Kvantitativní proteomická analýza Martin Hubálek
Kvantifikace proteinů • Většinou pouze relativní srovnání odezvy mezi dvěma experimenty, případně mezi experimentem a standardem • Množství proteinu bývá odvozeno z množství jednoho nebo více peptidů z proteinové sekvence • Založené na porovnání výšky nebo plochy píku • Peptidu(s) m/z (MS úroveň – MS1) • Fragmentu peptidu m/z (MS/MS úroveň – MS2)
– Důležitý výběr peptidu • Proteotypický peptid
Kvantifikace proteinů Stabilní Izotopové značení
Bezznačková (Label‐free)
2‐DE
( stable isotope labelling) MS1
MS2
Cílená
SRM
Data Independent Analysis (DIA) SWATH
Metabolické
Chemické
SILAC 14N/15N
medium
N‐term MS1 mTRAQ Dimethyl
C‐term MS2 iTRAQ TMT
Aminokyselina
Esterifikace 16O/18O
inkorporace
Lys (iTRAQ) Cys (ICAT) Trp
Proteotypický peptid • Peptidy, které je možné zaznamenat pomocí LC‐ MS – – – –
Štěpitelné použitou proteázou (nejčastěji trypsin) Bez možných variabilních modifikaci (Met, Trp) Správná retence na C18 Ionizace v nanoESI +
• Peptidy, které jsou specifické pro stanovovaný protein ve směsi s ostatními proteiny – Prohledání sekvence proti všem dostupným proteinovým sekvencím
PEPTIDERANK
http://wlab.ethz.ch/peptiderank/#home
• Predikce proteotypických peptidů MKSINILSFLLLSSTLSLVAFARSFTSENPIVLPTTCHDDDNLVLPEVYDQDGNPLRIGERY IINNPLLGAGAVYLYNIGNLQCPNAVLQHMSIPQFLGEGTPVVFVRKSESDYGDVVRVMTVV YIKFFVKTTKLCVDQTVWKVNDEQLVVTGGKVGNENDIFKIMKTDLVTPGGSKYVYKLLHCP SHLGCKNIGGNFKNGYPRLVTVDDDKDFIPFVFIKA
Bezznačkové metody
Kvantifikace proteinů Stabilní Izotopové značení
Bezznačková (Label‐free)
2‐DE
( stable isotope labelling) MS1 Cílená
SRM
MS2 Data Independent Analysis (DIA) SWATH
Metabolické
Chemické
SILAC 14N/15N
medium
N‐term MS1 mTRAQ Dimethyl
C‐term MS2 iTRAQ TMT
Esterifikace 16O/18O
inkorporace
Aminokyselina Lys (iTRAQ) Cys (ICAT) Trp
Selected Reaction Monitoring (SRM)
http://www.nature.com/nmeth/journal/v9/n6/images/nmeth.2015‐F1.jpg
Selected Reaction Monitoring (SRM) • Cílený přístup – Výběr prekursoru (Peptide m/z) Q1 – Fragmentace v kolizní cele Q2 – Sken fragmentu (Peptide fragment m/z) Q3 • Quantitation
APLDNDIGVSEATR (Beta-galaktosidáza) MS
1.53e4
729.3654
100
%
729.8720 730.3918 736.4456 737.4578
0
715
720
725
730
735
740
m/z
745
MSMS
y1 R b2
y3 TA
y5 ES b4
V b6
169.0914
563.2598
y9 D
N
y10 D
y11 L
y12 y13 A P
18.6
832.4432
326.1555
200
400
1290.7043
833.4423
600
Přechody:
1176.5780 1289.6802
183.1405
0
y8
719.3724
100
%
y6 y7 G I
800
1000
1200
1400
m/z
ID
Q1
Q3
CE
APLDNDIGVSEATRy8
729,4
832,5
42
APLDNDIGVSEATRy12
729,4
1289,6
42
APLDNDIGVSEATRy11
729,4
1176,6
42
XIC of +MRM (80 pairs): 729,4/1176,6 Da ID: APLDNDIGVSEATR from Sample...
Max. 1,8e5 cps.
1,8e5 1,6e5
729,4
1,4e5
832,5
1,2e5 1,0e5 8,0e4 6,0e4 4,0e4
XIC of +MRM (80 pairs): 729,4/1176,6 Da ID: APLDNDIGVSEATR from Sample...
2,0e4 0,0
8
10
12
14
16
18 20 Time, min
22
24
26
28
1,8e5
XIC of +MRM (80 pairs): 729,4/832,5 Da ID: APLDNDIGVSEATR from Sample ...
Max. 1,4e5 cps.
1,6e5
1,4e5 1,2e5
729,4
1,0e5
1176,6
1,4e5 1,2e5
8,0e4 6,0e4
1,0e5
4,0e4
8,0e4
2,0e4 0,0
Max. 1,8e5 cps.
30
8
10
12
14
16
18 20 Time, min
22
24
26
XIC of +MRM (80 pairs): 729,4/1289,6 Da ID: APLDNDIGVSEATR fromSample...
28
30
Max. 1,3e5 cps.
1,28e5 1,20e5
729,4
1,00e5
6,0e4 4,0e4 2,0e4
1289,6
0,0
8,00e4
8
10
12
6,00e4
14
16
18 20 Time, min
22
24
26
28
4,00e4 2,00e4 0,00
8
10
12
14
16
18 20 Time, min
22
24
26
28
30
Skyline sw pro tvorbu SRM přechodů i vyhodnocení výsledků Selekce nábojového stavu
Selekce přechodů
Finální metoda Optimalizace kolizní energie
30
Scheduled MRM™ maximalizace cyklu
• monitoruje každý MRM přechod jen očekávaném elučním čase • redukuje počet překrývajících se přechodů • zvyšuje čas měření pro každý přechod • zlepšuje analytickou přesnost • lepší LLOQ
Cycle Time
málo MRM
Intensity (cps)
MRM XIC
mnoho MRM
Time (mins)
AQUA Absolutní kvantifikace • Stabilně izotopicky značený peptid o stejné sekvenci jakou kvantifikuji
Peak ratio ‐ Light x Heavy PeptideSequence AGPESDGQFQFTGIK THSDQFLVSFK
ProteinName ReplicateName Absolute spike sp|Q9JJW3|USMG5_RAT 150420_RHD50G50 50 fmol tr|Q6PCU0|Q6PCU0_RAT 150420_RHD50G50 50 fmol
Absolutní koncetrace proteinu USMG5: 50 * 4,0401 = 202 fmol Q6PCU0: 50* 4,0608 = 203 fmol
RT RatioToStandard 54.54 4.0401 46.96 4.0608
Full Dynamic Range Proteome Analysis of S. cerevisiae by Targeted Proteomics
Figure 1 Cellular Concentrations of the Set of Measured Proteins Protein abundances are derived from Ghaemmaghami et al. (2003). Proteins detected by SRM assays are sorted by abundance to show the even distribution across the whole range of concentration (blue circles). Proteins for which the absolute abundance was measured using isotopically‐labeled standards are indicated on top of the graph (open circles). http://dx.doi.org/10.1016/j.cell.2009.05.051
SRM (MRM) peptidů • Vysoce selektivní • Široký dynamický rozsah
SWATH
SWATH‐MS: Sequential Windowed data independent Acquisition of the Total High‐resolution Mass Spectra
• Selekční okno prekurzoru ‐ kolem 25 mu (v SRM jednotka m/z) • Fragmentace v kolizní cele • MS/MS scan pro všechny prekurzory v cele – fragmenty ze všech dohromady
• TripleTOF 5600
SWATH‐MS
Adapted from Gillet et. al., Molecular & Cellular Proteomics, 2012
Příklad
Affinity Purification coupled to Mass Spectrometry Cell culture
Lysate
Affinity purification
Cloning N‐terminally FLAG Ddi2 pTRE‐Tight vector
Identification of hits Quantitative MS analysis Hit verification
Peptide preparation
Plot of T‐test t‐value versus p‐value. Red marks higlight proteins positively enriched in Ddi2 expressing cells
Interakční proteiny Accession number sp|P62987|RL40_HUMAN sp|P54727|RD23B_HUMAN sp|P11142|HSP7C_HUMAN sp|P08107|HSP71_HUMAN sp|O95757|HS74L_HUMAN sp|P34932|HSP74_HUMAN sp|Q15424|SAFB1_HUMAN sp|P38646|GRP75_HUMAN sp|P11021|GRP78_HUMAN
Protein Name Ubiquitin‐60S ribosomal protein L40 UV excision repair protein RAD23 homolog B Heat shock cognate 71 kDa protein Heat shock 70 kDa protein 1A/1B Heat shock 70 kDa protein 4L Heat shock 70 kDa protein 4 Scaffold attachment factor B1 Stress‐70 protein, mitochondrial 78 kDa glucose‐regulated protein
t‐value p‐value Fold Change 7.50 7.24E‐06 4.37 6.52 2.84E‐05 11.61 3.84 2.34E‐03 2.02 3.37 5.60E‐03 1.87 3.10 9.24E‐03 1.75 3.05 1.00E‐02 1.77 2.79 1.63E‐02 1.39 2.36 3.58E‐02 1.54 2.24 4.46E‐02 1.39
a)
b)
Fig 5.: example of manual curation of statistical result. Proteins a) UV excision repair protein RAD23 homolog B, and protein b) was assigned significant by T‐test analysis. The manual curation of protein b) disproved the result.
Stabilní izotopové značení • Stabilní izotopy Těžké (heavy): 13C, 15N, 18O, 2H Lehké (light): 12C, 14N, 16O, 1H
– Zavedení jednoho atomu • Trypsinové štěpení v H218O • 15N značené v buněčné kultuře
– Zavedení skupiny s několika těžkými izotopy • Stable isotope labelling of amino acids in cell culture (SILAC) • Isobaric tag for relative and absolute quantitation (iTRAQ) • Dimethyl labelling
• předpoklad • Shodné chování v průběhu chromatografie a ionizace – odpovídající H/L formy peptidu eluují ve stejný čas – obě formy mají stejnou pravděpodobnost ionizace na pozadí danné matrice
Kvantifikace proteinů Stabilní Izotopové značení
Bezznačková (Label‐free)
2‐DE
( stable isotope labelling) MS1 Cílená
SRM
MS2 Data Independent Analysis (DIA) SWATH
Metabolické
Chemické
SILAC 14N/15N
medium
N‐term MS1 mTRAQ Dimethyl
C‐term MS2 iTRAQ TMT
Esterifikace 16O/18O
inkorporace
Aminokyselina Lys (iTRAQ) Cys (ICAT) Trp
DOI: 10.1039/B618553N
Stabilní izotopové značení • Metabolické • Eg. SILAC
• Chemické • Eg. Dimethyl labeling
Značení stabilními izotopy - SILAC o Stable Isotope Labeling with amino ACids in cell culture (SILAC) o Metoda relativní kvantifikace proteinů ve dvou paralelně kultivovaných buněčných kulturách v médiu s lehkými nebo těžkými AK. o V mediu s těžkými AK se používá např.: Arg, Lys 13C, 15N o Kvantifikace MS1, ověření identity v MS2 o Nutné dosáhnout vysoké úrovně inkorporace těžkých AK do buněk o Minimálně 5 buněčných cyklů
MS spektrum 2x nabitých iontů při SILAC experimentu 37
SILAC Inkorporace
Inkorporace těžkých AK (13C 15N Arg, Lys) do buněčné kultury Protein selection Peptide selection
H/L ratio = 35 i.e. incorporation level 97 %
SILAC výsledek
SILAC +
‐
• Vzorky jsou smíseny na počátku experimentu • Vhodné pro složité postupy přípravy vzorku • Je možné použít shotgun i cílený přístup
• Auxotrofie pro Lys, Arg • Snadné pouze v buněčných kulturách • Metabolická konverze Arg na Pro • Limitovaná multiplicita • drahé
Kvantifikace proteinů Stabilní Izotopové značení
Bezznačková (Label‐free)
2‐DE
( stable isotope labelling) MS1 Cílená
SRM
MS2 Data Independent Analysis (DIA) SWATH
Metabolické
Chemické
SILAC 14N/15N
medium
N‐term MS1 mTRAQ Dimethyl
C‐term MS2 iTRAQ TMT
Esterifikace 16O/18O
inkorporace
Aminokyselina Lys (iTRAQ) Cys (ICAT) Trp
Dimethyl Labeling Reakce N‐termini a ε‐amino skupiny Lys s formaldehydem následovanou redukcí kyanoborohydridem sodným
Boersema, P. J., et al. Triplex protein quantification based on stable isotope labeling by peptide dimethylation applied to cell and tissue lysates. Proteomics. 8, 2008, pp. 4624–4632.
Dimethyl labelling + • Levné a snadno sehnatelné reagencie • Reakce – rychlá – V roztoku po štěpení
‐ • ostatní primarní aminy mohou reagovat s formaldehydem – vynechat Tris, Am. Bic, použij TEAB • Všechny kroky před smísením kriticky důležité pro kvantifikaci ‐ optimalizace
Izobarická značka pro rel. a abs. kvantifikaci iTRAQ Isobaric Tag for Relative and Absolute Quantitation (iTRAQ) – Současná (relativní) kvantifikace až 4 vzorků. Sada 4 izobarických činidel, která se váží na aminoskupinu peptidů (proteinů). V MS mají stejný poměr m/z, v MS/MS poskytují 4 různé ionty.
MS/MS
MS
Isobarická značka 145 Da iTRAQ značky Relativní kvantifikace podle intenzit iontů m/z 114, 115, 116, 117 Možný i oktaplex
39
iTRAQ • Poměry jsou odečteny po peptidové fragmentaci – MS/MS (MS2): Reporterové ionty a jejich poměry určují rozdíly v kvantitě
iTRAQ +
‐ • ostatní primarní aminy • Levnější než SILAC mohou reagovat s • Reakce formaldehydem – vynechat – rychlá Tris, Am. Bic, použij TEAB – V roztoku po štěpení • Všechny kroky před smísením • Stejné chování peptidu v kriticky důležité pro průběhu analýzy až na rozdíl kvantifikaci ‐optimalizace v MSMS spektru • Skutečné rozdíly v kvantitě jsou větší než naměřené
Kvantifikace proteinů Stabilní Izotopové značení
Bezznačková (Label‐free)
2‐DE
( stable isotope labelling) MS1 Cílená
SRM
MS2 Data Independent Analysis (DIA) SWATH
Metabolické
Chemické
SILAC 14N/15N
medium
N‐term MS1 mTRAQ Dimethyl
C‐term MS2 iTRAQ TMT
Esterifikace 16O/18O
inkorporace
Aminokyselina Lys (iTRAQ) Cys (ICAT) Trp
Dvoudimensionální elektroforéza 2DE – princip metody
+ pI 3
_
První dimense ++
‐‐ +‐ ‐ ‐ ‐‐
‐ ‐
‐ ‐ ‐ ‐ ‐‐ ‐‐ ‐
‐ ‐‐ ‐
+
+
‐
‐
‐‐
‐
+ + ‐
+ ‐
‐
+
+ + + + +‐
‐
+ ++
+
+ ‐‐ ‐ +
++‐ + + ‐ ++ ‐‐
+
‐ ‐
+ +
‐‐
Druhá dimense
Polyakrylamidový gel ++
‐ +
+
‐
‐
‐
2DE – relativní kvantifikace
+
+
pI 10
