T47D. Bcl-2 dan Bax merupakan Bcl-2-family, yaitu gen yang sangat berperan dalam jalur pengaturan apoptosis. Protein-protein yang termasuk Bcl-2 family pada umumnya mengatur apoptosis melalui regulasi permeabilitas membrane luar mitokondria. Penelitian Shen et al, 2007 menunjukkan bahwa kalkon dapat menghambat proliferasi sel dengan menginduksi apoptosis pada sel kanker kandung kemih manusia, yaitu sel T24 dan HT-1376. Pada kedua sel ini kalkon secara signifikan meningkatkan ekspresi protein p21 dan p27, serta menurunkan level cyclin B1, cyclin A, dan Cdc2, sehingga menyebabkan cell cycle arrest. Selain itu kalkon meningkatkan ekspresi Bax dan Bak, tetapi menurunkan level Bcl-2 dan Bcl-XL, sehingga memacu apoptosis melalui jalur mitokondria dengan melepaskan sitokrom dan mengaktivasi caspase-9 dan caspase-3. Induksi jalur mitokondria dan penghambatan aktivasi NF-B berperan penting dalam mempengaruhi aktivitas antiproliferasi kalkon pada sel T24 dan HT-1376. Pada
penelitin
ini,
senyawa
1-(4’-bromofenil)-3-(4-hidroksi-3-
metoksifenil)-2-propen-1-on merupakan kalkon dengan substitusi gugus hidroksil, metoksi, dan Bromo ternyata juga mampu menghambat proliferasi sel dan memacu apoptosis. Adanya kemampuan senyawa ini dalam menurunkan level ekspresi Bcl-2 dan meningkatkan level ekspresi Bax, menunjukkan bahwa senyawa ini mampu memacu apoptosis dengan induksi jalur mitokondria.
52
BAB 6 RENCANA TAHAPAN BERIKUTNYA
Sejauh ini, secara keseluruhan penelitian tahun pertama telah dilaksanakan. Pada tahun kedua akan dilanjutkan dengan kegiatan penelitian sebagaimana pada Gambar 24, yaitu : 1. Mengkaji
efek
perlakuan
senyawa
1-(4’-bromofenil)-3-(4-hidroksi-3-
metoksifenil)-2-propen-1-on, Doksorubisin, dan kombinasi keduanya terhadap daur sel HeLa dan T47D. 2. Mengamati perubahan ekspresi protein regulator daur sel (cyclin D/cyclin E/ cyclin B) pada sel HeLa dan T47D dengan adanya perlakuan senyawa 1-(4’bromofenil)-3-(4-hidroksi-3-metoksifenil)-2-propen-1-on, Doksorubisin, dan kombinasi keduanya
TAHUN II Uji penghambatan daur sel perlakuan senyawa derivat kalkon bersubstitusi bromo, Doksorubisin, dan kombinasi keduanya pada sel HeLa & sel T47D
Uji efek senyawa derivat kalkon bersubstutisi bromo, Doksorubisin, dan kombinasi keduanya terhadap ekspresi protein yang berperan dalam daur sel (cycD/cyc E/ cycB)
% sel pada setiap daur sel
Ekspresi protein (cycD/cyc E/ cycB)
Gambar 24. Bagan Alir Penelitian Metode penelitian yang dilakukan adalah : 1.
Uji Penghambatan Daur Sel dengan Flowcytometry
a.
Alat yang digunakan
: Flowcytometer (FACSCalibur),pPerlengkapan
perlindungan diri (sarung tangan steril, jas lab.), waterbath yang telah distel temperaturnya (37°C), Laminar Air Flow Hood (LAF), inkubator CO , tissue 2
culture flask/dish, pen marker, mikropipet, tip, rak ampul/tempat eppendorf, tissue, alat-alat gelas, flakon, timbangan analitik, mikroskop cahaya, inverted 53
microscope, tabung konikal, haemocytometer, cell counter, kamera digital, autoklaf, filter, vorteks, sentrifus. b.
Bahan yang digunakan: Reagen propidium iodida (PI) : 7% triton X (Merck), 0,2% RNase, 5% PI (Sigma) 0,1 mg% dalam PBS, dilarutkan dengan PBS hingga 100%.
c.
Prosedur Kerja Sel hasil panen ditumbuhkan pada plate kultur 6 sumuran sejumlah 5 x 105
sel/sumuran. Setelah inkubasi selama 24 jam sel diberi perlakuan dengan 1-(4”fluorofenil)-3-(4’-hidroksi-3’-metoksifenil)-2-propen-1-on
pada
berbagai
konsentrasi. Pemanenan sel dilakukan pada jam ke 24 dan jam 48 setelah perlakuan. Sel dipanen menggunakan tripsin/EDTA 0.25%/0.02%, kemudian disentrifugasi 1000 RPM selama 5 menit, dan dicuci dengan PBS dingin. Sel diinkubasi dengan larutan propidium iodida (PI) 500 ml (PI 50 mg/ml dalam PBS yang mengandung 0.1% triton-X). Sel selanjutnya diberi perlakuan dengan RNAse bebas DNAse (20 mg/ml) selama 10 menit pada suhu 370C. Sel dianalisis dengan alat flowcytometer BD FACSCalybur.
2.
Penghambatan Ekspresi Protein dengan Imunositokimia
a.
Alat yang digunakan : coverslips, plate 24 well, incubator, mikroskop cahaya.
b.
Bahan yang digunakan : Aseton (E.Merck), serum kambing normal (Novocastra), antibodi primer terhadap cyclin, PBS, streptavidin, biotin, antibodi IgG sekunder terbiotinilasi (Novocastra), konjugat streptavidin terhadap peroksidase kuda (Novocastra), kromogen 3,3-diaminobenzidin (DAB) (Novocastra), akuades, dan mayer-hematoksilin (Dako).
c.
Prosedur Kerja 4
Sel (kepadatan 5 X 10 sel/sumuran) ditanam pada coverslips dalam plate 24 sampai 80 % konfluen. Setelah itu diinkubasi dengan senyawa uji selama 4 dan 8 jam. Medium diambil, dicuci dengan PBS. Selanjutnya dilakukan fiksasi dengan formalin 4% selama 20 menit, cuci PBS, dilanjutkan dengan dehidrasi menggunakan etanol konsentrasi bertingkat yaitu 50, 70 dan 95%, masing-masing selama 5 menit. Cover slip yang memuat sel diangkat, diletakan diatas dish 6 cm. 54
Ditetesi dengan normal mouse serum (1:50) selama 15 menit, dibuang (tanpa cuci), lalu ditetesi dengan Primer Antibodi Monoklonal anti Bax dan Bcl-2 selama 60 menit dan dicuci dalam PBS sebanyak 3 kali. Preparat diinkubasi dalam biotin selama 10 menit dan dicuci dengan PBS sebanyak 2 kali selama 5 menit. Kemudian preparat diinkubasi dalam streptavidin-peroksidase selama 10 menit dan dicuci dengan PBS sebanyak 2 kali selama 5 menit. Selanjutnya, preparat diinkubasi dalam DAB selama 3-8 menit dan dicuci dengan akuades. Preparat direndam dalam hematoksilin selama 3-4 menit untuk counterstain dan dicuci dengan akuades. Ekspresi protein diamati menggunakan mikroskop cahaya. Sel yang mengekspresikan protein tertentu akan memberikan warna coklat/gelap, sedangkan yang tidak mengekspresikan protein tertentu memberikan warna ungu.
55
BAB 7 KESIMPULAN DAN SARAN
A. Kesimpulan 1. Senyawa
1-(4’-bromofenil)
-3-(4-hidroksi-3-metoksifenil)-2-propen-1-on
bersifat sitotoksik dengan IC50 sebesar 50 M pada sel Hela, dan 45 M pada sel T47D. Demikian juga Doksorubisin memiliki aktivitas sitotoksisk dengan IC50 sebesar 6 M pada sel Hela dan 185 nM pada sel T47D. Kombinasi senyawa
1-(4’-bromofenil)
-3-(4-hidroksi-3-metoksifenil)-2-propen-1-on
dengan Doksorubisin umumnya memberikan efek sinergi hingga sinergi kuat pada sel HeLa, dan efek mendekati aditif hingga sinergi pada sel T47D. 2. Senyawa
1-(4’-bromofenil)
-3-(4-hidroksi-3-metoksifenil)-2-propen-1-on
pada pemakaian tunggal dan kombinasinya dengan Doksorubisin memacu terjadinya apoptosis pada sel HeLa dan sel T47D. 3. Senyawa
1-(4’-bromofenil)
-3-(4-hidroksi-3-metoksifenil)-2-propen-1-on
pada pemakaian tunggal dan kombinasinya dengan Doksorubisin mampu menurunkan ekspresi Bcl-2 dan meningkatkan ekspresi protein Bax. B. Saran Perlu dilakukan penelitian lebih lanjut untuk menelusuri pengaruh senyawa ini terhadap daur sel dengan mengamati ekspresi protein yang berperan dalam daur sel.
56
DAFTAR PUSTAKA
Afzal S., Asad M. K, Rumana Q. F, Ansari, Muhammad F. N, and Syed S. S. 2008. Redox Behavior of Anticancer Chalcone on a Glassy Carbon Electrode and Evaluation of its Interaction Parameters with DNA, Int. J. Mol. Sci. 2008, 9, 1424-1434 American Cancer Society, 2012, Cancer Facts and Figure 2012, Atlanta, American Cancer Society, Inc.: 1-6 Arianingrum, R., Arty, I.S., dan Atun S., 2010, “Uji Sitotoksisitas Senyawa Mono Para Hidroksi Kalkon terhadap Cancer cell lines T47D”, Saintek Jurnal, UNY Arianingrum, R., Arty, I.S., dan Atun S., 2013, Kajian Potensi Senyawa Derivat Kalkon Bersubstituen Fluoro Sebagai Agen Ko-Kemoterapi Doxorubicin Pada Sel Kanker Leher Rahim Untuk Mengatasi Masalah Resistensi, Laporan Penelitian Fundamental 2013, LPPM, UNY. Arianingrum, R., Hermawan, A., Meiyanto, E., and Purnomo, H., 2012, Molecular Docking Studies of Chalcone Derivate Compound MPHC A With Tyrosine Kinase Receptors, Proceeding in 24th Federation of Asian Pharmaceutical Associations Congress (FAPA) Bali, Indonesia on September 13 – 16. Arty, I.S., 2009, “Synthesize and Citotoxicity Test of Several Compounds of Mono Para Hidroxy Chalcone”, Indo. J. Chem., 10 (1), 110-115 Arty, I.S., Arianingrum, R., dan Atun, S., 2012., Sintesis Senyawa Mono Para Hidroksi Kalkon Bersubstituen Bromo Dengan Katalis Asam dan Potensinya Sebagai Antioksidan dan Antikanker, Laporan Penelitian Guru Besar, LPPM. Arty, I.S., Arianingrum, R., dan Atun, S., 2013, Sintesis Senyawa Mono Para Hidroksi Kalkon Bersubstituen Bromo Dengan Katalis Asam dan Potensinya Sebagai Antioksidan, Prosiding seminar Nasional Optimalisasi Penelitian dan PPM untu Pencerahan dan Kemandirian Bangsa, LPPM UNY. Arty, S.A., Henk T, Samhudi, Sastrohamidjojo, and Henk an der Goot., 2000., Synthesis of benzylideneacetophenones and their inhibition of lipidperoxidation., Eur. J., Med. Chem. 35, 449-457 Boumendjel A, Ronot X, Boutonnat. 2009 . Chalcone derivatives acting as cell cycle blockers : potensial anticancer drugs ? J Curr Drug Targets. Apr;10(4):363-71. Boyer, M.J., and Tannock, I.F., 2005, The Basic Science of Oncology: Cellular and Molecular Basis of Drug Treatment for Cancer, Mc Graw Hill Compay, forth edition, New York. Davis, J.M., Navolanic, P.M., Weinstein-Oppenheimer, C.R., Steelman, L.S., Wei, H., Konopleva, M., Blagosklonny, M.V., and McCubrey, J.A., 2003, 57
“Raf-1 and Bcl-2 Induce Distinc and Common Pathways That Contribute to Breast Cancer Drug Resistantce”, Clin. Cancer Res.9:1161-1170. Departemen Kesehatan RI. (1997). Profil Kesehatan Indonesia. Depkes RI. Jakarta Ferreira, G.C., Epping, M., Kruyt, F.A.E., and Giaccone, G., 2008, “Apoptosis: Target of Cancer Therapy”, Clin. Cancer Research., 8: 2024-2034 Foster, J.S., Henley, D.C., Ahamed, S., and Wimalasena, J., 2001, “Estrogen and Cell Cycle Regulation in Breast Cancer”, Trend Endocr. Metab. 12(7):320-327 Gerl, R., and Vaux, D.L., 2005, Apoptosis in The Development and Treatment of Cancer, Carcin., 26 (2), 263-270. Gondhowiardjo, S., 2004, Proliferasi Sel dan Keganasan, Majalah Kedokteran Indonesia, 54 (7), 289-299. Hanhanan, D., and Wienberg, R.A., 2000, “The Hallmarks of Cancer”, Cell, 100, 57-70. Hsu, Y.L., Kuo, P.L., Tzeng, W.W., and Lin, C.C., 2006, “Chalcone Inhibits the Proliferation of Human Breast Cancer Cell by Blocking Cell Cycle Progression and Inducing Apoptosis”, Food Chem Toxicol, 44 (5):704-13 IARC, 2010, IARC Launch the Devinitive Cancer Statistics Resource Globocon, Press Release No 201., 1-2. Kampa, M., Alexaki, Vassilia-Ismini., Notas, George., Nifli, Artemissia-Phoebe., Nistikaki, Anatassia., Hatzoglou, Anastassia., Bakogeorge, Efstathia, Koumtzoglou, Elena., Blekas, George., Boskou, Dimitrios., Gravanis, Achille., and Castanas, E., 2004, Antiproliferatif and Apoptotic Effect of Selective Phenolic Acids on T47D Human Breast Cancer Cells: Potential Mechanisms of Action., Breast Cancer Res, 6: R63-R74 King, R. J. B., 2000, Cancer Biology, Pearson Education, Second Edition, England. p.1-7,228-231, 263-264 Lee, Y.S.; Lim, S.S.; Shin, K.H.; Kim, Y.S.; Ohuchi, K.; Jung, S.H.2006. Antiangiogenic and antitumoractivities of 2-hydroxy-4- methoxychalcone. Biol. Pharm. Bull. 29, 1028-1031. Lodish, H., Berk, A., Zipursky, S.L., Matsudaira, P, Baltimore, D., and Darnell, J., 2000, Molecular Cell Biology, 4th edition, New York: W.H. Freeman Matheny, C. J. M., Lamb, M. W., Brouwer, K. L. R., and Pollack, G. M., 2001, “Pharmacokinetic and Pharmacodynamic Implications of P-glycoprotein Modulation”, Pharmacotherapy, 21 (7), 778-796.
58
Mathivadani, P., Shanthi, P., and Sachdanandam, P., 2007, Apoptotic Effect of Semecarpus anacardium nut Extract on T47D Cancer Cell Line., Cell. Biol. Int., 31, 1198-1206 Meiyanto, E., 2002, Bahan Kuliah Biologi Molekuler: Signal Transduksi-Cell Cycle-Transposon, Proyek Que Fakultas Farmasi UGM, Yogyakarta. Petak, I., Houghton, Janet A., and Kopper, L., 2006, Molecular Targeting of Cell Death Signal Transduction Pathways in Cancer, Current Signal Transduction Therapy, 1, 113-131Pahl, H.L., 1999, “Activators and Target Genes of Rel/NF-κB Transcription Factors”, Oncogene 18 6853–6866. Pines, J., 1997, Mammalian Cell Cycle, Oncogenes and Tumor Suppressors, IRL Press, Oxford University Press, New York, 189-191. Reynold, C.P., and Meurer, B.J., 2005, Evaluating Response to Antineoplastic Drug Combination in Tissue Culture Models, Methods Mol. Med., 110, 173-183 Sasayama, T.; Tanaka, K.; Mizukawa, K.; Kawamura, A.; Kondoh, T.; Hosoda, K.; Kohmura, E. 2007. Trans-4-lodo,4-boranyl-chalcone induces antitumor activity against malignant glioma cell lines in vitro and in vivo. J. NeuOnc. 85, 123-132 Sen R. and Baltimore D., 1986, “Inducibility of Kappa Immunoglobulin Enhancer-Binding Protein Nf-kappa B by a Posttranslational Mechanism”, Cell, 1986 : 47, 921-8 Shen, K.H, Chang, JK, Hsu, Y.L, and Kuo, P.L., 2007, “Chalcone Arrests Cell Cycle Progression and Induces Apoptosis Through Induction Mitochondrial Pathway and Inhibition of Nuclear Faktor Kappa B Signaling in Human Bladder Cancer Cells”, Basic Clin Pharmacol Toxicol, 101 : 254-61 Singal, P.K., and Iliskovic, N., 1998, “Doxorubicin-induced Cardiomyopathy”, N. Engl. J. Med. 339:900-905 Teich, N. M., 1997, Oncogenes and Cancer in Franks, L.M. dan Teich, N.M., rd
Cellular and Molecular Biology of Cancer, 3 Edition, Oxford University Press, London. Tjindarbumi, D. and Mangunkusumo, R., 2002, “Cancer in Indonesia, Present and Future”, Jpn. J. Clin. Oncol. 32 (Supplement 1): S17-21 Toshio M. Li-Bo W. ,Seikou N. , Kiyofumi N., Eri Y., Hisashi M., Osamu .M., Li-Jun W., and Masayuki Y., 2009., Medicinal Flowers. XXVII.1) New Flavanone and Chalcone Glycosides, Arenariumosides I, II, III, and IV, and Tumor Necrosis Factor-a Inhibitors from Everlasting, Flowers of Helichrysum arenarium, Chem. Pharm. Bull. 57(4) 361—367 (2009) Valeria, P., 2005, “Changes in P-Glycoprotein Activity Are Mediated by The Growth of A Tumour Cell Line as Multicellular Spheroids”, Cancer Cell International, 5. 59
WHO, 2009, Cancer Control, Knowlendge into Action, WHO Guide for Effective Programes, www.who.int/cancer Wong, H.L., Bendayan, R., Rauth, A.M., Xue, H.Y., Babakhanian, K., and Wu, X.Y., 2006, “A Mechanistic Study of Enhanced Doxorubicin Uptake and Retention in Multidrug Resistant Breast Cancer Cells Using A PolymerLipid Hybrid Nanoparticle System”, The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics, 317 (3), 1372-1381 World Health Organization. 1998. The World Health Report : live in the 21st century, A vision for all, WHO, Geneva Wyllie, A., Donahue, V., Fischer, B., Hill, D., Keesey, J., and Manzow, S., 2000, Cell Death Apoptosis and Necrosis, Rosche Diagnostic Corporation Ye, C.L.; Liu, J.W.; Wei, D.Z.; Lu, Y.H.; Qian, F. 2005. In vivo antitumor activity by 2, 4-dihydroxy-6-methoxy-3, 5-dimethylchalcone in a solid human carcinoma xenograft model. Canc. Chemo.Pharm., 55, 447-452. Ye, C.L.; Liu, J.W.; Wei, D.Z.; Lu, Y.H.; Qian, F.2004. In vitro anti-tumor activity of 2, 4-dihydroxy-6-methoxy-3, 5-dimethylchalcone against six established human cancer cell lines. Pharmacol. Res. 2004, 50, 505-510
60
LAMPIRAN 1 Data Perhitungan Viabilitas Sel HeLa Perlakuan Senyawa 1-(4’-bromofenil) -3-(4-hidroksi-3-metoksifenil)-2-propen-1-on
Konsentrasi (M) 70 65 60 55 50 45 40 35 30 25 20 Kontrol Sel Kontrol Media
Log Konsentrasi 1,845 1,813 1,778 1,740 1,699 1,653 1,602 1,544 1,477 1,398 1,301
Absorbansi
Viabilitas Sel (%)
1
2
3
1
2
3
0,316 0,336 0,38 0,575 0,514 0,661 0,634 0,675 0,834 0,875 0,937 0,955 0,071
0,313 0,324 0,39 0,535 0,508 0,66 0,635 0,671 0,742 0,895 0,915 0,955 0,914
0,316 0,308 0,451 0,553 0,511 0,652 0,632 0,645 0,848 0,918 0,924 0,960 0,073
27,571 29,831 34,802 56,836 49,944 66,554 63,503 68,136 86,102 90,734 97,740
27,232 28,475 35,932 52,316 49,266 66,441 63,616 67,684 75,706 92,994 95,254
27,571 26,667 42,825 54,350 49,605 65,537 63,277 64,746 87,684 95,593 96,271
Rerata Viabilitas sel (%) 27,458 28,324 37,853 54,501 49,605 66,177 63,465 66,855 83,164 93,107 96,422
Harga koefisien determinasi (r2) perhitungan = 0,942, r = 0,9706. Harga r tabel untuk taraf kesalahan 5%, n=11 adalah 0,602. r hitung> r tabel, sehingga nilai IC 50 dapat dihitung dari persamaan tersebut : y = -131,64x + 274,26 50= -131,64x + 274,26 x = 1,7036 , IC50 = in log x IC50 = 50 M
61
Standar Error 0,113 0,916 2,507 1,307 0,196 0,322 0,100 1,063 3,757 1,404 0,722
LAMPIRAN 2 Data Perhitungan Efek Penghambatan Proliferasi Sel HeLa Perlakuan Senyawa 1-(4’-bromofenil) -3-(4-hidroksi-3-metoksifenil)-2-propen-1-on Jumlah sel HeLa pada pengamatan jam 24, 48, dan 72 dengan perlakuan BHM 12,5; 25; 50; dan 75 M dan tanpa perlakuan (kontrol) Jam
Kontrol
0 24 48 72 Jam
Kadar BHM (mM) 50 25 2 3
75 1 JUMLAH SEL RATA-RATA 5000,000 4918,033 4726,776 12504,554 268,670 1261,416 11404,110 51,370 1261,416 13515,982 268,265 222,603
4904,372 2818,761 2568,493 656,393
5373,406 5159,381 9731,735 9880,137
Kontrol
0 24 48 72
Kadar BHM (mM) 75 50 25 1 2 3 LOG JUMLAH SEL RATA-RATA 3,699 3,692 3,675 3,691 4,097 2,429 3,101 3,450 4,057 1,711 3,101 3,410 4,131 2,429 2,348 2,817
12,5 4
62
12,5 4 3,730 3,713 3,988 3,995
Jam
Kontrol
Kadar BHM (M) 50 25
75 sel 2 x lipat Log jumlah sel Doubling time
Perlakuan Kontrol BHM 12,5 M BHM 25 M BHM 50 M BHM 75 M
JUMLAH SEL RATA-RATA X 10 10000 9836 4,000 3,993 37,000
Persamaan garis y = 0,0052x + 3,8076 y = 0,0045x + 3,6961 y = -0,0111x + 3,741 y = -0,0166x + 3,6531 y = -0,0188x + 3,2413
63
12,5
4
9454 3,976
Slope 0,0052 0,0045 -0,0111 -0,0166 -0,0188
9809 3,992
10747 4,031 74
Nilai Doubling Time (Jam) 37,000 74,000 -
LAMPIRAN 3 Data Perhitungan Viabilitas Sel HeLa Perlakuan Doksorubisin
Konsentrasi (M) 75 50 25 12,5 10 5 2,5 1 0,5 0,25 0,125 Kontrol Media Kontrol Sel
Log Konsentrasi 1,875 1,699 1,398 1,097 1,000 0,699 0,398 0,000 -0,301 -0,602 -0,903
Absorbansi
Viabilitas Sel (%)
1
2
3
1
2
3
0,169 0,209 0,257 0,378 0,400 0,390 0,410 0,490 0,576 0,615 0,624 0,076 0,681
0,175 0,231 0,265 0,377 0,361 0,378 0,408 0,462 0,603 0,600 0,646 0,073 0,669
0,120 0,215 0,270 0,375 0,370 0,363 0,410 0,449 0,507 0,622 0,626 0,072 0,671
15,83 22,50 30,50 50,67 54,33 52,67 56,00 69,33 83,67 90,17 91,67
16,83 26,17 31,83 50,50 47,83 50,67 55,67 64,67 88,17 87,67 95,33
7,67 23,50 32,67 50,17 49,33 48,17 56,00 62,50 72,17 91,33 92,00
Rerata Viabilitas sel (%) 13,44 24,06 31,67 50,44 50,50 50,50 55,89 65,50 81,33 89,72 93,00 0,074 0,674
Harga koefisien determinasi (r2) perhitungan = 0,9639, r = 0,9818. Harga r tabel untuk taraf kesalahan 5%, n=11 adalah 0,602. r hitung> r tabel, sehingga nilai IC 50 dapat dihitung dari persamaan tersebut : y = -27,182x + 70,811 50 = -27,182x + 70,811 x = 52,08, IC50 = in log x IC50 = 6 M 64
Standar Error 2,903 1,094 0,631 0,147 1,965 1,302 0,111 2,016 4,764 1,082 1,171
LAMPIRAN 4 Uji Sitotoksik Kombinasi Senyawa 1-(4’-bromofenil) -3-(4-hidroksi-3metoksifenil)-2-propen-1-on dan Doksorubisin pada Sel HeLa Variasi Konsentrasi : IC50 1-(4’-bromofenil) -3-(4-hidroksi-3-metoksifenil)-2-propen-1-on IC50 Doksorubisin
: 6M
1/16 3,125 0,375
BHM (M) Dox ((M)
1/8 6,25 0,75
1/2
1/4 12,5 1,5
25 3
A. Viabilitas Sel BHM(M)
0 3,125 6,25 12,5 25
Dox(M)
0 100 95,80 96,85 80,54 50,71
0,375 72,39 67,39 64,73 53,55 9,20
0,75 69,05 63,87 67,14 53,86 5,93
1,5 58,55 58,12 57,07 26,87 5,99
3 50,09 51,20 47,87 11,12 5,44
Persamaan Garis Lurus : Doksorubisin : y = -27,182 + 70,811 (x = log konsentrasi) BHM : y = -131,64x + 274,26 (x = log konsentrasi) B. Konsentrasi Doksorubisin Tunggal 3,125 6,25 12,5 25
0,375 1,336 1,674 4,315 184,711
0,75 1,801 1,365 4,203 243,739
1,5 2,930 3,202 41,362 242,467
3 5,264 6,983 157,054 254,158
C. Konsentrasi BHM Tunggal 3,125 6,25 12,5 25
0,375 37,282 39,055 47,490 103,157
0,75 39,650 37,444 47,235 109,236
1,5 43,841 44,654 75,736 109,118
3 49,481 52,453 99,759 110,184
D. Combination Index 3,125 6,25 12,5 25
(BHM): 50M
0,375 0,364 0,384 0,350 0,244
0,75 0,495 0,716 0,443 0,232
1,5 0,583 0,608 0,201 0,235
65
3 0,633 0,549 0,144 0,239
LAMPIRAN 5 Data Perhitungan Viabilitas Sel T47D Perlakuan Senyawa 1-(4’-bromofenil) -3-(4-hidroksi-3-metoksifenil)-2-propen-1-on
Konsentrasi (M) 80 60 40 20 10 5 Kontrol Sel Kontrol Media
Absorbansi
Viabilitas Sel (%)
1
2
3
1
2
3
0,142 0,320 0,529 0,738 0,741 0,796 0,854 0,074
0,144 0,320 0,494 0,708 0,750 0,784 0,851 0,074
0,131 0,361 0,512 0,696 0,802 0,779 0,863 0,074
8,70 31,46 58,18 84,91 85,29 92,33
8,95 31,46 53,71 81,07 86,45 90,79
7,29 36,70 56,01 79,54 93,09 90,15
Rerata Viabilitas sel (%) 8,31 33,21 55,97 81,84 88,28 91,09 0,856 0,074
Harga koefisien determinasi (r2) perhitungan = 0,994, r = 0,997. Harga r tabel untuk taraf kesalahan 5%, n=6 adalah 0,811. r hitung> r tabel, sehingga nilai IC 50 dapat dihitung dari persamaan tersebut : y = -1,127x + 100,17 50= -1,127x + 100,17 x = 45 IC50 = 45 M
66
Standar Error 0,517 1,748 1,292 1,597 2,431 0,645
LAMPIRAN 6 Data Perhitungan Efek Penghambatan Proliferasi Sel T47D Perlakuan Senyawa 1-(4’-bromofenil) -3-(4-hidroksi-3-metoksifenil)-2-propen-1-on Jumlah sel T47D pada pengamatan jam 24, 48, dan 72 dengan perlakuan senyawa BHM dan tanpa perlakuan (kontrol) Jam
Kontrol
0 24 48 72
Jam
67,5 1 JUMLAH SEL RATA-RATA 5000,000 5399,543 13401,826 428,082 13858,447 507,991 11883,562 205,479
Kadar BHM (mM) 45 22,5 2 3 5045,662 2106,164 2106,164 313,927
5097,032 4914,384 7551,370 1906,393
5079,909 9452,055 12888,128 10724,886
Kontrol
0 24 48 72
Kadar BHM (M) 67,5 45 22,5 1 2 3 LOG JUMLAH SEL RATA-RATA 3,699 3,732 3,703 3,707 4,127 2,632 3,323 3,691 4,142 2,706 3,323 3,878 4,075 2,313 2,497 3,280
11,25 4
67
11,25 4 3,706 3,976 4,110 4,030
Jam
Kontrol
sel 2 x lipat Log jumlah sel Doubling time
Perlakuan Kontrol BHM 11,25 M BHM 22,5 M BHM 45 M BHM 67,5 M
Kadar BHM (M) 67,5 45 22,5 JUMLAH SEL RATA-RATA X 104 10000 10799 10091 10194 4,000 4,033 4,004 4,008 33,479
Persamaan garis y = 0,0048x + 3,8393 y = 0,0046x + 3,7893 y = -0,0046x + 3,8035 y = -0,0151x +3,7544 y = -0,0174x + 3,4733
68
Slope 0,0048 0,0046 -0,0046 -0,0151 -0,0174
11 10160 4,007 47
Nilai Doubling Time (Jam) 33,479 47,000 -
LAMPIRAN 7 Data Perhitungan Viabilitas Sel T47D Perlakuan Doksorubisin Absorbansi
Viabilitas Sel (%)
Konsentrasi (nM)
1
2
3
1
2
3
250 225 200 175 150 125 100 75 50 Kontrol Sel Kontrol Media
0,349 0,399 0,387 0,490 0,516 0,538 0,570 0,707 0,702 0,817 0,081
0,367 0,395 0,391 0,483 0,515 0,570 0,553 0,660 0,702 0,832 0,079
0,354 0,399 0,391 0,486 0,520 0,553 0,559 0,700 0,742 0,844 0,078
35,90 42,55 40,96 54,65 58,11 61,04 65,29 83,51 82,85
38,30 42,02 41,49 53,72 57,98 65,29 63,03 77,26 82,85
36,57 42,55 41,49 54,12 58,64 63,03 63,83 82,58 88,16
Rerata Viabilitas sel (%) 36,92 42,38 41,31 54,17 58,24 63,12 64,05 81,12 84,62 0,831 0,079
Harga koefisien determinasi (r2) perhitungan = 0,9526, r = 0,9760. Harga r tabel untuk taraf kesalahan 5%, n=9 adalah 0,666. r hitung> r tabel, sehingga nilai IC 50 dapat dihitung dari persamaan tersebut : y = -0,241x + 94,58 50 =-0,241x + 94,58 x = 185 IC50 = 185 nM
69
Standar Error 0,713 0,177 0,177 0,270 0,203 1,229 0,662 1,947 1,773
LAMPIRAN 8 Uji Sitotoksik Kombinasi Senyawa 1-(4’-bromofenil) -3-(4-hidroksi-3metoksifenil)-2-propen-1-on dan Doksorubisin pada Sel T47D Variasi Konsentrasi : IC50 1-(4’-bromofenil) -3-(4-hidroksi-3-metoksifenil)-2-propen-1-on IC50 Doksorubisin BHM (M) Dox (nM)
: 185 nM
1/16 2,8125 11,5625
1/8 5,625 23,125
1/4 11,25 46,25
1/2 22,5 92,5
E. Viabilitas Sel BHM(M) 0 2,8125 5,625 11,25 22,5
0 100 96,62 93,34 81,07 49,67
11,5625 99,34 98,38 84,25 71,33 46,74
Dox(nM) 23,125 96,01 87,18 85,31 61,33 26,35
46,25 70,67 67,95 63,15 36,65 9,39
92,65 49,12 33,87 28,37 5,50 5,15
Persamaan Garis Lurus : Doksorubisin : y = -0,241x + 94,58 (x = konsentrasi) BHM : y = -1,127x + 100,17 (x = konsentrasi) F. Konsentrasi Doksorubisin Tunggal 2,8125 5,625 11,25 22,5
11,5625 -15,79 42,86 96,48 198,49
23,125 30,71 38,46 137,96 283,11
46,25 110,52 130,42 240,38 353,49
92,65 251,90 274,73 369,62 371,08
G. Konsentrasi BHM Tunggal 2,8125 5,625 11,25 22,5
11,5625 1,584 14,126 25,592 47,405
23,125 11,528 13,185 34,461 65,501
46,25 28,593 32,848 56,364 80,551
92,65 58,827 63,709 84,000 84,313
H. Combination Index 2,8125 5,625 11,25 22,5
(BHM): 45M
11,5625 1,043 0,668 0,559 0,533
23,125 0,997 1,028 0,494 0,425
46,25 0,517 0,526 0,392 0,410
70
92,65 0,416 0,426 0,385 0,517
LAMPIRAN 9 Personalia Tenaga Peneliti Personalia yang terlibat dalam kegiatan ini adalah : No. Nama/NID
Instansi Asal Bidang Ilmu
1. Retno Arianingrum, M.Si FMIPA UNY /0015126803
2. Prof. Dr. Indyah Sulistyo FMIPA UNY Arty, M.S /0006045104
71
Alokasi Urain Tugas Waktu (jam/minggu) Biokimia 15 Jam Ketua Uji sitotoksik Uji aktivitas pemacuan apoptosis Uji Pengamatan Daur Sel Uji Ekspresi Protein Kimia Organik Farmasi
10 Jam
Anggota Uji sitotoksik
Publikasi pada “International Conference ICB Pharma II “Current Breakthrough in Pharmacy Material and Analyses”
72
73
Draf Paten Deskripsi PENGGUNAAN KOMBINASI DERIVAT KALKON BERSUBSTSITUEN BROMO DAN DOKSORUBISIN PADA PENGOBATAN KANKER PAYUDARA Bidang Teknik Invensi : Invensi ini berhubungan dengan penggunaan senyawa 1-(4’-bromofenil)-3-(4-hidroksi-3-metoksifenil)-2propen-1-on tunggal kemoterapi
dan kombinasinya dengan agen ko-
doksorubisin
sebagai
antikanker
pada
sel
kanker payudara. Latar Belakang Invensi Kanker payudara
merupakan
salah
satu
jenis
kanker penyebab kematian di dunia setelah kanker paruparu, perut, hepar, dan kolon dengan insidensi sebesar 502.000
kasus
(WHO,
2006).
Di
Indonesia,
pravalensi
kanker payudara menduduki peringkat ke-2 setelah kanker leher rahim dan merupakan penyebab kematian utama pada wanita. Dari semua kasus kanker pada wanita Indonesia, pada tahun 1991 kasus kanker payudara mencapai 17,77% (Tjindarbumi and Mangunkusumo, 2002). Beberapa
metode
dilakukan,
diantaranya
penyinaran
(radiasi).
untuk
pengobatan
pembedahan, Namun,
kanker
telah
kemoterapi
masing-masing
dan
metode
mempunyai kelemahan, sehingga tingkat keberhasilannya masih
rendah
(King,
2000).
Kegagalan
yang
sering
terjadi pada pengobatan melalui kemoterapi disebabkan karena
rendahnya
adanya
fenomena
selektivitas resistensi
sel
obat
anti
kanker
kanker
terhadap
dan agen
kemoterapi (drug-resistence) (Wong et al., 2006). Oleh karena
itu,
pengembangan
kanker,khususnya
kanker
dan
penemuan
payudara
diupayakan. 74
pengobatan
perlu
terus
Diantara menimbulkan
agen
kemoterapi
resistensi
adalah
kanker
yang
doksorubisin.
telah Senyawa
golongan antrasiklin ini diberikan pada berbagai jenis kanker.
Selain
menimbulkan
dapat
menyebabkan
jangka
panjang
resistensi,
kardiotoksisitas
(Ferreira
et
al.,
doksorubisin
pada
penggunaan
2008).
Salah
satu
alternatif untuk mengatasi resistensi adalah kombinasi agen
kemoterapi
dengan
agen
kemopreventif
sehingga
dapat meningkatkan keberhasilan terapi. Kalkon (1,3-difenilpropen-1-on) adalah jenis keton dengan
ikatan
tidak
jenuh
yang
telah
banyak
di
teliti sebagai senyawa terapetika, khususnya sebagai obat antitumor. Oleh karena
aktivitasnya sebagai ”high
therapeutic index”, kalkon di anggap sebagai ”the new era of medicines” dalam kapasitasnya sebagai antitumor, antibakterial, 2008).
dan
Disebutkan
anti-inflamatory pula
bahwa
(Afzal
sebagian
et
besar
al., target
utama dari senyawa-senyawa kalkon adalah mempengaruhi daur sel (Boumendjel et al., 2009). Shen et al, 2007 telah
membuktikan
bahwa
struktur
dasar
kalkon
(1,3-
difenilpropen-1-on) mampu menghambat aktivasi nuclear factor
kappa
tersebut
(NF-B).
menyebabkan
Penghambatan adanya
aktivasi
induksi
NF-B
apoptosis,
penghambatan siklus sel, dan menurunkan ekspresi Bcl-XL sebagai downstream target dari NF-B pada kultur sel kanker payudara
kandung MCF-7
kemih dan
T24
dan
MDA-MB-231
HT-1376, (Hsu
et
serta al.,
sel
2006).
Beberapa senyawa derivat kalkon yang mengandung gugus hidroksi pada posisi para seperti broussochalcone A; xanthoangelol
D;
butein;
isoliquiritigenin;
licochalcone A; isoliquiritigenin 2’-metil eter, dan xanthohumol juga mampu menghambat aktivasi NF-B (Yadav 75
et al., 2011). Penelusuran bahwa
beberapa
terhadap derivat
beberapa
kalkon
paten
telah
menunjukkan
digunakan
dalam
pengobatan kanker, seperti pada United States Patent US 6,498,195
B2
“Use
of
1-Propanone-1-(2,4-
dihydroxyphenyl)-3-hydroxy-hydroxyphenyl anticarcinogenic
agent”,
United
as
States
Patent
US
7,872,029 B2 “Chalcone and its analogs as agent for the inhibition of angiogenesis and related disease states”. Arty et al., (2013), telah mensintesis senyawa derivat
kalkon
bersubtituen
bromo,
yaitu
1-(4’-
bromofenil)-3-(4-hidroksi-3-metoksifenil)-2-propen-1-on (Gambar
1).
Senyawa
antioksidan
yang
ini
terbukti
memiliki
aktivitas
tinggi
dan
berpotensi
sebagai
antikanker pada sel kanker leher rahim. Invensi
ini
menggunakan
senyawa
1-(4’-
bromofenil)-3-(4-hidroksi-3-metoksifenil)-2-propen-1-on baik
tunggal
kemoterapi kanker
maupun
doksorubisin
payudara
dilakukan
kombinasinya
dengan
T47D. uji
dengan
sebagai
antikanker
Pengujian
sebagai
sitotoksik
bromida}. digunakan
Perhitungan Combination
(CI)
pada
sel
MTT
{3-
tetrazolium
sitotoksisitas Index
ko-
antikanker
menggunakan
(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenil
agen
kombinasi
(Reynols
and
Maurer,2005). Ringkasan Invensi Penggunaan
senyawa
1-(4’-bromofenil)-3-(4-
hidroksi-3-metoksifenil)-2-propen-1-on antikanker
baik
secara
tunggal
maupun
sebagai kombinasinya
dengan doksorubisin ini dilakukan untuk menghasilkan dosis yang efektif dalam mematikan sel kanker payudara.
76
Penggunaan senyawa ini dalam treatment meliputi tahapan berikut: a. Preparasi
senyawa
1-(4’-bromofenil)-3-(4-
hidroksi-3-metoksifenil)-2-propen-1-on doksorubisin aktivitas
(produk
Kalbe
sitotoksik
dimana
dan
Farma)
untuk
senyawa
uji
tersebut
dilarutkan dalam DMSO (Dimetilsulfoksida). b. Pengujian
aktivitas
sitotoksik
senyawa
baik
tunggal maupun kombinasinya dengan doksorubisin terhadap sel T47D (ATCC) menggunakan metode MTT dan
perhitungan
kombinasi
dosis
efektif
menggunakan Combination Index (CI) (Reynols and Maurer,2005). Uraian Singkat Gambar Gambar 1 memperlihatkan struktur senyawa
1-(4’-
bromofenil)-3-(4-hidroksi-3-metoksifenil)-2-propen-1-on atau
3-(4’-hidroksi-3’-metoksifenil)-1-fenil-2-propen-
1-on). Gambar
2
memperlihatkan
hubungan
konsentrasi
senyawa 1-(4’-bromofenil)-3-(4-hidroksi-3-metoksifenil)-2propen-1-on dengan % viabilitas sel T47D Gambar
3
memperlihatkan
hubungan
konsentrasi
doksorubisin dengan % viabilitas sel T47D Uraian Lengkap Invensi a. Preparasi senyawa 1-(4’-bromofenil)-3-(4-hidroksi3-metoksifenil)-2-propen-1-on Senyawa
1-(4’-bromofenil)-3-(4-hidroksi-3-
metoksifenil)-2-propen-1-on DMSO
hingga
konsentrasi
dilarutkan 100.000
dalam
pelarut
mikromolar
sebagai
larutan induk. Selanjutnya dibuat variasi konsentrasi 77
5; 10; 20; 40; 60; dan 80 mikromolar dengan menggunakan media kultur (MK). Media kultur yang digunakan dibuat dari:
(1)
Penisilin-streptomisin
(Penstrep)
2%.
(2)
Fetal Bovine Serum (FBS) 10%, dan (3) Fungizon 0,5% dilarutkan hingga 100 ml dengan medium Rosewell Park Memorial Institut (RPMI) 1640 (GIBCO BRL) yang dibuat dengan melarutkan 10,4 g RPMI ditambah NaHCO3 2,2 g; Hepes
2
g
dilarutkan
dengan
akuabides
steril
dan
dikondisikan pada pH 7,2 – 7,4, ditambahkan akuades hingga volume akhir 1 liter. Selanjutnya disterilisasi dengan filter 0,2 mikron. Senyawa
doksorubisin
dilarutkan
dengan
media
kultur yang sama dengan variasi konsentrasi 50; 75; 100; 125; 150; 175; 200; 225 dan 250 nanomolar. Variasi konsentrasi senyawa 1-(4’-bromofenil)-3-(4-hidroksi-3metoksifenil)-2-propen-1-on kombinasi
sebesar
:
yang
2,8125;
digunakan
5,625;
11,25;
untuk
dan
22,5
mikromolar, sedangkan konsentrasi doksorubisin sebesar : 11,5625; 23,125; 46,25; dan 92,5 nanomolar. b. Uji aktivitas sebagai antikanker pada sel kanker payudara Sel
dengan
didistribusikan
konsentrasi ke
dalam
1 plate
x
104 96
sel/sumuran sumuran
dan
diinkubasi selama 24 jam untuk beradaptasi dan menempel di sumuran. Keesokannya ditambahkan
100 μl
media
media
kultur
diambil
kemudian
yang
mengandung DMSO 0,1% (kontrol) atau sampel, inkubasi selama 24 jam. Pada akhir inkubasi, media kultur yang mengandung sampel dibuang, dicuci dengan 100 mikroliter PBS (Phospate Buffer Saline). Kemudian ke dalam masingmasing sumuran ditambahkan 100 mikroliter media kultur yang mengandung MTT 5 mg/ml, inkubasi lagi selama 4 jam 78
pada suhu 37°C. Sel yang hidup akan bereaksi dengan MTT membentuk jam,
kristal
media
ditambahkan formazan.
yang
formazan
mengandung
larutan
Digoyang
berwarna
SDS di
MTT
untuk
atas
ungu.
Setelah
dibuang,
kemudian
melarutkan
shaker
selama
4
kristal 10
menit
kemudian dibaca dengan dengan ELISA reader pada panjang gelombang 595 nm. Data yang diperoleh pembacaan ELISA reader berupa absorbansi masing-masing sumuran dikonversi ke dalam persen viabilitas sel. Persentase viabilitas sel dihitung menggunakan rumus: Absorbansi sel dengan perlakuan-absorbansi kontrol media
X 100%
Absorbansi kontrol sel – absorbansi kontrol media
Data yang berupa viabilitas sel kemudian dianalisis dengan membuat grafik log konsentrasi versus viabilitas sel. Nilai IC50 merupakan konsentrasi yang menyebabkan penghambatan pertumbuhan 50% dari populasi sel sehingga dapat diketahui potensi sitotoksisitasnya (Doyle and Griffiths, 2000). Sitotoksik kombinasi ditetapkan dengan menghitung indeks interaksi antara doksorubisin dengan senyawa 1(4’-bromofenil)-3-(4-hidroksi-3-metoksifenil)-2-propen1-on menggunakan persamaan : Combination Index/CI = (D)1/(Dx)1
+
(D)2/(Dx)2
D1 dan D2 adalah konsentrasi sampel yang digunakan dalam perlakuan kombinasi. (Dx)1 dan (Dx)2 adalah konsentrasi tunggal yang dapat menghasilkan efek sebesar yang ditimbulkan perlakuan kombinasi (Reynols and Maurer,2005). Angka CI yang diperoleh diinterpretasikan sebagaimana Tabel 1. Potensi ketoksikan senyawa 1-(4’-bromofenil)-3(4-hidroksi-3-metoksifenil)-2-propen-1-on terhadap sel 79
T47D disajikan pada Gambar 3, yaitu memiliki nilai IC50 sebesar
45
Sedangkan pada
mikromolar
potensi
Gambar
4,
yang
berarti
ketoksikan memiliki
sangat
doksorubisin
nilai
IC50
aktif.
disajikan
sebesar
185
nanomolar. Tabel 1. Interpretasi Nilai Indeks Kombinasi (CI) Nilai CI < 0,1 0,1 - 0,3 0,3 - 0,7 0,7 - 0,9 0,9 - 1,1 1,1 - 1,45 1,45 - 3,3 > 3,3 (Reynols and Maurer,2005) Uji
sitotoksik
senyawa
Interpretasi sinergi sangat kuat sinergis kuat sinergis sinergis ringan-sedang mendekati aditif antagonis ringan-sedang antagonis antagonis kuat-sangat kuat
kombinasi
doksorubisin
dan
1-(4’-bromofenil)-3-(4-hidroksi-3-
metoksifenil)-2-propen-1-on
terhadap
sel
T47D
pada
konsentrasi senyawa 1-(4’-bromofenil)-3-(4-hidroksi-3metoksifenil)-2-propen-1-on 11,25;
dan
22,5
sebesar
mikromolar,
2,8125;
sedangkan
5,625;
konsentrasi
doksorubisin sebesar : 11,5625; 23,125; 46,25; dan 92,5 nanomolar. Kombinasi kedua senyawa ini mampu menurunkan viabilitas sel lebih rendah daripada penggunaan senyawa 1-(4’-bromofenil)-3-(4-hidroksi-3-metoksifenil)-2propen-1-on
maupun
doksorubisin
sebagaimana ditunjukkan pada
80
secara
Tabel 2 .
tunggal
Tabel 2. Persen viabilitas sel perlakuan kombinasi senyawa 1-4’-bromofenil)-3-(4-hidroksi-3metoksifenil)-2-propen-1-on dan doksorubisin pada berbagai variasi konsentrasi. Viabilitas sel (%) pada variasi konsentrasi: 1-4’bromofenil)-3(4-hidroksi-3metoksifenil)2-propen-1-on (M)
0 2,8125 5,625 11,25 22,5
Berdasarkan terlihat
bahwa
0 100 96,62 93,34 81,07 49,67
perhitungan pada
Doksorubisin (nM) 11,5625 23,125 46,25 99,34 96,01 70,67 98,38 87,18 67,95 84,25 85,31 63,15 71,33 61,33 36,65 46,74 26,35 9,39 nilai
kombinasi
CI
(Tabel
senyawa
3),
1-(4’-
bromofenil)-3-(4-hidroksi-3-metoksifenil)-2-propen-1-on dengan konsentrasi sebesar 2,8125; 5,625; 11,25; dan 22,5 mikromolar, dan konsentrasi doksorubisin sebesar : 11,5625; 23,125; 46,25; dan 92,5 nanomolar memberikan interprestasi antara mendekati aditif (0,9 – 1,1) pada konsentrasi Dari
kombinasi
hasil
ini
rendah
membuktikan
dan
sinergi
bahwa
(0,3-0,7).
senyawa
1-(4’-
bromofenil)-3-(4-hidroksi-3-metoksifenil)-2-propen-1-on berpotensi untuk digunakan sebagai agen ko-kemoterapi doksorubisin pada pengobatan kanker payudara. Kombinasi yang
efektif
penggunaan
dalam
senyawa
mematikan
sel
T47D
adalah
pada
1-(4’-bromofenil)-3-(4-hidroksi-3-
metoksifenil)-2-propen-1-on
sebesar
11,25
dan doksorubisin sebesar 92,65 nanomolar.
81
mikromolar
92,65 49,12 33,87 28,37 5,50 5,15
Tabel 3.
Hasil perhitungan nilai CI pada perlakuan kombinasi senyawa 1-(4’-bromofenil)-3-(4hidroksi-3-metoksi-fenil)-2-propen-1-on dan doksorubisin pada berbagai variasi konsentrasi.
Nilai CI pada perlakuan kombinasi: 1-4’-bromofenil)-3(4-hidroksi-3metoksifenil)-2propen-1-on (M) 2,8125 5,625 11,25 22,5
Doksorubisin (nanomolar)
11,5625 1,0 0,7 0,6 0,5
82
23,125 1,0 1,0 0,5 0,4
46,25 0,5 0,5 0,4 0,4
92,65 0,4 0,4 0,4 0,5
Klaim 1. Penggunaan senyawa
1-4’-bromofenil)-3-(4-hidroksi-
3-metoksifenil)-2-propen-1-on
sebagai
antikanker
pada sel kanker payudara T47D dengan IC50 sebesar 45 mikromolar. 2. Penggunaan kombinasi senyawa 1-4’-bromofenil)-3-(4hidroksi-3-metoksifenil)-2-propen-1-on 11,25
mikromolar
dan
doksorubisin
sebesar
sebesar
nanomolar sebagai antikanker pada sel payudara.
92,65
83
Abstrak PENGGUNAAN KOMBINASI DERIVAT KALKON BERSUBSTSITUEN BROMO DAN DOKSORUBISIN PADA PENGOBATAN KANKER PAYUDARA
Invensi ini berhubungan dengan penggunaan senyawa derivat
kalkon
1-(4’-bromofenil)-3-(4-hidroksi-3-
metoksifenil)-2-propen-1-on kombinasinya sebagai
dengan
antikanker
Senyawa
agen
baik
ko-kemoterapi
pada
sel
kanker
dan
doksorubisin
payudara
T47D.
1-(4’-bromofenil)-3-(4-hidroksi-3-
metoksifenil)-2-propen-1-on dilarutkan Senyawa
tunggal
dalam
ini
antikanker
media
secara dengan
kultur
tunggal IC50
dan yang
dapat
sebesar
doksorubisin
mengandung digunakan
45
DMSO.
sebagai
mikromolar,
dan
dikombinasikan dengan doksorubisin dengan dosis efektif pada
penggunaan
senyawa
1-(4’-bromofenil)-3-(4-
hidroksi-3-metoksifenil)-2-propen-1-on
sebesar
11,25
mikromolar dan doksorubisin sebesar 92,65 nanomolar.
84
FBr
HO
CH3OHO O
Gambar 1
IC50 = 45 M
Gambar 2
IC50 = 185 nM
Gambar 3
85
Manuscripts for Asian Pasific Journal of Tropical Biomediicine
Cytotoxic and apoptotic effects of a chalcones derivative with bromo substituent on HeLa cells Retno Arianingrum*, Indyah Sulistyo Arty Department of Chemistry Education, Faculty of Mathematics and Natural Science, Universitas Negeri Yogyakarta, Yogyakarta, Indonesia ABSTRACT Objective: To investigate the cytotoxic effect, apoptosis induction, and Bcl-2 expression of a chalcone derivate 1-(4’-bromophenyl)-3-(4-hydroxy-3methoxyphenyl)-2-propene-1-on against human cervix cancer HeLa cell lines. Methods: The cytotoxic effect was analyzed using MTT [3-(4,5 dimethyltiazol-2-yl)-2,5diphenyltetrazoilium bromide] assay, the apoptotic effect was determined by Annexin-V flowcytometry method, and the expression of Bcl-2 was identified using immunocytochemistry method. Results: The research results showed that the IC50 of 1-(4’-bromophenyl) -3-(4hydroxy-3-methoxyphenyl)-2-propene-1-on was 53 M, and it increased the apoptotic induction and decreased the Bcl-2 expression level. Conclusion: According to the result, this compound is potential to be developed as chemotherapeutic agent for cervix cancer by inducing apoptosis. Keywords:
1-(4’-bromophenyl)-3-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-2-propene-1-on ,cytotoxic effect, apoptosis induction, Bcl-2 expression, HeLa cancer cells
1. Introduction Cancer is the second most fatal disease after heart attack. Cervix cancer is one type of cancer that has high prevalence and the first most common cancer worldwide which causes mortality [1]. In Indonesia, cervical cancer is the first most frequent one in women [2]. Current cancer therapies (surgery, radiation, immunotherapy, and chemo-therapy) [3] lead to undesired physical and psychological distress to the patients. So that researches on finding new anticancer compounds that have better therapeutic efficacy and fewer side-effects are still needed. Chalcones (trans-1,3-diaryl-2-propen-1-ones)4, a biosynthetic product of the shikimate pathway, belonging to the flavonoid family are precursors of open chain flavonoids and isoflavonoids, which are abundant in edible plants. Synthetic chalcones can be prepared by an aldol condensation between a benzaldehyde and acetophenone in the presence of strong bases. There are also some reports of acidcatalyzed aldol condensations5. Chalcones and their derivates have attracted increasing attention due to their numerous pharmacological applications. They have displayed a broad spectrum of pharmacological activities, one of them being anti-cancer6-10. Many chalcones and their derivates have been shown to induce 86
apoptosis in different types of cancer cells through a wide variety of mechanisms. These compounds have a common target, the Bcl-2 protein, which can induce apoptosis in cancer cells11-14. A chalcone derivate compound, 1-(4’-bromophenyl)-3-(4-hydroxy-3methoxyphenyl)-2-propene-1-on (Figure 1) , was synthesized by reaction between vanilin and 4-bromoacetofenon through a cross-aldol condensation reaction under acidic conditions15. Our previous research has reported that this compound has antioxidant and cytotocix activity on HeLa cells (no publish). However, there has been no research on how it affects apoptosis and Bcl-2 protein expression in HeLa cells. In this study, the effects of cytotoxicity, apoptosis induction and Bcl-2 expression of 1-(4’-bromophenyl)-3-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-2-propene-1on were investigated. This study is useful for further development of this compound as medicine in the treatment of cervix cancer. FBr
HO
CH3OHO O
Figure 1. The structure methoxyphenyl)-2-propene-1-on
of
1-(4’-bromophenyl)-3-(4-hydroxy-3-
2. Materials and methods 2.1 Materials The compound, 1-(4’-bromophenyl)-3-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-2propene-1-on, was produced through a cross-aldol condensation reaction of vanillin and bromoacetofenon in an acidic condition. The compound was used as a stock solution with concentration of 100 mg/ml in dimethylsulfoxide (DMSO). The final concentration of DMSO in the study wells was kept less than 0.1%. 2.2 Cell culture and cytotoxic assay HeLa cervical cancer cells were obtained from the collection of the Laboratory of Parasitology, Faculty of Medicine, Universitas Gadjah Mada (UGM). Cells were grown in medium culture RPMI (Rosewell Park Memorial Institut) from Gibco containing 10% FBS (Fetal Bovine Serum, Gibco) and 1% penicillin-streptomycin (Gibco) at 37oC in a humidified atmosphere of 5% CO2/95% air. Tripsin-EDTA 0.025% (Gibco) was used to detach cells on the flask. A cytotoxic assay was performed using [3-4, 5 dimetiltiazol-2-yl)-2,5 difeniltetra-zoilium bromide] (MTT) colorimetric assay. T47D cells were seeded at a density of 5x103 cells / well and allowed to attach for 24 hours in a humidified 87
incubator at 37oC. One day after initial seeding, the cells were treated with various concentrations of 1-(4’-bromophenyl)-3-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-2propene-1-on. After 24 hours incubation, the culture medium was removed and the cells were washed with 100 L Phosphate Buffered Saline (Sigma). Then, 100 L of MTT (Sigma Chemical, St. Louis, MO, USA) solution (0.5 mg/ml diluted with DMEM medium) was added to each well, followed by incubation for 4 h at 37oC. Viable cells react with MTT to produce purple formazan crystals. Then, 100 L stopper reagent (10% Sodium dodecyl sulphate from Sigma Chemical, St. Louis, MO, USA in 0.01M HCl) was added to dissolve the formazan crystal. The cells were incubated for 12 hours (overnight) at room temperature and protected from light. The absorbance of each well was measured using ELISA reader (BioRad) at λ 595 nm. The absorbance was converted to a percentage of viable cells18. The IC50 concentration was calculated by the concentration that caused 50% inhibition of cell growth19. Calculations of the IC50 value were done using the linear regression of concentration versus cell viability.
2.3 Apoptosis Analysis HeLa cells were seeded on a six tissue culture well-plate at 5 x 105 cells per well. After 24 hours incubation the cells were treated with various cincentration of 1-(4’-bromophenyl)-3-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-2-propene-1-on. After incubation the cells were removed using 0.25% trypsine solution and then spinned at 2000 rpm for 3 minute, and then washed twice with cold PBS. The cells were re-suspended in 500 l of Annexin V buffer (Roche) and then treated with Annexin V and propidium iodide (PI) for 10 minutes at room temperature and protected from light. The treated cells were subjected to a FAC-Scan flowcytometer. Bivariant analysis of FITC-fluorescence (FL-1) and PI-fluorescence (FL-3) gave different cell populations where the phenotype of FITC (-) and PI (-) were designed as viable cells, while the FITC (+) and PI (-) as early apoptotic cells; the FITC (-) and PI (+) as necrotic cells; and the FITC (+) and PI (+) as late apoptotic cells. 2.4 Immunocytochemistry method HeLa cells were seeded on the coverslips of a 24 well-plate at 5 x 104 cells per well and incubated for 24 hours (or until 80% confluent). The medium in each well was then replaced by the fresh medium containing various concentrations of 1-(4’-bromophenyl)-3-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-2-propene-1-on and then placed in a humidified incubator at 37 ˚C within an atmosphere of 5% CO2 and 95% air for 24 hours. The cells were then harvested and were washed with PBS and fixed with cold methanol for 10 minutes at -4°C freezer. After that, the cells in coverslips were placed each on a respective slide. The cells were washed with PBS and distilled water, then were blocked in a hydrogen peroxide blocking solution for 10 minutes at room temperature. They were again washed with PBS, and then incubated with pre-diluted blocking serum for 10 minutes at room temperature. Next, the cells were stained with primary Bcl-2 antibody for 1 hour at room temperature. After three time-washing with PBS, the secondary antibody 88
was applied for 15-20 min, and then washed with PBS three times. The slides were incubated with streptavidin-biotin complex for 10 minutes, and then washed with PBS three times. The slides were incubated in DAB (3, 3 diaminobenzidine) solution for 3-5 minutes and washed with distilled water. Cells were counterstained with Mayer-Haematoxilin reagent for 3-4 minutes. After incubation, the coverslips were washed with distilled water and then immersed in absolute ethanol and in xylol afterward. The protein expression was assessed under a light microscope. Cells which with expression give a dark brown color in the cell membrane, while the cells with no expression will give purple color. 3. Results 3.1 The cytotoxic effect of 1-(4’-bromophenyl)-3-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)2-propene-1-on on HeLa cells The cytotoxic activity of 1-(4’-bromophenyl)-3-(4-hydroxy-3methoxyphenyl)-2-propene-1-on was presented in Figure 2. The results indicated that the compound showed growth inhibitory effect on HeLA cells in dose dependent manner. Based on linear regression between concentration and cell viability percentage (p<0.05), IC50 of the compound is 53 M. (A)
(B)
(C)
(D)
Figure 2. The cytotoxic effect of 1-(4’-bromophenyl)-3-(4-hydroxy-3methoxyphenyl)-2-propene-1-on HeLa cells was determined using MTT assay. The studies were conducted by incubating 5x103 cells in 96 well plates for 24 hours in RPMI medium without or with 1-(4’-bromophenyl)-3-(4hydroxy-3-methoxyphenyl)-2-propene-1-on treatments of 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65 and 70 M. The profile of cell viability is expressed in 89
mean ± SD from three experiments (A). The morphological changes and cell populations under the treatment of the compound concentrations of 0 M or control (B) were compared to that of 20 M (C) and 60 M (C). The bold arrow indicates normal living cells, whereas the dashed arrows indicate the cell morphology changes. The cell morphology was observed using inverted microscope with 100x magnification.
3.2 The 1 -(4’-bromophenyl)-3-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-2-propene-1-on effect on apoptosis induction The effect of 1 -(4’-bromophenyl)-3-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-2propene-1-on treatment on HeLa cells apoptosis determined using flowcytometric method. The result showed that the compound induced the HeLa cell apoptosis at early and late phases of cell apoptosis as shown in Figure 3.
Figure 3.
The effect of 1 -(4’-bromophenyl)-3-(4-hydroxy-3methoxyphenyl)-2-propene-1-on treatment on apoptotic induction of HeLa cells. The cells were seeded at 5x105 cells/well on six wells tissue culture plate, then treated with the compound concentrations of 0, ¼ IC50, ½ IC50, and IC50. After 24 hours incubation, cell were harvested as described in the methodology, added with AnnexinV and PI reagents, were then subjected to FACS flowcytometer.
3.3 The effect of 1 -(4’-bromophenyl)-3-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-2propene-1-on treatment on Bcl-2 expression To confirm the apoptosis mechanism of 1-(4’-bromophenyl)-3-(4-hydroxy3-methoxyphenyl)-2-propene-1-on, a study on the effect of the compound on the expression of Bcl-2 was conducted using an immunocytochemistry method. Bcl-2 is a protein which suppresses cell apoptosis. Interestingly, the expression of Bcl2 of the compound treated cells was lower compared to that of the control cells (Figure 4). These data showed that 1-(4’-bromophenyl)-3-(4-hydroxy-3methoxyphenyl)-2-propene-1-on has potency to induce cell apoptosis by suppressing the Bcl-2 expression. 90
(A)
(B)
(C)
Figure 4. The expression of Bcl-2 on HeLa cells was determined using immunocytochemistry method. (A) is the control cells without antibody, (B) control cell with Bcl-2 Ab, and (C) 1-(4’-bromophenyl)-3-(4-hydroxy-3methoxyphenyl)-2-propene-1-on 12,5 M. The experiment used DAB as the chromogen. Dark brown staining in cell’s cytoplasm and mitochondria membrane indicated the positive expression of Bcl-2. Cells which showed purple colour after counterstained with Mayer-Haematoxilin indicated negative expression of Bcl-2. The bold arrow indicates the positive expression, whereas the dashed arrows indicate the negative expression of the protein. 4. Discussion The research results showed that 1-(4’-bromophenyl)-3-(4-hydroxy-3methoxyphenyl)-2-propene-1-on compound has anticancer potency, especially through its inhibition on the cell proliferation. It has cytotoxic effect to human cervical cancer cell-lines HeLa with IC50 of 53 M. Prayong20 mentioned that compound with IC50 less than 100 µM is potentially to be developed as anticancer agent. The cytotoxic effect of the compound could be related with its ability to accelerate the cell apoptosis, as shown by the data that the compound induced apoptosis in HeLa cells. Apoptosis is a programmed-cell death which is characterized by changes on cell morphology, membrane blabbing and chromatine21. In this study, the characteristic changes of cell morphology, such as cell shrinking, nuclear fragmentation, and cell apoptosis were more extensive after the treatment with 1(4’-bromophenyl)-3-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-2-propene-1-on (Figure 1). The flowcytometry analysis showed that treatment with the compouns at 12,5 M increased the cell death from 4.4% to 11.07%, and increased up to 39.81% after treatment with 25 M, and increased up to 72.42% with 50 M These data indicated that the compound is able to induce apoptosis. Ability in inducing apoptosis on cancer cells is an important property for a prospective anticancer drug because cancer cells generally are capable to evade apoptosis. Apoptosis process occurs via various mechanisms. NF-B protein inhibits apoptosis through increasing transcription of Bcl-2 that prevents the release of cytochrome c by Bax in mitochondria22. The inhibition of NF-B also causes decreasing of Bcl-2 and Bcl-XL expressions, two main anti apoptotic proteins. The study showed that the 1-(4’-bromophenyl)-3-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)91
2-propene-1-on treatment decreased the level of Bcl-2 which in turn induced the HeLa cell’s apoptosis. Some references stated that the main structure of chalcones, that is 1,3diphenyl-2-propenone, has been proven to have a chemopreventive effect on human breast cancer cell lines of MCF-7 and MDA-MB-23123 and human bladder cancer cell lines of T24 and HT-137624. It was showed to inhibit the proliferation of T24 and HT-1376 cells by inducing apoptosis and blocking cell cycle progress at G2/M phase. It significantly increased the expression of p21 and p27 proteins, and decreased the levels of cyclin B1, cyclin A and Cdc2, which contribute the cell cycle arrest. Moreover it increased the expression of Bax and Bak, and decreased the levels of Bcl-2 and Bcl-XL which subsequently triggered mitochondrial apoptotic pathway via releasing cytochrome c and activating caspase-9 and caspase-3. Chalcone has also an inhibitor activity to Nuclear factor kappa B (NF-κB) at concentration of 50 M. NF-κB is a transcription factor that plays a major role in development and progression of cancer because it regulates more than 400 genes involved in inflammation, cell survival, cell proliferation, invasion, angiogenesis, apoptosis, cell cycle and metastasis 25. The study’s compound, 1-(4’-bromophenyl)-3-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-2propene-1-on, is a chalcone derivate that has -3’ methoxy , 3 bromo, and -4’ hydroxyl phenyl moieties. Base on the references, those structure modifications still retain the cytotoxic activity of chalcones. It was showed that increased apoptosis induction via suppressing Bcl-2 level in HeLa cells. So that 1-(4’bromophenyl)-3-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-2-propene-1-on may have potential effects on the NF-κB survival system which play important roles in the anti-proliferative activity on the HeLa cells. The detail molecular mechanism of the apoptotic induction is still needs to be explored. Conflict of interest statement We declare that we have no conflict of interest Acknowledgments We gratefully thanks to DP2M DIKTI (Directorate of Higher Education) Ministry of Education Indonesia through “Hibah Bersaing”Research Grant 2015 for financial support in this study. References [1]
American Cancer Society. Cancer Facts & Figures 2012. Atlanta: American Cancer
Society; 2012. Page 9
[2] [3] [4]
[5]
Tjindarbumi, D. and Mangunkusumo, R. 2002. Cancer in Indonesia, Present and Future. Jpn. J. Clin. Oncol. 32 (Supplement 1): S17-21. King, R. J. B., 2000, Cancer Biology, Pearson Education, Second Edition, England. p.1-7,228-231, 263-264 Wong, H.L., Bendayan, R., Rauth, A.M., Xue, H.Y., Babakhanian, K., and Wu, X.Y. 2006. A Mechanistic Study of Enhanced Doxorubicin Uptake and Retention in Multidrug Resistant Breast Cancer Cells Using A PolymerLipid Hybrid Nanoparticle System. The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics, 317 (3), 1372-1381 Davis, J.M., Navolanic, P.M., Weinstein-Oppenheimer, C.R., Steelman, L.S., Wei, H., Konopleva, M., Blagosklonny, M.V., and McCubrey, J.A., 92
[6]
[7]
[8]
2003, “Raf-1 and Bcl-2 Induce Distinc and Common Pathways That Contribute to Breast Cancer Drug Resistantce”, Clin. Cancer Res.9:11611170. Ferreira, A.L.A., Matsubara, L.S., and Matsubara, B.B. 2008. Anthracycline-Induced Cardiotoxicity, Cardio-vascular & Hematological Agents in Medical Chemistry. 6. 278-281. Afzal S., Asad M. K, Rumana Q. F, Ansari, Muhammad F. N, and Syed S. S. 2008. Redox Behavior of Anticancer Chalcone on a Glassy Carbon Electrode and Evaluation of its Interaction Parameters with DNA, Int. J. Mol. Sci. 2008, 9, 1424-1434 Boumendjel A, Ronot X, Boutonnat. 2009 . Chalcone derivatives acting as cell cycle blockers : potensial anticancer drugs ? J Curr Drug Targets. Apr;10(4):363-71.
[9]
[10] [11]
[12]
[13]
[14] [15]
[16]
[17]
[18]
[19]
Shen, K.H, Chang, JK, Hsu, Y.L, and Kuo, P.L., 2007, “Chalcone Arrests Cell Cycle Progression and Induces Apoptosis Through Induction Mitochondrial Pathway and Inhibition of Nuclear Faktor Kappa B Signaling in Human Bladder Cancer Cells”, Basic Clin Pharmacol Toxicol, 101 : 25461 Pahl, H.L., 1999, “Activators and Target Genes of Rel/NF-κB Transcription Factors”, Oncogene 18 6853–6866. Hsu, Y.L., Kuo, P.L., Tzeng, W.W., and Lin, C.C., 2006, Chalcone Inhibits the Proliferation of Human Breast Cancer Cell by Blocking Cell Cycle Progression and Inducing Apoptosis. Food Chem Toxicol. 44 (5):704-13 Guttridge, D.C., Albanese, C., Reuther, J.Y., Pestell, R.G., and Baldwin, Jr. A.S., 1999, “NF-κB Controls Cell Growth and Differentiation Through Transcriptional Regulation of Cyclin D1”, Mol. Cell. Biol., 19, 5785 - 5799. Hinz, M., Krappmann, D., Eichten, A., Heder, A.,, Scheidereit, C., and Strauss, M., 1999, “NF-κB Function in Growth Control: Regulation of Cyclin D1 Expression and G0/G1-to-S-Phase Transition”, Mol. Cell. Biol., 19, 2690 - 2698. Arty SA. Synthesize and cytotoxic test of several compounds of mono para hydroxy Chalcones. Indo J. Chem 2010; 10 (1) 110-115 Arianingrm, R., Arty, I. S., dan Atun, S. 2010. Uji Sitotoksisitas Senyawa Mono Para Hidroksi Kalkon terhadap Cancer cell lines T47D, Saintek, 16 (2) : 121 -132 Arianingrum R, Sunarminingsih R, Meiyanto E, Mubarika S. Potential of a chalcone derivate compound as cancer chemoprevention in breast cancer. IPCBEE 2012; 38: 41-45 Arianingrum R, Sunarminingsih R, Meiyanto E, Mubarika S. Cytotoxic effect of para hydroxyl chalcone (pHmMC) on MCF-7 breast cancer cells by inducing cell arrest and apoptosis. 2ndICRIEMS proceedings 2015; C11:89-95 Mosmann T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays. J. Immunol Methods 1983; 65: 55-63 Doyle A, Griffith JB. Cell and tissue culture for medical research. New 93
[20]
[21]
[22]
[23] [24]
[25]
York: John Willey and Sons Ltd. 2000 Reynold, C.P. and Meurer, B.J. 2005. Evaluating Response to Antineoplastic Drug Combination in Tissue Culture Models. Methods Mol. Med. 110, 173-183 Di Leo A, Tanner M, Desmed C, Paesman M, Cardoso F, Durbecq V,et al. p-53 gene mutations as a predictive marker in a population of advanced breast cancer patients randomly treated with doxorubicin or docetaxel in the context of a phase III clinical trial. Ann Oncol 2007; 18: 997-1003. Vayssade M, Haddada H, Faridoni-Laurens L, Tourpin S, Valent A, Benard J, et al. p73 functionally replaces p53 in adriamycin-treated, p53-deficient breast cancer cells. Int J Cancer 2005; 116(6): 860-869. Rudin CM, Thompson CB. Regulation and clinical relevance of programmed cell death. Annu Rev Med 1997; 48: 267-281. Simstein R, Burow M, Parker A, Weldon C, Beckman B. Apoptosis, chemoresistance, and breast cancer: Insights from the MCF-7 cell model system. Exp Biol Med 2003;101:995-1003 Yadav VR, Prasad S, Sung B, Anggarwal BB. The role of chalcones in suppression of NF-kB-mediated inflammation and cancer. International Immunopharmacology 2011; 11 (3) : 295-309
94
